CZ340698A3 - Peptidy, farmaceutický prostředek a testovací sada s jejich obsahem a diagnostický postup, využívající tyto peptidy - Google Patents

Peptidy, farmaceutický prostředek a testovací sada s jejich obsahem a diagnostický postup, využívající tyto peptidy Download PDF

Info

Publication number
CZ340698A3
CZ340698A3 CZ983406A CZ340698A CZ340698A3 CZ 340698 A3 CZ340698 A3 CZ 340698A3 CZ 983406 A CZ983406 A CZ 983406A CZ 340698 A CZ340698 A CZ 340698A CZ 340698 A3 CZ340698 A3 CZ 340698A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
sequence
peptides
type
amino acid
Prior art date
Application number
CZ983406A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna Maria Helena Boots
Gijsbertus Franciscus Maria Verheijden
Original Assignee
Akzo Nobel N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nobel N. V. filed Critical Akzo Nobel N. V.
Publication of CZ340698A3 publication Critical patent/CZ340698A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

. Vynález se týká peptidů a jejich použití k léčbě chronického poškozování kloubní chrupavky při autoimunitních onemocněních, farmaceutických prostředků s obsahem takových peptidů, diagnostického postupu k detekci autoreaktivních T buněk v testovaném vzorku a testovacích sad pro použití při uvedeném postupu.
Dosavadní stav techniky
Imunitní systém je založen na principu rozlišení mezi cizími antigeny (nevlastními antigeny) a autoantigeny (vlastními antigeny, vyvinutými z jedinců tělu vlastních), jehož je dosaženo vytvořením tolerance (snášenlivosti) vůči autoantigenům.
Imunitní systém chrání jedince vůči cizím antigenům a na vystavení se cizímu antigenu odpovídá aktivováním specifických buněk, jako B a T lymfocytů, a vytvářenímrozpustných látek jako jsou interleukiny, protilátky a složky komplementu. Antigen, na nějž imunitní systém odpovídá, je degradován (znehodnocen) buňkami předkládajícími antigen (antigen presenting cells, APCs) a fragment antigenu je vystaven na buněčném povrchu, spojeném s glykoproteinem třídy II hlavního histokompatibilního komplexu (major histocompatibility complex; HHC). Komplex HHC-glykoproteinu a antigenniho fragmentu je předkládán T buňce, která pomocí receptoru této T buňky rozpozná antigenní fragment společně s ·*· ···· bílkovinou třídy II HHC, na níž je navázán. T buňka se stane aktivovanou, tj. proliferuje a/nebo vytváří interleukiny, což má za následek expansi aktivovaných lymfocytů, .zaměřených vůči útočícímu antigenu (Grey a spoluautoři, Sci. Am. 261, 38-46, 1989).
Vlastní antigeny jsou rovněž nepřetržitě zpracovávány a předkládány glykoproteiny HHC jako antigenní fragmenty T buňkám (Jardetsky se spoluautory, Nátuře 353, 326.-329, 1991). Rozpoznání sama sebe je tedy imunitnímu systému vlastní. Za normálních okolností je imunitní systém tolerantní vůči vlastním antigenům a aktivace imunitní odpovědi těmito vlastními antigeny neprobíhá.
Pokud se ztratí tolerance vůči vlastním antigenům, je imunitní systém aktivován vůči jednomu nebo ;více z vlastních antigenů, což má za následek aktivaci autoreaktivních T buněk a vytváření autoprotilátek. Tento jev je označován jako autoimunita. Vzhledem k tomu, že' imunitní odpověď je obecně destruktivní, což znamená, že ničí agresivní cizí antigen, může autoimunitní odpověď vyvolat ničení tkáně, která je tělu vlastní.
Příspěvek T buněk k áutoimunitním onemocněním byl prokázán několika studiemi. U myši je experimentální autoimunitní encefalomyelitida (EAE) zprostředkována velice omezenou skupinou T buněk, spojených specifičností vůči jedinému epitopu myelinové bazické bílkoviny (MBB), vytvářející komplex s molekulou třídy II HHC. U potkanů kmene Lewis, druhu s vysokou citlivostí vůči různým áutoimunitním onemocněním, bylo prokázáno, že onemocnění zprostředkovávají T-buňky.
• ·
- 3 • ··
V · ♦ · 9 • · « * · ··
Rovněž u lidských autoimunitních onemocněních se předpokládá, že jsou spojena s vývojem autoagresivních T buněk. Destruktivní autoimunitní odpověď je zapojena v různých onemocněních, jako je i revmatoidní arthritis (RA), u níž je celistvost kloubní chrupavky ničena chronickým zánětlivým procesem. Pro udržení mistni zánětiivé odpovědi se zdá být nezbytná pouhá přítomnost chrupavky. Bylo prokázáno, že při RA je znehodnocování chrupavky spojeno s aktivitou autoreaktivních T buněk, reagujících na chrupavku (Sigall se spoluautory, ' Clin. Exp. Rheumat. 6, 59, 1988; Glant se spoluautory, Biochem. Soc. Trans. 18, 796, 1990; Burmester se spol., Rheumatoid Arthritis, Smolen, Kalden, Maini (editoři), Springer-Verlag, Berlín - Heidelberg, 1992) . Nadto bylo prokázáno, že chirurgické odstranění chrupavky u pacientů s RA snížilo zánětlivý proces. Bílkoviny chrupavky jsou tedy považovány za cílové autoantigeny,,. schopné stimulace T buněk. Aktivace těchto autoreaktivních T buněk vede k .rozvoji autoimunitního onemocnění. Proto lze předpokládat, že funkční eliminace těchto T buněk by mohla být přínosná k regulaci, snižující destruktivní autoimunitní proces. Ovšem určení autoantigenních složek, hrajících roli v začátku revmatoidní arthritidy, zůstává stále nejasné.
Zánětlivá odpověď, mající za následek destrukci (zničení) chrupavky, může být léčena různými léky. Tyto léky jsou ovšem imunosupresivními léky, které jsou nespecifické a mají toxické vedlejší účinky. Nevýhody nespecifické imunosuprese činí tento postup vysoce nevýhodnou léčbou.
Antigenně specifická, netoxická imunosuprese, jaká je například popsána ve WO-A-9510301, poskytuje velmi atraktivní alternativu k nespecifické imunosupresi. Antigenně specifická • · léčba zahrnuje léčení pacientů syntetickými T buněčně reaktivními peptidy, které se podobají epitopům, přítomným na autoantigenu, nebo je imitují. Tyto peptidy mohou být tedy použity k indukování systémové imunologické tolerance tj. specifické T buněčné tolerance, jak vůči nim samotným, tak i
IndukOVana ojs lcillu vcí . j.iÍLÚiiOxuý±CKá tolerance je založena na. dlouhodobě pozorovaném jevu, že zvířata, která byla krmena antigenem či epitopem, nebo je inhalovala, jsou méně schopná vyvinout systémovou imunitní odpověď vůči' uvedenému antigenu či epitopu, pokud jsou uvedený antigen či epitop předkládány systematickou cestou. Pro účinné využití terapie peptidem indukované systémové tolerance k léčení T buněčně zprostředkované destrukce chrupavky existuje velká potřeba peptidů vyvolávajících reakci T buněk, které mohou desenzitizovat pacienty (snížit jejich vnímavost) vůči vlastnímu antigenu aktivujícímu . T buňky, odpovědné za zánětlivý proces.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnutí peptidů, které jsou schopné indukovat systémovou imunologickou toleranci, konkrétněji pak specifickou T buněčnou toleranci, vůči odpovídajícímu chrupavkovému antigenu u pacientů, trpících T buněčně zprostředkovaným poškozováním (destrukcí) chrupavky. Dalším předmětem vynálezu je poskytnuti postupu k detegování autoreaktivních T buněk, zapojených v destrukci kloubní chrupavky, a testovací sady pro použití v takovém postupu.
Předkládaný vynález poskytuje takové peptidy. Prvním aspektem vynálezu je zde poskytnutí peptidů, sestávající z 16 až 55 aminokyselinových zbytků, přičemž uvedený peptid ·· • · 4 * «
4 4 4 *
- 5 , · 4 · ♦ · , · 444 4 « , · 4 4, »••*«4 ·· ·· zahrnuje alespoň jednu z aminokyselinových sekvencí LVCYYTSWS (sekvence s identifikačním číslem 60), FLCTHIIYS (sekvence s id. č. 61), IIYSFANIS (sekvence s id. č. 62), LKTLLSVGG (sekvence s id. č. 63), FIKSVPPFL (sekvence s id. č. 64), FDGLDLAWL (sekvence s id. č. 65), LYPGRRDKQ (sekvence s id.
66), YDIAKISQH (sekvence s id, £Ί\ _ T.nPTQTMTY ,1 SíVTOnrp s id. č. 68), FISIMTYDF (sekvence . s id. .č. . 69)FRGQEDASP (sekvence s id. č. 70), YAVGYMLRL (sekvence s id. Č. 71), MLRLGAPAS (sekvence s id. č. 72), LAYYEICDF (sekvence s id. č. 73), LRGATVHRT (sekvence s id. č. 74), YLKDRQLAG (sekvence s id. č. 75), LAGAMVWAL (sekvence s id. č. 76), VWALĎLDDF (sekvence s id. č. 77) nebo LDLDDFQGS (sekvence s id. č. 78).
Konkrétněji peptid podle vynálezu zahrnuje alespoň jednu z aminokyselinových sekvencí YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence s iď. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), LDRFLCTHIIYŠFANI (sekvence s id. č. 5), THIIYSFANISNDHID (sekvence S id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. 12), NTQSRRTFIKSVPPFL (sekvence s id. č. 16), TFIKSVPPFLRTHGFD (sekvence s id. č. 17), PPFLRTHGFDGLDLAW (sekvence s id. č. 18), HGFDGLDLAWLYPGRR (sekvence s id. č. 19), DLAWLYPGRRDKQHFT (sekvence S id. č. 20), TIDSSYDIAKISQHLD (sekvence s id. č. 28) , DIAKISQHLDFISIMT (sekvence s id. č. 29), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence s id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34), DYAVGYMLRLGAPASK (sekvence s id. č. 37), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. č. 38), PASKLVMGIPTFGRSF (sekvence s id. č. 39), GTLAYYEICDFLRGAT (sekvence S id. Č. 46), EICDFLRGATVHRTLG (sekvence S id. č. 47), RGATVHRTLGQQVPYA (sekvence s id. č. 48), VKSKVQYLKDRQLAGA (sekvence s id. č. 53), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence S id. č. 54), LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence S id. Č. 55), WALDLDDFQGSFCGQD • t * • ··· • ♦ • · ·· · ··« ;ϊλ'ΐ • t «
« · ·« ·#· • · · ·«· · · • · · ·· »· (sekvence s id. c. 56) nebo DFQGSFCGQDLRFP č. 57) .
Peptid podle předkládaného vynálezu s jednu z aminokyselinových sekvencí vm ττ'τί
2), LDRFLCTHIIYSFANI (sekvence s id. Č. 5)
LT (sekvence s id.
5.výhodou zahrnuje YKLVCYYTSWSQYREG / — - « «. ~ -! · X (OCAVCilOC O -LkA. « , THIIYSFANISNDHID (sekvence s id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. .12), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence s . id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS {sekvence s id. č. 34), DYAVGYMLRLGAPASK (sekvence s id. č. 37), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55).
Ještě výhodněji zahrnuje peptid podle vynálezu jednu nebo více z aminokyselinových sekvenci YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s. id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s. id. č. 55) .
Peptidy podle vynálezu sestávají z 16 až 55, lépe z 16 až 35, ještě lepe z 16 až 25 a nejlépe z 16 aminokyselinových zbytků.
Vysoce upřednostňovanými peptidy podle vynálezu jsou hexadekapeptidy, sestávající z aminokyselinové sekvence YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence s id. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), LDRFLCTHIIYSFANI (sekvence s id. č. 5), THIIYSFANISNDHID (sekvence S id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. 12), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence s id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34),
DYAVGYMLRLGAPAŠK (sekvence s id. č. 37), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55) a zejména pak z aminokyselinových sekvencí YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2) SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34), MLRLGAPAšKLVMGIF (sekvence s id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence,s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55).
Do rozsahu vynálezu patří rovněž multimery peptidú podle vynálezu, jako například dimer nebo ' trimer peptidú podle vynálezu. Multimer podle vynálezu může být buď homomerem, sestávající z velkého množství' jednotek stejného peptidu, nebo heterómerem, sestávajícího z různých peptidú.
r · .
Charakteristické aminokyselinové sekvence peptidu podle vynálezu mohou být po stranách doplněny libovolnými aminokyselinovými sekvencemi. Přednost se dává náhodným sekvencím, majícím na peptidy stabilizační účinek a zvyšujícím tak jejich biologickou dostupnost.
Předkládaný vynález je založen na nečekaném objevu, že glykoprotein 39’ lidské chrupavky (dále zde označovaný jako HC gp-39) je cílovým autoantigenem u pacientů s RA (revmatoidní arthritidou), který aktivuje specifické T buňky a vyvolává tak nebo zprostředkovává zánětlivý proces. Peptidy odvozené od HC gp-39 byly ve velké míře rozpoznány autoreaktivními T buňkami pacientů s RA, ále jen vzácně T buňkami zdravých dárců, což naznačuje, že HC gp-39 je autoantigenem při RA. Arthritogenní povaha HC gp-39 byla dále prokázána u myší kmene Balb/c. Jediná podkožní injekce uvedeného proteinu myším Balb/c byla schopna u zvířat iniciovat arthritické • · ··
Mil · • ♦ * ·« ·· • · · příznaky. Průběh onemocnění, indukovaného HC gp-39, byl charakterizován recidivami, nastávajícími opakovaně na předních tlapkách a/nebo zadních tlapkách a postupně se vyvíjejícími od slabé arthritidy do závažnější formy. Pozorováno bylo také symetrické rozdělení postižených kloubů, CGZ Gjpol-ij. 3 pGSCjSOj-Iu. Cpaldlj GG xGdCÍ-TV G uVO2Sj3j<t uzlíků, připomíná postup-onemocnění u ..arthritis, zvláště RA.
Ještě překvapivěji bylo zjištěno, že podávání HC gp-39 mělo za následek imunologickou toleranci a ještě významněji opoždění a/nebo potlačení arthritického vývoje.
.Aminokyselinové .sekvence, uváděné v sekvencích- s identifikačními čísly 60 až 78 a specifičtěji sekvence uváděné v sekvencích s identifikačními čísly 1, 2, 5, 6, 12, 16-20, 28-30, 34, 37-39, 46-48,.. 53-57 připomínají epitopy restrikčních T buněk třídy II HHC, které jsou přítomné na HC gp-39. Peptidy podle vynálezu tedy mohou být chápány tak,, že obklopují fragmenty autoantigenu HC gp-39, které zahrnují jeden nebo více dříve určených epitopů restrikčních T buněk třídy II HHC a rovněž spadají do rozsahu vynálezu.
Ačkoli HC gp-39 byl popsán v práci Kakaly a spoluautorů, J. Biol. Chem. 268(34), 25803, 1993, kde byl charakterizován jako chitinázový protein a navržen k použití jako vhodný markér (látka pro rozlišení) revmatoidní arthritidy, nebyl přítomen žádný náznak anebo návrh, týkající se arthritogenní povahy HC gp-39.
Peptidy podle vynálezu mohou být připraveny dobře známými metodami organické chemie, týkajícími se syntézy peptidů, jako je například syntéza peptidů v pevné fázi, • ♦ «
♦ *· > · *· · · <
• * • t · • ··♦*
Peptide Protein Res. 35, 161-214, 1990.
Peptidy podle vynálezu mohou být technikami rekombinantní DNA. Sekvence.
VAHn π i c i 4 <1 1 o ttt m á Ί o1’11 « λΧ-. λ ř*·· w » YliUXCfakl 11CVU1 - 9 popsaná např. v J.' Amer. Chem. Soc. 85, 2149, 1963 a Int. J.
rovněž připraveny nukleové kyseliny,
WS i Π T «! «Η Λ W μ .*. -r «· In. 1LLU.4, UiiUCL . UCUVk-f V JUli peptidů, je vložena do expresního vektoru. Vhodnými vektory exprese jsou, kromě jiných, plasmidy, kosmidy, viry a tzv. YAC (Yeast Artificial Chromosomes, umělé kvasinkové chromosomy), zahrnující nezbytné .kontrolní oblasti replikace a exprese. Expresní vektor může být do exprese vnesen v hostitelské buňce. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou např. bakterie, buňky kvasinek a savčí buňky. Takové postupy jsou v oboru dobře známé, viz například publikaci Sambrookeho a spoluautorů Molecular Cloning: a Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory 'Press., Cold Spring Harbor, 1989.
Peptidy podle vynálezu jsou. peptidy reagující s· T buňkami, jsou rozpoznávány aktivovanými, autoreaktivními T buňkami a jsou schopné je stimulovat. Tyto autoreaktiviií T buňky jsou nacházeny v krvi pacientů s RA, ale jen zřídka u zdravých dárců.
Podle vynálezu jsou tedy syntetické peptidy, kteréžto peptidy připomínají epitopy restrikčních T buněk třídy II HHC přítomné na cílovém autoantigenu HC gp-39, velmi vhodné pro použití při léčbě, směřující k indukování specifické T buněčné tolerance vůči HC gp-39 u savců, konkrétněji u lidí, trpících destrukcí chrupavky zprostředkovanou T buňkami, jako je například arthritida a konkrétněji revmatoidní arthritida.
Ačkoli WO 95/01995 a WO 95/02188 popisují diagnostické • ΦΦΦ φφφ « φ • φ · » * · φ
- 10 ·· · • φφφ • · · • · φφφ ·«· fr • φ • φφ ···· použiti HC gp-39 jako markéru RA, arthritogenní povaha HC gp-39 zde není ani objevena, ani navržena. Nikde není učiněn náznak nebo návrh, týkající se využití fragmentů HC gp-39 nebo peptidů reagujících s T buňkami podle předkládaného vynálezu pro antigenně nebo peptidově specifickou léčbu k v -indukovaní specifické T bunecne tolerance 'Vuci m yp—o^ v napadené chrupavce.
Podle vynálezu mohou být pacienti, trpící T buněčně zprostředkovanou ..destrukcí kloubní chrupavky, léčeni léčebným prostředkem, obsahujícím jeden či více ,z peptidů podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Podávání farmaceutického prostředku, podle vynálezu bude indukovat systémovou imunologickou toleranci, zejména toleranci specifických ' autoreaktivních T buněk takových pacientů, k autoantigennim bílkovinám 'v napadené' kloubní . chrupavce a jiným vlastním antigenům, které vykazují identifikované epitopy vazných T buněk třídy II HHC, charakterizované nebo napodobované aminokyselinovými sekvencemi jednoho či více z peptidů podle vynálezu. Indukovaná tolerance tedy povede ke snížení místní zánětlivé odpovědi v napadené kloubní chrupavce.
Velmi vhodnými peptidy pro použití ve. farmaceutickém prostředku podle vynálezu jsou peptidy, mající 16 až 55, lépe 16 až 35, ještě lépe 16 až 25 a nejlépe 16 aminokyselinových zbytků, přičemž uvedené peptidy obsahují nejméně jednu z aminokyselinových . sekvencí LVCYYTSWS (sekvence s identifikačním číslem 60), FLCTHIIYS (sekvence s id. č. 61),
IIYSFANIS (sekvence s id. č. 62), LKTLLSVGG (sekvence s id. č. 63), FIKSVPPFL (sekvence s id. č. 64), FDGLDLAWL (sekvence s id. č. 65), LYPGRRDKQ (sekvence s id. č. 66), YDIAKISQH • *· • · » (sekvence s id. č. 61), LDFISIMTY (sekvence s id. č. 68}, FISIMTYDF (sekvence s id. č. 69), FRGQEDASP (sekvence s id. č. 70), YAVGYMLRL (sekvence s id. č. 71), MLRLGAPAS (sekvence s id. č. 72), LAYYEICDF (sekvence s id. č. 73), LRGATVHRT (sekvence s id. č. 74), YLKDRQLAG (sekvence s id. č. 75), LAGAMVWAL (sekvence s id. č. 76), VWALDLDDF (sekvence S id. č. 77) či LDLDDFQGS (sekvence s id. č.'78), zvláště pak jednu z aminokyselinových sekvencí YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence s id. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), LDRFLCTHIIYSFSNI (sekvence s id. č. 5), THIIYSFANISNDHID (sekvence s id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. 12), NTQSRRTFIKSVPPFL (sekvence s id. č. 16), TFIKSVPPFLRTHGFD (sekvence s id. Č. 17), PPFLRTHGFDGLDLAW (sekvence, s id. č. 18), HGFDGLDLAWLYPGRR (sekvence s id. č. 19), DLAWLYPGRRDKQHFT (sekvence s id. č. 20), ŤIDSSÝDIAKISQHLD (sekvence s id. č. ,28), DIAKISQHLDFISIMT (sekvence s id. č. 29), QHLDFIS1MTYDFHGA (sekvence s id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34), DYAVGYMLRLGAPASK (sekvence s id. č. 37), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. č. 38), PASKLVMGIPTFGRSF (sekvence s id. č. 39), GTLAYYEICDFLRGAT (sekvence s id. č. 46), EICDFLRGATVHRTLG (sekvence s id. č. 47), RGATVHRTLGQQVPYA (sekvence s id. Č.-48), VKSKVQYLKDRQLAGA. (sekvence s id. č. 53), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54), LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55), WALDLDDFQGSFCGQD (sekvence s id. č. 56} nebo DFQGSFCGQDLRFPLT (sekvence s id. č. 57).
Ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se zvláštní přednost dává peptidům majícím 16 až 55, lépe 16 až 35, ještě lépe 16 až 25 a nejlépe 16 aminokyselinových zbytků, přičemž uvedené peptidy obsahují nejméně jednu z aminokyselinových t«l Φ * · · ♦· φφ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ sekvencí YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence s id. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), LDRFLCTHIIYSFANI (sekvence s id. č. 5) , THIIYSFANISNDHID. (sekvence s id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. 12), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence s id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 3.4)........ dyavgymlrlgapask (sekvence s id= č= 37),
MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence S id. Č. .38)., ..YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence 5 id. č. 55).
Ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se ještě větší přednost dává peptidům majícím 16 až 55> lépe 16 až 35, ještě lépe 16 až . 25 a nejlépe 16 aminokyselinových zbytků, přičemž uvedené peptidy obsahují nejméně jednu z aminokyselinových sekvenci ' YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id., č. 34),
MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence S id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55).
Ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se nejvíce upřednostňují hexadekapeptidy, sestávající z aminokyselinové
- sekvence· -YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence -s - -id......č. -I),
YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. Č. 2), LDRFLCTHIIYSFANI (sekvence s id. č. 5), THIIYSFANISNDHID (sekvence s id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. Č. 12), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence š id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34), DYAVGYMLRLGAPASK (sekvence s id. č. 37), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence S id. Č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55) a zejména pak z aminokyselinových sekvencí YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2) SPLFRGQEDASPDRFS • 9 9 99 • · *·· 9 ·
9 9 (sekvence s. id. č. 34), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55).
Peptidy podle vynálezu mají ve srovnání s nespecifickým supresivním účinkem imunosupresivních léčiv tu výhodu, že vykazují specificky účinek na autoreaktivní T buňky a ponechávají tak jiné složky imunitního systému intaktní. Léčba peptidy podle vynálezu bude bezpečná a nenastanou žádné toxické vedlejší účinky.
Systémové imunologické tolerance může být dosaženo podáváním vysokých nebo nízkých dávek peptidů podle vynálezu. Množství peptidu bude záviset na způsobu podání, době podávání a věku pacienta, stejně jako na obecných zdravotních podmínkách a dietě.
. Obecně lze použít dávkování 0,01 až 1000 gg peptidu na kg tělesné hmotnosti/ lépe 0,5 až 500 gg a ještě lépe 0,1 až 100 gg peptidu na kg tělesné hmotnosti.
Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou osobám z oboru dobře známé a zahrnují _ například .sterilní.. fyziologický roztok, laktózu, sacharózu, fosforečnan vápenatý, želatinu, dextrin, agar, pektin, podzemnicový olej, olivový olej, sezamový olej a vodu. Jinými nosiči mohou být například molekuly třídy II HHC, pokud je to žádoucí, vsazené do liposomů.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu může nadto obsahovat jednu nebo více z adjuvantních látek. Vhodná adjuvantní činidla zahrnují, kromě jiného, hydroxid hlinitý, • · * · « ♦··* · * · · · · ··*··»' · · ··
- 14 fosforečnan hlinitý, A, muramyldipeptid a adjuvantnimi látkami vynálezu mukózní podjednotka B toxinu na slizníční epitel.
amphigen, tokoferoly, monofosfenyllipid saponiny jako je Quill A. S výhodou jsou pro použiti k toleranční léčbě podle (slizniční) adjuvantní látky, jako cholery, nebo karbomery, které se vážou
Množství adjuvantních látek závisi na povaze samotného adjuvans.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu ' může dále obsahovat jedno nebo- více ze .stabilizačních činidel, jako jsou například cukry včetně sorbitolu, mannitolu, škrobu, sacharózového dextrinu a glulózy, bílkoviny jako albumin nebo kasein a pufry jako jsou alkalické fosforečnany.
podání / jsou intramuskulární subkutání . (podkožní) injekce, injekce nebo intraperitoneální orální podávání (ústy) a nosní
Vhodnými cestami (nitrosvalové) injekce, intravenosní (nitrožilní) injekce (do dutiny břišní), spreje.
Peptidy podle vynálezu jsou rovněž velmi vhodné pro použití v diagnostickém postupu, sloužícím k detegování přítomnosti aktivovaných autoreaktivních T buněk,’ zapojených v procesech chronického zánětu-a destrukce kloubní chrupavky.
Diagnostický postup podle.vynálezu zahrnuje následující kroky:
a) isolací mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) z krevního vzorku testovaného jedince,
b) kultivaci těchto PBMC ve vhodných podmínkách,
c) inkubaci kultury těchto PBMC v přítomnosti jednoho .nebo více peptidů podle vynálezu, a
d) detegování odpovědi T buněk, například proliferativní odpovědi, ukazující na přítomnost aktivovaných autoreaktivních T buněk u testovaného jedince.
Detegování . proliferativní odpovědi . T buněk může být 3 prováděno například inkorporací H-thymidinu.
Do rozsahu vynálezu patří rovněž testovací sady, které obsahují jeden nebo. více ? peptidů podle vynálezu. Tyto testovací sady se hodí pro použití v diagnostickém postupu podle vynálezu.
Následující příklady dokreslují vynález a v žádném případě by nemělybýt brány jako omezující rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Metody
Pacienti
Tato studie zahrnuje 7 DR4(DRBl*0401)-positivních pacientů, u nichž bylo diagnosováno, že trpí RA podle kriterií ARA {Arnett se spoluautory, Arthritis Rheum. 31, 315, 1988). Vzorky periferní krve byly získány s poučeným souhlasem, V souboru bylo 5 žen a 2 muži ve věku 4 6 až 79 let. Doba trvání jejich onemocnění činila od více než 10 do více než 30 let. Tři ze sedmi pacientů měli nejméně 3 oteklé klouby. Čtyři pacienti nevykazovali žádné známky aktivního onemocnění. Všichni pacienti dostávali léky: čtyři pacienti byli léčeni prednisonem, tři pacienti dostávali antirevmatika a čtyři pacienti byli rovněž léčeni NSAID.
* * · ► · · ’ ft · ί
I ·«
Vzorky periferní krve 5 zdravých dárců, vykazujících DR4(DRBl*0401) specifičnost, byly získány s jejich poučeným souhlasem a jsou v této studii zařazeny jako kontrola.
. Definice polymorfismu HLA-DR
Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) pacienta a zdravého dárce, isolované z heparinizované periferní krve standardním odstředěním na Ficoll-Paque, byly stimulovány PHA .(fytohemaglutininem firmy Welcome, Dartford, Velká Britanie)
7 k zisku 5 x 10 -10 lymfocytů. K vyčištění chromosomální DNA z kultivovaných buněk byla použita (podle pokynů výrobce) krevní sada QIA amp (QIA amp blood kit, Qiagen Inc) . Chromosomální DNA extrakty byly analyzovány za použití sady . DR 'low resolution'SSP,.Za použití sady DRB1 04-SSP” bylo provedeno určení podtypů DR4. Určení typů HHC DR bylo provedeno v laboratoři transplantační sérologie v Universitní nemocnici v Nijmegen, Nizozemí (Transplant Serology Laboratory, University Hospital, Nijmegen, The Netherlands).
- 17 Tabulka I
RA pacient stadium nemoci synovitis trvání nemoci HLA-DR
191 IV ne 30 let 0401/01
259 III-IV ano 30 let 0401/16
262 τττ-τγ cliiG -i t. ±u xec 0401/0408
272 III-IV ne 30 let 0401/0701
276 IV ne 30 let 0401/14
286 IV ne 20 let 0401/0408
287 III-IV ano 20 let 0401/13
zdravý dárce HLA-DR
155 0401/14
157 0401/13
168 0401/07
230 . 0401/07
235 .0401/13
Syntéza peptidů
Peptidy byly syntetizovány v Eurosequence (Groningen, Nizozemí). Peptidy byly syntetizovány od C-konce k N-konci v 10 μιαοί množstvích, ' chemickým postupem využívajícím chránící skupiny FMOC, v pevné fázi. Surové peptidy byly částečně -vyčištěny někaltka-'dalšími ’ přěpářačemi’.''Jak bylo ' uvedeno výrobcem, alespoň 35 % lyofilizovaného produktu obsahovalo požadovaný produkt v plné délce. Zbytek obsahoval sůl a zbývající rozpouštědlo. Kvalita konečného produktu byla ověřena sekvenční analýzou, analýzou aminokyselin a/nebo za použití RF-HPLC. Sekvence syntetizovaných peptidů jsou uvedeny v Tabulce II.
• 9 ·
Tabulka II: Aminokyselinové sekvence peptidů, použitých v této studii.
sekvence s identit, číslem zbytek .peptid
1 22-37 YKLVCYYTSWSQYREG
2 28-43 YTSWSQYREGDGSCFP
3 34-49 YREGDGSCFPDALDRF
4 40-55 SCFPDALDRFLCTHII
5 46-61 LDRFLCTHIIYSFANI
6 52-67 THIIYSFANISNDHID
7 58-73 FANISNDHIDTWEWND
8 . 64-79 DHIDTWEWNDVTLYGM
9 70-85 EWNDVTLYGMLNTLKN
10 76-91 LYGMLNTLKNRNPNLK
11 ' 82-97 TLKNRNPNLKTLLSVG
12 88-103 PNLKTLLSVGGWNFGS
13- . . 9.4-109 LSVGGWNFGSQRFSKI
14 100-115 NFGSQRFSKIASNTQS
15 . 106-121 FSKIASNTQSRRTFIK
16 112-127 NTQSRRTFIKSVPPFL
17 118-133 TFIKSVPPFLRTHGFD
18 124-139 PPFLRTHGFDGLDLAW
19 130-145 HGFDGLDLAWLYPGRR
20 136-151 DLAWLYPGRRDKQHFT
21- ........— - • -142-157 — ' PGRRDKQHFTTLIKEM^
22 148-163 QHFTTLIKEMKAEFIK
23 154-169 IKEMKAEFIKEAQPGK
24 160-175 EFIKEAQPGKKQLLLS
25 166-181 QPGKKQLLLSAALSAG
26 172-187 LLLSAALSAGKVTIDS
27 178-193 LSAGKVTIDSSYDIAK
28 184-199 TIDSSYDIAKISQHLD
29 190-205 DIAKISQHLDFISIMT
30 196-211 QHLDFISIMTYDFHGA
31 202-217 SIMTYDFHGAWRGTTG
32 208-223 FHGAWRGTTGHHSPLF
f 444 4 · * 4 44 « · 4 4 4 ··« 4 4 • 4 «· 4 4 4 «·· ·4· «44 4444 « 44
33 214-229 GTTGHHSPLFRGQEDA
34 220-235 SPLFRGQEDASPDRFS
35 226-241 QEDASPDRFSNTDYAV
36 232-247 DRFSNTDYAVGYMLRL
37 238-253 DYAVGYMLRLGAPASK
38 244-259 MLRLGAPASKLVMGIP
39 250-265 PASKLVMGIPTFGRSF
40 256-271 MGIPTFGRSFTLASSE
41 262-277 GRSFTLASSETGVGAP
42 268-283 ASSETGVGAPISGPGI
43 274-289 VGAPISGPGIPGRFTK
44 280-295 GPGIPGRFTKEAGTLA
45 . 286-301 RFTKEAGTLAYYEICD
46 292-307 . GTLAYYEICDFLRGAT
47 298-313 EICDFLRGATVHRTLG
48 ' 304-319 RGATVHRTLGQQVPYA
49 310-325 RTLGQQVPYATKGNQW
50 316-3.31· VPYATKGNQWVGYDDQ
51 322-337 GNQWVGYDDQESVKSK
52 328-343 YDDQESVKSKVQYLKD
53 334-349 VKSKVQYLKDRQLAGA
54 340-355 YLKDRQLAGAMVWALD
55 346-361 LAGAMVWALKLDDFQG
56 352-377 WALDLDDFQGSFCGQD
57 358-373 DFQGSFCGQDLRFPLT
-58........... --- —-3-64-3-7-9 - — - CGQDLRFPLTNAIKDA'' '
59 368-383 LRFPLTNAIKDALAAT
Stanovení navázání peptidů HLA-DR
Molekuly DR4 (DRBl*0401) a DR4 (DRBl*0404) byly vyčištěny z homozygotních EBV-transformovaných lidských B lymfoblastoidních buněčných linií Hulyl38IC2 a BM92 za použití mAb L243, zaměřeného vůči komplexu DR (L.A. Lampson a R. Levý J. Immunol. 125, 293-299, 1980).
··· φ φ · « ΦΦ·
Studie týkající se navázání peptidu byly prováděny za použití semikvantitativního kompetičního vazného stanovení (Joosten se spoluautory,. Int. Immunol. 6, 751, 1994). V krátkosti, vyčištěné molekuly HLA-DR, 30 nmol.l'1 DR4 (DRBl*0401) nebo 15 nmol.l'1 DR4 (DRBl*0404), byly inkubovány při pH 5,0 s 50 nmol.l'1 biotinylováným peptidovým markérem' (HA 309Y-F) a koncentrační škálou kompetujícího peptidu v konečném objemu 20 ml vazného ' pufru (PBS obsahující 0, 01 % NaN3, 0,05 % NP-40, 5 % DMSO, 1 mmol.l'1 AEBSF, 1 mmol.i'1
N-ethylmaleinimid, 8 mmol.l1 EDTA a 10 mmol.I1 pepstatin A). Po 44 hodinách inkubace při laboratorní teplotě byl peptidový markér navázaný na HLA-DR oddělen od volného peptidového markéru za použití vakuového zařízení pro sání z jamek (Hybri.dot, BLR) a nitrocelulosové. membrány (Hybond ECL, Amersham, Velká Británie) . Nitrocelulosové filtry byly blokovány 0,'5% činidlem blokujícím DNA (Boehringer) v 0,1 mol.l'1 kyselině maleinové a 150 mmol.l'1 NaCl, pH 7,5. Po 0,5 až 1 hodině byly filtry promyty v PBS s 0,05% Tween 20 (Sigma) a inkubovány s přípravkem Streptavidin-HRPO (Southern Biotechnology) ve zředění 1:10 000.. Biotinylované peptidy byly detegovány na základě zvýšení chemiluminiscence za použití, s_ady ,._We.s.t.ern___Bl.o.t... ..ECL .. „..(Amersham)-._____Exposice— předexponovaných filmů (Hyperfilm ECL, Amersham) činila 10 minut. Skvrny byly analyzovány scanováním (rozkladovým snímáním) filmů a použitím softwaru Image Quant/Excel k analýze.
Afinita daného peptidu pro navázání DRBl*0401-kódovaných molekul závisela na kompetici s peptidovým markérem. Tato relativní vazná afinita byla definována jako koncentrace peptidu, při níž byl signál snížen na 50 % (IC50) .
4» * 4 * ·· * · • 4 4
Proliferativní odpovědi krevních mononukleárních buněk
K identifikování T-buněčných epitopů v HC gp-39 bylo 59 peptidů o délce 16 aminokyselin, překrývajících se v 10 aminokyselinách, testováno vzhledem ke schopnosti indukovat rt 1 -i λ v»· -·, ·+ X ·»«*. X J. J-CL O Li v HJ_
u.
unononukiearmch buněk periferní krve) pacientů s RA a zdravých dárců, nesoucích specificitu DR4 (DRBl*Q401) sekvence testovaných peptidů.
(Tabulka lj'; Tabulka II udává
PBMC získané z heparinizované žilní periferní krve byly isolovány standardním odstředěním na gradientu přípravku Ficoll-Paque. Buňky byly kultivovány ve čtyřech souběžných uspořádáních (čtyřmo) při koncentraci 1,5 x 105 buněk/jamku, v médiu, /doplněném .10% tepelně inaktivovanou autologní plasmou,ř.c;L;-glutaminem, 2-ME a antibiotiky v mikrotitračhích destičkách*· s* plochým dnem. Buňky byly kultivovány v samotném médiu nebo v přítomnosti fytohemaglútininu (PHA) (2,5 pg/ml) k potvrzení životnosti buněk, nebo v přítomnosti 10 či 100 gg/ml peptidů, odvozených od HC gp-39. V několika případech
Λ · byly v důsledku omezeného počtu PBMC jednotlivých dárců testovány sady 2 nebo 3 po sobě následujících peptidů. Kultury byly inkubovány v celkovém objemu 210 μΐ po 7 dní při 37 ’C ve zvlhčované atmosféře 5% CO2- Kultury byly během posledních 18 hodin kultivace pulsně označeny 0,25 μCi 3H-thymidinem ([3H]TdR). Buňky byly sbírány na filtry se skleněnou vatou a inkorporace [3H]TdR byla měřena pomocí plynové scintilace (na přístroji Packard.Matrix 96 fJcounter) . Pouze peptidy, indukující proliferativní odpověď jak při koncentraci 10, tak i 100 μg/ml byly považovány za obsahující T-buněčný epitop. Odpovědi byly definovány jako positivní, « Μ » · » · · • Μ Φ · · Φ ·Φ • » Φ Φ Φ *· Φ · ·
Φ Φ* Φ Φ · · φφ* Φ·Φ ΦΦ** ΦΦ *Φ pokud hodnoty stimulačního indexu (Si, antigenně specifické impulsy za 5 minut (cp5m)/ pozadí cp5m) převyšovaly 2 nebo se jim rovnaly.
Výsledky
Identifikace T-buněčných epitopů proliferativní odpovědí krevních mononukleárních buněk
Reaktivita T buněk vůči peptidům odvozeným od HC gp-39 byla analyzována měřením proliferativní odpovědi PBMC u pacientů s RA, positivních vzhledem k DRA (DRB1*O4Q1), a zdravých dárců. Proliferativní odpovědi byly testovány v autologní plasmě. V tabulkách IIIA a IIIB jsou představeny výsledky 7 pokusů, ukazující odpovědi pacientů s RA (Tabulka IIIA) a odpovědi zdravých dárců (Tabulka IIIB) na 59 překrývajících se sekvencí, odvozených od HC gp-39. Dárci, u nichž byla nalezena odpověd vůči oběma koncentracím (100 a· 10 gg/ml) peptidů byli řazeni mezi odpovídače” a dárci, kteří neodpovídali na žádnou z obou testovaných koncentrací, byli řazeni mezi neodpovídače (NR, non-responders).
Odpovědi na jednotlivé, peptidy 1,_.2,.. 5.,...6, .1.2.,. . .15, 30.,. 34, 37, 38, 40, 41, 54 a 55 (čísla odpovídají příslušným sekvencím s identifikačním například peptid 30 aminokyselinovou sekvenci, číslem každého z peptidů, znamená: peptid, mající uvedenou v sekvenci s identifikačním číslem 30) byly pozorovány u jednoho nebo více dárců, čímž byly tyto sekvence identifikovány jako T-buněčné epitopy.
Je zajímavé, že odpovědi na peptidy 2, 34, 38, 40, 54 a 55 byly pozorovány pouze u pacientů s RA.
» ·» » · « 1 t t • Φφ φ * · φ ·· • Φ « · ♦ *· Φ · φ ♦ Φ · Φ Φ Φ
ΦΦΦ φΦφ ···♦ ·· φφ
Na druhou stranu, peptidy 12 a 41 doposud indukovaly odpovědi pouze u zdravých dárců (230, 235).
Navíc, jak lze vidět v Tabulce 3, byly nalezeny odpovědi vůči následujícím sadám: peptidů 1/2, 1/2/3, 4/5/6, 5/6,
15/16, 17/18, 19/20, 28/29/30, 29/30, 37/38, 37/38/39,- 39/40, 46/47/48, 53/54, 55/56 a 55/56/57. Tyto výsledky jsou ve shodě s většinou výsledků, získaných s jednotlivými peptidy zmíněnými výše. Nadto odpovědi vůči sadě peptidů určují oblasti, které, obsahují přídvné T-buněčné epitopy, tj. .oblasti, pokryté peptidy 16-20 (zbytky 112-151), 28-29 (zbytky 184-205), 38-40 (zbytky 244-271), 46-48 (zbytky 292-319) a 53-57 (334-373).
Šest ze sedmi DR4 (DRBl*0401).-positivních pacientů odpovídali na peptidy odvozené od HC gp-39 nebo jejich sady, a byli proto označeni jako odpovídači. U skupiny zdravých dárců (HD, healthy donors) byli tři z pěti dárců zařazeni mezi odpovídače. Obecně se pacienti s RA zdáli odpovídat , na mnohem více oblastí HC gp-39 než zdraví dárci (zdravý dárce 230 je výjimka) . Například PBMC pacienta s RA č. 272, který byl testován vzhledem k jednotlivým peptidům, se zdály odpovídat na ys_ech_.ll „peptidů...(1.,. 2,--5,--6-,--3 0-,---3 4-,--3-7-,--38-,40, 54 a 55). PBMC ostatních pacientů (pacient 287 je výjimka) vykazovaly odpověď vůči sadě peptidů, překrývající těchto 11 sekvencí a identifikovaly některé přídavné oblasti, obsahující T-buněČné epitopy (peptidy 14-20 a 46-48).
PBMC, získané od zdravého dárce (230) dále potvrdily přítomnost T-buněčných epitopů v peptidech 1, 5, 6, 15, 30 a 37.
Souhrnně nejčastěji rozpoznávané peptidy nebo sady peptidů obsahují peptidy 1/2, 5/6, 30, 37/38 a 54/55.
«· · · · · · · • · · * ♦· • ♦ · ·>» ♦ ·
Vzájemný vztah T-buněčných epitopů a vazby DRB4 (DRBl*0401)
Peptidy 1, 2, 5, 6, 12, 15, 30, 34, 37, 38, 40, 41, 54 a .55 byly všechny shledány jako stimulující T buňky, .získané z periferní krve.' Souběžně bylo u všech .těchto peptidů .nalezeno navázání na DRB4 (DRB1*0401) s poměrně vysokou afinitou (kromě peptidů 2 a 38, které se navazují se střední poměrnou afinitou) . · Peptidy 3 4, 16, 17, 18, 19, 20, 28, 29, 39, 46, 47, 48, 53, 56' a 57 byly spíše než jednotlivě testovány v sadách. Je velmi pravděpodobné, že některé z těchto peptidů rovněž obsahují odpovídající T-buněčné epitopy. V každém případě mohou všechny tyto peptidy .vázat DRB4 . (DRBl*0401) s 'vysokou až střední .poměrnou afinitou (kromě peptidu 20, který se., váže se slabou poměrnou afinitou).
Tabulka IIIA: peptidem indukované proliferativní ’ odpovědi PBMC, získaných od pacientů s RA
RA 272 262 276 286 191 287 259 0401
-peptid' ·· 0401 - -0401 Ό4ΌΓ 0401 040 Γ 0401 0401 vazba
R R R R R NR R
1 pos pos pos pos pos +++
2 pos +
3
4 pos +
5 pos pos pos +++
6 pos +++
• 9 ·
9 9 9
9 9 * 9«* · ·
9 ·
99
9 9 « 9
7
8
9
10
11
12
13
14
15 pos +++
16 +++
17 pos
. 18 +
19 pos +
20 +/- .
. 21
22
23
24
25
26
27
28 pos +++
29 . pos pos ‘ pos . +++
30 pos ++Ί-
31 ---_ —----
32
33
34 pos +++
35
36
37 pos pos pos pos pos +++
38 pos +
39 pos ++
40& pos +++
41&
42
43
• t « ♦♦ · ·
9 9« 9 ·
9 · · ·
9 · . * «» + μ· ····
- 26 • · 9 • 9 9 • · · · 9 • · 9 »9
44
45 ’
46 pos . +++
47 +++
48 +
49
50
51&
52&
53 pos pos +++
54 pos · +++
55 . pos pos pos +++
56 +++
57
58 -
59
BG 0,2 0,7 0,5 0,8 2,4 0,9 0,2
pos = kladné odpovědi na 100 i 10 pg/ml peptidu nebo sady peptidů (SI > 2 bylo považováno za kladné). Dohromady peptidy (o délce 16 aminokyselin a překrývající se 10 aminokyselinami) pokrývají úplnou zralou sekvenci zralého HC gp-39 (zbytky 22-383). Peptidy byly syntetizovány v Eurosequence (Groningen, Nizozemí). RA = pacient s revmatoidní arthritis. 0401 = dárce, nesoucí spécifitu
HLA-DRBl*0401 asociovanou s řevmat. arthritis. NR = neodpovídač. R = odpovídáš. BG = střední hodnota impulsů pozadí za 5 minut x 10~3, měřená v jamkách bez antigenu. +++ = vazba s vysokou afinitou (IC50 menší než 1 pmol.l'1); ++ = vazba s dobrou afinitou (IC50 mezi 1 a 10 pmol.l'1); + = střední vazba (IC50 mezi 10 a 100 pmol.l'1); +/- = slabá vazba (ICS0 mezi 100 a 1000 prnol.l'3); - =. nulová vazba ((IC50 větší než 1000 pmol.r1).
·» * * • · · * « · ·· « ···« · • « * *· »4 «
« • · <
• * ««I »·· » * • » ·
*** ♦·**
Tabulka IIIB: Peptidem indukované proliferativni odpovědi PBMC, získaných od zdravých dárců
HD 155 157 163 230 235 0401
peptid 0401 0401 0401 0401 0401 vazba
R NR NR R R
1 pos +++
2
3
4
5 ζ pos +++
6 pos +++
7
8
9
10
11
12 pos +++
13
14&
15& pos +++
16
17
18
19
20
21
22
23
24 *
25
2.6 - -
27
28
29
30 pos +++
31
32
33 **
34
35
36
QT / z pos pos +++
38
39
40
41 pos +++
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54-
55
56. ............ -----—------ --- —......- -......
57
58
59
BG 4,2 10, 4 2,2 3, 6 3,5
pos = kladné odpovědi na 100 i 10 μς/ml peptidu nebo sady peptidů (SI > 2 bylo považováno za kladné). Dohromady peptidy (o délce 16 aminokyselin a překrývající se 10 aminokyselinami) pokrývají úplnou zralou sekvenci zralého HC gp-39 (zbytky 22-383). Peptidy byly syntetizovány v
- 29 Eurosequence (Groningen, Nizozemí). RA = pacient . s revmatoidní arthritis. 0401 = dárce, nesoucí specifitu
HLA-DRBl*0401 .asociovanou s revmat. arthritis. NR = neodpovídáš. R = odpovídáš. BG = střední hodnota impulsů pozadí za 5 minut x 10~3, měřená v jamkách bez antigenu. +++ = vazba š vysokou afinitou. (IC50 menší než 1 μιαοί. Γ1); ++ = vazba s dobrou afinitou (ICS0 mezi .1 a .10 μιαοί.Γ1); + = střední vazba (IC50 mezi 10 a 100 μαιοΙ.Γ1); +/- = slabá vazba (IC50 mezi 100 a 1000 μιαοί.I'1); = nulová vazba ((1C3O větší než 1000 μιαοί.I'1).
Zkratky
AEBSF:
BB:
BCA:
BSA:
DMSO:.
ECL:
EDTA:
FACS:· 1 HLA:
HPLC:
HRP:
HHC třídy II:
4- (2-aminoethyl)-benzensulfonylfluorid vazný pufr kyselina bicinchoninová hovězí sérový albumin dimethylsulfoxid zvýšená chemiluminiscence kyselina ethylendiamintetraoctová rozlišovač fluorescenčně aktivovaných buněk lidské leukocytární antigeny vysoce účinná kapalinová chromatografie křenová peroxidáza třída II hlavního histokompatibilního .komplexu___,_____-----—,---NMR: nukleární magnetická resonance
NP-40: Nonidet P-40
PBS: fosfátem pufrovaný fysiologický roztok
PVDF; difluorid polyvinylidenu
RA: revmatoidní arthritis
SDS-PAGE: elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s obsahem dodecylsulfátu sodného
Zastupuje:
PŘEHLED SEKVENCÍ (1) OBECNÁ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: Akzo Nobel N.V.
(B) ULICE: Velperweg 76 (C) MĚSTO: Arnhem (E) ZEMĚ: Nizozemí (F) POŠTOVNÍ KÓD: 6824 BM . (G) TELEFON: 0421-666376 (Hj TELEFAX: 0412-650592 (I) TELEX: 37503 akpha nl . (ii)' NÁZEV VYNÁLEZU: Peptidy, farmaceutický prostředek testovací sada s jejich obsahem a diagnostický postup, využívající tyto peptidy . (iii) POČET SEKVENCÍ: 78 — (iv) POČÍTAČEM NAČITATELNÁ FORMA:
(A) TYP PŘENAŠEČE: floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC ’ “ - '(Ο' OPERAČNÍ-^ŠTÉmT pC-ĎOS/MS-DOŠ--7-- — — (D) SOFTWARE: Patentln Release 1.0, verse 1.30 (EPO) (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární * · · · 1 « i ·· « *·» t
b ·· ··» (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitrní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 1:
Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser Gin Tyr Arg Glu Gly 1 5 10 ' 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI Ξ ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA:' 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární . (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 2:
Tyr Thr Ser Trp Ser Gin Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid *« · · • · · • · « · · «»· *«·· (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 3:
Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č.._ á (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) . DÉLKA: 16 aminokyselin (B) .TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST:'jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 2:
Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg Phe Leu Cys Thr His Ile Ile 1 5 10 -15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 5 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
___jA).. DÉLKA: 16 aminokyselin----·----------—— (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 5
Leu Asp Arg Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv, s id. č. 6
Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp His Ile Asp 1 5 10 15 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 7 ' (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA:.16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE:.lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid__________________________ (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 7:
Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp 1 5 10 15 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin
- 34 (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 8:
Asp. His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 9 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
- (A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) vláknitost: jednoduchá . (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:' peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 9'
Glu Trp Asn Asp_Val_.T.hr_Le.U-T-vr-Gl-V-Met-Leu-Asn—T-h-r—Leu—Lys—Asn—--15 10 15 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární • » • 9 · · * · > 9 » « • · · ···* (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE': sekv. s id. č. 10:
Leu Tyr Gly Met Leu Asn Thr Leu Lys Asn Arg Asn Pro Asn Leu Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 11:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) ‘TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv, s id. č. 11:
Thr Leu Lys Asn ATg Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 12:
Ci') CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 12:
Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 13:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) . TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 13:
Leu Ser Val Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gin Arg Phe.Ser Lys Ile 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č.' 14:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina —^p^LÁKNIT0ST; jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 14:
Ašn Phe Gly Ser Gin Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gin Ser 1 5 10 15 • · · (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 15:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina . (C) VLÁKNITOST:' jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 15:
Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gin Ser Arg Arg Thr Phe .Ile Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 16:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin · (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární _ _________________________ _____ (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 16:
Asn Thr Gin Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu 1 5 10
- 38 9 3 9
(2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 17:
' (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) , VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid •' (v) TYP'FRAGMENTU: - vnitřní
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv . s id. č. 17:·
Thř Phe ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg Thr His Gly Phe Asp
1 5 10 15
2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 18:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá __ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 18:
Pro Pro Phe Leu Arg Thr His Gly Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp 15 10 15
- 39,(2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 19:
. (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) . VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 19:
His Gly. Phe Asp Gly Leu Asp Leu. Ala Trp Leu Tyr- Pro Gly Arg Arg 1. 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 20:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ' VLÁKNITOST^jednoduchá^______„ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. Č. 20:
Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg Arg Asp Lys Gin His Phe Thr ·*» ··* ·
- 40 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 21:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 21:
Pro Gly Árg Arg Asp Lys Gin His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met 1 5 10 15 (2)· INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 22:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 22:
Gin His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe Ile Lys ··· »♦* · « · ·· »· (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 23:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin <B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 23:
Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu Phe Ile Lys Glu Ala.Gin Pro Gly Lys 15 10 '15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 24:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ____ (C) VLÁKNITOST: jednoduchá ______ ___ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 24:
Glu Phe Ile Lys Glu Ala Gin Pro Gly Lys Lys Gin Leu Leu Leu Ser 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 25:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 25:
Gin Pro Gly Lys Lys Gin Leu Leu Leu Ser Ala Ala .Leu Ser Ala Gly 1 5 10. 15 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 26:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin
... I -fr (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá .
(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 26:
Leu Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser 1 5 • ·» · * · (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 27:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č..27:
Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI Ξ ID. Č. 28:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 28:
Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala Lys Ile Ser Gin His Leu Asp 1 5
- 44 ··· · 4 • · 4 • ··
č. 29;
(2) INFORMACE O SEKVENCI Ξ ID. Č. 29 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYR: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id *
Asp Ile Ala Lys Ile Ser Gin His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr 1 5 10 15' (2) INFORMACE O,SEKVENCI S ID. Č. 30:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina
------__(.£)—VLÁKN-I-TOS-T-:^-j-ednoduchá______,___________ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 30:
Gin His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe His Gly Ala 1 5 10 15 »3 ΐ ¢2) INFORMACE Ο SEKVENCI S ID. Č. 31:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) .VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE:sekv. s id. č. 31:
Ser Ile Met Thr Tyr-Asp Phe His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 32:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 32:
Phe His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Phe
5 (2) INFORMACE O SEKVENCI Ξ ID. Č. 33:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid' (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPISSEKVENCE: sékv. s id. č. 33:
Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Phe Arg Gly Gin Glu Asp Ala 1 5 '10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 34:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 34:
Ser Pro Leu Phe Arg Gly Gin Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser
·«« « « ··
I » ··· (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 35:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv, . s id. č. 35:
Gin Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala Val ..-'V
1 5 10 15
(2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 36:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ______ (C) VLÁKNITOST: jednoduchá _ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 36:
Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu 15 10 15 «β * • *· ♦ ·» ··*· * · e · ««« *** • β ga ··· · · • · « ·· ·· (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 37;
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní' (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 37:
Asp Tyr Ala- Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 38:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina —-(-C-)—VLÁKN.IT.OáT/.—j-e.dnodu.chL_ ___ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 38:
Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Met Gly Ile Pro i 9
6 * t * • · ·
- 49 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 39:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 39:
Pro Ala Ser Lys Leu Val Met Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe
1 5 10 15
(2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 40:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina _(C )_VLÁKN.I.T_O.S.T_:_ jednoduchá______ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č, 40:
Met Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu 1 5 •ε· ··«
Ht «*»· * ···· 9 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. C. 41 (i) - CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA:· 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) .VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:· peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 41:
Gly Arg.Ser Phe Thr Leu Ala Ser .Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 42:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) . TYP: aminokyselina __(C) VLÁKNITOST: jednoduchá _____ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 42:
Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile (2) INFORMACE Ο SEKVENCI S ID. Č. 43:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
*4« ··· ♦ · 4*
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá
(D) TOPOLOGIE: : lineární
(ii) , TYP MOLEKULY: peptid
(V) TYP FRAGMENTU: vnitřní
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 43:
Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Tyr Lys 1 5 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 44:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina _____ (C) VLÁKNITOST: jednoduchá ____' (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 44:
Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 45:
(i) · CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY; peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní ’ (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 45:
Arg Phe Thr Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 46:
,-··;(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina _____(C) VLÁKNITOST: jednoduchá_ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv, s id. č. 46:
Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg Gly Ala Thr 1 5 10 15
- 53 {2} INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 47:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 47:
Glu. Ile Čys Asp Phe Leu Arg Gly Ala Thr Val His.Arg Thr Leu Gly 15 10 15 (2) INFORMACE Ó SEKVENCI S ID. Č. 48:
> · ' (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina '____(C) VLÁKNITOST: jednoduchá _ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: .vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 48:
Arg Gly Ala Thr Val His Arg Thr Leu Gly Gin Gin Val Pro Tyr Ala 15 10 15 □ 95Í *· · *
- 54 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 49:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
•(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU; vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 49:
Arg Thr Leu Gly Gin Gin Val Pro Tyr Ala.Thr Lys Gly Asn Gin Trp 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 50:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16,aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ____(C) VLÁKNITOST: jednoduchá__ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 50:
Val Pro Tyr Ala Thr Lys Gly Asn Gin 1 5
Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gin 10 15 ai Ď » τ
(2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. C. 51:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) 'TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 51:
.Gly Asn Gin Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gin .Glu Ser. Val Lys. Ser Lys 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 52:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 52:
Tyr Asp Asp Gin Glu Ser Val Lys Ser 1 5
Lys Val Gin Tyr Leu Lys Asp 10 15 ΰ * 9» 9 · * * ♦ * ί · » » 9 9 ·»· 9 9 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 53:
· (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16' aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE:-lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní. ' ' (xi). POPIS'SEKVENCE: sekv. s id. č. 53:
Val Lys Ser Lys Val Gin Tyr Leu Lys Asp Arg, Gin Leu Ala Gly Ala ' 1 . 5 10 . 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 54: í
I (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: ] (A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní <
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 54:
Tyr Leu Lys Asp Arg Gin Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp 1 5
- 57 « 4 · · *· fr » · *·» ι 1
4 4 4 « »t« ···♦ ·· ·* (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 55:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 55:
Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gin Gly 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 56:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (Dj TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 56:
Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gin Gly Ser Phe Cys Gly Gin Asp 1 5 * · v · · ··· « · • · ·, · « · (2) INFORMACE Ο SEKVENCI S ID. Č. 57:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina τΓτ ·ήτΑ7ΤΦΑΓτπ - —i---3 u / r v um wu ί l , J tí^UXUU.U.UilCl (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 57:
Asp Phe Gin Gly Ser Phe Cys Gly Gin Asp Leu Arg. Phe Pro Leu Thr 1 5 .10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 58:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin ,(B) TYP: aminokyselina ' (C) VLÁKNITOST: jednoduchá
-------(-D-)—T-OPOLOG-I-E-:—1-i-neárn-í--—---— (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 58:
(l
Cys Gly Gin Asp Leu Arg Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala *
b } 9 1 · b
•
O 3 9*« * « ·«· * · (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID, Č. 59:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP .FRAGMENTU: vnitřní
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 59:
Leu Arg Fhe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala Leu Ala Ala· Thr>Ů
1 5 10 15
(2) INFORMACE 0 SEKVENCI S ID. Č. 60:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá ___________p. T qpologi eT Tiňeárni (ii) TYP MOLEKULY: peptid • Λ (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 60:
Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser * * *
·.
(2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 61:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina t π i ťtť 4 TzvTTfnrin m - _ (Ό/ VllAIUU ikJOi · J CUilUULiOiiQ (D). TOPOLOGIE: lineární ' f (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 61:
Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 62:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá
TOPOLOGIE: lineární ~ (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sékv. s id. č. 62:
Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser 1 5
(2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 63:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: peptid
(V) TYP FRAGMENTU: vnitřní
(xi) POPIS SEKVENCE !: sekv. s id. č. 63
Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val Gly Gly 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 64:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ______(CJ-JVLÁKNLTO.S.TJ-^j.ednoduchá-·-(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 64:
Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 65:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU:'vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 65:
Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu I 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 66:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (Ď? TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 66:
Leu Tyr Pro Gly Arg Arg Asp Lys Gin 1 5 i 5 a β' • 5 ϊ
Β · ·Β .(2) INFORMACE Ο SEKVENCI S ID. Č. 67:
'0 a Ί • ♦' ·« ··», » B
B · ·
B* »* (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina .(C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární fc (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 67.;
Tyr Asp Ile Ala Lys Ile Ser Gin His 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 68:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) . DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 68:
Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr 1 5
444 * · · * 4 ▼ v v ▼ • 4· · · • 4« · 4 · · · 44 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 69:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin . (B) TYP: aminokyselina ' (CÍ VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) .TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 69;
Phe.Ile Ser Ile Met'Thr Tyr Asp Phe 1 5 (2) INFORMACE.O SEKVENCI S ID. Č. 70:
(i)· CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: .
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina _______(C) VLÁKNITOST: jednoduchá__ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 70:
Phe Arg Gly Gin Glu Asp Ala Ser Pro 1 5 to ··« · · · · ·· fc V· · to · ·· to to · t · toto to to · (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 71:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ,· (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 71:
Tyr Ala Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 72:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (-D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 72:
Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser 1 5 *5 i « ··* • · • i ·
- 66 - ·»'···· ,9 * · · » ’ « 9 9'· 9' 9 9
9. · «99 9 9.
9 9 9 9
999 9999 99 ·· (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 73:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
• (A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina t CjVLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární * · 1 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 73:
Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 74: i · 1 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE': ί í
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá ------(D)— TOPOLOGIET”lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 74:
Leu Arg Gly Ala Thr Val His Arg Thr 1 5 . *' . v * • ·· ·«« · · ·· ♦ · (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 75:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: ú
...... i (A) DÉLKA: 9 aminokyselin j í
(B) TYP: aminokyselina ' (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární ••1 . ' (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní ' i
(xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 75:
Tyr Leu Lys Asp Arg Gin Leu Ala Gly 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 76:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá ___ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid
I (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 76: I
Leu Ala Gly Ala Met Val Trp Ala Leu I
I *·· * · ·''-·*·.
• « * · · · ·99 · 9 • t> »' ·;« · · ·
- 68 - ·»··*· ...........
(2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 77:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 77:
Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe 1.5 (2) INFORMACE O SEKVENCI S ID. Č. 78:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNITOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární__———(ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. s id. č. 78:
Leu Asp Leu Asp Asp- Phe Gin Gly Ser

Claims (9)

1. Peptidy, sestávající z .16 až. 55. aminokyselinových zbytků, vyznačující se tím, že uvedený peptid zahrnuje alespoň jednu z aminokyselinových sekvencí LVCYYTSWS (sekvence s identifikačním číslem. 60), FLCTHIIYS (sekvence s id. č. 61), IIYSFANIS (sekvence s id. č. 62), LKTLLSVGG (sekvence s.id. č. 63), FIKSVPPFL (sekvence s id. č. 64), FDGLDLAWL (sekvence s id. č. 65), LYPGRRDKQ (sekvence s id. č. 66), YDIAKISQH (sekvence S id. č. 67), LDFISIMTY (sekvence s id. č. 68), 'FISIMTYDF (sekvence s ,id. č. 69), FRGQEDASP (sekvence s id. č. 70), YAVGYMLRL (sekvence s id. č. 71), MLRLGAPAS (sekvence s id. č. 72), LAYYEICDF (sekvence s id. č. 73), LRGATVHRT (sekvence s id. č. 74), YLKDRQLAG (sekvence s id. č. 75), LAGAMVWAL (sekvence s id. č. 76), VWALDLDDF (sekvence s id. č. .77) nebo LDLDDFQGS (sekvence s id. č. 78).
2. Peptidy sestávající z 16 až 55 aminokyselinových zbytků, vyznačující se tím, že uvedený peptid zahrnuje alespoň jednu z aminokyselinových sekvencí YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence s id. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id, č. 2), LDRFLCTHIIYSFANI (sekvence s id, č.
5), THIIYSFANISNDHID (sekvence S id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. 12), NTQSRRTFIKSVPPFL (sekvence s id. č. 16), TFIKSVPPFLRTHGFD (sekvence s id. č. 17), PPFLRTHGFDGLDLAW (sekvence s id. č. 18), HGFDGLDLAWLYPGRR (sekvence s id. č. 19), DLAWLYPGRRDKQHFT (sekvence s id. č. 20), TIDSSYDIAKISQHLD (sekvence s id. č. 28), DIAKISQHLDFISIMT (sekvence s id. č. 29), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence s id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č.
34),
DYAVGYMLŘLGAPASK (sekvence s id. č.
37), a a. · a a *a a a a a a a a a a
MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. č. 38), PASKLVMGIPTFGRSF (sekvence s id. č. 39), GTLAYYEICDFLRGAT (sekvence s id, č. 46), EICDFLRGATVHRTLG (sekvence s . id. č. 47), RGATVHRTLGQQVPYA (sekvence s id. č. 48)VKSKVQYLKDRQLAGA (sekvence s id. č. 53), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54), LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s . id. č. 55), WALDLDDFQGSFCGQD (sekvence s id. č. 56)': nebo . DFQGSFCGQDLRFPLT (sekvence s id. č. 57) .
% j*
3. Peptidy podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í ni, že uvedený peptid zahrnuje alespoň jednu z aminokyselinových sekvencí YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence s id. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2),
LDRFLCTHIIYSFANI (sekvence s id. č. 5), THIIYSFANISNDHID (sekvence s id. č,· 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence s id. č. 12), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvence s id. č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34), DYAVGYMLRLGAPASK (sekvence s id. č. 37), MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. Č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s id. č. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55) .
4. Peptidy podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, v y z n a-č-u~3—ί-c—í--s-e—t—i—m—,—že-u-vedený-pepti-d—zahrnuje—ad-espoňjednu z aminokyselinových sekvencí YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence
K s id. č. 2), SPLFRGQEDASPDRFS (sekvence s id. č. 34),
MLRLGAPASKLVMGIP (sekvence s id. Č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD »
(sekvence s id. c. 54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55).
5. Hexadekapeptid podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že uvedený hexadekapeptid obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencí YKLVCYYTSWSQYREG (sekvence
-.71 s iď. č. 1), YTSWSQYREGDGSCFP (sekvence s id. č. 2), LDRFLCTHIIYŠFANI (sekvence , s id. Č. 5), THIIYSFANISNDHID (sekvence s id. č. 6), PNLKTLLSVGGWNFGS (sekvence. s id. č. 12), QHLDFISIMTYDFHGA (sekvéričě s iď. . č. 30), SPLFRGQEDASPDRFS .(sekvence s iď. č. . 34) , .· DYAVGYMLRLGAPASK (sekvence^ id. č. .37), .MLRLGAPASKLVMGIP _(sekvence s id. č. 38), YLKDRQLAGAMVWALD (sekvence s ./id. č. .54) nebo LAGAMVWALDLDDFQG (sekvence s id. č. 55).
6. Peptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 5. pro použití jako léčebná látka.
7. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více peptidu.:podle kteréhokoli z nároků 1až 5 a farmaceuticky přijatelný nosič.
8. Diagnostický postup k detegování aktivovaných autoreaktivních T buněk, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky: a) isolaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) z krevního vzorku testovaného1 jedince, b) kultivaci těchto PBMC ve vhodných podmínkách, c) inkubaci kultury těchto PBMC v přítomnosti jednoho nebo více peptidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, a d) detegování odpovědi T buněk, například proliferativní odpovědi, ukazující na přítomnost aktivovaných autoreaktivních T buněk u testovaného jedince.
9. Testovací sada pro detegování aktivovaných autoreaktivních T buněk, vyzná u j í c i s e tím, že tato testovací sada zahrnuje jeden či více peptidů podle kteréhokoli z nároků l.až 5.
CZ983406A 1996-04-24 1997-04-22 Peptidy, farmaceutický prostředek a testovací sada s jejich obsahem a diagnostický postup, využívající tyto peptidy CZ340698A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96201106 1996-04-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ340698A3 true CZ340698A3 (cs) 1999-02-17

Family

ID=8223915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ983406A CZ340698A3 (cs) 1996-04-24 1997-04-22 Peptidy, farmaceutický prostředek a testovací sada s jejich obsahem a diagnostický postup, využívající tyto peptidy

Country Status (20)

Country Link
US (1) US6184204B1 (cs)
EP (1) EP0920451A1 (cs)
JP (1) JP2000510106A (cs)
KR (1) KR20000010561A (cs)
CN (1) CN1216551A (cs)
AR (1) AR006813A1 (cs)
AU (1) AU719481B2 (cs)
BR (1) BR9708744A (cs)
CA (1) CA2251680A1 (cs)
CZ (1) CZ340698A3 (cs)
HU (1) HUP9901375A3 (cs)
IL (1) IL120561A0 (cs)
NO (1) NO984937L (cs)
NZ (1) NZ332427A (cs)
PL (1) PL329618A1 (cs)
RU (1) RU2199548C2 (cs)
TR (1) TR199802135T2 (cs)
TW (1) TW575583B (cs)
WO (1) WO1997040068A1 (cs)
ZA (1) ZA973071B (cs)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9912378A (pt) 1998-07-23 2001-04-17 Akzo Nobel Nv Peptìdeo, composição farmacêutica, uso de um ou mais dos peptìdeos, e, composição para diagnóstico.
BR0014803A (pt) * 1999-10-18 2002-06-11 Akzo Nobel Nv Peptìdeo, composição farmacêutica, uso de um ou mais dos peptìdeos, e, composição de diagnóstico
IL132611A0 (en) 1999-10-27 2001-03-19 Yeda Res & Dev Synthetic genes and polypeptides and pharmaceutical compositions comprising them
MXPA03001421A (es) 2000-08-14 2004-01-26 Johnson & Johnson Pirazoles sustituidos.
US7002985B2 (en) * 2001-01-16 2006-02-21 Motorola, Inc. Method and apparatus for organizing and scheduling multimedia data transfers over a wireless channel
US7902143B2 (en) * 2004-12-07 2011-03-08 Toray Industries, Inc. Cancer antigen peptide and the use thereof
DE602006019205D1 (de) * 2005-02-28 2011-02-10 Bio Y As Monoklonale ykl-40-antikörper
FR2908654B1 (fr) * 2006-11-20 2014-04-04 Oreal Utilisation cosmetique de proteines de type chitinase
ES2536465T3 (es) * 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres
RU2008140688A (ru) * 2008-10-15 2010-04-20 Михаил Аркадьевич Шурдов (RU) Иммуносупрессивный пептид
WO2010142041A1 (en) 2009-06-11 2010-12-16 The University Of Guelph Serine rich peptides having antioxidative stress properties
CA2779161A1 (en) 2009-10-28 2011-05-05 University Of Manitoba Yellow pea seed protein-derived peptides
EP2576597A4 (en) 2010-05-31 2013-11-06 London Health Sci Ct Res Inc HYALURONIC ACID MEDIATED MOTILITY RECEPTOR BINDING PEPTIDES (RHAMM)
EP3565596A4 (en) 2017-01-05 2020-12-16 Brown University PROCESSES AND COMPOSITIONS RELATING TO ANTI-CHI3LI ANTIBODY REAGENTS
US10766968B2 (en) 2017-08-23 2020-09-08 Brown University Methods and compositions relating to anti-CHI3L1 antibody reagents to treat cancer

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2164498C (en) * 1993-07-09 2007-09-11 Paul A. Price Assay for ykl-40 as a marker for degradation of mammalian connective tissue matrices
IL115744A (en) 1994-10-27 2000-07-16 Akzo Nobel Nv Peptides comprising a subsequence of human cartilage glycoprotein - 39

Also Published As

Publication number Publication date
NO984937L (no) 1998-12-01
EP0920451A1 (en) 1999-06-09
NO984937D0 (no) 1998-10-23
AU2768597A (en) 1997-11-12
IL120561A0 (en) 1997-07-13
HUP9901375A2 (hu) 1999-08-30
NZ332427A (en) 2000-03-27
HUP9901375A3 (en) 2000-10-30
RU2199548C2 (ru) 2003-02-27
AR006813A1 (es) 1999-09-29
TR199802135T2 (xx) 1999-01-18
CN1216551A (zh) 1999-05-12
US6184204B1 (en) 2001-02-06
CA2251680A1 (en) 1997-10-30
BR9708744A (pt) 1999-08-03
KR20000010561A (ko) 2000-02-15
PL329618A1 (en) 1999-03-29
JP2000510106A (ja) 2000-08-08
AU719481B2 (en) 2000-05-11
ZA973071B (en) 1998-08-05
TW575583B (en) 2004-02-11
WO1997040068A1 (en) 1997-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050202034A1 (en) Identification of self and non-self antigens implicated in autoimmune diseases
CZ340698A3 (cs) Peptidy, farmaceutický prostředek a testovací sada s jejich obsahem a diagnostický postup, využívající tyto peptidy
KR100485979B1 (ko) 자가면역질병의 면역치료에 사용하기 위한 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드
FI118373B (fi) Peptidin p277 analogeja ja niitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia diabeteksen hoitamiseksi ja diagnosoimiseksi
AU3173199A (en) Novel peptides for the treatment, prophylaxis, diagnosis and monitoring of autoimmune diseases
WO1996012737A9 (en) Compositions and treatment for multiple sclerosis
EP0787147A1 (en) Compositions and treatment for multiple sclerosis
JP5999703B2 (ja) ＨＬＡ−ＤＲ１拘束性Ｔａｘ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ
RU2233290C2 (ru) Новые пептиды для применения в иммунотерапии аутоиммунных заболеваний
PL185258B1 (pl) Nowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów
US6881824B1 (en) Peptides suitable for use in antigen specific immunosuppressive therapy
US20020177554A1 (en) Novel peptides for use in treatment of T-cell mediated cartilage destruction in autoimmune diseases
MXPA98008866A (en) Novedosos peptidos suitable for use in antig specific immunosuppressive therapy
MXPA01000789A (en) Novel peptides for use in immunotherapy of autoimmune diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic