CN1175214A - 肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物 - Google Patents

肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1175214A
CN1175214A CN95197680A CN95197680A CN1175214A CN 1175214 A CN1175214 A CN 1175214A CN 95197680 A CN95197680 A CN 95197680A CN 95197680 A CN95197680 A CN 95197680A CN 1175214 A CN1175214 A CN 1175214A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
cell
val
iddm
hsp60
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN95197680A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1233417C (zh
Inventor
伊伦·R·科恩
戴娜·埃利亚斯
马提蒂亚胡·弗里德金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yeda Research and Development Co Ltd
Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26322965&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1175214(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from IL11209494A external-priority patent/IL112094A0/xx
Priority claimed from IL11446095A external-priority patent/IL114460A0/xx
Application filed by Yeda Research and Development Co Ltd filed Critical Yeda Research and Development Co Ltd
Publication of CN1175214A publication Critical patent/CN1175214A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1233417C publication Critical patent/CN1233417C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种具有hsp60的p277序列结构的肽,其中一个或两个半胱氨酸残基被缬氨酸残基替换和/或其中Thr19残基被Lys替换。它实际上具有与p277相同的生物活性,但具有更好的稳定性。该新的p277类似物可用于p277可以应用的各种用途。

Description

肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物
本发明涉及新的肽类，它们是人60KDa热休克蛋白(hsp60)的抗原决定基的变异型。本发明还涉及含有它们的药物组合物和用这种肽类诊断和治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的方法。
I型糖尿病，或IDDM，是一种自身免疫性疾病。它是由攻击和破坏胰岛素生成β-细胞的T细胞引起的。该产生胰岛素的β-细胞位于胰岛中(Castano和Eisenbarth，1990)。该自身免疫发展到高峰时胰岛素依赖性糖尿病的开始和发展不伴随有任何症状。这种疾病只有当β-细胞的累积损失超载了残余β-细胞提供胰岛素的能力时才在临床上显现出来。事实上，葡萄糖体内平衡的失控以及IDDM临床症状的产生被认为是在80-90％的β-细胞被免疫系统失活之后发生的。因而，被确诊为患有IDDM的病人其β-细胞被自身免疫破坏的程度一定相当严重。而且，通过检测β-细胞自身免疫的免疫学标记而进行的对初期患者，即无临床症状的糖尿病患者的诊断只有当自身免疫过程开始以后才能进行。因而，治疗方法的探索就是去寻找一种安全、有特异性并且有效的方法来阻止已相当严重的自身免疫过程。
本发明人以前通过研究NOD品系的小鼠中产生的自发性糖尿病已研究过这一问题。NOD品系小鼠中产生的这种糖尿病被认为是人IDDM精确的模型(Castano和Eisebarth，1990)。NOD小鼠在约4周龄产生胰岛炎，开始为轻微的胰岛周围浸润，然后发展为严重的胰岛内炎症。表明胰岛素不足的高血糖症在这种雌性小鼠中约14-17周龄时开始出现。到35-40周龄时几乎所有的雌性NOD小鼠都产生了严重的糖尿病，并在不进行胰岛素治疗的情况下全部死亡。雄性NOD小鼠的发病率较低，其原因尚不清楚。已证明NOD小鼠的糖尿病是由自身免疫性T细胞引起的(Bendelac等，1987)。
针对各种抗原的T细胞反应性和自身抗体已在IDDM病人以及NOD小鼠中进行了检测(Elias，1994)，但并不清楚对可能的靶抗原中任何单一的一种的免疫性是否该疾病的主要原因。除了对病因的探讨之外就是对治疗方法的探讨。
已经证实，NOD小鼠自身免疫过程的起始可通过将小鼠在糖尿病发作前进行各种处理来阻止。这种处理包括例如限制饮食、病毒感染或对免疫系统的非特异性刺激(Bowman等，1994)。NOD糖尿病也可以通过在糖尿病发作前的小鼠中诱导对抗原谷氨酸脱羧酸(GAD)的免疫耐受来进行预防(Kaufman等，1997；Tisch等，1993)。
本发明人以前已发现，NOD小鼠的糖尿病可通过用T细胞免疫接种来预防。该T细胞免疫接种使用的是特异于人hsp60分子的p277肽序列的T细胞(Elias等，1991)。该蛋白质以前被称为hsp65，但由于已得到了其更准确的分子量，现在被命名为hsp60。虽然名称不同，但表示同一种蛋白质。
p277肽为与IDDM相关的人hsp60的抗原决定簇，相应于人hsp60序列的437-460位序列。它被首次描述于本发明申请人的以色列专利申请No.9421中以及Elias和，Cohen，1997的文章中，其序列如下：
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID NO：1)
在胰岛炎发作时施用p277肽本身也显示可阻止糖尿病的发展。这可能是向下调节抗-p277免疫性引起的，而抗-p277的免疫性对NOD糖尿病来说是必须的(Elias)等，1991；以色列专利申请No.94241)。最近的研究表明，p277肽也可用于逆转已相当严重的β-细胞自身免疫性(Elias和Cohen，1994)。本发明人的研究小组最近报道了一种自身免疫性糖尿病可在C57BL/KsL品系的小鼠中诱发。这是通过施用非常低剂量的β-细胞毒素链脲佐菌素(STZ)进行的(Elias等，1994)。以日用量为40mg/kg的标准低剂量，将STZ施用5天通常在3周内诱发临床糖尿病。而以30mg/kg的剂量施用5天只有在约3个月的滞后期才诱发出临床糖尿病。诱发糖尿病的这一现象伴随着对胰岛素的自身抗体、对胰岛素自身抗体的抗特异型抗体以及对hsp60的自身抗体的前症状期的出现。这种小鼠也表现出对hsp60和对其p277肽的自发性T-细胞反应性(Elias等，1994)。因而，比标准低剂量更低的STZ所诱发的自身免疫过程好象与NOD小鼠产生的自发性糖尿病中所观察到的自身免疫过程相同(Elias等，1990)。
本发明的一个目的是提供变异型的肽p277，这种变异型肽可用于诊断和治疗IDDM。
在一个对肽p277的片段和变异型的研究中，我们意外地发现，其中唯一的苏氨酸残基被赖氨酸残基取代和/或一个或两个半胱氨酸残基被缬氨酸残基取代的这种肽在糖尿病的治疗中同p277一样具有活性。由于半胱氨酸残基被丝氨酸残基替换常引起肽的失活，这一结果更使人感到意外。
因而本发明涉及含有序列I的肽：
                     6                 11
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-
                                                    (I)
                    19
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID NO：2)其中X1和X2每一个是一个Cys或Val残基，和X3是一个Thr或Lys残基，但当X3是一个Thr残基时，X1和X2不能均为Cys残基。
在本发明的特定实施例中，该肽由序列I组成，其中X1和X2均为Cys和X3为Lys，本文中的p277(Lys19)(SEQ ID NO：3)或X1是Val，X2是Cys和X3是Thr或Lys，分别为本文中的p277(Val6)(SEQ ID NO：4)和p277(Val6-Lys19)(SEQ ID NO：5)；或者X1是Cys，X2是Val和X3是Thr或Lys，分别为本文中的p277(Val11)(SEQ ID NO：6)和p277(Val11-Lys19)(SEQ IDNO：7)；或者X1和X2均为Val和X3是Thr或Lys，分别为本文中的p277(Val6-Val11)(SEQ ID NO：8)和p277(Val6，11-Lys19)(SEQ ID NO：9)。本文中也将p277(Val6-Val11)肽称为p277(V)。
本发明的另一个目的是提供使用序列I的肽对IDDM进行早期诊断的方法和试剂盒。动物在IDDM的发展过程中表达hsp60分子或与其交叉反应的分子，这些分子可发现于动物的血液和尿中。它们也表达特异地针对于这些分子的抗体和T细胞。因而，在血液或尿中hsp60(或与其交叉反应的分子)或与它们具有特异性的抗体或T细胞的存在可以用作在β-细胞被完全破坏前和个体被注定为终生糖尿病前检测IDDM进程的测试指标。
病人是否患有或开始患有IDDM可通过检测所说患者的血液或尿中抗-hsp60抗体的存在或与人hsp60具有免疫反应性的T细胞的存在来进行诊断。所使用的是作为抗原的本发明的序列I的肽。实际上，上文所述的可用肽p277操作的任一种方法(例如PCT国际申请公开号NO.WO90/10449所述的方法，引入本文作为参考)也可用本发明序列I的肽替换p277来进行操作。
因而，本发明提供了一种诊断病人是否患有或开始患有IDDM的方法，包括检测所说病人是否存在抗-hsp60抗体或是否存在与hsp60进行免疫反应的T细胞。其中表明抗-hsp60存在、表明与hsp60免疫反应的T细胞存在、或表明一种T细胞或与hsp60免疫反应的T细胞存在的阳性结果即表明病人很有可能患有或开始患有IDDM。
在诊断IDDM的方法中可对病人检测抗-hsp60抗体的存在，其中所说的检测方法可包括放射免疫检测或ELISA检测。
也可对病人检测与hsp60免疫反应的T细胞的存在。在有关这方面的一个实施例中该检测方法包括T细胞繁殖检测，包括以下步骤：
(i)从病人体中抽取血液样品，制备含有T细胞的单核细胞组群。
(ii)向该单核细胞组群中加入一种抗原，该抗原选自本发明的序列I的肽。
(iii)在所说抗原的存在下将该细胞组群在适当的培养条件下温育适当长的时间。
(iv)在所说温育时间结束前适当时间向(iii)的细胞培养物中加入一种标记的核苷酸，从而使所说标记的核苷酸掺入到增殖中的T细胞的DNA中；和
(v)通过分析标记核苷酸掺入到所说T细胞中的量来确定增殖的T细胞的量。
在上述步骤(iv)中，所说标记核苷酸优选为3 H-胸苷。增殖T细胞量的确定是通过用标准方法计算T细胞的刺激指数(Stimulation index)来进行的。
在本发明这一方面的另一个实施例中，该检测方法包括T细胞细胞分裂素(Cytokine)响应测试，其中步骤(i)至(iii)与上述T细胞增殖检测相同，在第四(iv)步骤中，由响应性淋巴细胞分泌至培养基中的细胞分裂素例如IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ的存在通过标准方法用商品试剂盒进行检测。
另一方面，本发明提供了一种体内方法，其中将一种选自序列I肽的抗原皮下注射给病人，并观察可检测性皮肤反应(DTH)的发生。
本发明也涉及进行这种测试的方法，以及进行这种测试所用的试剂盒。该试剂盒可制备成可进行本发明中任意一种测试方法的形式。每一个这种试剂盒包括进行单个的测试或一定数目的多个测试所需的全部材料。例如，用于确定抗-hsp60是否存在的试剂盒可含有固相固定化的序列I的肽和一种可识别待测抗-hsp60抗体恒定区域的标记抗体，如标记的抗-人Fab抗体。该试剂盒也包括使用这种试剂盒的说明书和盛装试剂盒材料的容器。可使用任一种常规的标记物，如放射性同位素，酶，发色团或发荧光团。典型的放射性同位素是碘-125或硫-35。用于这一目的的典型的酶包括辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
通过检测抗-hsp60抗体来诊断IDDM的试剂盒包括：
(i)一种抗原，它选自序列I的肽，和
(ii)一种标记抗体，它可识别所说待测抗-hsp60抗体的恒定区。
通过检测与hsp60免疫反应的T细胞来诊断IDDM的试剂盒包括：
(i)一种抗原，它选自序列I的肽；
(ii)一种培养淋巴细胞(T细胞)的适当的培养基；和
(iii)一种用于T细胞增殖检测的标记核苷酸，或一种用于细胞分裂素检测的试剂盒，细胞分裂素，如，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ。
对于体内检测来说，该试剂只包括适当形式的用于注射的序列I肽。
本发明还涉及用于预防或治疗IDDM的方法。用本发明的序列I的肽抗原免疫接种可特异性地向下调节对该抗原的自身免疫性，并可有效地产生对IDDM自身免疫过程的抵抗力。用特异于这种抗原的T细胞接种可以达到同样效果。这种T细胞可以其减毒的或非毒性形式，或以为提高其免疫原性的处理后形式，或其碎片或活性部分的形式使用。如果病人已显示患有临床前的早期IDDM，用这种抗原或T细胞(或其部分)注射可向下调节对该抗原的自身免疫性，从而在严重的、永久性的损害产生前阻止该自身免疫过程。该肽也可用作治疗剂，即使在该自身免疫性已相当严重时阻止它的发展，正如最近本发明的发明人用肽p277治疗NOD小鼠时所显示的那样(Elias和Cohen，1994)。
因而，本发明提供了一种预防或治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的制剂，包括选自下组的T细胞产物：(a)显示出对人hsp60的p277序列具有特异性的人T细胞，该细胞已在所说序列I的肽存在下温育而被活化；(b)(a)的所说人T细胞，它们已被照射过或减毒过；(c)(a)的所说人T细胞，它们已被用静水压压力处理过，用化学交联剂处理过和/或用细胞骨架交联剂处理过；(d)(a)、(b)或(c)中的T细胞的碎片或其上脱落的表面蛋白质；或(e)基本上由特异于所说蛋白质的(a)的受体的可变区组成的肽，或它的盐、功能衍生物、前体或活性部分。
在本发明的一个最佳实施例中，该制剂含有从待治疗IDDM病人获得的自体人T细胞，该T细胞已通过在体外与所说序列I的肽相接触而被活化。然后将这些特异的和活化的T细胞施用于它们来源的同一个病人。
本发明也提供了一种预防和治疗IDDM的药物组合物，包括药用可接受的载体以及作为活性组分的有效量的序列I的肽、其盐或活性衍生物。该药用可接受的载体优选为油载体，例如被称为不完全佛氏佐剂(IFA)的矿物油乳剂。然而，IFA以及完全佛氏佐剂(CFA；一种含有不同量的杀死的分枝杆菌生物体的矿物油制剂)不能用于人类，因为矿物油是不可代谢的，不能被身体降解。
本发明人现已发现，一些多年来一直用于人类患者静脉内营养物的脂肪乳剂也可用作用本发明肽进行肽治疗的载体。这种乳剂的两个例子是可通过商业途径获得的乳剂，被称为Intralipid和Lipofundin。“Intralipid”是瑞典Kabi Pharmacia的注册商标，其产品是一种用作静脉内营养物的脂肪乳剂，描述于美国专利No.3169094。“Lipofundin”是德国B.Braun Melsungen的注册商标。这两种产品均含有作为脂肪的大豆油(100ml蒸馏水中含有100或200g：分别为10％或20％)。在Introlipid中，卵黄磷脂被用作乳化剂(12g/L蒸馏水)，在Lipofundin中用的是卵黄卵磷脂(12g/L蒸馏水)。在Introlipid和Lipofundin中加入甘油(25g/L)后产生等渗性。
本发明还涉及预防和治疗IDDM的方法，包括给需要进行预防和治疗的病人施用一种组合物，该组合物含有序列I的肽或一种制剂，该制剂含有与本发明的所说序列I的肽具有特异性的T细胞。
附图简要说明
图1表明p277和p277(Val6-Val11)稳定性。实心圆圈代表使用p277的结果，空心圆圈代表p277(Val6-Val11)的结果。大圆圈代表贮存一周后的结果，中等圆圈代表9周以后，最小的圆圈代表20周以后。
图2表明致糖尿病的NOD T细胞克隆C9在对肽p277(实心圆圈)和p277(Val6-Val11)(实心圆圈)所做出相应反应时的增殖。
图3表明NOD脾T细胞在肽p277(Lys19)存在时的增殖。在每一周龄组测试了5只雌雄NOD小鼠的脾的T细胞在响应肽p277(Lys19)(实心圆圈)，p277(空心圆圈)和对照肽p278(实心方块)时的增殖。
图4表明致糖尿病的NOD T细胞克隆C9在响应肽p277(Lys19)时的增殖。
图5表明用IFA中的p277(v)预处理来预防STZ-诱导的糖尿病与对照处理或用GADp34处理相比的有效性。
本发明的内容详细描述如下，本发明中所述的“序列I的肽”，只要这些肽保持其与糖尿病相关的生物活性，它们的盐和功能性衍生物也一并加以考虑。
本发明所说的肽I的“盐”是生理上可接受的有机和无机盐。
本文所述的肽I的“功能衍生物”包括可用现有技术的方法从功能基团制备的衍生物，这些功能基团位于残基的侧链上或N-或C-未端基团上。这些“功能衍生物”只要它们保持药物可接受性，包括在本发明的范围内，即它们不被坏该肽的活性(是指与已知的p277活性具有的相似性而言)，不使包含它的组合物产生毒害性质并且对其抗原性质没有不良影响。这样“功能衍生物”不包括在效果上为一种氨基酸转变成另一种氨基酸的变化。
根据上述定义的标准，这些衍生物可包括例如羧基脂肪酯，与氨或伯胺或仲胺反应而生成的羧基的酰胺，通过与酰化基团(如烷酰基团或碳环芳酰基团)发应形成的氨基酸残基自由氨基的N-酰基衍生物，或与酰化基团反应而形成的自由羧基的O-酰基衍生物。
本发明序列I的肽在药物组合物中可用作免疫原，尤其是在用于减轻或治疗IDDM的疫苗中，也在用于诊断IDDM的诊断性组合物中用作抗原。用现有技术已知的方法制备的这些药物和诊断性组合物也属于本发明的范围。
当本发明的肽用于治疗或用于预防疫苗时，它优选与促进自身免疫T细胞进行TH1-TH2转变的生物活性载体一起施用。CD4辅助类型的T细胞根据激活时它们分泌的细胞分裂素被分成两个组群(Mosmann和Coffman，1989)：TH1细胞分泌IL-2和IFN-γ，而TH2细胞分泌IL-4和IL-10。这样的载体优选为一种脂肪乳剂，含有10-20％的植物和/或动物来源的甘油三酯，1.2-2.4％的植物和/或动物来源的磷脂，2.25-4.5％的渗透调节剂，0-0.5％的抗氧化剂，加无菌水至100％。这样的载体最优选为Intralipid或Lipofundin。这种载体的用法描述于以色列专利申请(本发明人的案号为9523)，其申请日与本发明(本发明人的案号为9451A)的以色列专利申请日相同，其申请人与本发明为同一申请人。该申请的内容全部引入本文作为参考。
本发明的治疗用组合物可口服施用，也可肠胃外施用，例如皮下、肌肉、静脉内、鼻内或直肠内施用。
本文的实施例确立了用本发明的化合物或组合物对科学上可接受的人IDDM的动物模型进行治疗的有效性。实施例
材料和方法
(i)小鼠：NOD/Lt品系近亲交配的雌性小鼠是由Animal BreedingCenter of Weizman Institute of Science，rehovot，Israel提供的。这些小鼠在14至17周龄自发产生自身免疫性糖尿病，该病与人IDDM相仿。
(ii)肽：肽是通过标准Fmoc化学方法用ABIMED合成仪(FRG)合成并用反相层析在HPLC上进行了纯化。用氨基酸分析法确证其序列。合成了下列肽：p277肽；对照肽p278，其序列为：Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile(SEQ ID NO：10)，相应于人hsp60分子的第458-474位序列；p277的片段：p277的氨基侧半分子(p277.N)，p277的羧基侧半分子(p277.C)，和p277C与p278的组合(p277.C-p278)；肽p277(Lys19)；和对两个半胱氨酸残基具有不同氨基酸替换的肽p277，其序列如下：具有桥联(bridged)-SH基团的p277(p277(桥联Cys-Cys))；两个半胱氨酸残基均被缬氨酸取代(p277(Val6-Val11))或者均被丝氨酸取代(p277(Ser6-Ser11))的p277。
(iii)治疗和随后的观察：用p277、其它的肽或者小牛血清(BSA，购自Sigma，St.Louis，MO，USA)的乳液以0.1ml的体积从背部皮下注射的方式来处理小鼠。将该抗原用PBS稀释，并用等体积的矿物油(不完全弗氏佐剂(IFA)；Sigma)或10％Intralipid乳化。以Elias等1991描述的方式，在非禁食状态下，在上午10点检测小鼠的血液葡萄糖水平。检测时间为治疗(7，12，15或17周龄)的时间，对于那些幸存的小鼠是在40周龄时。显著的高血糖症被认为是在葡萄糖浓度为11.1mM/L或更高些，因为这一血葡萄糖浓度比在100个健康小鼠中测量到的平均血葡萄糖浓度高3个标准偏差(未提供数据)。胰岛的组织学检查是在苏木精和曙红染色的切片上进行的。这些切片由独立的两位观测者计分，他们都不知道这些切片来自哪些小鼠。用X2检测来确定各治疗组之间的统计偏差。
(iv)T-细胞增殖检测：将C9克隆的细胞和得自雌性NOD小鼠的脾细胞悬浮液用前述方法(Elias等，1991)进行T-细胞增殖检测。简言之，将1×105克隆细胞/ml或1×106脾细胞/ml在0.2ml培养基中并在5μg/ml的不同抗原存在或不存在情况下培养地微滴板小孔中，每种平行培养4份，培养时间为72小时。增殖情况通过在培养的最后12小时DNA中[3H]-胸苷的掺入量来测定。用刺激指数(Stimulation index)来计算结果：在抗原存在时的平均测试cpm与没有抗原时的平均对照cpm的比率。平行的四份样品间平均cpm的标准偏差均小于10％。在脾细胞实验中对照cpm小于1000，在用C9细胞时小于200cpm。每个小鼠的脾是分别进行检测的。每组小鼠的结果以平均±SD表示。实施例1
用p277或其片段治疗NOD小鼠
为检测单独的或组合在一起的p277肽的两种12个氨基酸的半分子在NOD小鼠中是否像p277肽同样有效，将雌性NOD小鼠在7周龄用50μg存在于油中的各种肽进行皮下接种。确定小鼠在40周龄时的状况。
结果示于表1。可以看出，对照hsp60肽p278对疾病的发展没有影响：在40个被处理的小鼠中，均患有糖尿病，在40周龄90％已死亡。相比之下，p277肽完全阻止了死亡的发生并治愈了20个被治疗小鼠的60％。p277的片段效果稍差：p277的氨基侧半分子(p277.N)，p277的羧基侧半分子(p277.C)及这两种分子的混合物(p277.N，p277.C)的效果相当于完整p277的一半。将肽p277.C通过合成与肽p278连接在一起以产生一个较长的肽；然而，p277.C-p278的效果并不比单独的p277.C好。因而，可以断定，完整的治疗效果需要完整的p277肽。
                          表1
用p277或其片段治疗NOD小鼠40周龄时的糖尿病状况。
肽治疗50μg   小鼠数目   健康％ 高血糖症％  死亡％
  p278     40     0     100     90
  p277     20     60*     40     0*
  p277.N     20     20     80     50*
  p77.C     20     30     70     40*
  p277.N，p277.C     20     35*     65     40*
p277.C-278     20     25     75     50*
*与用对照肽p278治疗的组相比p＜0.01。实施例2
用p277替换肽治疗NOD小鼠
用NOD小鼠检测了下列肽：p277，p277(桥联Cys-Cys)，p277(Val6-Val11)和p277(Ser6-Ser11)。
用存在于0.2ml矿物油(IFA)乳液中的100μg肽通过皮下施用治疗NOD雌性小鼠。这一治疗是在12周龄时进行的，在30周龄时计算糖尿病发生率。
如表2所示，p277(Val6-Val11)在治疗糖尿病上与p277同样有效。在没有进行治疗的小鼠中，糖尿病的发生率为80％，而用p277和p277(Val6-Val11)治疗的小鼠发病率分别为22％和23％。另一方面，无论是p277(桥联Cys-Cys)或p277(Ser6-Ser11)均没有治疗效果。p277的另外两种变异型，其中在第6位和第11位的半胱氨酸残基被丙氨酸或γ-氨基丁酸残基取代，当用克隆C9细胞和NOD脾T-细胞进行体外检测时也均无效果。由于这两种肽不被抗-p277特异性T细胞识别(未示出数据)，没有对它们进行体内治疗效果的检测。
                     表2
用p277替代物对NOD小鼠治疗*与用单独的佐剂处理的小鼠中糖尿病的发生率相比p＜0.01
Figure A9519768000162
与用单独的佐剂处理的小鼠中糖尿病的发生率相比没有显著差异实施例3
p277(Val6-Val11)的稳定性
由于对半胱氨酸进行替换原因是p277肽的稳定性差，在p277(Val6-Val11)合成后的不同时间对其进行了稳定性检测。即在严格的条件下，p277肽也是不稳定的并易被破坏(真空冷冻干粉，-20℃)。
为了对p277与其类似物p277(Val6-Val11)进行稳定性比较，将两种肽在同一时间合成，并以干粉贮存于-20℃。在合成后的1、9和20周，称取等量样品，进行溶解并测试。肽的稳定性是用其刺激T细胞克隆C9的能力来体现的。图1显示了该试验的结果。可以看出，虽然天然p277在合成后第9周丧失了其大部分效力并在第20周丧失了其全部效力，而p277(Val6-Val11)在贮存20周后其效力没有变化。
由于p277的不稳定性被认为是由半胱氨酸残基造成的，因而预期，保留p277生物活性的本发明的任一种它的类似物将具有比p277更好的稳定性，这一改良是通过与本实施例中p277(Val6-Val11)所示的相类似的方式实现的。实施例4
用p277或p277(Val6-Val11)治疗NOD雌性小鼠逆转了胰岛炎。
用存在于0.1cc矿物油(不完全弗氏佐剂)乳液中的无修饰的p277或p277(Val6-Val11)，以100μg/小鼠的量在12周龄通过皮下注射治疗NOD雌性小鼠。对照小鼠用的是PBS和矿物油的乳液。在6月龄时，每组杀死5只小鼠，取出胰脏，在布安氏液中固定，切片用苏木精：曙红进行染色。以双盲方式对胰岛炎进行计分。由于对照小鼠发展成了严重的糖尿病，在5月龄将它们杀死。这时，对照小鼠的血葡萄糖水平在29-48mmol/L的范围内。结果示于表3。
                            表3用p277或p277(Val6-Val11)治疗NOD雌性小鼠逆转了胰岛炎肽治疗         胰岛数目        组织检查(22周)
                   清亮    胰岛周胰岛炎  胰岛内胰岛炎(12周)                  ％          ％            ％无                83    10          23            67p277              49    25          69             6p277(Val6-Val11)62    52          31            17
在12周龄，即治疗时，没有治疗的小鼠中约60％的胰岛显示出胰岛内胰岛炎，约20％的胰岛具有胰岛周胰岛炎，约20％的胰岛没有胰岛炎。胰岛内浸润被认为是一种与β-细胞功能缺失相关的严重形式的胰岛炎。如表3所示，与用单独的油处理的对照小鼠相比，两个治疗组胰岛表象的发展具有明显的差异。用油处理的小鼠(对照)不受影响的胰岛的比率呈渐进性降低，到22周龄时只有10％正常胰岛存在，这时所有的小鼠都明显患有糖尿病。在22周龄时约67％的胰岛显示出胰岛内胰岛炎，其余的23％的胰岛显示出胰岛周胰岛炎。相比之下，用p277或用p277(Val6-Val11)治疗的小鼠显示出正常胰岛数量的上升(25％与52％之间)，并且具有胰岛内胰岛炎的胰岛的数量下降(6％与17％之间)。具有胰岛周胰岛炎的胰岛的数量上升至约31％-69％。因而，p277和p277(Val6-Val11)治疗是与组织学表象的改善相关的，并且与经治疗后持续了三个月以上的胰岛炎严重程度的逆转相一致。在雌性NOD小鼠中使用p277(V)的其它结果。
我们做了另外15个实验，其中，将包括10只的NOD雌性小鼠的每个组在12-15周龄用油中的p277(V)或用单独的油处理。在用单独的油处理的总共150只小鼠中，90％发展成糖尿病并且在32周龄时85％已经死亡。相比之下，用p277(V)治疗的小鼠的糖尿病发生率仅为50％(P＜0.01)并且仅有20％因该病严重死亡(P＜0.01)。因而，用p277(V)的后期治疗可有效地阻止致命的糖尿病的进一步发展。实施例5
用脂乳液中的p277(Val6-Val11)对I型糖尿病的肽治疗
胰脏中对产生胰岛素β-细胞的自身免疫性破坏是由T-淋巴细胞介导的。在胰岛周围的炎症性侵润在5-8周龄进一步发展，导致胰岛素缺失的β-细胞破坏以及明显的糖尿病症的出现发生于14-20周龄，到35-40周龄使几乎100％的雌性NOD小鼠受到损害。
用存在于0.1ml PBS或10％脂乳液中的100μg的肽p277(Val6-Val11)的剂量通过皮下治疗NOD每只雌性小鼠，该10％的脂乳液是由10％大豆油，1.2％卵磷脂和2.25％甘油组成的(Intralipid，Kabi Pharmacia AB，Sweden)。
在6月龄时对糖尿病发生率和抗-p277(Val6-Val11)抗体的产生进行测定。持续的高血糖症被诊断为糖尿病，即以一周的时间间隔用BeckmanGlucose Analyzer II至少两次检测到的血葡萄糖水平高于11.1mmol/L。由正常血葡萄糖浓度(低于11.1mmol/L)的维持、胰岛内胰岛炎症的减轻和作为TH2-型免疫应答指示物的对该治疗肽抗体的诱导来确定成功的肽治疗。结果示于表4。
                            表4
在6月龄时糖尿病的发病率治疗                         糖尿病发病率(％)    死亡(％)p277(Val6-Val11)/PBS           90                80p277(Val6-Val11)/Intralipid    45*               20*无                               100               90与没有治疗的NOD小鼠相比P＜0.01
从表4可以看出，用存在于Intralipid中的本发明的肽治疗可有效地降低糖尿病发病率和死亡率。另一方面，用存在于PBS中的肽进行治疗没有效果。实施例6
肽p277和p277(Val6-Val11)可发生免疫性交叉反应。
将从糖尿病发病前的NOD小鼠中分离的T-细胞克隆C9的细胞与肽p277(实心圆)，p277(Val6-Val11)(空心圆)，p277(Ser6-Ser11)(实心方块)和p277(桥联Cys-Cys)(空心菱形)一起温育。结果示于图2。发现克隆C9只对肽p277和p277(Val6-Val11)显示出增殖反应。这证明了p277和p277(Val6-Val11)具有交叉反应性，而治疗效果稍差的肽p277(Ser6-Ser11)和p277(桥联Cys-Cys)不具有免疫交叉反应性。实施例7
刚被确诊为IDDM的患者显示出对p277和p277(Val6-Val11)的T-细胞增殖反应
将刚被诊断(2-4周内)为IDDM的患者进行增殖检测试验。从加有肝素的全血的ficol-hypaque上分离外周血淋巴细胞，并在体外筛查其被hsp60肽p277，p277(Val6-Val11)和对照肽p278所诱导的增殖性。这是用3H-胸苷掺入来测定的。T细胞的增殖反应是用刺激指数(SI)来描述的：由肽刺激的T细胞胸苷掺入与对照(不加入抗原时)T细胞胸苷掺入之比。
                            表5
刚被诊断为IDDM的患者所显示的对p277和p277(Val6-Val11)的T细胞增殖反应患者            T细胞增殖(SI)
     p277   p277(Val6-Val11)  p278IDDM#68  3.5    3.2                 0.8IDDM#69  2.5    5.0                 0.5
如表5所示，刚被诊断为IDDM的患者对p277(Val6-Val11)的反应与对p277肽的反应一样好。因而，p277(Val6-Val11)与p277具有相同的免疫学性能。由于p277的治疗效力是由其免疫识别性能介导的，因而p277(Val6-Val11)可与p277进行免疫交叉反应的事实表明了它可替代p277用于治疗糖尿病。实施例8在IDDM和健康个体中对hap60和肽的T-细胞反应
将21个IDDM患者和14个健康供血者以实施例7的增殖检测方法进行抗-hsp60和p277(V)的筛查。表6和7显示了每一个体对对照抗原(对照Ag)，即破伤风类毒素和流感病毒-德克萨斯品系，对完整重组hsp60和对p277(V)的增殖T细胞响应(刺激指数；SI)。SI值大于等于3时被认为是阳性。
                        表6IDDM患者的增殖T细胞响应患者    年龄  确诊后的时间  对下述物质的T-细胞响应(刺激指数)
    (年)    (周/月)     对照抗原       hsp60     p277(V)1.   LM  32      3.5月        +              +         -2.   G   25      24月         +              +         -3.   H   23      6月          +              +         -4.   DV  20      3周          +              +         -
             5周          +              +         +5.  SD   15      6周          +              +         +6.  P    15      4周          +              -         -7.  G    60*     5周          +              +         +
             7周          +              +         +8.  F    45*     6周          +              +         +9.  IS   53      2周          +              +         -10. T    20      4周          +              +         +11. KK   21      4周          +              +         -12. RI   40      6周          +              -         -13. MS   5       1周          +              -         -14. KB   5       2月          +              +         +15. BI   11.3    3周          +              -         -16. YY   60      2月          +              +         -17. KA   12      4周          -              -         -18. ZA   12      4周          +              +         +19. A    17.5    11.5年       +              +         +20. N    17.5    7.5年        +              +         +21. A    19.7    5.7年        +              +         +*抗-GAD抗体为阳性的患者，尽管是在高龄发病，是I型而不是II糖尿病
             表7
健康血液供体的增殖T细胞响应供体    对下列物质的T-细胞响应(刺激指数)：
    对照抗原       hsp60    p277(V)1          +             -        -2          +             -        -3          +             nd       +4          +             -        -5          +             +        +6          +             -        -7          +             -        -8          +             -        -9          +             -        -10         +             -        -11         +             +        -12         +             -        -13         +             +        -14         +             -        -nd：没做试验
表8总结了以上结果，显示86％和52％的患者对hsp60和p277(V)响应，相比之下对照为21％和14％(P＜0.05)。因而，IDDM对hsp60和p277(V)的响应为显著阳性。可得出的结论为在IDDM患者中hsp60和p277(V)反应性个体的比率高于健康人群。
                表8
在IDDM和健康个体中阳性T-细胞反应性的比率响应者    T-细胞响应的比率(％)
      hsp60        P277(V)IDDM      18/21(86)    11/21(52)*健康人    3/14(21)     2/14(14)*与健康血液供体中抗-p277(V)响应者相比X2检测P＜0.05实施例9
对p277(Lys19)的NOD T-细胞增殖
p277(Lys19)肽与p277相差一个氨基酸。为了证实p277(Lys19)是NODIDDM中的一个自身抗原，我们比较了对肽p277的T-细胞增殖和对肽p277(Lys19)的T-细胞增殖。图3显示了雌性NOD脾的T细胞对p277(Lys19)肽的增殖程度与p277相同。对对照肽p278没有响应。
用克隆C9证实了上述结果，一个致糖尿病NOD细胞被发现对人肽p277有响应(Elias等，1991)。我们发现C9细胞对p277(Lys19)肽的增殖程度与对P277肽的相同(图4)。实施例10
用p277(Lys19)治疗NOD雌性小鼠
本发明人曾报道过，3月龄的老年雌性NOD小鼠所患的严重的胰岛炎可被一次注射人p277对小鼠的治疗而阻止；这些被治疗的小鼠发展成为临床上明显的糖尿病的频率和死于高血糖症的频率较低。为了检测肽p277(Lys19)，小鼠自身的p277肽，是否也同样有效，我们用存在于IFA中的100μg的人p277或p277(Lys19)治疗3月龄老年雌性NOD小鼠。
将存在于磷酸缓冲液(PBS)中的浓度为2mg/ml的肽p277或p277(Lys19)用同等体积的不完全弗氏佐剂(IFA)乳化。将由10只雌性3月龄老年NOD小鼠的组通过皮下用0.1ml(100μg肽)含有两种肽之一的乳液进行注射。对照小鼠是用PBS和IFA的乳液进行注射的。每4周将小鼠取血样并用BeckmannGlucose AnalyzerII进行血葡萄糖水平测定。在6月龄时对高血糖症和由糖尿病而死亡的发生率进行计分。如果小鼠的血葡萄水平高于11mmol/L则认为它们患有糖尿病。
结果示于表9。在6月龄，90％的对照小鼠明显患有高血糖症并且60％死于糖尿病。相比之下，用p277或p277(Lys19)进行治疗可阻止糖尿病(分别为40％和50％发生率)和死亡(分别为10％和20％发生率)。因而，小鼠自身的肽p277(Lys19)在治疗严重的胰岛炎方面好象与外源的p277同样有效。
           表9
用p277或p277(Lys19)治疗糖尿病在3月龄时治疗        6月龄时的糖尿病
          高血糖症(％)    死亡率(％)p277(Lys19)      50*           20*p277              40*           10*PBS               90*           60*P＜0.05
这些结果显示，用人hsp60分子和其p277肽检测的NOT T细胞的增殖应答等同于对小鼠hsp60和对小鼠p277(Lys19)序列的自身免疫应答。这一点被致糖尿病的C9 T细胞克隆以及具有糖尿病症状前的小鼠脾中正在发展的自发性响应所证实。而且，p277(Lys19)与p277对治疗NOD小鼠的糖尿病效果相同。周龄和性别相同的其它品系的小鼠的脾T细胞没有显示出对p277的自发性T-细胞增殖响应(未示出数据)。
由致糖尿病的T细胞靶击的对小鼠hap60序列自身免疫性的这一发现支持了IDDM是由自身免疫过程造成的这一普遍认识。实施例11
用p277(V)治疗STZ-诱发的糖尿病
链脲佐菌素(STZ)是一种β-细胞特异性毒素，如果一次注射量为200mg/kg，它通过在24-48小时内破坏β-细胞而造成毒性糖尿病。如果以小的亚毒性剂量给药，它可诱发遗传上敏感性小鼠的胰岛炎而导致糖尿病。该炎症病程依据STZ的用量可有20-30天。STZ诱发糖尿病的通常方案为，以每千克体重200mg STZ的用量，以40mg/kg的相同剂量连续5天给药5次(Like和Rossini，1976)，这一模型被称作低剂量STZ。我们发现，如果总用量降至150mg/kg(30mg/kg×5)在80-100天内产生糖尿病。STZ-诱发糖尿病的这一慢速渐进型模式可能更类似于人的自身免疫糖尿病，并且与NOD小鼠中自发性糖尿病的临床前期病程相同(Castano和Eisenbarth，1990)。再者，当剂量降低时，急性毒性效应将会消失。
该60KDa的热休克蛋白(hsp60)在NOD(Elias等，1990)和STZ诱发的(Elias等，1994)的糖尿病中都起一定作用。我们先前已经证实，针对hsp60的抗体和T-细胞增殖响应在明显的糖尿病发作前均已存在。对hsp60具特异性的T细胞克隆来源于前糖尿病期的NOD小鼠，并且可被年幼的NOD(Elias等，1991)或τγσNOD小鼠接受并发作胰岛炎和高血糖症。该NOD致糖尿病的T细胞克隆识别hsp60序列437-460的24氨基酸的肽，我们称之为p277。STZ诱发的糖尿病在前糖尿病期也伴随有抗-p277T细胞响应。
前述实施例显示了p277(Val6-Val11)肽可保护NOD小鼠。本实验检测了p277(V)在低剂量STZ模型中的治疗功效。
将每组10只的雄性小鼠用每天30mg/kg STZ的剂量处理5天。一周后，用100μg油中的p277(V)，一种由kanfman等1993描述的谷氨酸脱羧酶(GADp34)的肽，它参与NOD小鼠的糖尿病，或单独的油对小鼠进行治疗。在第85天重复这一治疗。在第100天，对小鼠取血样，对血液检测是否高血糖症(葡萄糖浓度大于15mmol/L)。结果总结于图5。可以看出，用GADp34治疗和没有治疗的小鼠组的平均血葡萄糖水平处于高血糖的范围内。相比之下，用p277(V)治疗的小鼠的平均血葡萄糖水平处于正常范围内。因而，p277(V)可有效地用于治疗由STZ在雄性C57BL/ksj小鼠中诱发的糖尿病以及在遗传上不相同的雌性NOD小鼠中产生的自发性糖尿病。p277(V)治疗的应用并不限于仅一种原因引起的糖尿病或仅一种基因型或性别。
本文引用的所有参考文献，包括期刊论文或摘要，公开的或相应的美国或外国专利申请，已授权的美国或外国专利，或其它任一种参考文献，全部引入本文作为参考，包括这些参考文献中全部的数据，表、图和正文。此外，本文参考文献中所引用的参考文献全部内容也全部引入本文作为参考。
对已知的方法步骤、常规的方法步骤、已有的方法或常规的方法的参考并不意味着我们承认本发明的任一方面、描述或实施方案已在这些相关文献中被公开、教导或提示。
前文对特定实施例的描述对本发明的总体的性质进行了完整的披露，其他人应用本领域技术的知识(包括本文引用的参考文献)可容易地对这些特定实施例进行修改和调整，而不需要进行过多的实验，也不偏离本发明的总体内容。因而，基于本文的教导和指示，这些调整和修改应包含于本文公开的实施例等同意思和范围之内。本文的措辞和用语应被理解为为了更清楚描述的目的，而不是限定其范围。本说明书的措辞和用语应由本技术领域的普通技术人员根据本文的教导和指示，并结合本领域普通技术人员的现有知识进行解释。
参考文献
Bendelac A，Carnaud C，Boitard C，Bach JF.(1987)Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NODice to healthy neonates.Requirement for both L3T4+and Ly+-2+T cells.J Exp Med，166：823-32.
Bowman MA，Leiter EH and Atkinson MA.(1994)prevention of diabetes in the NOD mouse：implications fortherapeutic intervention in human disease.Immunology Todav，15：115-20.
Castano L，Eisenbarth GS.(1990)Type-I diabetes：achronic autoimmune disease of human，mouse，and rat.Annu RevImmunol.8：647-79.
Elias，Dana.(1994)The NOD mouse：A model forautoimmune insulin-dependent diabetes.Autoimmune DiseaseModels，A Guidebook，pp147-61.
Elias D，Msrkovits D，Reshef T，van-Der Zee R andCohen IR(1990)Induction and therapy of autoimmune diabetesin the non-obese diabetic(NOD/Lt)mouse by a 65-kDa hestshock protein.proc Natl Acad Sci USA，87：1576-80.
Elias D，prigozin H，polak N，Rapoport M，Lohse AW，Cohen IR(1994)Autoimmune diabetes induced by the b-celltoxin streptozotocin.Diabetes，43：992-98.
Elias D，Reshef T，Birk OS，van der Zee R，WalkerMD，Coher IR.(1991)Vaccination against autoimmune mousediabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shockprotein.Proc Natl Acad Sci USA，88：3088-91.
Elias D.and Cohen IR.(1994)peptide therapy fordiabetes in NOD mice The Lancet 343：704-06.
Kaufman DL，Clare-Salzler M，Tian J，Forsthuber T，Ting GSp，Robinson P，Atkinson MA，Sercarz EE，Tobin AJ，Lehmann PV.(1993)Spontaneous loss of T-cell tolerance toglutamic acid decarboxylase in murine insulin-dependentdiabetes.Nature，366：69-72.
Like AA，Rossini AA(1976)Streptozotocin-inducedpancreatic insulitis：new model of diabetes mellitus.Science，193：415-17.
Mosmann T.R.and Coffman R.I.(1989)Ann RevImmunol，7：145-73.
Tisch R，Yang XD，Singer SM，Liblav RS，Fuggar L，McDevitt HO.(1993)Immune response to glutamic aciddecarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabeticmice.Nature，366：72-75.
                           序列表(1)总信息表(i)申请人：
(A)名称：耶达研究与发展有限公司
(B)街道：P.O.Box95
(C)城市：Rehovot
(E)国家：以色列
(F)邮编：76100
(A)名称：伊伦·R·科恩
(B)街道：11 Hankin Street
(C)城市：Rehovot
(E)国家：以色列
(F)邮编：76354
(A)名称：戴娜·埃利亚斯
(B)街道：57 derech Yavne
(C)城市：Rehovot
(E)国家：以色列
(F)邮编：76344
(A)名称：马提蒂亚胡·弗里德金
(B)街道：23 Miller Street
(C)城市：Rehovot
(E)国家：以色列
(F)邮编：76284(ii)发明名称：肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物(iii)序列数目：10(iv)计算机可读形式
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申请资料
(A)申请号：IL 112094
(B)申请日：21-DEC-1994(vi)在先申请资料
(A)申请号：IL 114460
(B)申请日：05-JUL-1995(2)SEQ ID NO：1的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro1           5                       10                  15                  20  Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：2的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(ix)特点：
(A)名称/关键词：肽
(B)位置：6，11，19
(D)其它资料：/注＝“在6/11位的Xaa＝Cys或Val；在19位的Xaa＝Thr或Lys；其中，当19位的Xaa是Thr时，在6/11位的Xaa不都是Cys.”(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Val Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa1               5                   10                  15Pro Ala Asn Glu Asp20(2)SEQ ID NO：3的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：4的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(ix)特点：
  (A)名称/关键词：肽
  (B)位置：19
  (D)其它资料：/注＝“在19位的Xaa是Thr或Lys”(ix)序列描述：SEQ ID NO：4：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：5的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：6的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(ix)特点：
(A)名称/关键词：肽
(B)位置：19
(D)其它资料：/注＝“19位的Xaa是Thr或Lys”(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：7的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：8的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽  (ix)特点：
(A)名称/关键词：肽
(B)位置：19
(D)其它资料：/注＝“19位的Xaa是Thr或Lys”(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：9的资料(i)序列特征：
(A)长度：24个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys Pro1               5                   10                  15                  20Ala Asn Glu Asp(2)SEQ ID NO：10的资料(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Asn Glu Asp Gln Lys Ile Gly Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile1               5                   10                  15

Claims (35)

1.一种序列I的肽和其盐及其功能衍生物：
                     6                 11
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-
                                                     (I)
                    19
Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQ ID NO：2)其中X1和X2各自是Cys或Val残基，而X3是Thr或Lys残基，但当X3是Thr时X1和X2不能均为Cys残基。
2.根据权利要求1所述的本文称作p277(Val6)的肽，其中X1是Val，X2是Cys和X3是Thr。
3.根据权利要求1所述的本文称作p277(Val11)的肽，其中X1是Cys，X2是Val和X3是Thr。
4.根据权利要求1所述的本文称作p277(Val6-Val11)的肽，其中X1和X2均为Val和X3为Thr。
5.根据权利要求1所述的本文称作p277(Lys19)的肽，其中X1和X2均为Cys和X3为Lys。
6.根据权利要求1所述的本文称作p277(Val6-Lys19)的肽，其中X1是Val，X2是Cys和X3是Lys。
7.根据权利要求1所述的本文称作p277(Val11-Lys19)的肽，其中X1是Cys，X2是Val和X3是Lys。
8.根据权利要求1所述的本文称作p277(Val6，11-Lys19)的肽，其中，X1和X2均为Val和X3是Lys。
9.将根据权利要求1-8中任意一项的肽用于诊断胰岛素依赖性糖尿病(下文称作IDDM)。
10.一种诊断病人是否患有或开始患有IDDM的方法，包含将权利要求1-8中任意一项的肽用作抗原检测所说病人的血液或尿中与人hsp60免疫反应的抗体或T细胞的存在。
11.根据权利要求10所述的方法，包含对所说病人检测抗-hsp60抗体或与hsp60免疫反应的T细胞的存在，其中，表明抗-hsp60抗体或与hsp60免疫反应的T细胞的存在为阳性的结果即表明很可能患有或开始患有IDDM。
12.根据权利要求10或11所述方法，其中对所说病人检测的是抗-hsp60抗体的存在。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该检测方法包含放射免疫测定。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该检测方法包含ELISA测定。
15.一种使用权利要求10至14中任意一项所述的方法检测抗-hsp60抗体的存在进行诊断是否患有IDDM的试剂盒，包含：
(i)一种权利要求1中所述序列(I)肽抗原；和
(ii)一种可识别所说待测抗-hsp60抗体的恒定区域的标记抗体。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所说抗原是权利要求2至8中任意一项的肽。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中所说抗原在一固相上固定化。
18.根据权利要求15至17中任意一项所述的试剂盒，还包括使用该试剂盒诊断IDDM的说明书。
19.根据权利要求15至18中任意一项所述的试剂盒，其中该标记物选自下组：放射性同位素，酶，发色团和发荧光团。
20.根据权利要求10或11所述的方法，其中对所说病人检测的是与hsp60免疫反应的T细胞的存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，包含T细胞增殖检测的检测方法，包含下列步骤：
(i)从所说病人的血样中制备含有T细胞的单核细胞群组；
(ii)向所说单核细胞群组中加入一种选自权利要求1的肽抗原；
(iii)将所说细胞群组在所说抗原的存在下并在适宜的培养条件下温育一段适当长的时间。
(iv)在所说温育时间结束前的适当时间，向(iii)的温育的细胞培养物中加入标记的核苷酸，以使所说标记的核苷酸可掺入增殖T细胞的DNA中；和
(v)通过分析标记核苷酸掺入所说T细胞的量来确定增殖T细胞的量。
22.根据权利要求20所述的方法，其中包含T细胞细胞分裂响应检测的检测方法包含以下步骤：
(i)从所说病人的血样中制备含有T细胞的单核细胞群组；
(ii)向所说单核细胞群组中加入选自权利要求1的肽抗原；
(iii)在适宜的培养条件下将所说细胞组群在所说抗原的存在下温育一段适当长的时间；和
(iv)检测响应的淋巴细胞分泌至培养基中的细胞分裂素(Cytokine)的存在。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，该细胞分裂素是IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，或TGFβ。
24.一种根据权利要求10，11和21中任意一项所述的方法检测与hsp60免疫反应的T细胞的存在来诊断IDDM的试剂盒，包含：
(i)一种根据权利要求1所述的肽抗原；
(ii)一种标记的核苷酸；和
(iii)一种用于培养淋巴细胞的适当的培养基。
 25.一种根据权利要求10、11、22和23中任意一项的方法检测与hsp60免疫反应的T细胞的存在来诊断IDDM的试剂盒，包含：
(i)一种权利要求1所述肽抗原；
(ii)一种用于培养淋巴细胞的适当的培养基；和
(iii)一种用于检测由响应的淋巴细胞分泌至培养基中的细胞分裂素的存在的检测试剂盒。
26.根据权利要求22至25中任意一项所述试剂盒，还包括使用该试剂盒诊断IDDM的说明书。
27.根据权利要求20所述的方法，其中选自权利要求1肽的所说抗原是通过皮下注射给病人的，然后观察可检测的皮肤反应的发生。
28.一种预防或治疗IDDM的制剂，包含选自下组的T细胞产物：(a)表现出对人hsp60的p277序列具有特异性的人T细胞，该细胞已在权利要求1所述序列I肽存在下进行温育而被活化；(b)已被照射或通过其它方式而减毒的人T细胞；(c)已经受了静水压压力处理、用化学交联剂进行的处理和/或用细胞骨架交联剂进行的处理的人T细胞；(d)(a)(b)或(c)中T细胞的碎片或从其表面脱落的表面蛋白质；或(e)基本上由对所说蛋白质具特异性的(a)的受体的可变区域组成的肽，或其盐、功能衍生物、前体或活性片段。
29.根据权利要求28所述的制剂，其中(a)的所说人T细胞是得自被治疗的IDDM病人的自体T细胞，并且该T细胞的所说特异性是通过在体外与所说序列I的肽相接触而产生的。
30.根据权利要求28或29所述的制剂，其中所说T细胞在体外产生对权利要求1的序列I的肽的特异性。
31.一种药物组合物，包含权利要求1的序列I肽和药用可接受的载体。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，用于预防和治疗IDDM。
33.根据权利要求31或32所述的药物组合物，其中所说的肽是根据权利要求2至8中任意一项的肽。
34.根据权利要求1至8中任意一项所述的肽，用于制备治疗IDDM的药物组合物。
35.一种预防和治疗IDDM的方法，包含给人个体施用有效量的存在于适当载体中的根据权利要求1的序列I肽。
CNB95197680XA 1994-12-21 1995-12-20 肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物 Expired - Lifetime CN1233417C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL11209494A IL112094A0 (en) 1994-12-21 1994-12-21 Novel peptides and pharmaceutical compositions comprising them
IL112094 1994-12-21
IL114460 1995-07-05
IL11446095A IL114460A0 (en) 1995-07-05 1995-07-05 Peptide p277 analogs and pharmaceutical compositions comprising them for treatment or diagnosis of diabetes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1175214A true CN1175214A (zh) 1998-03-04
CN1233417C CN1233417C (zh) 2005-12-28

Family

ID=26322965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB95197680XA Expired - Lifetime CN1233417C (zh) 1994-12-21 1995-12-20 肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物

Country Status (31)

Country Link
EP (1) EP0820303B1 (zh)
JP (2) JP3420245B2 (zh)
KR (1) KR100400480B1 (zh)
CN (1) CN1233417C (zh)
AR (1) AR002949A1 (zh)
AT (1) ATE242005T1 (zh)
AU (1) AU707835B2 (zh)
BR (1) BR9510102A (zh)
CA (1) CA2208274C (zh)
CZ (1) CZ293784B6 (zh)
DE (2) DE820303T1 (zh)
DK (1) DK0820303T3 (zh)
ES (1) ES2201137T3 (zh)
FI (1) FI118373B (zh)
HR (1) HRP950612B1 (zh)
HU (1) HU224160B1 (zh)
IL (1) IL116499A0 (zh)
IS (1) IS1966B (zh)
MX (1) MX9704738A (zh)
NO (1) NO317350B1 (zh)
NZ (1) NZ301440A (zh)
PL (1) PL184145B1 (zh)
PT (1) PT820303E (zh)
RO (1) RO116777B1 (zh)
RS (1) RS49517B (zh)
SI (1) SI0820303T1 (zh)
TR (1) TR199501630A2 (zh)
TW (1) TW496872B (zh)
UA (1) UA42040C2 (zh)
UY (1) UY24130A1 (zh)
WO (1) WO1996019236A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104418948A (zh) * 2013-09-10 2015-03-18 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备多肽药物的方法
CN104650209A (zh) * 2013-11-19 2015-05-27 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽药物DiaPep277 的合成方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6488933B2 (en) 1995-07-05 2002-12-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Preparations for the treatment of T cell mediated diseases
DE69724619T2 (de) * 1996-05-14 2004-07-01 Winnacker, Ernst-Ludwig, Prof. Chaperone, die prionproteine binden und zwischen den isoformen prpc und prpsc unterscheiden können
EP1335741A4 (en) * 2000-08-25 2005-10-26 Yeda Res & Dev METHOD FOR THE PREVENTION OF AUTOIMMUNE DISEASES WITH CpG-CONTAINING POLYNUCLEOTIDES (04.03.02)
IL140233A0 (en) * 2000-12-11 2002-02-10 Peptor Ltd Backbone cyclized analogs of heat shock proteins
WO2003063759A2 (en) 2002-01-31 2003-08-07 Peptor Ltd. Hsp peptides and analogs for modulation of immune responses via antigen presenting cells
CA2595520A1 (en) 2004-01-28 2005-08-11 Develogen Israel Ltd. Hsp therapy in conjunction with a low antigenicity diet
DE102004043750A1 (de) * 2004-09-10 2006-03-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Formulierungen des Peptids p277 oder dessen Varianten mit optimierter Stabilität
CN100352502C (zh) * 2004-12-29 2007-12-05 中国药科大学 能通过免疫防治ⅰ型糖尿病的重组蛋白和重组基因
US8691772B2 (en) 2005-01-04 2014-04-08 Yeda Research And Development Co. Ltd. HSP60, HSP60 peptides and T cell vaccines for immunomodulation
EP1858545A2 (en) * 2005-03-04 2007-11-28 Curedm Inc. Methods and pharmaceutical compositions for treating type 1 diabetes mellitus and other conditions
EP2295066B1 (en) 2005-05-25 2016-04-27 CureDM Group Holdings, LLC Peptides, derivatives and analogs thereof, and methods of using same
JP4283812B2 (ja) * 2006-01-06 2009-06-24 財団法人工業技術研究院 重症筋無力症の診断方法およびそのキット
WO2008064306A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 Curedm, Inc. Methods and compositions relating to islet cell neogenesis
MX337147B (es) 2007-08-30 2016-02-15 Curedm Group Holdings Llc Composiciones y metodos para utilizar peptidos proislet y sus analogos.
CU23701A1 (es) * 2008-12-29 2011-09-21 Ct Ingenieria Genetica Biotech Método de tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y diabetes tipo i
CN104203263A (zh) 2012-03-01 2014-12-10 耶达研究与发展有限公司 利用HSP60衍生肽再生胰岛β细胞
WO2013128450A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Hsp60 derived peptides and peptide analogs for suppression and treatment of non-autoimmune diabetes
CN104650244B (zh) * 2015-01-21 2017-12-08 中国药科大学 一种具有降血糖兼调脂作用的表位组合肽及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5114844A (en) * 1989-03-14 1992-05-19 Yeda Research And Development Co., Ltd. Diagnosis and treatment of insulin dependent diabetes mellitus

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104418948A (zh) * 2013-09-10 2015-03-18 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备多肽药物的方法
CN104418948B (zh) * 2013-09-10 2019-08-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种制备多肽药物的方法
CN104650209A (zh) * 2013-11-19 2015-05-27 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽药物DiaPep277 的合成方法
CN104650209B (zh) * 2013-11-19 2018-04-06 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽药物DiaPep277 的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR100400480B1 (ko) 2003-12-31
RS49517B (sr) 2006-10-27
UY24130A1 (es) 1996-06-11
NO972849D0 (no) 1997-06-19
WO1996019236A1 (en) 1996-06-27
JPH10511649A (ja) 1998-11-10
FI972669A (fi) 1997-08-15
MX9704738A (es) 1997-10-31
CA2208274C (en) 2005-12-06
HU224160B1 (hu) 2005-06-28
ES2201137T3 (es) 2004-03-16
TW496872B (en) 2002-08-01
FI972669A0 (fi) 1997-06-19
AR002949A1 (es) 1998-05-27
NO317350B1 (no) 2004-10-18
IS1966B (is) 2004-12-15
PL321091A1 (en) 1997-11-24
EP0820303A1 (en) 1998-01-28
PL184145B1 (pl) 2002-09-30
IS4510A (is) 1997-06-19
JP3420245B2 (ja) 2003-06-23
HRP950612B1 (en) 2003-12-31
SI0820303T1 (en) 2003-10-31
DE69531004D1 (de) 2003-07-10
JP3554319B2 (ja) 2004-08-18
AU707835B2 (en) 1999-07-22
CA2208274A1 (en) 1996-06-27
AU4686696A (en) 1996-07-10
NZ301440A (en) 2000-01-28
EP0820303B1 (en) 2003-06-04
HUT78092A (hu) 1999-09-28
HRP950612A2 (en) 1997-10-31
RO116777B1 (ro) 2001-06-29
PT820303E (pt) 2003-10-31
IL116499A0 (en) 1996-03-31
TR199501630A2 (tr) 1996-07-21
ATE242005T1 (de) 2003-06-15
DK0820303T3 (da) 2003-10-06
DE69531004T2 (de) 2004-02-05
JP2004026797A (ja) 2004-01-29
DE820303T1 (de) 1999-05-20
UA42040C2 (uk) 2001-10-15
CZ190897A3 (en) 1997-11-12
YU78795A (sh) 1998-05-15
BR9510102A (pt) 1997-11-25
NO972849L (no) 1997-08-13
FI118373B (fi) 2007-10-31
CN1233417C (zh) 2005-12-28
EP0820303A4 (zh) 1998-03-11
CZ293784B6 (cs) 2004-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1175214A (zh) 肽p277类似物及含有它们的诊断和治疗糖尿病的药物组合物
CN1188485A (zh) 胰高血糖素样肽-2及其治疗应用
JPH09503387A (ja) クローン化されたグルタミン酸デカルボキシラーゼ
CN1102598C (zh) 由人热激蛋白60衍生的新型肽类及其组合物和应用
CN105079781A (zh) 用于治疗乳糜泻的组合物和方法
CN1357006A (zh) 由hlaii类分子呈递的mage－a1肽
CN1735428A (zh) 伴侣蛋白10的免疫抑制作用
US6180103B1 (en) Peptide p277 analogs, and pharmaceutical compositions comprising them for treatment or diagnosis of diabetes
CN1102382C (zh) 用于治疗t细胞介导疾病的制剂与方法
CN1571675A (zh) 胰岛素抵抗状态的治疗和诊断
US20230181638A1 (en) Immunogenic peptides with new oxidoreductase motifs
Kozhich et al. Immunogenicity and immunopathogenicity of an autoimmune epitope are potentiated by increasing MHC binding through residue substitution.
RU2159250C2 (ru) АНАЛОГИ ПЕПТИДА p277 И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ДИАБЕТА
CN1191493A (zh) 体内糖尿病检测
Woodfolk Human T cell repertoires associated with distinct immune responses: studies using recombinant proteins and antigenic peptides from Trichophyton rubrum
CN1393455A (zh) 一种多肽——锌指蛋白－57.86和编码这种多肽的多核苷酸
CN1393471A (zh) 一种多肽——锌指蛋白－78.54和编码这种多肽的多核苷酸
CN1341619A (zh) 一种新的多肽——人含信号肽酶i特征性序列片段的蛋白8.91和编码这种多肽的多核苷酸
CN1345732A (zh) 一种新的多肽——f－盒蛋白44.33和编码这种多肽的多核苷酸
CN1359946A (zh) 一种新的多肽——人锌指蛋白184－63.47和编码这种多肽的多核苷酸
CN1425682A (zh) 一种多肽－含核糖体蛋白l16结构域的蛋白—11.99和编码这种多肽的多核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20051228

EXPY Termination of patent right or utility model