JPH11507919A - 自己免疫疾患におけるｔ細胞媒介軟骨破壊の治療に使用する新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、自己免疫疾患、特に関節炎におけるＴ細胞媒介の関節軟骨破壊に関連する自己攻撃性Ｔ細胞に対して耐性を誘発するための、ペプチド誘発耐性療法における新規ペプチドの使用に関する。本発明はさらに、かかるペプチドを含む製薬組成物、および被検サンプルにおいて自己免疫疾患におけるＴ細胞媒介の関節軟骨破壊に関連する自己反応性Ｔ細胞を検出するための診断方法、およびかかる方法において使用する試験キットを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患におけるＴ細胞媒介軟骨破壊の 治療に使用する新規ペプチド 本発明は、新規ペプチド、および自己免疫疾患においてＴ細胞が媒介する関節 軟骨破壊の治療におけるそれらの使用に関する。 より詳細には、本発明は、自己免疫疾患、特に関節炎、中でも慢性関節リウマ チにおける、Ｔ細胞媒介関節軟骨破壊に結びつく自己攻撃性Ｔ細胞に対する耐性 を誘発するための、ペプチド誘発耐性療法における該新規ペプチドの使用に関す る。 本発明はさらに、かかるペプチドを含む製薬組成物、および被検サンプルにお いて自己免疫疾患におけるＴ細胞媒介の関節軟骨破壊に関連する自己反応性Ｔ細 胞を検出するための診断方法、およびかかる方法において使用する試験キットを 包含する。 免疫系は、自己抗原（個体の自らの身体から誘導される自己抗原）に対する耐 性の確立によって達成される、外来抗原（非自己抗原）と自己抗原との識別に基 づく。 免疫系は外来抗原に対して個体を保護し、ＴおよびＢリンパ球のような特定の 細胞を活性化し、サイトカイン、抗体および 補体因子のような可溶性因子を産生することによって、外来抗原との接触に応答 する。免疫系が応答する抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって処置され、抗 原のフラグメントが主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＴＩ糖たんぱくと結 合した細胞表面に発現される。ＭＨＣ−糖たんばく−抗原フラグメント複合体が Ｔ細胞に提示され、Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体によって、抗原フラグメントが 結合しているＭＨＣクラスＩＩたんぱくと共同でかかる抗原フラグメントを認識 する。Ｔ細胞は活性化し、すなわち増殖しおよび／あるいはサイトカインを産生 して、攻撃されている抗原に向けて活性化Ｔ細胞の拡大をもたらす（Ｇｒｅｙら 、Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６１：３８−４６，１９８９）。 自己抗原はまた連続的に処置されて、ＭＨＣ糖たんぱくにより抗原フラグメン トとしてＴ細胞に提示される（Ｊａｒｄｅｔｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３： ３２６−３２９，１９９１）。正常な状況下では、免疫系は自己抗原に対して寛 容であり、これら自己抗原による免疫反応の活性化は避けられている。このよう に、自己認識は免疫系において本来備わっているものである。 自己抗原に対する寛容性が失われると、免疫系は１つまたは それ以上の抗原に対し活性化され、自己反応性Ｔ細胞の活性化と自己抗体の産生 をもたらす。この現象が自己免疫と称されるものである。免疫反応は一般に破壊 的である、すなわち侵入外来抗原を破壊しようとするので、自己免疫反応は身体 の自らの組織の破壊を引き起こしうる。 自己免疫疾患へのＴ細胞の寄与はいくつかの試験によって確認されている。マ ウスでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に複 合化したミエリン塩基性たんぱく質（ＭＢＰ）の単一エピトープに対する特異性 により連関されている、極めて限定されたＴ細胞群によって媒介される。種々の 自己免疫疾患に対する感受性が高い種であるルイスラットにおいて、疾患がＴ細 胞によって媒介されることが示された。ヒト自己免疫疾患でも自己攻撃性Ｔ細胞 の発現が関連すると考えられている。 破壊的な自己免疫反応は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）のような様々な疾患に関 わってきた。この疾患においては、多数の活性化リンパ球およびＭＨＣクラスＩ Ｉ発現細胞の存在から生じる慢性炎症過程によって、関節軟骨の完全性が破壊さ れる。単に軟骨が存在するだけで局所的な炎症反応を持続するのに十分 であると思われる：ＲＡにおいて、軟骨の分解は軟骨応答性の自己反応性Ｔ細胞 の活性に関連することが示されている（Ｓｉｇａｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒ ｈｅｕｍａｔ．６：５９，１９８８；Ｇｌａｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ．１８：７９６，１９９０；Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら、Ｒｈｅｕｍａｔ ｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｓｍｏｌｅｎ，Ｋａｌｄｅｎ，Ｍａｉｎｉ（編集 ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１ ９９２）。さらに、手術によってＲＡ患者から軟骨を除去すると、炎症過程が軽 減することが示された。それゆえ、軟骨のたんぱくは刺激性Ｔ細胞に応答能のあ る標的自己抗原であるとみなされる。これらの自己反応性Ｔ細胞の活性化が自己 免疫疾患の発症を導く。 軟骨の破壊をもたらす炎症反応は、ステロイド薬によって治療することができ る。しかし、これらの薬剤は非特異的な免疫抑制剤であり、有害な副作用を持つ 。非特異的免疫抑制の不都合さのゆえにこれは極めて好ましくない治療法となっ ている。 抗原特異的な無毒性免疫抑制療法は、非特異的免疫抑制に代わる非常に魅力的 な代替策を提供するであろう。この抗原特異的療法は、自己抗原から誘導される 、ＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ 細胞反応性ペプチドによる患者の治療を含む。これらのＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ 細胞反応性ペプチドは標的自己抗原のＴ細胞エピトープに対応し、投与したペプ チドと自己抗原の両方に対して特異的なＴ細胞耐性を誘発するのに使用すること ができる。Ｔ細胞媒介の関節軟骨破壊を治療するためにかかるペプチド誘発耐性 療法を有効に使用するには、炎症過程の原因となるＴ細胞を活性化している自己 抗原に対して患者を脱感作することができる、ＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞反応 性ペプチドが是非とも必要である。 本発明は、自己免疫疾患においてＴ細胞媒介の軟骨破壊に関連する自己攻撃性 Ｔ細胞に対して耐性を誘発するためのペプチド誘発耐性療法における使用に適し た、かかるＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞反応性ペプチドを提供する。より詳細に は、本発明は、関節炎、中でも慢性関節リウマチにおけるＴ細胞媒介の軟骨破壊 に関連する自己攻撃性Ｔ細胞に対して耐性を誘発するための、ペプチド誘発耐性 療法における使用に非常に適したＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞反応性ペプチドを 提供する。 本発明に従ったペプチドは１３〜５５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列 を持ち、かかるペプチドが少なくとも次のア ミノ酸配列（配列番号：１）を含むことを特徴とする： ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃Ｒ₄Ｒ₅ＹＰＩ ここで、Ｒ₁はＡまたはＳである;Ｒ₂はＱ、ＲまたはＧである；Ｒ₃はＴまたはＳ である；Ｒ₄はＶまたはＬである；及びＲ₅はＲまたはＱである。 より詳細には、本発明に従ったペプチドは次のアミノ酸配列（配列番号：２） を含む： ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃ＬＲ₅ＹＰＩ ここで、Ｒ₁はＡまたはＳである;Ｒ₂はＱ、ＲまたはＧである； Ｒ₃はＴまたはＳである；及びＲ₅はＲまたはＱである。 特に、本発明に従ったペプチドは、次のアミノ酸配列のうち少なくとも１つ： ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩ（配列番号：３）、ＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩ（ 配列番号：４）、ＡＧＷＬＡＤＧＳＬＲＹＰＩ（配列番号：５）またはＡＧＷＬ ＳＤＧＳＶＱＹＰＩ（配列番号：６）、あるいはそれらの組合せを含む。 好ましくは、本発明に従ったペプチドは１３〜３５個のアミノ酸残基、より好 ましくは１３〜２５個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を持つ。極めて好ま しいのは、１３〜１９個の残基から成るアミノ酸配列を持つペプチドである。特 に好まし いのは、ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩ（配列番号：３）、ＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲ ＹＰＩ（配列番号：４）、ＡＧＷＬＡＤＧＳＬＲＹＰＩ（配列番号：５）および ＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩ（配列番号：６）のアミノ酸配列から成るペプチド である。 本発明に従ったペプチドはまた、本発明に従ったペプチドによって形成される モノマー構築ブロックから構築される、たとえばダイマーやトリマーのような多 量体を含むことも理解される。これらのモノマー構築ブロックはスペーサー残基 によって任意に分離することができる。本発明に従った多量体は、多数のＴ細胞 反応性ペプチドを提供するという利点を持つ。 本発明は、本発明に従ったペプチドが、ヒト関節軟骨の成分である自己抗原た んぱく上に存在するＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープに類似するという事 実に帰する。より詳細には、本発明に従ったペプチドは、ヒト関節軟骨、ヒトア グレカン（ＨＡＧ）およびヒト軟骨リンクたんぱく（ＨＣＬＰ）の大きな凝集プ ロテオグリカン上に存在するＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープに類似する 。 意外にも、ＨＡＧの一次構造（シグナル配列のメチオニンから始まる）のアミ ノ酸残基２０１〜２１３、２９９〜３１１お よび６２３〜６３５ならびにＨＣＬＰの一次構造（シグナル配列のメチオニンか ら始まる）のアミノ酸残基２０７〜２１９が、自己免疫疾患、特に関節炎、中で も慢性関節リウマチにおける関節軟骨の破壊に結びつく軟骨反応性の自己攻撃性 Ｔ細胞によって認識される、ＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを表示する ことが判った。ＨＡＧおよびＨＣＬＰの一次構造は、各々Ｄｏｅｇｅら、Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６６，Ｎｏ．２：８９４−９０２（１９９１）お よびＤｕｄｈｉａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５ ：１２９２（１９９０）において述べられている。 関節軟骨たんぱくは、自己免疫疾患における関節軟骨の破壊に関わる刺激性自 己攻撃性Ｔ細胞に応答能のある標的自己抗原とみなされているが、軟骨反応性自 己反応性Ｔ細胞に関連するこれらのＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを軟 骨たんぱく、特にＨＡＧとＨＣＬＰ上で同定したのは本発明が初めてであった。 本発明に従ったペプチドはこれらのＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープに類 似しており、それ故ペプチド誘発のＴ細胞耐性療法において使用することができ るＴ細胞反応性ペプチドを提供する。従って、本発明に従ったペプチドによって 、 投与したペプチドだけでなく標的自己抗原であるＨＡＧおよびＨＣＬＰに対して も特異的なＴ細胞耐性を誘発するように患者を治療することができる。免疫系の 他の成分は本発明に従ったペプチドによって影響されないので、患者の免疫系は 無傷のままであり、他の感染に対して患者を保護することができる。 このように、本発明に従ったペプチドは、自己免疫疾患、特に関節炎、中でも 慢性関節リウマチにおけるＴ細胞媒介の関節軟骨破壊の治療において、古典的な ステロイド剤に代わる非常に魅力的な代替策を提供する。 本発明に従ったペプチドは既に記述されている。Ｐｅｒｉｎら，ＦＥＢＳ Ｌ ｅｔｔｅｒｓ ２０６：７３（１９８６）は、連結たんぱくとプロテオグリカン モノマーの構造的関係を記述し、連結たんぱくのトリプシン消化後に得られるペ プチドフラグメントを開示している。かかるペプチドフラグメントはＳＳＡＧＷ ＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩＳＫＡＲＰＮＸＧＧのアミノ酸配列を持つ。Ｇｏｅｔｉｎ ｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：２４０３−２４０８（１９８７）は 、連結たんぱくの一次構造のＡｓｎ²⁰⁷−Ｐｒｏ²²⁶およびＡｓｐ³⁰⁶−Ａｒｇ³²⁵ のアミノ酸残基に各々対応するペプチド、ＮＡＧＷＬＳＤＧ ＳＶＱＹＰＩＴＫＰＲＥＰおよびＤＡＧＷＬＡＤＧＨＳＶＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ を開示している。連結たんぱくとヒアルロン酸との間の相互作用を検討するため にかかるペプチドを合成し、かかるアミノ酸残基がヒアルロン酸への連結たんぱ くの結合に関わっていることが判った。Ｎｅａｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６１（８）：３５１９−３５３５（１９８６）は、ラット軟骨肉腫のプロテ オグリカン集合体からのリンクたんぱくの一次構造の説明を述べている。連結た んぱくのトリプシン消化の分析は、ＧＧＬＤＷＣＮＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩ ＴＫＰＲのアミノ酸配列を持つフラグメントを明らかにした。Ｐｅｒｉｄｅｓら 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．１０：５９８１−５９８７ （１９８９）は、グリアヒアルロネート結合たんぱく（ＧＨＢＰ）の単離と部分 的特性分析について述べている。ＧＨＢＰのトリプシン消化はいくつかのペプチ ドフラグメントをもたらし、その内のひとつはＥＱＬＦＡＡＹＥＤＧＦＥＱＣＤ ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩＲＡＰＲＶＧＣＹのアミノ酸配列を持つ。 しかしながら、これらの公表文献のいずれも、かかるペプチドが、免疫疾患に おける関節軟骨の破壊に関わる軟骨反応性自 己攻撃性Ｔ細胞によって認識される、ＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを 表示することは開示していない。またこれらの公表文献は、自己免疫疾患におい てＴ細胞媒介の関節軟骨破壊に結びつく自己攻撃性Ｔ細胞に対する耐性誘発のた めの、ペプチド誘発Ｔ細胞耐性療法におけるかかるペプチドの使用に関しては示 唆も暗示も行っていない。 本発明に従ったペプチドは、たとえばＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５ ：２１４９（１９６３）およびＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４（１９９０）に述べられている固相ペプチド合成 のような、ペプチド合成のための公知の有機化学的方法によって調製することが できる。 本発明に従ったペプチドはまた組換えＤＮＡ手法によっても調製することがで きる。本発明に従ったペプチドをコードする核酸配列あるいはかかるペプチドの 多量体を発現ベクターに挿入する。適切な発現ベクターは、特に、複製と発現の ために必要な制御領域を含むプラスミド、コスミド、ウイルスおよびＹＡＣ（酵 母人工染色体）である。発現ベクターは宿主細胞における発現をもたらすことが できる。適切な宿主細胞は、たとえ ば、細菌、酵母細胞および哺乳類細胞である。かかる手法は当業者には周知であ り、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９を参照のこと。 本発明に従って、Ｔ細胞媒介の関節軟骨破壊に罹患している患者を、本発明に 従った１つ以上のペプチドおよび製薬学的に許容される担体を含む治療組成物に よって治療することができる。本発明に従った製薬組成物の投与は、配列番号： １〜６のアミノ酸配列のひとつによって特徴づけられる同定されたＭＨＣクラス ＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを表示する、攻撃下にある関節軟骨中の自己抗原たん ぱくおよび他の自己抗原に対して特異的な、これらの患者の自己反応性Ｔ細胞の 耐性を誘発する。より詳細には、本発明に従った製薬組成物の投与は、自己抗原 ＨＡＧおよびＨＣＬＰに対する特異的自己攻撃性Ｔ細胞の耐性を誘発する。誘発 された耐性は、攻撃下にある関節軟骨において局所的炎症反応の軽減を導く。 本発明に従った製薬組成物において使用するのに非常に適し たペプチドは、かかるペプチドが配列番号：１および２に示されるアミノ酸配列 を少なくとも１つ含むことを特徴とする、１３〜５５個、好ましくは１３〜３５ 個、より好ましくは１３〜２５個、極めて好ましくは１３〜１９個のアミノ酸残 基を持つペプチドである。 本発明に従った製薬組成物において特に好ましいのは、かかるペプチドが配列 番号：３〜６に示されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含むことを特徴とする、 １３〜５５個、好ましくは１３〜３５個、より好ましくは１３〜２５個、極めて 好ましくは１３〜１９個のアミノ酸残基を持つペプチドである。 本発明に従った製薬組成物において極めて好ましいのは、かかるペプチドが配 列番号：１および２に示されるアミノ酸配列を持つことを特徴とする、１３個の アミノ酸残基を有するペプチドである。 本発明に従った製薬組成物において最も好ましいのは、配列番号：３、４、５ または６のアミノ酸配列を備えた、１３個のアミノ酸残基を有するペプチドであ る。 本発明に従ったペプチドは、免疫抑制ステロイド薬の非特異的抑制作用に比べ て、自己反応性Ｔ細胞への特異的作用を持ち、 従って免疫系の他の成分を無傷のまま残すという利点を有する。本発明に従った ペプチドによる治療は安全であり、有害な副作用は起こらないであろう。 耐性は、本発明に従った高用量あるいは低用量のペプチドを投与することによ って獲得できる。ペプチドの量は投与経路、投与時間、患者の年令ならびに全身 の健康状態と食事に依存する。 一般に、体重１ｋｇ当り０．０１〜１０００μｇのペプチド、好ましくは０． ５〜５００μｇ、より好ましくは０．１〜１００μｇのペプチドの用量が使用で きる。 製薬学的に許容される担体は当業者には周知であり、たとえば、滅菌食塩水、 乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、 ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油および水を含む。リポソームに包埋すること を所望する場合、他の担体は、たとえばＭＨＣクラスＩＩ分子でもよい。 さらに、本発明に従った製薬組成物は１つ以上のアジュバントを含みうる。適 切なアジュバントは、特に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アンフ ィゲン、トコフェロール、モノフォスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチドおよ びＱｕｉ ｌｌ Ａのようなサポニンを含む。アジュバントの量はアジュバント自体の特性 に依存する。 さらに、本発明に従った製薬組成物は、たとえば、ソルビトール、マンニトー ル、デンプン、スクロースデキストリンおよびグルコースを含む炭水化物、アル ブミンあるいはカゼインのようなたんぱく質、およびアルカリホスフェートのよ うな緩衝剤などの１つ以上の安定剤を含みうる。 適切な投与経路は筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射あるいは腹腔内注射、経 口投与および鼻内噴霧である。 本発明に従ったペプチドはまた、慢性炎症および関節軟骨の破壊に関わる活性 化自己反応性Ｔ細胞の存在を検出するための診断方法における使用にも非常に適 する。 本発明に従った診断方法は次の段階を含む： ａ）個体の血液サンプルからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離、 ｂ）適切な条件下でのかかるＰＢＭＣの培養、 ｃ）自己抗原あるいは本発明に従ってそれから誘導した１つ以上のペプチドの存 在下でのかかるＰＢＭＣ培養物のインキュベーション、および ｄ）個体における活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を示すＴ細胞の反応、たとえば 増殖反応の検出。 Ｔ細胞の増殖反応の検出は、たとえば、³Ｈ−チミジンの取込みによって検出 することができる。 また、本発明に従った１つ以上のペプチドを含む試験キットも本発明の範囲内 に属する。これらの試験キットは、本発明に従った診断方法における使用に適す る。 以下の実施例は本発明を例示するものであり、いかなる意味でも本発明の範囲 を制限するものとは解釈されるべきではない。 実施例 方法 患者 アメリカリウマチ学会（ＡＲＡ）の判定基準（Ａｍｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔ ｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：３１５，１９８８）に従ってＲＡに罹患していると診 断された患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。ＲＡ患者の疾患の重 症度は、レントゲンスコアによって決定したＩ−ＩＶ期の範囲であった。試験期 間中、患者をインドメタシン、メトトレキセート、糖質コルチコイドあるいは非 ステロイド系抗炎症薬で治療した。 ＭＨＣの型別 Ｄｙｎａｌ ＤＲ「低分解能」ＳＳＰキットを用いて、患者のＰＢＭＣの染色 体ＤＮＡ抽出物を分析した。ＤＲ４のサブタイピングはＤｙｎａｌ ＤＲＢ１^* ０４−ＳＳＰキットを用いて実施した。ＭＨＣタイピングデータの解釈は、Ｒａ ｄｂｏｕｄ病院の大学輸血サービス、Ｎｉｊｉｍｅｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅ ｒｌａｎｄｓの協力を得て行った。 ペプチド 本発明に従ったペプチドおよび対照ペプチドＩＨＡ（３０７−３１９）Ｆ、Ｐ ＫＦＶＫＱＮＴＬＫＡＴ（配列番号：７）を、固相ペプチド合成によって合成し た。簡単に述べると、ＰＥＧ−ＰＳ樹脂上のＦｍｏｃ／ｔＢｕ保護された活性化 エステルを用いて、完全自動化Ｍｉｌｌｉｇｅｎ９０５０シンセサイザーで遊離 アミノ末端およびカルボキシ末端を有するペプチドを合成した。ペプチドを樹脂 から開裂し、ＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオール／アニソール９０／５ ／３／２あるいはＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ ９５／５容量を用いて脱保護した。ペプチド を予備的ＨＰＬＣによって精製し、Ｄｏｗｅｘ Ａｃ樹脂で酢酸塩あるいは塩酸 塩に変換し、凍結乾燥した。ペプチドの純度と 同一性は、各々逆相ＨＰＬＣとＦＡＢ−ＭＳによって評価した。この試験で使用 したペプチドを表１に列挙する。３番目の残基（Ｙ）をＦで置換した、Ｎ末端ビ オチニル化インフルエンザ血球凝集素誘導のペプチド、ＩＨＡ（３０７−３１９ ）Ｆ、（ビオチン−ＮＨ−（ＣＨ₂）₅−ＣＯ−ＰＫＦＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ、配 列番号：７）を、ＤＲ４Ｄｗ４（ＤＲＢＩ^*０４０１）による結合試験における マーカペプチドとして使用した。ペプチド結合へのビオチン基の干渉を防ぐため に、スペーサーを通してビオチンをマーカペプチドのアミノ末端に連結した。 ＨＬＡ−ＤＲ分子のアフィニティー精製 ２つのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系、ＢＳＭ（ＤＲ４［ＤＲＢ１^* ０４０１］と型別される）およびＢＭ９２（ＤＲ４［ＤＲＢ１^*０４０４］と型 別される）はＡｃａｄｅｍｉｃ Ｈｏａｓｐｉｔａｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＤｒ．Ｍ．Ｏｕｄｓｈｏｏｍから提供された。細胞を 、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１％可欠アミ ノ酸（ＩＣＩ）、Ｌ−グルタミン、２−ＭＥおよび抗生物質を補足したダルベッ コ修正イーグル最小必須培地、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で培養した。細胞を１ ：２の割合で２〜３日ごとに常套的に継代させた。細胞を単離し、その後１ｍＭ ＰＭＳＦを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（４℃）中で３回洗浄した。 使用時まで細胞のペレットを−７０℃で保存した。ＨＬＡ−ＤＲ発現細胞を、Ｐ ＢＳ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中で３０ 分間、氷上で解凍し、溶解した。１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけ て（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＳＳ３４ローター）、溶解産物から核と残骸を取り除いた 。 ＨＬＡ−ＤＲ分子を、ＤＲ複合体上（Ｌａｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１２５：２９３，１９８０）の非多形性決定 基に対するモノクローナル抗体Ｌ２４３（ＡＴＣＣ）を用いて細胞溶解産物から アフィニティー精製した。たんぱくＧセファロース精製Ｌ２４３を、製造業者の 指示に従ってＮＨＳ−セファロース４ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結した。 浄化した細胞溶解産物を、０．４５μｍフィルターを通過させて、Ｌ２４３−Ｎ ＨＳセファロースビーズに加えた。一晩インキュベートした後、ビーズをカラム に移し、５倍量のＰＢＳ、１％ＮＰ−４０；５倍量のＰＢＳ、０．５％ＮＰ−４ ０；１５倍量のＰＢＳ、０．５％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ；５倍量のＰＢＳ 、０．０５％ＮＰ−４０；５倍量のＰＢＳ、１％ｎ−オクチル−グルコシド（Ｓ ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）ならびに５倍量の５０ｍＭジエチルアミ ン（Ｆｌｕｋａ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｎ−オクチル−グルコシドｐＨ ＝８．０で洗浄した。ＨＬＡ−ＤＲ分子を５０ｍＭジエチルアミン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｎ−オクチル−グルコシドｐＨ＝１１で溶出した。採集後直ち に、分画を２ＭグリシンｐＨ＝４．８で中和した。採集した分画を、非還元条件 下にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次いで銀染色に供した。精製ＨＬＡ−ＤＲを含 む分画をプールし、その後３０ｋＤカットオフ膜での限外濾過に よって濃縮した。 ペプチドＨＬＡ−ＤＲ結合検定 以前に述べられているような（Ｊｏｏｓｔｅｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：７５１，１９９４）半定量的結合検定を用いて、ペプチド結合試験を実施し た。精製したＨＬＡ−ＤＲ分子（０．０５−５μＭ）を、ｐＨ＝５．０で５０ｎ Ｍビオチニル化マーカペプチド（ＩＨＡ（３０７−３１９）Ｆ）および一定濃度 範囲の競合的ペプチド（ペプチドＨＡＧ１、ＨＡＧ２、ＨＡＧ３およびＨＣＬＰ １）と共に最終容量２５μｌの結合緩衝液（ＰＢＳ、１ｍＭＡＥＢＳＦ、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、８ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μＭペプスタチンＡ、０．０ １％ＮａＮ₃、０．０５％ＮＰ−４０および５％ＤＭＳＯ）中でインキュベート した。 室温で約４８時間インキュベートした後、結合したマーカペプチドと結合して いないマーカペプチドを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。半 乾燥ブロッティング系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてニトロセルロース膜（Ｈ ｙｂｏｎｄ ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）にたんぱくをブロットした 。ニトロセルロースフィルターを、０．１Ｍマレイン 酸ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で０．５％ＤＮＡブロック試薬（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってブロックした 。１時間後、フィルターをＰＢＳ、０．０５％トゥイーン２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓ ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）中で洗浄し、１：４０，０００希釈溶液中でＳｔｒｅ ｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） と共にインキュベートした。ビオチニル化ペプチドを、製造業者の指示に従って ウェスタンブロットＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を用いた増強 化学発光によって検出した。前フラッシュしたフィルム（ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ− ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を３０分間露光させた。 ＤＲＢ１^*０４０１あるいはＤＲＢ１^*０４０４をコードする分子に対しての本 発明に従ったペプチドの親和性はマーカペプチドとの競合に関係していた。この 相対的結合親和性ＩＣ₅₀（^eＩＣ₅₀）は、ビオチニル化マーカペプチドのシグナ ルが競合的ペプチド不在下でのシグナルの肉眼検査で５０％に低下するペプチド 濃度と定義した。 血液単核細胞の増殖反応 ペプチドＨＡＧ１、ＨＡＧ２、ＨＡＧ３およびＨＣＬＰ１を、ＰＢＭＣにおい て増殖反応を誘発する能力に関して試験した。ＰＶＭＣに関する増殖検定は、以 前に抗原特異的クラスＩＩ制限Ｔ細胞反応の活性化を測定するために使用されて いる（Ｇｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：１ １９９，１９８８）。 ヘパリン化静脈末梢血から採取したＰＢＭＣをフィコール−パック比重差での 標準遠心分離によって単離した。平底マイクロタイタープレートにおいて１０％ 熱不活化プールヒト血清、Ｌ−グルタミン、２−ＭＥおよび抗生物質を補足した ＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２培地中で１.５×１０⁵細胞／ウエルの濃度で３倍ある いは４倍に培養した。細胞を５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌあるいは０．５μｇ ／ｍｌの濃度で、培地単独中、あるいはＰＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下で 、あるいはニワトリプロテオグリカン分画、ニワトリ膠原分画、音波破砕したヒ ト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはペプ チドＨＡＧ１、ＨＡＧ２、ＨＡＧ３およびＨＣＬＰ１を含めた抗原の存在下でイ ンキュベートした。培養物を、５％ＣＯ₂の加湿大気中で、総容量２１０μｌと して３７℃で４、 ５、６あるいは７日間インキュベートした。細胞培養の最後の１８時間は、０． ５μＣｉ（１．８５×１０⁴Ｂｑ）の［³Ｈ］チミジン（［³Ｈ］ＴｄＲ）で培養 物をパルスした。ガラス繊維フィルターで細胞を分離し、［³Ｈ］ＴｄＲの取込 みをガスシンチレーションによって測定した。ガスシンチレーションによる計数 は液体シンチレーションに比べて５倍効率が低いことに留意しなければならない 。それ故、フィルターを５分間測定した（Ｐａｃｋａｒｄ Ｍａｔｒｉｘ ９６ β−カウンター；Ｍａｒｉｄｅｎ ＣＴ）。結果 ペプチドＨＬＡ−ＤＲ結合検定 ＤＲ４（ＤＲＢ１^*０４０１）およびＤＲ４（ＤＲＢ１^*０４０４）へのペプチ ドＨＡＧ１、ＨＡＧ２、ＨＡＧ３およびＨＣＬＰ１の結合を、アフィニティー精 製したＨＬＡ−ＤＲ分子を用いた直接半定量的競合結合測定において調べた。そ の結果を表２に示す。表２からわかるように、すべてのペプチドがＤＲ４（ＤＲ ＢＩ^*０４０１）に結合し、マーカペプチドと競合することができる。 ++=良好な結合剤、^eIC₅₀が１〜10μm;+=中間結合剤、^eIC₅₀が10〜100μM;+/-=不 良結合剤、^eIC₅₀が100〜1000μM;-=非結合剤、^eIC₅₀が1000μMを越える。 ＰＢＭＣ増殖検定 ペプチドＨＡＧ１、ＨＡＧ２、ＨＡＧ３およびＨＣＬＰ１に対するＴ細胞の反 応性を測定するために、ＲＡ患者におけるＰＢＭＣ増殖反応を分析した。表３は ５０μｇ／ｍｌで得た数値だけを示す。結果は３回あるいは４回の測定（５分当 りで計数）の平均で表わされている。平均の標準誤差は３０％を越えなかった。 下線を付した数値は陽性とみなされる（５分当りの計数＞１０００および刺激指 数ＳＩ＞２）。ほとんどの患者が本発明に従ったペプチドの少なくとも１つに対 して反応し、本発明 に従ったペプチドが自己免疫疾患に関連する自己攻撃性Ｔ細胞によって認識され ることを示した。 ND=実施せず、BG=バックグラウンド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 アミノ酸配列 １． ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃Ｒ₄Ｒ₅ＹＰＩ ここで、Ｒ₁＝Ａ、Ｓ Ｒ₂＝Ｑ、Ｒ、Ｇ Ｒ₃＝Ｔ、Ｓ Ｒ₄＝Ｖ、Ｌ Ｒ₅＝Ｒ、Ｑ を含むことを特徴とし、 但し、ＳＳＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩＳＫＡＲＰＮＸＧＧ、ＮＡＧＷＬＳＤＧ ＳＶＱＹＰＩＴＫＰＲＥＰ、ＤＡＧＷＬＡＤＧＨＳＶＲＹＰＩＳＲＰＲＫＲ、Ｇ ＧＬＤＷＣＮＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩＴＫＰＲあるいはＥＱＬＦＡＡＹＥＤ ＧＦＥＱＣＤＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩＲＡＰＲＶＧＣＹではない、１３〜５ ５個のアミノ酸残基を持つペプチド。 ２．少なくともアミノ酸配列 ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃ＬＲ₅ＹＰＩ ここでＲ₁＝Ａ、Ｓ Ｒ₂＝Ｑ、Ｒ、Ｇ Ｒ₃＝Ｔ、Ｓ Ｒ₅＝Ｒ、Ｑ を含むことを特徴とする、１３〜５５個のアミノ酸残基を持つペプチド。 ３．アミノ酸配列：ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩ、ＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩ 、ＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩおよびＡＧＷＬＡＤＧＳＬＲＹＰＩの少なくとも １つを含むことを特徴とする、１３〜５５個のアミノ酸残基を持つペプチド。 ４．アミノ酸配列：ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩ、ＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩ 、ＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩおよびＡＧＷＬＡＤＧＳＬＲＹＰＩの１つから成 るペプチド。 ５．１３〜５５個のアミノ酸残基を持ち、アミノ酸配列：ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃ Ｒ₄Ｒ₅ＹＰＩ、但しＲ₁＝Ａ、Ｓ、Ｒ₂＝Ｑ、Ｒ、Ｇ、Ｒ₃＝Ｔ、Ｓ、Ｒ₄＝Ｖ、Ｌ 、Ｒ₅＝Ｒ、Ｑ、を含む、薬剤として使用するためのペプチド。 ６．１３〜５５個のアミノ酸残基を持つペプチドを有し、該ペプチドはアミノ酸 配列：ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃Ｒ₄Ｒ₅ＹＰＩ、但しＲ₁＝Ａ、Ｓ、Ｒ₂＝Ｑ、Ｒ、Ｇ 、Ｒ₃＝Ｔ、Ｓ、Ｒ₄＝Ｖ、 Ｌ、Ｒ₅＝Ｒ、Ｑ、を含み、および製薬学的に許容される担体を含有する製薬的 調製物。 ７．１３〜５５個のアミノ酸残基を持つペプチドを有し、該ペプチドはアミノ酸 配列：ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃ＬＲ₅ＹＰＩ、但しＲ₁＝Ａ、Ｓ、Ｒ₂＝Ｑ、Ｒ、Ｇ、 Ｒ₃＝Ｔ、Ｓ、Ｒ₅＝Ｒ、Ｑ、を含み、および製薬学的に許容される担体を有する 製薬的調製物。 ８．アミノ酸配列：ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩ、ＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩ 、ＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩおよびＡＧＷＬＡＤＧＳＬＲＹＰＩの少なくとも １つを含む、１３〜５５個のアミノ酸残基を持つペプチドを含有する製薬的調製 物。 ９．ペプチド：ＡＧＷＬＡＤＱＴＶＲＹＰＩ、ＡＧＷＬＡＤＲＳＶＲＹＰＩ、Ａ ＧＷＬＡＤＧＳＬＲＹＰＩおよびＡＧＷＬＳＤＧＳＶＱＹＰＩの少なくとも１つ 、および製薬学的に許容される担体を含む製薬的調製物。 １０．アミノ酸配列：ＡＧＷＬＲ₁ＤＲ₂Ｒ₃Ｒ₄Ｒ₅ＹＰＩ、但しＲ₁＝Ａ、Ｓ、Ｒ₂ ＝Ｑ、Ｒ、Ｇ、Ｒ₃＝Ｔ、Ｓ、Ｒ₄＝Ｖ、Ｌ、Ｒ₅＝Ｒ、Ｑ、を含む、自己免疫疾 患においてＴ細胞が媒介する関節軟骨破壊に関連する自己攻撃性Ｔ細胞に対して 耐性 を誘発するためのペプチド誘発耐性療法において使用する製薬的調製物の製造の ための、１３〜５５個のアミノ酸残基を持つペプチドの使用。