KR100485979B1 - 자가면역질병의 면역치료에 사용하기 위한 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드 - Google Patents

자가면역질병의 면역치료에 사용하기 위한 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR100485979B1
KR100485979B1 KR1019960702711A KR19960702711A KR100485979B1 KR 100485979 B1 KR100485979 B1 KR 100485979B1 KR 1019960702711 A KR1019960702711 A KR 1019960702711A KR 19960702711 A KR19960702711 A KR 19960702711A KR 100485979 B1 KR100485979 B1 KR 100485979B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
peptide
peptides
arthritis
cells
Prior art date
Application number
KR1019960702711A
Other languages
English (en)
Other versions
KR960705848A (ko
Inventor
마리아 헬레나 부츠 안나
프란시스쿠스 마리아 베르하이덴 기스베르투스
Original Assignee
악조 노벨 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 악조 노벨 엔.브이. filed Critical 악조 노벨 엔.브이.
Publication of KR960705848A publication Critical patent/KR960705848A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100485979B1 publication Critical patent/KR100485979B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 아미노산 서열 FGRSFTLAS(서열 번호 1), FTLASSETG(서열 번호 2), YDDQQESSVKS(서열 번호 3) 및 FSKIASNTQ(서열 번호 4) 중에서 하나 이상의 서열을 포함하는, 자가항원 HC gp-39로부터 유도된 신규한 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는 관절 연골내의 자가항원 HC gp-39상에 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ 제한된 T-세포 에피토프와 유사하다. HC gp-39 및 상기 펩티드는 면역 시스템의 내성을 유도하는, 자가면역 질병에서 관절 연골 파괴의 항원-특이성 치료에 사용할 수 있다. 또한, 자가항원 HC gp-39 및 상기 펩티드는 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 생쥐에서 관절염을 유도하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 자가항원 및/또는 상기 펩티드을 포함하는 약학 조성물, 테스트 샘플 내에서 자가반응성 T-세포를 검출하는 진단 방법 및 상기 방법에 사용되는 테스트 키트에 관한 것이다.

Description

자가면역 질병의 면역 치료에 사용하기 위해 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드
본 발명은 신규한 자가항원 및 이로부터 유도된 펩티드, 자가면역 질병에서 관절 연골의 만성적인 파괴의 치료에 상기 펩티드를 사용하는 방법, 상기 펩티드를 함유하는 약학 조성물, 테스트 샘플 내에서 자가반응성 T 세포의 검출을 위한 진단 방법 및 상기 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
면역 시스템은 자가항원에 대한 내성을 구축하므로써 획득되는, 외래항원(비-자기항원)과 자가항원(자신의 신체에서 유도된 자기항원)을 구별함을 원칙으로 확립된다.
면역 시스템은 외래 항원으로부터 개체를 보호하며, T 및 B 임파구 같은 특이성 세포를 활성화하고, 인터루킨, 항체 및 보체 인자 같은 수용성 인자를 생성하므로써 외래 항원에 대한 노출에 대해 반응한다. 면역 시스템이 반응하는 항원은 항원 배출 세포(antigen presenting cells: APCs)에 의해 분해되며, 항원의 단편은 주로 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 Ⅱ 당단백질과 연합하는 세포 표면 상에서 발현된다. MHC-당단백질-항원-단편 복합체는 결합된 MHC 클래스 Ⅱ 단백질과 공동으로 항원 단편을 인식하는 T-세포 수용체에 의해 T-세포에 배출된다. T-세포는 활성화, 즉 번식하고, 또는 인터루킨을 생성하므로써 공격하에서 항원에 유도되는 활성화된 임파구를 발현한다[참조: Grey 등, Sci. Am., 261:38-46, 1989].
또한, 자기항원은 연속적으로 처리되고, MHC 당단백질에 의해 T-세포로 배출된다[참조:Jardetsky 등, Nature 353:326-329, 1991]. 따라서, 면역 시스템에서 자기 인식은 본질적인 것이다. 정상적인 환경하에서, 면역 시스템은 자기항원에 대해 내성적이며, 이들 자기항원에 의한 면역 반응의 활성화는 일어나지 않는다.
자기항원에 대한 내성이 상실되는 경우, 면역 시스템은 하나 이상의 자기항원에 대해 활성화되므로써 자가반응성 T-세포를 활성화시키고, 자가항체를 생성시킨다. 이 현상을 자가면역성이라 칭한다. 일반적으로 면역 반응이 파괴적이기 때문에, 즉 침입성 외래 항원을 파괴한다는 의미이기 때문에, 자가면역 반응은 자신의 신체 조직을 파괴할 수 있다.
자가면역 질병에 대한 T-세포의 역할은 다년간 연구되어 왔다. 생쥐를 이용하는 실험적인 자가면역 뇌막염(EAE)은 매우 제한된 그룹의 T-세포에 의해 중재되며, MHC 클래스 Ⅱ 분자에 복합되는 마이엘린 염기성 단백질(MBP)의 단일 에피토프에 대한 그들의 특이성과 연계되어 있다. 여러 가지 자가면역 질병에 대해 매우 민감한 루이스 쥐에서, 질병은 T-세포에 의해 중재되는 것으로 밝혀져 왔다. 또한, 인간에서, 자가면역 질병은 자가-공격성 T-세포의 발육과 연루되어 있다.
파괴적인 자가면역 반응은 다수의 활성화된 임파구 및 MHC 클래스 Ⅱ 발현 세포의 존재에 기인하는, 관절 연골의 완전성이 만성적인 염증성 과정에 의해 파괴되는 류마티스성 관절염(RA) 같은 여러 가지 질병과 관련되어 왔다. 연골이 단순히 존재한다는 것은 국부 염증성 반응을 유지하는데 필요한 것으로 보여지며; RA에서 연골 파괴는 연골-반응성 자가반응성 T-세포의 활성과 관련되어 있는 것으로 밝혀져 왔다[참조: Sigall 등, Clin. Exp. Rheumat. 6:59, 1988: Glant 등, Biochem. Soc. Trans. 18:796, 1990; Burmester 등, Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (Eds) Springer-Verrlag Berlin Heidelberg, 1992]. 또한, RA 환자로부터 수술로 연골을 제거하는 것은 염증의 진행을 감소시키는 것으로 밝혀졌다[참조: G.S. Panayi 등, Clin. Exp. Rheumatol. 11(suppl. 8): S1-S8, 1993]. 따라서, 연골 단백질은 T-세포를 자극하는 성분인 표적 자가항원으로 생각된다. 이들 자가반응성 T-세포의 활성화는 자가면역 질병의 진행을 초래한다.
연골의 파괴로 귀착되는 염증성 반응은 예를 들어 스테로이드 약제 같은 여러 약재로 치료할 수 있다. 그러나, 이들 약제는 비특이성이고, 독성 부작용을 가진 면역억제제이다. 비특이성 면역억제의 단점은 치료를 매우 부적절하게 만든다는 것이다.
항원-특이성, 비독성 면역억제 치료법은 비특이성 면역억제에 대한 매우 효과적인 대안이다. 이 항원-특이성 치료법은 표적 자가항원 또는 상기 자가항원으로부터 유도된 합성 T-세포-반응성 펩티드로 치료하는 것을 포함한다. 이들 합성 펩티드는 자가항원의 T-세포 에피토프에 대응하며, 그들 자신 및 자가항원 둘 다에 대한 특이성 T-세포 내성을 유도하는데 사용할 수 있다. 면역 시스템을 활성화시키는 항원과 매우 동일한 항원을 이용하여 면역 시스템의 민감성을 저하시키는 것이 역설같아 보이지만, 표적 (자가)항원의 조절된 투여는 면역 시스템의 민감성 저하에 매우 효과적일 수 있다.
T-세포 중재된 연골 파괴를 치료하기 위한 내성 치료법을 효과적으로 사용하기 위해, 확실한 자가항원을 동정하는 것과 염증 과정의 원인인 T-세포를 활성화시키는 자가항원에 대해 환자를 탈감각시킬 수 있는 T-세포-반응성 펩티드를 발견하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적은 T-세포 중재된 연골 파괴로 고생하는 환자에서 확실한 연골항원에 대한 특이성 T 세포 내성을 유도할 수 있는 자가항원 및 상기 자가항원으로부터 유도된 T-세포 반응성 펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 관절 연골의 파괴에 관련된 자가반응성 T-세포를 검출하는 방법 및 이 방법에 사용되는 테스트 키트를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 인간 연골 당단백질 39(이하 HC gp-39)이 RA 환자의 특이성 T-세포를 활성화시키며, 따라서 염증 과정을 촉발 또는 중재하는 표적 자가항원임을 발견하였다. HC gp-39 유도된 펩티드는 RA 환자의 자가반응성 T-세포에 의해 현저히 인식되나, 건강한 공여자의 T-세포에 의해서는 거의 인식되지 않는데, 이는 HC gp-39가 RA에서 자가항원임을 나타낸다. 또한, HC gp-39의 관절염 생성 특성은 Balb/c 생쥐에서 추가로 구체화하였다. 상기 단백질을 Balb/c 생쥐에게 단일 피하주사하는 것은 상기 동물에서 관절염의 징후를 개시할 수 있었다. HC gp-39-유도된 질병의 과정은 앞발 및/또는 뒷발에서 주기적으로 발생하는 병의 재발 및 양성 관절염에서 악성 관절염으로 점진적으로 진행됨을 특징으로 한다. 또한, 아픈 관절의 대칭 분포가 관찰되며, 관절염, 특히 RA에서 질병의 진행에 대한 징후로서 주기적인 재발 및 마디 형성이 동시에 관찰된다.
더욱 놀라운 것은 HC gp-39의 투여가 면역학적 내성으로 귀착된다는 것이며, 더 중요한 것은 관절염의 진행이 지연 및/또는 억제된다는 것이다.
HC gp-39는 환자 및 건강한 성인의 혈청내에 존재하는데, 상기 단백질의 혈청 농도는 건강한 성인에서 보다 환자의 혈청에서 약 2배 크다. 또한, HC gp-39를 암호화하는 mRNA는 RA 환자로부터 수득한 활막편 또는 연골에서 발견할 수 있는 반면, 수술로 얻은 건강한 성인의 연골은 상당량의 mRNA를 포함하지 않는다. 관절 콘드로사이트 및 활막 세포를 배양하는 경우, 그들의 주 분비 생성물은 HC gp-39이다[참조: Hakala 등, J. Biol. Chem., Vol. 268, 34:25803, 1993]. HC gp-39의 관절염 생성 특성은 Hakala 등의 문헌 또는 기타 문헌에 제시되거나 기술된 바 없다.
본 발명의 추가의 목적은 자가항원 HC gp-39의 부분서열을 함유하는 펩티드에 의해 달성되는데, 상기 펩티드는 아미노산 서열 FGRSFTLAS(서열 번호 1), FTLASSETG(서열 번호 2), YDDQESVKS(서열 번호 3) 및 FSKIASNTQ(서열 번호 4) 중에서 하나 이상의 서열을 포함함를 특징으로 한다.
더 구체적으로, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 PTFGRSFTLASSE(서열 번호 5), RSFTLASSETGVG(서열 번호 6), VGYDDQESVKSKV(서열 번호 7) 및 SQRFSKIASNTQSR(서열 번호 8)중 하나 이상의 서열을 포함한다.
"서열"은 "일부분"을 정의하는 것이며, 전체 단백질을 포함하는 것으로 이해해서는 아니된다. 본 발명의 펩티드는 9-55개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 보유하는 것이 바람직하다. 본 발명의 펩티드는 9-35개, 특히 9-25개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 보유하는 것이 더 바람직하다. 본 발명의 펩티드는 9-15개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 보유하는 것이 더욱 더 바람직하다. 본 발명의 펩티드는 13 또는 14개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 5-8에 제시한 아미노산 서열 같은 아미노산 서열을 보유하는 것이 매우 바람직하다.
단량체 서열이 스폐이서 잔기에 의해 임의로 분리될 수 있는, 이량체 또는 삼량체 같은 본 발명에 따른 펩티드의 다량체도 본 발명의 범위내에 있다. 이러한 다량체는 서열 번호 1-8에 제시한 다수의 T- 세포 에피토프를 제공한다.
본 발명에 따른 펩티드에서, 서열 번호 1-8에 제시한 아미노산 서열은 HC gp-39 단백질 또는 기타 단백질의 아미노산 서열내의 상응하는 아미노산의 천연 측면 위치에 대응할 수 있는 측면 부위에 의해 측면에 위치할 수 있다. 대안으로 상기 측면 부위는 무작위 아미노산 잔기로 구성되는 비천연 아미노산 서열일 수 있다. 이들 비천연 측면 위치는 상기 펩티드를 안정화시킬 수 있으며, 따라서 그들의 생물학적 유용성이 증가된다. 본 발명에 따른 펩티드의 생물학적 유용성을 증가시키기 위해 비천연 측면 위치가 바람직하다.
서열 번호 1-4, 구체적으로 서열 번호 5-8에 제시한 아미노산 서열은 HC gp-39 상에 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ 제한된 T- 세포 에피토프와 유사하다. HC gp-39 상에 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ 제한된 T- 세포 에피토프 HC gp-39의 아미노산 서열의 103-116, 259-271, 263-275 및 326-338 부위에 의해 표시된다(시그날 서열의 매티오닝으로부터 시작함, 참조:Hakala 등 1993). 따라서, 본 발명에 따른 펩티드는 확인된 MHC 클래스 Ⅱ 제한된 T- 세포 에피토프중 하나 이상을 함유하는 자가항원 HC gp-39의 단편을 함유하는 것으로 이해할 수 있으며, 그들도 본 발명의 일부이다.
본 발명에 따른 펩티드는 T-세포 반응성 펩티드이다. 이 펩티드는 활성화된 자가반응성 T-세포에 의해 인식되며, 활성화된 자가반응성 T-세포를 자극할 수 있다. 이들 자가반응성 T- 세포는 RA 환자의 혈액에서 발견되나, 건강한 공여자의 혈액에서는 발견되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 표적 자가항원 HC gp-39 상에 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ 제한된 T- 세포 에피토프와 유사한 HC gp-39 단백질 또는 합성 펩티드는 관절염, 구체적으로 류마티스성 관절염 같은 T-세포 중재된 연골 파괴로 고생하는 환자에게 HC gp-39에 대한 특이적인 T-세포 내성을 유도하는 치료법에 사용하는데 매우 적합하다.
WO 95/01995 및 WO 95/02188 은 RA 용 마커로서 HC gp-39의 진단적 용도를 기술하고 있으나, HC gp-39의 관절염 생성 특성은 개시 또는 제안된 바 없다. 이들은 항원 또는 펩티드 특이성 치료법에서 공격하에 연골에서 HC gp-39에 대한 T-세포 특이 내성을 유도하기 위해 본 발명에 따른 HC gp-39, 이의 단편 또는 T-세포 반응성 펩티드의 용도를 암시 또는 제안하고 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 펩티드 합성을 위해 공지된 유기 화학적 방법중 하나를 이용하여 제조할 수 있다. HC gp-39 및 펩티드는 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조할 수도 있다.
펩티드 합성을 위한 유기 화학적 방법은 균일상 또는 소위 고체상에서 축합 반응에 의해 필요한 아미노산을 결합함을 포함하는 것이라고 생각된다.
축합 반응은 하기와 같이 수행할 수 있다.
(a) 축합제의 존재하에서, 유리 카르복실기 및 보호된 기타 반응성 기를 가진 화합물(아미노산, 펩티드)과 유리 아미노기 및 보호된 기타 반응성 기를 가진 화합물(아미노산, 펩티드)의 축합 반응;
(b) 활성화된 카르복실기와 유리 또는 보호된 기타 반응기를 가진 화합물(아미노산, 펩티드)과 유리 아미노기 및 유리 또는 보호된 기타 반응성 기를 가진 화합물(아미노산, 펩티드)의 축합 반응.
카르복실기의 활성화는 특히 카르복실기를 산 할라이드, 아지드, 안하이드라이드, 이미다졸리드 또는 N-히드록시-석신이미드, N-히드록시-벤조트리아졸, p-니트로페닐 에스테르, N-히드록시-벤조트리아졸 에스테르 또는 펜타플로오로페놀 에스테르 같은 활성화된 에스테르로 전환하므로써 수행할 수 있다.
상기 응축 반응을 위한 가장 통상적인 방법은 카르보디이미드법, 아지드법, 혼합된 안하이드라이드법 및 문헌[참조: The Peptides, Analysis, Biology Vol. 1-3 (Ed. Gross, E. 및 Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (아카데믹 프레스 인코오포레이티드)]에 기술된 바와 같은 활성화된 에스테르를 이용하는 방법이다.
"고체상"을 이용하여 본 발명에 따른 상기한 펩티드의 적합한 단편의 제조는 예를 들어 문헌[참조: J. Amer. Chem. Soc. 85:2149(1963) 및 Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161-214 (1990)]에 기술되어 있다. 제조하려는 펩티드의 아미노산의 결합은 통상 카르복실 단부로부터 시작한다. 이 방법을 위해 고체상은 반응성 기가 있는 것이나, 그러한 기를 도입할 수 있는 것이 필요하다. 예를 들어, 벤젠과 반응성 클로로메틸기를 가진 디비닐벤젠의 공중합체 또는 히드록시메틸 또는 아민 작용기와 반응성이 되도록한 중합성 고체상을 사용할 수 있다.
특히 바람직한 고체상은 예를 들어, 문헌[참조: Wang J. Am. Chem. Soc. 95:1328 (1974)]에 기술된 p-알콕시벤질 알콜 수지(4-히드록시-메틸-페녹시-메틸-공폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지)이다. 합성후, 상기 펩티드는 온화한 조건하에서 고체상으로부터 분리할 수 있다.
바람직한 아미노산 서열의 합성 후에, 수지로부터 예를 들어, 스캐빈져, 예를 들어 트리이소프로필 실란, 아니솔 또는 에탄디티올, 티오아니솔을 함유하는 트리플루오로아세트산을 이용하여 상기 수지로부터 펩티드를 분리한다.
축합 반응에 참여하지 않는 반응성 기는 산, 염기를 이용하는 가수분해 또는 환원에 의해 매우 용이하게 제거될 수 있는 기에 의해 효과적으로 보호된다. 따라서, 카르복실기는 예를 들어, 고체 지지체에 연결된 메탄올, 에탄올, 3차 부탄올, 벤질 알콜 또는 p-니트로벤질 알콜 및 아민을 이용하는 에스테르화에 의해 효과적으로 보호할 수 있다.
아미노기를 효과적으로 보호할 수 있는 기는 에톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, t-부톡시-카르보닐(t-boc) 또는 p-메톡시-벤질옥시카르보닐기 또는 벤젠-설포닐 또는 p-톨루엔-설포닐기 같은 설폰산으로부터 유도되는 산기(acid group)이나, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 아르알킬기, 예를 들어 벤질 및 트리페닐메틸, 또는 오르토-니트로페닐-설페닐 및 2-벤조일-1-메틸-비닐같은 기를 사용할 수 있다. 특히 바람직한 α-아미노-보호기는 예를 들어, 염기-민감성 9-플루오레닐-메톡시카르보닐(Fmoc)기이다[참조: Carpino & Han J. Amer. Chem. Soc. 92:5748 (1970)].
더 넓은 범위의 가능한 보호기는 문헌[참조: The Peptides, Analysis, Biology Vol. 1-3 (Ed. Gross, Udenfriend 및 Meienhofer) 1979-1987(아카데믹 프레스 인코오포레이티드)]에서 발견할 수 있다.
보호기는 특정기의 성질에 따라 통상적인 여러 가지 방법, 예를 들어 트리플루오로아세트산을 이용하는 방법 또는 수소 및 팔라듐 같은 촉매, 또는 빙초산 내의 HBr을 이용하는 온화한 조건의 환원에 의해 분리할 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 HC gp-39 및 펩티드는 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따른 HC gp-39 또는 펩티드 또는 상기 펩티드의 다량체를 암호화하는 핵산 서열을 발현 벡터 내로 삽입한다. 적합한 발현 벡터는 복제 및 발현을 위해 필요한 조절 부위를 포함하는 플라즈미드, 코즈미드, 비루스 및 YAC's(효모 인공 크로모좀)중 하나이다. 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 발현할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 예를 들어, 박테리아, 효모 세포 및 포유동물 세포이다. 이러한 기법은 당업계에 공지되어 있다[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989].
면역 시스템을 활성화시키는 항원과 매우 동일한 항원을 이용하여 면역 시스템의 민감성을 저하시키는 것이 역설같아 보이지만, HC gp-39의 부분서열을 함유하는 HC gp-39 및/또는 펩티드의 조절된 투여는 표적 (자가)항원의 조절된 투여는 면역 시스템의 민감성 저하에 매우 효과적일 수 있다. 본 발명에 따라, 연골이 자가반응성 T-세포에 의해 공격받고 있는 환자는 본 발명에 따른 HC gp-39, 또는 하나 이상의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로 치료하여, 공격받는 연골내에 HC gp-39 및 서열 번호 1-8에 제시한 아미노산 서열중 하나를 보유하는 확인된 T-세포 에피토프를 보유하는 기타 자기 항원에 대해 내성적인 이들 환자의 특이 자가반응성 T-세포를 제조하고, 염증성 반응을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 매우 적합한 펩티드는 서열 번호 5-8에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 펩티드이다.
또한, 본 발명에 따른 조성물에 사용하기 매우 적합한 것은 HC gp-39 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드를 암호화하는 DNA (발현) 벡터이다. 일단 전달되면, DNA (발현) 벡터는 발현에 의해 HC gp-39 또는 펩티드를 함유하는 약학 조성물의 직접 투여에 의해 획득되는 수준과 유사한 수준으로 본 발명에 따른 재조합 HC gp-39 또는 펩티드를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 자가항원 및 펩티드는 면역억제성 스테로이드 제제의 비특이성 억제 효과와 비교하는 경우, 자가반응성 T-세포에 대한 특이성 내성화 효과를 보유하는 잇점을 가지므로, 완전한 면역 시스템의 기타 성분을 이탈시킨다. 본 발명에 따른 자가항원 및 펩티드는 안전할 것이며, 부작용으로 나타나는 독성도 발생하지 않을 것이다.
내성은 본 발명에 따른 자가항원 및 펩티드를 다량 또는 소량 투여하면 나타날 수 있다. 자가항원 또는 펩티드의 양은 투여 경로, 투여 시간, 환자의 연령 뿐만 아니라 일반적인 건강 상태와 식사등에 의존할 것이다.
일반적으로, 체중 1 kg당 펩티드 또는 단백질 0.01 내지 1000 ㎍, 바람직하게는 체중 1 kg당 펩티드 또는 단백질 0.5 내지 500 ㎍, 더 바람직하게는 체중 1 kg당 펩티드 또는 단백질 0.1 내지 100 ㎍의 투여량이 사용될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 멸균염수, 락토오즈, 수크로오즈, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트린, 한천, 펙틴, 땅콩기름, 올리브유, 참기름 및 물을 포함한다. 기타 담체는 예를 들어, MHC 클래스 Ⅱ 분자, 바람직하게는 리포좀에 매립된 것을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 적합한 보조제는 기타의 것들 중에서 알루미늄 히드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 암피겐, 토코페놀, 모노포스페닐 리피드 A, 무라밀 디펩티드 및 퀼 A 같은 사포닌을 포함한다. 보조제의 양은 보조제 자체의 성질에 따라 결정된다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 안정제, 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오즈덱스트린 및 글루코오즈를 포함하는 탄수화물, 알부민 또는 카제인 같은 단백질 및 알칼린 포스페이트 같은 완충액을 포함할 수 있다.
적절한 투여 경로는 근육내 주사, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 복강내 주사, 경구 및 비강내 투여이다. 경구 및 비강내 투여가 바람직한 투여 경로이다.
관절염생성 특성 때문에, 본 발명에 따른 HC gp-39 또는 펩티드는 인간을 제외한 포유동물에서 임상적 관절염을 유도하는데 사용할 수 있다. HC gp-39 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드를 소량 투여하면, 상기 포유동물에서 관절염의 징후가 발생할 것이며, 관절염, 구체적으로 류마티스성 관절염에서 질병 진행의 질병 패턴 회사으로 귀착될 것이다. Balb/c 생쥐에게 HC gp-39 단백질을 피하 투여하는 경우, 상기 동물은 관절염의 징후를 나타낸다. HC gp-39-유도된 질병의 과정은 앞발 및/또는 뒷발에서 주기적으로 발생하는 병의 재발 및 심하지 않은 관절염에서 심한 형태로 점진적으로 진행됨을 특징으로 한다. 또한, 아픈 관절의 대칭 분포가 관찰되며, 관절염 특히 RA에서 질병의 진행에 대한 징후로서 주기적인 재발 및 마디 형성이 동시에 관찰된다.
따라서, 이들 아픈 동물들은 관절염 발생의 개시 및 진행을 수행하는 메카니즘 연구를 위한 적합한 동물 모델을 제공한다. 또한, 상기 아픈 동물들은 관절염 치료를 위한 새로운 약제의 개발 및 관절염 발생에 대한 이들 약제의 효과 연구를 위해 사용할 수 있다. 관절염, 특히 류마티스성 관절염에 대한 동물 모델에 사용하기 적합한 것은 생쥐이다.
상기 포유동물에서 관절염을 유도하기 위해, HC gp-39 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 적합한 양을 투여하여야 한다. 적합한 양은 체중 1 kg당 0.1 내지 1000 ㎍, 바람직하게는 체중 1 kg당 1 내지 100 ㎍, 더 바람직하게는 체중 1 kg당 10 내지 50 ㎍이다. HC gp-39 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 양은 투여 경로, 투여 시간 및 사용된 동물의 형태에 따라 결정될 것이다. 적합한 투여 경로는 전술한 바와 동일하다. 관절염 유도 효과를 유발하기 위해, HC gp-39 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드는 전술한 하나 이상의 안정제 또는 보조제를 함유할 수 있다.
HC gp-39 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드는 관절 연골의 만성 염증에 관련되는 활성화된 자가반응성 T- 세포의 존재를 검출하기 위한 진단 방법에 매우 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 개체의 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하는 단계;
(b) 적합한 조건하에서 상기 PBMC를 배양하는 단계;
(c) 자가항원 또는 본 발명에 따라 유도된 하나 이상의 이의 유도체의 존재 하에서 상기 PBMC 배양물을 항온처리하는 단계: 및
(d) 개체에서 활성화된 자가반응성 T- 세포의 존재를 나타내는, T- 세포의 반응, 예를 들어 증식 반응을 검출하는 단계.
자가반응성 T-세포의 증식 반응을 측정하므로써 반응을 검출하는 경우, 예를 들어 3H-티미딘 같은 방사성 동위원소의 혼입을 증식을 위한 측정법으로 사용할 수 있다. PBMC내에 존재하는 자가반응성 T-세포의 반응은 시토킨 방출 또는 51크로뮴 방출을 이용하는 시토킨-특이성 ELISA로 세포독성을 측정하므로써 검출할 수 있다. 다른 검출 방법은 FACS 분석, 예를 들어 I1-2R에 의해 활성화 마커의 발현을 측정하는 방법이 있다. 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드와 적합한 검출제를 함유하는 진단 조성물은 본 발명의 일부를 형성한다. 검출 형태에 따라, 검출제는 방사성 동위원소, 효소, 또는 세포 표면 또는 활성화 마커에 특이성이 있는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명의 범위는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드를 함유하는 테스트 키트를 포함한다.
따라서, 본 발명은 HC gp-39에 대해 반응성이 있는 자가공격성 T-세포가 관절염, 특히 류마티스성 관절염 같은 T-세포 중재된 연골 파괴로 고생하는 환자에 존재 여부를 검출하기 위한 방법을 제공한다. HC gp-39-특이성 T- 세포가 존재하는 경우, HC gp-39 또는 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 조합물을 함유하는 약학 조성물로 이들 T-세포를 내성화(tolerization)하는 것은 관절염의 발생을 지연 또는 억제할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명을 제한하지 않는다.
도면의 간단한 설명
제 1 도는 HC gp-39 내성화한 Balb/c 생쥐 및 비-내성화한 Balb/c 생쥐에서 관절염의 개시 및 진행을 나타내는 도면이다. 감작화후 1 일당 아픈 동물의 총 관절염 수치는 앞발 및 뒷발 둘 다에 대해 나타냈다. 감작화후 1 일당 아픈 동물의 수도 나타냈다.
실시예 1
방법
환자
미합중국 류마티즘 협회(ARA) 기준[참조: Aanett 등, Arthritis Rheeum. 31:315, 1988]에 따라 RA로 진단된 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 채취하였다. RA 환자의 질병의 경중을 뢴트겐스코어로 결정한 바와 같이 Ⅰ - Ⅳ 단계로 구분하였다.
DR4Dw4(DRRB1*0401) 또는 DR1 특이성을 보유하는 건강한 공여자로부터 PBMC를 채취하여 대조용으로 사용하였다. 또한, 임의의 RA 관련된 DR 분자를 보유하지 않는 두명의 건강한 공여자로부터 PBMC를 채취하였다.
MHC 타이핑
환자 및 건강한 공여자 PBMC 크로모좀 DNA 추출물을 다이날 DR '저해상도' SSP 키트로 분석하였다. 다이날 DRB1*04-SSP 키트(네덜란드 왕국, 니메겐, 라드보드 하스피탈, 유니버시티 트랜스퓨젼 서비스)를 이용하여 DR4 서브타이핑을 수행하였다.
펩티드
본 발명에 따른 펩티드 및 대조용 펩티드는 고체상 펩티드 합성법으로 합성하였다. 간단히 설명하며, PEG-PS 상에서 Fmoc/tBu 보호된 활성화된 에스테르를 이용하는 밀리겐 9050 합성기로 유리 아미노- 및 카르복시 말단를 가진 펩티드를 제조하였다. 절단 및 탈보호후, 상기 펩티드를 분취용 HPLC로 정제하고, 도웩스 Ac-수지를 이용하여 아세트산 염 또는 클로라이드 염으로 전환하고, 동결건조 하였다. 상기 펩티드를 분광광도법으로 측정하였다. 본 연구에 사용한 펩티드는 표 1에 목록화하였다. N-말단이 비오티닐화된 인플루엔자 해마글루티닌 유도된 펩티드(서열 번호 9), 즉 세번째 잔기(Y)가 F로 대체된 비오틴-스페이서-IHA(307-319)F, 즉 (비오틴-NH-(CH2)5A-CO-PKFVKQNTLKLAT)는 DR4Dw4(DRB1*0401)를 이용하는 결합 연구에 마커 펩티드로 사용하였다. 서열 번호 9를 보유하는 비-비오티닐화된 펩티드 IHA(307-319)F는 대조용 펩티드로 사용하였다.
표 1: 합성된 펩티드의 아미노산 서열
펩티드 1-4 및 대조용 펩티드 IHA(307-319)의 아미노산 서열을 나타냈으며, 이는 각각의 서열 번호에 대응한다.
정제된 HLA-DR 분자의 생성을 위한 세포 배양
2 개의 EBV-형질전환된 B-세포주인 BSM(A2, B62, Cw2, DR4Dw4, DQ8, Dpw2) 및 BM92(A25, B51, Cw1, DR4Dw14, DQ8)은 네덜란드 왕국의 아카데믹 하스피탈 레이든으로부터 기증받았다. 상기 세포를 10% FCS(하이클론 레보래토리즈), 1% 비-필수 아미노산(ICI), L-글루타민, 2-ME 및 항생제로 보충된 DMEM/HAM's F12(미합중국, 뉴욕, 그랜드 아일랜드에 소재하는 지브코 레보래토리즈)에서 배양하였다. 세포는 2-3일 마다 1:2의 비로 계대배양하였다. 세포를 수확한 후, 1 mM PMSF를 함유하는 PBS(4℃)내에서 3회 세척하였다. 사용전에 세포 펠릿은 -70℃에서 저장하였다.
HLA-DR 분자의 친화성 정제
HLA-DR 분자는 DR-복합체상의 비다형체성 결정기에 대해 유도된 단일클론항체 L243(ATCC HB55)를 이용하여 세포 용해물로부터 친화성 정제하였다[참조: Lampson 등, J. Immunol. 125:293, 1980]. 단백질 G 세파로오즈 정제된 L243은 제조자의 지시에 따라 NSH-세파로오즈 4FF(파마시아)에 결합하였다.
HLA-DR 발현 세포는 해동하고, PBS, 1% NP-40, 1 mM AEBSF(칼바이오켐) 내에의 얼음상에서 30분 동안 용균시켰다. 용균물을 15000 rpm 에서 30분 동안 원심분리(소르발, SS34 로터)하여 세정하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 여과기를 통해 통과시키고, L243-NHS-세파로오즈 비드에 첨가하였다. 밤새 항온처리한 후, 비드를 컬럼에 이전하고, 5부피의 PBS, 1% NP-40; 5부피의 PBS, 0.5% NP-40; 15부피의 PBS, 0.5% NP-40, 0.1% SDS; 5부피의 PBS, 0.05% NP-40; 5부피의 PBS, 1% n-옥틸-글루코시드(미합중국, 세인트 루이스에 소재하는 시그마) 및 5부피의 50 mM 디에틸아민(플루카), 150 mM 염화나트륨, 1% n-옥틸-글루코시드(pH 8.0)으로 세척하였다. HLA-DA 분자는 50 mM 디에틸아민, 150 mM 염화나트륨, 1% n-옥틸- 글루코시드(pH 11.0)으로 희석하였다. 수접후 즉시, 상기 분획들을 2M 글리신 (pH 4.8)로 중화시켰다. 수집된 분획들은 비환원 조건에서 SDS-PAGE로 분석한 후, 실버 염색하였다. 정제된 HLA-DR를 함유하는 분획은 30 kD 차단막을 이용하여 한외여과로 농축하였다.
HLA-DR 펩티드 결합 분석
펩티드 결합 분석은 이전 문헌[참조: Joosten 등, INT. Immunol. 6:751, 1994]에 기술된 반-정량 분석법을 개선한 방법으로 수행하였다. 정제된 HLA-DR 분자(0.5-500 nM)는 최종 부피가 25 ㎕이고, pH가 5.0인 결합 완충액(PBS, 1 mM AEBSF, 1 mM N-에틸말레이미드, 8 mM EDTA, 10 μM 펩스타틴 A, 0.01% NaN3, 0.05% NP-40 및 5% DMSO) 내에서 50 nM 비오티닐화된 마커 펩티드(비오틴-스페이서-IHA(307-319)F)와 일정 농도 범위의 경쟁자 펩티드(펩티드 1-4 및 IHA(307-319)F)와 함께 배양하였다.
실온에서 약 45분 배양한 후, 결합 및 비결합 마커 펩티드를 SDS-PAGE를 수행한 후, 니트로셀룰로오즈 필터(바이오라드) 상에서 블로팅하거나, 니트로셀룰로오즈 필터(바이오라드)와 하이브리.도트 장치(비알엘)를 이용하는 진공 도트 블로팅으로 분리하였다. 0.1 M 말레산(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨 내에서 0.5% DNA 차단 시약으로 블로트를 차단하였다. 30분 후, 블로트를 PBS, 0.02% 트윈 20(미합중국, 세인트 루이스에 소재하는 시그마)내에서 세척하고, 스트렙타비딘-HRPO(서던 바이오테크놀로지)와 함께 각각 1:40000 또는 1:5000의 희석비로 배양하였다. DR-결합된, 비오티닐화된 마커 펩티드는 제조자의 지시에 따라 웨스턴 블로트 ECL 키트(영국, 아메르샴)을 이용하는 개선된 화학발광법으로 검출하였다. 기착색된 필름(하이퍼필름-ECL, 영국의 아메르샴)을 10분 동안 노출시켰다. 주어진 펩티드의 상대 결합 친화성은 마커 펩티드와의 경쟁에 관련되어 있었다. 이 상대 친화성은 신호가 50%로 감소하는 농도(RIC50)로 정의하였다.
SDS-PAGE의 경우, RIC50 값은 육안으로 결정하였다. 도트 블로트-스포트의 밀도는 컴퓨터의 지원을 받는 밀도계측기(미합중국의 몰레큘라 다이나믹스)와 이미지 트 및 엑셀 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
혈액 단핵 세포의 증식 반응
HC gp-39 내에서 펩티드 서열에 대한 T-세포 반응성을 확인하기 위해, 상기 펩티드 1-4를 RA 환자로부터 취한 PBMC내에서 증식 반응을 유도하는 능력에 대해 테스트하였으며, 건강한 DR1 또는 DR4를 대조용으로 사용하였다.
헤파린 처리한 정맥 말초 혈액으로부터 취한 PBMC를 피콜-파큐 구배상에서 표준 원심분리에 의해 분리하였다. 상기 세포는 바닥이 평평한 미량역가 평판내의 10% 열-불활성화한 자가조직 플라즈마, L-글루타민, 2-ME 및 항생제로 보충된 배지내에서 1.5 x 105 세포/웰의 농도로 3 또는 4배 배양하였다. 세포는 단독배지 또는 PHA(2.5 ㎍/ml) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 추출물(항원임을 상기할 것)(1 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml)을 포함하는 항원 또는 100 ㎍/ml, 25 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml를 함유하는 펩티드 1-4의 존재하에서 배양하였다. 배양액은 37℃에서 7일 동안 총 210 ㎕의 부피로 5% 이산화탄소로 가습된 대기하에서 배양하였다. 배양액은 0.25 μCi의 3H-티미딘으로 최종 18 시간 동안 충격을 주었다.
정의
테스트한 하나 이상의 펩티드로 농도 둘 다에 대해 반응하는 것으로 확인된 환자는 고 반응자(HR)로 분류하였고, 시험한 하나 이상의 펩티드중 하나 이상의 농도에 대해 반응하는 것으로 확인된 환자는 반응자(R)로 분류하였다. 결과적으로, 테스트한 임의의 펩티드에 대해 반응하지 않은 환자는 비반응자(NR)로 분류하였다.
제시한 펩티드의 상대 결합 친화성은 마커 펩티드와의 경쟁에 관련되어 있었다. 이 상대 친화성은 신호가 50%로 감소하는 농도(RIC50)로 정의하였다.
결과
펩티드 1-4에 대한 T-세포 반응성을 결정하기 위해, PBMC 증식성 반응을 RA 환자와 건강한 공여자에서 분석하였다.
지금까지, DR1, DR4Dw4, DR4Dw14 또는 DR10 특이성을 보유한 HC gp-36-유도된 펩티드에 대한 대부분의 HR 또는 R은 모두 RA의 발생 위험의 증가에 관련되어 있는 것으로 알려져있다. DR4Dw4 및 DR4Dw14에 대한 펩티드 1-4의 결합은 표 2에 나타낸 바와 같이 입증되었다.
표 2: HLA-DR 분자에 대한 펩티드 1-4의 결합
HLA-DR 분자에 대한 아미노산 서열 5-8을 각각 함유하는 펩티드 1-4의 결합.
펩티드 결합은 pH 5에서 마커 펩티드로서 50nM의 IHA(307-319)F를 이용하는 반정량적 결합 분석법(실시예 1의 방법에 기술함)으로 측정하였다. RIC50 의 값은 μM로 측정하였다(경쟁자 펩티드 없이 신호의 약 50%가 감소되는 경쟁자 펩티드의 농도). 펩티드 4를 제외한 모든 결과는 2개의 개별 실험(각각, SDS-PAGE 및 도트 블로트)으로부터 획득하였다.
대부분의 RA 환자는 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드에 반응하는 반면(표 3), 건강한 공여자 군에서는 거의 반응이 발견되지 않았다(표 4). 6명의 RA 환자는 테스트한 임의의 펩티드에 대해 반응하지 않는 것으로 확인되었다(결과는 도시하지 않음).
RA 환자에서 질병의 경중은 I-IV 단계로 구분하였다. 본 명세서에 제시한 뢴트겐 수치는 관절 파괴 정도의 산정치이다. 펩티드 1-4 에 대한 HR 및 R 은 질병의 모든 단계에서 발견되었다.
본 발명에 따른 펩티드는 자가반응성 T-세포 에피토프를 나타내며, 이들 에피토프에 대한 반응성은 주로 RA 환자에서 확인되나, 건강한 공여자에서는 확인되지 않았다. 따라서, RA 환자는 자가항원 HC gp-39에 유도된 활성화된 자가반응성 T-세포를 보유한다. 명백하게, 자가항원 HC gp-39는 T- 세포의 공격하에 있으며, 이 결과 연골에서 HC gp-39 항원의 염증 및 파괴가 초래된다.
표 3: 10% 자가조직성 혈청 내에서 측정된 펩티드 1-4에 대한 RA 환자로부터 취한 PBMC의 증식성 반응
각각 아미노산 서열 5-8을 가진 펩티드 1-4에 대한 RA 환자로부터 취한 PBMC의 증식성 반응.
결과는 자극 지수(SI) 값(=항원-특이성 cp5m(측정치의 평균)/대조용 cp5m(측정치의 평균)). Cp5m은 5분당 수를 나타낸다. 2 보다 크거나 같은 SI 값은 양성, 2 보다 작은 SI 값은 음성으로 간주한다. - 는 측정 평균의 표준 오차가 허용치를 능가함을 의미하며, 따라서 그 값은 나타나지 않았다. HR을 고 반응자(테스트한 펩티드 농도 둘 다에서 양성 반응)이며, R은 반응자(테스트한 펩티드 농도중 최고 농도에서 양성 반응함)이다. 소진은 거의 모든 연골이 사라졌음을 의미한다.
표 4: 10% 자가조직성 혈청 내에서 측정된 펩티드 1-4에 대한 건강한 공여자로부터 취한 PBMC의 증식성 반응
각각 아미노산 서열 5-8을 가진 펩티드 1-4에 대한 건강한 공여자로부터 취한 PBMC의 증식성 반응.
결과는 자극 지수(SI) 값(=항원-특이성 cp5m(측정치의 평균)/대조용 cp5m(측정치의 평균)). 2 보다 작은 SI 값은 음성으로 간주한다. R은 반응자(테스트한 펩티드 농도중 최고 농도에서 양성 반응함)이다. - 는 측정 평균의 표준 오차가 허용치를 능가함을 의미하며, 따라서 그 값은 나타나지 않았다.
실시예 2
방법
MG63 골육종 세포주로부터 취한 HC gp-39의 정제
세포 팩토리에서 MG63 세포(인간 골육종 ATCC CRL 1427)를 DMEM/HAM's F12 무혈청 배지내에서 배양하였다. HC gp-39는 배양 상청액으로부터 헤파린 특이성 크로마토그래피후, 수퍼 덱스 75 크로마토크래피에 의해 정제하였다. 순도는 SDS-PAGE로 측정하였다. 또한, N-말단 아미노산 서열은 정제된 단백질이 Hakala 등이 기술한 단백질과 동일함을 확인시켜 주었다.
Balb/c 생쥐에서 HC gp-39의 관절염 생성
불완전 프레운트 보조제(IFA) 내에서 1:1로 혼합된 PBS(0.5 M 염화나트륨, 0.01 M 인산나트륨 완충액, pH 7.5) 100 ㎕내의 정제된 HC gp-39 10 내지 50 ㎍을 2 x 4 암컷 Balb/c 생쥐(네덜란드 왕국, 지스트에 소재하는 할란 CPB)의 가슴부위에 피하주사하였다. 생쥐는 관절염의 임상적 징후 발생 여부를 매일 검사하였다. 관절염의 경중은 각각의 발에 대해 0-3이란 수치로(Glant 등의 논문에 따름) 평가하였다. 간략히 설명하면, 0 은 변화없음, 1 은 홍반 및 부풀음, 2 는 부풀음 및 변형 발생, 3 은 관절 및 신장부의 상실로 인한 이동 불가능을 나타낸다.
HC gp-39의 비강내 투여에 의한 내성 유도
단백질 28 ㎍을 10 마리의 암컷 Balb/c 생쥐(엔플루런스를 이용하여 가볍게 마취함)에게 PT45 마이크로 관 및 해밀톤 주사기를 이용하여 비강내로 (20 ㎕) 투여하였다. 관절염이 유도되기 15, 10 및 5일 전에 항원을 투여하였다. 대조용(n=10)은 동일 과정을 수행하였으나, 비히클(PBS)만을 투여하였다(표 5).
면역학적 내성은 상기한 바와 같이 0 일째에 단백질 10 ㎍을 이용하여 감작화한 후 지연된 형태의 고감도(DTH)를 측정하므로써 평가하였다. 0일 째의 감작화후, 8일 째에 좌측 뒷발바닥에 부피를 50㎍으로 하여 10 ㎍을 주사하였다(항원 투여). DTH 반응은 발바닥에서 증가하는 것으로 측정되었다([좌측 부풀음(mm x 10-3) - 우측 부풀음(mm x 10-3)]/우측 부풀음(mm x 10-3)) x 100%). 발바닥 부풀음은 항원 투여후 0, 24 및 48 시간에 실험실 용으로 제조된 마이크로미터를 이용하여 측정하였다.
이들 동일한 생쥐에서 관절염에 대한 내성은 감작화후 31일이 경과할 때까지 모니터하였으며, 생쥐는 임상적 징후 발생 여부에 대해 매일 조사하였다. 관절염의 경중은 상기한 바와 동일하게 평가하였다.
표 5: 내성화 계획
DTH는 지연된 형태의 고감도.
PBS는 0.5 M 염화나트륨, 0.01 M 인산 나트륨 pH 7.5.
결과
HC gp-39의 관절염 생성
IFA와 혼합한 HC gp-39 50 ㎍을 주사한 후, 모든 생쥐는 점차적으로 심한 관절염으로 발전하였다(표 6). 관절염의 징후는 감작화 후 15-20일에 최초로 관찰되었으며, 4마리중 3마리가 앞발에서 관찰되었다. 앞발에서 아무런 징후도 관찰되지 않았던 생쥐는 앞발 또는 뒷발에서 주기적으로 관절염이 재발하였으며, 점진적으로 양성 관절염에서 악성 관절염으로 발전하였다(질병은 62일 동안 진행되었다). 매우 빈번히(＞50%) 아픈 관절의 대칭 분포가 관찰되었으며, 이는 앞발 둘다 또는 뒷발 둘다에 관절염이 동시에 발생했음을 의미하는 것이었다.
관절염 유도는 IFA와 혼합한 HC gp-39 50 ㎍ 대신에 10 ㎍을 이용하여 획득하였다. 그러나, 관절염 수치는 다소 낮았다(자료는 나타내지 않음). 4마리 생쥐중 3마리가 심한 관절염으로 발전하였다. 생쥐 한마리는 실험이 지속되는 동안 양성 관절염 만을 나타냈다.
단백질 10 및 50㎍ 둘 다는 Balb/c 생쥐에서 진행성 관절염을 유도하기에 충분하였다. 관절의 대칭적 고통 이외에 재발을 특징으로 하는 HC gp-39에 의한 만성적인 관절염 유도의 특성은 류마티스성 관절염 진행의 징후이다.
표 6: HC gp-39 감작화된 Balb/c에서 관절염의 개시 및 진행
관절염 징후: 없음은 수치 0, 양성은 동물 1마리당 치수는 2를 초과하지 않음을 나타내고, 악성은 동물 1마리당 수치가 4보다 크거나 같음을 나타낸다.
DTH 분석법에서 측정된 면역학적 내성
0일에 HC gp-39로 주사한 대조용 생쥐는 강한 항원-특이성 DTH 반응을 나타냈는데, 이는 HC gp-39에 대한 세포성 면역 반응이 감작화시 유도된 것임을 의미한다. 그러나, HC gp-39의 비강내 투여는 자가항원에 대한 완전히 DTH 반응을 폐기하는 것을 의미하며, 따라서 HC gp-39-특이성 T 세포는 완전히 내성화되었다.
현저히, 비내성화된 그룹의 10 마리의 동물중 4마리는 항원 투여 위치에 근접한 발목에서 관절염을 발생시켰다. 대조하여, 내성화된 그룹은 항원투여 위치 주변의 관절에서 관절염을 발생시키지 않았다. 이는 HC gp-39에 대한 면역학적 내성이 관절염 발생에 대해 동물을 보호함을 의미하는 것이다.
표 7: 비강 투여에 의한 내성화후 HC gp-39에 대한 DTH 반응
관절염 유도 또는 진행에 대한 내성
HC gp-39 내성화된 또는 비내성화된 Balb/c 생쥐를 관절염의 개시 및 진행에 대해 추가로 검색하였다.
대조(비내성화)군의 모든 생쥐에서, HC gp-39를 이용하는 감작화후 관절염의 발생하였다(표 8). 7 마리의 생쥐는 점차 악성 관절염으로 진행된 반면, 3 마리의 생쥐는 단지 양성 징후(최상 수치: 2)만을 나타냈다. 대조하여 HC gp-39 내성화군중 5 마리의 생쥐는 실험중 관절염이 발생되지 않았다. 또한, 내성화군중 2 마리의 생쥐는 단시간 동안 단지 양성 징후만을 나타냈다. 3 마리의 생쥐는 수치 4의 더 악성인 관절염으로 발전하였다.
흥미롭게도, 내성화된 동물들에서 관절염 개시는 앞발 및 뒷발 둘 다에서 각각 최소 7-9일 지연되었다(제 1 도). 내성화군에서 영향받는 동물들은 거의 없었지만, 동물 1 마리당 앞발의 관절염 수치는 비내성화된 동물에서의 관절염 수치에 필적할만 하였다. 그러나, 동물 1 마리당 뒷발의 관절염 수치는 내성화된 동물에서 보다 다소 낮았다(제 1 도).
표 8: HC gp-39-내성화 및 비-내성화뢴 Balb/c 생쥐에서 관절염의 개시 및 진행
관절염 개시: 최초 징후 발생 - 영향받은 동물의 최고치.
관절염 징후: 없음: 수치 0, 양성: 동물 1 마리당 수치는 2를 초과하지 않음, 악성: 동물 1 마리당 수치는 4 보다 크거나 같음.
상기 실험은 Balb/c 생쥐에서 HC gp-39의 관절염 생성 특성을 입증하는 것이다. HC gp-39 유도된 질병의 과정은 앞발에서 주기적으로 발생하는 질병의 재발과 점진적으로 양성 관절염에서 악성 관절염으로 진행하는 것을 특징으로 한다. 또한, 류마티스성 관절염에서 고통받는 관절의 대칭 분포는 질병 진행의 징후로서 주기적인 재발과 함께 관찰되었다. HC gp-39의 강한 관절염 생성 특성은 모든 동물에서 관절염 징후를 개시하는 단백질 10㎍ 또는 50㎍을 단일 피하 주사하므로써 예시하였다. HC gp-39 감작화에 대한 반응으로 규명된 상기 HC gp-39 특이성 T 세포는 HC gp-39-특이성 DTH 반응으로 입증하였다. 이들 자료는 HC gp-39를 이용하여 발바닥을 면역조치한 동물에서 시험관내 HC gp-39 특이성 증식성 반응의 입증으로 재확인하였다(자료는 나타내지 않음). 중요한 것은, 비내성화된 동물은 주사 위치 주변의 발목에서 관절염을 발생시켰는데, 이는 관절염 유도에 HC gp-39-특이성 T- 세포가 관여함을 제안하는것이다.
펩티드 항원의 비강내 투여는 항원-특이성 면역 내성을 유도하는데 사용되어 왔다. 상기 실험은 HC gp-39의 비강내 투여가 면역학적으로 비반응성을 유도함을 입증하였다. 감작화후 DTH 반응은 HC gp-39-내성화된 생쥐에서 완전히 사라진 반면, 대조용 생쥐는 항원-특이성 부풀음을 나타냈다. 이들 관찰은 HC gp-39의 투여가 주변 면역 내성을 유도함을 제시하는 것이다.
비내성화된 동물에서, DTH 반응은 10 마리의 생쥐중 4 마리의 발목(항원투여위치와 근접한 위치)에서 관절염을 수반하였다. 대조하여, HC gp-39-내성화된 동물은 완전히 보호되며, 이는 자가반응성 T- 세포가 효과적으로 활동하지 않음을 의미하는 것이다. HC gp-39를 이용하는 내성화가 발병을 저지한다는 개념은 내성화된 10 마리의 동물중 5 마리가 실험 기간 전체를 통해 완전히 보호되는 것을 관찰하므로써 추가로 입증하였다. 상기 동물군중 나머지 5 마리는 실질적으로 임상적 징후를 발생시켰지만, 관절염의 개시는 상당히 지연되었다. 이에따라, 결론지을 수 있는 것은 HC gp-39-특이성 T-세포가 관절염 생성 과정에 관여한다는 것이며, 더 중요한 것은 본 발명에 따른 약학 조성물을 이용하여 이들 T-세포를 내성화하므로써 관절염 발생을 지연 또는 억제할 수 있다는 것이다.

Claims (13)

  1. 아미노산 서열 FGRSFTLAS(서열 번호 1), FTLASSETG(서열 번호 2), YDDQESVKS (서열 번호 3) 및 FSKIASNTQ(서열 번호 4)로부터 선택되는 HC gp-39 부분 서열중 하나로 구성되는 펩티드.
  2. 아미노산 서열 PTFGRSFTLASSE(서열 번호 5), RSFTLASSETGVG(서열 번호 6), VGYDDQESVKSKV(서열 번호 7) 및 SQRFSKIASNTQSR(서열 번호 8)로부터 선택되는 HC gp-39 부분 서열중 하나로 구성되는 펩티드.
  3. 제2항에 있어서,
    아미노산 서열 PTFGRSFTLASSE(서열 번호 5)로 구성되는 펩티드.
  4. 제2항에 있어서,
    아미노산 서열 RSFTLASSETGVG(서열 번호 6)로 구성되는 펩티드.
  5. 제2항에 있어서,
    아미노산 서열 VGYDDQESVKSKV(서열 번호 7)로 구성되는 펩티드.
  6. 제2항에 있어서,
    아미노산 서열 SQRFSKIASNTQSR(서열 번호 8)로 구성되는 펩티드.
  7. HC gp-39 단백질 또는 제1항 내지 제6항중 어느 한 항의 펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, T-세포 중재된 연골 파괴로 고생하는 환자에서 HC gp-39 자가항원에 대한 특이성 T-세포 내성을 유도하기 위한 약학 조성물.
  8. HC gp-39 단백질 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 관절염으로 고생하는 환자에서 HC gp-39 자가항원에 대한 특이성 T-세포 내성을 유도하기 위한 약학 조성물.
  9. 인간을 제외한 포유동물에서 임상적 관절염을 유도하는 방법에 사용하기 위한, HC gp-39 단백질 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩티드.
  10. 진단 물질로 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩티드.
  11. (a) 개체의 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하는 단계;
    (b) 적합한 조건하에서 상기 PBMC를 배양하는 단계;
    (c) HC gp-39 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩티드 존재하에서 상기 PBMC 배양액을 항온 처리하는 단계; 및
    (d) 개체에서 활성화된 자가반응성 T-세포의 존재를 나타내는 T-세포의 반응을 검출하는 단계를 포함하는, 활성화된 자가반응성 T-세포 검출을 위한 검출 방법.
  12. HC gp-39 단백질 또는 제1항 내지 제6항중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는, 활성화된 자가반응성 T-세포 검출용 테스트 키트.
  13. 제9항에 있어서,
    포유 동물이 생쥐인 것을 특징으로 하는, HC gp-39 단백질 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펩티드.
KR1019960702711A 1994-10-27 1995-10-25 자가면역질병의 면역치료에 사용하기 위한 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드 KR100485979B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94203128 1994-10-27
EP94203128.7 1994-10-27
EP95200886.0 1995-04-07
EP95200886 1995-04-07
PCT/EP1995/004201 WO1996013517A1 (en) 1994-10-27 1995-10-25 Novel peptides derived from autoantigen for use in immunotherapy of autoimmune diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR960705848A KR960705848A (ko) 1996-11-08
KR100485979B1 true KR100485979B1 (ko) 2006-01-27

Family

ID=26136688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019960702711A KR100485979B1 (ko) 1994-10-27 1995-10-25 자가면역질병의 면역치료에 사용하기 위한 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5736507A (ko)
EP (1) EP0733065B1 (ko)
JP (1) JP3755894B2 (ko)
KR (1) KR100485979B1 (ko)
CN (1) CN1161379C (ko)
AT (1) ATE177756T1 (ko)
AU (1) AU696827B2 (ko)
BR (1) BR9506377A (ko)
CA (1) CA2173874A1 (ko)
DE (1) DE69508380T2 (ko)
DK (1) DK0733065T3 (ko)
ES (1) ES2130672T3 (ko)
FI (1) FI118472B (ko)
GR (1) GR3030296T3 (ko)
HK (1) HK1002012A1 (ko)
HU (1) HU218027B (ko)
IL (1) IL115744A (ko)
MX (1) MX9602495A (ko)
NO (1) NO316703B1 (ko)
NZ (1) NZ295659A (ko)
PL (1) PL183761B1 (ko)
RU (1) RU2178797C2 (ko)
TR (1) TR199501326A2 (ko)
WO (1) WO1996013517A1 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843449A (en) * 1996-03-25 1998-12-01 Akzo Nobel N.V. Proteins and novel peptides derived from autoantigen for use in immunotherapy of autoimmune diseases
US6881824B1 (en) 1996-04-24 2005-04-19 Akzo Nobel N.V. Peptides suitable for use in antigen specific immunosuppressive therapy
IL120561A0 (en) * 1996-04-24 1997-07-13 Akzo Nobel Nv Peptides suitable for use in immunosuppressive therapy
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
CN1310724A (zh) * 1998-07-23 2001-08-29 阿克佐诺贝尔公司 用于自身免疫疾病的免疫疗法中的新型肽
WO2000004917A2 (en) * 1998-07-23 2000-02-03 Akzo Nobel N.V. USE OF HC gp-39 IN IMMUNE DISEASES
MXPA02003520A (es) * 1999-10-18 2002-08-20 Akzo Nobel Nv Imitaciones de peptido y peptidos modificados para utilizarse en inmunoterapia.
US7265208B2 (en) * 2001-05-01 2007-09-04 The Regents Of The University Of California Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases
WO2003009808A2 (en) 2001-07-24 2003-02-06 Yale University Methods, compositions and kits relating to chitinases and chitinase-like molecules and inflammatory disease
EP1729805A4 (en) * 2004-02-25 2008-11-26 Medimmune Inc METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO CHITINASES AND CHITINASE-MOLECULARS AND MODULATION OF OSTEOCLASTS
WO2007027748A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Medimmune, Inc. C/clp antagonists and methods of use thereof
RU2302872C9 (ru) * 2006-06-22 2008-12-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" Средство, нормализующее функции хрящевой ткани, и способ его получения
GB0710529D0 (en) 2007-06-01 2007-07-11 Circassia Ltd Vaccine
DK2190473T3 (da) 2007-08-15 2013-03-25 Circassia Ltd Peptid med reduceret dimerdannelse
WO2010018384A1 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Circassia Limited T-cell antigen peptide from allergen for stimulation of il-10 production
PT2153841E (pt) 2008-08-15 2012-03-21 Circassia Ltd Vacina compreendendo péptidos amb a 1 para utilização no tratamento de alergia a ambrósia
US8753644B2 (en) 2009-02-05 2014-06-17 Circassia Limited Grass peptides for vaccine
HUE029150T2 (hu) * 2009-10-27 2017-02-28 Erytech Pharma Készítmény specifikus immuntolerancia indukálására
WO2017041051A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6323898A (ja) * 1986-07-16 1988-02-01 Dainippon Pharmaceut Co Ltd 新規ポリペプチド及びそれをコ−ドするｄｎａ並びにそれらの製法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL92629A0 (en) * 1989-12-10 1990-08-31 Yeda Res & Dev Direct binding of t-cell epitopes to mhc gene products on intact living antigen presenting cells and the use thereof for identifying epitopes causing autoimmune diseases and pharmaceutical compositions for treating such diseases
CA2164498C (en) * 1993-07-09 2007-09-11 Paul A. Price Assay for ykl-40 as a marker for degradation of mammalian connective tissue matrices

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6323898A (ja) * 1986-07-16 1988-02-01 Dainippon Pharmaceut Co Ltd 新規ポリペプチド及びそれをコ−ドするｄｎａ並びにそれらの製法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Biol Chem Vol.268(34), pp25803-25810 (1993. 12. 5) *

Also Published As

Publication number Publication date
DE69508380D1 (de) 1999-04-22
PL183761B1 (pl) 2002-07-31
CN1168677A (zh) 1997-12-24
GR3030296T3 (en) 1999-09-30
HK1002012A1 (en) 1998-07-24
NO962695L (no) 1996-06-26
ES2130672T3 (es) 1999-07-01
FI962619A0 (fi) 1996-06-25
AU696827B2 (en) 1998-09-17
HU9601401D0 (en) 1996-07-29
HUT74847A (en) 1997-02-28
IL115744A0 (en) 1996-01-19
JPH09507861A (ja) 1997-08-12
KR960705848A (ko) 1996-11-08
WO1996013517A1 (en) 1996-05-09
CA2173874A1 (en) 1996-05-09
DE69508380T2 (de) 1999-09-09
FI118472B (fi) 2007-11-30
EP0733065A1 (en) 1996-09-25
RU2178797C2 (ru) 2002-01-27
NO316703B1 (no) 2004-04-13
TR199501326A2 (tr) 1996-06-21
IL115744A (en) 2000-07-16
AU3925295A (en) 1996-05-23
EP0733065B1 (en) 1999-03-17
NO962695D0 (no) 1996-06-26
MX9602495A (es) 1997-05-31
PL315198A1 (en) 1996-10-14
ATE177756T1 (de) 1999-04-15
US5736507A (en) 1998-04-07
JP3755894B2 (ja) 2006-03-15
HU218027B (hu) 2000-05-28
NZ295659A (en) 1998-02-26
DK0733065T3 (da) 1999-10-11
FI962619A (fi) 1996-06-25
BR9506377A (pt) 1997-09-16
CN1161379C (zh) 2004-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100485979B1 (ko) 자가면역질병의 면역치료에 사용하기 위한 자가항원으로부터 유도된 신규의 펩티드
US5843449A (en) Proteins and novel peptides derived from autoantigen for use in immunotherapy of autoimmune diseases
US20050202034A1 (en) Identification of self and non-self antigens implicated in autoimmune diseases
RU2199548C2 (ru) Новые пептиды, которые могут быть использованы в антиген-специфической иммуносупрессорной терапии
EP0833842B1 (en) Novel peptides for use in treatment of t-cell mediated cartilage destruction in autoimmune diseases
US6964766B1 (en) Peptides for use in immunotherapy of autoimmune diseases
US20020177554A1 (en) Novel peptides for use in treatment of T-cell mediated cartilage destruction in autoimmune diseases
US6881824B1 (en) Peptides suitable for use in antigen specific immunosuppressive therapy
MXPA98008866A (en) Novedosos peptidos suitable for use in antig specific immunosuppressive therapy
MXPA01000789A (en) Novel peptides for use in immunotherapy of autoimmune diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
B90T Transfer of trial file for re-examination
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20080417

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee