MXPA02009698A - Identificacion de peptidos de subunidad alfa del receptor de acetilcolina, inmunodominantes, potenciales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al tratamiento de padecimientos autoinmunes, en particular de Miastenia Gravis; esta invencion proporciona peptidos dominantes, autoinmunes, novedosos derivados del receptor de acetilcolina, asi como metodos para preparar los peptidos; la presente invencion ademas proporciona complejos que comprenden estos peptidos asociados con una molecula de complejo de histocompatibilidad mayor, apropiada (MHC) y metodos para elaborar estos complejos; los complejos de la presente invencion se pueden usar de forma terapeutica o profilactica para el tratamiento de Miastenia Gravis.

Description

IDENTIFICACIÓN DE PEPTIDOS DE SUBUNIDAD ALFA DE RECEPTOR DE ACETILCOLINA, INMUNODOMINANTES. POTENCIALES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades autoinmunes son una clase particularmente importante de respuestas inmunes perjudiciales y constituyen un grave problema de salud en Estados Unidos, que afecta a más de nueve millones de personas. En las enfermedades autoinmunes, se pierde la tolerancia propia y el sistema inmune ataca el tejido propio, como si fuera un objetivo extraño. Careciendo de curas, estas enfermedades son generalmente crónicas y hay muchos casos fatales. Un método crudo de tratar las enfermedades autoinmunes es la inmunosupresión general. Esta tiene la desventaja obvia de estropear la habilidad del sujeto para responder a materiales extraños reales a los cuales necesita proveer una respuesta inmune. Un método tan sólo ligeramente más sofisticado se basa en la extirpación de los complejos inmunes que implican el tejido de objetivo. Este tiene también efectos secundarios adversos y es difícil de efectuar. Aparte de los agentes inmunosupresores, los cuales tienen efectos secundarios perjudiciales, hay pocos tratamientos efectivos de duración prolongada para cualquier enfermedad autoinmune. Hay más de 30 formas diferentes sistémicas o específicas en órgano de autoinmunidad con índices de incidencia variables. Aquéllas con poblaciones de pacientes relativamente grandes, tales como artritis reumatoide, diabetes de tipo I y esclerosis múltiple, se fijan como objetivo más frecuentemente por razones económicas obvias para el desarrollo de terapias novedosas. Un entendimiento creciente del papel que desempeñan los linfocitos T en el mantenimiento de la tolerancia y la patología de la autoinmunidad afirmó el desarrollo de una variedad de terapias específicas en antígeno destinadas a suprimir o eliminar células T autorreactivas, a la vez que se preserva la inmunidad protectora. Estas estrategias dependen de la identificación de los autoantígenos y los epítopes de péptidos de autoantígeno implicados en la enfermedad autoinmune. Para muchas enfermedades autoinmunes, incluyendo aquéllas con las poblaciones de pacientes más grandes, esta información es desconocida y completa o controvertida. La miastemia grave ( G) es una enfermedad autoinmune que afecta la unión neuromuscular y pone en peligro la vida. Se estima variablemente el tamaño de la población de pacientes en 25,000-100,000 (Drachman (1994) N. Eng. J. Med. 330:1797-1810; MG Foundation, 1997) y se anticipan números crecientes de casos conforme aumenta la edad media de población. La MG se caracteriza por autoanticuerpos al receptor de acetilcolina (AchR). Ciertos modelos de animales in vivo y fármacos inmunosupresores indican que la generación de estos autoanticuerpos es dependiente de células T CD4+. En la MG, los anticuerpos se unen al receptor de acetilcolina (AchR) sobre la membrana muscular en la unión neuromuscular, causando la endocitosis del AChR y el daño mediado por complemento. La pérdida de AChR reduce la eficiencia de la función muscular, con síntomas que varían de la fatiga a la deficiencia respiratoria. La MG ofrece varias ventajas para el desarrollo y la comprobación clínica de terapias específicas en antígeno, incluyendo la existencia de un autoantígeno bien caracterizado, el AChR. Se reconoce extensamente el AChR como el objetivo de células T y B autorreactivas, a diferencia de enfermedades, tales como esclerosis múltiple en que pueden estar implicadas múltiples proteínas de mielina (incluyendo proteína básica de mielina, proteína de proteolípido, glicoproteína de oligodendrocito de mielina, glicoproteína asociada con mielina, aB-cristalina, CNPasa y proteínas de choque térmico). Además, hay disponibles parámetros clínicos definitivos. Por ejemplo, la prueba de tensión, que mide la enfermedad temporal en el deterioro muscular debido al bloqueo de acetilcolinesterasa, y la detección de anticuerpos anti-AChR son herramientas diagnósticas para la MG. La enfermedad está asociada con HLA-DR3 en pacientes durante el ataque inicial y con HLA-DR2 en el ataque posterior. Además, se mide fácilmente la función muscular por electromiografía y se pueden determinar los niveles de anti-AChR por ELISA u otros ensayos relativamente sencillos, de modo que una prueba clínica de MG se beneficia de los indicadores sustitutos, definitivos y sencillos de la actividad de la enfermedad. A pesar de estas ventajas, se han sometido a prueba pocas estrategias terapéuticas en la MG.

La mayor dificultad en el desarrollo de terapias específicas de antígeno y la MG es la falta común de consensos sobre la identidad de los epítopes de AChR inmunodominantes. El AChR es un canal iónico pentamérico compuesto de a2ßed en músculo inervado de adulto y a2ß?d en músculo embriónico y desnervado y en células mioides del timo. La subunidad AchRa tiene el sitio de enlace para la acetilcolina así como la región inmunogénica principal (MIR) en 67-76, un sitio dominante del enlace de autoanticuerpos (Tzartos et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2899-2903). Aunque hay muchos informes de epítopes dominantes de células de AchR en la literatura, muchos de esos estudios no están corroborados y no hay consenso claro (reseñado, por ejemplo, en Manfredi et al. (1992) J. Lab. Clin. Med. 1 :13-21; Hawke et al. (1996) Immunol. Today 17:307-311 ). La mayoría de estos estudios dejaron de probar las restricciones de HLA-DR. Además, varios estudios basaron la identificación de péptidos ¡nmunodominantes en la generación de líneas de células T reactivas a péptidos sintéticos de AChR, pero en muchos casos estas células T dejaron de reaccionar al AChR nativo (Matsuo eí al. (1995) J. Immunol. 155-3683-3692; Hawke et al., mencionado anteriormente). No está claro por lo tanto si estas células T son artificios del sistema de ensayo. Ciertos estudios previos han examinado también las respuestas de células mononucleares sanguíneas periféricas en pacientes de MG a un conjunto de péptidos de AChR (véanse, por ejemplo, Harcourt et al. (1988) J. Clin. Invest. 82:1894; y Newsom-Davis et al. (1989) J. Autoimmun. 2:101 ). Los estudios sometieron a prueba, sin embargo, o bien un conjunto incompleto de péptidos de AChR o un conjunto de péptidos en que la sobreposición de péptidos consecutivos estaba limitada a pocos aminoácidos, carentes posiblemente del epítope pertinente. En otros casos, no se determinó la restricción de HLA-DR de la respuesta de las células T. Otros estudios han identificado péptidos inmunodominantes que unen alelos de HLA-DR y pueden tener significado para la MG, pero no se ha confirmado la reactividad de las células T a éstos. A pesar de estos progresos, la técnica carece de consenso sobre los péptidos de AChR inmunodominantes asociados con HLA-DR. Las terapias comunes para la MG no son específicas y en muchos casos tienen efectos secundarios perjudiciales. Por ejemplo, la plasmaferesis para separar anticuerpos es un método costoso y, cuando se termina, el título puede volver rápidamente y exceder el nivel de pretratamiento. Se administran algunas veces esteroides y otros inmunosupresores (por ejemplo, ACTH, azatioprina, y ciclosporina A), pero van acompañados algunas veces por nefrotoxicidad, hipertensión u otros riesgos de salud. La timectomia es efectiva en muchos casos, pero falla también a menudo, puede requerir hasta cinco años para establecer el efecto y está contraindicada en los muy jóvenes y los ancianos. Hay por lo tanto una necesidad en la técnica de métodos para tratar las enfermedades autoinmunes, en particular la MG, eficientemente, sin efectos secundarios graves y sin afectar el sistema inmune entero. Esta invención plantea esta y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones que se pueden usar para inhibir aquellos aspectos del sistema inmune responsables de la respuesta autoinmune en la miastenia grave. Las composiciones de la invención están diseñadas para fijar como objetivo células T colaboradoras que reconocen un antígeno particular en asociación con un componente de MHC. Las composiciones de la invención unen células T y causan la falta de sensibilidad en las células T de objetivo, proveyendo una terapia específica con menos efectos secundarios que las terapias previas. La invención provee identificación de péptidos de subunidad de AChR con afinidad relativamente alta con HLA-DR2 y HLA-DR3 y que pueden representar epítopes inmunodominantes de células T en pacientes de MG con estos haplotipos. Se pueden usar entonces estos péptidos para inducir la falta de sensibilidad en las células T de objetivo y tratar por lo tanto la MG. En una modalidad, la invención provee los péptidos. En otras modalidades, se pueden usar los péptidos en composiciones farmacéuticas para tratar la MG o se pueden complejar a una molécula de MHC y usar luego en una composición farmacéutica. En otra modalidad todavía, la invención provee un método para tratar la MG.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la posición de péptidos de AChR sobrepuestos, sometidos a prueba en el ensayo de afinidad DELFIA con HLA-DR2 y HLA-DR3. La figura 2 muestra un histograma de péptido 1 de AChRa/valores, que ilustra la afinidad relativa de los péptidos con HLA-DR2 y HLA-DR3. La figura 3 muestra los resultados de un ensayo ELISPOT para los PBMC de muestras normales de individuos sanos. Se considera que es positivo el índice reactivo de 2 o más para un antígeno particular. La figura 4 muestra los resultados de un ensayo ELISPOT para los PBMC procedentes de muestras de pacientes de MG. Se identifica como positiva la reactividad de células T, si el índice reactivo para un antígeno particular es mayor que dos. La figura 5 muestra una comparación del porcentaje del individuos sanos normales ("normales") o pacientes de MG ("pacientes") que muestran una reactividad positiva a diferentes péptidos de AChR. La figura 6 muestra una comparación de porcentaje de individuos sanos normales DR2+ ("normales") o pacientes de MG DR2+ ("pacientes") que muestran reactividad a los péptidos de AChR.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS I. Introducción La presente invención provee péptidos que se pueden usar para modular la función de las células T. Por ejemplo, se pueden enlazar los péptidos a una molécula de MHC y usar para inhibir una respuesta inmune perjudicial medida por células T, en particular en la miastenia grave. Además, se pueden usar los péptidos mismos para inducir la falta de sensibilidad y se pueden usar para tratar enfermedades. Se describe posteriormente por separado cada uno de los péptidos y los componentes de MHC con los cuales se pueden complejar, seguido esto por una descripción de los métodos mediante los cuales se preparan, evalúan y emplean los péptidos y los complejos. Se exponen los métodos generales adecuados para hacer y usar los complejos de MHC:péptidos de la invención, en la patente de E. U. A. 5,468,481 y en la solicitud de patente PCT WO 96/40944. En particular, esta invención provee novedosos péptidos de receptor de acetilcolina (AChR), polipéptidos de MHC de clase II y complejos de péptidos de MHC de clase ll:AChR. La invención provee formas aisladas (de fuentes naturales), sintéticas y generadas recombinantemente de péptidos de AChR y polipéptidos de MHC de clase II. Se pueden expresar estos péptidos y proteínas recombinantemente in vitro o in vivo. Se pueden hacer y aislar los péptidos, polipéptidos y complejos de la invención, usando cualquier método conocido en la técnica, y la invención provee algunos medios ejemplares para generar tales proteínas. Además, se enseña acerca de los medios para hacer los complejos de MHC de clase Ihpéptido, por ejemplo en las patentes de E. U. A. Nos 5,194,425, expedida el 16 de marzo de 1993; 5,130,297, expedida el 14 de julio de 1992; 5,284,935, expedida el 8 de febrero de 1994; 5,260,422, expedida el 9 de noviembre de 1993; y 5,468,481 , expedida el 21 de noviembre de 1995; y la solicitud de patente PCT No. WO 96/40944. Se describen procedimientos para la manipulación de ácidos nucleicos y la expresión recombinante de genes que codifican los péptidos de AChR, las moléculas de MHC de clase II y los complejos de péptidos de AChR:MHC de clase II de la invención, en la literatura científica y de patentes (véanse, por ejemplo, Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Ausubel eí al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); y Tijssen eí al., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybrídization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993)). Se pueden introducir mutaciones a un ácido nucleico mediante una variedad de procedimientos convencionales, bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un método rápido para realizar eficientemente la mutagénesis dirigida a sitios es la reacción en cadena de polimerasa de extensión por sobreposición (Urban (1997) Nucleic Acids Res. 25:2227-2228). Los métodos de secuenciación para verificar la secuencia de ácido nucleico interés usan típicamente secuenciación de didesoxi (Sequenase, U.S. Biochemical); sin embargo, otros equipos y métodos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se puede usar una variedad de sistemas y procedimientos de expresión in vivo para transformar células procarióticas y eucarióticas y es bien conocida por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477, Sambrook eí al.; y Tijssen et al., ambos mencionados anteriormente). Se pueden sintetizar también péptidos de AChR, moléculas de MHC de clase II y complejos de MHC de clase Ihpéptido de la invención, por completo o en parte, usando métodos clínicos bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; y Banga, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems Technomic Publishings Co., Lancaster, PA (1995)). Por ejemplo, se puede realizar la síntesis de péptidos usando varios procedimientos de fase sólida (véanse, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202, y Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) y se puede lograr la síntesis automatizada, usando por ejemplo el sintetizador de péptidos ABI 431 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante.

II. Definiciones Como se usa en la presente, un "péptido" o "oligopéptido" es una serie de residuos, típicamente L-aminoácidos, conectados uno a otro típicamente por enlaces de péptidos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de aminoácidos adyacentes. La longitud de los péptidos no es crítica para la invención, siempre que se mantengan los epítopes correctos. Los péptidos son típicamente menores que aproximadamente 30 residuos de longitud y constan usualmente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 residuos, preferiblemente de 14 a 20 residuos. Un "oligopéptido de AChR" es uno que tiene un secuencia derivada de una porción de AChR que se enlaza específicamente a una molécula de MHC en induce una respuesta inmune en células T asociadas con la miastenia grave. Un oligopéptido puede comprender una secuencia de AchR (por ejemplo, residuos 7-22 o 36-49) o una sustancialmente idéntica a la misma. El término abarca también varios análogos de tales secuencias, como se describe posteriormente. El término "residuo" se refiere a un aminoácido (D o L) o un mimético de aminoácido incorporado en un oligopéptido por un enlace de amida o mimético de enlace de amida. Un mimético de enlace de amida de la invención incluye modificaciones de estructura de base de péptido bien conocidas por los expertos en la técnica. "Mimético de aminoácido", como se usa en la presente, es una porción diferente de un aminoácido presente en la naturaleza que sirve conformacional y funcionalmente de sustituto de un aminoácido en un péptido de la presente invención. Tal porción sirve de sustituto de un residuo de aminoácido, si no entorpece sustancialmente la habilidad del péptido de enlazarse al AChR. Los miméticos de aminoácidos pueden incluir aminoácidos que no contengan proteína, tales como ß-?-d-aminoácidos, ß-?-d-iminoácidos (tales como ácido piperifin-4-carboxílico) así como muchos derivados de L-a-aminoácidos. Varios miméticos adecuados de aminoácido son conocidos por el experto en la técnica; incluyen ciclohexilalanina, ácido 3-ciclohexilpropiónico, L-adamantilalanina, ácido adamantilacético y similares. Algunos miméticos de péptido adecuados como péptidos de la presente invención son discutidos por Morgan y Gainor (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252. Se dice que dos polipéptidos son "idénticos", si la secuencia de residuos de aminoácido en las dos secuencias es igual, cuando se alinea para su máxima correspondencia. Se determina el "porcentaje de identidad de secuencia" comparando dos secuencias alineadas ópticamente sobre una ventana de comparación, en que la porción de la secuencia de polinucleótidos o aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir brechas), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje determinando el número de posiciones en que ocurre la base de ácido nucleico o el residuo de 1 aminoácido idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" de secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos para estos propósitos significa normalmente la identidad de secuencia por lo menos del 60%. El porcentaje preferido de identidad de los polipéptidos o polinucleótidos puede ser un número entero de 60% a 100%. Ciertas modalidades más preferidas incluyen por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% ó 99%. Los polipéptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias, como se indica anteriormente, excepto que las posiciones de los residuos que no son idénticas pueden diferir por cambios conservadores de los aminoácidos. "Sustituciones conservadoras de aminoácidos" se refieren a la capacidad de intercambio de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es el de glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es el de serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es el de asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es el de fenilalanina, tirosina y triftófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es el de licina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es el de cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores, preferidos, son los de: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutámico y asparagina-glutamina. Se puede efectuar la alineación óptima de secuencias, para su comparación, mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981 ) Add. APL. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineación de identidad de Needleman y Lipman (1988) Proc. Nathl. Acad. Sci. (E.U.A.) 85:2444, mediante la búsqueda del método de similaridad de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A.) 85:2444, mediante aplicaciones en computadora de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) o por inspección. Algunos ejemplos preferidos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul eí al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul eí al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul eí al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Se usan los BLAST y BLAST 2.0 con los parámetros descritos en la presente, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de las secuencias de ácido nucleicos y de aminoácidos de la invención. El soporte lógico para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de evaluación para calcular la evaluación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando la evaluación acumulativa de la alineación disminuye en la cantidad X a partir de su valor máximo logrado; la evaluación acumulativa se acerca a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de recibo de evaluación negativa; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. Para secuencias de aminoácidos, el programa usa por omisión una longitud de palabra de 3 y una expectación (E) de 10, y la matriz de evaluación de BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. La frase "aislado" se refiere a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que los acompañan normalmente, tal como se encuentra en su estado nativo. Los términos "inmunodominante" o "péptidos inmuno-dominantes", cuando se usan en la presente, se refieren a aquellos péptidos o epítopes de péptido que sirven de objetivo primario para una respuesta inmune. Los péptidos ¡nmunodominantes son típicamente aquéllos que producen anticuerpos en cantidades mayores y con afinidades de enlace más altas que los otros epítopes disponibles. La identificación de esto es importante, porque son los que se deben fijar como objetivo para combatir las enfermedades autoinmunes. La inmunodominación es la propiedad de ciertos epítopes dentro de un antígeno complejo (o ciertos residuos dentro de un epítope) que los hace los más críticos para inmunogenicidad o antigenicidad. El término "componente de MHC aislado", como se usa en la presente, se refiere a una glicoproteína de MHC o una porción efectiva de una glicoproteína de MHC (es decir una que comprende un antígeno que se une a un sitio o sitios y secuencias necesarios para el reconocimiento por el receptor apropiado de células T) que está en un estado diferente de su estado nativo, por ejemplo, no asociado con la membrana celular de una célula que expresa normalmente MHC. Como se describe posteriormente con detalle, el componente de MHC se puede producir recombinantemente, solubilizar a partir de la fuente de célula apropiada o asociar con un liposoma. Para moléculas de MHC humanas, se prefieren particularmente las células linfoblastoides humanas. El término "recombinante", cuando se usa con referencia por ejemplo a una célula o un ácido nucleico, una proteína o un vector, indica que la célula, el ácido nucleico, la proteína o el vector ha sido modificado por la introducción de una proteína o un ácido nucleico heterólogo o un ácido nucleico heterólogo o la alteración de una proteína o un ácido nucleico, o que se ha derivado la célula a partir de una célula así modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa "no recombinante") de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, se expresan deficientemente o no se expresan en absoluto.

El término "heterólogo", cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación de uno con otro en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce por lo general recombinantemente, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionadas dispuestas para hacer un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo un productor procedente de una fuente y una región de codificación procedente de otra fuente. Similarmente, la proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación de una con otra en la naturaleza (por ejemplo una proteína de fusión). El término "ligado operablemente" se refiere a un ligamiento funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor o un conjunto de sitios de enlace de factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en que la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. lll. El componente de MHC Se han estudiado extensamente las glicoproteínas tanto en el sistema humano como en el murino. El complejo de genes MHC se denomina complejo H-2 en los ratones y complejo HLA en los seres humanos. Se han clasificado las glicoproteínas de MHC en glicoproteínas de clase I, encontradas sobre la superficies de todas las células y reconocidas principalmente por las células T citotóxicas, y de clase II, que se encuentran sobre la superficies de varias células, incluyendo células accesorias tales como macrófago, y están implicadas en la presentación de antígenos a células T colaboradoras. Se han aislado y caracterizado algunas de las proteínas de histocompatibilidad. Para una reseña general de la estructura y la función de las glicoproteínas de MHC, véanse Paul, Fundamental Immunology, 2a Ed., Ravens Press N.Y. (1989) y Alberts eí al., Molecular Biology ofthe Cell, 2a Ed., Garland Publishing, Inc., N.Y. & London (1989). Las moléculas de MHC de clase II son particularmente útiles en la presente invención. Se forma una molécula de MHC de clase II a partir de porciones de dominio N-terminales de dos cadenas de clase II que se extienden desde la capa doble membranácea. La porción N-terminal de una cadena tiene dos dominios de homología con las regiones alfai y alfa2 de la secuencia de antígenos de MHC de clase I. La bolsa de unión es abierta por ambos lados en moléculas de clase II, de manera que tiene espacio para péptidos más largos. Se ha descrito la estructura tridimensional de HLA-DR1 (Brown eí al. (1993) Nature 364:33). La clonación de los genes de clase II permite la manipulación de los dominios de unión de MHC de clase II por ejemplo como se describen posteriomente. Se pueden obtener las porciones de glicoproteína de MHC de los complejos de la invención, por aislamiento a partir de lipocitos, y seleccionar en cuanto a la habilidad de unirse al antígeno deseado de péptido. Los linfocitos son de las especies de individuos que se tratarán con los complejos. Por ejemplo, se pueden aislar de células B humanas de un individuo que padezca de la enfermedad autoinmune fijada como objetivo, las cuales se hayan inmortalizado por transformación con un virus de Epstein-Barr deficiente en su replicación, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos para purificar proteínas de histocompatibilidad de clase II son bien conocidos en la técnica. Se pueden aislar a partir de una multiplicidad de células, usando una variedad de procedimientos. Por ejemplo, se pueden solubilizar las glicoproteínas, por tratamiento con proteasa, por tratamiento con KCl a 3M o por tratamiento con un detergente. En un método preferido, se usa una extracción con detergente con proteína de clase II procedente de linfocitos, seguido esto por la purificación de afinidad (véase, por ejemplo Turkewitz, eí al. (1983) Molecular Immunology 20:1139-1147). Se han desarrollados varios métodos para producir heterodímeros convenientes de histocompatibilidad de MHC de clase II que no presenten antígenos endógenos (Stern and Wiley (1992) Cell 68:465-77; Ljunggren eí al. (1990) Nature 346:476-80; y Schumacher eí al. (1990) Cell 62:563-67) que se pueden cargar con un péptido selecto. Alternativamente, se puede expresar recombinantemente el componente de MHC, usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Se conoce la secuencia de aminoácidos de cada una de un número de proteínas de clase II y se han clonado los genes o los ADNc. De esta manera, se pueden usar estos ácidos nucleicos para expresar polipéptidos de MHC. Si no está disponible un gen de MHC o ADNc deseado, se pueden usar métodos de clonación conocidos por los expertos en la técnica para aislar los genes. Uno de tales métodos que se pueden usar es purificar el polipéptido de MHC deseado, obtener una secuencia parcial de aminoácidos, sintetizar una sonda de nucleótidos con base en la secuencia de aminoácidos y usar la sonda para identificar clones que albergan el gen deseado procedente de un ADNc o una genoteca. Se pueden expresar polipéptidos de MHC procedentes de secuencias de nucleótidos clonadas que codifican los polipéptidos de MHC, ligando operablemente los ácidos nucleicos truncados o de longitud completa a señales que dirigen la expresión de genes en un hospedero deseado. Una variedad de hospederos adecuados está disponible y es conocida por los expertos en la técnica. Se pueden expresar entonces ¡ntracelularmente los polipéptidos de MHC o se pueden secretar a partir de la célula, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden modificar las secuencias de nucleótidos usadas para transfectar las células hospederas, de acuerdo con procedimientos normales para dar polipéptidos de MHC con una variedad de propiedades deseadas. Muchos procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos de MHC pueden variar de la secuencia presente en la naturaleza al nivel de estructura primaria en las instalaciones de aminoácidos, sustituciones, supresiones y similares. Se pueden utilizar también funciones de proteínas que confieran nuevas actividades o combinaciones de actividades al polipéptido de MHC. Se pueden usar estas modificaciones en varias combinaciones para producir la cadena final de polipéptido de MHC modificado. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos con varios objetivos en mente, incluyendo la facilitación de la purificación y la preparación del polipéptido recombinante. Los polipéptidos modificados son también útiles para modificar la vida media terapéutica, y mejorar la eficacia terapéutica y disminuir la severidad o la ocurrencia de efectos secundarios durante el uso terapéutico. Las variantes de secuencias de aminoácidos son variantes usualmente predeterminadas, no presentes en la naturaleza, pero que exhiben la misma unión en péptidos y actividad de unión de células T que el MHC de secuencia nativa. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de polipéptido que comprenden solamente una porción (usualmente por lo menos de aproximadamente 60-80%, típicamente de 90-95%) de la estructura primaria. En ciertas modalidades preferidas, los polipéptidos de MHC constan esencialmente ya sea del dominio a? o ßi del polipéptido de longitud completa. Tales segmentos comprenden típicamente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 aminoácidos, preferiblemente entre aproximadamente 60 y aproximadamente 90, más preferiblemente entre aproximadamente 70 y aproximadamente 80. Alternativamente, se pueden usar métodos sintéticos para preparar polipéptidos (véanse, por ejemplo, Merrifield (1986) Science 232:341-347; Atherton eí al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford). Se puede confirmar la composición de los péptidos sintéticos por análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; (véase, por ejemplo, Creighton Proteins, Structures and Molecular Principies, Freeman and Co., New York NY (1983)), o mediante cualquier otro procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica. En general, se efectúan fácilmente las modificaciones de las secuencias que codifican los polipéptidos de MHC, mediante una variedad de procedimientos bien conocidos, tales como la mutagénesis dirigida al sitio (véanse, Gillman y Smith (1979) Gene 8:81-97; y Roberts eí al. (1987) Nature 328:731-734). Se evalúa la mayoría de las modificaciones mediante selección de rutina en un ensayo adecuado para la característica deseada. Por ejemplo, se puede determinar fácilmente el efecto de varias modificaciones en habilidad del polipéptido de unirse a un péptido o afectar la proliferación de células T, usando los ensayos descritos posteriormente. Se ensayan todas las modificaciones de otras propiedades, tales como oxidación-reducción o estabilidad térmica, naturaleza hidrófoba, susceptibilidad a la proteólisis con la tendencia a agregarse de acuerdo con procedimientos normales. Para ciertas aplicaciones, se modifican las secuencias de codificación de ADNc de MHC para suprimir el dominio transmembranáceo y expresar los polipéptidos de MHC solubles que resultan. Se puede realizar el truncamiento de ADNc de MHC, por ejemplo por mutagénesis de supresión dirigida a oligonucleótidos o por reacción en cadena de polimerasa. La mutagénesis in vitro dirigida a oligonucleótidos es descrita, por ejemplo, por Kunkel eí al. (1987) Meth. Enzymol. 154:367-382 (véase también, Ausubel eí al., mencionado anteriormente).

IV. Péptidos Se cree que la presentación del antígeno por la glicoproteína de MHC sobre la superficie de células que presentan antígenos (APC) ocurre subsiguientemente a la hidrólisis de proteínas antigénicas a unidades de péptido más pequeñas. Se cree que estos segmentos son de 8-18 residuos de longitud y contienen tanto en agrétope (reconocido por la molécula de MHC) como el epítope (reconocido por el receptor de células T sobre la célula colaboradora T). El epítope mismo es una secuencia contigua o no contigua de 5-6 aminoácidos que reconoce el receptor específico en antígeno de las células colaboradoras T. El agrétope es una secuencia continua o no continua que es responsable de la asociación del péptido con las glicoproteínas de MHC. Se pueden identificar péptidos importantes en la MG, por ejemplo, seleccionando un conjunto de péptidos de AChR que se sobreponen para unirse a HLA-DR2 y HLA-DR3. Se puede medir la afinidad de unión de un péptido al compuesto de MHC, usando una variedad de ensayos de unión conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo de ensayo de unión adecuado es el ensayo de unión competitivo a base de europio (véase, por ejemplo, Tompkins eí al., (1993) J. Immunol. Methods 163:209-216). Adicionalmente, se puede determinar la capacidad de los péptidos de la invención de inducir una respuesta de las células T, usando una variedad de métodos normales, conocidos por los expertos en la técnica, como se describe posteriormente. Típicamente, los péptidos de la invención comprenderán secuencias de aminoácidos correspondientes, o sustancialmente idénticas o similares, a secuencias de aminoácidos en AChR. Se pueden aislar los péptidos de la invención a partir de fuentes naturales, sintetizar o expresar recombinantemente, usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden modificar los péptidos que tiene la actividad deseada, como necesarios para proveer ciertos atributos deseados, por ejemplo, características farmacológicas mejoradas, mientras que se aumenta o se retiene por lo menos sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para unir la molécula de MHC deseada e inducir la falta de sensibilidad de la célula T apropiada. Por ejemplo, los péptidos pueden estar sujetos a varios cambios, tales como sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras, en que tales cambios podrían proveer ciertas ventajas en su uso, tales como unión de MHC mejorada. Se puede comprobar también el efecto de sustituciones únicas de aminoácidos, usando D-aminoácidos. Se pueden hacer tales modificaciones, usando lis bien conocidos procedimientos de síntesis de péptidos, como describe, por ejemplo, Merrifield (1986) Science 232:341-347; Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, eds.

(N.Y., Academic Press), págs. 1-284 (1979); y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2a Ed. (1984). Se pueden modificar también los péptidos, extendiendo o disminuyendo la secuencia de aminoácidos del péptido, por ejemplo mediante la adición o la supresión de aminoácidos. Se pueden modificar también los péptidos de la invención, alterando el orden o la composición de ciertos residuos, apreciándose fácilmente que no se pueden alterar generalmente ciertos residuos de aminoácidos esenciales para la actividad biológica, por ejemplos aquéllos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, sin el efecto adverso en la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no deben estar limitados necesariamente a los que están presentes por naturaleza en las proteínas, tales como L-a-aminoácidos o sus D-isómeros, pero pueden incluir también aminoácidos no naturales, tales como ß-?-d-aminoácidos, así como muchos derivados de L-a-aminoácidos. Típicamente, se emplea una serie de péptidos con sustituciones únicas de aminoácidos, para determinar el efecto de carga electrostática, naturaleza hidrófoba, etc. en la unión. Por ejemplo, se hace una serie de sustituciones de aminoácidos con carga positiva (por ejemplo Lys o Arg) o con carga negativa (por ejemplo, Glu), sobre la longitud el péptido que revela diferentes patrones de sensibilidad hacia las varias moléculas de MHC y receptores de células T. Además, se pueden emplear múltiples sustituciones usando porciones pequeñas, relativamente neutras, tal como Ala, Gly, Pro, o residuos similares. Las sustituciones pueden ser homooligómeros o heterooligómeros. El número y los tipos de residuos que son sustituidos o añadidos dependen de la separación necesaria entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo naturaleza hidrófoba con respecto a naturaleza hidróflia). Se logrará también la afinidad de unión incrementada para una molécula de MHC o receptor de células T, mediante tales sustituciones, en comparación con la afinidad del péptido de origen. De cualquier manera, tales sustituciones deben emplear residuos de aminoácido u otros fragmentos moleculares escogidos para evitar, por ejemplo, interferencia estérica o de carga que pudiera deshacer la unión. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos. Se pueden combinar sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas, para llegar a un péptido final. Las variantes sustitucionales son aquéllas en las cuales se ha separado un residuo de un péptido e insertado un residuo diferente en su lugar. Se hacen generalmente tales sustituciones, de acuerdo con el siguiente cuadro 1 , cuando se desea modular finamente las características del péptido.

CUADRO 1 Se hacen cambios sustanciales de función (por ejemplo afinidad con las moléculas MHC o receptores de células T), seleccionando sustituciones que son menos conservadores que las del cuadro 1 , es decir seleccionando residuos que difieren más significantemente en su efecto en mantener a) la armazón de la estructura de base de péptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una hoja o una conformación helicoidal, b) la carga o la naturaleza hidrófoba de la molécula en el sitio del objetivo o c) la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que produzcan los cambios más grandes de las propiedades de los péptidos serán aquéllas en las cuales a) se sustituye un residuo hidrófilo, por ejemplo 2 serilo, por (o con), un residuo hidrófobo, por ejemplo leucilo, ¡soleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; b) se sustituye un residuo que tenga una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, por (con) un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o c) se sustituye un residuo que tenga una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, por (con) uno que no tenga una cadena lateral, por ejemplo glicina. Los péptidos pueden comprender también isósteros de dos o más residuos en el péptido inmunogénico. Se define aquí un isóstero como una secuencia de dos o más residuos que se pueden sustituir por una segunda secuencia, porque la conformación estérica de la primera secuencia se ajusta a un sitio de unión específico para la segunda secuencia. El término incluye específicamente modificaciones de estructura de base de péptido bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno de amida, el a-carbono, el carbonilo de amida, el reemplazo completo de enlace de amida, las extensiones, las supresiones y los entrelazamientos de estructura de base (véase, en general, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. Vil (Weinstein Ed., 1983)): Además, se pueden modificar también los péptidos por ligadura a otras moléculas. Por ejemplo, se pueden introducir diferentes grupos N- o C-terminales para alterar las propiedades físicas y/o químicas de la molécula. Se pueden utilizar tales alteraciones para afectar, por ejemplo, la adhesión, la estabilidad, la biodisponibilidad, la localización o la detección de las moléculas. Con propósitos diagnósticos, se puede ligar una extensa variedad de marcas al terminus, el cual puede proveer, directa o indirectamente, una señal detectable. Así, se pueden modificar los péptidos de la presente invención de una variedad de maneras con una variedad de propósitos finales, mientras que se retiene todavía la actividad biológica. Así, además de los péptidos derivados directamente de la secuencias de aminoácidos de AChR, se puede usar un número de análogos conformacionales de aquellas secuencias. Como se usa en la presente, "análogos conformacionales" son moléculas que tienen organización espacial o polar, suficientemente similar a las secuencias de aminoácidos del AChR para enlazar un componente de MHC. Los análogos conformacionales de la invención pueden constar enteramente de residuos de aminoácidos diferentes de los que se encuentran en la secuencia de AChR.

V. Formación del complejo Se pueden usar complejos solubles de heterodímero de MHC:péptido de la presente invención, como antagonistas para bloquear terapéuticamente el enlace de las células T particulares y las células que presentan antígenos. Además, las moléculas pueden inducir alergia, o falta de sensibilidad proliferativa, en las células T fijadas como objetivo. Se pueden asociar los elementos del complejo por medios normales conocidos en la técnica. Se pueden asociar no covalentemente los péptidos con el sitio de enlace de antígeno de la proteína de MHC, por ejemplo mezclando dos componentes. Se puede separar el péptido en exceso mediante cualquiera de un número de procedimientos normales, tales como ultrafiltración o diálisis. Se pueden enlazar covalentemente también a la bolsa de enlace antígeno, usando procedimientos normales, tales como marcación de fotoafinidad (véanse, por ejemplo, Hall (1985) Biochemistry 24:5702-5711 ; Leuscher (1990) J. Biol. Chem. 265:11177-11184; Wraith (1989) Cell 59:247-255) o cualquier otro modo adecuado de enlace (véanse, por ejemplo, Husain (1995) Biochem. Mol Biol. Int. 36.669-677; Traut (1995) Biochem. Cell Biol. 73:949-958; Haselgrubler (1995) Bioconjug. Chem. 6:242-248; y Carroll (1994) Bioconjug. Chem. 5:248-256). Alternativamente, se puede diseñar el complejo de clase llipéptido como un polipéptido recombinante contiguo (véanse, publicaciones de PCT Nos. WO 97/40944, 19 de diciembre de 1996; WO96/40194, 19 de diciembre de 1999; y WO97/04360, 6 de noviembre de 1997). Una molécula fundida de heterodímero de MHC:péptidos dirigida hacia una enfermedad autoinmune deseada (por ejemplo miastenia grave) contiene el péptido antigénico implicado para la enfermedad autoinmune (por ejemplo un péptido de AChR), posicionado, apropiadamente en el surco de enlace de la molécula de MHC, sin necesidad de solubilización del MHC o la carga exógena de un péptido producido independientemente. En tal complejo, se ligan permanentemente el componente de MHC y el péptido antigénico a una sola configuración de cadena. Esos complejos eliminan la carga ineficiente o no específica de péptido. La producción de los complejos reclamados de MHC: péptido por metodología recombinante resulta en la producción específica de proteína de alto rendimiento entre el producto final contiene solamente el complejo de elección de MHC: péptido, configurado apropiadamente. Se puede sintetizar un oligonucleótido que codifica el péptido, usando los codones conocidos para cada aminoácido. Preferiblemente, se utilizan aquellos codones que tienen utilización preferida en el organismo que se ha de usar, para diseñar el oligonucleótido. Se conoce en la técnica el uso preferido de codones para una variedad de organismos y tipos de células. Se puede incorporar entonces una secuencia adecuada a la secuencia que codifica los péptidos derivados del componente de MHC, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. El sitio de incorporación será tal que, cuando se expresa y pierda la molécula, se enlazará el antígeno de péptido de AChR al sitio de enlace de antígeno del componente de MHC y estará disponible como epítope para las células de objetivo. Por ejemplo, se pueden conectar un péptido de AChR, expuesto aquí al sitio de enlace de antígeno N-terminal de un polipéptido derivado de un antígeno de MHC asociado con la MG, usando el procedimiento recombinante normales de ADN. Si se ha de usar el complejo recombinante en factores, por ejemplo, se puede incorporar el péptido de AChR a una secuencia que codifique ya sea la cadena l-Ab-alfa o l-Ab-beta. Si se ha de incorporar el péptido de AChR a la cadena beta, por ejemplo, se puede insertar el oligonucleótido como reemplazo del péptido principal. Se conocen en la técnica métodos de reemplazar secuencias dentro de los polinucleótidos.

Se puede usar un protocolo similar para la incorporación del péptido de AChR a una secuencia que codifique un péptido derivado del antígeno de HLA humano apropiado. Por ejemplo, en seres humanos, el haplotipo de DR2W2W está asociado con la MG. Por consiguiente, se puede incorporar el péptido de AChR, por ejemplo a una secuencia que codifique una cadena beta de un alelo DR2. Se conoce la base la estructural en la subregión DR para las principales especificidades serológicas DR 1-9 como lo son las secuencias que codifican las cadenas HLA-DR-beta a partir de un número de haplotipos de DR (véase, por ejemplo, Bell eí al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6234-6238). Se pude ligar el péptido de antígeno autoinmune y el componente de MHC a través de ligaduras de péptido. Sin embargo, otros modos de ligaduras son obvios para los expertos en la técnica y podrían incluir, por ejemplo la unión a través de grupos carbohidratos sobre las glicoproteínas, incluyendo, por ejemplo, porciones de carbohidrato de las cadenas alfa y/o beta. Se pueden valorar de varias maneras las propiedades físicas y biológicas de los complejos solubles fundidos, de heterodímero de MHC:péptido. Se usan habitualmente en la técnica métodos y análisis de espectros de masa, tales como electroaspersión y análisis de espectrometrías de masas de tiempo de vuelo de disolución/ionización por láser asistida por matriz (MALDI TOF), para proveer tal información como peso molecular y confirmar la formación de enlace de disulfuro. Se puede usar análisis de FAC para determinar el plegado apropiado del único del complejo de cadena. Se puede usar además un número de ensayos normales, tal como ensayo inmunosorbente ligado a enzimas, para pedir la concentración y confirmar el plegado correcto del MHC soluble, fundido (véase, por ejemplo WO96/40944).

VI: Medición de las respuestas de las células T inducidas por los péptidos y los complejos de la presente invención Se pueden ensayar los péptidos y los complejos de AChR:MHC de clase II, usando una variedad de modelos in vitro bien conocidos en la técnica. Para activar las células T CD4+, no es suficiente el enlace por TCR en el MHC de clase Ihpéptido. Se necesita una señal "coestimuladora", adicional. La interacción de un complejo de la invención de MHC de clase I péptido con TCR carece de una señal coestimuladora. Así, se induce un estado de falta de sensibilidad de células T específica del antígeno (Boussiotis (1994) Curr. Opin. Immunol. 6:797-807; Park (1997) Eur. J. Immunol. 27:1082-1090) se puede causar esta inmunosupresión "tolerancia" o "alergia" y falta de sensibilidad de reposición, por alergia clonal de células T por una falta de sensibilidad inducidas por citocinas inmunosupresoras, o ambos (Schwartz (1989) Cell 57:1073-1081; Quill (1987) J. Immunol. 138:3704-3712). El grado de ¡nmunosupresión o falta de sensibilidad a la no exposición (es decir, tolerancia, anergia) se pueden medir con el monitoreo de la proliferación celular, el metabolismo celular, secreción de citocinas o linfocinas, o cualquier forma de activación celular. De igual manera, se pueden medir las respuestas de la célula T inducidas por los péptidos de la invención, utilizando los métodos enumerados anteriormente. La activación de la célula T se puede medir mediante una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la proliferación de las células T se puede calcular midiéndola por la captación de 3H-timidina o por la captación de bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-7')-2,5 difeniltetrazolio (ver, ej., Liu (1997) J. Neuriochem. 69:581-593). Alternativamente, como las células T sintetizan y secretan citocinas en su activación, la eficacia inmunosupresora de un complejo MHC Clase ll:peptido y las respuestas de la célula T inducidas por los péptidos de la invención se pueden calcular midiendo la transcripción, la translación o secreción de citocina. Así, se puede cuantificar una gran variedad de citocinas y linfocinas, por ejemplo, interieucinas, interferones (INF) (por ejemplo, INF gama), factores de necrosis tumoral (TNF) (ejemplo TNF beta) y similares. Los métodos para medir la producción y/o secreción de citocina y linfocina son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, pruebas ¡nmunológicas, como la prueba de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA).

Otras pruebas que se pueden utilizar incluyen la prueba ELISPOT. La prueba ELISPOT es una ELISA modificada que permite la detección de la secreción de linfocina por células T individuales, en respuesta a la estimulación con antígeno (Czerkinsky et al. (1989) J. Immunol. Methods 110:29-36). En esta prueba, un Ab monoclonal de captura contra una linfocina particular se coloca en un filtro (por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa o PVDF) y se añaden a los pozos células mononucleares periféricas de la sangre (PBMC) + antígeno. Con la estimulación, las células T secretan linfocinas que son capturadas localmente por el anticuerpo antilinfocina colocado. Al final de la fase de captura (generalmente de 24 horas) las células son lavadas y se detecta la linfocina secretada. La secreción de linfocinas diferentes se puede medir utilizando las pruebas ELISPOT de la invención, incluyendo por ejemplo, IL-2, IL-4, etc. La linfocina secretada se puede detectar, por ejemplo, con un segundo anticuerpo antilinfocina. Este segundo anticuerpo antilinfocina se puede marcar, o acoplar directa o indirectamente a una etiqueta o a una enzima fácilmente detectable (por ejemplo, fosfatasa alcalina). Están disponibles numerosas etiquetas y enzimas que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención, y son conocidas para los expertos en la técnica. En el lugar en donde hay una linfocina secretada por una célula T estimulada, se forma una mancha. Esta técnica es más sensible que las pruebas ELISA, ya que ha sido utilizada por muchos grupos para estudiar la respuesta de la célula T de los pacientes MG (ver, ej., Link et al. (1991) J. Clin. Invest. 87:2191-2196; Sun eí al. (1992) Eur. J. Immunol. 2:1553-1559; Yi eí a/.(1994) J. Neuroimmunol. 50:177-186; Newsom-Davis eí al. (1989) J. Autoimmun. 2:101-108; Ahlberg et al. (1992) J. Immunol. 36:435-442; Link eí al. (1992) J. Immunol. 36:405-414). Además, una prueba ELISPOT modificada, llamada la prueba de expansión clonal ELISA-Spot (o CEE-SPOT) también se puede utilizar en el contexto de la presente invención. En la prueba CEE-SPOT, los PBMC son estimulados con antígeno durante una cantidad de tiempo apropiada (por ejemplo 7 días) para promover la proliferación de células T específicas de antígeno, antes de la reestimulación y la captura de linfocina (por ejemplo, en el día 10). Esta expansión clonal de las T reactivas mejora de manera significativa la sensibilidad de la prueba. La producción de linfocinas se puede medir utilizando esta prueba, incluyendo, por ejemplo, IL-2, IL-4, etc. Típicamente, la linfocina se captura en un filtro, de preferencia un filtro PVDF para mejorar el trasfondo y la intensidad de las manchas. El conteo de manchas típicamente se lleva a cabo utilizando una cámara de video para hacer la imagen y análisis por computadora. Este tipo de prueba también se puede utilizar para identificar los epítopes derivados del procesamiento natural, primero estimulando las células T con la proteína entera y después volviéndolas a estimular con péptidos derivados de la proteína. También se puede monitorear la muerte celular, ya que se ha observado que la incubación prolongada de las células T inactivas con complejos MHC Clase ll:peptido, da como resultado la apoptosis de la célula T (Arimilli (1996) Immunol. Cell Biol. 74:96-104). La muerte celular se puede medir mediante una variedad de procedimientos conocidos, por ejemplo, por permeabilidad de exclusión de colorante. La apoptosis se puede calcular utilizando, por ejemplo la fragmentación de ADN celular, observación (como con microscopía de transmisión de electrones), detección y cuantificación de la proteína asociada con apoptosis, como bcl-2, y similares (ver, ejemplo., Arimilli (1996)s¿ypra). Los complejos solubles de heterodímero MHC:péptido de la presente invención también se pueden probar in vivo en una cantidad de modelos animales de enfermedad autoinmune, en particular en el modelo experimental de miastenia grave alérgica.

Vil. Formulación v administración de las composiciones farmacéuticas de la invención Si se incluye la región transmembranal de la subunidad MHC, las composiciones de la invención se administran convenientemente después de haber sido incorporadas en monocapas o bicapas de lípido. Normalmente los liposomas se utilizan para este propósito, pero se puede utilizar cualquier forma de membrana de lípido, como las membranas planas de lípido o las membranas celulares de una célula (por ejemplo, célula de glóbulo rojo). Las composiciones también se incorporan convenientemente en micelas. Los liposomas se pueden preparar mediante métodos estándar, como se describe más adelante. Sin embargo, si es eliminada la región transmembranal, la composición se puede administrar en una manera utilizada convencionalmente para los productos farmacéuticos que contienen péptidos. La administración es sistémica y se efectúa mediante inyección, de preferencia intravenosa, así se pueden utilizar las formulaciones compatibles con la ruta de administración por inyección. Las formulaciones adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Se puede preparar una variedad de composiciones farmacéuticas que comprenden los complejos de la presente invención y vehículos farmacéuticamente efectivos. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas en una variedad de sistemas de suministro de fármaco. Para tener una breve perspectiva de los métodos de suministro de fármaco, vea Langer (1990) Science 249:1527-1533. En la preparación de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, con frecuencia es preferible modificar los complejos de la presente invención para alterar su farmacocinética y biodistribución. Para una discusión general sobre la farmacocinética, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Chapters 37-39. Un número de métodos para alterar la farmacinética y la biodistribución, son conocidos para los expertos en la técnica (ver, ej., Langer, supra). Por ejemplo, los métodos adecuados para aumentar la vida media del suero de los complejos ¡ncluyen el tratamiento para remover los carbohidratos que están o involucrados en la eliminación de los complejos del torrente sanguíneo. De preferencia, se remueven substancialmente todas las porciones de carbohidrato mediante tratamiento.

Substancialmente todas las porciones de carbohidrato son removidas si por lo menos aproximadamente el 75%, de preferiblemente aproximadamente el 90%, y más preferiblemente aproximadamente el 99% de las porciones de las porciones de carbohidrato son removidas. También es efectiva la conjugación a macromoléculas solubles, tales como proteínas, polisacáridos, o polímeros sintéticos, tales como polietilenglicol. Otros métodos incluyen la protección de los complejos en vesículas compuestas de sustancias tales como proteínas, lípidos (por ejemplo, liposomas), carbohidratos, o polímeros sintéticos. Se pueden utilizar agentes tensioactivos comunes bien conocidos para los expertos en la técnica, en la presente invención. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen laurato de sodio, oleato de sodio, lauriisulfato de sodio, monodecil éter de octaoxietilenglicol, octoxinol 9 y PLURONIC F-127® (Wyandotte Chemicals Corp.). Los agentes tensioactivos preferidos son los detergentes no iónicos de polioxietileno y polioxipropileno que son compatibles con la inyección IV tales como TWEEN-80®, PLURONIC F-68®, y similares. Un detergente preferido es dodecil-ß-maltosido. Además, también se pueden utilizar fosfolípidos, tales como los que se describen para utilizarse en la producción de liposomas, para la formación de miscelas. Como las subunidades MHC de la presente invención comprenden una región transmembranal lipofílica y un dominio extracelular relativamente hidrofílico, se forman miscelas mixtas en la presencia de agentes tensioactivos comunes o fosfolípidos y las subunidades. Las miscelas mixtas de la presente invención pueden comprender cualquier combinación de subunidades, fosfolípidos y/o agentes tensioactivos. Así, las miscelas pueden comprender subunidades y detergente, subunidades en combinación con fosfolípidos y detergente, o subunidades y fosfolípido. Para las composiciones farmacéuticas que comprenden los complejos de la presente invención, la dosis variará de acuerdo con, por ejemplo, el complejo en particular, la forma de administración, la enfermedad en particular que será tratada y su severidad, la salud general y la condición del paciente, el juicio del médico que lo prescribe. Los niveles de dosis para sujetos de murino están generalmente entre aproximadamente 10 µg y aproximadamente 500 µg. Es preferible una dosis total de entre aproximadamente 50 µg y aproximadamente 300 µg. Por ejemplo, en los tratamientos provistos durante el transcurso de la enfermedad, son efectivas tres dosis de 25 µg ó 100 µg. Las dosis totales varían entre aproximadamente 0.015 y aproximadamente 15 µg/kg, de preferencia aproximadamente 0.15 a aproximadamente 10µg/kg. Las composiciones farmacéuticas están hechas para una administración parenteral, tópica, oral o local, como por aerosol o transdérmica, para un tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosis unitaria, dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosis unitaria adecuadas para la administración oral incluyen polvos, tabletas, pildoras y cápsulas.

De preferencia, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa. Así, esta invención provee composiciones para la administración intravenosa que comprenden una solución del complejo disuelto o suspendido en un vehículo aceptable, de preferencia un vehículo acuoso. Se pueden utilizar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua con pH regulado, solución salina al 0.4%, y similares. Por ejemplo, es particularmente preferida la solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) para la administración de los complejos solubles de la presente invención. Una formulación preferida es PBS que contiene 0.02% TWEEN-80. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas convencionales de esterilización bien conocidas, o se pueden esterilizar mediante filtración. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empacar para su uso tal como están, o liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinada con una solución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera, para ajustar las condiciones fisiológicas, tales como el ajuste del pH y agentes reguladores de pH, agentes ajustadores de la toxicicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. La concentración del complejo puede variar mucho, es decir, desde menos de aproximadamente 0.05%, normalmente a por lo menos aproximadamente 1 % hasta de 10 a 30% en peso, y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular seleccionado de administración. Las concentraciones preferidas para la administración intravenosa son de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 0.1% o más en PBS. Para las composiciones sólidas, se pueden utilizar los vehículos sólidos no tóxicos convencionales los cuales incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sodio sacarina, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. Para la administración oral, se forma una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquier excipiente que se emplee normalmente, como los vehículos que se enumeraron anteriormente, y por lo general de 10 a 95% del ingrediente activo. Para la administración en aerosol, los complejos de preferencia se suministran en una forma finamente dividida junto con un agente tensioactivo y un propulsor. Por supuesto, el agente tensioactivo debe de ser no tóxico, y de preferencia soluble en el propulsor. Los agentes representativos de dichos agentes son los esteres o esteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olesteárico y oleico, con un alcohol alifático polihídrico o su anhídrido cíclico, como por ejemplo, etilenglicol, glicerol, eritrol, arabitol, manitol, sorbitol, los anhídridos de hexitol derivados de sorbitol, y los derivados polioxietileno y polioxipropileno de estos esteres. Se pueden emplear esteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El agente tensioactivo puede constituir 0.1%-20% en peso de la composición, de preferencia 0.25-5%. Normalmente el resto de la composición es el propulsor. Los propulsores licuados típicamente son gases en condiciones ambientales, y se condensan bajo presión. Entre los propulsores licuados adecuados están los alcanos inferiores que contienen hasta 5 carbonos, tales como butano y propano; y de preferencia los alcanos fluorados o fluoroclorados. Las mezclas de los anteriores también se pueden emplear. Para producir el aerosol, un recipiente equipado con una válvula adecuada se llena con el propulsor apropiado, conteniendo los compuestos y el agente tensioactivo finamente divididos. De esta manera se mantienen los ingredientes a una presión elevada hasta que son liberados por la acción de la válvula. Las composiciones que contienen los complejos se pueden administrar para aplicaciones terapéuticas, profilácticas o de diagnóstico. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya sufra de una enfermedad, como se describió anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, o por lo menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. La cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y del peso y del estado general del paciente. Como se discutió antes, ésta será normalmente de entre aproximadamente 0.5 mg/kg y de aproximadamente 25 mg/kg de preferencia de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 mg/kg. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los complejos de la invención se administran a un paciente que es susceptible, o que está en riesgo de una enfermedad particular. Dicha cantidad se define como una "dosis profilácticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen una vez del estado de salud del paciente y del peso. Las dosis generalmente estarán en las escalas establecidas anteriormente. En las aplicaciones de diagnóstico, las composiciones que contienen los complejos apropiados o un cóctel de los mismos, se administran a un paciente del cual se sospecha que tiene un estado de enfermedad autoinmune, para determinar la presencia de células T autoreactivas asociadas con la enfermedad. Alternativamente, se puede monitorear la eficacia de un tratamiento en particular. Una cantidad suficiente para lograr esto se define como una "dosis diagnósticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependerán del estado de salud del paciente y similares, pero generalmente variarán de 0.01 a 1000 mg por dosis, especialmente aproximadamente de 10 a aproximadamente 100 mg por paciente. También se pueden proveer equipos para usos terapéuticos o de diagnóstico. Así, la composición objetivo de la presente invención se puede proveer normalmente en una forma liofilizada dentro de un recipiente. Los complejos, los cuales pueden estar conjugados a una etiqueta o toxina, o no conjugados, se incluyen en los equipos con regulares de pH, tales como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, albúmina de suero, o similares, y un conjunto de instrucciones para uso. Generalmente, estos materiales estarán presentes en menos de aproximadamente el 5% en peso basándose en la cantidad del complejo, y normalmente estarán presentes en una cantidad total de por lo menos aproximadamente 0.001% en peso basándose, de nuevo, en la concentración de proteína. Con frecuencia será preferible incluir un extensor o excipiente inerte para diluir los ingredientes activos, en donde el excipiente puede estar presente en de aproximadamente 1 a 99% en peso de la composición total.

En donde se emplea un anticuerpo capaz de unirse al complejo en una prueba, éste normalmente estará presente en un frasco por separado.

Normalmente el anticuerpo está conjugado a un marcador y está formulado de acuerdo con las técnicas conocidas en la técnica. Todas las publicaciones y solicitudes de patente que se citan en esta especificación, se incorporan en la presente como referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual estuviera específica e individualmente indicada para incorporarse como referencia. Aunque la anterior invención ha sido descrita con algunos detalles a manera de ilustración y ejemplo con el propósito de aclarar su entendimiento, será evidente fácilmente para un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención, que se pueden hacer a la misma ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Determinación de los valores IC50 para la unión de HLA-DR para un coniunto de péptidos AChR sobrepuestos Un conjunto de 68 péptidos AChRa sobrepuestos (14 mer con 7 aminoácidos sobrepuestos) fueron probados mediante la prueba de unión competitiva de fluoroinmunoensayo de lantánido incrementado por disociación ("DELFIA") para su afinidad relativa a HLA-DR4. La figura 1 muestra la posición de los péptidos AChR sobrepuestos probados en la prueba de afinidad DELFIA a HLA-DR2 y HLA-DR3. La secuencia de la subunidad AChRa aparece con cada una de las regiones transmembranales (M1-M4) indicadas por un cuadro sombrado. Se coincubaron diluciones de diez veces (de preferencia 1-100,000 nM) de péptidos AChRa no marcados, a pH 5.5 con el péptido de la proteína básica de mielina biotinilada MBP 84-102, y se midió en IC5o de la unión a HLA-DR2 (una matriz de DRB1*1501 y DRB5*0101 ) o HLA-DR3 (una matriz de DRB1*0301 y DRB3*0101 ) solubilizados. La medición del IC50 se hace de preferencia mediante el fluoroinmunoensayo de lantánido incrementado por disociación (DELFIA) de europio-estreptavidina, y el IC50 típicamente calculado por un análisis de ajuste de cuatro parámetros con el programa de software SOFTmax Pro. El cuadro A enumera los IC50 de cada péptido AChRa uniéndose a HLA-DR2 y HLA-DR3. La afinidad relativa de estos péptidos es demostrada en la gráfica de I/IC50 en la figura 3. Esta gráfica muestra la ubicación relativa de los péptidos AChRa con la afinidad relativa más alta para HLA-DR1-4. Los péptidos con afinidad relativa alta para HLA-DR2 incluyen AChRa 7-22,113-126,024-217,310-327,419-437, y 421-434. Basándose en estudios de unión con genotecas de despliegue de fago, los péptidos sintéticos, y secuenciación de péptidos eluidos, muchos grupos han reportado motivos de unión para DRB1*1501 y DRB5*0101. Se encontró que los fragmentos de péptido que tienen una alta afinidad para DR2 contienen el potencial de epítopes de célula T citado en la literatura y un consenso de motivo de unión DR2. El Cuadro B muestra alineaciones posibles de los péptidos AChRa con alta afinidad para HLA-DR2 para acoplar estos motivos propuestos. Menos péptidos demostraron una alta afinidad para HLA-DR3, que para HLA-DR2. Los que si exhibieron una alta afinidad incluyen 7-22, 36-49, 145-163, 195-212, y 400-413. El motivo de péptido DR3 se caracteriza por la presencia casi universal del residuo D en la posición n+3, en donde n es el residuo de ancla unido por el nicho 1 DR3. El cuadro C muestra las alineaciones posibles de los péptidos AChRa con alta afinidad para DR3 para acoplar estos motivos propuestos. Un resumen de los péptidos candidatos inmunodominantes asociados con DR2 y DR3 basándose en ICso = 10,000 nM, aparece en el cuadro D.

CUADRO A PEPTIDO SECUENCIA DR2 DR3 NOTAS 1-14 SEHETRLVAKLFKD > > 7-22 LVAKLFDYSSWRPV 3,842 6,153 8-21 VAKLFKDYSSWRP 16,672 > 15-28 YSSWRPVEDHRQV > > 19-34 VRPVEDHRQWEVTVG > > 22-35 VEDHRQWEVTVGL > > 27-42 VEVTVGLQLIQLIN 9,179 13,270 36-49 QLIQLINVDEVNQI 10,963 7,299 43-56 VDEVNQIVTTNVRL > 58,911 48-67 QIVTTNVRLKQQWVDYNLK 30,645 W 50-63 VTTNVRLKQQWVDY > > 57-70 KQQWVDYNLKWNPD > > 64-77 NLKWNPDDYGGVKK > > 71-84 DYGGVKKIHIPSEK > > 78-91 IHIPSEKIWRPDLV > > 85-98 IWRPDLVLYNNADG > 92-105 LYNNADGDFAIVKF 12,722 > 99-112 DFAIVKFTKVLLQY 13,186 34,183 106-119 TKVLLQYTGHITWT > > 113-126 TGHITWTPPAIFKS 2,835 72,956 120-133 PPAIFKSYCEIIVT > > 127-140 YCEIIVTHFPFDEQ > > 134-147 HFPFDEQNCSMKLG > > 141-154 NCSMKLGTWTYDGS > > 145-163 MKLGTWTYDGSWAINPESD > 2,002 148-161 TWTYDGSWAINPE > > 155-168 WAINPESDQPDLS > > 162-175 SDQPDLSNFMESGE > > 169-182 NFMESGEWVIKESR > > 176-189 WVIKESRGWKHSVT > > 181-195 SRGWKHSVTYSSCCPDTPY > > 183-196 GWKHSVTYSCCPDT 93,698 > 190-203 YSCCPDTPYLDITY > > 195-212 DTPYLDITYHFVMQRLPL 36,797 6,036 204-217 HFVMQRLPLYFIVN 2,456 71 ,284 M1 18-231 VIIPCLLFSFLTGL 6,790 M1 25-238 FSFLTGLVFYLPTD 99,660 > M1 32-245 VFYLPTDSGEKMTL > > M1. M2 39-252 SGEKMTLSISVLLS > > M2 CUADRO A (CONTINUACIÓN) PEPTIDO SECUENCIA DR2 DR3 NOTAS 252-266 LTVFLLVIVELIPS 11 ,386 13,618 M2 260-273 IVELIPSTSSAVPL > > 267-280 TSSAVPLIGKYMLF > > M 295-308 VINTHHRSPSTHVM > > M3 302-315 SPSTHVMPNWVRKV > > 304-322 STHVMPNWVRKVFIDTIPN > 28,749 309-322 PNWVRKVFIDTIPN > 45,199 310-327 NWVRKFIDTIPNIMFFS 5,741 316-329 FIDTIPNIMFFSTM 25,356 18,855 320-337 IPNIMFFSTMKRPSREKQ 6,612 15,824 323-336 IMFFSTMKRPSREK > > 330-343 KRPSREKQDKKIFT > > 337-350 QDKKIFTEDIDISD > > 338-355 DKKIFTEDIDISDISGKP > > 344-357 EDIDISDISGKPGP > > 351-364 ISGKPGPPPMGFHS > > 352-368 SGKPGPPPMGFHSPLIK > > 358-371 PPMGFHSPLIKHPE 73,573 > 364-380 HSPLIKHPEVKSAIEGIK > > 365-378 PLIKHPEVKSAIEG > > 372-385 VKSAIEGIKYIAET > > 379-392 IKYIAETMKSDQES > > 386-399 MKSDQESNNAAAEW > > 387-400 KSDQESNNAAAEWK > > 393-406 NNAAAEWKYVAMVM > > 400-413 KYVAMVMDHILLGV 6,064 2,460 M4 419-437 IIGTLAVFAGRLIELNQQG 5,741 48,911 M4 421-434 GTLAVFAGRLIELN 1 ,602 > M4 424-437 AVFAGRLIELNQQG > > M4 CUADRO B Péptidos AChR con alta afinidad relativa para DR2 PEPTIDO SECUENCIA IC50 AChRa 421-434 GTLAVFAGRLIELN 1 ,602 AChRa 204-217 HFVMQRLPLYFIVN 2,456 AChRa 113-217 (TGHITWTPPAIFKS) 2,835 AChRa 7-22 LVAKLFKDYSSWRPV 3,842 AChRa 310-327 NWVRKFIDTIPNIMFFS 5,741 AChRa 310-327 (alt) NWVRKFIDTIPNIMFFS AChRa 419-437 IIGTLAVFAGRLIELNQQG 5,741 AChRa 400-413 YVAMVMDHILLGV 6,064 AChRa 320-337 IPNIMFFSTMKRPSREKQ 6,612 AChRa 218-337 VIIPCLLFSFLTGL 6,790 AChRa 27-42 VEVTVGLQLIQLIN 9,179 OTROS PEPTIDOS CON ALTA AFINIDAD RELATIVA PARA DR2 PEPTIDO SECUENCIA REF HALA-A3 152-155 EAEQLRAYLDGTGVE 1 HLA-DRa 45-58 LEEFGRFASFEAQG 1 HLA-DQw643-58 DVGVYRAVTPQGRPDA SP3-1-16 AILEFRAMAQFSRKTD 1 MBP 85-105 PWHFFKNIVTPRTPPPSQGK 1.2 MBP 148-162 GTLSKIFKLGGRDSRSG 1.2 CUADRO C Péptidos AChR con alta afinidad relativa para DR3 PEPTIDO SECUENCIA IC50 AChRa 144-163 MKLGTWTYDGSWAINPESD 2,002 AChRa 400-413 KYVAMVMDHILLGV 2,460 AChRa 195-212 DTPYLDITYHFVMQRLP 6,036 AChRa 7-22 LVAKLFKDYSSWRPV 6,153 AChRa 36-49 QLIQLINVDEVNQI 7,299 OTROS PEPTIDOS CON ALTA AFINIDAD RELATIVA PARA DR3 PEPTIDO SECUENCIA REF Apo B 2877-2892 ISNQLTLDSNTKYFHK 1.2 LDL-R 518-532 KPRAIWDPVHGFMY 1.2 Apo B 4483-4496 AVNEIISDYHQQFT 1 Apo B 1273-1290 IPDNLFLKSDGRVKYTLN 1.2 TF-R 620-634 LLSFVRDLNQYRADI 1.2 IFN-R? 128-146 GPPKLDIRKEEKQIM 1 lgG2A KQTISPDYRNMI 1.2 aIAT 149-164 VDTFLEDVKNLYHSEA 1.2 HSP 65 3-13 KIIAYDEEARR 3 CUADRO D - IC50(nM) POSICIÓN DR2 DR3 7-22 3,842 6,153 27-42 9,179 > 36-49 10,963 7,299 113-126 2,835 145-163 2,002 195-212 > 6,036 204-217 2,456 > 310-327 4,187 > 320-327 6,612 > Además, la afinidad relativa para HLA-DR4 de un conjunto de sesenta y nueve péptidos sobrepuestos sintéticos de AChRa (14 mer con 7 aminoácidos sobrepuestos) fue medido mediante una prueba de unión competitiva con base de europio, utilizando DR4 solubilizado. La concentración de péptidos AchR requeridos para inhibir el 50% de unión de un péptido de unión DR4 conocido fue calculado para cada péptido. Los péptidos de alta afinidad se identificaron basándose en su valor IC50. El cuadro 2 resume los resultados para cinco péptidos de unión a DR2 de alta afinidad que fueron elegidos para los estudios ELISPOT. Estos péptidos y sus valores IC50 se proporcionan en el cuadro 2.

CUADRO 2 Fragmentos de péptido AChRa que muestran valores ICsn inferiores para la unión a HLA-DR2. Los valores ICso inferiores indican una afinidad de unión más alta para HLA-DR EJEMPLO 2 Reactividad de la célula T de los péptidos AChR Se midió la reactividad de la célula T de los péptidos anteriores con los PBMC de un paciente y de un individuo normalmente saludable, mediante la prueba modificada ELISPOT. Los PBMC obtenidos de 30 individuos normales y 9 pacientes MG, fueron incluidos en este estudio. Los péptidos anteriores junto con TT/PPD como control positivo, y medio como control negativo fueron probados para la reactividad de la célula T. En resumen, se incubaron los PBMC y el antígeno durante 7 días, y se realizó una expansión clonal específica de antígeno en el octavo día. Se midió el perfil de estimulación de la célula específico de antígeno para cada uno de los antígenos, mediante la secreción del ?-IFN detectado como manchas, utilizando un par de anticuerpos anti-?-IFN. El número de manchas obtenidas para cada antígeno fue normalizado al número de manchas obtenido para el control de medio. Se estableció un índice reactivo, definido como la relación del número de manchas para un antígeno al número de manchas para un control de medio, para cada muestra PBMC y cada antígeno. Se proporciona una gráfica del índice reactivo contra el antígeno utilizado para los PBMC normales y de paciente, en la figura 3 y 4 respectivamente. La comparación de los resultados de la prueba para los pacientes y los individuos normales, no indicó ninguna diferencia obvia en la reactividad de la célula T hacia los cinco epítopes AchR probados. Como se esperaba, muchos pacientes MG demostraron una reactividad a los epítopes AchR probados, pero ninguno de ellos resultó ser único en términos de alta reactividad. Es interesante notar que los PBMC normales también mostraron una reactividad a aquellos epítopes autoantigénicos. Esto indica claramente que muchos otros factores, incluyendo la reactividad de la célula T hacia un antígeno en particular, puede ser el responsable de la iniciación de un proceso de enfermedad activo. Se ha hecho una observación similar en el caso de la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunes. Aunque el número de pacientes estudiados en este proyecto fue mucho más pequeño que el número de individuos normalmente saludables, se probó la existencia de alguna tendencia preliminar en la reactividad de la célula T en pacientes y en individuos normalmente saludables. Se comparó el porcentaje de pacientes o individuos normalmente saludables que demostraron un índice reactivo arriba de 2. En forma similar, la existencia de una tendencia en pacientes DR2+ también fue probada. Los resultados de dicho análisis de los datos aparecen en la figura 5 y en la figura 6. Si se ignora el tipo HLA de todos los individuos normalmente saludables yu los pacientes, el porcentaje de pacientes que demuestra reactividad a los péptidos AchR 421-434, 400-413 y 36-49 es aproximadamente dos veces el porcentaje de los individuos normalmente saludables que demuestran reactividad a estos epítopes. Esta es una indicación adicional de que estos péptidos pueden ser los epítopes patogénicos de la célula T involucrados en el proceso activo de enfermedad.

Un análisis similar de solamente los pacientes DR2+ indicó que todos los péptidos, excepto AchRa 204-217, podrían ser los epítopes patogénicos de la célula T. Así, de los 69 péptidos AchRa probados, cinco demostraron una alta afinidad de unión a DR2 (ver ejemplo 1 ) y cuatro de estos cinco péptidos demostraron una reactividad desviada de la célula T hacia la población de pacientes MG, en comparación con los individuos normales. A partir de todo lo anterior, se podrá apreciar que, a pesar de que se han descrito modalidades específicas de la invención en la presente, con el propósito de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y el alcance de la invención.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición caracterizada porque comprende un oligopéptido AChR aislado que comprende entre aproximadamente 12 y aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, en donde el oligopéptido tiene una secuencia sustancialmente similar a un péptido seleccionado del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el péptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el péptido comprende un aminoácido D o un mimético de aminoácido.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el oligopéptido es un péptido inmunodominante.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el péptido está asociado con un componente MHC Clase II aislado que tiene un sitio de unión antigénico, en donde el péptido está asociado con el sitio de unión antigénico.

6.- La composición de confopnidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el componente MHC es una molécula HLA-DR2.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el péptido se selecciona del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el componente MHC es una molécula HLA-DR3.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el péptido se selecciona del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL.

10.- Una composición caracterizada porque comprende un péptido antigénico y un componente MHC aislado que tiene un sitio de unión antigénico, en donde el péptido antigénico está asodado con el sitio de unión antigénico, y en donde el péptido tiene una secuencia que es sustan almente similar a un péptido seleccionado del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el componente MHC es HLA-DR2.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque el péptido se selecciona del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el componente MHC es HLA-DR3.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el péptido se selecciona del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL.

15.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido como el que se reclama en la reivindicación 1.

16.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicadón 15, caracterizada además porque el péptido está asodado con una molécula MHC clase II aislada.

17.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicadón 16, caracterizada además porque el componente MHC se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR2 y HLA-DR3.

18.- El uso de la composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 15, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la miastenia grave en un paciente.

19.- El uso de la composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 16, para la preparadón de un medicamento para el tratamiento de la miastenia grave en un paciente.

20.- El uso de la composidón farmacéutica como la que se reclama en la reivindicadón 17, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la miastenia grave en un paciente.

21.- El uso de un péptido antigénico y un componente MHC clase II aislado que tiene un sitio de unión de antígeno, en donde el péptido antigénico está asociado con el sitio de unión de antígeno, y en donde el péptido antigénico tiene una secuenda que es sustandalmente similar a un péptido selecdonado por el grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL, para la fabricadón de un medicamento para inducir la no respuesta en una célula T en un mamífero.

22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el péptido antigénico tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: LVAKLFKDYSSWRPV, VEVTVGLQLIQLIN, TGHITWTPPAIFKS, HFVMQRLPLYFIVN, NWVRKFIDTIPNIMFFS, IPNIMFFSTMKRPSREKQ, QLIQLINVDEVNQI, MKLGTWTYDGSWAINPESD, DTPYLDITYHFVMQRLPL.

23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el componente MHC es HLA-DR2.

24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde el componente MHC es HLA-DR3.

25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el medicamento es administrable intravenosamente.