NO320363B1 - Preparater for behandling av T-cellemedierte autoimmune sykdommer og anvendelse av en fettemulsjon som biologisk aktiv baerer. - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS FELT

Foreliggende oppfinnelse angår vaksineterapi for T-cellemedierte autoimmune sykdommer og spesielt terapeutiske preparater omfattende antigener som ble gjenkjent av T-celler involvert i patogenesen av T-cellemedierte autoimmune sykdommer, slik som autoimmune sykdommer, og anvendelse av en fettmulsjon som en biologisk aktiv bærer.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Autoimmune forstyrrelser, for eksempel insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM eller type I diabetes), multippel sklerose, reumatoid artrites og tyroidites, er kjennetegnet med reaktiviteten til immunsystemet overfor et endogent antigen, med påfølgende skade på vev. Disse immunresponsene for selv-antigener blir opprettholdt ved den vedvarende aktiveringen av selv-reaktive T-lymfocytter.

T-celler av CD4 "helper"-typen har vært delt i to grupper ved de karakteristiske cytokinene de utskiller når aktivert (Mosmann and Coffman, 1989). TH1 celler utskiller IL-2, som induserer T-celle proliferasjon og cytokiner slik som IFN-y, som medierer vevsinflammason. TH2-celler derimot utskiller IL-4 og IL-10. IL-4 hjelper T-celler som utskiller antistoffer av visse IgG isotyper og undertrykker produksjonen av TH1 inflammatoriske cytokiner (Banchereau et al., 1994). IL-10 hemmer indirekte TH1 aktivering ved påvirking av antigen-presentasjonen og inflammatorisk cytokinproduksjon ved makrofager (Moor et al., 1993). Det er TH 1-cellene som bidrar til patogenesen av organspesifikke autoimmune sykdommer. TH1 type responser synes også å være involvert i andre T-celle medierte sykdommer eller tilstander slik som kontaktdermatitis (Romagnani, 1994).

Peptider passende for immunologisk spesifikk terapi av en autoimmun sykdom er peptider som blir gjenkjent av T-celler involvert i patogenesen av autoimmunsykdommer. Hver autoimmun sykdom vil ha dets ideelle peptid for anvendelse i terapi. En sykdom som multippel sklerose omfatter T-celler som er reaktive for celleantigener slik som myelinbasiske proteiner (MBP) (Allegreta et al., 1990) vil kreve et peptid av myelin basisk protein fra dets terapi, som eksempelvis er de beskrevet av Ota et al., 1990.

Foreliggende oppfinnere har vist at autoimmune sykdommer slik som type I diabetes mellitus, kan bli behandlet ved administrasjon av et passende peptid i en oljebærer. NOD-mus utvikler spontan type I diabetes på grunn av autoimmune T-celler som angriper de insulinavhengige 13-cellene i de pankranske øyer. Det autoimmune angrepet er forbundet med T-cellereaktivitet til forskjellige selv-antigener, inkludert et peptid av 60 kDa varmesjokkproteinet (hsp60) og peptider av glutaminsyredekarboksylase (GAD). Således kan for eksempel spontan diabetes-utvikling i NOD/Lt-stammen av mus bli behandlet med et peptid betegnet p277 tilsvarende til posisjon 437-460 i den humane hsp60-sekvensen (PCT søknad nr. WO90/10449; D. Elias and LR. Cohen, Peptide therapy for diabetes in NOD mice, The Lancet 343:704-06,1994); med forskjellige varianter av p277-peptidet hvor en eller begge systeinrestene ved posisjon 6 og/eller 11 har blitt erstattet av valin og/eller Thr-resten ved posisjon 16 og erstattet med Lys (se PCT søknad WO/96/19236) og med peptider betegnet pl2 og p32 tilsvarende henholdsvis posisjon 166 til 185 og 466 til 485 av den humane hsp60-sekvensen. Se israelsk patentsøknad nr. 144,407 med samme søker som foreliggende søknad, innlevert 30. Juni 1995. Se også PCT søknad publisert som WO 97/01959, innlevert 1. Juli 1997, som krever prioritet fra nevnte israelske søknad nr. 114,407, hvis hele innhold er innlemmet som referanse.

Peptidterapi for behandling av IDDM ved anvendelse av pl2, p32, p277 eller varianter derav, ble funnet av foreliggende oppfinnere å være effektiv når peptidet ble administrert til mus subkutant (sc) i en oljebærer, slik som en emulsjon av mineralolje kjent som incomplete Freund's adjuvans (IFA). Imidlertid, er IFA såvel som complete Freund's adjuvans (CFA; et preparat av mineralolje innholdende forskjellige mengder avlivede organismer av Mycobakterium) ikke tillatt for human anvendelse, da mineraloljen ikke blir metabolisert og ikke kan bh' degradert i kroppen. Derfor vil det være ønskelig å oppdage en effektiv bærer for peptidterapi som vil bli metabolisert.

Flere fettemulsjoner har vært i anvendelse i mange for intravenøs næring til humane pasienter. To av de tilgjengelige kommersielle fettemulsjonene, kjent som intralipid ("Intralipid" er et registrert varemerke til Kabi Pharmacia, Sverige, for en fettemulsjon for intravenøs næring, beskrevet i US patent nr. 3,169,094) og lipofundin (et registrert varemerke til B. Braun Melsungen, Tyskland) inneholdende soyabønneolje som fett (100 eller 200 g i 1.000 ml destillert vann; henholdsvis 10 eller 20%). Eggeplommefosfolipider ble benyttet som emulgatorer i intralipid (12 g/l destillert vann) og eggplomme-lesitin i lipofundin (12 g/l destillert vann). Isotonisitetresultater av tilsetning av glyserol (25 g/l) både i intralipid og lipofundin. Disse fettemulsjonene er relativt stabile og har blitt benyttet for intravenøs ernæring til pasienter som lider av gastrointestinale eller neurologiske forstyrrelser som forhindrer dem i å motta næring oralt og således mottar de nødvendige kaloriene for å opprettholde liv. Vanlig daglig dosering er opp til 1 liter daglig.

US patent nr. 4,073,943, bevilget 14. Februar 1978, Wretland et al., og Re. 32,393, bevilget 29. Mai 1990 som reissue patent av US patentnr. 4,168,308 bevilget 18. September 1979, Wretland et al., beskriver at bærersystem for anvendelse for øking av parental, spesielt intravenøst, administrasjon av et farmakologisk aktivt, oljeoppløselig middel, omfattende en stabil, olje-i-vann emulsjon inneholdende et farmakologisk inert lipid som en hydrofob fase dispergert i en hydrofil fase, hvor nevnte lipid er dispergert i emulsjonen som fintfordelte partikler med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på mindre en 1 mikron, for å oppnå hurtig start av en akseptabel terapeutisk effekt, nevnte bærersystem blir benyttet med en effektiv dose av nevnte farmakologiske aktive oljeoppløselige middel hovedsakelig oppløst i nevnte lipid ved et forhold til dette i den hydrofobe fasen, nevnte terapeutiske effekt blir tilskrevet til nevnte effektive dose av det aktive middelet. Bærersystemet blir sagt å være tilpasset for administrasjon av vannuoppløselige eller vannoppløselige, oljeoppløselige farmakologiske aktive midler som hovedsakelig blir oppløst i lipidfasen. Eksempler på slike farmakologiske aktive stoffer er midler for nedsettelse av livsfunksjoner, anaestetiker, analgestiker, stimulanter, spasmolytika, muskelrelaksanter, vasodepressanter og diagnostika, for eksempel røntgenkontrastmidler. Bærersystemet blir sagt å øke den diagnostiske terapeutiske effekt av middelet med hurtig start fulgt av en redusert grad av skade til kroppsvevet.

Intralipid er blitt foreslått som en ikke-irriterende bærer for flere adjuvanser for anvendelse i vaksiner slik som for eksempel, 6-0-(2-tetradesylhekadesanoyl)- og 6-0-(3-hydroksy-2-dekosylheksassosanoyl)-N-asetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (Tsjuimoto et al., 1986 og 1989), avridin (Woodward og Jasman, 1985), N,N-dioktadesyl-N',N'-bis(2-hydoksyetyl) propandiamin (CP-20,961) (Tysk patentsøknad nr. DE 2945788; Anderson og Reynold, 1979; Niblack et al., 1979). Kristiansen og Sparrman, 1983, har beskrevet at immunogenesiteten til hemagglutinin og neuraminidase i mus blir markert øket etter adsorpsjon på lipide partikler bestående av intralipid.

Ingen av publikasjonene ovenfor beskriver anvendelsen av intralipid som en bærer for peptider i behandling av autoimmune sykdommer, heller har det ikke vært noen beskrivelse av at intralipid kan mediere et skift i immunresponsen fra en TH 1-type respons til en TH2-type respons.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Det har nå blitt funnet ifølge foreliggende oppfinnelse, at metaboliserbare lipidemulsjoner, slik som intralipid og lipofundin, kan virke som vehikkel for peptidterapi av autoimmune sykdommer og av andre TH1 T-celle medierte sykdommer eller tilstander. Det har videre blitt funnet at denne aktiviteten er forbundet med et TH1 til TH2 cytokinskift.

Foreliggende oppfinnelse angår således et terapeutisk preparat for behandling av en T-cellemediert sykdom eller tilstand, kjennetegnet ved at den omfatter et antigen og en biologisk aktiv bærer, hvor antigenet er et antigen som blir gjenkjent av inflammatoriske T-celler forbundet med patogenesen av nevnte sykdom eller tilstand, og hvor nevnte bærer er en fettemulsjon omfattende 10-20% triglyserider av plante- og/eller animalsk opprinnelse, 1,2-2,4% fosfolipider av plante- og/eller animalsk opprinnelse, 2,25-4,5% osmo-regulator, 0-0,05% antioksidant, og sterilt vann for å gi 100 ml.

Triglyseriden og fosfolipidene av plante eller animalsk opprinnelse kan være avledet fra en hvilken som helst passende vegetabilsk olje, slik som sojebønneolje, bomullsfrøolje, kokosnøttolje eller olivenolje, eller fra eggeplomme eller bovint serum. Fortrinnsvis er triglyseriden avledet fra soyabønneolje og fosfolipiden avledet av soyabønner eller av eggeplomme. Fortrinnsvis er triglyserid/fosfolipid vektforholdet omkring 8:1.

En hvilken som helst passende osmoregulator kan bli tilsatt til fettemulsjonen, fortrinnsvis glyserol, xylitol eller sorbitor. Fettemulsjonen kan eventuelt omfatte en antioksidant, for eksempel 0,05% tokoferol.

I en utførelsesform av oppfinnelsen blir fettemulsjonen som definert ovenfor, bearbeidet ved sentrifugering, for eksempel ved 10.000 g eller høyere, for derved å danne et lite rriglyserid-rikt (omkring 90% triglyserid) lag på toppen av en fosfolipid anriket vandig dispersjon inneholdende omkring 1:1 triglyserid:fosfolipid og denne siste vandige dispersjonen blir benyttet som lipid vehikkel i preparatene ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er preparatet for behandling av insulinavhengige diabetes mellitus (IDDM) og omfatter et peptid avledet fra det humane varmesjokkproteinet 60 (hsp60) som blir gjenkjent av inflammatoriske T-Celler forbundet med patogenesen av IDDM; hvor nevnte peptid er valgt blant gruppen omfattende peptider i den følgende tabell:

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av en fettemulsjon omfattende 10-20% triglyserider av plante- og/eller animalsk opprinnelse, 1,2 til 2,4% fosfolipider av plante og/eller animalsk opprinnelse, 2,25 til 4,5% osmoregulator, 0-0,5% antioksidant og sterilt vann til 100% for fremstilling av et terapeutisk preparat ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen angår også anvendelse av en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2% eggeplomme fosfolipider 2,5% glyserol og sterilt vann til 100% for fremstillingen av et terapeutisk preparat ifølge oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1 viser anti-p277 antistoffproduksjon i NOD-mus behandlet med peptid p277 (Val<6->Val") i:

(i) intralipid eller

(ii) fosfatbufferet saltvann (PBS) som beskrevet i eksempel 2.

Figur 2 viser TH2-avhengige antistoff isotyper indusert i NOD-mus ved behandling med peptidet p277 (Val<6->Val<11>) i intralipid, som beskrevet i eksempel 3. Figurene 3 A-B viser at p277 (Va^-Va^Vintralipid-terapi induserer i NOD-mus en spesifikk veksling i profilen av cytokiner produsert av T-cellene reaktive overfor p277 (Val<6->Val") peptidet, som beskrevet i eksempel 4. Figur 3A viser at det er en reduksjon i TH1 (IL-2, IFN-y) og økning av TH2 (IL-4, IL-10) cytokiner etter behandling av mus med p277 (Val<6->Val<n>)-peptidet i intralipid og inkubering av miltcellene med p277 (Val<6->Val<n>); Figur 3B viser at det ikke er noen forandring i cytokinet etter behandling av mus med p277 (Val<6->Val<n>) peptidet i intralipid og inkubering av miltcellene med Con A. Figur 4 viser at spontan T-celle proliferativresponser overfor p277 (Val<6->Val<1>1) ble redusert etter behandling med p277 (Val<6->Val<11>) peptidet i intralipid, som beskrevet i eksempel 5. Figur 5 viser at behandlingen av rotter med myelin basisk proteinpeptid p71-90 intralipid reduserer alvoret av eksperimentell autoimmun ensefalomyelitis (EAE), som beskrevet i eksempel 6. Figur 6 viser at behandlingen av rotter med myelin basisk proteinpeptid p71-90 i IFA reduserer alvoret av eksperimentell autoimmun ensefalomyelitis (EAE), som beskrevet i eksempel 6.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet at p277 (Val6-Val1 ^-peptid behandling i en passende bærer, regulerer ned de spontane T-celle proliferative responser overfor epitoper av både hsp60 og GAD og opphever produksjonen av autoantistoffer overfor hsp60, overfor GAD og overfor insulin. Stans av sykdomsprosessen var assosiert, ikke med T-celletoleranse eller anergi, men med et skift i cytokinene produsert av de autoimmune T-cellene reaktive overfor p277 (Val<6->Val<11>) fra en THl-lik profil (IL-2, JFNy) til en TH2-lik profil (IL-4, IL-10). Modulasjonen var immunologisk spesifikk; den spontane T-celleresponsen av behandlede mus overfor bakterielt hsp60 peptid forble i TH1 -modus. Den diabetogene prosessen kjennetegnet ved autoimmunitet overfor flere selv-antigener kan bli leget ved anvendelse av et av antigenene, for eksempel peptid p277 (Val<6->Val<11>).

Assosieringen av p277 (Val<6->Val<n>) terapi med et skift i reaktiviteten overfor p277 (Val6-Val1 ]) fra T-celle proliferasjon til antistoffer, indikerer at den terapeutiske effekten er et resultat av et skift i dominerende cytokin og produsert av de autoimmune T-cellene i de behandlede mus. THl-celler utskiller IL-2, som induserer T-celle proliferasjon og cytokiner, slik som TFN-y, som medierer vevsinflammasjon for derved å bidra til patogenesen av sykdommen; TH2-celler utskiller i motsetning IL-4 og IL-10. IL-4 hjelper B-celler til utskille antistoffer av visse IgG isotyper og undertrykker produksjonen av THl inflammatoriske cytokiner. IL-10 hemmer indirekte THl aktivering ved å påvirke antigenpresentasjonen og antiinflammatorisk cytokinproduksjon av makrofager. TH2-celler undertrykker således THl-aktivitet (se Liblau et al., 1995). Skiftet fra THl til TH2-lignende oppførsel ble støttet av analyser av isotyper av antistoffene produsert før og etter p277 (Val<6->Val<n>)-terapien.

Det faktum at mekanismen til den terapeutiske effekten av peptidet i en lipid vehikkelbehandling, er vist å omfatte et THl-TH2-cytokinskift, gir muligheten for anvendelse av THl -TH2-skiftet som et bevis for at behandlingen var effektiv og induserte en fordelaktig respons. Med andre ord, kan THl-TH2-skiftet tjene som en surrogatmarkør for responsen overfor behandlingen. For eksempel, kan mangelen på et skift indikere et behov for en andre behandling. Se israelsk patentsøknad nr. 114,459, innlevert 5. Juli 1995 og den tilsvarende PCT-søknad innlevert på samme dato som foreliggende søknad, hvis hele innhold herved er innlemmet som referanse. Lipidemulsjon ifølge foreliggende oppfinnelse, når benyttet som en vaksineadjuvans med antigenstoffet overfor hvilket T-cellene involvert i sykdommen eller tilstanden som blir behandlet, er aktive, tjener til å mediere et skift fra en THl T-cellerespons før behandling til en TH2 T-cellerespons etter behandling. Dette funnet bekrefter at slike lipidemulsjoner er tolerogene biologiske aktive bærere som kan bli benyttet i vaksiner for behandling av en hvilken som helst THl-mediert sykdom eller tilstand. I slike vaksiner, gir antigenet den immunologiske spesifisiteten for en terapeutisk effekt, mens den biologiske aktive bæreren ifølge foreliggende oppfinnelse blir det biologiske resultatet, dvs. THl-TH2-skiftet. På grunn av skiftet mediert av nevnte biologiske aktive bærer ifølge foreliggende oppfinnelse, kan sykdommer med et spekter av autoreaktiviteter bli slått av med en enkel antigen/bærerkombinasjon som er i stand til å indusere et T-celle cytokinskift.

En foretrukket anvendelse er behandlingen av organspesifikke autoimmune sykdommer som blir mediert av THl-celler. Slike sykdommer omfatter autoimmune sykdommer

slik som IDDM, reumatoide artritis, multippel sklerose og tyrioditis. Peptidet benyttet i slik behandling er et autoantigenpeptid. Således er for eksempel for IDDM, peptidet det ovenforaevnte p277-peptidet eller den valinsubstituerte analogen p277 (Val<6->Val<n>), for multippel sklerose er slike peptider levert fra myelin basiske protein; for tyroditis er peptidet antatt å være avledet fra tyroglobulin og fra reumatoid artritis kan autoantigenet bli levert fra mykobakteriumorganismer, for eksempel Mykobacterium tuberculosis.

Det er ikke kritisk at antigenet er et peptid. Således kan for eksempel THl-medierte allergiske responser som resulterer i hudsensitivitet og inflammasjon, slik som kontaktdermatitis, bli behandlet med en vaksine inneholdende det irritante antigenet og en biologisk aktiv bærer ifølge foreliggende oppfinnelse som vil forårsake et skift i cytokinresponsen fra en THl-type til en TH2-type. Således, mens pasienten vil fortsette å ha eleverte antistoffernivået mot antigenet, vil den inflammatoriske T-celleresponsen som forårsaker hudirritasjon bli undertrykket.

Følgelig, kan de tolerogeniske biologiske aktive bærerne ifølge foreliggende oppfinnelse bli benyttet med en hvilken som helst tid hvor det er ønskelig å skape toleranse for antigenet som T-cellene angriper, dvs. når som helst når en vaksine blir benyttet for å begrense en T-cellemediert tilstand, spesielt en THl-cellemediert tilstand. Dersom det kan bli bestemt hvilket antigen som aktiverer responsen i transplantatawisning eller i transplantat versus vertsykdom, så vil administrasjonen av et slikt antigen med en bærer ifølge foreliggende oppfinnelse være forventet å utføre skiftet av den uønskede inflammatoriske THl-responsen til en mer ønskelig TH2-respons, uansett den totale kompleksiteten av antall antigener overfor hvilket T-cellene er aktive i slike tilstander.

For å bestemme T-cellesituasjonen av cytokiner etter aktivering med peptider, blir lymfocytter fra perifert blod til pasientene testet i en in vitro aktiveringsanalyse. Perifere blodlymfocytter blir isolert fra heparinisert helblod på ficol-hypaque, og dyrket med testpeptidet eller testpeptidene ved konsentrasjon av fra 5-50 ug/ml. Supernatantene fra de dyrkede T-cellene ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og testet for aktivitet av forskjellige cytokiner, ved ELISA eller bioanalyser.

Eksempler på fett emulsjoner som kan bli benyttet i fremstillingen av foreliggende oppfinnelse omfatter de kommersielt tilgjengelige "Intralipid" og "Lipofundin" for intravenøs ernæring og fettemulsjonene beskrevet i de ovenfor nevnte US patentene nr. 3,169,096,4,073,943 og 4,168,308, som her er innlemmet som referanse i sin helhet. Imidlertid, kan funnene ifølge oppfinnelsen at disse metaboliserbare lipidene bli administrert tidligere for intravenøs ernæring, bli effektivt benyttet som vehikler for terapi av T-cellemedierte sykdommer, er fullstendig uventet. Tilsvarende, er oppdagelsen at disse preparatene er tolerogene biologiske bærere som medierer et TH1-TH2-skifte er også totalt uventet.

Fettemulsjonene ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis benyttet som ferskt preparerte eller etter lagring i en beholder som ikke er åpen for atmosfærisk luft. Forlenget lagring av intralipid forårsaker for eksempel under eksponering for atmosfærisk luft, en reduksjon i pH og en tilsvarende reduksjon i biologisk aktivitet.

I en utførelsesform er den biologiske aktive bærer ifølge oppfinnelsen en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2% eggeplommefosfolipid, 2,5% glyserol og sterilt vann for å utgjøre 100 ml (intralipid 10%). En annen utførelsesform, er vehikkel en fettemulsjon omfattende 20% soyabønneolje, 2,4% eggeplommefosfolipider, 2,5% glyserol og sterilt vann for å gi 100 ml.

I enda en utførelsesform er vehikkelen en fettemulsjon omfattende 5% soyabønneolje og ytterligere 5% triglyserider fra animalsk opprinnelse, for eksempel 5% mediumkjede-trigylserider fra smør, 1,2% eggeplommelesitin, 2,5% glyserol og destillert vann for å gi 100 ml (lipofundin 10%).

Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen er vehikkelen en prosessert lipidemulsjon oppnådd ved sentrifugering for eksempel ved 10.000 g eller høyere, av den opprinnelige fettemulsjonen definert heri, hvorved en liten triglyseridrik (ca. 90% triglyserid)-fraksjon ble dannet på toppen av en fosfolipidanriket vandig dispersjon inneholdende omkring 1:1 triglyserid:fosfolipider. De to fasene ble separert og den fosfolipid-rike vandige dispersjonen ble benyttet som en vehikkel.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kan omfatte en eller flere peptider. For eksempel, kan for behandling av IDDM, preparatet omfatte en eller flere av peptidene pl2, p32, p277, p277 (Val<6>), p277 (Val<11>), p277 (Val<6->Val<1>') eller en hvilken som helst av de andre peptidene i tabell 1. I en foretrukket utførelsesform, omfatter preparatet for behandling av IDDM, et peptid p277 eller p277 (Val<6->Val<11>) og en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2% eggeplommefosfolipider, 2,5% glyserol og sterilt vann for å utgjøre 100 ml (intralipid 10%).

Oppfinnelsen omfatter dessuten anvendelsen av en fettemulsjon som definert heri eller en prosessert fosfolipid anriket vandig dispersjon fremstilt derfra ved sentrifugering for fremstilling av et terapeutisk preparat omfattende et eller flere peptider eller andre antigener og nevnte fettemulsjon eller prosesserte vandige dispersjon, som en vehikkel i terapi av autoimmune sykdommer eller andre THl-medierte sykdommer eller tilstander.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert ved de følgende ikke-begrensende eksemplene.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Peptidterapi av type I diabetes ved anvendelse av p277 ( Val6- Val") i olje.

Effektiviteten til forskjellige lipidpreparater som vehikler for peptidterapi av diabetes av NOD-mus ble testet. I denne modellen blir autoimmun destruksjon av insulinproduserende 6-celler i pankras medierte av T-lymfocytter. Et inflammatorisk infiltrat utvikles rundt de pankreatiske øyene ved 5-8 ukers alder og B-celledestruksjon fører til insulinsvikt og åpen diabetes blir manifestert ved 14-20 ukers alder hos nær 100% av hunnkjønns NOD-mus ved 35-40 ukers alder.

Hunnkjønns NOD-mus ble behandlet med 100 u.g peptid p277 (Val<6->Val<n>) pr. mus sc i 0,2 ml:

(i) Fosfatbufret saltvann (PBS), eller

(ii) en 10% lipidemulsjon sammensatt av 10% soyabønneolje, 1,2% eggefosfolipider og

2,25% glyserol (Intralipid, Kabi Pharmacia AB, Sverige).

Hyppigheten av diabetes ved 6 måneders alder og produksjonen av anti-p277 (Val<6->Val1 'j-antistofFer ble fulgt. Diabetes ble diagnostisert som vedvarende hyperglysemia, blodglukosenivåer over 11 mmol/1 målt minst to ganger ved ukentlige intervaller med en Beckmann glukoseanalysator II. Suksessfull peptidbehandling ble fastslått ved opprettholdelsen av en normal blodglukosekonsentrasjon (mindre enn 11 mmol/1), tilbakegang av intra-øy inflammasjon i det pankreatiske øyene (insulitis) og induksjon av antistoffer for det terapeutiske peptidet som en indikator for en TH2-type immunrespons. Resultatene er vist i tabell 2.

Som det kan sees fra tabell 2, var peptidbehandling administrert i intralipid effektiv for reduksjon av hyppigheten av diabetes og død. På den annen side, var behandling administrert i PBS ineffektiv.

EKSEMPEL 2

Anti- p277 fv' al6- Val") antistoffproduksion.

Beskyttelsen mot diabetes ved behandling med p277 (Val<6->Val<11>) peptidet er avhengig av TH2-immunologisk reaktivitet overfor peptidet. Derfor ble antistoffproduksjonen målt i p277 (Val<6->Val'^-immuniserte mus ved ELISA. Maxisorp mikrotiterplater (Nunc) ble belagt med p277 (Val<6->Val<n>)-peptid, 10 p.g/ml, i 18 timer og ikke-spesifikk binding blokkert med 7% melkepulver i 2 timer. Musesere, fortynnet i 1:50 ble tillatt å binde seg i 2 timer og den spesifikke binding ble detektert ved tilsetting av alkalisk fosfatase anti-mus IgG (Serotec) i 2 timer og p-nitrofenylfosfatsubstrat (Sigma) i 30 minutter. Fargesyntesiteten ble målt ved en ELISA-leser (Anthos) ved OD=405 nm.

Som det kan sees fra figur 1, utviklet NOD-mus immunisert overfor p277 (Val<6->Val<n>) i intralipid, peptid-spesifikkantistoffer, mens mus immunisert overfor p277 (Val<6->Val'') i PBS, ikke viste noe som helst antistofrfespons.

EKSEMPEL 3

Antistoffisotyper indusert ved p277 ( Val6- Valn)- terapi.

Forbindelsen mellom p277 (Val<6->Val<11>) intralipidterapi med antistoffer overfor p277 (Val<6->Val<1>') vist i eksempel 2, antyder at den terapeutiske effekten kan resultere fra et

skift i de dominerende cytokinene fremstilt ved autoimmune T-cellene. T-celler av CD4 "helper" typen har blitt delt i to grupper ved de karakteristiske cytokiner de utskiller når de er aktivert (Mosmann og Cofrma, 1989): THl-celler utskiller IL-2 som induserer T-celleproliferasjon, og cytokiner slik som i IFNy» som medierer vevsinflammasjon; TH2-celler, derimot, utskiller JL-4 som "hjelper" B-celler produserer visse antistofifsotyper og IL-10 og andre cytokiner som "undertrykker" vevsinflammasjon. Muligheten for et skift fra THl til TH2-lik oppførsel var støttet ved analyse av isotypene av antistoffene produsert etter p277 (Val6-Val' ')-terapi.

Grupper av NOD-mus, 3 måneder gamle, ble behandlet med p277 (Val<6->Val<1>') eller med PBS i olje som beskrevet i eksempel 2. Sera av individuelle mus ble analysert for isotypene av deres antistoffer overfor p277 (Val<6->Val<11>) etter behandling (12-15 mus pr. gruppe). Antistofifsotypene ble detektert ved anvendelse av en ELISA-analyse med isotype-spesifikke utviklingsantistoffreagenser (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). Resultatene er vist i figur 2, hvor: antistoffer overfor p277 (Val<6->Val") i kontrollbehandlede NOD-mus-åpne sirkler; i p277 (Val6-Val1 ')-behandlede mus- lukkede sirkler. Kolonnene i hvert eksperiment viser resultater fra like antall mus; en tilsynelatende reduksjon i antallet sirkler skyldes overlapping.

Analyse av antistoffisotypene av anti-p277 -antistoffene som ble utviklet etter behandling, viser at de kun er av IgGl- og IgG2b-klassene avhengige av TH2 T-celler som produserer EL-4 (Snapper et al., 1993a) og muligens TGFØ (Snapper et al., 1993b). Der ble ikke indusert noen THl-type IgG2a-antistoffer ved p277 (Val<6->Val<n>)-terapi. Utviklingen av antistoffer overfor spesifikke peptider benyttet i behandlingen, er et tegn på at de autoimmune T-celleresponsene har skiftet fra en skadelig inflammatorisk modus kalt THl til en TH2 T-cellerespons som produserer uskadelige antistoffer og undertrykker inflammasjon og vevsskade (Rabinovitch, 1994).

EKSEMPEL 4

Peptid p277 fV al6- Valn VintraliDid terapi induserer et spesifikt skift i cvtokin profiler.

For å bekrefte ideen om et cytokinskift, ble cytokinene produsert av T-cellene som var reaktive overfor p277 (Val<6->Val<11>) i de p277 (Val<6->Val<n>)/intralipid behandlede og kontrollmusene analysert. Concanavalin A (ConA), et T-celle mitogen, ble benyttet for å aktivere totale milt T-celler som en kontroll.

Grupper på 10 NOD-mus, 3 måneder gamle, ble behandlet med p277 (Val<6->Val") i intralipid (lukkede søyler) eller med PBS intralipid (åpne søyler; se eksempel 2). Fem uker senere ble milten fra musene fjernet og miltcellene ble oppsamlet. Miltcellene ble inkubert med ConA eller p277 (Val<6->Val<11>) i 24 timer (for IL-2 og IL-4-sekresjon) eller i 48 timer (for JL-10 og IFNy sekresjon). Nærværet av cytokin i kultursubkutantene ble kvantifisert ved ELISA ved anvendelse av Pharmingen parede antistoffer ifølge Pharmingen cytokin ELISA-protokoll. Pharmingen rekombinante mus-cytokiner ble benyttet som standard for kalibrering av kurver. Kort, ble flatbunnet 96-brønners mikrotiterplater belagt med rotte-antimuscytokin mAbs i 18 timer ved 4°C og kultursupematantene eller rekombinante mus-cytokiner ble tilsatt i 18 timer ved 4°C. Platene ble vasket og biotinylert rotte-antimus-cytokin mAbs ble tilsatt i 45 minutter ved romtemperatur, så grundig vasket og avidin-alkalisk fosfatase ble tilsatt. Platene ble vasket, et kromogen substrat (p-nitrofenylfosfat) ble tilsatt og prøvene ble avlest ved 405 nm i en ELISA-Ieser. Resultatene er vist i figur 3. Konsentrasjonene av cytokiner er vist som OD-avlesninger. <*> P<0,01.

Figur 3 A viser at miltcellene fra kontrollmusene utskilte både IL-2 og IFNy etter inkubering med p277 (Val<6->Val<1>'). Derimot, produserte de p277 (Val<6->Val'') behandlede musene signifikant mindre (P<0,01) (IL-2 og IFNy i respons for inkubering med peptid p277 (Val<6->Val<1>'). Denne reduksjonen i THl cytokiner var spesifikk; p277 (Val<6->Val<n>) behandlede mus opprettholdt deres IL-1 og IFNy cytokinresponser overfor

ConA (figur 3 B). Figurene 3 A og 3B viser mengden av IL-10 og IL-4 produsert av musenes miltceller. Kontrollmus produserte veldig lite IL-4 eller IL-10 som respons på p277 (Val6-Val11) eller ConA. Derimot, var der en signifikant økning i IL-10 og IL-4 som respons kun på p277 (Val<6->Val<n>) og kun i p277 (Val^Val^/intralipid behandlede mus (P<0,01). En reduksjon i IL-2 og IFNy koblet med en økning i IL-10 og IL-4 bekrefter skiftet fra THl lignende oppførsel til TH2 lignende oppførsel. Et slikt skift kan hjelpe til å forklare både en reduksjon i T-celle proliferasjon overfor p277 vist tidligere av oppfinnerne (Elias et al., 1991) og opptreden av IgGl og IgG2b-antistoffer overfor p277 (Val<6->Val<u>) ifølge foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 5

Spontane T- celle proliferative responser overfor p277 ( Val6- Val") blir redusert ved <p>277 fyal6- ValnVterapi.

Grupper på 5 hunnkjønnsdyr av NOD/Lt stamme ble behandlet ved 3 måneders alder med 100 u.g peptid p277 (Val<6->Val<11>) i intralipid eller med PBS blandet med intralipid, sc i ryggen. 5 uker senere ble musenes milt fjernet og de T-celle proliferative responsene ble analysert in vitro overfor T-celle mitogen Con A (1,25 ug/ml) eller overfor p277 (Val<6->Val<1>') ved anvendelse av en standard analyse. Resultatene vist i figur 4, hvor: Con A-stripete søyler; p277 (Val<6->Val<ll>)-grå søyler. T-celleresponsen ble detektert ved inkorporering av [<3>H] thymidin tilsatt til brønnene i kvadruple kulturer i minst 18 timer i en 3 dagers kultur. Stimuleringsindeksen (SI) ble beregnet som forholdet mellom gjennomsnittlig telling pr. minutt av testkulturene til gjennomsnittlig telling pr. minutt av antigeninnholdende broer til kontrollbrønner dyrket uten antigener eller Con A. Standardavvikene fra gjennomsnittlig telling pr. minutt var alltid mindre enn 10%.

Som vist i figur 4 viste kontrollmusene testet med PBS/intralipid T-celle proliferative responser overfor både p277 (Val<6->Val<1>') og overfor T-celle mitogenet Con A. Derimot, viste musene behandlet med p277 (Val<6->Val<11>) i intralipid en reduksjon i T-celle proliferativ reaktivitet overfor p277 (Val<6->Val<11>), men ingen reduksjon i Con A. Således, er den fordelaktige effekten av p277 (Val<6->Val<n>) peptid-terapi forårsaket ikke av inaktivering av den autoimmune responsen, men ved aktivering av autoimmuniteten til en annen cytokin-oppøfrselsmodus (Cohen, 1995). Reguleringen av destruktiv immunitet er programmert i immunsystemet (Cohen, 1992); den trenger kun å bli aktivert ved et passende signal som krever peptidet sammen med lipid vehikkel; verken peptidet alene eller lipidet uten peptidet er effektiv som vist i tabell 1. Disse resultatene indikerer at metabolisert lipidemulsjoner kan bli benyttet effektivt som vehikler for terapi av autoimmune sykdommer. Hver sykdom vil kreve dets eget spesifikke peptid, men den metaboliserbare lipidemulsjonen kan bli benyttet for de forskjellige terapiene.

EKSEMPEL 6

Administrasjon av peptid i intralipid gir utvikling av eksperimentell autoimmun ensefalom<y>elitis.

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitis (EAE) er en eksperimentell autoimmun sykdom hos dyr som er antatt å være modell for aspekter av multippel sklerose (Zamvil og Steinman, 1990). EAE kan bli indusert i mottagelige stammer av rotter, slik som Lewis-rotter, ved immunisering for myelin basisk protein (MBP) i complete Freund's adjuvans (CFA), en emulsjon av mineraler og inneholdende avlivede mykobakteria. Sykdommen utvikler seg omkring 12 dager etter immunisering og er kjennetegnet ved paralyser av forskjellig grad på grunn av inflammasjon i sentralnervesystemet. Paralysen kan vare i opptil 6 eller 7 dager og rottene kommer seg vanligvis hvis de ikke dør under toppen av den akutte paralysen. EAE er forårsaket av T-celler som gjenkjenner definerte determinanter i MBP-molekylet. Den viktigste MBP-determinanten i Lewis-rotten er sammensatt av petidsekvensen 71-90 (Zamvil og Steinman, 1990).

Det ble derfor utført et eksperiment for å teste om administrasjonen av det encefalitogene MBP-peptidet p71-90 i IFA også kunne hemme utviklingen av EAE.

Figur 5 viser at administrasjonen av p71-90 i IFA 14 dager før induksjon av EAE førte til en betydelig reduksjon i den maksimale grad av paralyse sammenlignet med kontrollbehehandling med PBS emulgert i IFA, som ikke hadde noen effekt på alvoret av sykdommen. P71-90 gitt i IFA påvirker således EAE.

Imidlertid, kan IFA ikke bli administrert som angitt ovenfor, til mennesker da den ikke blir metabolisert i kroppen og forårsaker lokal inflammasjon. Derfor ble Lewis-rottene behandlet med p71-90 intralipid. Figur 6 viser resultatene. Rottene som hadde mottatt p71-90 intralipid utviklet signifikant lavere paralyse enn kontrollrottene behandlet med PBS/intralipid. Derfor kan det bli konkludert at relevante peptider slik som p71-90 administrert i intralipid er i stand til å modulere EAE hos rotter. Således, er effekten av peptid/intralipidbehandling ikke begrenset til kun et peptid, i en art, eller til kun en autoimmun sykdom.

EKSEMPEL 7

Effektivitet av nv versus eldre 10% intralipid emulsjon.

10% intralipid emulsjon ble benyttet for å behandle 12 uker gamle NOD hunnkjønns-mus med et p277 (Val<6->Val<11>). Emulsjonen ble benyttet enten på den dagen den forseglede flasken ble åpnet eller 4 måneder senere etter eksponering for atmosfærisk luft. PH i emulsjonen ble testet ved prepareirngstiden på peptid pluss emulsjonen for behandling. Aldring var markert ved tall i pH fra 8,2 til 6,7. I hvert eksperiment ble 10 mus behandlet med peptid pluss emulsjonspreparatet, 10 mus mottok emulsjonen alene og 10 mus var ubehandlet. Resultatene er vist i tabell 3.

Det kan bli sett at de placebo-behandlede musene (kun emulsjon, gruppe 2 og 4) og de ubehandlede mus (gruppe 5) utviklet en tilsvarende hyppighet av diabetes, 80-90% ved 6 måneders alder. Derimot, beskyttet behandling av musene med peptid i nyåpnet emulsjon 80% av musene for diabetes. Imidlertid, ved anvendelse av "eldre" emulsjon beskyttet kun 40%. Derfor, var emulsjonen kjemisk ustabil etter eksponering for luft som vist ved markert økning i pH-verdien. Denne endringen er relevant for dets biologiske aktivitet. Således, er intralipid en biologisk aktiv bærer hvis funksjonelle egenskap avhenger av pH og ikke kun av nærværet av inert lipid.

REFERANSER

1. Allegretta, M. Niklas, J.A., Sriram, S. og Albertini, R.J., Science 247: 718-721

(1990). 2. Bancherau, J. og Rybak, M.E., i: The Cytokine Handbook, 2<nd> Ed., Thompson Ed., Academic Press New York, pp 99 (1994).

3. Cohen, I.R., Immunology Today 13:490-494 (1992).

4. Cohen, I.R., i: Selective Immimosuppression: Basic Concepts and Clinical Applications (eds. Adorini, L., Capra, D.J., Waldmann, H.) Chem. Immunol. Karger, Basel, 60, 150-60(1995).

5. Kristiansen, T., Sparrman, M. og Heller, L., Biosci 5 fsu<pp>l IV 149-155 (1983).

6. Liblau, R.S., Singer, S.M. and McDevitt, H.O., Immunology Today 16: 34-38 (1995). 7. Moore, K.V., 0'Garra, A., de Waal Malefyt, R., Vieira, P. og Mosman, T.R., Ann. Rev. Immunol. 11,165-190.

8. Mosman, T.R. og Coffman R.L., Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173 (1989).

9. Ota, K., Matsui, M., Milford, E.L., Mackin, G.A., Weiner, H.I. og Hafler, D.A., Nature 346, 183-187(1990). 10. Rabinovitch, A. Sorensen, O., Sua-Pinzon, W.K., Rajotta, R.V. og Bleakley, R.C., Diabetologia37: 833-837.

11. Romagnani, S., Ann. Rev. Immunol. 12:227-257 (1994).

12. Snapper, CM. og Mond., J.J., Immunology Today 14:15-17 (1993).

13. Snapper, C.M., Waegell, W., Beernink, H. og Dasch, J.R., J. Immunol. 151:4625-36

(1993).

14. Zamvil, S.S. og Steinman, L., Ann. Rev. Immunol. 8: 579-621 (1990).

Claims (19)

1. Terapeutisk preparat for behandling av en T-cellemediert autoimmun sykdom eller tilstand, karakterisert ved at den omfatter et antigen og en biologisk aktiv bærer, hvor antigenet er et antigen som blir gjenkjent av inflammatoriske T-celler forbundet med patogenesen av nevnte sykdom eller tilstand, og hvor nevnte bærer er en fettemulsjon omfattende 10-20% triglyserider av plante-og/eller animalsk opprinnelse, 1,2-2,4% fosfolipider av plante- og/eller animalsk opprinnelse, 2,25-4,5% osmo-regulator, 0-0,05% antioksidant, og sterilt vann for å gi 100 ml.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at triglyserinene er av planteopprinnelse, fortrinnsvis soyabønneolje, av animalsk opprinnelse er avledet av eggeplomme eller bovint serum.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at fosfolipidene er av planteopprinnelse, fortrinnsvis avledet av soyabønner, eller av animalsk opprinnelse, fortrinnsvis avledet av eggeplomme eller bovint serum.

4. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at osmoregulatoren er valgt blant gruppenomfattende glyserol, sorbitol og xylitol.

5. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det omfatter 0,05% tokoferol som antioksidant.

6. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den biologisk aktive bæreren er en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2% eggeplomme fosfolipider, 2,5% glyserol og sterilt vann til 100%.

7. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den biologisk aktive bæreren er en fettemulsjon omfattende 20% soyabønneolje, 2,4% eggeplomme fosfolipider, 2,5% glyserol og sterilt vann til 100%.

8. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den biologisk aktive bæreren er en fettemulsjon omfattende 5% soyabønneolje, 5% medium kjedelengde triglyserider, 1,2% eggeplommelecitin, 2,5% glyserol og sterilt vann til 100 ml..

9. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at det forårsaker skift av en individuell T-celle cytokinrespons fra THl til TH2 uttrykt ved å gi en reduksjon IL-2 eller IFN-y T-celle cytokinrespons og en økning i IL-4 eller IL-10 T-celle cytokinrespons.

10. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for behandling av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), karakterisert ved at nevnte antigen omfatter et peptid avledet av det humane varmesjokkproteinet 60 (hsp 60) som blir gjenkjent av inflammatoriske T-celler forbundet med patogenesen av IDDM, hvor nevnte peptid er valgt blant gruppen omfattende peptidene opplistet i tabell 1.

11. Preparat ifølge krav 10 for behandling av IDDM, karakterisert ved at det omfatter peptidet p277 og en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2% eggeplomme fosfolipider, 2,5% glyserol og sterilt vann til 100%.

12. Preparat ifølge krav 11 for behandling av IDDM, karakterisert ved at det omfatter peptidet p277(Val<6->Val<n>) og en bærer omfattende en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2 eggeplomme fosfolipider, 2,5 glyserol og sterilt vann for å gi 100%.

13. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for behandling av multippel sklerose, karakterisert ved at nevnte antigen omfatter et peptid avledet av myelin basisk protein (MBP), som blir gjenkjent av T-celler involvert i patogenesen av multippel sklerose.

14. Anvendelse av en fettemulsjon omfattende 10-20% triglyserider av plante- og/eller animalsk opprinnelse, 1,2 til 2,4% fosfolipider av plante og/eller animalsk opprinnelse, 2,25 til 4,5% osmoregulator, 0-0,5% antioksidant og sterilt vann til 100% for fremstilling av et terapeutisk preparat ifølge krav 1.

15. Anvendelse av en fettemulsjon omfattende 10% soyabønneolje, 1,2% eggeplomme fosfolipider 2,5% glyserol og sterilt vann til 100% for fremstillingen av et terapeutisk preparat ifølge krav 6.

16. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at fettemulsjonen er "Intralipid" 10%.

17. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at fettemulsjonen er "Lipofundin" 10%.

18. Preparat ifølge krav 11 for behandling av IDDM, karakterisert ved at det omfatter peptidet p277 og en fettemulsjon, der fettemulsjonen er intralipid 10%.

19. Preparat ifølge krav 12 for behandling av IDDM, karakterisert v e d at det omfatter peptidet p277 (Val6-Val1') og en fettemulsjon, der fettemulsjonen er valgt fra "Intralipid" 10% eller "Lipofundin" 10%.