PL184145B1

PL184145B1 - Analogi peptydu p277, środek diagnostyczny do diagnozowania IDDM, sposób wykrywania IDDM, środek farmaceutyczny do leczenia lub zapobiegania IDDM

Info

Publication number: PL184145B1
Application number: PL95321091A
Authority: PL
Inventors: Irun R. Cohen; Dana Elias; Matityahu Fridkin
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1994-12-21
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2002-09-30
Also published as: DE69531004T2; RO116777B1; CN1175214A; JP2004026797A; PL321091A1; NZ301440A; IL116499A0; NO317350B1; HU224160B1; SI0820303T1; EP0820303A4; CZ190897A3; KR100400480B1; AU4686696A; JPH10511649A; UY24130A1; PT820303E; MX9704738A; BR9510102A; JP3420245B2

Abstract

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu- X3 -Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw nr 2) znamienny tym, ze X 1 i X2 oznacza reszte cysteiny lub reszte waliny, a X3 jest reszta treoniny lub lizyny, przy czym reszta X 1 i/lub X2 jest inna niz reszta cy- steiny, gdy X3 jest reszta treoniny oraz sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które wystepuja jako boczne lancuchy reszt aminokwa- sowych lub grup na koncu N lub C, obejmujace estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych. 9 Srodek diagnostyczny do diagnozowania cukrzycy insulinozaleznej (IDDM), znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera unieruchomiony na podlozu stalym peptyd o sekwencji I lub gotowy do iniekcji peptyd o sekwencji I 6 11 Val-Leu-Glv-GIy-Gly-X 1 -Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu- 19 X3 -Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw nr. 2) w której X1 i X2 oznacza reszte cysterny lub reszte walmy, a X3 jest reszta treoniny lub lizyny, przy czym reszta X1 i/lub X2 jest rnna niz reszta cystei n y , gdy X3 jest reszta treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które wystepuja jako boczne lancuchy reszt aminokwasowych lub grup na koncu N lub C, obejmujace estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych 10 Sposób wykrywania u pacjenta stadium poczatkowego lub zaawansowanego IDDM, obejmujacy badanie krwi i moczu, znam ienny tym, ze jako anty- gen do stwierdzenia obecnosci przeciwcial lub limfocytów T. oddzialujacych immunologicznie z ludzkim hsp60, stosuje sie peptyd o sekwencji I. 6 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1 -Ala-Leu-Leu-Arg-X2 -Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu- 19 X3 -Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr. 2) w którym. X1 i X2 oznacza reszte cysteiny lub reszte walmy, a X3 jest reszta treoniny lub lizyny, przy czym reszta X 1 i/lub X2 jest inna niz reszta cysteiny, gdy X3 jest reszta treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które wystepuja jako boczne lancuchy reszt aminokwasowych lub grup na koncu N lub C, obejmujace estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych 12 Srodek farmaceutyczny zwlaszcza do leczenia lub zapobiegania IDDM, znamienny tym, ze zawiera peptyd o sekwencji I 6 11 Val-Leu-Gly-Gl y-G ly-X 1 -Ala-Leu-Leu-Arg-X2 -Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu- 19 X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw nr: 2) w której X 1 i X2 oznacza reszte cysteiny lub reszte walmy, a X3 jest reszta treoniny lub lizyny, przy czym reszta X1 i/lub X2 jest inna niz reszta cysteiny, gdy X3 jest reszta treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które wystepuja jako boczne lancuchy reszt aminokwasowych lub grup na koncu N lub C, obejmujace estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O- acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych, i nosnik dopuszczalny farmaceutycznie PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest peptyd o sekwencji I:

11

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X_rAla-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu19

X₃-Pro-Aia-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr 2), w której X! i X₂ jest resztą cysteiny lub waliny oraz X₃jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym X, i X₂ nie mogą być jednocześnie resztami cysteiny, gdy X₃jest resztą treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występują jako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych.

Korzystnie przedmiotem wynalazkujest peptyd, p277(Lys¹⁹) o sekwencji I, wktórej X, jak i X2 sąresztami cysteiny, a X3jest resztąlizyny, (Sekw. nr 3); lub peptydy p277(Val⁶) (Sekw. nr 4) i p277(Val⁶-Lys¹9) (Sekw. nr 5) o sekwencji I, w której X, jest resztą waliny, X2 resztą cysteiny a X3 jest resztą odpowiednio treoniny lub lizyny; lub peptydy p277(Val”) (Sekw. nr 6) i p277(Val* ,-Lys¹⁹) (Sekw. nr 7) o sekwencji I, w której X! jest resztą cysteiny, X2jest resztą waliny, a X3jest resztą odpowiednio treoniny lub lizyny; lub peptydy p277(Val6-Val¹¹) (Sekw; nr 8) i p277(Val6ⁿ-Lys^I9) (Sekw; nr 9) o sekwencji I, w której zarówno X, jak i X2 sąresztami waliny a X3jest resztą odpowiednio treoniny lub lizyny;. Peptyd p277(Val6-Val¹-) w niniejszym zgłoszeniu patentowym jest opisywany także jako p277(V).

Przedmiotem wynalazku jest również środek diagnostyczny diagnozowania cukrzycy insulinozależnej (IDDM), w której jako substancję czynną stosuje się peptyd o sekwencji I:

11

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Xl-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Aia-Leu-A.sp-Ser-Leu19

X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr 2) w której: Xy X2 oznacza resztę cysteiny lub resztę waliny, a X3jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym reszta X1 i/lub X2 jest inna niż reszta cysteiny, gdy X3jest resztątreoniny, albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występująjako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych.

Inną odmianą wynalazku jest sposób wykrywania u pacjenta stadium początkowego lub zaawansowanego IDDM, obejmujący badanie krwi i moczu, w którym jako antygen do stwierdzenia obecności przeciwciał lub limfocytów T, oddziałujących immunologicznie z ludzkim hsp60, stosuje się peptyd o sekwencji I (Sekw. nr: 2), w którym: X1 i X2 oznacza resztę cysteiny łub resztę waliny, a X3jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym reszta X1 i/lub X2 jest inna niż reszta cysteiny, gdy X3 jest resztą treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występująjako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydro6

184 145 ksylowych. W korzystnej odmianie oznacza się obecność przeciwciał skierowanych przeciw hsp60 lub limfocytów T, oddziałujących immunologicznie z hsp60; przy czym wynik pozytywny, wykazujący obecność przeciwciał skierowanych przeciw hsp60 lub limfocytów T, oddziałujących immunologicznie z hsp60; wskazuje na wysokie prawdopodobieństwo występowania u pacjenta stadium początkowego lub zaawansowanego IDDM.

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny, zwłaszcza do leczenia lub zapobiegania IDDM zawierająca peptyd o sekwencji I:

11 yal-Leu-Gly-Gly-Gly-Kj-Ala-Leu-Leu-Arg^-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu19

X₃ -Pro-Ala-Asn-Glu-Asp SSekw. nr: 2) w której: X,i X₂ oznacza resztę cysteiny lub resztę waliny, a X₃jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym reszta X! i/lub X₂ jest inna niż reszta cysteiny, gdy X₃ jest resztą treoniny, albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występuj ąjako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych oraz nośnik dopuszczalny farmaceutycznie.

Korzystnie środek farmaceutyczny zawiera peptyd p277(Val⁶) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której Xj jest resztą waliny, X2 jest resztą cysteiny, a X₃ jest resztą treoniny albo peptyd p277(Val¹ *) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której Xj jest resztą cysteiny, X2 jest resztą waliny, a X3 jest resztą treoniny albo peptyd p277(Val6-Valⁿ) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której Xi i X2 są resztami waliny, a X3 jest resztą treoniny albo peptyd p277(Lys¹⁹) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której zarówno Xi i X2 są resztami cysteiny, a X3 jest resztą lizyny albo peptyd p277(Val6-Lys¹⁹) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której Xi jest resztąwaliny, X2jest resztą cysteiny, a X3 jest resztą lizyny albo peptyd p277(Valⁿ-Łys¹⁹) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której Xj jest resztą cyteiny, X2 jest resztą waliny, a X3,jest reszhąlizyny albo peptyd p277(Val6ⁿ-Lysi9) o sekwencji I (Sekw·. nr 2), w której zarówno Xi i X2 są resztami waliny, a X3 jest resztą lizyny.

W środkach farmaceutycznych preferowanym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem jest nośnik olejowy, np. emulsja oleju mineralnego znana jako niepełny adjuwant Freunda (IFA). Jednakże zarówno IFA, jak i pełny adjuwant Freunda (CFA; emulsja oleju mineralnego zawierająca różne ilości zabitych komórek Mycobacterium) są niedopuszczone do użycia u ludzi ponieważ olej mineralny nie jest metabolizowany i nie ulega degradacji w organizmie.

Autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że pewne emulsje tłuszczowe, używane przez wiele lat w dożylnym żywieniu pacjentów mogąbyć używane również jako nośniki w terapii peptydowej, z wykorzystaniem peptydów według obecnego wynalazku. Dwa przykłady takich emulsji to, dostępne w sprzedaży emulsje tłuszczowe znane jako Intralipid i Lipofundin. „Intralipid” jest zarejestrowanym znakiem handlowym firmy Kabi Pharmacia, Szwecja, stosowanym do emulsji tłuszczowej, używanej w żywieniu dożylnym. „Lipofundin” jest zarejestrowanym znakiem handlowym B.Braun Melsungen, Niemcy. Obie zawienyąolej sojowy jako źródło tłuszczu (100 lub 200 g w 1,000 ml destylowanej wody, odpowiednio: 1.0% lub 20%). Jako środki emulguj ące w Intralipidzie używane są fosfolipidy z żółtka kurzego (12 g/l destylowanej wody), a w Lipofundinie -lecytyna z żółtka kurzego (12 g/l destylowanej wody). Izotoniczność roztworu zarówno w Intralipidzie jak i Lipofundinie, uzyskuje się przez dodanie glicerolu (25 g/l).

Wynalazek zostanie przedstawiony w przykładach wykonania w odniesieniu do rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia stabilność p277 ip277 (Val6-Valⁿ); kółka czarne oznaczają wyniki dotyczące p277, a kółka białe - p277(Val6-Val^H); duże kółka odnoszą się do wyników uzyskanych po 1 tygodniu przechowywania, kółka średniej wielkości dotyczą wyników uzyskanych po 9 tygodniach przechowywania, a najmniejsze po 20 tygodniach przechowywania; fig. 2 przedstawia, proliferację limfocytów T szczepu NOD diabetogennego klonu C9 w odpowiedzi napeptydy p277 (kółka czarne) i p277(Val-Valⁿ) (kółka białe); fig. 3 przedstawia, proliferację limfocytów T pochodzących z trzustek myszy szczepu NOD w obecności peptydu p277(Lys'9);

18-4145 w każdej grupie wiekowej przebadano proliferację limfocytów T, pochodzących z trzustek 5 samic szczepu NOD, w odpowiedzi na peptydy p277(Lys¹1) (kółka czarne), p277 (kółka białe) i kontrolę - peptyd p278 (czarne kwadraty); fig. 4 przedstawia, proliferację limfocytów T diabetogennego klonu C9 szczepu NOD w odpowiedzi na peptyd p277 (Lys¹⁹); fig. 5 przedstawia skuteczność zapobiegania cukrzycy wywoływanej podaniem STZ dzięki uprzedniemu podaniu p277(V) w IFA, w porównaniu z kontrolą lub leczeniem GADp34.

Wszędzie gdzie, w opisie wynalazku, używa się określenia „peptyd o sekwencji I”, rozumie się przez to także sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne, jeśli zachowują one biologiczną aktywność peptydu w stosunku do cukrzycy.

„Sole” peptydu według wynalazku są to fizjologicznie akceptowane sole organiczne i nieorganiczne.

„Funkcjonalne pochodne” peptydu I obejmują pochodne, które mogą być uzyskiwane z grup funkcyjnych, które występ^^ako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup N- lub C-końcowych, ogólnie znanych i są objęte zakresem wynalazku tak długo jak długo pozostają farmaceutycznie dopuszczalne tj. nie znoszą aktywności peptydu w odniesieniu do aktywności peptydu p277, nie wywierają toksycznego wpływu na składniki je zawierające i nie wpływają szkodliwie na ich właściwości antygenowe. Do „funkcjonalnych pochodnych”, nie zalicza się związków, w których nastąpiło przekształcenie jednego aminokwasu w inny.

Zgodnie z powyższym pochodne te mogą obejmować np. estry alifatyczne grup karboksylowych; amidy grup karboksylowych, otrzymywane w reakcji z amoniakiem lub pierwsze- lub drugorzędowymi aminami; N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych powstałych w reakcji z grupami acylowymi (np. alkanoil lub cyklowęglowe grupy aroilowe); lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych (np. reszt serynowych lub treoninowych) powstałe w reakcji z grupami acylowymi.

Peptyd o sekwencji I będący przedmiotem wynalazku może być używany zarówno jako immunogen w zestawach farmaceutycznych, szczególnie w szczepionkach, używanych do złagodzenia i leczenia IDDM, oraz jako antygen w zestawach używanych do wykrywania IDDM.

Używany jako środek terapeutyczny lub jako szczepionka profilaktyczna, peptyd będący przedmiotem niniejszego wynalazku, jest podawany z biologicznie aktywnymi nośnikami, które aktywują przesunięcie TH1 - TH2 autoimmunogennych limfocytów T. Pomocnicze limfocyty T typu CD4 są dzielone na dwie grupy w zależności od rodzaju cytokin, jakie wydzielająpo ich zaktywowaniu. (Mosmann i Coffman, 1989): limfocyty TH1 wydzielająIL-2 i INF-γ, podczas gdy limfocyty TH2 wydzieląjąIL-4 i IL-10. Tak więc najlepszym nośnikiemjest emulsja tłuszczowa, zawierająca 10 - 20% trójglicerydów pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego; 1,2 - 2,4% fosfolipidów pochodzenia roślinnego i/lub zwierzęcego; 2,25 - 4,5% regulatora osmotyczności: 0 - 0,5% cntyutleniacza i uzupełnienie sterylną wodą do 100%. Najlepszym tego typu nośnikiem jest Intralipid lub Lipofundin.

Zestawy terapeutyczne zgodne z obecnym wynalazkiem mogąbyć podawane doustnie lub pozcjelitowojcknp. podskórnie, domięśniowo, dożylnie, donosowo, dodbytniczo.

W trakcie rozwoju IDDM u zwierząt zachodzi ekspresja cząsteczek hsp60 lub cząsteczek, które wchodzą z nimi w reakcje krzyżowe i są następnie wydalane do krwi i moczu zwierzęcia. U zwierząt tych zachodzi również ekspresja przeciwciał i limfocytów T skierowanych specyficznie przeciwko tym cząsteczkom. Zatem obecność hsp60 (lub cząsteczek, które wchodząz nim w reakcje krzyżowe), przeciwciał, lub specyficznych limfocytów T skierowanych przeciwko tym cząsteczkom, umożliwia wykrywanie procesu IDDM zanim nastąpi zniszczenie komórek β i osobnik zachoruje na cukrzycę.

Poniższe przykłady określają skuteczność działania terapeutycznego z użyciem związków i zestawów niniejszego wynalazku w naukowo dopuszczalnych modelach zwierzęcych ludzkiej IDDM.

184 145

Materiały i Metody (i) Myszy. Samice mysie z hodowli wsobnej szczepu NOD/Lt dostarczone przez Centrum Hodowli Zwierząt Instytut im. Weizmanna, Rehovot, Izrael. U myszy tych, między 14 a 17 tygodniem życia spontanicznie rozwija się cukrzyca pochodzenia autoimmunogennego, stąd są dobrym modelem zwierzęcym ludzkiej EDDM.

(ii) Peptydy. Peptydy zostały zsyntetyzowane metodą standardowąFmoc przy użyciu syntezatora ABIMED (FRG) i oczyszczone metodą HPLC chromatografii odwróconych faz. Poprawność sekwencji potwierdzono przeprowadzając analizę składu aminokwasowego uzyskanych peptydów. Zsyntetyzowano następujące peptydy: peptyd p277; używany jako kontrola peptyd p278 o sekwencji: Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile (Sekw. nr 10), odpowiadający w pozycjach 458 - 474 cząsteczce ludzkiego hspóO; fragmenty p277: N-końcowy fragment p277 (p277.N), C-końcowy fragment p277 (p277.C), oraz peptyd będący połączeniem p277.C i p278 (p277.C - p278); peptyd p277(Lys¹⁹), peptyd p277 zawierający szereg różnych podstawień aminokwasowych w miejsce dwóch reszt cyteiny występujących w jego sekwencji tj.: p277 zawierający mostek dwusiarczkowy [p277(mostek CysCys)]; p277 mający obie reszty cysternowe zastąpione przez reszty waliny [p277(Val⁶-Val¹¹)] lub przez reszty seryny [p277(Ser⁶-Ser^u)].

(iii) Myszom wstrzykiwano podskórnie, w okolicę karku 0,1 ml zawiesiny p277 lub innych peptydów lub albuminę z surowicy wołowej (BSA, zakupiona w firmie Sigma, St. Louis, MO, USA). Antygeny rozpuszczano w PBS i zawieszano w równej objętości oleju mineralnego (niepełny adiuwant Freunda (IFA); Sigma) lub 10% Intralipidzie. Podczas trwania eksperymentu (w7,12,15,lub 17, a u tych osobników, które przeżyły również i w 40 tygodniu życia) o godzinie 10 rano sprawdzano poziom glukozy we krwi po jedzeniu, jak opisano (Elias i in., 1991). Za znaczące przypadki hiperglikemii uważano te, w których stężenie glukozy było równe lub większe niż 11,1 mmoli/1. Poziom ten uznano za krytyczny bowiem j est to stężenie glukozy we krwi wyższe, od średniego stężenia glukozy we krwi oznaczonego w próbie losowej 100 zdrowych myszy, o wartość równą trzy razy χ odchylenie standardowe (dane nie prezentowane). Przeprowadzono badanie histologiczne wysepek trzustki w preparatach barwionych hematoksyliną lub eozyną. Skrawki były pobierane do badania przez dwóch niezależnych obserwatorów, obaj nie wiedzieli z jakiej grupy pochodzi zwierzę, od którego pobierali wycinek. Aby wyznaczyć różnice statystyczne pomiędzy doświadczeniami, w których używano zawiesiny różnych peptydów wykorzystano test chi-kwadrat.

(iv) Badanie proliferacji limfocytów T. Komórki klonu C9 i zawiesiny komórek wątroby pobrane od samic myszy NOD badano pod kątem proliferacji komórek, metodą opisaną poprzednio (Elias i in. 1991). W skrócie, lxl0⁵ komórek klonu C9/ml lub lxl0⁶ limfocytów śledziony/ ml inkubowano przez 72 godz. w 0,2 ml pożywki hodowlanej na 11 płytkach mikrotitracyjnych w obecności odpowiedniego antygenu (stężenie antygenu 5 (pg/ml) lub bez antygenu, test ten przeprowadzano w czterech niezależnych powtórzeniach. Proliferację oznaczano mierząc poziom włączania ³H-tymidyny do DNA komórek podczas ostatnich 12 godzin ich inkubowania. Rezultaty przeliczano na współczynnik symulacji: stosunek średniej wartości cpm w obecności antygenu do średniej wartości cpm tła (przy braku antygenu). Powtórzenia (cztery) różniły się między sobą o nie więcej niż 10% średniej wartości cpm. W doświadczeniach z limfocytami śledziony średnia wartość tła była niższa niż 1000 cpm, a w doświadczeniach z komórkami C9 200 cpm· Trzustka każdej myszy badana była osobno. Wyniki uzyskane dla każdej z grup myszy są przedstawione jako wartość średnia +/- odchylenie standardowe (SD).

przykład I. Wpływ p277 lub jego fragmentów na myszy szczepu NOD.

^by sprawdzić, w jakim układzie dwa 12 aminokwasowe fragmenty peptydu p277 zachowują właściwości terapeutyczne tego peptydu, samicom myszy szczepu NOD przez 7 tygodni wstrzykiwano podskórnie 50 pg zawiesiny różnych peptydów w oleju. W 40 tygodniu życia określa*¹⁰ stan myszy.

Rezultaty przedstawia tabela I. Można zauważyć, że kontrolny peptyd p278 nie ma żadnego wpływu na rozwój choroby: spośród 40 myszy, którym go podano u wszystkich rozwinęła

184 145 się cukrzyca, a 90% zmarło przed osiągnięciem 40 tygodnia życia. Zupełnie inną sytuację obserwowano przy zastosowaniu peptydu p277: całkowicie zapobiegał on śmierci zwierząt i leczył 60% spośród 20, którym go podano. Pojedyncze fragmenty p277 były mniej skuteczne: N-koniec p277 (p277.N), C-koniec p277 (p277.C) oraz mieszanina obydwu (p277.N, p277.C), wykazywały o połowę mniejszą skuteczność niż cały peptyd p277. Stworzono również układ, w którym peptyd p277.C został zsyntetyzowany i dołączony do peptydu p278, jednak układ ten, p277.C-p278 nie był skuteczniejszy niż sam p277.C. Można zatem stwierdzić, że pełen efekt terapeutyczny wymaga stosowania całego peptydu p277.

Tabela I

Wpływ peptydu p277 lub jego fragmentów na myszy szczepu NOD Stan myszy w 40 tygodniu cukrzycy

Podany peptyd (50 pg)	Liczba osobników	Zdrowe (%)	Wykazujące hiperglikemię (%)	Martwe (%)
p278	40	0	100	90
p277	20	60*	40	0*
p277.N	20	20	80	50*
p277.C	20	30	70	40*
p277.N, p277.C	20	35*	65	40*
p277.C-p278	20	25	75	50*

* p <0,01 w porównaniu do grupy, której podawano peptyd kontrolny p278.

Przykład II. Wpływ peptydu p277 zawierającego podstawienia aminokwasowe na myszy szczepu NOD.

Badano wpływ następujących peptydów na myszy NOD: p277, p277 (mostek Cys-Cys), p277(Val6-Val^H) oraz p277 (SeASer¹¹).

Samicom myszy NOD w 12 tygodniu życia podawano podskórnie 100 pg peptydu zawieszone w 0,2 cm3 oleju mineralnego (IFA). W 30 tygodniu życia badano częstość występowania cukrzycy u tych myszy.

Wyniki przedstawia tabela II. Peptyd p277(Val6-Valⁿ) był równie skuteczny w leczeniu cukrzycy, jak peptyd p277. Częstość występowania cukrzycy u myszy, którym nie podawano żadnego peptydu wynosiła 80%, podczas gdy u myszy, którym podawano p277 lub p277(Val6-Valⁿ) wynosiła ona odpowiednio 22% i 23%. Z drugiej strony ani p277 (mostek Cys-Cys), ani p277(Ser⁶-Serⁿ) nie wykazywały żadnego efektu terapeutycznego. Dwie dodatkowe odmiany peptydu p277, w których reszty cysteiny w pozycji 6 i 11 zostały zastąpione przez reszty alaniny lub kwasu γ -aminomasłowego były również nieskuteczne w badaniach prowadzonych in vitro na komórkach pochodzących z klonu C9 lub na limfocytach T pochodzących z trzustek myszy szczepu NOD. Ponieważ te dwa peptydy były dodatkowo nierozpoznawane przez specyficzne limfocyty T skierowane przeciw p277 (dane nie prezentowane), nie były one używane w dalszych badaniach in vivo, dotyczących własności terapeutycznych.

Tabela II

Wpływ peptydu p277 zawierającego podstawienia aminokwasowe na myszy szczepu NOD

Podany peptyd	Częstość występowania cukrzycy (%)	Liczba badanych myszy
1	2	3
brak	80	100
p277	22*	200

184 145 ciąg dalszy tabeli II

1	2	3
p277 (mostek Cys-Cys)	70#	10
p277 (Val6-Val¹1)	23*	52
p277 (Ser⁶-Ser)	85#	20

* p<0,01 w porównaniu do częstości występowania cukrzycy u myszy, którym podawano tylko adjuwant.

# Rozbieżność nie wpływająca na wynik w porównaniu do częstości występowania cukrzycy u myszy, którym podawano tylko adjuwant.

Przykład III. Stabilność p277 (Val⁶-Valⁿ).

Ponieważ przyczyną zastąpienia reszt cysternowych w cząsteczce peptydu p277 była jego niska stabilność, zbadano zatem stabilność peptydu p277(Val6-Val¹¹). Badania te przeprowadzono w różnych odstępach czasu od momentu syntezy tego peptydu. Peptyd p277 jest niestabilny i ulega rozkładowi nawet przy zachowaniu wszystkich zasad dotyczących jego przechowywania (liofilizowany proszek w próżni, -20°C).

Aby porównać stabilność p277 ijego analogu p277(Val6-Valⁿ) oba peptydy zsyntetyzowano w tym samym czasie i przechowywano w postaci suchego proszku w temp. -20°C. 1, 9 i 20 tygodni od dnia syntezy pobierano odważki, ważonoje, rozpuszczano, a następnie badano. Stabilność peptydu sprawdzano określając jego zdolność do stymulacji limfocytów T klonu C9. Figura 1 przedstawia wyniki eksperymentu. Widoczne jest, że p277 traci większość swojej skuteczności po 9 tygodniach od dnia syntezy, a całkowita utrata skuteczności następuje po upływie 20 tygodni; aktywność p277(Val6-Valⁿ) nie ulega zmianie nawet po 20 tygodniach przechowywania.

Ponieważ uważa się, że niestabilność p277 związana jest z występowaniem w obrębie jego cząsteczki reszt cysteiny, można spodziewać się, że jakikolwiek peptyd (będący analogiem peptydu, któryj est przedmiotem niniej szego wynalazku), który będzie wykazywał biologicznąaktywność p277, będzie mógł uzyskać większą stabilność niż peptyd 277, w ten sam sposób jaki przedstawiono na przykładzie p277(Val6-Valⁿ).

Przykład IV. Stosowanie p277 lub p277(Val6-Valⁿ) u samic myszy szczepu NOD odwraca proces zapalenia wysp trzustkowych.

W 12 tygodniu życia samicom myszy NOD podano podskórnie 100 pg/mysz niezmodyfikowanego p277, lub p277(Val6-Val¹¹) zawieszone w 0,1 cm³ oleju mineralnego (IFA). Myszom należącym do grupy kontrolnej podano emulsję zawierającą PBS lub olej mineralny. W 6 miesiącu życia z każdej grupy wybrano losowo 5 mysz, pobrano z nich trzustki, które następnie utrwalono w utrwalaczu Bouina i pocięto na skrawki, które barwiono hematoksyliną:eozyną. Ponieważ u myszy należących do grupy kontrolnej rozwij ała się cukrzyca, izolacj ę trzustki przeprowadzano z wybranych losowo myszy w 5 miesiącu życia. Poziom glukozy we krwi myszy kontrolnych w momencie pobrania trzustki wynosił 29-48 mmoli/1. Wyniki przedstawia tabela DI.

Tabela III

Stosowanie p277 lub p277(Val⁶-Val11) u samic myszy szczepu NOD odwraca proces zapalenia wysp trzustkowych

Podany peptyd (12 tydzień życia)	Ilość wysepek trzustkowych	Badanie Histologiczne (22 tydzień życia)
Wysepki nienaruszone (%)	Zapalenie przywysepkowe (%)	Zapalenie wewnątrzwysepkowe (%)
żaden	83	10	23	67
p277	49	25	69	6
p277(Val6-Val11)	62	52	31	17

18-4145

W 12 tygodniu życia, w momencie rozpoczęcia leczenia u myszy nieleczonych ok. 60% wysepek wykazuje cechy zapalenia wewnątrzwysepkowego, u ok. 20% można stwierdzić występowanie zapalenia przywysepkowego, a tylko 20% wysepek nie wykazuje żadnych cech zapalenia. Naciek wewnątrzwysepkowy uważany jest za poważną formę zapalenia wysepek trzustkowych, związaną z unieczynnieniem komórek β. Tabela III przedstawia wyraźną różnicę w wyglądzie wysepek wyizolowanych od myszy, którym podawano peptydy, a wysepkami izolowanymi od myszy należących do grupy kontrolnej, którym podawano tylko olej. U myszy należących do grupy kontrolnej (którym podawano tylko olej) obserwowano stale postępujący spadek ilości nienaruszonych wysepek, a w 22 tygodniu życia tylko 10% wysepek trzustkowych pozostało nienaruszonych. U myszy z grupy kontrolnej w 22 tygodniu życia 67% wysepek ma cechy zapalenia wewnątrzwysepkowego, a pozostałe 23% wysepek wykazuje cechy zapalenia przywysepkowego. W przeciwieństwie do myszy z grupy kontrolnej, u myszy, którym podano p277, lub p277(Vcl6-Val¹l) obserwowano wzrost ilości zdrowych wysepek (pomiędzy 25% a 52%) i spadek ilości wysepek wykazujących cechy zapalenia wewnątrzwysepkowego (pomiędzy 6% a 17%); liczba wysepek wykazujących cechy zapalenia przywysepkowego wynosiła 31 % - 69%. Można wnioskować, że z podaniem p277 i p277(Vc16-Vc1¹ ') wiąże się poprawa obrazu histologicznego trzustki (związana z odwróceniem stopnia nasilenia zapalenia wysepek trzustkowych), która utrzymuje się ponad 3 miesiące od momentu podania peptydu.

Dodatkowe wyniki uzyskane podczas podawania p277(V) samicom myszy szczepuNOD.

Wykonano 15 dodatkowych doświadczeń, podczas których grupom składającym się z 10 samic myszy NOD między 12 a 15 tygodniem życia podawano zawiesinę p277(V) w oleju, lub tylko sam olej. Spośród całkowitej liczby 150 myszy, którym podano tylko olej, u 90% rozwinęła się cukrzyca, a 85% zmarło przed osiągnięciem 32 tygodnia życia. Myszy, którym podano p277(V) wykazywały znaczne obniżenie zapadalności na cukrzycę - tylko 50% (pO,01), a tylko 20% spośród nich zmarło (p<0,01). Dlatego też można stwierdzić, że nawet późne podanie p277(V) skutecznie hamowało rozwój śmiertelnej cukrzycy.

PrzykładV. Terapia peptydowa cukrzycy typu I, z wykorzystaniem p277(Vcl6-Val¹¹) w postaci emulsji lipidowej.

Autoimmunologiczne zniszczenie komórek β trzustki produkujących insulinę jest powodowane przez limfocyty T. Między 5 a 8 tygodniem życia myszy rozwija się zapalenie naciekowe wokół wysepek trzustki, następuje zniszczenie komórek β, co prowadzi do niedoboru insuliny w organizmie i ujawnienia się cukrzycy między 14 a 20 tygodniem życia; przed osiągnięciem 35-40 tygodnia życia, prawie 100% samic myszy szczepu NOD ma cukrzycę.

Samicom myszy NOD podano podskórnie 100 pg peptydu p277(Val6-Vall^I)/masz, zawieszonegow0,1 mlPBSlub 10% emulsji lipidowej składającej sięw 10% z oleju sojowego; 1,2% z fosfolipidów jaja kurzego i 2,25% z glicerolu (Intralipid Kabi Pharmacia Ab, Szwecja).

W 6 miesiącu życia badano częstość występowania cukrzycy i poziom wydzielania przeciwciał skierowanych przeciw β277(Val6-Val¹¹). Cukrzycę obserwowano jako proces stale utrzymującej się hiperglikemii, gdzie poziom glukozy we krwi mierzony co tydzień przynajmniej przez dwa kolejne tygodnie przekraczał 11,1 mmolad, poziom glukozy oznaczano przy użyciu Beckman Glucose Analyzer II. Za korzystny wynik leczenia peptydowego przyjmowano utrzymywanie normalnego stężenia glukozy we krwi (<11,1 mmola/l) i reemisję zapalenia wewnątrzwysepkowego wysepek trzustki oraz pobudzenie produkcji przeciwciał skierowanych przeciw podanym peptydom (jest to wskaźnik odpowiedzi immunologicznej typu TH-2). Wyniki przedstawia tabela IV.

Tabela IV

Częstość występowania cukrzycy w 6 miesiącu życia

Podany związek	Częstość występowania cukrzycy (%)	Śmiertelność (%)
1	2	3
p277(Val⁶-Val^H)/PBS	90	80

184 145 ciąg dalszy tabeli IV

1	2	3
p277(Vai6-Val-l-)Intralipid	45*	20*
żaden	100	90

* p < 0,01 w porównaniu z grupą myszy NOD niczym nie leczonych.

Jak wynika z tabeli IV leczenie, z wykorzystaniem peptydów (będących przedmiotem niniejszego wynalazku) podanych w Intralipidzie, w znacznym stopniu obniżało częstość zapadania na cukrzycę oraz śmiertelność. Z drugiej strony leczenie oparte na podawaniu peptydów zawieszonych w PBS było nieskuteczne.

Przykład VI. Peptydy p277 i p277(Val6-Val^H) wykazują immunologiczną reakcję krżyżową.

Limfocyty T klonu C9 izolowane z myszy NOD, u których jeszcze nie rozwinęła się cukrzyca, inkubowano w obecności peptydów: p277 (kółka czarne), p277(Vai6-Val9) (kółka białe), p277(Ser6-Serⁿ) (kwadraty czarne) i p277(mostek Cys-Cys) (białe romby). Wyniki przedstawia fig. 2. Stwierdzono, że klon C9 przejawia pozytywnąodpowiedź polegającąna proliferacji po zastosowaniu peptydów p277 i p277(Val6-Val¹-).

Obserwacja ta dowodzi, że p277 i p277 (Vai6-Val-¹) wchodzą ze sobą w reakcję krzyżową, podczas gdy peptydy p277 (SeASer¹¹) i p277 (mostek Cys-Cys), które nie wykazują działania terapeutycznego, nie wchodzą w immunologiczną reakcję krzyżową.

Przykład VII. U pacjentów z wcześnie zdiagnozowanąlDDM obserwuje się proliferację limfocytów T w odpowiedzi na podanie p277 i p277(Val6-Val¹¹).

U wcześnie zdiagnozowanych (2-4 tyg.) pacjentów przeprowadzono testy na proliferację. Od pacjentów uzyskano limfocyty krwi obwodowej, które badano in vitro pod kątem proliferacji. Proliferację wywoływaną przez peptydy p277, p277(Val6-Val^H) (wchodzące w skład białka hsp60) mierzono na podstawie ilości włączonej ³H-tymidyny; jako kontrolę stosowano peptyd p278. Proliferację limfocytów T określano podając indeks stymulacji (SI) tj.: stosunek ilości tymidyny wbudowanej pod wpływem peptydu do ilości tymidyny wbudowanej przez limfocyty T przy braku antygenu (tło).

Tabela V

U pacjentów z wcześnie zdiagnozowanąlDDM obserwuje się proliferację limfocytów T w odpowiedzi na podanie p277 i p277(Val -Val )

Pacjent	Proliferacja limfocytów T (SI)
p277	p277(Val6-Val”)	p278
IDDM#68	3,5	3,2	0,8
IDDM#69	2,5	5,0	0,5

Jak wynika z tabeli V u pacjentów, u których wcześnie zdiagnozowano IDDM, zaobserwowano odpowiedź na podanie zarówno p277(Val6-Val-¹) jak p277. Zatem, możemy stwierdzić, że p277(Val6-Val¹¹) jest immunologicznym równoważnikiem p277. Ponieważ działanie terapeutyczne p277 opiera się na rozpoznaniu immunologicznym, fakt że p277(Val6-Val1¹ )jest immunologicznym równoważnikiem p277, umożliwia zastosowanie do leczenia cukrzycy p277(Val6-Val¹¹) zamiast p277.

Przykład VIII. Limfocyty T odpowiadająna hsp60 i peptyd p277 (V) zarówno u pacjentów chorych na IDDM, jak i u ludzi zdrowych.

U 21 pacjentów chorych na IDDM oraz 14 zdrowych, badano proliferację pod wpływem anty-hsp60 i p277(V), test prowadzono jak opisano w przykładzie VII. Tabele VI i VII przedstawiają poziom proliferacji limfocytów T (indeks pobudzenia, SI) w odpowiedzi na antygen kontrolny (Ag), pełne białko hsp60 oraz p277(V). Antygenem kontrolnym stosowanym w tym

184 145 doświadczeniu była anatoksyna tężcowa i wirus grypy -szczep Texas. SI o wartości 3 lub więcej uważano za wynik pozytywny.

Tabela VI

Proliferacja limfocytów T u pacjentów, u których zdiagnozowano IDDM

Pacjent	Wiek (lata)	Czas od wykrycia (tyg., mies.)	Proliferacja limfocytów T (SI) w odpowiedzi na:
Antygen kontrolny (Ag)	hsp60	p277(V)
1. LM	32	3,5 mies.	+	+	-
2. G	25	24 mies.	+	+	-
3.	23	6 mies.	+	+	-
4. DV	20	3 tyg.	+	+	-
		5 tyg.	+	+	+
5. SD	15	⁶ tyg.	+	+	+
6. P	15	⁴ tyg.	+	-	-
7. G	60*	5 tyg.	+	+	+
		7 tyg.	+	+	+
8. F	45*	6 tyg.	+	+	+
9. IS	53	2 tyg.	+	+
10. T	20	⁴ tyg.	+	+	+
11. KK	21	⁴ tyg.	+	+	-
12. RI	40	6 tyg.	+	-	-
13. MS	5	1 tyg.	+	-	-
14. KB	5	2 mies.	+	+	+
15. BI	11,3	3 tyg.	+	-	-
16. YY	60	2 mies.	+	+	-
17. KA	12	⁴ tyg.	-	-	-
18. ZA	12	⁴ tyg.	+	+	+
19. A	17,5	5 lat	+	+	+
20. N	17,5	5 lat	+	+	+
21. A	19,7	7 lat	+	+	+

* Pacjenci, u których obserwuje się pozytywną odpowiedź na przeciwciała skierowane przeciw GAD zalicza się do chorych na cukrzycę typu I, a nie na cukrzycę typu II, pomimo, późnego wieku zachorowania.

Tabela VII

Proliferacja limfocytów T u ludzi zdrowych

Dawca	Proliferacja limfocytów T (SI) w odpowiedzi na:
Antygen kontrolny (Ag)	hsp60	p277 (V)
1	2	3	4
1	+	-	-
2	+	-	-

ciąg dalszy tabeli VII

1	2	3	4
3	+	nzb	+
4	+	-	-
5	+	+	+
6	+	-	-
7	+	-	-
8	+	-	-
9	+	-	-
10	+
11	+	+	-
12	+	-	-
13	+	+	-
14	+	-	-

nzb - nie zbadano.

Tabela VIII jest tabeląpodsumowującądane. 86% i 52% pacjentów odpowiada na podanie odpowiednio hsp60 i p277(V); w grupie kontrolnej wartości te wynoszą odpowiednio 21 % i 14% (p,05). Można zatem stwierdzić u grupy pacjentów IDDM zdecydowanie pozytywną odpowiedź limfocytów T na podanie hsp60 i p277(V). Wskazuje to na znacznie wyższą ilość osób wrażliwych na hsp60 i p277(V) w. grupie pacjentów IDDM, niż wśród ludzi zdrowych.

Tabela VIII

Częstość pozytywnej odpowiedzi limfocytów T u osób zdrowych i IDDM

Grupa badana	Częstość odpowiedzi limfocytów T na :
hsp60 (%)	p277(V) (%)
IDDM	18/21 (86)	11/21(52)*
osoby zdrowe	3/14(21)	2/14 (14)

* p <0,05 wyznaczona metodą/ , w porównaniu do częstości występowania odpowiedzi przeciw p277(V) wśród ludzi zdrowych.

Przykład IX. Proliferacja limfocytów T pochodzących ze szczepu NOD w odpowiedzi na podanie p277 (Lys¹⁹).

Peptyd p277(Lys‘9) różni się od peptydu p277 tylko jedną resztą aminokwasową. Aby potwierdzić, że p277(Lys’9) jest autoantygenem u myszy szczepu NOD porównano proliferację limfocytów T w odpowiedzi na podanie peptydu p277 oraz peptydu p277(Lys¹9). Figura 3 przedstawia wynik tego eksperymentu. Można stwierdzić, że limfocyty T pochodzące z trzustek samic myszy szczepu NOD proliferują w odpowiedzi na podanie antygenu p277(Lys¹9) w tym samym stopniu co po podaniu p277. Nie zaobserwowano żadnej proliferacji komórek w odpowiedzi na podanie peptydu kontrolnego p278.

Wyniki te dodatkowo potwierdzono używając klonu C9. W doświadczeniu tym stwierdzono, że klon limfocytów T pochodzących od chorych na cukrzycę myszy szczepu NOD proliferuje w odpowiedzi na podanie ludzkiego peptydup277 (Eliasiin., 1991). Stwierdzono również, że komórki C9 proliferująw odpowiedzi na podanie peptydu p277(Lys¹⁹) w tym samym stopniu co na podanie peptydu p277 (fig. 4).

18-4145

Przykład X. Wpływ peptydu p277(Lys¹9) na samice myszy szczepu NOD.

Autorzy wynalazku wcześniej opisali fakt, że zaawansowane zapalenie wysp trzustkowych występujące w trzecim miesiącu życia u samic myszy NOD, może być zahamowane przez podanie im pojedynczego zastrzyku ludzkiego peptydu p277; u myszy tych obserwowano niższą częstość występowania klinicznej postaci cukrzycy i niższą śmiertelność spowodowaną poważną hiperglikemią. Aby sprawdzić czy peptyd p277(Lys’9), który pochodzi od myszy, jest równie skuteczny co peptyd p277, trzymiesięcznym samicom myszy szczepu NOD podano 100 pg ludzkiego peptydu p277 lub 100 pg p277(Lys¹9) w IFA.

Peptydy p277 lub p277 (Lys¹9) rozpuszczono w buforze PBS do końcowego stężenia 2 mg/ml c następnie zawieszono w równej objętości niepełnego adiuwanta Freunda (IFA). Grupom składającym się z 10 trzymiesięcznych samic myszy szczepu NOD każda, wstrzykiwano podskórnie 0,1 ml (100 g) emulsji zawierającej jeden z dwóch opisanych wcześniej peptydów. Myszom w grupie kontrolnej wstrzykiwano emulsję składającą się z PBS i IFA. Po 4 tygodniach myszy skrwawiano i oznaczano poziom glukozy w ich krwi, oznaczenia wykonywano z użyciem Beckmann Glucose Analyzer II. W 6 miesiącu życia określano częstość zapadania na hiperglikemię oraz śmiertelność. Uważano, że u myszy rozwinęła się cukrzyca jeżeli stężenie glukozy we krwi było wyższe niż 11 mM.

Rezultaty przedstawia tabela IX. W 6 miesiącu życia u 90% myszy należących do grupy kontrolnej rozwinęła się hiperglikemią, a 60% padło na skutek cukrzycy. Zarówno podanie p277 jak i p277(Lys¹9) zapobiegało rozwojowi cukrzycy (odpowiednio 40% i 50%) oraz śmierci (odpowiednio 10% i 20%). Zatem mysi p277(Lys*9) wydaje się być równie skuteczny w zwalczaniu zaawansowanego zapalenia wysp trzustkowych, co obcy p277.

Tabela IX

Skuteczność p277 i p277(Lys19) w leczeniu cukrzycy

Podano w 3 miesiącu życia	Cukrzyca w wieku 6 miesięcy
Hiperglikemią (%)	Śmiertelność (%)
p277(Lys19)	50*	20*
p277	40*	10*
PBS	90*	60

* p < 0,05

Rezultaty te wskazują, że odpowiedź proliferacyjna limfocytów T w szczepie NOD obserwowana po podaniu cząsteczki ludzkiego hsp60 i peptydu p277 jest równoważna odpowiedzi na mysi hsp60 i mysi peptyd p277(Lys¹9). Efekt ten obserwowano zarówno w przypadku limfocytów T pochodzących z diabetogennego klonu C9 jak i spontanicznej odpowiedzi rozwijającej się w trzustkach myszy będących w stanie przedcukrzycowym. Co więcej, β277(Las¹9) był równie skuteczny w leczeniu cukrzycy u myszy szczepu NOD jak p277. Limfocyty T izolowane z trzustek myszy (będących tej samej płci i w tym samym wieku, co badane myszy szczepu NOD) należących do innych szczepów nie wykazywały spontanicznej proliferacji w odpowiedzi na podanie p277 (dane nie zaprezentowane).

Uważa się, że zaobserwowanie występowania cutoimmunogeniczności diabetogennych limfocytów T w odpowiedzi na sekwencję mysiego hsp60 jest dowodem na istnienie procesu cetoimmenizacaj nego.

Przykład XI. Wpływ p277(V) na cukrzycę indukowaną STZ.

Streptozotocyna STZjest specyficzną toksyną działającąna komórki β, która podana w dawce 200 mg/kg w ciągu 24 - 48 godzin, wywołuje cukrzycę niszcząc komórki β. Podawana w małych dawkach subtoksycznych indukuje, u genetycznie podatnych myszy, zapalenie wysp trzustkowych prowadzące do cukrzycy. W zależności od dawki STZ proces zapalny może trwać od 20 do 30 dni. Zwykłym sposobem wywoływania cukrzycy przy zastosowaniu STZ (zw. Iow16

184 145 dose STZ) jest podanie 200 mg na kg masy ciała zwierzęcia; przez pięć kolejnych dni wstrzykuje się dawkę 40 mg/kg (Like i Rossini 1976). Zauważyliśmy, że obniżenie dawki całkowitej do 150 mg/kg (30 mg/kg x 5) powoduje rozwój cukrzycy w ciągu 80 do 100 dni. Ta wolno rozwijająca się postać cukrzycy wywoływanej przez STZ, lepiej naśladuje autoimmunogenną cukrzycę rozwijającą się u ludzi i wykazuje ten sam czas trwania, co stadium przedkliniczne u spontanicznie rozwijających cukrzycę myszy szczepu NOD (Castano i Eisenbarth, 1990). Co więcej, silne efekty toksyczne obniżają się przy zastosowaniu mniejszej dawki STZ.

Białko szoku cieplnego o masie 60 kDa (hsp60) odgrywa rolę w powstawaniu cukrzycy zarówno u myszy szczepu NOD (Elias i in., 1990), jak i cukrzycy indukowanej STZ (Elias i in., 1994). Uprzednio wykazano, że zarówno odpowiedź proliferacyjna limfocytów T, jak i produkcja przeciwciał następująca po podaniu hsp60 ujawnia się przed zapoczątkowaniem jawnej postaci cukrzycy. Od myszy szczepu NOD będących w fazie przed ujawnieniem się cukrzycy uzyskano klony limfocytów T, specyficzne względem hsp60 i stwierdzono, że mogą one „przenosić” zapalenie wysp trzustkowych oraz hiperglikemię na młode myszy NOD (Elias i in. 1991), lub myszy τγιδ NOD. Klony limfocytów T pochodzące z rozwijających cukrzycę myszy NOD rozpoznają 24 aminokwasowy peptyd, stanowiący od reszty aminokwasowej 437 do 460 część sekwencji hsp60, nazwany p277. Rozwojowi cukrzycy wywoływanej przez STZ towarzyszy pojawienie się w stadium przedklinicznym limfocytów T skierowanych przeciwko p277.

Przykłady podane powyżej wykazały, że p277(Val⁶-Valⁿ) chroni myszy szczepu NOD. Opisane poniżej doświadczenie miało na celu określenie skuteczność p277(V) w leczeniu cukrzycy wywoływanej niskimi dawkami STZ.

Samcom myszy, po 10 osobników w każdej grupie, podawano przez 5 dni dawkę 30 mg/kg STZ. Tydzień później myszom tym podano bądź 100 pg p277(V) zawieszonego w oleju, lub peptyd wchodzący w skład dekarboksylazy kwasu glutaminowego (GADp34) (Kaufman i in., 1993), mający istotny wpływ na rozwój cukrzycy u myszy NOD; lub sam olej. Taką samą dawkę podano powtórnie w 85 dniu życia. W setnym dniu życia myszy skrwawiono i ich krew badano pod kątem hiperglikemii (stęż. glukozy wyższe niż50nm/l). Wyniki przedstawiono nafig.5. Można zauważyć, że średni poziom glukozy we krwi myszy, którym podano GADp34 lub sam olej odpowiadał zakresowi hiperglikemii. U myszy, którym podano p277(V) średni poziom glukozy we krwi odpowiadał stężeniu prawidłowemu. Zatem p277(V) może być skutecznym środkiem używanym w leczeniu cukrzycy indukowanej STZ u samców szczepu C57BL/ksj oraz cukrzycy spontanicznie rozwijającej się u genetycznie podatnych samic myszy szczepu NOD. p277(V) można stosować do leczenia cukrzycy wywoływanej przez różne czynniki, u organizmów o różnych genotypach i obu płci.

Cała literatura cytowana poniżej, łącznie z artykułami naukowymi lub skrótami; opublikowanymi zagranicznymi zgłoszeniami patentowymi, lub odpowiadającymi im patentami Stanów Zjednoczonych; wydanymi patentami zagranicznymi lub Stanów Zjednoczonych, a także wszelkimi innymi odnośnikamijest całkowicie objęta zamieszczonymi niżej odnośnikami literaturowymi, wraz z danymi, tabelami, rysunkami i tekstem tam zamieszczonymi. Dodatkowo wszystkie odnośniki literaturowe znajdujące się w literaturze cytowanej poniżej również wchodzą w skład cytowanej literatury.

Odnośniki literaturowe dotyczące ogólnie znanych i standardowo stosowanych metod biochemicznych i ich poszczególnych etapów, nie są w żadnym wypadku przyznaniem, że jakikolwiek aspekt, opis, załącznik niniejszego wynalazku, jest zamieszczony, wymyślony lub sugerowany w pokrewnej dziedzinie nauki.

Poniższy opis specyficznych zastosowań wynalazku ujawnia całkowicie ogólną naturę wynalazku, którą inni przy zastosowaniu swych umiejętności (włączając metodykę zawartą w cytowanej literaturze) mogą łatwo modyfikować i/lub stosować w różnych celach, bez dodatkowych doświadczeń i nie odchodząc od głównej koncepcji wynalazku. Zatem modyfikacje, oparte na wskazówkach tu przedstawionych, uważa się za zawarte w znaczeniu i zakresie wynalazku. Frazeologia i terminologia użyte w opisie wynalazku nie podlegają ograniczeniom, lecz winny

184 145 być interpretowane przez badaczy w świetle technik i wskazówek zawartych w wynalazku, w połączeniu z ich wiedzą i umiejętnościami.

WYKAZ SEKWENCJI

INFORMACJE OGÓLNE:

ZGŁASZAJĄCY:

NAZWA: YEDA RESEARCH AND DEYELOPMENT CO .LTD ULICA: P.O. Box 95 MIASTO: Rehovot KRAJ: Izrael

KOD POCZTOWY: 76100 NAZWISKO: Iran R. COHEN ULICA: 11 Hankin St.

MIASTO: Rehovot KRAJ: Izrael

KOD POCZTOWY: 76354 NAZWISKO: Dana ELIAS ULICA: 57 Derech Yavne MIASTO: Rehovot KRAJ: Izrael

KOD POCZTOWY: 76344 NAZWISKO: Matityahu FRIDKIN ULICA: 23 Miller St.

MIASTO: Rehovot

KRAJ: Izrael

KOD POCZTOWY: 76284

TYTUŁ WYNALAZKU: Analogi peptydu p277, sposób wytwarzania zestawu do diagnozowania IDDM, sposób wykrywania IDDM, kompozycje farmaceutyczne do leczenia lub zapobiegania.

LICZBA SEKWENCJI: 10 OSPRZĘT KOMPUTEROWY:

TYP NOŚNIKA: Dyskietka KOMPUTER: IBM PC kompatybilny SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS OPROGRAMOWANIE: Patent #1.0, wersja #1.25 DANE ZGŁOSZENIA PATENTOWEGO:

NUMER ZGŁOSZENIA: IL 112094

DATA WYPEŁNIENIA ZGŁOSZENIA: 21 grudnia 1994 DANE ZGŁOSZENIA PATENTOWEGO:

NUMER ZGŁOSZENIA: IL 114460

DATA WYPEŁNIENIA ZGŁOSZENIA: 05 Lipca 1995

INFORMACJA O SEKW. Nr 1:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasy TYP: aminokwas ŁAŃCUCH: pojedynczy TOPOLOGIA: liniowa

TYP CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 1:

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW , Nr 2:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

TYP CZĄSTECZKI: peptyd WŁAŚCIWOŚCI:

NAZWA/SYMBOL: Peptyd POZYCJA: 6, 11, 19

INNE INFORMACJE: uwaga: „Xaa w pozycji 6/11 = Cys lub Val; Xaawpozycji 19 = Thr lub Lys; podczas gdy Xaa w pozycji 6/11 nie mogą być obie Cys, gdy Xaa w pozycji 19 jest Thr”

OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 2:

Val Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW, Nr 3

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

TYP CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 3

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW. Nr 4

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasy TYP: aminokwas ŁAŃCUCH:pojedynczy TOPOLOGIA: liniowa

TYP CZĄSTECZKI: peptyd WŁAŚCIWOŚCI:

NAZWA/SYMBOL: Peptyd POZYCJA: 19

INNE INFORMACJE: uwaga: „Xaa w pozycji 19 jest Thr lub Lys” OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 4:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW. Nr 5:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasy TYP: aminokwas

184 145

ŁAŃCUCH: pojedynczy TOPOLOGIA: liniowa

TYP CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 5:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW. Nr 6:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

TYP CZĄSTECZKI: peptyd WŁAŚCIWOŚCI:

NAZWA/SYMBOL: Peptyd POZYCJA: 19

INNE INFORMACJE: uwaga: „Xaa w pozycji 19 jest Thr lub Lys”. OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 6:

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW. Nr 7:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

TYP CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 7:

Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys

10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW. Nr 8:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

TYP CZĄSTECZKI: peptyd WŁAŚCIWOŚCI:

NAZWA/SYMBOL:

Peptyd POZYCJA: 19

INNE INFORMACJE: uwaga: „Xaa w pozycji 19 jest Thr lub Lys”. OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 8:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Xaa 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

184 145

INFORMACJA O SEKW. Nr 9:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

TYP CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 9:

Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp Ser Leu Lys 15 10 15

Pro Ala Asn Glu Asp

INFORMACJA O SEKW. Nr 10:

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów TYP: aminokwas ŁAŃCUCH: pojedynczy TOPOLOGIA: liniowa

TYP CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEKW. Nr 10:

Asn Glu Asp Gin Lys Ile Gly Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile 1 5 10 15

184 145

FIG.2

PEPTYD (ug/ml)

184 145

FIG. 3

WIEK (miesiące )

184 145

Fl G. 4

ZAWARTOŚĆ

GLUKOZY WE KRWI (_mrn 01 / L ) KOMÓRKI T

PROLIFERACJA ( SI)

FIG.5

LECZENIE

184 145

F I G. 1

KOMÓRKI Τ

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Peptyd o sekwencji I:

6 11

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X_]-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu19

X₃-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr 2) znamienny tym, że: X! i X2 oznacza resztę cysteiny lub resztę waliny, a X₃jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym reszta X! i/lub X₂jest inna niż reszta cysteiny, gdy X3jest resztątreoniny oraz sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występują jako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych.
2. Peptyd p277(Val⁶) według zastrz. 1, znamienny tym, że X_t jest resztą waliny, Χ2 jest resztą cysteiny, a Χ3 jest resztą treoniny.
3. Peptyd p277(Val^{] 1}) według zastrz. 1, znamienny tym, że X₁ jest resztą cysteiny, X₂ jest resztą waliny, a X3 jest resztą treoniny.
4. Peptyd p277(Val⁶-Valⁿ) według zastrz. 1, znamienny tym, że zarówno X1 i X₂ są resztami waliny, a X3 jest resztą treoniny.
5. Peptyd p277(Lys¹⁹) według zastrz. 1, znamienny tym, że zarówno X1 i X2 są resztami cysteiny, a X3 jest resztą lizyny.
6. Peptyd p277(Val6-Lys¹⁹) według zastrz. 1, znamienny tym, że X1 jest resztą waliny, X2 jest resztą cysterny, a X3 jest resztą lizyny.
7. Peptyd p277(Val¹1-Lys¹1) według zastrz. 1, znamienny tym, że X1 jest resztą cysteiny, X2 jest resztą waliny, a X3 jest resztą lizyny.
8. Peptyd p277(Val6¹1-Lys'1) według zastrz. 1, znamienny tym, że zarówno Xji X2 są resztami waliny, a X3 jest resztą lizyny.
9. Środek diagnostyczny do diagnozowania cukrzycy insulinozależnej (IDDM), znamienny tym, że jako substancję czynnązawiera unieruchomiony na podłożu stałym peptyd o sekwencji I lub gotowy do iniekcji peptyd o sekwencji I:

6 11

Val-iLeu-Gly-Gly-Gly-X₁-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu19

X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr: 2) w której: X1 i X2 oznacza resztę cysteiny lub resztę waliny, a X3jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym reszta X, i/lub X2 jest inna niż reszta cysteiny, gdy X₃ jest resztą treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występująjako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych.
10. SposóS wykrywania u pacj enta stadium docząpoowego lr^t> oaawansowimego IDDM, obejmujący badanie krwi i moczu, znamienny tym, że jako antygen do stwierdzenia obecności przeciwciał lub limfocytów T, oddziałujących immunologicznie z ludzkim hsp60, stosuje się peptyd o sekwencji I:

6 11 yal-Leu-Gly-Gly-Gly^-Ala-Leu-Leu-Arg-^-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu19

18-4145

X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr: 2) w którym: X! i X₂ oznacza resztę cysteiny lub resztę waliny, a X₃jest resztą treoniny łub lizyny, przy czym reszta Xj i/lub X₂ jest inna niż reszta cysteiny, gdy X3 jest resztą treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występująjako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że oznacza się obecność przeciwciał skierowanych przeciw hsp60 lub limfocytów T, oddziałujących immunologicznie z hsp60; przy czym wynik pozytywny, wykazujący obecność przeciwciał skierowanych przeciw hsp60 lub limfocytów T, oddziałujących immunologicznie z hsp60; wskazuje na wysokie prawdopodobieństwo występowania u pacjenta stadium początkowego lub zaawansowanego IDDM.
12. Środek farmaceutyczny zwłaszcza do leczenia lub zapobiegania IDDM, znamienny tym, że zawiera peptyd o sekwencji I

6 11

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X₁-Ala-Leu-Leu-Arg-X2-Ile-Pro-Ala-I.eu-Asp-Ser-Leu19

X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw·; nr: 2) w której : X₁i X2 oznacza resztę cysteiny lub resztę waliny, a X3 jest resztą treoniny lub lizyny, przy czym reszta X1 i/lub X2 jest inna niż reszta cysteiny, gdy X3 jest resztą treoniny albo sole tego peptydu i jego funkcjonalne pochodne grup funkcyjnych, które występująjako boczne łańcuchy reszt aminokwasowych lub grup na końcu N lub C, obejmujące estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych, i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie.
13. Środek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera peptyd p277(Val⁶) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której X1 jest resztą waliny, X2 jest resztą cysteiny, a X3 jest resztą treoniny.
14. Środek według zastrz. 12, znamienny tym,że zawiera peptyd p277(Valⁿ)o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której X1 jest resztą, cysteiny, X2 jest resztą waliny, a X3 jest resztą treoniny.
15. Środek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera peptyd p277(Val6-Val^1]) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której X, i X2 są resztami waliny, a X3, jest resztą treoniny.
16. Środek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera peptyd p277(Lys¹⁹) o sekwencji I (Sekw. nr 2), w której zarówno X1 i X2 są resztami cysteiny, a X3 jest resztą, lizyny.
17. Środek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera peptyd p277(Val6-Lys*9) o sekwencji I (Sekw. nr 2), wktórej X1 jest resztąwaliny, X2jest resztącysteiny, a X3jest resztą lizyny.
18. Środek według zastrz. 37, znamienny tym, że zawiera peptyd p277(Val¹ '-Lys¹') o sekwencji I (Sekw. nr 2), wktórej X₁ jest resztącyteiny, X2jest resztąwaliny, aX3jest resztą lizyny.
19. Środek według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera peptyd p277(Val61¹-Lys¹9) o sekwencji I (Sekw. nr 2), wktórej zarówno X₁ i X₂ sąresztami waliny, a X3 jest resztą lizyny.

* * *

Obecny wynalazek dotyczy nowej grupy peptydów będących wariantami epitopu ludzkiego białka szoku cieplnego o masie cząsteczkowej 60 kDa (hsp60) i farmaceutycznych środków zawierających te białka do zapobiegania i leczenia cukrzycy insulinozależnej (IDDM).

Typ I cukrzycy (IDDM), jest chorobąautoimmunologicanąpowodowanąprzez limfocyty T, które atakują i niszczą produkujące insulinę komórki (3, znajdujące się w wysepkach trzustki (Castano i Eisenbarth, 1990). Proces autoimmunologiczny, którego efektem jest IDDM, rozpoczyna się i rozwija bezobjawowo. Choroba ujawnia się tylko wtedy, gdy ilość zniszczonych komórek β przekracza zdolność pozostałych komórek do zapewnienia wystarczającej ilości insuliny. Uważa się, że załamanie homeostazy glukozowej i pojawienie się klinicznej postaci IDDM ma miejsce tylko, gdy 80% - 90% komórek β zostało zniszczonych przez system immunologiczny. Dlatego pacjenci, u których stwierdza się występowanie IDDM sąjuż w zaawanso4

184 145 wanym stadium autoimmunologicznej destrukcji swoich komórek β. Co więcej, diagnoza lub przewidywanie cukrzycy, przed rozwinięciem się jej formy klinicznej, na drodZe wykrywania markerów immunologicznych autoimmunologicznych komórek β, jest możliwe tylko gdy proces autoimmunologiczny się już rozpoczął. Dlatego też celem leczniczym jest znalezienie bezpiecznego, specyficznego i wydajnego sposobu wyłączenia procesu autoimmunologicznego, który jest już znacznie zaawansowany.

Autorzy wynalazku zajmowali się tym problemem już wcześniej badając spontaniczny rozwój cukrzycy u myszy szczepu NOD, który uważany jest za wiarygodny model ludzkiej IDDM (Castano i Eisenbarth, 1990). U myszy NOD zapalenie wysp trzustkowych rozwija się w wieku ok. 4 tygodni. Rozpoczyna się ono jako łagodny naciek śródwysepkowy i prowadzi do poważnego wewnątrzwysepkowego ogniska zapalnego. Hiperglikemia, związana z niedoborem insuliny, rozpoczyna się u samic opisanej kolonii pomiędzy 14 a 17 tygodniem życia. W wieku 35-40 tygodni prawie wszystkie samiceNOD majązaawansowanąpostać cukrzycy i większość z nich umiera, jeżeli nie zastosuje się leczenia insulinowego. Samce szczepu NOD mają niższą częstość występowania choroby z powodów dotychczas nie wyjaśnionych. Wykazano, że cukrzyca u myszy NOD jest powodowana przez autoreaktywne limfocyty T (Bendelac i in. 1987).

Zarówno u ludzi cierpiących na iDDM jak i u myszy NOD, stwierdzono reaktywność limfocytów T i autoprzeciwciał w stosunku do różnych antygenów (Elias, 1994). Nie wiadomo, czy immunogenność w stosunku do jakiegokolwiek z tych antygenów jest podstawową przyczyną choroby. Poza pytaniem o przyczynę choroby pozostaje również pytanie o jej leczenie.

Wykazano, że u myszy NOD można zapobiec rozpoczęciu procesu autoimmunologicznego, przez poddanie ich różnym manipulacjom przed rozpoczęciem się cukrzycy, tj.: zaostrzona dieta, infekcje wirusowe, czy niespecyficzna stymulacja systemu immunologicznego (Bowman i in., 1994). Rozwojowi cukrzycy u myszy NOD można również zapobiec indukując tolerancję immunologiczną wobec antygenu GAD (dekarboksylazy kwasu glutaminowego) przed rozwinięciem się cukrzycy (Kaufman i in., 1993; Tisch i in., 1993).

Autorzy wynalazku stwierdzili, że cukrzycy u myszy NOD można zapobiec stosując szczepionkę z wykorzystaniem limfocytów T specyficznych w stosunku do sekwencji peptydu p277 ludzkiej cząsteczki hsp60 (Elias i in., 1991). Białko to wcześniej określano jako hsp65, obecnie jako hsp60. Zmiana ta związana jest z dokładniejszym określeniem jego masy cząsteczkowej. Należy pamiętać, że obydwa określenia dotyczą tego samego białka.

Peptyd p277 będący epitopem ludzkiego hsp60 zaangażowanym w powstawanie IDDM i odpowiadający pozycjom 437 - 460 sekwencji ludzkiego hsp60, został po raz pierwszy opisany w Izraelskim Zgłoszeniu Patentowym No. 94241 przez autora obecnego zgłoszenia i w artykule Elias i Cohen, 1994, jako następująca sekwencja:

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-A]a-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-LeuThr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp (Sekw. nr 1)

Wykazano, że podanie peptydu p227, przed rozpoczęciem procesu zapalenia wysp trzustkowych, zapobiega rozwojowi cukrzycy najprawdopodobniej na drodze down-regulacji odporności przeciw p277, która jest niezbędna do rozwoju cukrzycy u myszy NOD (Elias i in., 1991; Izraelskie Zgłoszenie Patentowe nr 94241). Ostatnie badania wskazują, iż peptyd p277 może być także stosowany do odwrócenia autoimmunizacj i komórek P, która rozwinęła się do stadium zaawansowanego (Elias i Cohen 1994).

W pracowni autorów zgłoszenia odkryto, że pewna postać autoimmunogennej cukrzycy może również być wywołana u myszy szczepu C57BL/KsJ przez podanie bardzo niskich dawek toksyny komórek β - streptozotocyny (STZ) (Elias i in., 1994). Codzienne podawanie standardowej, niskiej dawki STZ w wysokości 40 mg/kg przez 5 dni, zwykle powoduje wystąpienie klinicznej postaci cukrzycy w ciągu 3 tygodni, a podawanie dawki 30 mg/kg przez 5 dni powoduje wystąpienie klinicznej postaci cukrzycy po okresie lag trwającym ok. 3 miesiące. Ten model indukowanej cukrzycy charakteryzuje się pojawieniem się przeciwciał antyidiotypowych skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw insulinie oraz przeciwciał przeciw hsp60 przed pojawieniem się przeciwciał przeciw insulinie. U myszy zaobserwowano również poja184 145 wianie się spontanicznej reaktywności limfocytów T w stosunku do hsp60 oraz jego peptydu p277 (Elias i in., 1994). Zatem niższa niż standardowa, niska dawka STZ wydaje się uruchamiać proces autoimmunizacyjny, inny niż obserwowany w przypadku spontanicznej cukrzycy rozwijającej się u myszy NOD (Elias i in., 1990).

Podczas badania różnych fragmentów i wariantów peptydu p277 nieoczekiwanie stwierdzono, że peptydy, w których jedynie reszta treoniny została zastąpiona resztą lizyny i/lub jedna lub obie reszty cysteiny zostały zastąpione przez resztę(y) waliny, były tak samo skuteczne w leczeniu cukrzycyjakp277. Rezultaty te były tym bardziej zaskakujące, jako że podstawienie reszt cysteiny resztami seryny powodowało zniesienie aktywności peptydu.

Przedmiotem obecnego wynalazku jest dostarczenie różnych wariantów peptydu p277, które są użyteczne do diagnozowania i leczenia IDDM.