NO316703B1

NO316703B1 - Nye peptider som stammer fra autoantigen, anvendelse derav, samt farmasoytisk og diagnostisk blanding, og diagnostisk fremgangsmate

Info

Publication number: NO316703B1
Application number: NO19962695A
Authority: NO
Inventors: Anna Maria Helena Boots; Gijsbertus Francisc Verheijden
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1994-10-27
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2004-04-13
Also published as: JP3755894B2; HK1002012A1; DE69508380D1; ES2130672T3; FI962619A; KR960705848A; WO1996013517A1; RU2178797C2; BR9506377A; US5736507A; AU696827B2; NO962695L; ATE177756T1; PL183761B1; NZ295659A; HUT74847A; IL115744A0; CN1161379C; JPH09507861A; HU9601401D0

Description

Oppfinnelsen dreier seg om nye peptider som stammer fra autoantigen, anvendelse derav, samt farmasøytisk og diagnostisk blanding og diagnostisk fremgangsmåte.

Immunsystemet er basert på prinsippet om å kunne diskriminere mellom fremmede antigener ('ikke-selv-antigener) og autoantigener ('selv'-antigener, som stammer fra individets egen kropp), som oppnås ved en innebygget toleranse mot autoantigenene.

Immunsystemet beskytter individer mot fremmede antigener og svarer når det blir utsatt for et fremmed antigen ved å aktivere spesifikke celler som T- og B-lymfocytter, og ved å produsere løselige faktorer som interleukiner, antistoffer og komplementfaktorer. Antigenet som immunsystemet reagerer på blir nedbrutt av de antigen-presenterende celler (APCs), og et fragment av antigenet blir presentert på celleoverflaten bundet sammen med et "major histocompatibility complex" (MHC), klasse-II-glykoprotein. MHC-glykoprotein-antigen-fragmentkomplekset blir presentert for en T-celle som, via dennes T-celle-reseptor, gjenkjenner antigen-rfagmentet sammen med MHC klasse-H-proteinet som det er bundet til. T-cellen blir aktivert, dvs. prolifererer og/eller produserer interleukiner, noe som resulterer i ekspansjon av de aktiverte lymfocyttene som er rettet mot det angrepne antigen (Grey et al., Sei Am., 261:38-46,1989).

Selv-antigener blir også kontinuerlig prosessert og presen-tert for T-cellene av MHC-glykoproteinene som antigenrfagmenter (Jardetsky et al., Nature 353:326-329,1991). Selvgjenkjennelse er altså innebygget i immunsystemet. Under normale forhold er imidlertid immunsystemet tolerant overfor selv-antigener, og aktivering av immunresponsen forårsaket av disse selv-antigener unngås.

Når toleransen mot selv-antigener forsvinner blir immunsystemet aktivert av et eller flere selv-antigener, noe som resulterer i aktivering av autoreaktive T-celler og produksjon av autoantistoff. Dette fenomen kalles autoimmunitet. Siden immunresponsen generelt er destruktiv, dvs. fører til ødeleggelse av det invaderende fremmede antigen, kan autoimmune responser tilsvarende gi destruksjon av kroppens eget vev.

Bidraget av T-celler i autoimmune sykdommer har blitt klarlagt i flere studier. Hos mus er eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) mediert av en meget begrenset

gruppe av T-celler, som deler spesifisitet mot en enkelt epitop på myelin basisk protein (MBP) bundet til et MHC-klasse-II-molekyl. Hos Lewis rotter, en stamme som har høy mottagelighet av ulike autoimmune sykdommer, har det blitt vist at sykdommer overføres med T-celler. Hos mennesker mener man også at autoimmune sykdommer er forbundet med utvikling av autoaggressive T-celler.

En destruktiv autoimmun respons har blitt implisert i ulike sykdommer som f.eks. reumatoid artritt (RA, kronisk leddgikt), der leddbrusken blir ødelagt av en kronisk betennelsesreaksjon som er forårsaket av tilstedeværelsen av mange aktiverte lymfocytter og celler som uttrykker MHC-klasse-H-proteiner. Tilstedeværelsen av brusk synes å være nødvendig for å vedlikeholde den lokale betennelsesreaksjon: det har blitt vist at brusk-ødeleggelse er knyttet til aktiviteten hos brusk-responderende autoreaktive T-celler i RA (Sigall et al, Clin. Exp. Rheumat 6:59, 1988; Glant et al., Biochem. Soc. Trans. 18:796, 1990; Burmester et al., Rheumatoid Arthritis, Smolen, Kalden, Maini (Eds.) Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1992). Videre ble det vist at kirurgisk fjernelse av brusk fra RA pasienter reduserte betennelsesprosessen (G.S. Panayi et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1 l(suppl. 8): S1-S8, 1993). Bruskproteinene er derfor antatt å være mål-autoantigener som er kompetente til å stimulere T-celler. Aktivering av disse autoreaktive T-celler fører til utvikling av autoimmun sykdom.

Betennelsesreaksjonen som resulterer i ødeleggelse av brusken kan behandles med ulike medikamenter, for eksempel steroider. Imidlertid er disse medikamenter ofte uspesifikke immuno-suppressiva som har toksiske bivirkninger. Ulempene med uspesifikk immuno-suppresjon gjør at dette er en meget lite brukbar terapi.

Den antigen-spesifikke, nontoksiske immunosuppresjonsterapi er et meget attraktivt alternativ til den uspesifikke immuno-suppresjon. Denne antigen-spesifikke terapi omfatter behandling av pasienter med mål-autoantigenet eller med syntetiske T-celle-reaktive peptider som stammer fra autoantigenet. Disse syntetiske peptider korresponderer til autoantigenets T-celle-epitoper og kan bli brukt til å indusere spesifikk T-celle-toleranse både mot dem selv og mot autoantigenet. Selv om det synes paradoksalt å desensibilisere immunsystemet med det samme antigenet som er ansvarlig for aktivering av immunsystemet kan kontrollert tilsetning av mål-(auto)antigenet være meget effektivt i å desensibilisere immunsystemet.

For å kunne bruke toleranse terapi effektivt under behandling av T-celle-mediert ødeleggelse av brusk er det nødvendig å identifisere det ansvarlige autoantigen og å finne T-celle-reaktive peptider som kan desensibilisere pasienter overfor det autoantigen som aktiverer de T-cellene som er ansvarlige for betennelsesprosessen.

Et av oppfinnelsens mål er å beskrive autoantigenet og T-celle-reaktive peptider som stammer fra dette autoantigenet, som har evne til å indusere spesifikk T-celle-toleranse overfor det ansvarlige bruskantigen hos pasienter som lider av T-celle-mediert bruskdestruksjon. Et annet av oppfinnelsens mål er å utvikle en metode som kan brukes til å oppdage autoreaktive T-celler som er innblandet i ødeleggelse av leddbrusk, og utvikle utstyrspakker som kan brukes til denne metode.

Det ble overraskende nok funnet at 'Human Cartilage glykoprotein 39' (heretter beskrevet som HC gp-39) er et mål-autoantigen hos RA pasienter, som aktiverer spesifikke T-celler og dermed forårsaker eller medierer betennelsesprosessen. Peptider som stammer fra HC gp-39 ble hovedsaklig gjenkjent av autoreaktive T-celler fra RA-pasienter, men bare sjeldent av T-celler fra friske donorer, noe som antydet at HC gp-39 er et autoantigen i RA. Evnen som HC gp-39 har til å fremkalle leddbetennelse ble videre påvist i Balb/c mus, der en enkel subkutan injeksjon av dette proteinet førte til tegn på artritt hos dyrene. Utviklingen av sykdommen som ble indusert av HC gp-39 var karakterisert av periodiske tilbakefall i forlabber og/eller baklabber, og utviklet seg gradvis fra mild artritt til en mer alvorlig form. En symmetrisk fordeling av de affiserte ledd ble også observert, noe som sammen med de gjentagne tilbakefall og knutedannelser minner om sykdomsutviklingen i artritt, spesielt RA.

Enda mer uventet var oppdagelsen at tilførsel av HC gp-39 ga immunologisk toleranse og, viktigere, en forsinket og/eller dempet utvikling av artritten.

HC gp-39 er tilstede i serum både hos pasienter og hos friske voksne, selv om proteinets konsentrasjon i serum er omtrent dobbel så høy hos pasienter som hos friske voksne. Videre kan mRNA som koder for HC gp-39 bli funnet i leddbrusk og prøver fra synovialvev (leddhinne) fra RA pasienter, mens brusk fra friske voksne som fremskaffes ved kirurgi ikke inneholder målbare mengder av dette mRNA. Dersom bruskceller (kondrocytter) fra ledd og synovialceller blir dyrket, blir HC gp-39 funnet å være deres viktigste sekretoriske produkt (Hakala et al., J. Biol. Chem., Vol. 268, 34:25803,1993). Evnen HC gp-39 har til å fremkalle artritt ble ikke beskrevet eller antydet i Hakala et al. publikasjonen, og heller ikke i noen annen publikasjon.

Et videre mål for oppfinnelsen blir oppnådd av peptid, kjenntegnet ved at det omfatter en delsekvens av HC gp-39, har en aminosyresekvens med 9-55 aminosyre, og hvor peptidet omfatter en eller flere av aminosyresekvensene FGRSFTLAS (SEKV ID NR 1), FTLASSETG

(SEKV ID NR 2), YDDQESVKS (SEKV ID NR 3) og FSKIASNTQ (SEKV ID NR 4).

Mer spesifikt vil et peptid ifølge oppfinnelsen omfatte en eller flere av aminosyre-sekvensene PTFGRSFTLASSE (SEKV ID NR 5), RSFTLASSETGVG (SEKV ID NR 6),

VGYDDQESVKSKV (SEKV ID NR 7) og SQRFSKIASNTQSR (SEKV ID NR 8).

"Delsekvens1 forstås som 'en del', og må ikke misforstås som hele proteinet. Fortrinnsvis har oppfinnelsens peptider en amino-syresekvens på 9-55 aminosyrerester. Mer

foretrukket har peptidene i henhold til oppfinnelsen en aminosyresekvens på 9-35, særlig 9-25 aminosyrerester. Mye mer foretrukket er om oppfinnelsens peptider har en aminosyresekvens på 9-15 aminosyrerester, og spesielt foretrukket er peptider som har aminosyresekvener på 13 eller 14 aminosyrerester, som for eksempel peptidene med aminosyresekvensene angitt i

SEKV ID NR 5-8.

Multimere utgaver av oppfinnelsens peptider, som for eksempel en dimer eller trimer, der monomersekvensen om så ønskes kan bli separert med 'space^-rester er også innenfor oppfinnelsens område. Slike multimerer gir en rekke av T-celle-epitopene som er gitt i SEKV ID NR 1-8.

I peptidene, ifølge oppfinnelsen, kan aminosyresekvensene oppgitt i SEKV ID NR 1-8 være flankert av flankeregioner som kan tilsvare de opprinnelige flankeområder som omgir de tilsvarende aminosyrer i aminosyresekvensen i HC gp-39 proteinet, eller i andre proteiner der de beskrevne aminosyresekvenser er tilstede. Som alternativ kan de beskrevne flankeregioner også være ikke-naturlige aminosyresekvenser laget av tilfeldige aminosyrerester. Disse

unaturlige flankeområder kan bli brukt til å stabilisere peptidene, og derved øke deres

. biologiske tilgjengelighet. Slike unaturlige flankeområder blir foretrukket for å øke den biologiske tilgjengelighet av peptidene i henhold til oppfinnelsen.

Aminosyresekvensene oppgitt i SEKV ID NR 1-4, og mere spesifikt sekvensene gitt i SEKV ID NR 5-8 ligner MHC-klasse-II-begrensete T-celle epitoper som er tilstede på HC gp-39. MHC-klasse-II-begrensete T-celle epitoper på HC gp-39 finnes på regionene 103-116, 259-271,263-275 og 326-338 i HC gp-39s aminosyresekvens (begynnende ved metionin i signalsekvensen, se Hakala et al., 1993). Ifølge oppfinnelsen kan således peptidene forståes å omfatte fragmenter av autoantigenet HC gp-39 som omfatter en eller flere av de ovenfor identifiserte MHC-klasse-II-begrensete T-celle-epitoper, og de er også innenfor denne oppfinnelsens område.

Peptidene, ifølge oppfinnelsen, er T-celle reaktive peptider som gjenkjennes av og har evne til å stimulere aktiverte, autoreaktive T-celler. Disse autoreaktive T-celler finnes i blodet hos RA pasienter, men sjelden hos friske donorer.

Således er oppfinnelsens HC gp-39 protein eller de syntetiske peptider, hvor de nevnte peptider ligner på de MHC-klasse-II-begrensete T-celle-epitoper som er tilstede på mål-autoantigenet HC gp-39, meget velegnet for bruk i behandling der man vil indusere spesifikk T-celle-toleranse overfor HC gp-39 hos pasienter som lider av T-celle-mediert bruskdestruksjon, som for eksempel artritt, og mer spesifikt reumatoid artritt.

WO 95/01995 og WO 95/02188 beskriver den diagnostiske bruk av HC gp-39 som en markør for RA, og den artritt-fremkallende effekt av HC gp-39 blir hverken beskrevet eller nevnt. Ingen steder antydes eller nevnes noe om bruk av HC gp-39, fragmenter av dette eller denne oppfinnelses T-celle-reaktive peptider i antigen- eller peptid-spesifikk terapi for å indusere T-celle-spesifikk toleranse overfor HC gp-39 i brusken som er under angrep.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter HC gp-39 proteinet eller peptider som definert i krav 4, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det er videre beskrevet anvendelse av HC gp-39 proteinet eller et eller flere av peptidene ifølge krav 4, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere spesifikk T-celletoleranse mot HC gp-39 autoantigenet hos pasienter som lider av T-cellemediert ødeleggelse av leddbrusk.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av HC gp-39 proteinet eller et eller flere av peptidene ifølge krav 4, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere spesifikk T-celletoleranse mot HC gp-39 autoantigenet hos pasienter som lider av artritt, særlig reumatoid artritt.

Det er også beskrevet HC gp-39 protein eller peptider omfattende en delsekvens av HC gp-39, kjennetegnet ved at nevnte peptid omfatter en eller flere av aminosyre-sekvensene

FGRSFTLAS (SEKV ID NR 1), FTLASSETG (SEKV ID NR 2), YDDQESVKS (SEKV ED

NR 3) og FSKIASNTQ (SEKV ID NR 4) for anvendelse som en terapeutisk substans.

Oppfinnelsen vedrører videre diagnostisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter et eller flere av peptidene ifølge ethvert av kravene 1-3 og et agens for peptiddeteksjon.

Det er i foreliggende oppfinnelse også beskrevet diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av aktiverte autoreaktive T-celler, kjennetegnet ved at den omfatter de følgende trinn: a) isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra en blodprøve fra et individ,

b) dyrking av de nevnte PBMC under passende betingelser,

c) inkubering av nevnte PBMC-kultur i nærvær av HC gp-39, fragmenter av dette og/eller et eller flere peptider ifølge ethvert av kravene 1-3, og d) påvisning av T-cellerespons, som indikerer tilstedeværelse av aktiverte autoreaktive T-celler i individet.

Det er også beskrevet utstyrspakke for påvisning av aktiverte autoreaktive T-celler, Kjennetegnet ved at dette analysesettet omfatter HC gp-39 eller et eller flere av peptidene

ifølge ethvert av kravene 1 til 3.

Fremstilling av oppfinnelsens peptider utføres v.h.a. en av de kjente organisk kjemikalske metoder for peptidsyntese. HC gp-39 og peptidene kan også fremstilles ved bruk av rekombinant DNA teknikk.

De organisk kjemikalske metoder for peptidsyntese består av kopling av de ønskete aminosyrer via en kondensasjonsreaksjon, enten i en homogen fase eller ved hjelp av en såkalt fast fase.

Kondensasjonsreaksjonen kan utføres som følger:

a) kondensasjon av en forbindelse (aminosyre, peptid) med en fri karboksylgruppe og beskyttete andre reaktive grupper, med en forbindelse (aminosyre, peptid) med en fri aminogruppe og beskyttete andre reaktive grupper under tilstedeværelse av et kondensasjonsreagens; b) kondensasjon av en forbindelse (aminosyre, peptid) med en aktivert karboksylgruppe og frie eller beskyttete andre reaktive grupper, med en forbindelse (aminosyre, peptid) med en

fri aminogruppe og frie eller beskyttete andre reaktive grupper.

Aktivering av karboksylgruppen kan foregå bl. a. ved å overføre karboksylgruppen til et surt halid, azid, anhydrid, imidazolid eller en aktivert ester, slik som N-hydroksy-suksinimid, N-hydroksy-benzotriazol, p-nitrofenylester, N-hydroksy-benzotriazolester eller pentafluorofenolester.

De vanligste metoder for å utføre de ovennevnte kondensasjonsreaksjoner er: karbodiimidmetoden, azidmetoden, blandet anhydridmetoden og metoden der man bruker aktiverte estere, som beskrevet i 'The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology<*> Vol. 1-3 (Eds. Gross, E and Meienhofer, J.) 1979, 1980,1981 (Academic Press, Inc.).

Fremstilling av passende fragmenter av de over beskrevne peptider ifølge oppfinnelsen, ved bruk av 'fast fase', er for eksempel beskrevet i J.Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963) og i Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214 (1990). Kopling av aminosyrene i det peptid som skal fremstilles starter vanligvis fra den karboksyterminale side. For å bruke denne metode behøves en fast fase der det er reaktive grupper eller der slike grupper kan introduseres. Dette kan for eksempel være en kopolymer av benzen og divinylbenzen med reaktive klorometyl-grupper eller en polymer-fast-fase som er blitt gjort reaktiv med hydroksymetyl eller amin-funksjon.

En særlig passende fast-fase er for eksempel p-alkoksybenzyl alkohol resinet (4-hydroksymetylfenoksymetylkopolystren-l%-divinylbenzen-resin), beskrevet av Wang ((1974) J. Am. Chem. Soc. 95:1328). Etter syntesen kan peptidene bli splittet fra denne faste fase

under skånsomme betingelser.

Etter syntese av den ønskete aminosyresekvens følger løsrivelse av peptidet fra resinet, for eksempel med trifluoroeddiksyre som inneholder "scavengers", for eksempel triisopropyl silan, anisol eller etandithiol, thioanisol.

De reaktive grupper som ikke må delta i kondensasjonsreaksjonen er som angitt effektivt beskyttet av grupper som senere meget enkelt kan fjernes ved hydrolyse, fremkalt av syre, base eller reduksjon. En karboksylgruppe kan således være godt beskyttet via for eksempel esterifisering med metanol, etanol, tertiært butanol, benzylalkohol eller p-nitro-benzylalkohol og aminer bundet til fast-fase.

Grupper som effektivt kan beskytte en amino gruppe er etoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, t-butoksykarbonyl (t-boc) eller p-metoksy-benzyloksykarbonyl-gruppen, eller en syregruppe avledet fra en sulfonsyre, slik som benzensulfonyl eller p-toluensulfonyl- gruppen, men andre grupper kan også brukes slik som substituert eller usubstituert aryl eller aralkyl-grupper, for eksempel benzyl og trifenylmetyl, eller grupper som orto-nitrofenylsulfenyl og 2-benzoyl-l-metyl-vinyl. En særlig brukbar alfa-amino beskyttende gruppe er for eksempel den base-følsomme 9-fluorenyl-metoksy-karbonyl (Fmoc) gruppe [Carpina and Han (1970) J. Am. Chem. Soc. 92:5748].

En bredere beskrivelse av mulige beskyttende grupper kan finnes i The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology<1> Vol. 1-9 (Eds. Gross, Udenfriend and Meienhofer) 1979-1987 (Academic Press, Inc.).

De beskyttende grupper kan splittes av med ulike konvensjo-nelle metoder som avhenger av den spesielle gruppes egenskaper, for eksempel med hjelp av tri fluor eddiksyre, eller ved mild reduksjon, for eksempel med hydrogen og en katalysator som palladium eller med HBr i iseddiksyre.

Som allerede antydet over kan HC gp-39 og peptidene i henhold til oppfinnelsen også bli fremstilt med hjelp av rekombinant DNA teknikker. For dette formål blir en nukleinsyre-sekvens som koder enten for HC gp-39, eller et av oppfinnelsens peptider eller en multimer av dette peptid, ført inn i en ekspresjonsvektor. Passende ekspresjonsvektorer er bl.a. plasmider, kosmider, virus og YACs (Yeast Artificial Chromosomes), som omfatter de nødvendige kontrollregioner som regulerer replikasjon og ekspresjon. Ekspresjonsvektoren kan så uttrykkes i en vertscelle. Passende vertsceller er for eksempel bakterier, gjærceller og patte-dyrceller. Slike teknikker er velkjent innenfor fagområdet (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

Selv om det kan synes som et paradoks å desensibilisere immunsystemet med det samme antigenet som er ansvarlig for å aktivere immunsystemet, kan allikevel kontrollert tilførsel av HC gp-39 og/eller peptider som omfatter delsekvenser av HC gp-39 være effektive i å desensibilisere immunsystemet. Pasienter der brusken blir ødelagt av autoresponsive T-celler kan bli behandlet med en farmasøytisk blanding som omfatter HC gp-39, eller et eller flere av peptidene i henhold til oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærersubstans. For derved å gjøre de spesifikt autoreaktive-T-cellene hos disse pasientene tolerante overfor HC gp-39 i brusken som er under angrep og andre selv-antigener som bærer de identifiserte T-celle-epitoper som har en av aminosyresekvensene som er oppgitt i SEKV DD NR 1-8, og å minske betennelsesreaksjonen. Peptider som meget effektivt kan brukes i en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen er peptidene med aminosyresekvenser oppgitt i SEKV ID NR 5,6,7 og 8.

DNA (ekspresjons)vektorer som omfatter DNA som koder for HC gp-39 eller en eller flere av oppfinnelsens peptider er også meget brukbare i en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen. Ved levering kan DNA (ekspresjons)vektoren ved ekspresjon produseres et nivå av det rekombinante HC gp-39 protein eller av peptider ifølge oppfinnelsen som er sammenlign-bart med det som kan oppnåes ved direkte tilførsel av en farmasøytisk blanding som omfatter HC gp-39 proteinet eller peptidene.

Autoantigenet og peptidene i henhold til oppfinnelsen har den fordel at de har en spesifikk toleranseskapende effekt på de autoreaktive T-celler, mens de etterlater seg de andre deler av immunsystemet intakt, sammenlignet med den uspesifikke hemmende effekt som de immunosuppresive-steroid-medikamentene har. Behandling med autoantigenet eller med peptider ifølge oppfinnelsen vil være trygg og toksiske bieffekter vil ikke oppstå.

Toleranse kan oppnåes ved å tilføre høye eller lave doser av autoantigenet eller peptidene ifølge oppfinnelsen. Mengden autoantigen vil avhenge av tilførselsveien, tilførsels-tid, pasientens alder samt generelle helsetilstand og diett.

Vanligvis vil en dose på 0,01 til 1000 fig peptid eller protein pr. kg kroppsvekt, fortrinnsvis 0,5 til 500 [ lg, mer foretrukket 0,1 til 100 [ ig av peptid eller protein kunne brukes.

Farmasøytisk akseptable bærere er godt kjent for fagfolk innen fagområdet og inkluderer for eksempel sterilt saltvann, laktose, sukrose, kalsiumfosfat, gelatin, dekstrin, agar, pektin, peanøttolje, olivenolje, sesamolje og vann. Andre bærere kan for eksempel være

MHC-klasse-II-molekyler, om ønskelig inkludert i liposomer.

I tillegg kan de farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen omfatte en eller flere adjuvanser. Passende adjuvanser inkluderer bl.a. aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat, amfigen, tokofenoler, monofosfenyllipid A, muramyl dipeptid, og saponiner som Quill A. Mengde tilsetning avhenger av egenskapene til den tilsatte forbindelse.

Videre kan den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen omfatte et eller flere stabiliserende agens, som for eksempel karbohydrater, blant dem sorbitol, mannitol, stivelse, sukrosedekstrin og glukose, proteiner som albumin eller kasein, og buffere som alkaliske fosfater.

Passende tilførselsveier er intramuskulære injeksjoner, subkutane injeksjoner, intravenøse injeksjoner eller intraperitoneale injeksjoner, samt oral eller intranasal tilførsel. Oral eller intranasal tilførsel er de foretrukne tilførselsveier.

På grunn av dets evne til å fremkalle artritt kan HC gp-39 eller peptidene ifølge oppfinnelsen bli brukt til å indusere klinisk artritt i ikke-menneske-pattedyr. Etter tilførsel av små mengder med HC gp-39, eller et eller flere av oppfinnelsens peptider, vil tegn på artritt utvikles i de nevnte pattedyr, noe som resulterer i et sykdomsmønster som ligner sykdomsutviklingen i artritt, særlig reumatoid artritt. Når Balb/c mus ble injisert subkutant med HC gp-39 protein utviklet dyrene tegn på artritt. Utviklingen av sykdommen fremkalt av HC gp-39 ble karakterisert av periodiske tilbakefall i forlabber og/eller i baklabber, og en gradvis utvikling fra en lett type til en mere alvorlig form av artritt. En symmetrisk fordeling av affiserte ledd ble observert, noe som sammen med de observerte gjentatte tilbakefall og utvikling av knuter minner om sykdomsutvikling ved artritter, særlig RA.

Disse affiserte dyr gir således en adekvat dyremodell som kan brukes for å studere mekanismen som ligger til grunn for påbegynnelse og progresjon av artrittutvikling. I tillegg kan de affiserte dyr benyttes for å lete etter nye medikamenter som kan behandle artritt, og for å studere effekten disse har på utvikling av artritt. Mus benyttes fortrinnsvis som dyremodeller for artritt, særlig for reumatoid artritt.

For å indusere artritt i de nevnte dyr må passende mengder av HC gp-39 eller et eller flere av oppfinnelsens peptider bli tilført. Passende mengder er 0,1-1000 fig, fortrinnsvis 1-100 fig, og bedre 10-50 fig pr. kilo kroppsvekt. Mengde HC gp-39 eller peptid wil avhenge av tilførselsvei, tilførselstid, og type dyr som benyttes. Passende tilførselsveier er som beskrevet tidligere. For å fremkalle artritt induksjon kan HC gp-39 eller oppfinnelsens peptider omfatte ett eller flere stabiliserende agens eller tilsetninger, som tidligere beskrevet.

HC gp-39 eller oppfinnelsens peptider kan også, som angitt ovenfor brukes i en diagnostisk metode beregnet på å oppdage tilstedeværelsen av aktiverte autoreaktive T-celler som er innblandet i den kroniske leddbruskbetennelse.

I tilfeller der påvisning av respons gjøres med måling av proliferasjon av de autoreaktive T-celler benyttes «inkorporering av en radioisotop som for eksempel <3>H-tymidin som et mål for proliferasjon. En respons av de autoreaktive T-celler tilstede i PBMC kan også bli registrert ved å måle frigjøring av cytokiner med cytokin-spesifikk ELISA, eller ved å måle celletoksisitet med <51>Krom-frigjøring. En annen påvisningsmetode er måling av ekspresjon av aktiveringsmarkører ved FACS analyse, for eksempel av I1-2R. En diagnostisk blanding som omfatter et eller flere av oppfinnelsens peptider og et passende påvisningsagens er således en del av oppfinnelsen. Avhengig av metoden som benyttes for å påvise respons kan påvisningsagens være en radioisotop, et enzym, eller antistoff som er spesifikt rettet mot celleoverflate eller aktiveringsmarkører.

Utstyrspakker som omfatter et eller flere av oppfinnelsens peptider er også innenfor oppfinnelsens omfang. Disse utstyrspakkene er tilpasset bruk i en diagnostisk metode ifølge oppfinnelsen.

Denne oppfinnelse gir således en metode som tillater påvisning av om autoaggressive T-celler, reaktive mot HC gp-39, er tilstede i pasienter som lider av T-celle-mediert bruskdestruksjon, som for eksempel artritt, særlig reumatoid artritt. Dersom HC gp-39-spesifikke T-celler er tilstede kan toleranse-utvikling av disse T-celler oppnåes med en farmasøytisk blanding som omfatter HC gp-39 eller oppfinnelsens peptider, eller kombinasjoner av disse, noe som kan forsinke eller hemme utvikling av artritt.

FIGURTEKSTER

Figur 1: Begynnelse og utvikling av leddbetennelse i Balb/c mus enten gjort tolerante eller ikke mot HC gp-39. Den totale graderingen av leddbetennelse i de affiserte dyr pr. dag etter sensibilisering blir gitt for både for- og baklabb. Antall affiserte dyr pr. dag etter sensibilisering er også oppgitt.9+

EKSEMPEL 1

METODER

Pasienter

Perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra pasienter som hadde blitt diagnostisert med RA ifølge kriteriene fra "American Rheumatism Association (ARA)" (Amett et al., Arthritis Rheum. 31:315, 1988) ble samlet. Sykdomsgrad hos RA pasienter varierte mellom stadium I-IV, bestemt med "Røntgenscore".

PBMC fra friske donorer med spesifisitet enten DR4Dw4 (DRB1 <*>0401) eller DR1 ble samlet som kontroll. PBMC fra to friske donorer som ikke hadde noen av de RA-assosierte DR molekyler ble også samlet.

MHC typebestemmelse

Kromosomale DNA-ekstrakter fra PBMC fra pasienter og friske donorer ble analysert med Dynal DR 'low resolution' SSP utstyrs-pakke. DR4 subtyping ble utført med Dynal DRB1<*>04-SSP utstyrspakke (University Transfusion Service, Radboud Hospital, Nijmegen, Nederland).

Peptider

Peptider ifølge oppfinnelsen og et kontrollpeptid ble syntetisert med fast fase-peptidsyntese. I korthet ble peptider med frie amino- og karboksyterminaler syntetisert på en Milligen 9050 syntesemaskin, med bruk av Fmoc/tBu beskyttete aktiverte estere på PEG-PS resiner. Etter kløving fra resin og fjernelse av beskyttelse ble peptidene renset via preparativ HPLC (høytrykks væskekromatografi), konvertert til acetatsalter med Dowex Ac-resin eller til kloridsalter og frysetørket. Peptidene ble sjekket med massespektrometri. Peptidene som ble brukt i denne studie er gitt i tabell 1. Et N-terminalt biotinylert peptid avledet fra Influensa Hemagglutinin (SEKV ID NR 9), biotin-"spacer"-IHA(307-319)F, der den tredje rest (Y) blir byttet ut med F, (biotin-NH-(CH2)5-CO-PKFVKQNTLKLAT), ble brukt som markørpeptid i bindings-studier med DRD4Dw4 (DRB 1<*>0401). Det ikke-biotinylerte peptid BHA(307-319)F med SEKV ID NR 9 ble brukt som kontroll peptid.

Aminosyresekvens av peptidene 1-4 og kontrollpeptidet IHA(307-319)F blir oppgitt, korresponderende med de respektive sekvens DD nummer.

Cellekultur for produksjon av rensete HLA-DR molekyler

To EBV-transformerte B-celle linjer, BSM (A2, B62, Cw3, DR4Dw4, DQ8, Dpw2) og BM92 (A25, B51, Cwl, DR4Dwl4, DQ8) var gaver fra det Akademiske Hospital, Leiden, Nederland. Cellene ble dyrket i DMEM/HAM's F12 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), for-sterket med 10% FCS (Hyclone Laboratories), 1% ikke-essensielle aminosyrer (ICI), L-glutamin, 2-ME og antibiotika. Celler ble som en rutine overført hver 2-3 dag i en 1:2 ratio. Celler ble høstet og deretter vasket tre ganger i PBS (4°C) med 1 mM PMSF. Celle-pelletene ble lagret ved -70°C inntil bruk.

Affinitetsrensing av HLA-DR molekyler

HLA-DR molekyler ble affinitetsrenset fra cellelysater med monoklonale antistoff L243 (ATCC HB55), rettet mot en nonpolymorf determinant på DR komplekset (Lampson et al., J. Immunol. 125:293, 1980). Protein G-Sepharose-renset L243 ble koplet til NHS-Sepharose 4FF (Pharmacia) etter produsentens anvisninger.

Celler som uttrykte HLA-DR ble tint og oppløst på is i 30 minutter i PBS, 1% NP-40, 1 mM AEBSF (Calbiochem). Lysatet ble klargjort ved sentrifugering ved 15000 rpm (Sorvall SS34 rotor) i 30 minutter. Supematanten ble overført gjennom et 0,45 [ im filter og tilsatt L243-NHS-Sepharose kuler. Etter inkubasjon over natten ble kulene overført til en kolonne og vasket med fem volumer PBS, 1% NP-40; 5 volumer PBS, 0,5% NP-40; 15 volumer PBS, 0,5% NP-40, 0,1% SDS; 5 volumer PBS, 0,05% NP-40; 5 volumer PBS, 1% n-oktyl-glukosid

(Sigma, St. Louis, USA) og 5 volumer 50 mM dietylamin (Fluka), 150 mM NaCl, 1% n-oktyl-glukosid, pH=8,0. HLA-DR molekyler ble eluert med 50 mM dietylamin, 150 mM NaCl, 1% n-oktylglukosid, pH=l 1. Umiddelbart etter oppsamling ble fraksjonene nøytralisert med 2M glysin, pH 4,8. Oppsamlete fraksjoner ble analysert med SDS-PAGE (polyakrylamid gel-elektroforese i nærvær av natrium-laurylsulfat) utført under ikke-reduserende betingelser, etterfulgt av sølvfarging av gelene. Fraksjoner som inneholdt renset HLA-DR ble konsentrert ved ultrafiltrering over en membran med molekylgrense på 30 kilodalton.

HLA-DR peptidbinding analyse

Peptidbindingsstudiene ble utført med en forbedret versjon av en semikvantitativ bindingsmetode som er beskrevet tidligere (Joosten et al., Int. Immunol. 6:751,1994). Rensete HLA-DR molekyler (0,5-500 iiM) ble inkubert ved pH=5,0 med 50 nM biotinylert markør-peptid (biotin-'spacer'-IHA(307-319)F og konkurrerende peptider (peptider 1-4 og DHA(307-319)F som kontroll) i et passende konsentrasjonsområde, i et sluttvolum på 25 fil bindings-buffer (PBS, 1 mM AEBSF, 1 mM N-etylmaleimid, 8 mM EDTA, 10 ( M pepstatin A, 0,01% NaN3, 0,05% NP-40 og 5% DMSO.

Etter ca. 45 timers inkubering ved romtemperatur ble bundet og fritt markørpeptid separert, enten ved SDS-PAGE kombinert med overføring til et nitrocellulosefilter (BioRad) eller ved vakuum- DOT-blotting med et nitrocellulosefilter (BioRad) og 96 brønners Hybry Dot-utstyr (BRL). Blottene ble blokkert med 0,5% DNA blokkerende reagens (Boehringer Mannheim, Tyskland) i 0,1 M maleinsyre, pH=7,5, 150 mM NaCl. Etter en halv time ble blottene vasket i PBS, 0,02% Tween 20 (Sigma, St. Louis, USA) og inkubert med Streptavidin-HRPO (Southern Biotechnology) i henholdsvis 1:40000 eller 1:5000 fortynning. DR-bundet, biotinylert markør-peptid ble påvist med forsterket kjemoluminescens, hvorved man benyttet et 'Western Blot ECL Kit' (Amersham, U.K.) etter produsentens anvisninger. Preeksponerte filmer (Hyperfilm-ECL, Amersham, U.K.) ble eksponert i 10 minutter. Den relative bindingsaffinitet til de ulike peptider ble relatert til konkurranse med markørpeptidet. Denne relative affinitet ble definert som peptidkonsentrasjonen der signalet var redusert til 50% (<R>IC50)

I tilfellene der SDS-PAGE ble brukt ble <R>ICso-verdier estimert ved visuell inspeksjon. Tettheten på DOT Blot-flekkene ble analysert med et densitometer (Molecular Dynamics, USA) og Image Quant og Excel Software.

Blod mononukleære cellers proliferative responser

For å identifisere T-celle reaktivitet overfor peptid sekvenser fra HC gp-39 ble peptidene 1-4 tested m.h.p. deres evne til å indusere proliferative responser i PBMC fra RA pasienter og fra friske DR1 eller DR4 kontroller.

PBMC fra heparinisert venøst perifert blod ble isolert med standard sentrifugering på en Ficoll-Paque gradient. Celler ble dyrket i tre- eller fire-ganger ved en konsentrasjon på 1,5 x IO<5> celler/brønn i medium forsterket med 10% varmeinaktivert autologt plasma, L-glutamin, 2-ME og antibiotika i flatbunnete mikrotiter plater. Celler ble inkubert enten bare i medium, i medium med PHA (2,5 pig/ml) eller i medium med antigener, inkluderende Candida albicans ekstrakt ("gjenkallings" antigen) (1 /Ag/ml, 0,1 fig/ ml) eller et av peptidene 1-4 i konsen-trasjoner på 100 /ig/ml, 25 /ig/ml eller 10 pig/ml. Kulturer ble inkubert i et totalvolum på 210 pil i 7 dager ved 37°C i en fuktig atmosfære med 5% CO2. Kulturene ble pulset i de siste 18 timer med 0,25 /iCi <3>H-tymidin.

Definisjoner

Pasienter som svarte på begge konsentrasjonene av minst ett peptid ble rangert som høye "besvarere<1> (HR), pasienter som svarte på minst en av konsentrasjonene av minst ett peptid ble rangert som besvarere (R). Som konsekvens ble pasienter som ikke svarte på noen av peptidene som ble tested rangert som ikke-besvarere (NR).

Den relative bindingsaffinitet av et gitt peptid ble relatert til konkurranse med markør-peptidet. Denne relative affinitet ble definert som peptidkonsentrasjonen der signalet var redusert til 50% (<R>IC50).

RESULTATER

Den PBMC-proliferative respons hos RA pasienter og friske donorer ble analysert for å bestemme T-celle reaktivitet overfor peptidene 1-4.

De fleste som var HR eller R overfor de peptider som stammet fra HC gp-39 bar DR1, DR4Dw4, DR4Dwl4 eller DR10 spesifisiteter, som alle er kjent å være knyttet til øket risiko for å utvikle RA. Binding av peptidene 1-4 til DR4Dw4 og DR4Dwl4 ble påvist som vist i Tabell 2.

Binding av peptider 1-4, med aminosyresekvenser oppgitt i henholdsvis SEKV DD NR 5-8, til HLA-DR molekyler. Peptidbinding ble bestemt ved en semikvantitativ bindingsmetode (beskrevet i Metoder i Eksempel 1) ved pH=5 og med 50 nM IHA (307-319)F som et markørpeptid. Resultatene representerer <R>ICso verdier i mikromolar (konsentrasjon av konkurrerende peptid som reduserer signalet med ca. 50% sammenlignet med signalet som fåes uten konkurrerende peptid). Alle resultater, unntatt de for peptid 4, er fra to uavhengige eksperimenter (henholdsvis SDS-PAGE og DOT Blot).

De fleste RA pasienter responderte på ett eller flere av oppfinnelsens peptider (Tabell 3), mens responser sjeldent ble observert i gruppen med friske donorer (Tabell 4). 6 RA pasienter ble funnet å ikke svare på noen av de analyserte peptider (resultater ikke vist).

Sykdomsgrad hos RA pasienter ble rangert fra stadium I-IV. Røntgengradering ("score") som indikert her er en vurdering av graden av leddødeleggelse. HR og R overfor peptidene 1-4 ble funnet i alle stadier av sykdom.

Oppfinnelsens peptider representerer autoreaktive T-celle epitoper, og reaktivitet mot disse epitoper ble hovedsaklig funnet his RA pasienter, sjeldent hos friske donorer. RA pasienter har således aktiverte, autoreaktive T-celler rettet mot autoantigenet HC gp-39. Det er klart at HC gp-39 er angrepet av T-celler, noe som resulterer i betennelse og ødeleggelse av HC gp-39 antigenet i leddbrusken.

EKSEMPEL 2

METODER

Rensing av HC gp-39 fra osteosarkom (benkreft) cellelinjen MG63:

MG63 celler (humant osteosarkom ATCC CRL 1427) ble dyrket i cellefabrikker i DMEM/HAM's F12 serumfrie medium. HC gp-39 ble renset fra kultur-supematanten ved heparin affinitetskromatografi fulgt av superdex 75-kromatografi. Renhet ble kontrollert med SDS-PAGE. I tillegg bekreftet N-terminal aminosyresekvensering at det rensete proteinet var identisk med proteinet beskrevet av Hakala et al.

Fremkalling av artritt med HC gp-39 hos Balb/c mus:

10 eller 50 pig renset HC gp-39 i et volum på 100 fil PBS

(0,5 M NaCl, 0,01 M natriumfosfat buffer, pH 7,5) blandet 1:1 i ufullstendig Freund's adjuvans (IFA) ble injisert subkutant i brystregionen hos 2x4 Balb/c hunmus (Harlan CPB, Zeist, Nederland), mens 4 kontroller ble injisert med PBS (1:1 i IFA). Musene ble undersøkt hver dag med henblikk på kliniske tegn på artritt. Grad av artritt ble vurdert ved å gradere hver labb fra 0 til 3 (ifølge artikkelen av Glant et al.). I korthet er dette: grad 0 = ingen endringer, grad 1 = erytem og hevelse, grad 2 = hevelse og deformiteter, grad 3 = immobilitet forårsaket av tap av bøye og strekkeevne.

Induksjon av toleranse ved intranasal tilførsel av HC gp-39:

28 fig protein ble tilfart intranasalt (2 x 10 pil) til 10 Balb/c hunmus (lett bedøvet med Enflurance) ved bruk av en PT45 mikroleder og en Hamilton sprøyte. Antigen ble tilført på dagene -15, -10 og -5 før artritt ble fremkalt. Kontrollene (n = 10) ble utsatt for samme prosedyre, men fikk bare bærermediet (PBS) tilført (Tabell 5).

Immunologisk toleranse ble vurdert ved å måle 'forsinket type hypersensitivitet' (DTH) responser etter sensibilisering som beskrevet over på dag 0, ved bruk av 10 fig protein. Sensibilisering på dag 0 ble fulgt av en injeksjon med 10 fig HC gp-39 i 50 pil volum i den venstre bakre fotpute på dag 8 (stimulering). DTH reaksjoner ble målt som øking av fotputen ([hevelse venstre (mm x IO"<3>) - hevelse høyre (mm x IO"<3>)]/ hevelse høyre (mm x 10<*3>)) x 100%. Hevelse av fotpute ble utført med et mikrometer utviklet lokalt, ved tidspunktene 0, 24 og 48 timer etter stimulering.

Toleranse overfor induksjon av artritt i de samme mus ble så videre overvåket inntil dag 31 etter sensibiliseringen, og musene ble studert hver dag m.h.p kliniske tegn. Grad av artritt ble vurdert som beskrevet over.

RESULTATER

Artrittfremkallende egenskaper ved HC gp-39:

Etter en injeksjon av 50 pig HC gp-39 med IFA utviklet alle musene gradvis en alvorlig artritt (Tabell 6). Tegn på artritt ble først observert på dagene 15-20 etter sensibiliseringen, i for-labbene hos 3 av 4 dyr. Musen dom ikke viste noen tegn i forlabbene utviklet artritt i baklabbene på dag 34 etter sensibilisering. Utviklingen av HC gp-39-indusert sykdom var karakterisert av periodevise tilbakefall i forlabber eller baklabber, og gikk gradvis fra lett artritt til en alvorlig type artritt (sykdoms-progresjon ble fulgt i 62 dager). Svært ofte (>50%) ble en symmetrisk fordeling av de skadete ledd observert, dvs. at begge forlabber eller begge baklabber samtidig viste tegn på artritt.

Induksjon av artritt ble også oppnådd ved bruk av 10 /ig istedenfor 50 pig HC gp-39 blandet med IFA. Graden av artritt var imidlertid her litt lavere (resultater ikke vist). Tre av fire mus utviklet en alvorlig artritt. En mus viste bare svake tegn under eksperimentets varighet. Gjennom hele eksperimentet var kontroll-musene uten tegn på artritt.

Sett som en helhet var både 10 fig og 50 fig protein tilstrek-kelig til å indusere en progredierende artritt i Balb/c mus. Den kroniske type av artritt indusert av HC gp-39, som var karakterisert av gjentatte tilbakefall i tillegg til symmetrisk påvirkning av ledd, minner om sykdomsprogresjon i reumatoid artritt (RA).

Immunologisk toleranse målt ved DTH metoden:

Kontroll mus injisert med HC gp-39 på dag 0 viste en sterk, antigen-spesifikk DTH respons, som antyder at en cellulær immun-respons mot HC gp-39 ble fremkalt etter sensibilisering (Tabell 7). Intranasal tilførsel av HC gp-39 hemmet imidlertid fullstendig DTH-responsene fremkalt av stimulering med autoantigen, noe som derved viser at immunologisk toleranse mot HC gp-39 gir beskyttelse mot utvikling av artritt.

Toleranse overfor induksjon eller progresjon av artritt.

Balb/c musene som var gjort tolerante mot HC gp-39 samt tilsvarende ikke-tolerante mus, ble fulgt videre med henblikk på begynnelse og progresjon av artritt.

I alle kontroll (ikke-tolerante) mus ble sykdom indusert etter sensibilisering med HC gp-39 (Tabell 8). Syv mus utviklet gradvis en alvorlig artritt, mens tre mus bare viste milde tegn (høyest gradering var 2). Som kontrast ble fem mus i gruppen som var tolerant mot HC gp-39 beskyttet mot sykdomsutvikling under eksperimentets varighet. Videre viste to mus i den tolerante gruppe kun svake tegn under kortere perioder. Tre dyr utviklet en alvorligere artritt med gradering 4.

Interessant nok var artrittens begynnelse i tolerante dyr forsinket med minimum 7-9 dager både i forlabb og baklabb (Figur 1). Selv om færre dyr ble affisert i den tolerante gruppe var artrittgraderingen pr. dyr i forlabbene sammenlignbar med artritt-graderingen i ikke-tolerante dyr. Artrittgradering pr. dyr i bak-labbene var imidlertid noe lavere i de tolerante dyr (Figur 1).

Eksperimentene beskrevet over viser den artrittfremkallende evne hos HC gp-39 i Balb/c mus. Utviklingen av sykdom fremkalt av Hc gp-39 var karakterisert av periodiske tilbakefall i forlabber og/eller baklabber, og utviklet seg gradvis fra en svak artritt til en mere alvorlig form. En symmetrisk fordeling av de affiserte ledde ble også observert, noe som sammen med de gjentatte tilbake-fall minner om utviklingen av reumatoid artritt. Den sterke artritt-fremkallende virkning av HC gp-39 ble illustrert av en enkelt subkutan injeksjon av 10 eller 50 fig protein som induserte tegn på artritt i alle dyrene. At HC gp-39-spesifikke T-celler virkelig er aktivert som respons på HC gp-39 sensibilisering ble vist ved induksjon av HC gp-39-spesifikke DTH responser. Videre ble disse resultater bekreftet ved at HC gp-39-spesifikke in vitro-proliferative-responser ble påvist i dyr som var immunisert i fotputen med HC gp-39 (resultater ikke vist). Av betydning er at ikke-tolerante dyr utviklet artritt i ankelen nær injeksjons-stedet, noe som virkelig antyder at HC gp-39-spesifikke T-celler er involvert i induksjon av artritt.

Intranasal tilførsel av peptid antigen har blitt benyttet for å indusere antigenspesifikk toleranse. Eksperimentene viste at intranasal tilførsel av HC gp-39 fører til mangel på immunologisk respons. DTH responser etter sensibilisering ble fullstendig hemmet i mus som var gjort tolerante mot HC gp-39, mens kontroll- mus viste en antigenspesifikk hevelse. Disse observasjonene antyder at tilførsel av HC gp-39 fører til perifer immunologisk toleranse.

I ikke-tolerante dyr var DTH responsene fulgt av artritt i ankelen (nær det stimulerte sted) i fire av ti mus. Hos mus som var tolerante mot HC gp-39 var anklene i motsetning komplett beskyttet, noe som antyder at atoreaktive T-celler hadde blitt effektivt hemmet. Ideen om at toleranseutvikling med HC gp-39 beskytter mot sykdomsutvikling ble ført videre med observasjonen at 5 av 10 dyr i den tolerante gruppen ble totalt beskyttet under hele eksperimentets varighet. Selv om de andre fem dyr i gruppen etter hvert utviklet kliniske sykdomstegn var begynnelsen på artritt vesentlig forsinket. Det kan derfor konkluderes med at HC gp-39-spesifikke T-celler er involvert i den artrittogene prosess, og, viktigere, at ved å gjøre disse T-celler tolerante med en farmasøytisk blanding ifølge denne oppfinnelse kan utvikling av artritt bli forsinket eller svekket.

Claims

1. Peptid, karakterisert ved at det omfatter en delsekvens av HC gp-39, har en aminosyresekvens med 9-55 aminosyre, og hvor peptidet omfatter en eller flere av aminosyresekvensene FGRSFTLAS (SEKV ID NR 1), FTLASSETG (SEKV ID NR 2), YDDQESVKS (SEKV ID NR 3) og FSKIASNTQ (SEKV ID NR 4).

2. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en eller flere av aminosyresekvensene PTFGRSFTLASSE (SEKV ID NR 5), RSFTLASSETGVG (SEKV ID NR 6), VGYDDQESVKSKV (SEKV ID NR 7) og SQRFSKIASNTQSR (SEKV ID NR 8).

3. Peptid ifølge kravene 1 og 2, karakterisert ved at det har aminosyre-sekvensene PTFGRSFTLASSE (SEKV ID NR 5), RSFTLASSETGVG (SEKV ID NR 6), VGYDDQESVKSKV (SEKV ID NR 7) eller SQRFSKIASNTQSR (SEKV ID NR 8).

4. HC gp-39 protein eller peptider omfattende en delsekvens av HC gp-39, karakterisert ved at nevnte peptid omfatter en eller flere av aminosyre-sekvensene FGRSFTLAS (SEKV ID NR 1), FTLASSETG (SEKV ID NR 2), YDDQESVKS (SEKV ID NR 3) og FSKIASNTQ (SEKV ID NR 4) for anvendelse som en terapeutisk substans.

5. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter HC gp-39 proteinet eller peptider som definert i krav 4, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

6. Anvendelse av HC gp-39 proteinet eller et eller flere av peptidene ifølge krav 4, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere spesifikk T-celletoleranse mot HC gp-39 autoantigenet hos pasienter som lider av T-cellemediert ødeleggelse av leddbrusk.

7. Anvendelse av HC gp-39 proteinet eller et eller flere av peptidene ifølge krav 4, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere spesifikk T-celletoleranse mot HC gp-39 autoantigenet hos pasienter som lider av artritt, særlig reumatoid artritt.

8. HC gp-39 protein eller et eller flere av peptidene ifølge krav 4, karakterisert ved at de anvendes i en fremgangsmåte for å fremkalle klinisk artritt i ikke-humane pattedyr, fortrinnsvis mus.

9. Diagnostisk blanding, karakterisert ved at den omfatter et eller flere av peptidene ifølge ethvert av kravene 1-3 og et agens for peptid-deteksjon.

10. Diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av aktiverte autoreaktive T-celler, karakterisert ved at den omfatter de følgende trinn: a) isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra en blodprøve fra et individ, b) dyrking av de nevnte PBMC under passende betingelser, c) inkubering av nevnte PBMC-kultur i nærvær av HC gp-39, fragmenter av dette og/eller et eller flere peptider ifølge ethvert av kravene 1-3, og d) påvisning av T-cellerespons, som indikerer tilstedeværelse av aktiverte autoreaktive T-celler i individet.

11. Utstyrspakke for påvisning av aktiverte autoreaktive T-celler, karakterisert ved at dette analysesettet omfatter HC gp-39 eller et eller flere av peptidene ifølge ethvert av kravene 1-3.