CN1102382C - 用于治疗t细胞介导疾病的制剂与方法 - Google Patents

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Abstract

可代谢的脂质乳浊液，如Intralipid和Lipofundin，是对自身免疫疾病和其它TH1 T细胞介导疾病进行肽治疗的理想载体，因为它可以促使从TH1向TH2细胞因子的转换。这样的乳浊液可以和T细胞介导疾病发病相关的炎症性T细胞识别的抗原一起使用，用以该疾病的治疗。

Description

用于治疗T细胞介导疾病的制剂与方法
本发明涉及T细胞介导疾病的疫苗治疗，具体地说涉及含有与T细胞介导疾病(如自身免疫病)发病相关的T细胞所识别的抗原和作为生物活性载体的可代谢脂质乳浊液的医疗制剂。
自身免疫失调，如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM或I型糖尿病)，脑脊髓多发性硬化，风湿性关节炎和甲状腺炎，其特点是免疫系统对内源抗原有反应性，结果导致组织损伤。这些对自身抗原的免疫反应是通过对自身反应性T淋巴细胞的持续激活而得以维持的。
CD4“辅助”型T细胞依其受刺激后分泌的特征性细胞因子的不同可分为二组(Mosmann and Coffman，1989)。TH1细胞分泌的IL-2可诱导T细胞增殖，而其分泌的IFN等细胞因子则介导组织炎症。TH2细胞则不同，它分泌IL-4和IL-10。IL-4辅助T细胞分泌一定类型的IgG同种型抗体，并且抑制TH1炎症性细胞因子的产生(Banchereau等，1994)。IL-10通过影响巨噬细胞抗原呈作用和炎症因子的产生而间接抑制TH1的活化(Moore等，1993)。正是TH1细胞导致器官特异的自身免疫疾病的发生。TH1型反应亦见于其他T细胞介导疾病如接触性皮炎(Romagnani，1994)。
适于作为自身免疫的特异性免疫治疗的肽正是那些被自身免疫性疾病相关的T细胞所识别的肽。每一种自身免疫病有其理想的肽适于治疗。如多发性硬化涉及与髓鞘质碱性蛋白(MBP)等自身抗原反应的T细胞(Allegrefa等，1990)，它就需要MBP肽来治疗，如Ota等(1990)对此就有过叙述。
本发明人证实，自身免疫疾病，如I型糖尿病，可使用置于油性载体上的合适的肽而得到治疗。NOD小鼠因自身免疫T细胞攻击胰岛中产生胰岛素的β细胞而自然诱发糖尿病。这种自身免疫攻击涉及到对许多自身抗原，包括60K D热激蛋白(hsp60)以及谷氨酸脱羧酶(GAD)，有反应性的T细胞。因此，如在NOD/Lt品系自发产生的糖尿病，就可以用相当于人hsp60序列位点437-460的被称为p277的肽进行治疗(PCT专利公布号WO 90/10449；D.ELias和I.R.Co hen，NOD小鼠糖尿病的肽治疗，The Lancet 343：704-706，1994)；或采用p277的变体(位点6和/或11的Cys残基被Val残基取代，和/或位点16的Thr残基被Lys取代，见PCT公布号WO 96/19236)进行治疗；或采用称为p12和p32的肽(分别相当于人hsp60序列位点166-185，466-485)进行治疗。见本申请申请人的以色列专利申请号114,407，于1995年6月30日申请。亦见PCT申请号PCT/US96...，申请于1996年7月1日(要求上述以色列申请号114,407的优先权)，其全部内容引入本文作为参考。
本发明人发现，将p12，p32和p277或其变体，置于如不完全弗氏佐剂(IFA)的矿物油乳浊液这样的油性载体之上皮下施用，这种治疗IDDM的肽疗法是有效的。然而，IFA以及完全弗氏佐剂(CFA，含有各种数量的灭活的分枝杆菌菌体的矿物油制剂)不允许用于人体，因为矿物油是不可代谢的，在体内不被降解。因而，人们希望发现用于肽治疗的可代谢的有效载体。
某些脂肪乳浊液作为人静脉营养补给已使用了多年。已商品化的2种脂肪乳浊液。称为Intralipid(Intralipid乃是瑞典KabiPharmacia公司用于静脉营养补给的一种脂肪乳浊液的注册商标，US专利号3,169,094中有描述)和Lipofundin(德国B，Braun Melsungen公司的注册商标)，均以大豆油作为脂肪(1000ml蒸馏水含有100或200g：分别为10％或20％)。Intralipid中以卵黄磷脂作为乳化剂(12g/L蒸馏水)，而Lipofundin则使用卵黄卵磷脂。在Intralipid和Lipofundin中均添加甘油(25g/l)以达等渗态。这些脂肪乳浊液十分稳定，已用于胃肠道或中枢紊乱病人的静脉营养补给，因为这些病人不能通过正常饮食获取营养，只能靠这些能量维持生命。正常剂量每天为1升。
1978年2月14日颁发给Wretlind等的US专利4073943，以及1990年5月29日对1979年9月18日颁发给Wretlind等的专利4,168,308重新颁发的专利Re,32,393，二者均阐述了这样的一个载体系统；它能促进胃肠外，特别是静脉，使用具有药理活性的脂溶性制剂；它是一个稳定的油/水乳浊液，包含分散于亲水相的呈药理惰性的类脂疏水相；该乳浊液中的脂质均匀分散，平均粒径小于1微米，从而获得满意的治疗效应的迅速启动；该载体系统是与有效剂量的所说的以疏水相中的一定比率溶于类脂之中的药理活性脂溶性制剂一起使用的，而治疗效果来自上述活性制剂的有效剂量。据称，此载体系统适用于水不溶制剂，或者水溶脂溶性药理活性制剂，但该制剂主要溶于脂相。这样的药理活性剂有抑制剂、麻醉剂、止痛剂、刺激剂、解痉剂、肌肉松驰剂、血管松驰剂以及诊断试剂(如x-射线衬剂)等。据说该系统在促进制剂的诊断或治疗效应的快速启动的同时，伴随有对体组织损伤的减少。
Intralipid被提议用作疫苗的几种佐剂的非刺激性载体，比如6-O-(2-十四烷基-十六烷酰基)-和6-O-(3-羟基-2-二十二烷基二十六烷酰)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氮酰-D-异谷氨酰胺(Tsujimoto等，1986和1989)，avridine(Woodard and Jasman，1985)，N，N-2-二十八烷基-N’，N’-双(2-羟乙基)丙二胺(CP-20，961)(德国专利申请DE2945788；Anderson and Reynolds，197 9；Niblack等，1979)。Kristiansen and Sparrman 1983揭示血凝素和神经氨酸苷酶在吸附到含有Intralipid的脂质颗粒上后对小鼠的免疫原性大大提高。
所有上述出版物都没有阐述Intralipid作为肽载体用于自身免疫病的治疗，也没有揭示Intralipid可以介导免疫反应从TH1型反应向TH2型反应的转换。
现已发现，可代谢的脂质乳浊液，如Intralipid和Lipofundin，可以作为对自身免疫病和其它TH1 T细胞介导的疾病进行肽治疗的载体。进一步发现，该活性与TH1向TH2细胞因子转换有关。
因而本发明涉及一种用于治疗自身免疫疾患或其它T细胞介导疾病的医用制剂，包括一种肽或其它抗原以及一种生物活性脂质载体，其中该肽或其它抗原是一种与该疾患发病机理相关的炎症T细胞识别的肽或抗原，而该生物活性脂质载体是一种脂肪乳浊液，包含10-20％植物和/或动物来源的甘油三酯，1.2-2.4％植物和/或动物来源的磷酯，2.25-4.5％渗透压调节剂，0-0.05％防氧化剂，加无菌水至100％。
植物或动物来源的甘油三酯和磷脂可取自任何适宜的植物油，比如大豆油，棉籽油，可可油或橄榄油，或取自卵黄或牛血清。优选该三酰甘油来自大豆油，磷脂则来自大豆油或卵黄。三酰甘油/磷脂重量比最好是8∶1。
任何合适的渗透压调节剂都可以加入该脂质乳浊液，但最好是甘油，木糖醇或山梨醇。该脂肪乳浊液可任选地含有一种抗氧化剂，此如0.05％生育酚。
作为本发明的一个具体方案，前面定义的脂肪浮浊液可经离心处理，如10,000g或更高，这样形成较小的富含甘油三酯(约95％甘油三酯)的上层，下层水分散相则富含磷脂，其甘油三酯/磷酯之比约为1∶1。下层水分散相被用作本发明制剂的脂质载体。
在本发明的一个优选实施方案中，上述制备剂是用于治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的，它包含一种衍生于与IDDM发病机理相关的炎症T细胞所识别的人热激蛋白60(hsp60)的肽，其中该肽为选自下表的一组肽：
                      表1肽          SEQ ID NO：            氨基酸序列(单字母代码)p3           1(31-50)               KFGADARALMLQGVDLLADAp10          1(136-155)             NPVEIRRGVMLAVDAVIAELp11          1(151-170)             VIAELKKQSKPVTTPEEIAQp12          1(166-185)             EEIAQVATISANGDKEIGNIp14          1(195-214)             RKGVITVKDGKTLNDELEIIp18          1(255-274)             QSIVPALEIANAHRKPLVIIAp20          1(286-305)             LVLNRLKVGLQVVAVKAPGFp24          1(346-365)             GEVIVTKDDAMLLKGKGDKAp29          1(421-440)             VTDALNATRAAVEEGIVLGGp30          1(436-455)             IVLGGGCALLRCIPALDSLTp32          1(466-485)             EIIKRTLKIPAMTIAKNAGVp35          1(511-530)             VNMVEKGIIDPTKVVRTALLp39          1(343-366)             GKVGEVIVTKDDAMp277         1(437-460)             VLGGGCALLRCIPALDSLTPANEDp277(Val6)      *2                 VLGGGVALLRCIPALDSLTPANEDp277(Val11)     **3                VLGGGCALLRVIPALDSLTPANEDp277(Val6-Val11) ***4             VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED*SEQ ID NO：1的437-460，其中C-442变为V**SEQ ID NO：1的437-460，其中C-447变为V***SEQ ID NO：1的437-460，其中C-442，C-447变为V。
本发明还涉及对患有自身免疫疾病或其它TH1介导的疾病的病人的治疗方法，包括给该病人施用有效量的本发明所述的医疗制剂。
附图简要说明
图1显示，用存在于(I)Intralipid或(II)磷酸盐缓冲液(PBS)中的肽p277(Val6-Val11)处理NOD小鼠后，抗体的产生情况。叙述见实施例2。
图2显示，用Intralipid中的肽p277(Val6-Val11)处理NOD小鼠，诱导TH2依赖性抗体同种型产生。叙述见实施例3。
图3A-B显示，p277(Val6-Val11)/Intralipid治疗导致NOD小鼠对p277(Val6-Val11)肽反应的T细胞所产生的细胞因子模式的特异性转换。叙述见实施例4。图3A显示，用存在于Intralipid中的p277(Val6-Val11)肽处理小鼠和用p277(Val6-Val11)肽温育脾细胞后，观察到TH1细胞因子(IL-2，IFN-γ)的减少，以及TH2细胞因子(IL-4，IL-10)的增加。图3 B显示，用Inhalipid中的p277(Val6-Val11)肽处理小鼠，和用ConA温育脾细胞后，没有任何细胞因子的改变。
图4显示，在用Intralipid中的p277(Val6-Val11)肽处理后，T细胞对p277(Val6-Val11)自发增殖反应减弱，叙述见实施例5。
图5显示，用Intralipid中的髓鞘质碱性蛋白的肽p71-90处理小鼠降低了实验性自身免疫脑炎(EAE)的严重性。叙述见实施6。
图6显示，用IFA中的髓鞘质碱性蛋白的肽p71-90处理小鼠降低了实验性自身免疫脑炎(EAE)的严重性，叙述了实施例6。
根据本发明，我们发现用合适载体承载的p277(Val6-Val11)肽处理可以向下调节T细胞对hsp60和GAD表位的自发性增殖反应，破坏了针对hsp60、GAD和胰岛素的自身抗体的产生。致病过程的扼制与T细胞耐受或麻痹无关，而是与p277(Val6-Val11)反应的自身免疫T细胞产生的细胞因子从TH1样模式(IL-2，IFN-γ)向TH2样模式(IL-4，IL-10)的转变有关。这种调节是免疫特异性的：处理小鼠对细菌hsp60肽的自发性T细胞反应仍保持TH1模式。因此，针对几种自身抗原的自身免疫为特征的糖尿病发生过程可以通过使用这些抗原之一而得到治疗，例如使用肽p277(Val6-Val11)。
p277(Val6-Val11)治疗与对p277(Val6-Val11)反应性从T细胞增殖向抗体的改变之间关联，表明治疗效果产生于处理小鼠自身免疫T细胞产生的主要细胞因子的转变。TH1细胞分泌的IL-2诱导T细胞增殖，而分泌的IFN-γ等细胞因子则介导组织炎症，因而导致疾病发生；相比之下TH2细胞则分泌IL-4和IL-10。IL-4帮助B细胞分泌某些IgG同种型抗体，而抑制TH1炎症细胞因子的产生。IL-10通过影响巨噬细胞抗原提呈作用和炎症细胞因子的产生而间接抑制TH1活化。因此，TH1细胞抑制TH2活性(见Liblau等，1995)。分析p277(Val6-Val11)治疗前后所产生的抗体同种型的结果支持了TH1向TH2样行为转换的事实。
结合于脂质载体上的肽的疗效机理被证明涉及TH1→TH2细胞因子的转换，这一事实提供了利用TH1→TH2转换作为治疗的有效性和诱导了有益反应的证据的可能性。换言之，TH1→TH2转换可以作为对治疗有反应的替代性标志。例如，缺乏转换表示需要进行第二次治疗。见以色列专利申请号114,459，于1995年7月5日申请。亦可见于同一日期申请的相应的PCT申请，其全部内容引入本文作为参考。
本发明的脂质乳浊液，当作为疫苗佐剂与被治疗的疾病所涉及的T细胞能与之反应的抗原物质一起使用时，介导了处理前TH1 T细胞反应向处理后TH2 T细胞反应的转换。这一发现证实，这样的脂质乳浊液是耐受原性的生物活性载体，可被用在治疗任何TH1介导的疾病的疫苗中。在这样的疫苗中，抗原提供疗效的免疫特异性，而本发明的生物活性载体则提供了生物学效应，即TH1→TH2转换。由于本发明的上述生物活性载体介导的转换，一系列自身反应性疾病可以通过使用一种可诱导T细胞细胞因子转换的抗原/载体组合加以治疗。
本发明的一个优选用途为用于治疗由TH1细胞介导的器官特异性的自身免疫病。这样的疾病包括但不限于诸如IDDM、风湿性关节炎、多发性硬化和甲状腺炎等自身免疫性疾病。用于这种治疗的肽是一种自身抗原肽。因此，举例来讲，对IDDM而言，该肽是上面提到的p277肽，或其缬氨酸替代类似物p277(Val6-Val11)；对多发性硬化而言，该肽衍生于髓鞘质碱性蛋白；对甲状腺炎而言，该肽被认为衍生于甲状腺球蛋白；对风湿性关节炎而言，自身抗原原则衍生于分枝杆菌，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculo sis)。
该抗原是否为肽并不重要。因此，举例而言，对TH1介导的过敏反应，其结果是皮肤过敏和发炎，如接触性皮炎，可以使用这样的疫苗来治疗：包括刺激性抗原和本发明的可以引起细胞因子反应从TH1型向TH2型转换的生物活性载体。因此，虽然病人继续维持针对抗原的高水平的抗体，但造成皮肤发炎的炎症性T细胞反应则被抑制。
因而，本发明的耐受原性生物活性载体可以在需要对T细胞攻击的抗原产生耐受的任何时候使用，即，当疫苗被用以限制T细胞介导疾病，特别是TH1细胞介导疾病的任何时候。如果可以确定在移植物排拆或移植物抗宿主疾病中是何种抗原激活此反应，那么使用这样的抗原和本发明的载体就可以指望促使从不希望的炎症性TH1反应向更为期望的TH2反应转换，不管在这种情况下能与T细胞反应的抗原数目总体上的复杂性。
为了确定肽激活后T细胞分泌的细胞因子，用体外激活分析法检测人外周血中的淋巴细胞。从置于ficol-hypaque中的肝素化全血中分离外周血淋巴细胞，与5-50μg/ml浓度的供试肽培养。在不同时间收集培养细胞上清液，按ELISA或生物活性检测法检验不同细胞因子的活性。
可以用于本发明制剂的脂肪乳浊液的例子包括，但不限于：供静脉营养补给的商品化的Intralipid和Lipofundin以及前面提到的US专利NO 3,169,096、4,073.943和4,168,308中描述的脂肪乳浊液，其全部内容引入本文作为参考。然而，本发明发现这些以前用于静脉营养补给的可代谢脂类，可以有效地作为载体用于T细胞介导的疾病的治疗，这是完全出乎意料的。类似地，这些制剂为可以介导TH1→TH2转换的耐受原性生物活性载体这一发现也是完全出乎意料的。
本发明的脂肪乳浊液最好现配现用，或者贮于与空气隔绝的容器密封保存后使用。Intralipid暴露于空气的长期贮存会造成pH降低以及生物活性相应降低。
在一具体方案中，本发明的生物活性载体是这样的乳浊液：含10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油，加灭菌水至100ml(Intralipid 10％)。另一具体方案中，载体是这样的乳浊液：含10％大豆油，2.4％卵黄磷脂，2.5％甘油，加灭菌水至100ml。
还有一方案，该载体是这样的乳浊液：含有5％大豆油，动物来源的5％甘油三酯，例如5％来自黄油的中等链长甘油三酯，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油和加灭菌水至100ml(Lipofundin 10％)。
在本发明的另一具体方案中，该载体为本文限定的原始脂肪浊液经离心(如10,000g或更高)得到的加工后的脂质乳浊液。其中，富含甘油三酯(约95％)的一薄层形成于上，下层含约1∶1某油三酯/磷脂的富集磷脂的水相分散层。分离两相，富集磷脂的水分散层即被用作载体。
本发明的制剂可含有一种或多种肽。例如，对于IDDM的治疗来说，该制剂可含有一种或多种肽p12、p32、p277、p277(Val6)、p277(Val11)、p277(Val6-Val11)、或表1的其它肽中的任意一种。在一优选实施方案中，用于治疗IDDM的制剂包括一种肽p277或p277(Val6-Val11)及一种脂肪乳浊液，该脂肪乳浊液含有10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油，加灭菌水至100ml(Intralipid10％)。
本发明还涉及将上述本文所限定的脂肪乳浊液，或经离心制备的加工后磷脂富集的水分散相用于制备治疗自身免疫疾病或其它TH1介导疾病的医疗制剂，该制剂包括一种或多种肽或其它抗原和所说的作为载体的脂肪乳浊液或加工后的水分散相。
本发明可由以下非限定性的实施例进一步说明。
实施例1
使用油中p277(Val6-Val11)进行I型糖尿病的肽治疗
验证了各种脂质制剂作为载体对NOD小鼠糖尿病肽治疗的效果。在这个模型中，胰脏中产生胰岛素的β-细胞的自身免疫破坏是由T淋巴细胞介导的。5-8周龄胰岛周围发生炎症性浸润，到14-20周龄导致胰岛素缺乏的β-细胞损伤和外显糖尿病都已显现出来，到了35-40周龄则100％的雌性NOD小鼠都受到影响。
NOD雌性小鼠每只皮下注射0.1ml含100μg肽p277(Val6-Val11)的(I)磷酸盐缓冲液或(II)10％脂质乳浊液，由10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.25％甘油组成，(Intralipid，Kab Pharmacia AB，瑞典)。
6月龄时检查糖尿病发病率和抗p277(Val6-Val11)的抗体的产生率。糖尿病诊断依据是持续高葡萄糖血症，间隔一周至少二次用Beckman Glucose Analyser II测得葡萄糖水平超过11mmol/l。成功的肽治疗如此分析：正常血糖浓度(低于11mmol/l)的维持，胰岛的岛内炎症(胰岛炎)的减轻和作为TH2型免疫反应指标的针对治疗肽的抗体的诱导。结果见2
               表2：6月龄糖尿糖的发生率
治疗                          糖尿病            死亡率(％)
p277(Val6-Val11)/PBS         90                80
p277(Val6-Val11)/Intralipid  45#               20#
无                             100               90
#与非处理NOD小鼠相比P＜0.01
如表2所见，在Intralipid中施用的肽治疗对降低糖尿病和死亡的发生是有效的，而在PBS中使用是无效的。
实施例2
抗p277(Val6-Val11)抗体的产生
用p277(Val6-Val11)肽治疗对糖尿病的保护依赖于TH2对该肽的免疫反应性。因此，用ELISA来测定p277(Val6-Val11)免疫的小鼠中抗体产生情况。取Maxisorp微量滴定板(Nunc)用10μg/mlp277(Val6-Val11)肽包被18小时，用7％奶粉封闭非特异性结合2小时。小鼠血清以1∶50稀释后，结合2小时，特异性结合通过加入碱性磷酸酶抗小鼠IgG(Serotec)保温2小时和对-硝基苯磷酸盐底物(Sigma)保温30分钟进行检测。光密度值由ELISA读数仪(Anthos)在OD＝405nm进行测定。
如图1所示，NOD小鼠用Intralipid中的p277(Val6-Val11)免疫后产生特异性抗体，而当用存在于PBS中的p277(Val6-Val11)免疫后小鼠不表现任何反应。实施例3
p277(Val6-Val11)治疗所诱导的抗体同种型
实施例2中所示的p277(Val6-Val11)Intralipid治疗与针对p277(Val6-Val11)抗体的关联，提示治疗效应可能源自自身免疫性T细胞产生的主导性细胞因子的转换。根据激活时所分泌的特异性细胞因子的不同，CD4“辅助”型T细胞被分成两组(Mosmann andCoffmann，1989)：TH1细胞分泌IL-2，诱导T细胞增殖，而其分泌的诸如IFN-γ等细胞因子则介导组织炎症；与此不同，TH2细胞分泌IL-4，协助B细胞产生某些抗体同种型，以及IL-10和其它细胞因子，抑制组织炎症。从TH1样向TH2样行为的转换的可能性得到了p277(Val6-Val11)治疗后产生的抗体同种型分析的支持。
分组的3月龄NOD小鼠用油中的p277(Val6-Val11)或PBS进行处理，见实施例2中叙述。处理后分析单只小鼠血清针对p277(Val6-Val11)的抗体同种型(每组12-15只小鼠)。抗体同种型是使用同种型特异的抗体试剂(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)进行ELISA分析检测的。结果见图2，其中，对照处理的NOD小鼠中针对p277(Val6-Val11)抗体-空心圈；p277(Val6-Val11)处理的小鼠-实心圈。每个试验的柱状图均显示同等数目鼠的实验结果：小圈数目的明显减少是迭加的结果。
处理后产生的抗p277抗体的抗体同种型分析表明它们无一例外属IgG1和IgG2b类，它们依赖于产生IL-4(Snapper et al，1993a)可能还有TGF-β(Snapper et al，1993b)的TH2 T细胞。p277(Val6-Val11)治疗不诱导TH1型IgG2α抗体。产生针对治疗中所用的肽的特异性的抗体是下述过程的信号：自身免疫T细胞反应已经从叫做TH1的破坏性炎症模式转向产生无害的抗体以及抑制炎症和组织损伤的TH2 T细胞反应(Rabinovitch，1994)。
实施例4
p277(Val6-Val11)/Intralipid治疗诱导细胞因子模式特异性转换
为证实细胞因子转换的观点，分析了p277(Val6-Val11)/Intralipid处理小鼠和对照小鼠中对p277(Val6-Val11)反应活性的T细胞所产生的细胞因子。伴刀豆球蛋白(ConA)，一种T细胞分裂原，用以刺激整个脾T细胞以作对照。
3月龄的10只一组的NOD小鼠，用Intralipid中的p277(Val6-Val11)(实心棒)或Intralipid中的PBS(空心棒)处理(见实施2)。5周后，取下各小鼠的脾，将脾细胞混合在一起。将脾细胞与ConA或p277(Val6-Val11)共孵育24小时(分泌IL-2和IL-4)或48小时(以分泌IL-10和IFN-γ)。培养上清中存在的细胞因子按ELISA计量，依照Pharmingen细胞因子ELISA说明书采用Pharmingen成对抗体。Pharmingen重组小鼠细胞因子作为标准制备标准曲线。简言之，平底96孔微量滴定板用大鼠抗小鼠细胞因子单抗4℃包被18小时，加入培养上清或重组小鼠细胞因子，置4℃18小时。冲洗该板，加入生物素结合的大鼠抗小鼠细胞因子单抗，室温45分钟，然后充分冲洗，加入抗生物素蛋白-碱性磷酸酶。冲冼此板，加入显色底物(对-硝基苯磷酸盐)，在ELISA读数仪上测定样品在405nm吸收值，结果见图3。细胞因子浓度以OD值表示，*P＜0.01。
图3A表明，对照小鼠脾细胞在与p277(Val6-Val11)共孵育后分泌IL-2和IFN-γ。与此不同，p277(Val6-Val11)处理小鼠对与肽p277(Val6-Val11)的反应所产生的1L-2和IFN-γ则明显为低(P＜0.01)这种TH1细胞因子的降低是特异性的；p277(Val6-Val11)处理小鼠保持了对ConA的IL-2和IFN-γ细胞因子反应(图3B)。图3A和3B显示了小鼠脾细胞产生的IL-10和IL-4的量。针对p277(Val6-Val11)或ConA的应答反应，对照鼠产生很少的IL-4或IL-10。而只有在p277(Val6-Val11)/Intralipid处理小鼠中，有明显IL-10和IL-4的升高(P＜0.01)，以产生对p277(Val6-Val11)的应答反应。IL-2和IFN-γ的降低与IL-10和IL-4升高的偶联，证明了从TH1样行为向TH2样行为的转换。这种转换有助于解释发明人以前曾揭示的T细胞对p277增殖效应的降低(Elias et al.，1991)以及本发明的针对p277(Val6-Val11)的IgG1和IgG2b抗体的出现。
实施例5
p277(Val6-Val11)治疗降低了针对p277(Val6-Val11)的自发性T细胞反应
每组5只3月龄NOD/Lt系小鼠背部皮下注射100μg Intralipid中的p277(Val6-Val11)或与Intralipid混合的PBS。5周后，取下小鼠脾脏，用标准方法体外分析T细胞对T细胞分裂原ConA(1.25μg/ml)或p277(Val6-Val11)(10μg/ml)的T细胞增殖反应。结果见图4，其中，ConA-黑条柱；p277(Val6-Val11)-灰柱。T细胞反应以加入四个平行孔中在3天培养期最后18小时加入的[3H]胸腺嘧啶的掺入量测定。刺激指数(SI)以含有抗原孔的供试培养物的平均CPM与不含有抗原或ConA孔中的培养物的平均cpm的比率计算，平均cpm的标准差均低于10％。
如图4所示，PBS/Intralipid处理的对照小鼠对p277(Val6-Val11)和T细胞分裂原ConA均表现T细胞增殖反应。与此不同，用Intralipid中的p277(Val6-Val11)处理小鼠，则表现对p277(Val6-Val11)T细胞增殖反应的降低，但对ConA反应未降低。因此，p277(Val6-Val11)肽治疗的积极效应并非得自失活自身免疫反应，而是源于将自身免疫激活成不同的细胞因子行为模式(Cohen，1995)。破坏性自身免疫的调节是在免疫系统内部进行的(Cohen，1992)；它只需要有肽和脂质载体一起存在的合适信号去激活；肽本身或无肽的脂类均无此效应，见表1。这些结果表明，可代谢的脂质乳浊液可被有效地用作自身免疫疾病治疗载体。第一种疾病需自身特异的肽，但可代谢的脂质乳浊液可被用于多种不同的治疗。
实施例6
Intralipid中肽的使用影响实验性自身免疫脑炎的发生
实验性自身免疫脑炎(EAE)是一种动物的实验性自身免疫病，被认为可以作为多发性硬化各方面的模型(Zamvil andSteinman，1990)。EAE可以在易感大鼠品系，如Lewis大鼠中诱发；用髓鞘质碱性蛋白(MBP)和弗氏完全佐剂(CFA，一种包含有杀死的分枝杆菌的矿物油乳浊液)免疫。免疫约12天后，发生疾病。表现为源于中枢系统炎症的不同程度的瘫痪。瘫痪可持续6或7天，除非在急性瘫痪高峰期死亡，大鼠通常可恢复健康。EAE是由识别MBP分子的一定的决定簇的T细胞引起的。Lewis大鼠中的主要MBP决定簇由肽序列71-90构成(Zamvil and Steinman，1990)。
因此，我们进行实验以检验使用IFA中的脑炎性MBP肽p71-90是否也可以抑制EAE的发生。图5表明，在诱导EAE前14天使用IFA中的p71-90，与IFA中乳化的PBS对照处理相比，导致瘫痪严重程度的明显降低，后者对疾病的严重性没有明显效应。因此，IFA中加入p71-90影响EAE。
然而，正如前述，IFA不能用于人体，因为它在体内不能代谢而造成局部炎症。我们因此把p71-90加入Intralipid处理Lewsis大鼠。图6显示了实验结果。接受Intralipid中的p71-90的大鼠较PBS/Intralipid处理的对照小鼠而言，瘫痪的发生显著减少。以此，可以得出结论，在Intralipid中施用的相关肽如p71-90可以调节大鼠EAE。因而，肽/Intralipid处理效应不局限于一种肽，一种动物，或仅一种自身免疫性疾病。
实施例7
新鲜和陈旧的10％Intralipid乳浊液的有效性
含有p277(Val6-Val11)的10％Intralipid乳浊液被用于处理12周龄NOD雌性小鼠。乳浊液或者在开瓶的当天使用，或者暴露于空气中4个月之后使用。在制备治疗用肽-乳浊液时检测乳浊液的pH值。陈旧者以pH值从8.2下降到6.7为标志。每次试验中，10只小鼠用肽加乳浊液制剂处理，10只小鼠接受乳浊液单独处理，10只小鼠不经处理。结果见表3
                         表3
组别    处理        乳浊液(PH)    糖尿糖(％)    死亡率(％)
1       肽+乳浊液     8.2            20*          10*
2       乳浊液        8.2            90           70
3       肽+乳浊液     6.7            60           40
4       乳浊液        6.7            80           60
5       未经处理       -             90           80
*P＜0.01
可见安慰剂处理小鼠(仅用乳浊液，组2和4)和非处理小鼠(组5)糖尿糖发生率相近，6月龄时为80-90％。与此形成鲜明的对照，用新启开的肽处理小鼠保护80％小鼠不得糖尿病。然而，使用“陈旧”乳浊液只保护40％。因此，乳浊液暴露于空气后在化学上是不稳定的，pH值明显下降就是证明。这种改变与其生物学活性是相关的。为此，Intralipid是一种生物活性载体，其功能依赖于其pH值，而不仅仅依赖于惰性脂质的存在。
在详细介绍本发明后，本领域普通技术人员将会认识到，在很大范围内的等同参数、浓度和条件下可以得到同样的结果，而不背离本发明的精神和范围，也不需要过多的实验。
当在结合具体的方案阐述了本发明后，应该理解，本发明是可以进一步修改的。本申请意在涵盖总体上根据本发明的原理而对本发明所作的任何变动，应用或修改，也包括本发明所属技术领域的已知或习惯做法范围内的应用于本文所述基本特征，并属于权利要求范围内的内容。
所有这里引用的文献，包括期刊文章或摘要，公布或未公布的美国或外国专利申请，颁发的美国或外国专利，或其它文献，全部引入本文作为参考，包括引用文献中所有数据表格，附图和文字。此外，在其中引用的文献中引用文献的全部内容也引入本文作为参考。
对已知方法步骤，常规方法步骤，已知的或常规的方法引证并不是承认本发明的任何方面、描述或具体方案均在相关文献中被公开传授或提示。
前面对特定方案的描述对本发明的总体特性进行了全面揭示，以致其它人通过应用本领域的技能知识(包括这里引用的文献内容)可以很容易地修改或/和改进这些特定方案而进行各种应用，而不需要进行大量的实验，亦不偏离本申请的总体概念。因此，这样依据本文提供的教导和指导的修改和改进将属于被公开的方案的等同方案范围之内。应当认为本说明书的术语应由普通技术人员根据本文提供的讲授和指导并结合本领域的普通技能知识加以解释。
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(A)长度：573氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(Xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Leu Arg Leu Pro Thr Val Phe Arg Gln Met Arg Pro Val Ser Arg1               5                   10                  15Val Leu Ala Pro His Leu Thr Arg Ala Tyr Ala Lys Asp Val Lys Phe
        20                  25                  30Gly Ala Asp Ala Arg Ala Leu Met Leu Gln Gly Val Asp Leu Leu Ala
    35                  40                  45Asp Ala Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile
50                  55                  60Glu Gln Gly Trp Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val65                  70                  75                  80Ala Lys Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys
            85                  90                  95Leu Val Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly
        100                 105                 110Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ser Ile Ala Lys Glu Gly Phe
    115                 120                 125Glu Lys Ile Ser Lya Gly Ala Asn Pro Val Glu Ile Arg Arg Gly Val
130                 135                 140Met Leu Ala Val Asp Ala Val Ile Ala Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys145                 150                 155                 160Pro Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala
            165                 170                 175Asn Gly Asp Lys Glu Ile Gly Asn Ile Ile Ser Asp Ala Met Lya Lys
        180                 185                 190Val Gly Arg Lys Gly Va1 Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn
    195                 200                 205Asp Glu Leu Glu Ile Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile
 210                215                 220Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Thr Ser Lys Gly Gln Lys Cys Glu Phe Gln225                 230                 235                 240Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Gln Ser
            245                 250                 255Ile Val Pro Ala Leu Glu Ile Ala Asn Ala His Arg Lys Pro Leu Val
        260                 265                 270Ile Ile Ala Glu Asp Val Asp Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Leu
    275                 280                 285Asn Arg Leu Lys Val Gly Leu Gln Val Val Ala Val Lys Ala Pro Gly
290                 295                 300Phe Gly Asp Asn Arg Lys Asn Gln Leu Lys Asp Met Ala Ile Ala Thr305                 310                 315                 320Gly Gly Ala Val Phe Gly Glu Glu Gly Leu Thr Leu Asn Leu Glu Asp
            325                 330                 335Val Gln Pro His Asp Leu Gly Lys Val Gly Glu Val Ile Val Thr Lys
        340                 345                 350Asp Asp Ala Met Leu Leu Lys Gly Lys Gly Asp Lys Ala Gln Ile Glu
    355                 360                 365Lys Arg Ile Gln Glu Ile Ile Glu Gln Leu Asp Val Thr Thr Ser Glu
370                 375                 380Tyr Glu Lys Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asp Gly385                 390                 395                 400Val Ala Val Leu Lys Val Gly Gly Thr Ser Asp Val Glu Val Asn Glu
            405                 410                 415Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val
        420                 425                 430Glu Glu Gly Ile Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile
    435                 440                 445Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp Gln Lys Ile Gly
450                 455                 460Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile Pro Ala Met Thr Ile Ala465                 470                 475                 480Lys Asn Ala Gly Val Glu Gly Ser Leu Ile Val Glu Lys Ile Met Gln
            485                 490                 495Ser Ser Ser Glu Val Gly Tyr Asp Ala Met Ala Gly Asp Phe Val Asn
        500                 505                 510Met Val Glu Lys Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val VAl Arg Thr Ala
    515                 520                 525Leu Leu Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Val
530                 535                 540Val Val Thr Glu Ile Pro Lys Glu Glu Lys Asp Pro Gly Met Gly Ala545                 550                 555                 560Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Phe
            565                 570(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征
(A)长度：24氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp1               5                   10                 15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp
        20(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征
(A)长度：24氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp1               5                   10
                                                                                             15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp
        20(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征
(A)长度：573氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：肽(Xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp1               5                   10                  15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp
        20

Claims (23)

1、一种用于治疗T细胞介导疾病的医用制剂，包括一种抗原和一种生物活性载体，其中该抗原是与上述疾病发病机理有关的炎症性T细胞识别的抗原，而上述载体为脂质乳浊液，该脂质乳浊液含10-20％植物和/或动物来源的甘油三酯，1.2-2.4％植物和/或动物来源的磷脂，2.25-4.5％渗透压调节剂，0-0.05％抗氧化剂，加无菌水至100ml。
2、根据权利要求1所述的制剂，其中该甘油三酯系植物来源。
3、根据权利要求2所述的制剂，其中该甘油三酯来源于大豆油。
4、根据权利要求1所述的制剂，其中该甘油三酯系动物来源。
5、根据权利要求4所述的制剂，其中该甘油三酯来源于卵黄或牛血清。
6、根据权利要求1-5中任意一项所述的制剂，其中该磷酯系植物来源。
7、根据权利要求6所述的制剂，其中该磷酯系大豆来源。
8、根据权利要求1-5中任意一项所述的制剂，其中该磷酯系动物来源。
9、根据权利要求8所述的制剂，其中该磷酯来源于卵黄或牛血清。
10、根据权利要求1-5中任意一项所述的制剂，其中该渗透压调节剂选自甘油、山梨醇或木糖醇。
11、根据权利要求1-5中任意一项所述的制剂，包含0.05％生育酚作为抗氧化剂。
12、根据权利要求1所述的制剂，其中该生物活性载体是一种脂质乳浊液，它包含10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油，和加灭菌水至100ml。
13、根据权利要求1所述的制剂，其中该生物活性载体是一种脂质乳浊液，它包含20％大豆油，2.4％卵黄磷脂，2.5％甘油，和加灭菌水至100ml。
14、根据权利要求1所述的制剂，其中该生物活性载体是一种脂质乳浊液，它包含5％大豆油，5％中等链长甘油三酯，1.2％卵黄卵磷酯，2.5％甘油和加灭菌水至100ml。
15、根据权利要求1-5或12-14中任意一项所述的制剂，它用于治疗胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，包括与IDDM发病机理相关的炎症性T细胞识别的人热激蛋白60(hsp60)衍生的肽，该肽选自表1所列的一组肽。
16、根据权利要求15所述的制剂，该制剂用于治疗IDDM，包括肽p277和这样的脂肪乳浊液：含有10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油和无菌水，至100ml。
17、根据权利要求15所述的制剂，该制剂用于治疗IDDM，包括肽p277(Val6-Val11)和由一种脂质乳浊液构成的载体，该脂质乳浊液含有10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油和无菌水，至100ml。
18、根据权利要求1-5或12-14中任意一项所述的制剂，该制剂用于治疗多发性硬化，包含与多发性硬化发病机理相关T细胞识别的衍生于髓鞘质碱性蛋白(MBP)的肽。
19、一种包括10-20％植物和/或动物来源甘油三酯，1.2-2.4％植物和/或动物来源的磷酯，2.25-4.5％渗透压调节剂，0-0.05％抗菌氧化剂和无菌水，至100ml的脂质乳浊液在制备治疗T细胞介导疾病的医用制剂中的应用。
20、按照权利要求19所述的应用，其中，所述的脂质乳浊液含有10％大豆油，1.2％卵黄磷脂，2.5％甘油和无菌水至100ml。
21、按照权利要求19所述的应用，其中，所述的脂质乳浊液还含有一种或多种列于表1中的肽。
22、按照权利要求19所述的应用，其中，所述的脂质乳浊液还含有肽p277。
23、按照权利要求19所述的应用，其中，所述的脂质乳浊液还含有肽p277(Val6-Val11)。
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