ES2201137T3 - Analogos del peptido p277 y composiciones farmaceuticas que los comprenden para el tratamiento o diagnostico de la diabetes. - Google Patents

Abstract

UN PEPTIDO QUE POSEE LA ESTRUCTURA DE LA SECUENCIA P277 DE HSP60 EN EL QUE UNO O AMBOS RESIDUOS DE CISTEINA ESTAN REEMPLAZADOS POR RESIDUOS DE VALINA Y/O EN EL QUE EL RESIDUO THR SUP,19} ESTA REEMPLAZADO POR LYS, POSEE SUSTANCIALMENTE LA MISMA ACTIVIDAD BIOLOGICA QUE P277 PERO CON UNA ESTABILIDAD SUSTANCIALMENTE MEJORADA. LOS NUEVOS ANALOGOS DE P277 PUEDEN UTILIZARSE PARA LOS MISMOS PROPOSITOS QUE P277.

Description

Análogos del péptido p277 y composiciones farmacéuticas que los comprenden para el tratamiento o diagnóstico de la diabetes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos que son variantes de unepítopo de la proteína humana de choque térmico de 60kDa (hsp 60) y a composiciones farmacéuticas que los comprenden y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de la diabetes mellitus insulino-dependiente (DMID) que usan dichos péptidos.

Antecedentes de la invención

La diabetes Tipo I, o DMID, es una enfermedad autoinmune producida por células T que atacan y destruyen las células \beta que producen insulina situadas en los islotes del páncreas (Castano y Eisenbarth, 1990). El proceso autoinmune que culmina en DMID comienza y se desarrolla sin síntomas. La enfermedad se deja ver clínicamente solo cuando la pérdida acumulativa de células \beta excede la capacidad de las células \beta residuales para administrar insulina. De hecho, se piensa que el colapso de homeostasis de glucosa y DMID clínica tiene lugar solamente después de que el 80-90% de las células \beta se hayan inactivado por el sistema inmune. Así, pacientes que pueden identificarse como que sufren de DMID seguro que estarán en una fase avanzada de destrucción autoinmune de sus células \beta. Es más, el diagnóstico de diabetes incipiente, preclínica, por la detección de marcadores inmunológicos de autoinmunidad de células \beta puede hacerse solo después de la aparición del proceso autoinmune. Por lo tanto, la búsqueda terapéutica es para encontrar un modo seguro, específico y eficaz de apagar un proceso autoinmune que está ya bien encaminado.

Los presentes inventores han examinado antes esta cuestión estudiando la diabetes espontánea que se desarrolla en ratones de la cepa NOD, que se considera que es un modelo fiable de DMID humana (Castano y Eisenbarth, 1990). Los ratones NOD desarrollan insulitis aproximadamente a las 4 semanas de edad, la cual comienza como un infiltrado peri-islote leve y progresa a inflamación intraislote grave. La hiperglicemia, que atestigua la insuficiencia de insulina, empieza en las hembras de nuestra colonia a aproximadamente las 14-17 semanas de edad. A las 35-40 semanas de edad, casi todos los ratones hembra NOD han desarrollado diabetes severa y la mayoría muere en ausencia de tratamiento de insulina. Los ratones macho NOD tienen una incidencia más baja de la enfermedad, por motivos que no están claros. Se ha demostrado que la diabetes de ratones NOD se produce por células T autoinmunes (Bendelac y col., 1987).

Se han detectado la reactividad de las células T y los autoanticuerpos contra diversos antígenos en pacientes de DMID humanos así como en ratones NOD (Elias, 1994), y no está claro si la inmunidad a uno cualquiera de los posibles antígenos diana solo es la causa principal de la enfermedad. Más allá de esta cuestión de la causa está la cuestión de la terapia.

Se ha demostrado que la iniciación del proceso autoinmune en los ratones NOD puede prevenirse sometiendo a los ratones, antes de la aparición de la diabetes, a diversas manipulaciones tales como una dieta restrictiva, infecciones virales, o estimulación no específica del sistema inmune (Bowman y col., 1994). La diabetes NOD se puede también prevenir por inducción de la tolerancia inmunológica al antígeno ácido glutámico descarboxilasa (GAD) en ratones prediabéticos (Kaufman y col., 1993; Tisch y col., 1993).

Los presentes inventores han descubierto previamente que la diabetes de ratones NOD se puede prevenir por vacunación con células T usando células T específicas para la secuencia del péptido p277 de la molécula humana hsp60 (Elias y col., 1991). Esta proteína se denominó anteriormente hsp65, pero se denomina ahora hsp60 en vista de la información más exacta de peso molecular; por cualquiera de las dos denominaciones, las proteínas son la misma.

El péptido p277, que es el epítopo de la hsp60 humana implicado en DMID y que corresponde a las posiciones 437-460 de la secuencia hsp60 humana, se describió primero en la Solicitud de Patente Israelí No. 94241 del presente solicitante y en Elias y Cohen, 1994, y tiene la siguiente secuencia:

Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Ley-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr- Pro-Ala-Asn-Glu-Asp

\hskip1cm

(SEC ID Nº1)

Se mostró también que la administración del péptido p277 por sí mismo al inicio de la insulitis prevenía el desarrollo de la diabetes, probablemente por regulación negativa de la inmunidad anti p277 que es esencial para la diabetes NOD (Elias y col., 1991; Solicitud de Patente Israelí No. 94241). Estudios recientes han indicado que el péptido p277 puede también usarse para invertir la autoinmunidad de células \beta que se ha desarrollado a una fase avanzada (Elias y Cohen, 1994).

El laboratorio de los presentes inventores ha informado recientemente que se puede inducir en la cepa C57BL/KsJ de ratones una forma de diabetes autoinmune por la administración de una dosis muy baja de toxina de célula beta estreptozotocina (STZ) (Elias y col., 1994). Mientras que la dosis de STZ estándar de 40 mg/kg administrada diariamente durante 5 días normalmente induce diabetes clínica en 3 semanas, la administración de 30 mg/kg durante 5 días induce diabetes clínica solo después de un periodo de demora de aproximadamente tres meses. Este modelo de diabetes inducida se caracteriza por la aparición en el periodo prodromo de los anticuerpos contra insulina, anticuerpos anti idiotípicos contra los anticuerpos de insulina, y autoanticuerpos contra la hsp60. Los ratones también manifiestan reactividad espontánea de células T contra hsp60 y su péptido p277 (Elias y col., 1994). Así, la baja dosis de STZ inferior a la estándar parece desencadenar un proceso autoinmune no diferente al observado en la diabetes espontánea que se desarrolla en ratones NOD (Elias y col., 1990).

Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes del péptido p277, siendo dichas variantes útiles para el diagnóstico y tratamiento de DMID.

Resumen de la invención

En un estudio de fragmentos y variantes del péptido p277, se encontró inesperadamente que los péptidos en los que se reemplazó el único residuo de treonina por un residuo de lisina y/o uno o ambos de los residuos cisteína se reemplazaron por residuo(s) de valina, eran activos como el p277 en el tratamiento de la diabetes. Estos resultados eran incluso más sorprendentes ya que la sustitución de los residuos de cisteína por residuos de serina resultaron en péptidos inactivos.

La presente invención se refiere así a un péptido que comprende la secuencia I:

1

en el que X_{1} y X_{2} cada uno es un residuo de Cys o Val y X_{3} es un residuo de Thr o Lys, pero X_{1} y X_{2} no pueden ser ambos residuos Cys cuando X_{3} es un residuo Thr.

En formas de realización específicas de la invención, el péptido consiste en la secuencia I en la que tanto X_{1} como X_{2} son Cys y X_{3} es Lys, en la presente invención (Lys^{19}) (SEQ ID NO: 3) o X_{1} es Val, X_{2} es Cys y X_{3} es Thr o Lys, en la presente invención p277 (Val^{8}) (SEQ ID NO:4) y p277 (Val^{6}-Lys^{19}) (SEQ ID NO:5), respectivamente; o X_{1} es Cys, X_{2} es Val y X_{3} es Thr o Lys, en la presente invención p277 (Val^{11}) (SEQ ID NO: 6) y p277 (Val^{11}-Lys^{19}) (SEQ ID NO: 7), respectivamente; o tanto X_{1} como X_{2} son Val y X_{3} es Thr o Lys, en la presente invención p277 (Val^{16}-Val^{11}) (SEQ ID NO: 8) y p277 (Val^{6,11}-Lys^{19}) (SEQ ID NO: 9), respectivamente. También se refiere al péptido (Val^{6}-Val^{11}) como p277 (V) en la presente invención.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar procedimientos y kits para el diagnóstico temprano de la DMID usando un péptido de secuencia I de la invención. En el curso del desarrollo de la DMID, los animales expresan moléculas de hsp60, o moléculas que son reactivas cruzadas con las mismas, que encuentran su camino dentro de la sangre y la orina de los animales. También expresan anticuerpos y células T dirigidas específicamente a tales moléculas. Así, la presencia de hsp60 (o moléculas que son reactivas cruzadas con la misma) o anticuerpos o células T específicas contra la misma en sangre u orina, sirven como ensayo para la detección del proceso de DMID antes de que se complete la destrucción de las células beta y el individuo se condene a diabetes de por vida.

La presencia de DMID incipiente en un paciente puede diagnosticarse comprobando la presencia en sangre u orina de dicho paciente de anticuerpos anti hsp60 o células T las cuales son inmunológicamente reactivas contra la hsp60 humana, usando como antígeno un péptido de secuencia I de la invención. De hecho, cualquiera de los procedimientos descritos previamente como que son operables usando el péptido p277, como aquellos descritos en la Solicitud Internacional PCT publicada bajo No. WO 90/10449 pueden usarse también sustituyendo el p277 por un péptido de secuencia I de la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para diagnosticar la presencia o incipiencia de la DMID en un paciente, que comprende comprobar la presencia en dicho paciente de anticuerpos anti hsp60 o de una célula T que inmunorreacciona contra hsp60, por lo que un resultado que indica la presencia positiva de anticuerpos anti hsp60, o de una célula T que inmunorreacciona con hsp60, o una célula T o de una célula T que inmunorreacciona con hsp60, indica una elevada probabilidad de la presencia o incipiencia de DMID.

En el procedimiento para diagnosticar DMID, se puede comprobar la presencia de anticuerpos anti hsp60 en el paciente, en el que dicho procedimiento de prueba puede comprender un radioinmunoensayo o un test ELISA.

También se puede comprobar la presencia de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 en el paciente. En una forma de realización de este aspecto, el procedimiento de prueba comprende un test de proliferación de células T que comprende las etapas:

(i) preparar una fracción celular mononuclear que contiene células T de una muestra de sangre obtenida de dicho paciente;

(ii) añadir a dicha fracción celular mononuclear un antígeno seleccionado de entre un péptido de secuencia I de la invención;

(iii) incubar dicha fracción celular en presencia de dicho antígeno durante un periodo de tiempo adecuado y bajo condiciones adecuadas de cultivo;

(iv) añadir un nucleótido marcado al cultivo celular incubado de (iii) en un momento adecuado antes del final de dicho periodo de incubación para proporcionar la incorporación de dicho nucleótido marcado en el ADN de las células que proliferan; y

(v) determinar la cantidad de células T que proliferan por análisis de la cantidad de nucleótidos marcados incorporados a dichas células T.

En la etapa (iv) anterior, dicho nucleótido marcado es preferiblemente ^{3}H-timidina. La determinación de la cantidad de las células T que proliferan se hace calculando el índice de estimulación de las células T por procedimientos patrón.

En otra forma de realización de este aspecto de la invención, el procedimiento de prueba comprende un test de respuesta a citoquina de células T, en el que las etapas (i) a (iii) son como el test de proliferación de células T anterior, y en una cuarta etapa (iv) se detecta la presencia de citoquina, como IFN-\gamma, IL-4, IL-6, IL-10, TNF\alpha o TGF\beta, secretada por los linfocitos que responden en el medio, por procedimientos patrón con kits accesibles comercialmente.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vivo en el que un antígeno que se selecciona de un péptido de secuencia I se inyecta subcutáneamente en un paciente y se observa la aparición de una reacción de piel detectable (DTH).

La presente invención también se refiere a medios para realizar tales ensayos, así como a kits para realizar tales ensayos. Los kits pueden prepararse para llevar a cabo cualquiera de los diferentes ensayos usados para llevar a cabo la presente invención. Cada uno de estos kits incluye todos los materiales necesarios para realizar un único ensayo o un número fijado de ensayos. Por ejemplo, un kit tal para determinar la presencia de anticuerpos anti hsp60 puede contener un péptido inmovilizado en fase sólida de secuencia I y un anticuerpo marcado capaz de reconocer la región no variable del anticuerpo anti hsp60 que se va a detectar, como anti Fab humano marcado. El kit puede también contener indicaciones para usar el kit y envases para guardar los materiales del kit. Puede usarse cualquier marcador convencional, como un radioisótopo, una enzima, un cromóforo o un fluoróforo. Un radioisótopo típico es el yodo-125 o el azufre-35. Enzimas típicas para este propósito incluyen peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina.

Un kit para diagnosticar la presencia de DMID comprobando la presencia de anticuerpos anti hsp60 comprende:

(i) un antígeno seleccionado de un péptido de secuencia I; y

(ii) un anticuerpo marcado capaz de reconocer la región no variable de dichos anticuerpos anti hsp60 que se van a detectar.

Un kit para diagnosticar la presencia de DMID comprobando la presencia de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 comprende:

(i) un antígeno seleccionado de un péptido de secuencia I:

(ii) un medio adecuado para cultivo de linfocitos (células T); y

(iii) o bien un nucleótido marcado para el test de proliferación de células T, o un test de ensayo de citoquina, por ej., IFN-\gamma, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF\alpha o TGF\beta, para el test de citoquina.

Para el test in vivo, el kit comprenderá solo un péptido de secuencia I en una forma adecuada para la inyección.

La presente invención además se refiere a medios para prevenir o tratar la DMID. La vacunación con el péptido antígeno de secuencia I de la presente invención puede proporcionar una regulación negativa específica de autoinmunidad al antígeno, y efectivamente crea una resistencia al proceso autoinmune de la DMID. Lo mismo es verdad con respecto a la vacunación con células T específicas para dichos antígenos, en forma atenuada o avirulenta o después de haberse tratado para aumentar su antigenicidad, o fragmentos o fracciones activas de las mismas. Si el paciente muestra estar todavía en las fases incipientes preclínicas de la DMID, la inyección con un antígeno tal o célula T (o fracción) puede crear una regulación negativa de autoinmunidad para este antígeno y así detener el proceso autoinmune antes de que se produzca daño significativo, permanente. El péptido puede usarse también como agente terapéutico para detener el proceso autoinmune incluso después de que esté bastante avanzado, como muestran recientemente los inventores de la presente invención con respecto al tratamiento de ratones NOD con el péptido p277 (Elias y Cohen, 1994).

Por consiguiente, la presente invención proporciona una preparación para prevenir o tratar la diabetes mellitus insulino-dependiente (DMID), que comprende un producto de célula T elegido del grupo que consiste en: (a) células T humanas que manifiestan especificidad por la secuencia p277 de hsp60 humana, células que se han activado por incubación en presencia de dicho péptido de secuencia I; (b) dichas células T humanas de (a) que se han irradiado o atenuado de otra manera; (c) dichas células T humanas de (a) que se han sometido a tratamiento de presión por medio de presión hidrostática, tratamiento con un agente químico de conexión cruzada y/o tratamiento con un agente de citoesqueleto de conexión cruzada; (d) fragmentos de, o proteínas superficiales liberadas de las células T de (a), (b), o (c); o (e) un péptido que consiste esencialmente en la región variable del receptor de (a) específico para dicha proteína, o una sal, derivado funcional, precursor activo o fracción del mismo.

En una forma de realización preferida de la invención, la preparación comprende células T humanas autólogas obtenidas de un paciente de DMID que se va a tratar, células T que se han activado por contacto in vitro con dicho péptido de secuencia I. Tales células T específicas y activadas se administran entonces al mismo paciente de quien se obtuvieron originalmente.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de la DMID que comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente y, como principio activo, una cantidad eficaz de un péptido de secuencia I, una sal, o un derivado funcional del mismo. El vehículo farmacéuticamente aceptable es preferiblemente un vehículo aceitoso como una emulsión de aceite mineral conocida como adyuvante incompleto de Freund (IFA). Sin embargo, el IFA, así como el adyuvante completo de Freund (CFA; una preparación de aceite mineral que comprende diferentes cantidades de organismos muertos de Mycobacterium) no se permite para uso humano por que el aceite mineral no es metabolizable y no puede degradarse por el cuerpo.

Los presentes inventores han descubierto ahora que ciertas emulsiones grasas, que han estado en uso durante muchos años para nutrición intravenosa de pacientes humanos, pueden también actuar como un vehículo para terapia de péptidos usando los péptidos de la presente invención. Dos ejemplos de tales emulsiones son las emulsiones grasas comerciales accesibles conocidas como Intralípido y Lipofundina. El "Intralípido" es una marca comercial registrada de Kabi Pharmacia, Suecia, para una emulsión grasa de nutrición intravenosa, descrita en la patente de E.E.U.U. no. 3,169,094. La "Lipofundina" es una marca comercial registrada de B. Braun Melsungen, Alemania. Ambas contienen aceite de soja como grasa (100 ó 200 g en 1000 ml de agua destilada: 10% o 20%, respectivamente). Los fosfolípidos de la yema de huevo se usan como emulsionantes en el Intralípido (12 g/l de agua destilada) y la lecitina de yema de huevo en la Lipofundina (12 g/l de agua destilada). La isotonicidad resulta de la adición de glicerol (25 g/l) tanto en Intralípido como en Lipofundina.

La invención también se refiere a un procedimiento de prevención y tratamiento de DMID que comprende administrar a un paciente necesitado de la misma una composición farmacéutica que comprende un péptido de secuencia I o una preparación que comprende células T que han desarrollado especificidad para dicho péptido de secuencia I de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una gráfica que muestra la estabilidad de p277 y p277(Val^{6}-Val^{11}). Los círculos cerrados señalan los resultados usando p277 y los círculos abiertos p277(Val^{6}-Val^{11}). Los círculos grandes representan los resultados después de 1 semana de almacenamiento, los círculos de tamaño medio después de 9 semanas, y los círculos más pequeños después de 20 semanas.

La Fig. 2 muestra que las células T de NOD del clon diabetogénico C9 proliferan en respuesta a los péptidos p277 (círculos cerrados) y p277(Val^{6}-Val^{11}) (círculos abiertos).

La Fig. 3 muestra que las células T del bazo de NOD proliferan en presencia del péptido p277(Lys^{10}). Se probaron los bazos de 5 ratones hembra NOD en cada grupo de edad para la proliferación de células T en respuesta a los péptidos p277(Lys^{19}) (círculos cerrados), p277 (círculos abiertos) y péptido control p278 (cuadrados cerrados).

La Fig. 4 muestra que las células T de NOD del clon diabetogénico C9 proliferan en respuesta al péptido p277(Lys^{19}).

La Fig. 5 es una gráfica que muestra la eficacia del pretratamiento con p277(V) en IFA en la prevención de diabetes inducida por STZ comparado con el tratamiento control o el tratamiento con GADp34.

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Descripción detallada de la invención

Siempre que se menciona un "péptido de secuencia I" en la invención, también se contemplan las sales y derivados funcionales del mismo, siempre que se mantenga la actividad biológica del péptido con respecto a la diabetes.

Las "sales" del péptido contempladas por la invención son sales orgánicas e inorgánicas fisiológicamente aceptables.

Los "derivados funcionales" del péptido I tal y como se usa en la presente invención abarcan derivados que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que se dan como cadenas laterales en los residuos o los grupos terminales N- o -C, por medios conocidos en la materia, y se incluyen en la invención siempre que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, no destruyan la actividad del péptido en la medida en que afecta a su similitud con la actividad conocida de p277, no confieran propiedades tóxicas en composiciones que los contienen y no afecten adversamente las propiedades antigénicas de los mismos. No se tiene intención de que tales "derivados funcionales" comprendan cambios tales que conviertan eficazmente un aminoácido en otro.

Sujetos a los requisitos anteriores, estos derivados pueden, por ejemplo, incluir ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo producidas por reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N- acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados por reacción con radicales acilo (por ej., grupos alcanoilo o aroilo carbocíclicos) o derivados O-acilo de grupo hidroxilo libre (por ejemplo ese de residuos serilo o treonilo) formados por reacción con radicales acilo.

El péptido de secuencia I de la invención puede usarse como inmunógeno en composiciones farmacéuticas, particularmente vacunas para el alivio y tratamiento de la DMID, así como un antígeno en composiciones diagnósticas para el diagnóstico de DMID. Estas composiciones farmacéuticas y diagnósticas, que pueden prepararse de una forma conocida en la materia, también forman parte de la presente invención.

Cuando se usa para tratamiento terapéutico o como una vacuna profiláctica, el péptido de la presente invención se administra preferiblemente con un vehículo activo biológicamente que promueve el cambio TH1-TH2 de las células T autoinmunes. Las células T del tipo CD4 ayudantes se clasifican en dos grupos según las citoquinas que secretan cuando se activan (Mosman y Coffman, 1989): Las células TH1 secretan IL-2 e IFN-\gamma, mientras que las células TH2 secretan IL-4 y IL-10. Un vehículo tal es preferiblemente una emulsión grasa que comprende el 10-20% de triglicéridos de origen vegetal y/o animal, el 2,25-4,5% de osmoregulador, el 0- 0,5% de antioxidante, y agua estéril hasta el 100%. Dicho vehículo es más preferiblemente Intralípido o Lipofundina. El uso de dichos vehículos se describe en una solicitud de patente Israeli No. 122755 presentada sobre datos uniformes con la fecha de presentación de la solicitud Israelí en la presente invención No. 116499, con el mismo solicitante que el de la presente solicitud.

La composición terapéutica según la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral, así como subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, intranasalmente o intrarectalmente.

Los ejemplos en la presente invención establecen la eficacia del tratamiento terapéutico con los compuestos y composiciones de la presente invención en modelos animales de la DMID humana aceptados científicamente.

Ejemplos Materiales y procedimientos (i) Ratones

Se suministraron ratones hembra endogámicos de la cepa NOD/Lt por el Centro de Alimentación Animal del Instituto de Ciencia Weizmann, Rehobot, Israel. Estos ratones desarrollan espontáneamente diabetes autoinmune a las 14 a 17 semanas de edad que imita la DMID en humanos.

(ii) Péptidos

Los péptidos se sintetizaron por química Fmoc patrón usando un sintetizador ABIMED (FRG) y se purificaron en HPLC por cromatografía de fase inversa. Las secuencias se confirmaron por análisis de aminoácidos. Se sintetizaron los siguientes péptidos: el péptido p277; el péptido control p278 de secuencia: Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile (SEQ ID NO:10), correspondiente a las posiciones 458-474 de la molécula hsp60 humana; fragmentos del p277, la mitad amino del p277 (p277.N), la mitad carboxi del p277 (p277.C), y p277 combinado con p278 (p277.C-p278); el péptido p277(Lys^{19}); y el péptido p277 con diferentes sustituciones de aminoácidos por los dos residuos de cisteína en la secuencia como sigue: p277 con grupos puente -SH (p277(puente Cys-Cys)); p277 con ambos residuos de cisteína reemplazados por valina (p277(Val^{6}-Val^{11})) o por serina (p277(Ser^{6}-Ser^{11})).

(iii) Tratamiento y seguimiento

Los ratones se trataron con emulsiones de p277, de los otros péptidos, o de albúmina de suero bovino (BSA, comprada en Sigma, St. Louis, MO, USA) en volúmenes de 0,1 ml inyectados subcutáneamente en la espalda. Los antígenos se diluyeron en PBS y se emulsionaron en un volumen igual de aceite vegetal (adyuvante de Freund incompleto (IFA); Sigma) o 10% intralípido. Se midieron los niveles de glucosa en los ratones a las 10 A.M. en un estado de no ayuno como se describe (Elias y col., 1991) en el momento del tratamiento (7, 12, 15, ó 17 semanas de edad) y, en aquellos ratones que sobrevivieron, a la edad de 40 semanas. Se consideró hiperglicemia significativa una concentración de glucosa de 11,1 mM/L o mayor porque esta concentración de glucosa en sangre era tres desviaciones típicas mayor que la concentración de glucosa en medio sangre medida en 100 ratones sanos (no mostrado). El examen histológico de los islotes del páncreas se hizo en secciones teñidas con hematoxilina y eosina. Las secciones se puntuaron independientemente por dos observadores que no estaban al tanto de la identidad de los grupos. Se usó el test chi cuadrado para averiguar las diferencias estadísticas entre los diversos tratamientos.

(iv) Ensayo de proliferación de células T

Se ensayaron células del clon C9 y suspensiones de células del bazo obtenidas de ratones NOD hembra para proliferación T como se describe anteriormente (Elias y col., 1991). Brevemente, se incubaron 1 x 10^{5} células/ml de clon o 1 x 10^{6} esplenocitos/ml por cuadruplicado durante 72 horas en 0,2 ml de medio de cultivo en pocillos de microvaloración en presencia o ausencia de diferentes antígenos a 5 \mug/ml. La proliferación se midió por la incorporación de [^{3}H]-timidina en ADN durante las 12 horas finales de la incubación. Los resultados se calcularon como el índice de estimulación: la relación de cpm del test del medio en presencia de antígeno a las cpm del fondo del medio en ausencia de antígeno. Las desviaciones típicas entre cuadruplicados fueron siempre <10% de las cpm del medio. El fondo fue <1000 cpm en experimentos de esplenocitos y <200 cpm con células C9. El bazo de cada ratón se analizó separadamente. Los resultados de cada grupo se muestran como el medio \pm DE.

Ejemplo 1 Tratamiento de ratones NOD con p277 o fragmentos del mismo

Para analizar si cualquiera de las dos mitades de 12 aminoácidos, ya sean solas o combinadas, del péptido p277, solas o combinadas son eficaces en ratones NOD como lo es el p277, se trataron ratones NOD hembra a la edad de 7 semanas por inoculación subcutánea de 50 \mug de diferentes péptidos en aceite. Se determinó el estado de los ratones a las 40 semanas de edad.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Se puede ver que el péptido p278 del hsp60 control no tuvo efecto en el desarrollo de la enfermedad: de los 40 ratones tratados, todos eran diabéticos y el 90% estaban muertos a las 40 semanas de edad. Por contraste, el péptido p277 evitó completamente la muerte y curó al 60% de los 20 ratones tratados. Los fragmentos de p277 fueron menos eficaces: la mitad amino del p277 (p277.N), la mitad carboxi del p277 (p277.C) y una mezcla de ambas (p277.N, p277.C) funcionaron aproximadamente la mitad de bien que funcionó el p277 intacto. El péptido p277.C se sintetizó unido al péptido p278 para producir un péptido más largo; sin embargo, p277.C-p278 no fue nada mejor que el p277.C solo. Por lo tanto, se puede concluir que el efecto terapéutico completo requiere el péptido p277 intacto.

TABLA 1 Tratamiento de ratones NOD con p277 o sus fragmentos

Estado a las 40 semanas de diabetes

Tratamiento con	Número de	Sanos	Hiperglicémicos	Muertos
péptido (50 \mug)	ratones	%	%	%
P278	40	0	100	90
P277	20	60*	40	0*
P277.N	20	20	80	50*
P277.C	20	30	70	40*
P277.N, p277.C	20	35*	65	40*
P277.C-p278	20	25	75	50*
* p<0,01 comparado con el grupo tratado con péptido control p278.

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Ejemplo 2 Tratamiento de ratones NOD con péptidos de sustitución de p277.

Los siguientes péptidos se probaron en ratones NOD: p277, p277(puente Cys-Cys), p277(Val^{6}-Val^{11}) y p277(Ser^{6}Ser^{11}).

Las hembras NOD se trataron con 100 \mug de péptido en una emulsión de 0,2 cc de aceite mineral (IFA) administrado subcutáneamente. Los ratones se trataron a las 12 semanas de edad y la incidencia de la diabetes tuvo lugar a las 30 semanas.

Como se muestra en la tabla 2, el p277(Val^{6}-Val^{11}) fue tan eficaz como el p277 en el tratamiento de la diabetes, siendo la incidencia de la diabetes en ratones no tratados del 80%, mientras que los ratones tratados con p277 y p277(Val^{6}-Val^{11}) mostraron una incidencia del 22% y 23% respectivamente. Por otro lado, ni el p277(puente Cys-Cys) ni el p277(Ser^{6}-Ser^{11}) tuvieron ningún efecto terapéutico. Dos variantes adicionales de p277, en los que los residuos de cisteína en la posición 6 y 11 se reemplazaron por residuos de alanina o de ácido \gamma-aminobutírico, tampoco fueron eficaces cuando se probaron in vitro ambos en células del clon C9 y en células T esplénicas de NOD. Como estos péptidos no fueron reconocidos por células T específicas anti p277 (no mostrado), no se probaron adicionalmente in vivo para efecto terapéutico.

TABLA 2 Tratamiento de ratones NOD con sustituciones del p277

Tratamiento de	Incidencia de diabetes (%)	Número de receptores
péptido
Ninguno	00	100
P277	22*	200
P277(puente Cys-Cys)	70 \P	10
P277(Val^{6}-Val^{11})	23*	52
P277(Ser^{6}-Ser^{11})	85\Re	20
. p<0,01 comparado con la incidencia de la diabetes en ratones tratados con adyuvante solo.
\P \Re No diferencia significativa comparada con la incidencia de diabetes en ratones tratados
con adyuvante solo.

Ejemplo 3 Estabilidad del p277(Val^{6}-Val^{11})

Ya que la razón para reemplazar las cisteínas era la estabilidad problemática del péptido p277, se analizó la estabilidad del p277(Val^{6}-Val^{11}) en varios momentos después de su síntesis. El péptido p277 es inestable y se deteriora incluso bajo condiciones estrictas (polvo liofilizado al vacío, -20ºC).

Para comparar la estabilidad del p277 con su análogo p277(Val^{6}-Val^{11}), se sintetizaron ambos péptidos en el mismo momento y se almacenaron como polvo seco a -20ºC. A las semanas 1, 9 y 20 después de la síntesis, una alícuota se pesó, se disolvió y se analizó. La lectura para la estabilidad del péptido fue su capacidad para estimular el clon C9 de la célula T. La Fig. 1 muestra los resultados del experimento. Se puede ver que, mientras que el p277 natural perdió la mayoría de su efecto en 9 semanas y todo, a las 20 semanas después de su síntesis, el p277(Val^{6}-Val^{11}) no cambió después de 20 semanas de almacenamiento.

Como se cree que la inestabilidad del p277 se produce por los residuos de cisteína, se espera que cualquiera de los análogos de la presente invención que contenga la actividad biológica del p277 tendrá una estabilidad mejorada sobre el p277 de una forma similar a la demostrada en este ejemplo para el p277(Val^{6}-Val^{11}).

Ejemplo 4 El tratamiento de ratones hembra NOD con p277 o p277(Val^{6}-Val^{11}) invierte la insulitis

Se trataron ratones hembra NOD a las 12 semanas de edad con 100\mug/ratón de p277 no modificado o p277(Val^{6}-Val^{11}) en emulsión de 0,1 cc de aceite mineral (adyuvante incompleto de Freund), subcutáneamente. Los ratones control recibieron una emulsión de PBS y aceite mineral. A los 6 meses de edad, 5 ratones de cada grupo se sacrificaron, se sacaron sus páncreas y se fijaron en bouin y se tiñeron secciones con hematoxilina: eosina. La insulitis se puntuó de una forma ciega. Dado que los ratones control desarrollaron diabetes grave, se sacrificaron a los 5 meses de edad. Por entonces, los niveles de glucosa en sangre de los ratones control estaban en el intervalo de 29-48 mmol/L. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 El tratamiento de ratones hembra NOD con p277 o p277(Val6-Val11) invierte la insulitis

Tratamiento con péptido	Número de islotes	Examen Histológico (22 semanas)
		Claro %	Insulitis	Intraislote %
			peri-islote %
Ninguno	83	10	23	67
p277	49	25	69	6
p277(Val^{6}-Val^{11})	62	52	31	17

A las 12 semanas de edad, el tiempo del tratamiento, aproximadamente el 60% de los islotes en los ratones no tratados mostraron insulitis intra-islote, aproximadamente el 20% de los islotes tenía insulitis peri-islote, y aproximadamente el 20% de los islotes no mostraron insulitis. Se considera que la infiltración intra-islote es una forma grave de insulitis asociada con la falta de función de células \beta. Como se muestra en la Tabla 3, se desarrolló un marcada divergencia en la aparición de los islotes en los dos grupos tratados en comparación con los ratones control tratados con el aceite solo. Los ratones tratados con el aceite (control) mostraron una caída progresiva en la proporción de islotes no afectados y solo pudieron verse un 10% de islotes normales a las 22 semanas de edad, momento en el que todos los ratones eran abiertamente diabéticos. Aproximadamente el 67% de los islotes mostraron insulitis intra-islote a las 22 semanas y el 23% de los islotes que quedaba mostró insulitis peri-islote. Por contraste, los ratones tratados con p277 o con p277(Val^{6}-Val^{11}) mostraron un aumento en los números de islotes normales (entre 25% y 52%) y una disminución en el número de islotes con insulitis intra-islote (entre 6% y 17%). Los islotes con insulitis peri-islote aumentaron hasta aproximadamente 31%-69%. Así, los tratamientos de p277 y p277(Val^{6}-Val^{11}) se asociaron con una imagen histológica mejorada consistente con la inversión del grado de insulitis que persiste durante 3 meses después del tratamiento.

Resultados adicionales usando p277 (v) en ratones NOD hembra

Se han hecho quince experimentos adicionales en los que se trataron grupos de 10 ratones NOD hembra cada uno con p277(V) en aceite o con aceite solo a las 12-15 semanas de edad. Del total de 150 ratones tratados con aceite solo, el 90% desarrollaron diabetes y el 85% murieron a la edad de 32 semanas. Por contraste, los ratones tratados con p277(V) mostraron una incidencia de diabetes de solo el 50% (p<0,01) y solo el 20% murieron de enfermedad grave(p<0,01). Por lo tanto, el tratamiento tardío con p277(V) fue eficaz en detener el desarrollo de la diabetes letal.

Ejemplo 5 Terapia de péptido de diabetes de tipo I usando p277(Val^{6}-Val^{11}) en emulsiones de lípidos

La destrucción autoinmune de las células \beta productoras de insulina en el páncreas está mediada por los linfocitos T. Se desarrolla un infiltrado inflamatorio alrededor de los islotes pancreáticos y la destrucción de células \beta a las 5-8 semanas de edad conduciendo a una deficiencia de insulina y se hace manifiesta la diabetes abierta a las 14-20 semanas de edad afectando casi al 100% de los ratones NOD hembra a las 35-40 semanas de edad.

Los ratones hembra NOD se trataron subcutáneamente con 100 \mug de péptido p277(Val^{6}-Val^{11}) por ratón en 0,1 ml de PBS o de un 10% de emulsión de lípidos compuesta por 10% de aceite de soja, 1,2% de fosfolípidos de huevo y 2,25% de glicerol (Intralípido, Kabi Pharmacia AB, Suecia).

Se siguió la incidencia de la diabetes a los 6 meses de edad y la producción de anticuerpos anti p277(Val^{6}-Val^{11}). La diabetes se diagnosticó como hiperglicemia persistente, niveles de glucosa en sangre sobre 11,1 mmol/L medidos por lo menos dos veces a intervalos semanales con el analizador de Glucosa Beckman II. Se ensayó un tratamiento satisfactorio de péptido por el mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre normal (menos de 11,1 mmol/L), la remisión de la inflamación intra-islote de los islotes pancreáticos (insulitis) y la inducción de anticuerpos contra el péptido terapéutico como un indicador de la respuesta inmune tipo TH-2. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Incidencia de la diabetes a los 6 meses

Tratamiento	Incidencia de diabetes (%)	Muerte (%)
P277(Val^{6}-Val^{11})/PB	90	80
P277(Val^{6}-Val^{11})/Intralípido	45*	20*
Ninguno	100	90
*p<0,01 comparado con ratones NOD no tratados

Como se puede ver en la Tabla 4, el tratamiento con un péptido de la presente invención administrado en Intralípido fue eficaz en reducir la incidencia de la diabetes y la muerte. Por otro lado, el tratamiento administrado en PBS fue ineficaz.

Ejemplo 6 Los péptidos p277 y P277(Val^{6}-Val^{11}) son inmunológicamente reactivos cruzados

Las células del clon C9 de la célula T aislado de ratones NOD prediabéticos se incubaron con péptidos p277 (círculos cerrados), p277(Val^{6}-Val^{11}) (círculos abiertos), p277(Ser^{6}-Ser^{11}) (cuadrados cerrados) y p277 (puente Cys-Cys) (rombos abiertos). Los resultados se muestran en la Fig. 2. Se encontró que el clon C9 manifestaba una respuesta de proliferación positiva solo a los péptidos p277 y p277(Val^{6}-Val^{11}). Esto prueba que p277 y p277(Val^{6}-Val^{11}) son reactivos cruzados y que los péptidos p277(Ser^{6}-Ser^{11}) y p277 (puente Cys-Cys), que no son eficaces terapéuticamente, no son inmunológicamente reactivos cruzados.

Ejemplo 7 Pacientes de DMID recién diagnosticados muestran respuestas proliferativas de células T tanto a p277 como a P277(Val^{6}-Val^{11})

Se analizaron pacientes de DMID recién diagnosticados (2-4 semanas) en un ensayo de proliferación. Se aislaron linfocitos de sangre periférica de sangre heparinizada completa en ficol-hypaque, y se discriminaron in vitro para la proliferación, se midieron como incorporación de ^{3}H-timidina, se indujeron por péptidos de hsp60, p277, p277(Val^{6}-Val^{11}) y péptido control p278. La respuesta proliferativa de células T se representa como el índice de estimulación (IE): la relación entre la incorporación de timidina estimulada por péptido y la incorporación de timidina del fondo (sin añadir antígeno) por las células T.

TABLA 5 Pacientes de DMID recién diagnosticados muestran respuestas proliferativas de células T tanto a p277 como a P277(Val^{6}-Val^{11})

Paciente		Proliferación de células T (IE)
	p277	p277(Val^{6}-Val^{11})	p278
DMID#68	3,5	3,2	0,8
DMID#69	2,5	5,0	0,5

Como se muestra en la Tabla 5, pacientes de DMID recién diagnosticados responden a p277(Val^{6}-Val^{11}) así como al péptido p277. Por lo tanto, el p277(Val^{6}-Val^{11}) es inmunológicamente equivalente al p277. Dado que el efecto terapéutico del p277 está mediado por reconocimiento inmunológico, el hecho de que el p277(Val^{6}-Val^{11}) sea inmunológicamente reactivo cruzado con el p277, indica que se puede usar en lugar del p277 al tratar la diabetes.

Ejemplo 8 Respuestas de las células T a la hsp60 y péptido en individuos con DMID y sanos

Veintiún pacientes con DMID y catorce donantes de sangre sanos se discriminaron para anti hsp60 y p277(V) por medio del ensayo de proliferación del ejemplo 7. Las Tablas 6 y 7 muestran la respuesta de células T proliferativa (índice de estimulación; IE) de cada individuo al antígeno control (Ag control), es decir, toxoide del tétano y virus de la gripe-cepa Texas, a la hsp60 recombinante completa y al p277(V). Se consideró que los valores IE de 3 o mayores eran positivos.

TABLA 6 Respuesta de células T proliferativa de pacientes con DMID

Paciente	Edad	Tiempo desde el diagnóstico	Respuestas de células T
	(años)	(semanas/meses)	(índice de estimulación) a
			Ag	Hsp60	P277(V)
			control
1. LM	32	3,5 meses	+	+	-
2. G	25	24 meses	+	+	-
3. H	23	6 meses	+	+	-
4. DV	20	3 semanas	+	+	-
		5 semanas	+	+	+
5. SD	15	6 semanas	+	-	+
6. P	15	4 semanas	+	+	-
7. G	60	5 semanas	+	+	+
8. F	45	6 semanas	+	+	+
9. IS	53	2 semanas	+	+	-
10. T	20	4 semanas	+	+	+
11. KK	21	4 semanas	+	+	-
12. RI	40	6 semanas	+	-	-
13. MS	5	1 semana	+	-	-
14. KB	5	2 meses	+	+	+
15. BI	11,3	3 semanas	+	-	-
16. YY	60	2 meses	+	+	-
17. KA	12	4 semanas	-	-	-
18. ZA	12	4 semanas	+	+	+
19. A	17,5	11,5 años	+	+	+
20. N	17,5	7,5 años	+	+	+
21. A	19,7	5,7 años	+	+	+

Pacientes positivos para anticuerpos anti GAD, son diabéticos tipo I y no tipo II a pesar de la avanzada edad de aparición.

TABLA 7 Respuesta de células T proliferativa de donantes de sangre sanos

Donante	Respuestas de células T (índice de estimulación) a:
	Ag control	hsp60	p277(V)
1	+	-	-
2	+	-	-
3	+	nd	+
4	+	-	-
5	+	+	+
6	+	-	-
7	+	-	-
8	+	-	-
9	+	-	-
10	+	-	-
11	+	+	-
12	+	-	-
13	+	+	-
14	+	-	-
nd: no hecho

La tabla 8 es una tabla resumen que muestra que el 86% y el 52% de los pacientes respondieron a la hsp60 y al p277(V) comparado con el 21% y 14% de los controles (p<0,05). Así, el grupo de DMID fue significativamente positivo para la respuesta de células T a hsp60 y a p277(V). Esto lleva a la conclusión de que la incidencia de los individuos reactivos a hsp60 y p277(V) es más elevada entre pacientes de DMID que entre gente sana.

TABLA 8 Incidencia de la respuesta de células T positiva en individuos con DMID y sanos

Respondedor	Incidencia de respuestas de células T a (%)
	hsp60	P277(V)
DMID	18/21 (86)	11/21 (52)
Sanos	3/14 (21)	2/14 (14)

p<0,05 por análisis X^{2}, comparado con la incidencia de los respondedores anti p277(V) en donantes de sangre sanos.

Ejemplo 9 Proliferación de células T NOD contra p277(Lys^{19})

El péptido p277(Lys^{19}) difiere del p277 en un aminoácido. Para confirmar que el p277(Lys^{19}) es un autoantígeno en DMID NOD, comparamos la proliferación de células T contra el péptido p277 y contra el péptido p277(Lys^{19}). La Fig. 3 demuestra que las células T de bazos de NOD hembra proliferaron contra el péptido p277(Lys^{19}) en la misma medida que contra el p277. No hubo respuesta al péptido control p278.

Los resultados anteriores se confirmaron usando el clon C9, un clon de células T NOD diabetogénicas que se encontró que respondía al péptido humano p277 (Elias y col., 1991). Se encontró que las células C9 proliferaban contra el péptido p277(Lys^{19}) en la misma medida que contra el péptido p277 (Fig. 4).

Ejemplo 10 Tratamiento de ratones hembra NOD con p277(Lys19)

Los presentes inventores habían informado anteriormente que la insulitis avanzada presente en los ratones NOD hembra de tres meses se podía detener tratando los ratones con una única inyección de p277 humano; los ratones tratados desarrollaron una incidencia más baja de diabetes clínicamente abierta y de muerte por hiperglicemia grave. Para analizar si el péptido p277(Lys^{19}), que es el péptido p277 propio de ratón, era también eficaz, tratamos ratones NOD hembra de tres meses con 100 \mug de o bien p277 humano o p277(Lys^{19}) en IFA.

Se emulsionaron los péptidos p277 o p277(Lys^{19}) a una concentración de 2 mg/ml en tampón fosfato salino (PBS) con un volumen igual de adyuvante de Freund incompleto (IFA). Se inyectaron subcutáneamente grupos de 10 ratones NOD de tres meses hembra con 0,1 ml (100 \mug de péptido) de emulsión que contenía cada péptido. Los ratones control se inyectaron con una emulsión de PBS e IFA. A los ratones se les sacó sangre cada 4 semanas y se determinaron los niveles de glucosa en sangre con el analizador de glucosa Beckman II. La incidencia de hiperglicemia y de muerte por diabetes se tanteó a los 6 meses de edad. Los ratones se consideraron diabéticos si su glucosa en sangre era mayor de 11 mmol/L.

Los resultados se muestran en la Tabla 9. A los 6 meses de edad, el 90% de los ratones control eran abiertamente hiperglicémicos y el 60% había muerto de diabetes. Por contraste, el tratamiento ya sea con p277 o con p277(Lys^{19}) evitó ambas diabetes (40% y 50% de incidencia, respectivamente). Así, el péptido propio de ratón p277(Lys^{19}) parece que es tan eficaz como el p277 extraño en la terapia de insulitis avanzada.

TABLA 9 Tratamiento de diabetes con p277 o p277(Lys^{19})

Tratamiento a los tres meses	Diabetes a los 6 meses
	Hiperglicemia (%)	Mortalidad (%)
p277(Lys^{19})	50*	20*
P277	40*	10*
PBS	90*	60
p< 0,05

Estos resultados muestran que las respuestas proliferativas de las células T NOD detectadas usando la molécula hsp60 humana y su péptido p277 son el equivalente de una respuesta autoinmune a la secuencia de hsp60 de ratón y a la de p277(Lys^{19}) de ratón. Esto se demostró para el clon de la célula T C9 diabetogénico así como para la respuesta espontánea que se desarrolla en los bazos de ratones prediabéticos. Es más, el p277(Lys^{19}) fue tan eficaz como el p277 en el tratamiento de diabetes en ratones NOD. Las células T de bazo de ratones de la misma edad y sexo de otras cepas no manifestaron una respuesta proliferativa de células T espontánea a p277 (no mostrado).

El descubrimiento de la autoinmunidad a una secuencia hsp60 de ratón dirigida por células T diabetogénicas apoya la creencia general de que la DMID se produce por un proceso autoinmune.

Ejemplo 11 Tratamiento de diabetes inducida por STZ por p277(V)

La estreptozotocina es una toxina específica de célula beta que puede producir diabetes tóxica al destruir las células beta en 24-48 h si se inyecta una dosis de 200mg/kg. Dada en dosis subtóxicas pequeñas induce insulitis en ratones genéticamente susceptibles que conduce a diabetes. El proceso inflamatorio lleva 20-30 días, dependiendo de la dosis de STZ. El protocolo usual para la diabetes inducida por STZ es una dosis de 200 mg de STZ por kg de peso corporal, dada en 5 dosis iguales de 40 mg/kg en días consecutivos (Like y Rossini, 1976) y el modelo se denomina STZ de baja dosis. Encontramos que si la dosis total se reduce a 150 mg/kg (30 mg/kg x 5), la diabetes aparece en 80-100 días. Esta forma progresiva lenta de diabetes inducida por STZ probablemente se parece más a la diabetes autoinmune en humanos y es de la misma duración que la fase preclínica de la diabetes espontánea en ratones NOD (Castano y Eisenbarth, 1990). Es más, los efectos tóxicos agudos disminuyen a medida que se reduce la dosis.

La proteína de choque térmico de 60 KDa (hsp60) juega un papel tanto en la diabetes NOD (Elias y col., 1990) como en la inducida por STZ (Elias y col., 1994). Hemos mostrado anteriormente que tanto la respuesta proliferativa de anticuerpos como la de células T tienen lugar antes de la aparición de la diabetes abierta. Los clones de células T específicos para hsp60 se obtuvieron de ratones NOD prediabéticos y podían adoptivamente transferir insulitis e hiperglicemia en ratones NOD jóvenes (Elias y col., 1991) o en ratones NOD \tau, \gamma e \delta. Los clones de células T diabetogénicos de NOD reconocen un péptido largo de 24 aminoácidos de la secuencia de hsp60 437-460 que denominamos p277. La diabetes inducida por STZ se acompaña también de respuestas de células T anti p277 en la fase preclínica.

Ejemplos anteriores han mostrado que el péptido p277(Val^{6}-Val^{11}) protege a los ratones NOD. El presente experimento prueba la eficacia del tratamiento de p277(V) en el modelo de STZ de baja dosis.

Se trataron ratones macho, 10 por grupo, con una dosis de STZ de 30 mg/kg, diariamente durante 5 días. Una semana más tarde, los ratones se trataron con 100 \mug tanto de p277(V) en aceite, como de un péptido de ácido glutámico descarboxilasa (GADp34) descrito por Kaufman y col., 1993, como que está involucrado en la diabetes de ratones NOD, o de aceite solo. El tratamiento se repitió en el día 85. En el día 100, se les sacó sangre a los ratones y se analizó su sangre para hiperglicemia (concentración de glucosa superior a 15 nmol/L). Los resultados se resumen en la Fig. 5. Se puede ver que la media de glucosa en sangre de los grupos de ratones tratados con p277(V) estaba en el intervalo normal. Así, el p277(V) puede ser eficaz en el tratamiento de la diabetes inducida por STZ en ratones C57BL/ksj macho así como en la diabetes espontánea que se desarrolla en los ratones NOD hembra genéticamente diferentes. La aplicabilidad de la terapia de p277(V) no se limita a la diabetes de solamente una causa o a solo un genotipo o género.

La referencia a etapas de procedimientos conocidos, etapas de procedimientos convencionales, procedimientos conocidos o procedimientos convencionales no es en ningún caso una admisión de que ningún aspecto, descripción o forma de realización de la presente invención esté revelada, enseñada o sugerida en la materia relevante.

La descripción precedente de las formas de realización específicas revelará así completamente la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento en la habilidad en la materia (incluyendo los contenidos de los antecedentes citados en la presente invención), fácilmente modificar y/o adaptar para distintas aplicaciones dichas formas de realización específicas, sin experimentación excesiva, sin partir del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se tiene intención de que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado e intervalo de equivalentes de las formas de realización reveladas, basadas en la enseñanza y orientación presentadas en la presente invención. Se debe entender que la fraseología o terminología en la presente invención es con el propósito de descripción y no de limitación, que dicha terminología o fraseología de la presente solicitud debe interpretarse por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y orientaciones presentadas en la presente invención, en combinación con el conocimiento de uno de experiencia habitual en la materia.

Bibliografía

Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach JF. (1987) Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD ice to healthy neonatos. Requirement for both L3T4+ y Ly+-2+ T cells. J Exp Med, 166:823-32.

Bowman MA, Leiter BH and Atkinson MA. (1994) Prevention of diabetes in the NOD mouse: implications for therapeutic intervention in human disease. Immunology today, 15:115-20.

Castano L, Eisenbarch GS. (1990) Type I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat. Annu Rev Immunol, 8:647-79.

Elias, Dana. (1994) The NOD mouse: A model for autoimmune insulin- dependent diabetes. Autoimmune Disease Models, A Guidebook, pp 147-61.

Elias D, Markovits D, Reshef T, van-Der Zee R y Cohen IR (1990) Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouse by a 65-kDa heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA, 87:1576-80.

Elias D, Prigozin H, Polak N, Rapoport M, Lohse AW, Cohen IR (1994) Autoimmune diabetes induced by the b-cell toxin streptozotocina. Diabetes, 43:992-98.

Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker MD, Cohen IR. (1991) Vaccination against autoimmune mouse diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA, 88:3088-91.

Elias D. and Cohen IR. (1994) Peptide therapy for diabetes in NOD mice. The Lancet, 343:704-06.

Kaufman DL, Clare-Salzler M, Tian J, Forsthuber T, Ting GSP, Robinson P, Atkinson MA, Sercarz EE, Tobin AJ, Lehman FV. (1993) Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decarboxilasa in murine insulin-dependent diabetes. Nature, 366:69-72.

Like AA, Rossini AA (1976) Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new model of diabetes mellitus. Science, 193:415-17.

Mosmann T.R. and Coffman R.I. (1989) Ann Rev Immunol, 7:145- 73.

Tisch R, Yang XD, Singer SM, Liblav RS, Fuggar L, McDevitt Ho. (1993) Immune response to glutamic acid decarboxilasa correlates with insulitis in non- obese diabetic mice. Nature, 366:72-75.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: P.O. Box 95

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehobot

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Irun R. COHEN

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 11 Hankin Street

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehobot

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76354

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Dana Elias

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 57 Derech Yavne

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehobot

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76344

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Matityahu FRIDKIN

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 23 Miller street

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rehobot

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Israel

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76284

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANÁLOGOS DEL PÉPTIDO p277, Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS COMPRENDEN PARA TRATAMIENTO O DIAGNÓSTICO DE DIABETES

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv)

FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patentin Release # 1:0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 112094

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-Dic-1994

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: IL 114460

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-Jul-1995

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

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(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\newpage

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 6, 11, 19

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "aaX en la pos. 6/11 = Cys o Val; aaX en la pos. 19 = Thr o Lys; en el que los aaX en la pos. 6/11 no son ambos Cys cuando aaX en la pos. 19 es Thr."

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Xaa Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

U BICACIÓN: 19

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "aaX en la posición 19 es Thr o Lys"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\newpage

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 19

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "aaX en la posición 19 es Thr o Lys"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Xaa Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 19

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp}

\sac{Ser Leu Lys Pro Ala Asn Glu Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LARGO: 17 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

ESTRUCTURA DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Glu Asp Gln Lys Ile Gly Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys}

\sac{Ile}

Claims (17)

1. Un péptido de secuencia I:

1

en el que cada X_{1} y X_{2} es un residuo de Cys o Val, y X_{3} es un residuo de Thr o Lys, pero X_{1} y X_{2} no pueden ser ambos residuos de Cys cuando X_{3} es Thr, y sales y derivados funcionales del mismo.

2. Un péptido según la reivindicación 1 seleccionado de los péptidos de la presente invención nombrado p277(Val^{6}) en el que X_{1} es Val, X_{2} es Cys y X_{3} es Thr; p277(Val^{11}) en el que X_{1} es Cys, X_{2} es Val y X_{3} es Thr; p277(Val^{6}-Val^{11}) en el que tanto X_{1} como X_{2} son Val y X_{3} es Thr; p277(Lys^{19}) en el que tanto X_{1} como X_{2} son Cys y X_{3} es Lys; p277(Val^{6}-Lys^{19}) en el que X_{1} es Val, X_{2} es Cys y X_{3} es Lys; p277(Val^{11}- Lys^{19}) en el que X_{1} es Cys, X_{2} es Val y X_{3} es Lys; p277 (Val^{6,11}-Lys^{19}) en el que tanto X_{1} como X_{2} son Val y X_{3} es Lys.

3. Uso de un péptido según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de una composición para el diagnóstico de diabetes melitus insulino-dependiente (de aquí en lo sucesivo DMID).

4. Un procedimiento para diagnosticar la presencia o incipiencia de DMID en un paciente, que comprende probar la sangre u orina de dicho paciente con un péptido como antígeno según la reivindicación 1 ó 2 para la presencia de anticuerpos o células T que son reactivas inmunológicamente con la hsp60 humana, de forma que un resultado que indica la presencia positiva de anticuerpos anti hsp60 o de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 indica una elevada probabilidad de la presencia o incipiencia de DMID.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la presencia de anticuerpos anti hsp60 se analiza por radioinmunoensayo o por un test ELISA.

6. Un kit para diagnosticar la presencia de DMID probando la presencia de anticuerpos anti hsp60, según el procedimiento de la reivindicación 4 ó 5, que comprende:

(i) un antígeno que es un péptido de secuencia (I) en la reivindicación 1; y

(ii) un anticuerpo marcado capaz de reconocer la región no variable de dichos anticuerpos anti hsp60 que se van a detectar.

7. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la presencia de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 se prueba por un test de proliferación de células T que comprende las siguientes etapas:

(i) preparar una fracción celular mononuclear que contiene células T de una muestra de sangre obtenida de dicho paciente;

(ii) añadir a dicha fracción celular mononuclear un antígeno seleccionado de un péptido según la reivindicación 1;

(iii) incubar dicha fracción celular en presencia de dicho antígeno durante un periodo de tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas;

(iv) añadir un nucleótido marcado al cultivo celular incubado de (iii) en un momento adecuado antes del final de dicho periodo de incubación para proporcionar la incorporación de dicho nucleótido marcado al ADN de las células T que proliferan y

(v) determinar la cantidad de células T que proliferan por análisis de la cantidad de nucleótidos marcados incorporados a dichas células T.

8. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que se prueba la presencia de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 por un test de respuesta de citoquina de célula T que comprende las siguientes etapas:

(i) preparar una fracción celular mononuclear que contiene células T de una muestra de sangre obtenida de dicho paciente;

(ii) añadir a dicha fracción celular mononuclear un antígeno seleccionado de un péptido según la reivindicación 1.

(iii) incubar dicha fracción celular en presencia de dicho antígeno durante un periodo de tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas; y

(iv) medir la presencia de citoquina secretada por los linfocitos que responden en el medio; en el que la citoquina es IFN-\gamma, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF- \alpha o TGF\beta.

9. Un kit para diagnosticar la presencia de DMID probando la presencia de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 según el procedimiento de la reivindicación 7, que comprende:

(i) un antígeno que es un péptido según la reivindicación 1;

(ii) un nucleótido marcado; y

(iii) un medio adecuado para cultivo de linfocitos.

10. Un kit para diagnosticar la presencia de DMID probando la presencia de una célula T que inmunorreacciona con hsp60 según el procedimiento de la reivindicación 8, que comprende:

(i) un antígeno que es un péptido según la reivindicación 1;

(ii) un medio adecuado para cultivo de linfocitos; y

(iii) un kit de ensayo para medir la presencia de la citoquina secretada por los linfocitos que responden en el medio.

11. Una preparación para prevenir o tratar la DMID, que comprende un producto de célula T seleccionado del grupo que consiste en : (a) células T humanas que manifiestan especificidad por la secuencia p277 de hsp60 humana, células que se han activado al incubarse en presencia de un péptido de secuencia I según la reivindicación 1; (b) dichas células T humanas de (a) que se han irradiado o atenuado de otra manera; y (c) dichas células T humanas de (a) que se han sometido a tratamiento de presión por medio de presión hidrostática, tratamiento con agente químico de conexión cruzada y/o tratamiento con un agente de conexión cruzada de citoesqueleto.

12. Una preparación según la reivindicación 11, en la que dichas células T humanas de (a) son células T autólogas obtenidas del paciente de DMID que se va a tratar, y dicha especificidad de dichas células T se ha desarrollado por contacto in vitro con dicho péptido de secuencia I.

13. Una preparación según la reivindicación 11 ó 12, en la que dichas células T han desarrollado especificidad in vitro por un péptido de secuencia I según la reivindicación I.

14. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de secuencia I según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 14 para la prevención o tratamiento de DMID.

16. Una composición farmacéutica según la reivindicación 14 ó 15, en la que dicho péptido es un péptido según la reivindicación 2.

17. Uso de un péptido según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de DMID.