RS49517B - PEPTID p277-ANALOZI I FARMACEUTSKI PREPARATI KOJI GA SADRZE - Google Patents

Abstract

Peptid sekvence I: 6 ; 11 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-X1-Ala-Leu-Lwu-Arg-X2-Ile-Pro-19 ; (I) Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-X3-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(SEQID br.2) gde X1 i X2 svaki posebno su Cys ili Val ostatak, a X3 je Thr ili Lys ostatak, a X1 i X2 ne mogu oba biti Cys ostaci kada X3 je Thr, kao i njihove soli i njihovi funkcionalni derivati. Prijava sadrži još 9 nezavisnih i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Oblast tehnike

Pronalazakjeiz oblasti organske i farmaceutske hernije.

Tehnički problem

Predmetni pronalazak se odnosi na nove peptide koji su varijante

epitopa humanog 60 kDa toplotnog šok proteina (hsp 60)ina farmaceutske preparatekojiga sadrže.

Stanje tehnike

Tip dijabetaI iliIDDM je autoinuno obolenie uzrokovano Tdelijama koje napadaju irazaraju beta-ćelii« kuje proizvodeinsulin locirane

u pankreasu (castano and Resenbarth, 1990) . Autoimuni proces koji

kulminira u IDDM počinje i napreduje bez simptoma. Obolenje se

klinički opaža samo kada kumulativni gubitak beta-ćelija prelazi

kapacitet preostalih beta-tfelija radi obezbedjivania insulina.Ustvari

kolaps alukozne homeostaze i klinički IDDM se iavljaiusamokaoa ou-90'e

beta-ćelija bude inaktivirano imunim sistemom. Tako, pacijenti

za koje se može dokazati da pate od IDDM su veđ u veoma razvijenom

stadijumu autoimunog razaranja njihovih beta-đelija. Medjutim.

dijagnoza, predkliničkog dijabeta detekcijom imunoloških markera

autoimunih beta-ćelija može biti načinjena samo posle početka

autoimunog procesa. Stoga, terapeutski zahtev je nađi bezbeđni,

specifičaniefikasannačiniskuljučenja autoiniunoaprocesa koji

već podmakloteče-

Ovi pronalazači su razmatrali ovo<p>itanje ranije proučavanjem

spontanogdiabefcarazviienog na miševimaNOD vrste, koji se

smatra vernim modelom humanog IDDM (Castano and Eisenbarth, 1990).

NOD mišuvi razvijaju insulitis oko 4 sedmice starosti, koii počinje

kao umeren peri-inslet inflitrat i napreduje flo ozbiljne intra-islet

inflamacije. Hiperglikemija koja dokazuje insulinsku insufi-

cijenciju, počinje kod ženki oko 14-17 sedmice starosti. Posle35-40

sedmica starosti, skoro sve ženke NOD miševa su imale ozbilino

razvijen dijabet i većina ih je uginula u odsustvu insulinskoq

tretmana. Mužjaci NOD miševa su imali manji broj obolenja što nije

bilo jasno. Pikazano ie da je dijabet kod NOD miševa izazvan

autoimunim T ćelijama (Bendelac et al., 19B7) .

Reakti^nost T-ćelije i autoantitela prema raznim antigenima<g>u

de tek tova ni kod humanih IDDM pacijenata kaoikod NOD miševa (Elias,

1994) i nije jasno da li imunitet prema iednom od mogućih

ciljnih antigena je primarni uzročnik obolenia. Pored pitanja

uzročnika<p>ostojiipitanje terapije.

Pokazanojeda iniciranje autoimunog procesa kod NOD miševa može?

biti s<p>rečeno podvrgavanjem miševa, ore<p>očetka diiabeta, raznim

postupcima takvim kao restriktivna dijeta, virusne infekcije ili

ne-specifičnoj stimulaciji imunoa sistema (Bowman et al., 1 994) .

NOĆ dijabeti se mogu sprečiti tak od i e indukf..:. jom imunološke tolerancijo

u rrs-dijabetskim miševima prema antiaenskoi glutamisnke kisni ine

dekarboksilazi (GAD) (Kaufman et al., 1993, Tisch et al. 1993) .

Ovi pronalazači su našli prethodno da diabeti NOD miševa mocru biti

sprečeni pomoću T ćelijske vakcinacije koristeći T ćelije snecifične

za p277 oeptidnu sekvencu humanog hsp60 molekula (Elias et al.,

1991) . Cvai protein je prvo označen kaohsp6E>, ali je sada označen

kao hsp60 sa obzirom na tačniju informaciiu molekulske mase, bez

obzira na oznaku, protein ie isti.

p277 peptid koii je epitop humanog hsp6G koji učestvuje u IDDMi

koji odgovara položajima 437-460 humane hs<p>60 sekvence prvi ie

opisan u Izraeleskoj patentnoj prijavi br. 94241 ovih prijavioca i

u Elias and Cohen, 1994 a iira sledeću sekvencu:Vo. 1 - iAi u- G1 y -G1 y-G 1 y -C y 3 -Ala -Leu- Leu-Arg-C ys -1 le Pro-^JLa-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp {SEQ ID N0:1)

Davanje p27~ samog peptiđa na početku isnulitisa pokazano je da sprečava razvoj dijabeta, verovatno snižavanjem anti-p277 imuni-teta !<oji je bitan za NOD dijabete (Elias et al., 1991, Izraelska patentna priiava br. 94241) . Nedavna proučavanja su pokazala đa p277 peptid može biti takodje korišćen za povratni beta-ćelijski autoimunitet koji napreduje (Elias and Cohen. 1994).

Laboratorija ovih pronalazača je nedavno objavila da oblik autoimunog diabeta može biti izazvan u C57BL/KsJ vrsti miševa davanjem veoma male doze beta-ć?:lijskog toksičnog streptozoticina (3TZ)

(Elias et al, 1994) . Dok standardna niska doza 5TZ od 4C mg/kg davana dnevno pet dana obično izaziva klinički diabet tokcm 3 sedmice, davanje 3C mg/kg 5 dana indukuje klinički diabet samo posle produ-ženoa perioda od oko 3 meseca. Ovaj model indukovanja diabeta je ozna-čen pojavom autoantitela prema insulinu, anti-idiotipičnih antiteia prema insulinskim autoantitelima i autoantitela prema hsp6G. Miševi takodj.e manifestu ju spentanu T-ćeiijsku reaktivnost premahsp6Q

i svom p277 peptidu (Elias et al., 1994). Tako,niže od standardne doze STZ pokreću autoimunproces koji nije sličan onom u spontano razvijenom điabetu u NOD miševima (Elias et al., 1990) .

Predmet predmetnog pronalaska je obezbedjivanje varijanti peptida p277 koje su korisne za dijagnozu i tretiranje IDDM.

Opis pronalaska

rJ proučavanju fragmenata i varijanti peptida p277 neočekivano je nadjeno da peptidi u kojima je treonin ostatak zamenjen lizinskim ostatkom i/ili 1 ili oba cisteinska ostatka su zamenjena vaiinskim ostatkom su aktivni kao p277 u tretiranju diabeta. Ovi rezultati su još neočekivaniji pošto supstitucija cisteinskih ostataka serinskim ostacima daje neaktivne peptide.

Predmetni pronalazak se takodje odnosi na peptiđ koji obuhvata sekvencu I:

gdeX1iX2svaki je Cys ili Val ostatak i X3je Thr ili Lys ostatak,

ali XjiX2 nemoau biti oba Cys ostaci kada X3ie Thr ostatak.

U specifičnim realizacijama pronalaska, pe<p>tid se satoji od sekvence

I gde oba Xxi X2su Cys i X3je Lysfgde je p277(Lys<19>) ili XAje

val, X, je Cys 1 X, je Thr ili Lys. gde je o277 (Val6) i p277 (Val6-

19 * ■*

Lys ) , respektivno; ili X, je Cys. X, ie Val i X, je Thr ili L.ys,

11 11 19

gde je p277(Val ) i p277 (Val -Lys" ). respektivno; xlx ooa X. i X2 su Val i X, je Thr ili Lys, gde je p277 (Val6-ValU) i o277 (Val

19 6 11

Lys )# respektivno. p277(Val -Val )<p>eptid ie takodje označen ovde

kao p277 (V).

Dalje, predmet predmetnog<p>ronalaska je obezbedjivanie postupaka

iopreme za ranu dijagnozu tddm koi-is+ećl peotiH sekvence I pronalska.

Utoku razvijanja IDDM, životinje izražavaju hsp60 molekule ili

molekule koii su reaktivni sa njima, koji nalaze svoj putuVc\-ili

urin životinja. One takodje izražavaju antitelaiT delije usmerene

direktno i specifično na takve molekule. Tako, prisustvo nsp60

(ili molekula koji su reaktivni sa niima) ili antitela iliTćelija

specifičnih prema njima u krvi ili urinu služi kao proba za detekciiu

IDDM procesa pre završetka razaranja beta ćeliia i individua ie

osudiena na dugo-živeći diabetis.

Prisustvo ili početni IDDM kod pacijenata može biti diiagnoziran

testiranjem krvi ili urina pacijenata na prisustvo anti-hsp60 antitela ili T ćelija koje su imunološki reaktivne sa humanim hsp60,

koristeći kao antigen peptid sekvence I<p>ronalaska. Pored procedura

prethodno opisanih kao operativnih koje koriste p277 i'<p>ct interna-

cionalna prijava objavljena pod br. W0 90/10449, koja je ubačena

ovde referencom) takodje se može koristiti kao zamena za d277, pentiH

sekvence I predmetnog pronalsaka.

Stoga, predmetni pronalazak obezbedjuje<p>ostupak za điiagnozu ili

početak IDDM kod<p>acijenata koii obuhvata testiranie paciienta na

prisustvo anti-hsp60 antitela ili T ćeliie koja imunoreaguje sa

nsTiflOŠto indicirapozitivne prisustvo anti-hsp60 antitela,. T ćelije

kois inujmoreagujesahsp60 ili T ćelije ili T ćelije koja imunorea-

»juje sa h-spSOšto indicira veliku verovatnoću prisustva ili<p>očetka

IDDM.

Uposfcunki.1za dijaanozu IDDM. pacijent može biti testiran na prisustvo

anti--hsp60 antitela, gde metod testiranja obuhvata rađioimuno ispitivanje ili ELISA test.

Pacijentmožetakodje biti testiran na prisustvo T ćelije koja imunoreaguje sa hsp60 . U iednoj reallzcaiii ovog aspekta, metod testiranja

cbunvataTdelijski proliferacioni test koii obuhvata stupnjeve:

i. dobijanjeinononuklearns ćeliiske frakcije koja sadrži

Tćeliieizuzorka krvi pcmenutog paciienta,

ii.dodavanje mononuklearnoj ćeliiskoj frakciji antigena odabranogiz peptidnesekvenceIpronalaska,iii.inkublranje nomenute ćeliiske frakcijeu prisustvupomenuto<q>antigena tokomprihvatljivog vremenskoq<p>eriodai ooduslovimai'odMsjiiv.'za k'ilturu,

.i", dodavanja obeleženognukleotidainkub> ■ a.noj će lij široj

kult-uri (il<:>.) ore kraia inkubacionog perioda radi n--7.bed j i van ja

ugradjivanjacbeležejio<q>nukleotidauDNA<p>roliferiiuđih Tćelija i

v. odredjivanje količine profiliraj uđihTĆPli-ia analizom

količine obeleženog nukleotida ugradjenog u T ćelije.

U stupnju (iv). napred, pomenut obeležen nukleotid j<p>pozelino

"H-timiđin, Odredjivanie količine proliferiraiuđih ćeliia se vrši

izračunavanjem stimulizacionog indeksa T ćelija standardnim postu<p>cima.

U drugcirealizaciji ovoc asoekta, metodtestiranja obuhvata'i'-ćeli-jski citotokin test odgovora gde su stupnievi(i) do (iii)kao uaorniem Tđeliiskom proliferacionom testuau četvrtom stupnju (iv) prisustvo citokir.attakvoq kao IFN-gama,IIi-2,TL-4. JL-6, IL-10,TKFalfa ili TGPbetaizlučenogpomoću odgovarajuđih limfocitau sredinu

sedetektuje standardnim<p>ostupcima sa komercijalno dostupnom oprftmo".

UHruoom aspektupronalaska, pronalazak obezbedjujein vivo<p>ostupakfjc'ie se antigen odabran odpeptida sekvenceT injektira uotkožnopaci-

ientu i orati se poiava detektabi1 ne kožne reakcije (DTH) .

Predriet!\i pror&lazak se takodie odnosi na srp^t^o za vrćenje takvih isoi ti :' čti\ja kao i na opremu za izvođjenje takvih Ispitivani«. Oprema se može dobiti za izvodjenje raznih ispitivanja korišćenjih za realizaciju pređmetnoa pronalaska. Svaka takva oprema uključuje sve materijale potrebne za vršenje jedno<q>isDitivania ili odredjenog broiči ispitivanja. Na primer, takva oprema za odredjivanie prisustva anti-hsi>60 antitela može da sadrži peptid sekvence I imobiliziran na čvrstoj fazi i citirano antitelo sposobno da prepozna nepromenljivj region anti-hsp60 antitela koje se detektuje. takvoa kao anti-humani fah. Oprema može takodje da sadrži uoustva za korišđenie ooreme i konrejnere za držanje materijala o<p>reme. Bilo koii

ot' iO lizi vPČ'NoZt? biti korišćena, takav kao raaioizotop, enzim, nromoror ili fluorofor. Tipični radioizotop je jod-125 ili sumpor 35. Ti<p>ični enzimi za ovu svrhu uključuju peroksidazu hrena, beta-galaktosidazu i ulkalnu fosfatazu.

Oprema za dijaanoziranje prisustva IDDM pomoću testiranja na prisustvo anti-hso60 antitela obuhvata: i . antigen odabran iz ceotidnr. sakvenrc 1. i ii. citirano mtjtel*-- -"osobno da prepoznanepromenln i viregion pomenutih anti-hspGO antitela koia se detektuju.

Ourema za di iaqnozi ran je<p>risustva IDDM testiraniem na p isutvo T ćelije koja imunornagnje sa hsp60 obuhvata:

i. antigen odabran Iz peDtidne sekvenceJ.

ii. podesnu srediru za kulturu limfocita (T ćelije), i

iii. obeležen nukleotid za T ćelijski proliferacioni test ili citokin. npr . TFN-aam*. tt.-7.tt.-*.. tt.-6,il-10 , THPalfa ili TGFbeta opremu zacitokin r*»st.

Sa test in vivo, oprema će da ouhvati samo neptiđ sekvence T"p'Tdesnom obliku za injrsktiranje.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ■sreripr.'fn za sprečavanie iii tretiranje tddm, Vakcinacija sa antigenskim peptidom sekvence I predmetnog pronalaska može da obezbedi specifičnu regulaciju auto-imunitetu prema antigenu i efektivno stvori rezistenciju<p>rema autoinunom procesu IDDM. Isto važi i za vakcinaciju sa T ćelijama specifičnim prema takvim antigenima u razblaženom ili razređjcnom obliku ili posle tretiranja radi poboljšanja antigeničnosti ili fracjmenti.ma ili njihovim aktivnim frakcijama. Ako je pokazano da je pacijent veđ bio u pre-kliničkom početnom stađiiumu IDDM, injektiranje sa takvim ar.ticenom ili T delijom (ili frakcijom) može da obezbed i regulisanie autcimuniteta za ovaj antigen i tako zaustavi antoimuni proces pre neao ovajizazove znatanaoštećenia. Peptid takodje može bit korlšđen kao terapeutsko sredstvo da zaustavi »utoimnni nrones ''ak lak« je ovai d?»leko odmakao kao što su nedavno pokazali pronalazači ovo« prona"i?sVaC2obziroai na tretiranje NOD miševa sa pe^tidoi:.

d-277 (Elias i Cohen, 1994) .

Stooa, oredmerni<p>ronalazak daj#» preparat za tretiranje ili sprfičavanie insulin-zavisnog diabeta melitus (IDDM) koji obuhvara T ^el'jsVi proizvod odabran iz grupe koju čine : a) humane T delije koj«> pokazuju specifičnost za p277 sekvencu humanog hsp60. koie su aktivirane inkubiranjem u prisustvu pomenute peptidne sekvence I. b) pomenute humane T delije a) koje su ozračene i Hruoačije razblažene, c) pomenute- humane ćelijo 7 a) koje su bile podvronute te tiraniju pritiskom pomoću hiđrostatiike prese, tretiranju sa n^miiskim umre-žavaj ud im sredstvom i/ili tretiranju se uitoskeletr.ini umrežavaiućim sredstvom, S. fragmenti ili površinski<p>roteini iz T či^iia a) ,b) C) ili e) peptid sastavljen uglavnom od promenlj.i voq regiona receptora a) specifičnog za pomenuti protein ili niegova so, funkcionalni derivat, orekursor ili aktivna frakcija.

U poželjno]realizaciji pronalaska,<p>re<p>arat obuhvata autologn<p>humane T đeliie dobivene iz IDDM pacijenta koji se tretira koje su aktivirane in vitro kontaktiraniem sa pomenutim p<p>ptidom sekvence t. Takve specifične i aktivirane T feliic cc t3.da daju istom pacijentu

od koqa su originalno i dobivene.

Predmetni<p>ronalazak takodje obezbediuje farmaceutski preparat za sprečavanje ili tretiranje IDDM koji obuhvata farmaceutski<p>rihvatljiv nosač i kao aktivni orincio, efikasnu količinu peptida sekvence I, njeaovu so ili funkcionalni derivat. Farmaceutski prihvatljiv nosač

ie poželjno uliani nosač takav kao emulzija mineralnog ulja<p>oznat

kaoi:Oi:r:uriFreund-ov dodatak (IFA) . Medjutim, IFA kao potpun Fr^uiid-on.* dodatak (CFA<p>reparatmineralnog ulja koji sađrSLra2nekoličineubijenih mikrooraanizamaMicobaoterija) nije dozvoljenzahumanu upotrebu cošto mineralno ulje nije roetabolizibiIno i r.e i'.ožv.- se razgraditi u organzmu.

Ovi pronalazači su našli da izvesne masne emulzije, koje su mnoqo godina korišđene za intravenoznu ishranuhumanihoacij.enata, takodje mogu da deluju kao nosači za peptidnu terapiju koja koristi peptide oreiimetnoa pronalaska. Dva orimeratakvihemulzija su komerciialno dostupne: Intralinid iLinof»ndin. "Intralipid"je registrovar.

nazivKabi Pharmacia(Švedska) za masnuemulziju za intravenoznuishranu, ooisaii je u US patentu br. 3 169094 ."l.ipof undin'" je registrovan naziv B.Braun Melsugen (Nemačka) . Oba sadrže soj ino nlj<p>kao masnomu P00 ili 200nu lOOOml destilovane vode: 10- ili 20%, respektivno) . Fosfolioiđi žuinanca se koristekaoemulqatori u Intralipidu (12 a/ l destilovane vođe} i lecitin žum^nca u lipofundinu (12 g/l destilo'ie vode). Izotoničnost nastaje kao rezultat dodavanja alicerola (25 a/l u obe emulzije.

Prona]a-.?:»kce dalje odnosi na postupak sprečavanja ili tretiranja IDDM koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno farmaceutsko«: preparata koji obuhvata peptid sekvence I ili pret»xai-a koji obuhvata T ćelijeK'.-je imaju razvijenu specifičnost<p>rema p.-.Tiemitom ppptiriu sek"en<~e I nronalsska .

Si .1 ie grafik koji ookazuie stabilnost o277 i p277 (Val^-Val11) . Zatvoreni kružići prikazuju rezultate za p27 7 a otvoreni kružići rezulatte za p277 (Val6-Val11) . Veliki kružići predstavljaju rezultate posle 1 sedmice magacioniranja, kružići srednje veličine posle 9 sedmica i naimanji kružići posle20sedmica magacionirania.

31.2 pokazuje rl« KOD T ćelijediabetogenogkiona c<y>proiiteriraiu

6 11

u odgovoru na peptide p277(zatvorenikružići) i p277 (Val -Val )

(otvoreni kružići).

51.3<p>okazuje da NOD slezinske T ćeliie proliferiraju u prisustvu pe<p>tida p277 (Lys 19). Slezine 5 ženki NOD miševa su testirane u svakoj «ru"i zn T ćeliiskuproliferacii uu odgovoru na<p>eptide p277(Lys 19) (zatvoreni kružići).p277(otvoreni kružići) i kontrolni

kao ne-ootvan Freunđ-ov dodatak (3FA) . Medjutim, IFA kao potpun

Freund-ov dodatak iCFA preparat mineralnog ulja koji sadrži razne

količine ubijenih niikrooraanizama Micobacterija) niie dozvoljen za

humanu upotreba<p>ošto mineralno ulje nije metabolizibilno i ne može se

razgraditi u organzir.u-

Cvi pronalazači su našli da izvesne masne emulzije, koje su mnogo

godina korišđene za intravenoznu ishranu humanih<p>acijenata, takodje

mogu da deluju kao nosači za peptidnu terapiju koja koristi peptide

oredmetnoa pronalaska. Dva<p>rinera takvih emulzija su komercijalno

dostupne: IntraliniđiLinofunđin. "Intralipid" je registrovan

naziv Kabi Pharmacia (švedska} za masnu emulziju za intravenoznu

ishranu, opisan je u US patentu br. 3 169 094. "Lipofundin" je registrovan naziv B.Braun Helsugen (Nemačka). Oba sadrže sojino ulje kan

masnomu (i00 ^li 200 a u lOOOml destilovane vode: 10- ili 20%, respektivno) . Fosfolioiđi žu<p>anea se koriste kao emulqatori u Intralipiđu

(12 q/l destilovane vode) i lecitin žumanca u lipofundinu (12 g/l

destilc ne vode). 3sotoničnosfc nastaje kao rezultat dodavanja

alicerola (25 a/l u obe emulzije.

Pronala-zaksedalje odnosi na postupak sprečavanjaili.tretiranja

IDDM koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno farmaceutskog

preparata koji obuhvata peptid sekvence I ili prep«.ra?a koji obuhvata

T delije kuje imaju razvijenu specifičnost<p>rema pomenutom peptidu

sek«en<~e I pronalaska .

51.1 ie graflk koji ookazuie stabilnost o277ip277 (Val6-Vali:i) .

Zatvoreni kružići prikazuju rezultate za p277 a otvoreni kružići

rezulatte za p277(Val 6 -Val 3 1). Veliki kružići predstavljaju rezultate

posle 1 sedmice magacioniranja, kružići srednje veličine posle 9

sedmica i najmanji kružići posle 20 sedmica magacionirania.

51.2pokazujunaNODTćelije diabetogenog kiona C<y>proiiteriraiu

6 11

u odgovoru na pe<p>tide p277 (zatvoreni kružići) i p277 (Val -Val )

(otvoreni kružići).

51.3<p>okazuje da KOD slezinske T ćeliie proliferiraju u prisustvu

peDtiđa p277 (Lys 19). Slezine 5 ženki NOD miševa su testirane u

svakoj r-rimiz*T ćeli isku proliferaciiu u odgovoru na osptide

p277(Lys 19;(zatvoreni krnžiči). p277 (otvoreni kružići) i kontrolni

p<?p~io u2'?fe (zatvoreni, kvaciratici) .

SI. 4 cokazj-ii? ci:i NOĐ T eeline điabetoaenog klona C9 Dro! i .'.erira ju u odgovoruri;peptid o277 Uz/d' i 9) .

SI.bji? ara-'ik koji pokazuje efikasnost predtretiranja sa p277 (V)

u IFA u prevenciji STZ-izazvario« diiabeta uporednenju sa kontrolnim tredtretiranjeni ili tretiranjem sa GADd34.

Kad god se<y>pronalsku pomene "peptid sekvence I", podrazumevaiu se takodne niegove soli i fnnkrionalni derivati sve održavaju biološku aktivnost sa obzirom na điabete.

"Soli"postidi T kakv. s:, sođrazurneva unronalsku sufiziološkiDrihvat.ljive organske i neorganske soli.

"Funkcionalni derivati" peotiđa I kako je koriSćeno ovde pokrivaju derivate koji se mogu dobiti iz funkcionalnih grupa koje se navijanu kao bočni lanci na ostacima ili N- ili C-terminalnim grupama na "oznat način i uključeni su u pronalazak toliko d"go koliko ostaju farmaceutski prihvatljivi, tj. ne razaraju aktivnost peptida što se tiće njihov« sličnosti sa<p>oznatom aktlvno<s>č"p.?"7"7.:^ daju toksične osobinu, preparatu koji ih sadrži i ne utiču negativno na njegove a'ntig<p>nskr osobine. Takvi "funkcionalni derivati" nisu anmenieni za takve promem k-jc prevode jodne amoni kisleine u drucre.

Saglasno qornni.n> definicijama, ovi derivati mogu, na prirner, aa uključe alifatične sstre karboksilnih grupa, amide karboksilnih arui->a dobivene reakcijom sa amonijakom ili primarnim ili sekundarnim amini-ma. N-acil derivate slobodnih amino grupe amino kiselinskih ostataka nacradjene reakcijom sa acil sredstvima (npr. alkanoil ili karboci-klične aroil grupe) ili O-acil derivate slobodne hidroksilne grupe, (n<p>r. one seril ili treonil ostataka) nagrednenih reakcijom sa

uCI jL 3G-3 i.'. \ "iFTicl #

Peptidna sekvenca I pronalaska se može koristiti kao imunog<p>n u farmaceutskim, preparatima. naročito vakcinama za ublaživanje i tretiranje IDDM,kao antigen u dijaonostičkim preparatima za dijaanozi. IDDM. Ovi farmaceutski i dijaonostifiki preparati koji se mogu dobiti na<p>oznat način takodje čine deo predmetnog pronalaska.

Kada sakoristi za tera<p>eutsko tretiranje ili kao profilaktična vakcina

peotid predmetnog pronalaska se podesno daje sa biološki aktivnim

nosačem kojidomaže TH1-->TH2 oomerai autoimunihTćeliia. T delije

CD4 pomoćnog tipa su klasifikovane u đve grupe prema citokinima koie

lučo kada sa aktivirane (Mosmann i Coffman. 1989}: TK1 delije luče

II.-2iIFH-gama dok TH2 delije luč« IL-4 i TL-10. Takav nosaf: je

<p>oželjno masna emulzija koja obuhvata 10-20% triolicerida bilinoa

i/ili animalnog porekla, 1,2-2,4% fosfolipida biljnog i/ili animalnog

porekla. 2,25-4,5% osmo-regulatora, 0-0,5% antioksidansa i sterilne

vode do 100%. Takav liDid ie najpoželjnije Intralipid ili Lipofundin.

Korišđenje nosača je opisano u Izraelskoj<p>atentnoj prijavi (identi-

fikovanoj od strane prijvioca pod br. 9523) od istoa datama Izraelske

prijave predmetnog<p>ronalska Jid^ntifkova«og e<3 sirane'prijavioca

pod br. S451A) od istog prijavioca kaoipredmetna nriiava. čiji ie

ceo sadržaj ubačen ovde referencom.

TerapeutsVi preparat prema<p>redmetnom pronalsku može biti dat oralne

ili parenteralno, t--':o pađkožno, intramuskularnc. intravenozno,

intranazalno ili intrarektalno.

Ovde dati primei.j daiu efikasnost terapftutskoa tretiraniasaj>vJlii-. ■ >.—

njimaioreparatlma predmetnog<p>ronalaska u naučno prihvatljivim

animalnim ili humanim IDDM modelima.

Primeri

Materiiali i postupci

i. Miševi Rodjene ženke miševa NOD/Lt vrste su dobiveni

iz Animal Breeding Center of th<=- Weizmann Institute of Science. Rehovort

Isreal. Ovi miševi su spontano razvijali autoirauni diabet 14-17

sedmica posle rodjenja koji je sličan onom kod ljudi.

ii .P epti diPeptidi su sint*»tiRani periodu standardne Fmoc

hernije koristeći ABIMET sintizer (FRG) 1<p>rečišćeni su na HPLC<p>ovratno

faznom hromatoarafijom. Sekvence su potvrđjene analizom amino

kiselina. Sintetisani su sleđeći peptidi: p277 peptid, kontrolni

<p>eptid o278 sekvence: Asn-Glu-Asp-Gln-Lvs-Ile-Glv-n e-Glu-Il^-I l e-T.ys-Ara-Thr-Leu-Lys-Ile (SEQ ID NO: 10) , koja gdgovara položajima

458-474 humanog hsp60 molekula, fragmenti p277, amino polovina p277

(p2 7 7.W.>, kiiL-hofcsi dao p277 (p277.C) i p277C sjedinjen sa p.'d".'8 fp27V «C-pJ7B) , pepttd p277 (Lys* ) i peptid p277 sa raznim amino kise-li ns kim supstitucijama za dva cisteinska ostatka u sekvenci kao što sledi: p277 sa preroožtavajuđim -SH grupama (p277 (pre-inošten Cys-Cys)), 6 J 1 a277 sa oba cisteinska ostatka zamenjena sa valinoin (p277 vVaJ -Val ) ) 8<l>1

ili serinom (?277(Ser -Ser )).

iii. Tretiranje Miševi su tretirani sa emulzijama p277, drugih peptida ili goveđjeg serumskog albumina (BSA dobivenog od Sigma,St.louis, MO, OSA) u zapreminama 0,lml injektiranim podkožno u zadnjicu. Antigeni su razblaženi u PRS i<p>mulgovani u istoj zapremini mineralnog ulja 'nepotpun Freund-ov dodatak (IFA) : Sigina; ili lCi Ir.tralipidu . Miševi su testirani na nivo krvne glukoze u 10 časova

u stanju bez dijete kao što je opisano (Elias et al-, 1991) pri starosti od 7,12,15 ili 17 seditica i 40 za one-koji su preživeli. Značajna hipoklikemija je smatrana onom pri koncentraciji 11,1 mg/ml ili iznad ovu vrednosti pošto je ova koncentracija trostruko viša od prosečne koncentracije glukoze u krvi merene kod 100 zdravih miševa (nije prikazano) . Histološko ispitivanje pankreasa je izvršeno na sekcijama obojenim sa hen..atoksilincm i cekinom. Sekcije su ispitivane dvapv. r. c.nezavisno nepoznajući idontite grupa. Ći. kvadratni test je korišćen radi odredjivanja statistički"razlika izmedju raznih tretiranja.

iv. Ispitivanje T- ćelojnke proliferaclje ćelijeK'lona C9

i suspenzije ćelija slezine dobivene iz ženki NOD miševa su ispitivane na T-ćelijsku proliferaciju kao što je opisano prethodno (Elias et al., 1591). Ukratko, 1 x IO5 klon ćelija/ml ili 1 x 40<6>splentocita/ml su inkubirani u po 4 probe 72 čaca u 0,2ml sredini kultrure u mi krotiter oknima u prisustvu ili odsustvu raznih antigena pri koncentraciji 5^ug/ml. Priliferacija je merena ugradjivanjem / 3H/-timidina u DNA tokom krajnjih 12 časova inkubacije. Rezultati su računati kao stimulacioni indeks: odnos<p>rosećnih cpm u prisustvu antigena prema prosečnim cpm u od<s>ustvu an<tig>ena (referentna vrednost) . Standardne devijacij<e>izmedju proba su uvek bile ispod 10% prosečne vrednosti.Refernetna vrednost je bila manja od lOOOoptc u eksperimentima sa splentocitom i ispod 200 cpm sa C9 ćelijama. Slezina svakog miša je testirana posebno. Rezultati za svaku grupu miševa su prikazani kao prosečna vrednost _+SD.

Primas:<*>

Tretiranje NOD miševa sa p277 ili njegovim fragmentima Rad?, testiranja da ii su obe ili jedna od dve 12-amino kiselihske polovine p277 peptida, same ili u kombinaciji, efikasne u NOD miševima kao što je p27 7, ženke NOD miševa su tretirane pri starosti od 7 sedmica podkožnom inokulacijom 50^ug raznih peptida u ulju. Satus miševa je odredjivan pri starosti od 40 sedmica.

Eezulati su prikazani u Tabeli 1. može se videti da kontrolni hsp60 peptid p278 nema efekta razvijanje obolenja: od 40 tretiranih miševa, svi su bili điabeticni i 90% je uginulo do 40 sedmica starosti. Na suprot ovome, p277 peptid je potpuno sprečio smrt i izleceno je 60% od 20 tretiranih miševa. Fragmenti p277 su bili manje efikasni: amino polovina p277 (p277.N), karboksi polovina p277 (p277.C) i smeša (p277.N i p277.C) su imali efekat upola lošiji nego p277. Peptid p227.C je sintetisan i vezan na peptid p278 radi dobivanja dužeg peptida; medjutiTn, p277 .C-p278 nije bio bolji od p277 X samog. Stoga, može se zaključiti da potpun terapeutski efekat azhteva nedirnut p277 peptid.

p manje 0,01 uporedjenju sa grupom tretiranom sa kontrolnim peptidom p 278 .

Trs? t. i an ie NCD ir.i3t?va sa p277 snpstituclonim pei)tiđia--a

Sledi?e"L peptidsutestirani na NOD miševima:

p277, p2"?7(prsmošten Cys-Cys), p277 (Val6-Val1 1)ip277 {£er6 -Ser1 X1 .

NOD ženke su tretirane sa luO^ug peptida u 0,2 cm<3>emulzije mineralnog uljii (I^A) datog pođkožno. Miševi su tretirani pri starosti od 12 sedmica i pojava diabeta je ispitivana pri starosti od 30 sedmica.

Kao što je pokazano u tabeli 2, p277(Val^-Val11) je bio efikasan

kao p277ii tretiranju đlaneta, pojava diabeta kod nctretiranih miševa je bilo 80* dok p277 i pZ77 (Val6-Val1tretirani miševi su poaksali pojavu diabeta di 22% i 23% respektivno. Sa druge strane p277 (premo-šten Cys-Cys) i p277(Ser^-Ser1 1) peptid nisu imali terapeutski efekat. Dve dodatne varijante p277 peptida u kojima su clsteinski ostaci u položajima 6 i 11 zamenjeni alaninom ili ostacima ua-ra-aminobuterne kisleine nisu takod-o. bile efikasne in vitro testovima na klonskim C9 ćelijama i NOD splenskim T-đelijama . Kako ova dva peptida nisu bila prepoznatljiva pomoću anti-p277 specifičnih T ćelijo fnije prikaeano) r.isu dalje ni testirani in vivo na terapeutski «f ekat.

pri.i"&! 3

Stabilnost?27?(Vai<6->Val<l1>)

Xako je rozloaz&2 antenu ciste ina problematična stabilnost p27.7 peptida. stabilnost p277(Val 6 -Val 11) je testirana na više vremenskih tačaka posle njegove sinteze. p277 peptid je nestabilan i raspada se čak pod pravilno održavanim"slovima (liofiliziran prah u vakumu na -20°C) .

U cilju uporedjivanja stabilnosti p277 sa njegovim p277 (Val^-Val11) analogom, oba peptida su sintetisna u isto vreme i magacionirana kao suvi prah na -20 C. Na lr9 i 20 sedmica posle sinteze, alikvot je odmaravan, rastvaran i testiran, način,procene stabilnosti za peptid bila je njegova sposobnost stimulacije T ćelije klona C9. SI. I pokazuje rezultate eksperimenta. Može se videti da, dok je prirodni p?.77 peptid izgubio najveći deo svoje efikasnosti posle 9 sedmica i svu posle 20 sedmica cd sinteze, p277(Val^-Val11) bio je nepromenjen posle 20 sedmica magacioniranja.

Kao se veruje da je nestabilnost p277 izazvana cisteinskim ostacima, očekivalo s*- da će aivjlozi predmetnog pronaiska koji zadržavaju biološku aktivnost p277 icati poboljšanu stabilnost u odnosu na p277 na sličan način kao što je pokazano za p277(Val<**->val<13>).

Primer 4

Tretiranje NOD ženki miševa sa p277 ili p277(Val<6->Val<11>) reversni

insuliti&

NOD ženke miševa su tretirane pri starosti od 12 sedmica sa lOC^ug/mišu

nemodifikovanog p277 ili p277 (Val^-Val11) u 0,lcm^ emulziji mineralnog

ulja (nepotpun Freun-ov dodatak), pođkožno. Kontroni miševi su dobili

emulziju PBS i mineralnog ulja. Pri starosti od 6 meseci, po 6 miševa

iz svake grupe je usmrćeno, uklonjeni su im pankreasi1fiksirani i

sekcije su obojene pomoću hem9toksilinreozina. Insuliti su zbrajani.

Kako se kod kontrolnih miešva razvio ozbiljni diabet, ovi su usmrćeni

pri starosti od 5 meseci. Tada nivo glukozi u krvi im jo bio u oblasti29-28 mmol/Lit . Rezultati su dati u Tabeli 3.

Pristarosti od12 sedmica,vreme tretiranja, oko 60% isletakodnetretiranih miševajepokazao intra-islet insulitis,oko 20% isleta

je imalo peri-islet insulitis,ioko 20% isleta nije pokazalo

insulitis. Intra-islet infiltracija je smatrana ozbiljnimoblikominsulitisa vezana sa izostankom beta-ćelijskefunkcije. KaoštojepokazanouTabeli3,znatnajedivergencija u pojavi isletarazvi-jenih kod dve tretiranegrupeuporedjenjus kontrolnom grupommiševa tretiranihsamouljem. Miševi tretiranisa uljem (kontrolni)pokazivali suprogresivni padu proporciji nepromenjenihisleta isamo 10% normalnih isleta se mogu videti pri starostiod22sadnice, vremekadasu svi miševi bili očito diabetični. Oko6 71isleta jopokazivalo intra-islet insulitis na 22 sedniceapreostalih23%isleta je pokazalo peri-islet insulitis. Na suprotovome, miševitretirani sa p277 (Val**-Val**) su pokazali porastubrojunormalnihisleta (izmedju 25i52%)ipadubroju isleta saintra-isletinsulitisom (izmedju6i 17%). Isleti sa peri-isletom sudostigli31-69%. Tako p277ip277 (Va^-Val11) tretiranjasupovezana sa poboljšanom histološkom slikom konsistentnom sa povratnimstepenom insulitisa koji supostojali3meseca posletretiranja.

Đpdatntreznlfcfti koristećip277(v) kodženkiNnn mj ševaIzvršenoje 15dodatnih eksperimenatau kojima su grupe od po 10

<žen>ki NODmiševa tretirane sa p277 (V) u ulju ili samo sa uljem pri starosti od12-15 sedmica.Od ukupno 150 miševa tretiranih samo sa uljem, 90% je razvilo diabet i85%je uginulo do starosti o<5

32 sedmice. Suprotno- miševi tretirani sa p277 (v) supoka?.alipojavu diabet«samou50% (p manje od 0,01) i samo 20% je uginulo ozbiljno

obolelelih (p manje 6d 0,01).Stoga, tretman sa p277(v) je bio

efikasan u zaustavljanju razvoja smrtonosnog diabeta.

Primer 5

6 11

Peptiđna terapija diabeta tipa I koristeći p277 (Val -Val ) u

lipidnoj emulziji

Autoimuno razaranje beta-ćelija koje proizvode insulln u pankreasu

je promenjeno pomoću T-limfočita. Inflamatorni infiltrat še razvija

oko pankreatičnih isleta 5-8 sedmica starosti i razaranje beta-

ćelije koje dovodi do nedostatattca insullna i razvoja diabeta je

počelo da se manifestuje na 14-20 sedmica starosti na skoro 100%

ženki NOD miševa starosti 35-40 sedmica.

6 11

NOD ženke miševa su tretirar.e sa 100^ug peptida p277 (Val -Val )

po mišu pođkožno u 0,lml PBS ili 10% lipidnoj emulziji sastavlejnoj

od 10% sojinog ulja, 1,2% fosfolipida žumancai2,25% glicerola

(Intralipid, Kabl Pharmacia AB, švedska).

Praćeni su pojava diabeta na 6 meseci starosti i proizvod-ja ..ir.H.-

p277 (Val^-Val1, S antitela. Diabet i su dijagnozirani kao persistentna

hiperglikemija, nivo glukoze u krvi iznad ll,lmmol/iit meren bar

2 sedmično sa Bevkaian Glukose Analvzer II. Uspešni. peptiđn treunan

je ispitivan održavanjem normalne koncentracije glukoze u krvi (ispod

11,1 mmol/lit), remisijom intra-islet inflamatacije pankreatičnog

isleta (insullitis) i indukcijom antitela u terapeutski peptid

kao indikator TH2-imunog odgovora. Rezulatati su prikazani u Tabeli 4.

Kdo a'..o ??vicli. iz. tabele4ttretiranje sa peptidom predmetnogpronaiAsJeft .-.latim u intr^ilipidu je efikasno u smanjenju pojave diabeta i smrtnosti, Sa druge strune ,tretiranje sa peptidom pronalaska u PBS ja neifikasno.

Priroer 6

Peptidi p277 i p277(Val^-Val11) su imunološki medjureaktivni

Ćelije T-ćeli jakog klona C9 su izolovane iz pređiabetičnog NCD miša i inkubirane sa peptidima p277(zatvoreni kružići), p277(Val^-Val<11>)

(otvoreni kružići), p277 (Ser6-Ser11) zatvoreni kvadratići i p277 (premošten Cys-Cys) (otvoreni rombovi). Rezultati su prikazani ne si.2. Kion CS je nadjen da pokazuje pozitivni proliferacioni odgovor samo prema peptidima p277 i p277 (Val^-Val11) . Ovo pctvrdjuje da p277 i p277 (Va^-Val<11>) su medjureaktivni i da peptidi p277(Ser<6->

Ser*1) i p277 (premošten Cys-Cys) koji nisu efikasni terapeutski

nisu imunološki med ju reaktivni.

Primer 7

Novo aijagonozirani IDDM oacijenti pokazuju T-ćelijske proiifera-

6 1L

tivne odgovore prema p277 i p277(Val -Val )

Novo di jag: i rani (2-4 sedmice) IDDM pacijenti su testirani u ispitivanju proliferacije, Periferni krvni limfociti su izolovani

iz čitave heparinizirane krvi n aficol-hipaku i testirani in vitro

na proliferaciju merenu kao "*H_timidin ugradjivanje izazavano

pomoću hsp60 peptida p277, p277 (Val^-Val11)ikontrolnog peptida

p278.Proliferativni odgovor T ćelije je posmatran kao stimulacioni indeks (SI): odnos izmedju ugradjivanja timitiidina izazavano peptidom i ugrađivanje timitidina bez peptida pomoću T ćelija.

Kao Ste je pokazanov.Tabeli5, novo dijagnozirani IDDM pacijentiodgovaraju nap277 (Val -val*1) kaoina p277peptid.Stoga, p277(Val°-Val* ) jo imunološkiekvivalentan sa p277. Kako je terapeutski efekatp277 umanjen pomođuimunološkog prepoznavanja. Činjenica da

p277(Val -Val ") je imunološki medju-reaktivan sa p277 pokazuje da

ovaja-oSebiti korišđen umesto p277 u tretiranju diabeta.

Primer 8

T-čelijski odgovori prema hsp60 i peptidu u IDDM i zdravim individuama

21 IDDM pacijenata 1 14 zdravih krvnih-donora je testirano na anti

hspfiOip277(v) pomodu proliferacionog ispitivanja primera 7. Tabele

6i 7pokazuju proliferativniT-delijskl odgovor (stimulacioni indeks,SI)

svake individue prema kontrolnom antigenu (kontrolni Ag) , t j . tetanus

toksoid i influenca virus-Teksas vrsta, prema rekoinbinantnomhspoO

i p277(v). Si vrednosti3 iiznad su smtrane pozitivnim.

Tabela 8 je zbirna tabela koja pokazuje da 86% i 52% pacijenata

odgovara na hsp60ip277(v) uporedjenjusa?IiiJ4% na kontrolu

(p je manje od 0,05) . Tako IDDM grupa je bila znatno<p>ozitivna za

T-delijske odgovor« na hsp60ip277(v). Ovo dovodi do zaključka da

jepojava hsp60 i p277 (v) reaktivnih individua veća medju IDDM

pacijentima nego medju zdravim ljudima.

Primer 9

19

NOD T-ćelijska proliferacija prema n277 (Lys )

2:

p27? {Lyspectiđ se razlikuje od p277 za jedno amino kiselinu.

Ucilju potvrđjivanja da p277 (Lys 19) je autoantigen u NODIDDM,

uporedili smo T-đelijsku prolLferaciju prema peptiđu p277 i peptidu p277 (Lys i 9). SI.3 pokazuje da T-đelije slezine ženke NOD proliferiraju prema p277(Lys 19) peptidu u istoj meri kao prema p277. Nije

bilo odgovora prema kontrolnom peptiđu p278.

Gornji rezultati su potvrdjeni korišćenjem clona C9, diabetogenog

NODT-đelijskog klona koji je nadjeno da odgovara na humani peptid

p277 (Elias et al., 1991) . C9 ćelije nadjeno je da proliferiraju

prema p277 fLys 19) peptidu u istoj meri kao prema p277 peptidu (si.4) .

Primer 10

19

Tretiranje NOD ženki miševa sa p277 (Lys )

Ovi pronalazači su prethodno pokarali da poodmakli insulitis prisutan

kod ženki NOD miševa3tarih 3 raeseca može biti zaustavljen tretiranjem miševa sa jednom injekcijom humanog p277i tretirani miševi su

razvili manju pojavu klinički pokazanih diabetaismrtnosti od ozbiljni

hiperglikemije. Radi testiranja da li je peptid p277 (l,ys 19), ko^i

je i sam mišji p277 psptid, takodje efikasan, tretirali smo ženka NOD miša sa lOO^ug bilo humanog p277 ili p277(Lys 19) peptida u IFA.

Peptidi p27- ili p277 (Lys 19) pri koncentraciji 2 mg/rt:i u fosfatno

puferisanom slanom rastvoru (PBS) su emulgovani sa istom zapreminom

nepotpunog Freund-ovog dodatka (IFA). Grupe od po 10 ženki NOD miševa

starih 3 meseca su injektirane pođkožno sa 0,lml (100^ug peptida)

emulzije koja sadrži peptid. Kontrolni miševi su injektirani sa

emulzijom PBS i IFA. Miševima je uzimana krv svake 4 sedmice i nivpi

glukoze u krvi su odredjivani pomoću Beckmann Glukose Analyzer II.

Pojava hiperglikemije i smrti od diabeta su odredjeni pri starosti

cd 6 meseci. Miševi su smatrani diabetiČnim ako im je3adržaj glukoze

u krvi bio veći od 11 mmol/lit.

Rezultati su prikazani u Tabeli 9. Pri starosti od6meseci, 90%

kontrolnih miševa šu bili očigledno hiperglikemični i 60% je uginulo od diabeta. Nasuprot ovome, tretiranje sa p277 ili p277(Lys 19) sprečilo je pojavu diabeta (40 i 50%) i smrtnosti (10 i 20%) ,respektivn< Tako, mišji peptid p277(Lys 19) izgleda da je efikasan kao i strani p277 peptid u terapiji poodmaklog insulitisa.

Ovirezultati pokazuju da proliferativni odgovori NODTćelijadetektovaniKoristeći humani hsp60 molekul i njegov p277 peptid

su ekvivalentni odgovoru na mišji hspbO i mišji p277(Lys 19} peptid.

Ovo je pokazano za diabetogeni C9 T ćelijski klon kao i zaspontan

odgovor koji se razvija u slezinama pređiabetičnih miševa. Med

19

p277(Lys ) je bio efikasan kao p277 u tretiranju diabetakod NOD

miševa. Slezinske T-celije starostiiodgovarajućeg pola drugih

vrsta nisu pokazale spontani T-ćelijski prolif erativniodgovorpremap277 (nijepokazano).

Nalaz autoimuniteta premamišjojhsp60 sekvenci meton1-diabenogenih

Tćelija, potvrdjuje opšti stav da IDDM je izazvan autoimunlm

procesom.

Primer11

Tretiranje STZ-indukovanoy diabeta sa p277(v)

streptozotocin(STZ)je beta-ćelijski specifični toksin koji može da

izazove toksične diabete razaranjem beta-ćelija tokom 24-48 časa

ako se injektira doza od 200mg/kg. Davan u balim subtoksičnim dozama

izaziva genetski propustljiv mišji insulitis koji dovodidodiabet.

Inflamatorni proces može da uzme 20r30 dana, zavisnooddoze STZ.

Regularni protokol za STZ-indukovan diabet je doza od 200mg STZ po

kgtelesne mase, datau5 jednakih doza od po 40 mg/kg uzastopno 5 dana (LikeandRossini, 1976)imodel je nazvannisko-dozni STZ.Našli smo da akoseukupna doza smanji na 150 mg/kg(30mg/kg x5)diabet se razvija za80-100dana.Ovaj sporo anpredujući oblik RTZ-inkukovanog diabetaverovatno bolje ličinaautoimuni diabet kod ljudi iistog je trajanja kao preklinički stadij um spontanogdiabeta kod

W>D miševa(Castane and Kisenbarth, 1990) - Međjutim, akutnitoksični<p>f<p.>kti s? smanjuju pri smanjenju doze.

60 kDa toplotni g0}< protein (hsp60) igra ulogu u NOD (Elias et al., 1990) i STZ-indukovanom (Elias et al.,1994) diabetu. Prethodno smo pokazali da antiteini i T-ćelijski proliferativni odgo-/or na hsp60 se javljaju pre početka očiglednog diabeta. T-ćelijski klonovi specifični prema hsp60 su izvedeni iz prediabetičnih NOD miševa

imogu podesivo da prenose insulitis i hiperglikemiju kođ mladih

NOD (Elias et al., 199.1)i li - Cf- if NODmiševa. NOD diabetogeni T-ćeli-jski klonovi prepoznaju 24 amino kiselinski peptid hsp60 sekvence

437-460 nazvan p277. STZ-indukovani diabet je takodje praćen anti-p277 T-ćelijskim odgovorima u prekliničkom stadij umu.

Prethodni primeri su pokazali da p277 (Val^-Val1 *) peptid štiti

NOD miševe. Predmetni eksperiment testira efikasnost p277(v) tretiranja u nisko đoznom STZ modelu.

Mužjaci miševa (po 10 grupi, su tretirani sa dozom STZ od 30 mg/kg dnevno tokom 5 dana. Sedmicu kasnije, miševi su tretirani sa

100 .ug p277(v) u olju ili peptidom dekarbofcsilaze giutaininsku kiseline (GADp34) koji je opisao Kaufman et al. ^993, kako je nadjen u diabetu NOD miševa ili samo uljem. Tre-1- ran je je ponovljeno 8S. dana. 100. dana, miševima je uzeta krv i testirana na hiper-glikemi ju (koncentracija glukoze iznad 15nmol/lit). Rezultati su dati u Tabeli 5 . Može se videti da je prosečna glukoza u krvi miševa tretiranih sa GADp34 ili netretiranih u oblasti hipergli-kemi je. Na suprot ovome, prosečna glukoza u krvi miševa tretiranih sa p277 (v) je. bila u normalnoj oblasti. Tako, p2 77 (v) možebiti efikasan u tretiranju diabeta indukovanog u miševima C57BI,/ksj pomoću STZ kao i spontanog diabeta razvijenog u genetički predoođre-djsnim žcrJcsmc. NOD miševa. Primenjivcst p277 (v) terapije nijc ograničena na diabete na one izazavane ili one genotipske .

Sve reference citirane ovde, uključujući članke iz žurnala ili abstrakte, objavjene ili odgovarajuće US ili strane patentne prijave, izdate US ili druge strane patente ili druge referece,

su ubačene ovde u celosti referencama uključujući sve podatke, tabele,slike i prikazan tekst u citiranim referencama. Dodatno,

cei oku pri i. ađdrid.ia referenci citiranih u referencama citiranim ovde su takodje ubačeni ovdereferencom.

Reffrncanapoznate stupnjevepostupka,uobičajene stupnjeve postupka poznata postupke ili uobičajenepostupkenije na bilo koji način priznanje da je neki aspekt, opis ili realizacija predmetnog pronaiska objavljena poznata ilisugeriranau odgovarajućoj tehnici.

Gornji opis specifičnihrealizacijađesasvim obelodanitiopštu prirodu pronalaska kojidalje možebitiprimenom znanjastručnjaka u ovoj oblastilako modifikovani/ilipodešenza razne primenetakvihspecifičnih realuzacija beznepodesneeksperiment<p>oijr.

bez udaljavanja oč opštegkonceptapredmetnog pronalaska. Stoga, takve adaptacije i modifikacije su uobimuekvivalencije opisanih realizacija. Razumljivoje dafrazeologija i terminologija ovde je data u svrhu opisa a ne ograničavanja, tako da treba da bude intrepretirana od stručnjaka u svtlu učenja i rukovodjenja datih ovde u kombinaciji sa znanjem stručnjaka.

Claims (17)

1. Peptid sekvence I: gde XiiX2svaki posebno su Cys ili Val ostatak, a X3je Thr ili Lys ostatak, ali X| i X2ne mogu oba biti Cys ostaci kada X3je Thr, kao i njihove soli i njihovi funkcionalni derivati.

2. Peptid prema zahtevu l, naznačen time što je izabran između peptida koji su ovde označeni kao p277 (Vah, gde Xije Val, X2 je Cys, a X3 je Thr; p277 (Val"), gde Xije Cys, X2 je Val, a X3je Thr; p277 (Val<6>- Val"), gde i X, i X2su Val, a X?je Thr; p277(Lys1<9>), gde i X, i X2 su Cys, a X3 je Lys; p277 (Val<6>- Lys<19>), gde X. je VaJ, X2 je Cys, a X3je Lvs: p277 (Val" - Lys,<q>), gde X| je Cys, X2je Val, a Xj je Lys; p277 (Val6-11- Lys<19>), gde i X, i X2su Val, a X, jc Lys.

3. Upotreba peptida iz zahteva 1 ili 2 za dobijanje preparata za dijagnostikovanje insuiin - zavisnog dijabetes melitusa (u daljem tekstu IZDM).

4. Postupak za dijagnostikovanje prisustva ili početka IZDM kod pacijenta, naznačen time Što obuhvata ispitivanje krvi ili urina navedenog pacijenta sa peptidom iz zahteva 1 ili 2 kao antigenom na prisustvo antitela ili T ćelija koje su imunološki reaktivne sa humanim hsp60, pri čemu rezultat koji ukazuje pozitivno prisustvo anti-hsp60 antitela ili T ćelija koje imunološki reaguju sa hsp60 ukazuje na veliku verovatnoću prisustva ili početka IZDM.

5.Postupakprema. zahvzvu. 4. naznačen time sto se prisustvo anil-hsp60 antitela ispituje radioJ.T7urio;eatom ili ELISA testom.

6. Kompletz*.dijagnostikovanje prisustva IZDM ispitivanjem prisustva anti-hspćO antitela, prema postupku iz zahteva 4 ili 5, a koji obuhvata: (i) antigen koji je peptid sekvence (l) iz zahteva l; i (ii) obeleženo antitelo koje je sposobno da prepozna ne-varijabilni region navedenih anti-hspoO antitela koje treba da se detektuju.

7. Postupak prema zahrevu 4, naznačen time što se prisustvo T ćelije koja imunološki reaguje sa hspćO ispituje testom proliferacije T ćelije, a koji obuhvata sledeće korake: (i) pripremanje Frakcije mononuklearnih ćelija koja sadrži T ćelije iz uzorka krvi koji je dobijen od navedenog pacijenta; (ii) dodavši]u navedenu frakciju mononuklearnih ćelija antigena koji je izabran od peptida iz zahteva i; (iii) inkubaciju navedene ćelijske frakcije u prisustvu navedenog antigena tokom odgovarajućeg vremenskog perioda i pod odgovarajućim uslovima kultivacije; (iv) dodavanje obeleženog nukleotida u inkubiranu ćelijsku kulturu iz (iii) u odgovarajućem trenutku pre okončanja navedenog perioda inkubacije, kako bi se obezbedila inkorporađja navedenog obeleženog nukleotida u DNK proliferišućih T ćelija; i (v) određivanje količine proliferišućih T ćelija analizom količine obeleženog nukleotida koji je inkorporiran u navedene T ćelije.

8. Potupak prema zahtevu -1, naznačen time što se prisustvo T ćelije koja je imunološki reaktivna sa hsp60 ispituje putem testa cilokinskog odgovora T ćelije, a koji sadrži siedećekorake: (i) dobij/inje frakcije mononuklearnih ćelija koja sadrži T ćelije iz uzorka krvi dobijeneg od navedenog pacijenta; (ii) dodavanje u navednu frakciju mononuklearnih ćelija antigena koji je izabran od peptida iz zahteva I; (iii) inkubiranje navedene ćelijske frakcije u prisustvu navedenog antigena tokom odgovarajućeg vremenskog perioda i u odgovarajućim usiovima kultivacije; i (iv) merenje prisustva citokina sekretovanih od odgovarajućih limfocita u medijum; pri čemu su citokini IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a ili TGF-p.

9. Komplci za dijagnostikovanje prisustva IZDM ispitivanjem prisustva T ćelije koja je imunološki reaktivna sa hsp60 prema postupku iz zahteva 7, a koji sadži: (i) antigen koji je pepiid iz zahteva I; (ii) obeležent nukleoiid; i (iii) odgovarajući medijum za kulturu limfocita.

10. Komplet za dijagnostikovanje prisustva IZDM ispitivanjem prisustva T ćelije koja je imunološki reaktivna sa hspćO prema postupku iz zahteva 8, a koji sadži: (i) antigen koji je peptid iz zahteva 1; (ii) odgovarajući medijum za kulturu limfocita; i (iii) komplet za testiranje za merenje prisustva citokina koji su sekretovani od odgovarajućih limfocita u medijum. i I.

Preparatza sprečavanje iii tretiranje IZDM koji sadrži proizvod T ćeiije izabran iz grupe x.oju č-ni: (a) liumane T ćelije koje pokazuju specifičnost za p277 sekvencu humanog hsp60, pri čemu su ćelije aktivirane inkubiranjem u prisustvu peptida sekvence I iz zahteva l; (b) navedene humane T ćelije iz (a) koje su ozračene ili na neki drugi način atenuirane; i (c) navedene T ćelije iz (a) koje su podvrgnute tretmanu sa pritiskom putem hidrostatskog pritiska, tretmanu sa sredstvom za hemijsko ukršienn vezivanje i/ili tretmanu sa sredstvom za citoskeletno ukršteno vezivanje.

12. Preparat prema zahtevu 11, naznačen time što navedene humane T ćelije iz (a) predstavljaju autologe T ćelije koje su dobijene od pacijenta sa IZDM koji se tretira, a navedena specifičnost navedenih T ćelija je razvijena putemin vitrokontakta sa navedenim peptidom sekvence I.

13. Preparat prema zahtevu 11 ili 12, naznačen time što navedene T ćelije posedujuin vitroravijenu specifičnost za peptid sekvence I iz zahteva 1.

14. Farmaceutski preparat koji sadrži peptid sekvence I iz zahteva 1 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

15. Farmaceutski preparat iz zahteva 14 za prevenciju ili tretman IZDM.

16. Farmaceutski preparat prema zahtevu 14 ili 15, naznačen time Što navedeni peptid je peptid iz zahteva 2.

17. Upotreba peptida iz zahteva 1 ili 2 za dobijanje farmaceutskog preparata za prevenciju ili tretman IZDM.