PL185258B1 - Nowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów - Google Patents

Nowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów

Info

Publication number
PL185258B1
PL185258B1 PL96324208A PL32420896A PL185258B1 PL 185258 B1 PL185258 B1 PL 185258B1 PL 96324208 A PL96324208 A PL 96324208A PL 32420896 A PL32420896 A PL 32420896A PL 185258 B1 PL185258 B1 PL 185258B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino acid
peptide
peptides
acid residues
acid sequence
Prior art date
Application number
PL96324208A
Other languages
English (en)
Other versions
PL324208A1 (en
Inventor
Gijsbertus F. M. Verheijden
Anna M. H. Boots
Original Assignee
Akzo Nobel Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nobel Nv filed Critical Akzo Nobel Nv
Publication of PL324208A1 publication Critical patent/PL324208A1/xx
Publication of PL185258B1 publication Critical patent/PL185258B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

. Peptyd, który ma od 13 do 55 reszt aminokwasowych, znamienny tym, ze obejmuje sekwen- cje aminokwasowa AGWLR1 DR2R3R4R5 YPI w której R1 = A, S R 2 = Q, R, G R3 = T, S R 4 = V,L R 5 = R, Q , pod warunkiem, ze peptyd nie jest peptydem SSAGWLADRSVRYPISKARPNXGG, NA- GW LSDGSVQYPITKPREP, DAGW LADGSVRYPISRPRKR, GGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPR albo EQLFAAYEDGFEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCY. 6. Preparat farmaceutyczny zawierajacy substancje czynna i dopuszczalny farmaceutycznie no- snik, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencje aminokwasowa AGWLR1DR2R3R 4R5YPI, w której R1 = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S, R 4 = V, L i R5 =R, Q . 10. Zastosowanie peptydu o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencje ami- nokwasowa AGWLR1DR2 R .3R4R5 YPI, w której R1 = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S, R4 = V, L i R5 = = R, Q, do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do zastosowania w terapii tolerancji wywolanej peptydem w celu zaindukowania tolerancji na autoagresywne limfocyty T zwiazane z uszkodzeniem chrzastki stawowej, w którym biora udzial limfocyty T w chorobach autoagresyjnych. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sąnowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów do leczenia uszkodzenia chrząstki stawowej związanego z limfocytami T w chorobach autoagresyjnych.
Wynalazek dotyczy nowych peptydów, które nadają się do stosowania w terapii tolerancji indukowanej peptydami stosowanej w celu indukcji tolerancji na autoagresyjne limfocyty T związane z uszkodzeniem chrząstki stawowej w chorobach autoagresyjnych, w którym biorą udział limfocyty T, bardziej szczegółowo w zapaleniach stawów, a szczególnie w reumatoidalnym zapaleniu stawów.
Wynalazek obejmuje też preparaty farmaceutyczne zawierające peptydy.
Zasady działania układu odpornościowego opierają się na rozróżnianiu pomiędzy obcymi antygenami (nie swoimi antygenami) i autoantygenami (swoimi antygenami, pochodzącymi z własnego organizmu osobnika) co jest osiągane przez wywoływanie tolerancji względem autoantygenów.
Układ odpornościowy chroni osobniki przed obcymi antygenami i odpowiada na ekspozycję na obce antygeny aktywacją swoistych komórek, takich jak limfocyty T i B i przez produkcję takich rozpuszczalnych czynników jak cytokiny, przeciwciała i składniki dopełniacza. Antygen, na który odpowiada układ odpornościowy jest przetwarzany przez komórki prezentujące antygen (APC) i fragment antygenu jest wyrażany na powierzchni komórki w połączeniu z glikoproteina klasy II głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Kompleks glikoproteiną MHC-fragment antygenu jest prezentowany limfocytom T, które dzięki swemu receptorowi limfocyta T rozpoznają fragment antygenu w połączeniu z białkiem klasy II MHC, z którym jest związany. Limfocyt T ulega aktywacji, tj. proliferuje i/lub wytwarza cytokiny, co powoduje rozprzestrzenienie aktywowanych limfocytów T nakierowanych na atakowany antygen (Grey i in., Sci. Am., 261:38-46, 1989).
Antygeny własne są również przetwarzane w sposób ciągły i prezentowane limfocytom T jako fragmenty antygenu przez glikoproteiny MHC (Jardetsky i in., Naturę 353:326-329,1991).
W normalnych warunkach, układ odpornościowy toleruje własne antygeny i aktywacja odpowiedzi odpornościowej na własne antygeny nie zachodzi. Tak więc, rozpoznawanie własnych antygenów jest cechą wrodzoną układu odpornościowego.
Gdy tolerancja na własne antygeny zanika, układ odpornościowy staje się aktywny wobec jednego lub wielu antygenów własnych, powodując aktywację autoreaktywnych limfocytów T i wytwarzanie autoprzeciwciał. Zjawisko to określane jest jako autoagresja. Ponieważ odpowiedź odpornościowa jest zwykle niszcząca, tj. nastawiona na zniszczenie inwazyjnego obcego antygenu, odpowiedź autoagresyjna może zniszczyć własną tkankę organizmu.
Udział limfocytów T w chorobach autoagresyjnych został ustalony w kilku badaniach. U myszy, doświadczalne autoagresyjne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) zachodzi przez ściśle określoną grupę limfocytów T, połączonych swoistością wobec pojedynczego epitopu zasadowego białka mieliny (MBP) w kompleksie z cząsteczką MHC klasy II. U szczurów Lewis, gatunku o wysokiej podatności na różne choroby autoagresyjne, choroba zachodzi, jak wykazano, przez limfocyty T. Uważa się, że u ludzi choroby autoagresyjne są związane z rozwojem autoagresyjnych limfocytów T.
Niszcząca odpowiedź autoagresyjna wiązana jest z różnymi chorobami takim jak reumatoidalne zapalenie stawów (RA), w którym integralność chrząstki stawowej jest uszkodzona przez przewlekły proces zapalny spowodowany obecnością znacznej liczby aktywowanych limfocytów i komórek wyrażających MHC klasy II. Sama obecność chrząstki wydaje się być wystarczająca
185 258 do podtrzymywania miejscowego procesu zapalnego: wykazano, że zniszczenie chrząstki związane jest z aktywnością autoagresyjnych limfocytów T reagujących na chrząstkę w RA (Sigall i in., Clin. Exp. Rheumat. 6:59,1988; Giant i in., Biochem. Soc. Trans. 18: 1990; Burmestei i in., Rheumatoid arthritis; Smolen, Kalden, Maini (wyd.) Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992). Ponadto, chirurgiczne usunięcie chrząstki pacjentom z RA zmniejsza, jak wykazano, proces zapalny. Białka chrząstki są więc uważane za autoantygeny docelowe, które są zdolne do pobudzania limfocytów T. Aktywacja tych autoreaktywnych limfocytów T prowadzi do rozwoju choroby autoagresyjnej.
Odpowiedź zapalna powodująca zniszczenie chrząstki może być leczona lekami steroidowymi. Jednakże, leki te sąnieswoiście immunosupresyjne i powodują toksyczne efekty uboczne. Wady nieswoistej immunosupresji powodują, że jest to bardzo niekorzystna terapia.
Swoista antygenowo, nietoksyczna terapia immunosupresyjna powinna dostarczyć bardzo atrakcyjnej alternatywy dla immunosupresji nieswoistej. Ta terapia swoista antygenowo obejmuje leczenie pacjentów pochodzącymi z autoantygenu peptydami reaktywnymi wobec limfocytów T wiążącymi się z MHC klasy II. Te reaktywne wobec limfocytów T, wiążące się z MHC klasy II peptydy odpowiadają epitopom limfocytów T docelowego autoantygenu i mogą być zastosowane do wywołania swoistej tolerancji limfocytów T wobec, zarówno podawanych peptydów jak i autoantygenu. Skuteczne zastosowanie terapii tolerancji wywołanej peptydami do leczenia niszczenia chrząstki wywołanego przez limfocyty T powoduje zapotrzebowanie na peptydy reaktywne wobec limfocytów T, wiążące się z mHc klasy II, które mogą odczulać pacjentów na własne antygeny, które aktywują limfocyty T odpowiedzialne za proces zapalny.
Wynalazek dostarcza takich reaktywnych wobec limfocytów T, wiążących się z MHC klasy II peptydów, które są przydatne do terapii tolerancji wywołanej peptydami w celu indukcji tolerancji autoagresyjnych limfocytów T związanych z uszkodzeniem chrząstki spowodowanym przez limfocyty T w chorobach autoagresyjnych. W szczególności, wynalazek dostarcza reaktywnych wobec limfocytów T, wiążących się z MHC klasy II peptydów, które są bardzo przydatne do zastosowania w terapii tolerancji wywołanej peptydami w celu indukcji tolerancji autoagresyjnych limfocytów T związanych z uszkodzeniem chrząstki spowodowanym przez limfocyty T w zapaleniu stawów, w szczególności w reumatoidalnym zapaleniu stawów.
Peptydy według wynalazku mają sekwencję od 13 do 55 reszt aminokwasowych i charakteryzują się tym, że obejmują sekwencję aminokwasową o (Identyfikatorze Sekw. nr 1)
AGWLR,R2R3R4R5YPI w której R, oznacza A albo S; R2 oznacza Q, R albo G; R3 oznacza T albo S; R4 oznacza V albo L; i R5 oznacza R albo Q, pod warunkiem, że peptyd nie jest peptydem SSAGWLADRSVRYPISKARPNXGG, NAGWLSDGSVQYPITKPREP, DAGWLADGSVRYPISRPRKR, GGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPR albo QLFAAYEDGFEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCY.
Bardziej szczegółowo, peptydy według wynalazku obejmują przynajmniej sekwencję aminokwasową (Identyfikator Sekw. nr 2)
AGWLR,DR2R3LR5YPI w której R oznacza A albo S; R2 oznacza Q, R albo G; R3 oznacza T albo S; i R5 oznacza R albo Q.
Szczegółowo, peptydy według wynalazku obejmują przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych AGWLADQTVRYPI (Identyfikator Sekw. nr 3); AGWLADRSVRYPI (Identyfikator Sekw. nr 4); AGWLADGSLRYPI (Identyfikator Sekw. nr 5) albo AGWLSDGSVQYPI (Identyfikator Sekw. nr 6), pod warunkiem, że nie jest to peptyd SAGWLADRSVRYPISKARPNXGG, NAGWLSDGSVQYPITKPREP, GGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPR albo EQLFAAYEDGPEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCY.
Korzystny jest peptyd, składający się z jednej z sekwencji aminokwasowych AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLSDGSVQYPI i AGWLADGSLRYPI.
Korzystnie, peptydy według wynalazku mają sekwencję aminokwasową o 13 do 35 resztach aminokwasowych, bardziej korzystnie o 13-25 resztach aminokwasowych. Najbardziej
185 258 korzystne sąpeptydy mające sekwencję o 13 do 19 resztach aminokwasowych. Szczególnie korzystne sąpeptydy zawierające sekwencję aminokwasową AGWLADQTVRYPI (Identyfikator Sekw. nr 3); AGWlADRSVRYPI (Identyfikator Sekw. nr 4); AGWLADGSLRYPI (Identyfikator Sekw. nr 5) albo AGWLSDGSVQYpI (Identyfikator Sekw. nr 6).
Peptydy według wynalazku obejmują również multimery, takie jak np. dimer albo trimer, które sązbudowane z budujących bloków monomerycznych utworzonych przez peptydy według wynalazku. Te monomeryczne bloki budujące mogą być oddzielone resztami oddzielającymi. Multimery wykazujątakązaletę, że dostarczajjąlicznych peptydów reaktywnych wobec limfocytów T.
Wynalazek opiera się na fakcie, że peptydy według wynalazku są podobne do epitopów limfocytów T wiążących MHC klasy II obecnych na białkach autoantygenowych, które stanowią składniki chrząstki stawowej człowieka. Bardziej szczegółowo, peptydy według wynalazku są podobne do epitopów limfocytów T wiążących MHC klasy II obecnych na wielkim agregującym proteoglikanie ludzkiej chrząstki stawowej, ludzkim agrekanie (aggrecan) (HAG) i ludzkim białku łączącym chrząstki (HCLP).
Nieoczekiwanie stwierdzono, że reszty aminokwasowe 201-213, 299-311 i 623-635 struktury pierwszorzędowej HAG (począwszy od metioniny w sekwencji sygnałowej), jak również reszty aminokwasowe 207-219 struktury pierwszorzędowej HCLP (począwszy od metioniny w sekwencji sygnałowej) stanowią epitopy limfocytów T wiążące MHC klasy II, które są rozpoznawane przez autoagresyjne limfocyty T reagujące na chrząstkę, związane z uszkodzeniem chrząstki stawowej w chorobach autoagresyjnych, bardziej szczegółowo w zapaleniu stawów, zaś w szczególności w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Strukturę pierwszorzędową HAG i HCLP opisano, odpowiednio, w Doege i in., J. Biol. Chem. Vol. 266; nr 2:894-9092 (1991) i Dudhia i in., Nuci. Acid Res., Vol 18, nr 5: 1292 (1990).
Jakkolwiek białka chrząstki stawowej uważane są za docelowe autoantygeny zdolne do pobudzania autoagresyjnych limfocytów T związanych z uszkodzeniem chrząstki stawowej w chorobach autoagresyjnych do momentu niniejszego wynalazku nie było wiadome, że te epitopy limfocytów T wiążące się z MHC klasy II związane z autoagresyjnymi limfocytami T reagującymi na chrząstkę zidentyfikowano w białkach chrząstki, w szczególności w HAG i HCLP. Peptydy według wynalazku przypominają te epitopy limfocytów T wiążące MHC klasy II dostarczając w ten sposób peptydów reaktywnych wobec limfocytów T, które mogą być wykorzystane w terapii tolerancji limfocytów T wywołanej peptydem. Pacjenci mogą być leczeni peptydami według wynalazku w celu indukowania swoistej tolerancji limfocytów T, nie tylko na podawane peptydy ale również na docelowe autoantygeny HAG i HCLP. Ponieważ peptydy według wynalazku nie wpływają na inne składniki układu odpornościowego, zatem układ odpornościowy pacjenta pozostaje niezaburzony i jest zdolny do obrony pacjenta przed innymi zakażeniami.
Tak więc, peptydy według wynalazku dostarczają bardzo atrakcyjnej alternatywy dla klasycznych leków steroidowych stosowanych w leczeniu uszkodzenia chrząstki stawowej wywołanego przez limfocyty T w chorobach autoagresyjnych, bardziej szczegółowo w zapaleniu stawów, w szczególności w reumatoidalnym zapaleniu stawów.
Perin i in., FEBS Letters 206: 73 (1986) opisują zależność strukturalną pomiędzy białkiem łączącym i monomerami proteoglikanu, oraz ujawniają fragment peptydowy otrzymany po trawieniu trypsynąbiałka łączącego. Fragment peptydowy ma sekwencję aminokwasową SSAGWLADRSVrYpISKARPNXgG. Goetingiin., J. CellBiol. 105:2403-2408 (1987) ujawniająpeptydy NAGWLSDGSVQYPITKPREP i DAGWLADGSVRYPISRPRKR, które odpowiadają, odpowiednio, resztom aminokwasowym Asn207-Pro226 i Asp306-Arg325 struktury pierwszorzędowej białka. Peptydy te zsyntetyzowano w celu zbadania oddziaływania pomiędzy białkiem łączącym a kwasem hialuronowym i stwierdzono, że te reszty aminokwasowe biorą udział w wiązaniu białka łączącego z kwasem hialuronowym. Neame i in., J. Biol. Chem. 261 (8):3519-3535 (1986) opisują wyjaśnienie struktury pierwszorzędowej białka łączącego z agregatu proteoglikanu chrzęstniakomięsaka szczura. Analiza produktów trawienia trypsynąbiałka łączącego wykazała obecność fragmentu o sekwencji aminokwasowej GGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPR.
185 258
Perides i in., J. Biol. Chem. Vol. 264, nr 10:5981-5987 (1989) opisują izolowanie i częściową charakterystykę glejowego białka wiążącego hialuronian (GHBP). Trawienie trypsyną GHBP dało w wyniku kilka fragmentów peptydowych, z których jeden miał sekwencję aminokwasową EQLFAAYEDGFEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCY.
Jednakże, żadna z tych publikacji nie ujawniła że peptydy te stanowiąepitopy limfocytów T wiążące MHC klasy II, które są rozpoznawane przez autoagresyjne limfocyty T reagujące na chrząstkę związane z uszkodzeniem chrząstki stawowej w chorobach autoagresyjnych. Żadna z tych publikacji nie sugerowała również zastosowania tych peptydów w terapii tolerancji limfocytów T wywołanej peptydem do indukcji tolerancji autoagresyjnych limfocytów T związanych z uszkodzeniem chrząstki związanym z limfocytami T w chorobach autoagresyjnych.
Preparat farmaceutyczny według wynalazkujako substancję czynną zawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencję aminokwasową AGWLRj DR2R3 R4R5YPI, w której R, = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S, R4 = V, L i R5 = R, Q.
Korzystnie preparat farmaceutyczny według wynalazku zawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencję aminokwasową AGWLR1DR2R3LR5YPI, w której R, = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S i R4 = R, Q.
Korzystny preparat farmaceutyczny według wynalazku jako substancję czynną zawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje co najmniej jednąz sekwencji aminokwasowych AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLSDGSVQYPI i AGWLADGSLRYPI albo co najmniej jeden z peptydów AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLADGSLRYPI i AGWLSDGSVQYPI.
Preparaty według wynalazku obok substancji czynnej zawierają farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Peptydy według wynalazku mogą być wytwarzane dobrze znanymi chemicznymi sposobami syntezy peptydów takimi jak, np. synteza peptydów na podłożu stałym opisana przykładowo w J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963) i Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214 (1990).
Peptydy według wynalazku mogą być również wytwarzane technikami rekombinacji DNA. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującąpeptyd według wynalazku albo multimer takiego peptydu wprowadza się do wektora ekspresyjnego. Odpowiednimi wektorami ekspresyjnymi mogą być m.in. plazmidy, kosmidy, wirusy i YAC (sztuczne chromosomy drożdży), które zawierają niezbędne sekwencje kontrolujące replikację i ekspresję. Wektory ekspresyjne można doprowadzić do ekspresji w komórkach gospodarza. Odpowiednimi komórkami gospodarza są, np. bakterie, komórki drożdży i komórki ssacze. Techniki takie są dobrze znane, patrz np. Sambrook i in., Molecular Cloninig: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.
Pacjent cierpiący na uszkodzenie chrząstki stawowej wywołane limfocytami T może być leczony preparatem farmaceutycznym zawierającym jeden lub wiele peptydów według wynalazku i nośnik dopuszczalny farmaceutycznie. Podawanie preparatu farmaceutycznego według wynalazku powinno wywołać tolerancję swoistych autoagresyjnych limfocytów T tych pacjentów, na autoantygenowe białka w zaatakowanej chrząstce stawowej i inne autoantygeny, które stanowią zidentyfikowane epitopy limfocytów T wiążące MHC klasy II, charakteryzowane przez jedną z sekwencji aminokwasowych o Identyfikatorach Sekw. o Nr od 1 do 6. Bardziej szczegółowo, podanie preparatu farmaceutycznego według wynalazku, powinno wywołać tolerancję swoistych autoagresyjnych limfocytów T na autoantygeny HAG i HCLP. Wywołana tolerancja powinna więc doprowadzić do zmniejszenia miejscowej odpowiedzi zapalnej w zaatakowanej chrząstce stawowej.
Bardzo przydatnymi peptydami do zastosowania w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku są peptydy o 13-55, korzystniej 13-35, jeszcze korzystniej 13-25, niezwykle korzystnie 13 do 19 resztach aminokwasowych, charakteryzujące się tym, że zawierają przynajmniej jednąz sekwencji aminokwasowych podanych w Identyfikatorze Sekw. Nr 1 i 2.
Szczególnie korzystne w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku sąpeptydy o 13-55, korzystniej 13-35, jeszcze korzystniej 13-25, niezwykle korzystnie o 13-19 resztach
185 258 aminokwasowych charakteryzujące się tym, że zawie rająco najmniej jedną z sekwencji aminokwasowych podanych w Identyfikatorze Sekw. Nr od 3 do 6.
Niezwykle korzystne w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku są peptydy o 13 resztach aminokwasowych, charakteryzujące się tym, że zawierają przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych podanych w Identyfikatorze Sekw. Nr 1 i 2.
Najkorzystniejsze w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku sąpeptydy o 13 resztach aminokwasowych z sekwencjami aminokwasowymi podanymi w Identyfikatorze Sekw. Nr 3, 4, 5 lub 6.
Peptydy według wynalazku majątę zaletę, że wywierają swoisty wpływ na autoreaktywne limfocyty T, pozostawiając inne składniki układu odpornościowego nietknięte w porównaniu z nieswoistym wpływem supresyjnym steroidowych leków immunosupresyjnych. Leczenie peptydami według wynalazku powinno być bezpieczne i nie powinny występować toksyczne efekty uboczne.
Tolerancję można wywołać przez podawanie wysokich albo niskich dawek peptydów według wynalazku. Ilość peptydu zależeć będzie od drogi podania, czasu podawania, wieku pacjenta jak również stanu ogólnego i diety.
Ogólnie, mogąbyć stosowane dawki od 0,01 do 1000 pg peptydu na kilogram ciężaru ciała, korzystnie 0,5 do 500 pg, najkorzystniej od 0,1 do 100 pg peptydu.
Nośniki dopuszczalne farmaceutycznie są dobrze znane specjalistom i obejmują, przykładowo, sterylny roztwór soli, laktozę, sacharozę, fosforan wapnia, żelatynę, dekstrynę, agar, pektyny, olej arachidowy, oliwę z oliwek, olej sezamowy i wodę. Innymi nośnikami mogą być przykładowo, cząsteczki MHC klasy II, jeżeli to pożądane, wbudowane do liposomów.
Oprócz tego, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może obejmować jeden albo wiele adiuwantów. Odpowiednie adiuwany obejmują, m.in. wodorotlenek glinu, fosforan glinu, apfigen, tokofenole, monofosfenylo-lipid A, dipeptyd muramylowy i saponiny takie jak Quill A. Ilość adiuwantu zależy od charakteru samego adiuwantu.
Ponadto, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może obejmować jeden lub wiele stabilizatorów takich jak np. węglowodany takie jak sorbitol, mannitol, skrobia, sacharodekstryna i glukoza, białka takie jak albumina albo kazeina, i bufory takie jak fosforany alkaliczne.
Odpowiednimi drogami podania są wstrzyknięcia domięśniowe, podskórne, dożylne albo dootrzewnowe, podanie doustne i rozpylanie donosowe.
Peptydy według wynalazku są bardzo przydatne do zastosowania w metodach diagnostycznych służących do wykrywania obecności aktywowanych autoreaktywnych limfocytów T związanych z przewlekłym stanem zapalnym i zniszczeniem chrząstki stawowej.
Metody diagnostyczne, w których stosuje się peptydy według wynalazku, obejmują następujące etapy:
a) izolowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pacjenta z próbki krwi osobnika;
b) hodowanie PBMC w odpowiednich warunkach;
c) inkubację hodowli PBMC w obecności autoantygenu albo jednego lub wielu pochodzących z niego peptydów według wynalazku, i
d) wykrywanie odpowiedzi limfocytów T, przykładowo odpowiedzi proliferacyjnej, wskazującej na obecność aktywowanych autoreaktywnych limfocytów T u osobnika.
Odpowiedź proliferacyjną limfocytów T można wykryć, przykładowo, przez wbudowywanie 3H-tymidyny.
W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie peptydu o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencję aminokwasową AGWLR]DR2R3R4R5YPI, w której R1 = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S, R4 = V, L i R5 = R, Q, do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do zastosowania w terapii tolerancji wywołanej peptydem w celu zaindukowania tolerancji na autoagresywne limfocyty T związane z uszkodzeniem chrząstki stawowej, w którym biorą udział limfocyty T w chorobach autoagresyjnych.
185 258
Poniższe przykłady ilustrują wynalazek i nie powinny być interpretowane jako ograniczenie zakresu wynalazku.
Przykłady
Metody
Pacjenci
Pobierano komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od pacjentów, u których postawiono diagnozę RA zgodnie z kryteriami American Rheumatism Association (ARA) (Arnett i in., Arthritis Rheum. 31:315, 1988). Zaawansowanie choroby według ARA określano w skali od I do IV według skali rentgenowskiej. W trakcie trwania badania pacjenci byli leczeni indometacyną, metotreksatem, glikokortykoidami albo niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi.
Typowanie MHC
Ekstrakty chromosomalnego DNA PBMC pacjentów analizowano stosując zestaw Dynal DR SSP o niskiej rozdzielczości. Typowanie DR4 wykonano przy użyciu zestawu Dynal DRB1*04-SSP. Interpretacji danych typowania MHC dokonano przy współudziale University Transfusion Service, Radboud Hospital, Nijmegen, Holandia.
Peptydy
Peptydy według wynalazku oraz peptyd kontrolny IHA(307-319)F, PKFVKQNTLKAT(Identyfikator Sekw. nr 7) zsyntetyzowano metodąsyntezy peptydów na podłożu stałym. Pokrótce, z wolnymi końcami aminowymi i karboksylowymi syntetyzowano na w pełni zautomatyzowanym syntezatorze Milligen 9050, stosując aktywowane estry chronione Fmoc/tBu na żywicach PEG-PS. Peptydy odcięto od żywicy i odblokowano przy użyciu mieszaniny TFA/tioanizol/etanoditiol/anizol, 90/5/3/2 albo TFA/H2O 95/5. Peptydy oczyszczono preparatywnąHPLC, przekształcono w sole octanowe na żywicy Dowex Ac albo sole chlorkowe i liofilizowano. Czystość i tożsamość peptydów oceniono, odpowiednio, przez HPLC z odwróconymi fazami i FAB-MS. Peptydy zastosowane w tym badaniu podano w tabeli 1. Biotynylowany na końcu aminowym peptyd pochodzący z hemaglutyniny wirusa grypy, IHA(307-319)F, w którym trzecią resztę aminokwasową (Y) zastąpiono przez F (biotyno-NH-(CH2)5-CO-PKFVKQNTLKLAT, Identyfikator Sekw. nr 7) zastosowano jako peptyd markerowy w badaniu wiązania z DR4Dw4(DRB 1 *0401). W celu zapobieżenia zakłócaniu grupą biotynową wiązania peptydu, biotynę przyłączono przez odstępnik do końca aminowego peptydu markerowego.
Tabela 1: Zsyntetyzowane peptydy
Peptydy Sekwencja Czystość w HPLC Identyfikator Sekw. Nr
HAGI AGWLADQTVRYPI >90% 3
HAG2 AGWLADRSVRYPI >90% 4
HAG3 AGWLADGSLRYPI >90% 5
HCPL1 AGWLSDGSVQYPI >90% 6
IHA(307-319)F PKFVKQNTLKLAT >90% 7
Oczyszczanie przez powinowactwo cząsteczek HLA-DR
Dwie linie limfocytów B transformowanych EBV, BSM (oznaczona jako DR4(DRB1 *0401)) i BM92 (oznaczona jako DR4(DRB 1 *0404)) otrzymano od Dr M. Oudshoom z Academic Hospital Leiden, Holandia. Komórki hodowano w minimalnej pożywce Eagla w modyfikacji Dulbecco DMEM/HAM F12 (Gibco Laboratories, Grand Island, Ny) z dodatkiem 10% FCS (Hyclone Laboratories), 1%o niepodstawowych aminokwasów (ICI), L-glutaminy, 2-ME i antybiotyków. Komórki rutynowo pasażowano co 2-3 dni dzieląc je w stosunku 1:2. Komórki
185 258 zebrano i płukano trzykrotnie w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) (4°C) zawierającym 1 mM PMSF. Osad komórkowy przechowywano w -70°C aż do użycia. Komórki wyrażające HLA-DR rozmrożono i poddano lizie na lodzie przez 30 minut w PBS, 1%NP-40,1 mMAEBSF (Calbiochem). Lizat oczyszczono z jąder i resztek przez odwirowanie przy 15000 obr./min. (Sorvall, wirnik SS34) przez 30 minut.
Cząsteczki HLA-DR oczyszczono przez powinowactwo z lizatów komórkowych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych L243 (ATCC) skierowanych przeciwko niepolimorfocznym determinantom na kompleksie DR (Lampson i in., J. Immunol. 125:293,1980). L243 oczyszczone na Sepharose-białku G sprzęgnięto z NHS-Sepharose 4 FF (Pharmacia) według instrukcji producenta. Sklarowany lizat komórkowy przepuszczono przez filtr 0,45 pm i dodano do perełek L243-NHS-Sepharose. Po całonocnej inkubacji, perełki przeniesiono do kolumny i płukano pięcioma objętościami PBS, 1%o NP-40; pięcioma objętościami PBS, 0,50% NP-40,15 objętościami PBS, 0,5% NP-40,0,1% SDS; 5 objętościami PBS, 0,05°%NP-40; 5 objętościami PBS, 1%> n-oktylo-glukozydem (Sigma, St. Louis, USA) i 5 objętościami 50 mM dietylaminy (Fluka), 150 mMNaCl, 1% n-oktylo-glukozydem, pH 8,0. Cząsteczki HLA-DR eluowano 50 mM dietyloaminą, 150 mM NaCl, 1% n-oktylo-glukozydem, pH 11,0. Bezpośrednio po zebraniu, frakcje zobojętniono 2 M glicynąpH 4,8. Zebrane frakcje analizowano na SDS-PAGE w warunkach nieredukujących i barwiąc srebrem. Frakcje zawierające oczyszczone HLA-DR łączono, a następnie zatężano przez ultrafiltrację przez membranę o ciężarze odcięcia 30 kDa.
Test wiązania peptydu z HLA-DR
Badania wiązania peptydu przeprowadzono przy użyciu półilościowego testu wiązania jak to opisano uprzednio (Joosten i in., Int. Immunol. 6:751, 1994). Oczyszczone cząsteczki HLA-DR (0,05-5 pM inkubowano przy pH 5,0 z 50 nM biotynylowanego peptydu markerowego (IHA(307-319)F) i zakresem stężeń peptydu kompetycyjnego (peptydy HAG1, HAG2, HAG3 i HCLP1) w objętości końcowej 25 pl buforu wiążącego (PBS, 1 mM AEBSF, 1 mM N-etylomaleimid, 8 mM EDTA, 10 pM pepstatyna A, 0,01% NaN3,0,05% NP-40 i 5% DMSO).
Po około 48 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej, związany i niezwiązany peptyd markerowy oddzielono przez SDS-PAGE w warunkach nieredukujących. Białka przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Hybond ECL, Amersham, UK) przy użyciu układu przenoszącego w warunkach pół-suchych (Pharmacia). Filtry nitrocelulozowe zablokowano 0,5% odczynnikiem blokującym DNA (Boehringer Mannheim, Germany) w 0,1 M kwasie maleinowym pH 7,5,150 mM NaCl. Po godzinie, filtry płukano w PBS, 0,05% Tween 20 (Sigma, St. Louis, USA) i inkubowano z kompleksem streptawidyny-HRP (Southern Biotechnology) w roz cieńczeniu 1:40000. Peptydy biotynylowane wykrywano wzmocnionąchemiluminescencją stosując zestaw Western Biot ECL (Amersham, UK) według instrukcji producenta. Wstępnie naświetlone filmy (Hyperfilm-ECL, Amersham, UK) eksponowano przez 30 minut.
Powinowactwo peptydów według wynalazku do wiązania kodowanych cząsteczek DRB1*0401 albo DRB1*0404 odniesiono do współzawodnictwa z peptydem markerowym. Względne powinowactwo wiązania IC50 (eIC50) było określone jako stężenie peptydu, przy którym sygnał biotynylowanego peptydu markerowego był zmniejszony do 50%, co określono wizualnie pod nieobecność peptydu kompetycyjnego.
Odpowiedź proliferacyjna jednojądrzastych komórek krwi
Peptydy HAG1, HAG2, HAG3 i HCLP1 badano na ich zdolność do wywołania odpowiedzi proliferacyjnych w PBMC. Testy proliferacyjne z udziałem PBMC zastosowano uprzednio do zmierzenia aktywacji odpowiedzi limfocytów T swoistej antygenowo, w kontekście MHC klasy II (Good i in.. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:1199, 1988).
PBMC uzyskane z heparynizowanej żylnej krwi obwodowej izolowano przez standardowe odwirowanie na gradiencie Ficoll-Paque. Komórki hodowano w trzy- lub czterokrotnych powtórzeniach w gęstości 1,5x105 komórek/studzienkę w pożywce DMEM/HAM F12 z dodatkiem 10% inaktywowanej ciepłem pulowanej surowicy ludzkiej, L-glutaminy, 2-ME i antybiotyków w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania. Komórki inkubowano same albo w obecności PHA (2,5 pg/ml) albo w obecności antygenów, obejmujących frakcję proteoglikanu
185 258 kury, frakcję kolagenu kury, sonikowanych Mycobacterium tuberculosis albo peptydów HAG1, HAG2, HAG3 i HCLP1 w stężeniach 50 pg/ml, 5 pg/ml albo 0,5 pg/ml. Hodowle inkubowano w objętości końcowej 210 pl przez 4, 5, 6 albo 7 dni w 37°C w nawilżanej atmosferze 5% CO2. Hodowle pulsowano 0,5 pCi (1,85x104 Bq) [3H]-tymidyną([3H]TdR) przez końcowe 18 godzin hodowli. Komórki zbierano na filtry z włókna szklanego i mierzono wbudowywanie [3H]TdR metodą scyntylacji gazowej. Należy zauważyć, że zliczanie przez scyntylację gazowąjest około
5-krotnie mniej sprawne w porównaniu ze scyntylacjąciekłą. Stąd, filtry mierzono przez 5 minut (Packard Matrix 96 β-counter, Meriden, CT).
Wyniki
Test wiązania peptydu z HLA-DR
Wiązanie peptydów HAG1, HAG2, HAG3 i HCLP1 z DR4(DRB 1 *0401) i DR4(DRB 1 *0404) przeprowadzono w półilościowym kompetycyjnym teście wiązania przy użyciu oczyszczonych przez powinowactwo cząsteczek HLA-DR. Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Jak widać z tabeli 2, wszystkie peptydy wiązały się z DR4(DRB 1*0401) i współzawodniczyły z peptydem markerowym.
Tabela 2:
Peptydy wiążące kodowane cząsteczki HLA-DRB 1*040
Peptydy Sekwencja DRB*0401 eIC5()
HAGI AGWLADQTVRYPI ++
HAG2 AGWLADRSVRYPI ++
HAG3 AGWLADGSLRYPI ++
HCPL1 AGWLSDGSVQYPI +
++ = dobre wiązanie, eIC5o między 1-10 pm; + = średnie wiązanie eIC50 między 10-100 pM; +/- = słabe wiązanie, eIC50 między 100-1000 pM; - = brak wiązania, e^0 przekracza 1000 pM
Test proliferacyjny PBMC
W celu określenia reaktywności limfocytów T na peptydy HAG 1, HAG2, H AG3 i HCLP 1, analizowano odpowiedź proliferacyjnąu pacjentów z RA. Tabela 3 przedstawia jedynie wartości uzyskane przy 50 pg/ml. Wyniki wyrażane sąjako średnia trzech-czterech pomiarów (liczba zliczeń na 5 minut). Błąd standardowy średniej nie przekraczał 30%. Wartości podkreślone są uważane za pozytywne (liczba zliczeń na 5 minut > 1000 i wskaźnik pobudzenia SI> 2). Większość pacjentów odpowiadała na przynajmniej jeden peptyd według wynalazku, co wskazuje, że peptydy według wynalazku są rozpoznawane przez autoagresyjne limfocyty T związane z chorobą autoagresyjną.
Tabela 3:
Odpowiedzi proliferacyjne PBMC pacjentów z RA na peptydy
Dawcy Peptydy 191(RA) 209(RA) 227 (RA)
HAGI 1177 1336 1352
HAG2 1061 1115 ND
HAG3 233 1094 ND
HCPL1 ND 1503 1964
BG 320 405 833
ND nie wykonano, BG = tło
185 258
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: AKZO NOBEL N.V.
(b) ULICA: Velperweg 76 (C) MIASTO: Arnhem (E) KRAJ: Holandia (F) KOD: 6824 BM (G) TELEFON: 04120-66376 (H) TELEFAX: 04120-50592 (I) TELEX: 37503 akphanl (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Nowe peptydy do zastosowania w leczeniu uszkodzenia chrząstki związanego z limfocytami T w chorobach autoagresyjnych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 7 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY:: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Yersion #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) LOKALIZACJA; 1. 13 (D) INNE INFORMACJE: /znacznik = Xaa /uwaga = „Xaa w poz. 5=A albo S; Xaa w poz. 7=Q, R albo G; Xaa w poz. 8=T albo S; Xaa w poz. 9=V albo L; Xaa w poz. 10=R albo Q” (x) OPIS SEKWENCJI: IDENTATENATOR SEKW. SER 1 Ala Gly Trp Leu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Pro lie 1 5 10
185 258 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) LOKALIZACJA: 1. 13 (D) INNE INFORWFCJE: Anacznik = ΡΕΡΊΎ P /uwaga = „Xaa w poz. 5=A albo S; Xaa w poz. 7=Q, R albo G; Xaa w poz. 8=T albo S; Xaa w poz. 10=R albo Q” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 2 Ala Gly Trp Leu Xaa Asp Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Pro Ile 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 3 Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gin Thr Val Arg Tyr Pro Ile 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (b) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 4
Ala Gly Trp Leu Ala Asp Arg Ser Val Agr Tyr Pro Ile 1 5 10
185 258 (2) INFORMACJA dla IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NE: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 5 Alą Gly Trp Leu Ala Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Pro Ile 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 6 Ala Gly Trp Leu Ser Asp Gly Ser Val Gin Tyr Pro Ile 1 5 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKE^E^NER: IDEDEYTIKFITAR SEKW. NR 7 Pro Lys Phe Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10
185 258
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Peptyd, który ma od 13 do 55 reszt aminokwasowych, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową
    AGWLR,DR2 R3 R4 R 5 YPI w której IR- A, S R2 = Q, R,G R3 = T,S R4 = V,L R5 = R, Q, pod warunkiem, że peptyd nie jest peptydem SSAGWLADRSVRYPISKARPNXGG, NAGWLSDGSVQYPITKPREP, DAGWLADGSVRYPISRPRKR, GGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPR albo EQLFAAYEDGFEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCY.
  2. 2. Peptyd, który ma od 13 do 55 reszt aminokwasowych, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej sekwencję aminokwasową AGWLR, DR2R3LIR YPI w której R, = A, S
    R2 = Q, R, G
    R3 = T, s
    R5 = R, Q.
  3. 3. Peptyd, który ma od 13 do 55 reszt aminokwasowych, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej jedną z sekwencji aminokwasowych AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLSDGSVQYPI i AGWLADGSLRYPI, pod warunkiem, że nie jest to peptyd SAGWLADRSVRYPISKARPNXGG, NAGWLSDGSVQYPITKPREP, GGLDWCNAGWLSDGSVQYPITKPR albo EQLFAAYEDGPEQCDAGWLADQTVRYPIRAPRVGCY.
  4. 4. Peptyd, składający się z jednej z sekwencji aminokwasowych AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLSDGSVQYPI i AGWLADGSLRYPI.
  5. 5. Peptyd, który ma od 13 do 55 reszt aminokwasowych i obejmuje sekwencję aminokwasową
    AGWLR! DR2 R3 R4R 5 YPI, w której A, S, R2=Q, R, G, R3 = T, S, R4=V, L i R 5 = R, Q, do zastosowania jako lek.
  6. 6. Preparat farmaceutyczny zawierający substancję czynną i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienny tym, żejako substancję czynną zawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencję aminokwasową AGWLR, DR2iRR4R5YPI, w której R] = = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S, R4 = V, L i R5 =R, Q.
  7. 7. Preparat farmaceutyczny zawierający substancję czynnąi dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienny tym, żejako substancję czynnązawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwaso wych, który obejmuje sekwencję aminokwasową AGWLR, DIRIR. LIR YPI, w której R[ = A, S, R2 = Q, R, G, R3 — T, S i R5 — R, Q.
  8. 8. Preparat farmaceutyczny zawierający substancję czynnąi dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienny tym, żejako substancję czynną zawiera peptyd o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje co najmniej jednąz sekwencji aminokwasowych AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLSDGSVQYPI i AGWLADGSLRYPI.
  9. 9. Preparat farmaceutyczny zawierający substancję czynnąi dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienny tym, żejako substancję czynnązawiera co najmniej jeden z peptydów AGWLADQTVRYPI, AGWLADRSVRYPI, AGWLADGSLRYPI i AGWLSDGSVQYPI.
  10. 10. Zastosowanie peptydu o 13-55 resztach aminokwasowych, który obejmuje sekwencję aminokwasową AGWLRjDR2 R3 R4 R5 YPI, w której R) = A, S, R2 = Q, R, G, R3 = T, S, R4 = V,
    185 258
    L i R5 = R, Q, do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do zastosowania w terapii tolerancji wywołanej peptydem w celu zaindukowania tolerancji na autoagresywne limfocyty T związane z uszkodzeniem chrząstki stawowej, w którym biorą udział limfocyty T w chorobach autoagresyjnych.
PL96324208A 1995-06-19 1996-06-17 Nowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów PL185258B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95201656 1995-06-19
PCT/EP1996/002605 WO1997000270A1 (en) 1995-06-19 1996-06-17 Novel peptides for use in treatment of t-cell mediated cartilage destruction in autoimmune diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL324208A1 PL324208A1 (en) 1998-05-11
PL185258B1 true PL185258B1 (pl) 2003-04-30

Family

ID=8220392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96324208A PL185258B1 (pl) 1995-06-19 1996-06-17 Nowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0833842B1 (pl)
JP (1) JPH11507919A (pl)
KR (1) KR19990022972A (pl)
CN (1) CN1155617C (pl)
AT (1) ATE185151T1 (pl)
AU (1) AU704942B2 (pl)
BR (1) BR9608626A (pl)
CA (1) CA2221981A1 (pl)
DE (1) DE69604492T2 (pl)
DK (1) DK0833842T3 (pl)
ES (1) ES2139363T3 (pl)
GR (1) GR3031990T3 (pl)
HU (1) HU223275B1 (pl)
IL (1) IL118524A (pl)
MX (1) MX9710508A (pl)
NO (1) NO975968L (pl)
NZ (1) NZ311022A (pl)
PL (1) PL185258B1 (pl)
TR (1) TR199701658T1 (pl)
WO (1) WO1997000270A1 (pl)
ZA (1) ZA965163B (pl)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
MEP42108A (en) 1998-10-23 2011-02-10 Kiren Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
IL132611A0 (en) 1999-10-27 2001-03-19 Yeda Res & Dev Synthetic genes and polypeptides and pharmaceutical compositions comprising them
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules

Also Published As

Publication number Publication date
CN1155617C (zh) 2004-06-30
NO975968D0 (no) 1997-12-18
HUP9802197A3 (en) 1999-06-28
NO975968L (no) 1997-12-18
TR199701658T1 (xx) 1998-06-22
CA2221981A1 (en) 1997-01-03
DE69604492D1 (de) 1999-11-04
EP0833842A1 (en) 1998-04-08
AU704942B2 (en) 1999-05-06
IL118524A0 (en) 1996-09-12
GR3031990T3 (en) 2000-03-31
HU223275B1 (hu) 2004-04-28
WO1997000270A1 (en) 1997-01-03
ATE185151T1 (de) 1999-10-15
HUP9802197A2 (hu) 1999-02-01
CN1188483A (zh) 1998-07-22
DK0833842T3 (da) 2000-04-03
KR19990022972A (ko) 1999-03-25
ES2139363T3 (es) 2000-02-01
JPH11507919A (ja) 1999-07-13
NZ311022A (en) 1999-11-29
PL324208A1 (en) 1998-05-11
ZA965163B (en) 1997-01-23
IL118524A (en) 2004-02-19
MX9710508A (es) 1998-03-31
BR9608626A (pt) 1999-06-15
AU6224696A (en) 1997-01-15
DE69604492T2 (de) 2000-04-13
EP0833842B1 (en) 1999-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5843449A (en) Proteins and novel peptides derived from autoantigen for use in immunotherapy of autoimmune diseases
JP3755894B2 (ja) 自己免疫疾患の免疫療法に用いるための、自己抗原から誘導された新規なペプチド
AU719481B2 (en) Novel peptides suitable for use in antigen specific immunosuppressive therapy
PL185258B1 (pl) Nowe peptydy, preparat farmaceutyczny i zastosowanie peptydów
US20020177554A1 (en) Novel peptides for use in treatment of T-cell mediated cartilage destruction in autoimmune diseases
AU758310B2 (en) Novel peptides for use in immunotherapy of autoimmune diseases
US6881824B1 (en) Peptides suitable for use in antigen specific immunosuppressive therapy
MXPA98008866A (en) Novedosos peptidos suitable for use in antig specific immunosuppressive therapy
MXPA02009698A (es) Identificacion de peptidos de subunidad alfa del receptor de acetilcolina, inmunodominantes, potenciales.
MXPA01000789A (en) Novel peptides for use in immunotherapy of autoimmune diseases

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20050617