JP2002521388A - 自己免疫疾患の免疫療法に使用するための新規ペプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、自己免疫疾患を予防するためのペプチド誘導寛容療法における新規ペプチドの使用、特に関節軟膏の慢性破壊の治療におけるその使用に関する。本発明は更に、前記ペプチドを含む医薬組成物及び試験サンプル中の自己反応性Ｔ細胞を検出するための診断方法を包含する。
Description
【０００１】 本発明は、新規ペプチド、前記ペプチドの自己免疫疾患の関節軟膏の慢性破壊
の治療における使用、前記ペプチドを含む医薬組成物、及び試験サンプル中の自
己反応性Ｔ細胞を検出するための診断方法に関する。
の治療における使用、前記ペプチドを含む医薬組成物、及び試験サンプル中の自
己反応性Ｔ細胞を検出するための診断方法に関する。
【０００２】 免疫系は、外来抗原（非自己抗原）と自己抗原（個体自身の身体から誘導され
る自己抗原）の間の自己抗原に対する固有寛容により達成される識別の原則に基
づいて確立される。
る自己抗原）の間の自己抗原に対する固有寛容により達成される識別の原則に基
づいて確立される。
【０００３】 免疫系により、個体は外来抗原から保護され、Ｔリンパ球やＢリンパ球のよう
な特定細胞を活性化し、インターロイキンのような可溶性因子、抗体または補体
因子を産生することにより外来抗原に対して応答する。免疫系が応答する抗原は
抗原提示細胞（ＡＰＣ）により分解され、抗原断片は主要組織適合遺伝子複合体
（ＭＨＣ）クラスＩＩ糖タンパク質が結合している細胞表面上で発現する。ＭＨ
Ｃ−糖タンパク質−抗原断片複合体は、そのＴ細胞レセプターにより抗原断片を
それが結合しているＭＨＣクラスＩＩタンパク質と共に認識するＴ細胞に提示さ
れる。Ｔ細胞が活性化されると、すなわち増殖及び／またはインターロイキンを
産生すると、攻撃されている抗原に対する活性化リンパ球が増殖する（Ｇｒｅｙ
ら，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６１：２８−４６，１９８９）。
な特定細胞を活性化し、インターロイキンのような可溶性因子、抗体または補体
因子を産生することにより外来抗原に対して応答する。免疫系が応答する抗原は
抗原提示細胞（ＡＰＣ）により分解され、抗原断片は主要組織適合遺伝子複合体
（ＭＨＣ）クラスＩＩ糖タンパク質が結合している細胞表面上で発現する。ＭＨ
Ｃ−糖タンパク質−抗原断片複合体は、そのＴ細胞レセプターにより抗原断片を
それが結合しているＭＨＣクラスＩＩタンパク質と共に認識するＴ細胞に提示さ
れる。Ｔ細胞が活性化されると、すなわち増殖及び／またはインターロイキンを
産生すると、攻撃されている抗原に対する活性化リンパ球が増殖する（Ｇｒｅｙ
ら，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６１：２８−４６，１９８９）。
【０００４】 また、自己抗原は連続的に処理され、Ｔ細胞に対するＭＨＣ糖タンパク質によ
り抗原断片として提示される（Ｊａｒｄｅｔｓｋｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：
３２６−３２９，１９９１）。従って、自己認識は免疫系に固有である。正常な
状況下では、免疫系は自己抗原に対して寛容であり、これら自己抗原による免疫
応答の活性化は避けられる。
り抗原断片として提示される（Ｊａｒｄｅｔｓｋｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：
３２６−３２９，１９９１）。従って、自己認識は免疫系に固有である。正常な
状況下では、免疫系は自己抗原に対して寛容であり、これら自己抗原による免疫
応答の活性化は避けられる。
【０００５】 自己抗原に対する寛容が失われると、免疫系は１つ以上の自己抗原に対して活
性化されるようになり、その結果自己反応性Ｔ細胞が活性化され、自己抗体が産
生される。この現象を自己免疫と呼ぶ。免疫応答は通常破壊的である、すなわち
侵襲性外来抗原を破壊するので、自己免疫応答により個体自体の組織が破壊され
得る。
性化されるようになり、その結果自己反応性Ｔ細胞が活性化され、自己抗体が産
生される。この現象を自己免疫と呼ぶ。免疫応答は通常破壊的である、すなわち
侵襲性外来抗原を破壊するので、自己免疫応答により個体自体の組織が破壊され
得る。
【０００６】 Ｔ細胞の自己免疫疾患への関与は幾つかの研究で確認されている。マウスでは
、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）はＭＨＣクラスＩＩ分子に複合体化され
たミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の単一エピトープに対する特異性により
結合したかなり限られたＴ細胞群により媒介される。各種自己免疫疾患に対して
高い感受性を有する種であるルイスラットでは、病気がＴ細胞により媒介される
ことが判明している。ヒトでも、自己免疫疾患は自己攻撃型Ｔ細胞の発生に関連
していると考えられている。
、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）はＭＨＣクラスＩＩ分子に複合体化され
たミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の単一エピトープに対する特異性により
結合したかなり限られたＴ細胞群により媒介される。各種自己免疫疾患に対して
高い感受性を有する種であるルイスラットでは、病気がＴ細胞により媒介される
ことが判明している。ヒトでも、自己免疫疾患は自己攻撃型Ｔ細胞の発生に関連
していると考えられている。
【０００７】 破壊的自己免疫応答は、多数の活性化リンパ球及びＭＨＣクラスＩＩ発現細胞
が存在するために生ずる慢性炎症反応により関節軟骨の一体性が破壊される慢性
関節リウマチ（ＲＡ）のような各種疾患に関与している。軟骨の存在が局所的炎
症応答を保持するために必要であると思われる。軟骨破壊はＲＡにおける軟骨応
答自己反応性Ｔ細胞の活性に関係している（Ｓｉｇａｌｌら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ
．Ｒｈｅｕｍａｔ．，６：５９，１９８８；Ｇｌａｎｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１８：７９６，１９９０；Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら，慢性関
節リウマチ(Rheumatoid arthritis)，Ｓｍｏｌｅｎ，Ｋａｌｄｅｎ，Ｍａｉｎｉ
編，ベルリンハイデルベルグに所在のＳｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９
２）。更に、ＲＡ患者から手術により軟骨を除去すると、炎症反応が少なくなる
ことが判明した（Ｒ．Ｓ．Ｌａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ
ｅｒｙ（Ａｍ），７２：５２９，１９９０）。従って、軟骨タンパク質は、刺激
Ｔ細胞の成分である標的自己抗原であると見做される。前記自己反応性Ｔ細胞を
活性化すると、自己免疫疾患が発生する。しかしながら、慢性関節リウマチの発
症に関与する自己抗原成分は依然として同定されていない。
が存在するために生ずる慢性炎症反応により関節軟骨の一体性が破壊される慢性
関節リウマチ（ＲＡ）のような各種疾患に関与している。軟骨の存在が局所的炎
症応答を保持するために必要であると思われる。軟骨破壊はＲＡにおける軟骨応
答自己反応性Ｔ細胞の活性に関係している（Ｓｉｇａｌｌら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ
．Ｒｈｅｕｍａｔ．，６：５９，１９８８；Ｇｌａｎｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１８：７９６，１９９０；Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら，慢性関
節リウマチ(Rheumatoid arthritis)，Ｓｍｏｌｅｎ，Ｋａｌｄｅｎ，Ｍａｉｎｉ
編，ベルリンハイデルベルグに所在のＳｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９
２）。更に、ＲＡ患者から手術により軟骨を除去すると、炎症反応が少なくなる
ことが判明した（Ｒ．Ｓ．Ｌａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ
ｅｒｙ（Ａｍ），７２：５２９，１９９０）。従って、軟骨タンパク質は、刺激
Ｔ細胞の成分である標的自己抗原であると見做される。前記自己反応性Ｔ細胞を
活性化すると、自己免疫疾患が発生する。しかしながら、慢性関節リウマチの発
症に関与する自己抗原成分は依然として同定されていない。
【０００８】 軟骨の破壊をもたらす炎症応答は、数種の薬物（例えば、ストロイド薬）によ
り治療され得る。しかしながら、これらの薬物はしばしば非特異的であり且つ有
毒な副作用を有する免疫抑制薬である。非特異的免疫抑制の欠点のために、前記
治療はかなり好ましくない。
り治療され得る。しかしながら、これらの薬物はしばしば非特異的であり且つ有
毒な副作用を有する免疫抑制薬である。非特異的免疫抑制の欠点のために、前記
治療はかなり好ましくない。
【０００９】 抗原特異的非毒性免疫抑制療法は非特異的免疫抑制療法に代わる非常に魅力的
な治療法である。この抗原特異的療法では、患者を標的抗原を用いてまたは自己
抗原から誘導される合成Ｔ細胞反応性ペプチドを用いて治療する。前記合成ペプ
チドは自己抗原のＴ細胞エピトープに相当し、それ自体及び自己抗原に対する特
異的Ｔ細胞寛容を誘導するために使用され得る。免疫系を免疫系の活性化に関与
する全く同一の抗原で脱感作することは矛盾するようであるが、標的（自己）抗
原を管理投与することは免疫系の脱感作において非常に有効であり得る。免疫系
の脱感作または免疫寛容は、抗原またはエピトープを投与されたかまたは吸入し
た動物では抗原またはエピトープを全身ルートを介して投与したときに前記抗原
またはエピトープに対する全身免疫応答を発現しにくいという長年観察された現
象に基づいている。
な治療法である。この抗原特異的療法では、患者を標的抗原を用いてまたは自己
抗原から誘導される合成Ｔ細胞反応性ペプチドを用いて治療する。前記合成ペプ
チドは自己抗原のＴ細胞エピトープに相当し、それ自体及び自己抗原に対する特
異的Ｔ細胞寛容を誘導するために使用され得る。免疫系を免疫系の活性化に関与
する全く同一の抗原で脱感作することは矛盾するようであるが、標的（自己）抗
原を管理投与することは免疫系の脱感作において非常に有効であり得る。免疫系
の脱感作または免疫寛容は、抗原またはエピトープを投与されたかまたは吸入し
た動物では抗原またはエピトープを全身ルートを介して投与したときに前記抗原
またはエピトープに対する全身免疫応答を発現しにくいという長年観察された現
象に基づいている。
【００１０】 ヒト軟骨糖タンパク質−３９（ＨＣ ｇｐ−３９）は慢性関節リウマチ（ＲＡ
）における標的自己抗原として既に同定されている（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら，
Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：１１１５−１１２５，１９９７）。Ｈ
Ｃ ｇｐ−３９内の関連自己エピトープを同定するために続けられた方法は、Ｄ
Ｒ４またはＤＲ１分子が２段階で、最初はＴ細胞レパトアを形成し、次に決定因
子を選択することによりＲＡを受けやすいという仮定に基づいていた（Ｇａｏら
，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，３３：９３９−９４６，１９９０；Ｎｅｌ
ｓｏｎら，「慢性関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis)」，第１１回国際組織適
合研究会及び会議の会報(Proceedings of the Eleventh International Histoco
mpatibility Workshop and Conference)，Ｖｏｌ．１，Ｔｓｕｊｉら編，Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）発行）。ＲＡ関連ＤＲ
分子中に存在する共有エピトープはＴ細胞に対する提示のための類似の組のペプ
チドの選択に関与し得る（Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．，３０：１２０５−１２１３，１９８７）。ＨＣ ｇｐ−３９の主要構造内
の推定結合配列がＤＲ４（Ｂ１＊０４０１）ペプチド結合モチーフを用いて同定
された（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：１
１１５−１１２５，１９９７）。シグナル配列を除く３６２アミノ酸のタンパク
質であるＨＣ ｇｐ−３９（Ｈａｋａｌａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
８：２５８０３−２５８１０，１９９３）は前記モチーフを持つ６個の領域を含
む。こうして選択された４個のペプチドを合成し、ＲＡ−関連ＤＲ１及びＤＲ４
（Ｂ１＊０４０１及び０４０４）変異体の結合について試験した。ＨＣ ｇｐ−
３９の残基１０３−１１６、２５９−２７５、２６３−２７５及び３２６−３３
８にわたるモチーフをベースとするペプチドのすべてがＤＲＢ１＊０４０１分子
に対して高い相対アフィニティーで結合することが判明した。その後、これらの
ペプチドをＲＡ患者及び健康なドナーからの末梢血Ｔ細胞による認識について試
験した。モチーフをベースとするペプチドのすべてがＲＡ患者において容易に認
識された。このことから、ＲＡ中に高頻度でＨＣ ｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が存
在することが示唆された。２６３−２７５に対する応答が最も顕著であった。１
８人のＲＡ患者中８人がこのペプチドに対して応答した（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ
ら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：１１１５−１１２５，１９９７）
。従って、ＨＣ ｇｐ−３９は関節中の免疫認識に対する標的である。
）における標的自己抗原として既に同定されている（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら，
Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：１１１５−１１２５，１９９７）。Ｈ
Ｃ ｇｐ−３９内の関連自己エピトープを同定するために続けられた方法は、Ｄ
Ｒ４またはＤＲ１分子が２段階で、最初はＴ細胞レパトアを形成し、次に決定因
子を選択することによりＲＡを受けやすいという仮定に基づいていた（Ｇａｏら
，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，３３：９３９−９４６，１９９０；Ｎｅｌ
ｓｏｎら，「慢性関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis)」，第１１回国際組織適
合研究会及び会議の会報(Proceedings of the Eleventh International Histoco
mpatibility Workshop and Conference)，Ｖｏｌ．１，Ｔｓｕｊｉら編，Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）発行）。ＲＡ関連ＤＲ
分子中に存在する共有エピトープはＴ細胞に対する提示のための類似の組のペプ
チドの選択に関与し得る（Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕ
ｍ．，３０：１２０５−１２１３，１９８７）。ＨＣ ｇｐ−３９の主要構造内
の推定結合配列がＤＲ４（Ｂ１＊０４０１）ペプチド結合モチーフを用いて同定
された（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：１
１１５−１１２５，１９９７）。シグナル配列を除く３６２アミノ酸のタンパク
質であるＨＣ ｇｐ−３９（Ｈａｋａｌａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
８：２５８０３−２５８１０，１９９３）は前記モチーフを持つ６個の領域を含
む。こうして選択された４個のペプチドを合成し、ＲＡ−関連ＤＲ１及びＤＲ４
（Ｂ１＊０４０１及び０４０４）変異体の結合について試験した。ＨＣ ｇｐ−
３９の残基１０３−１１６、２５９−２７５、２６３−２７５及び３２６−３３
８にわたるモチーフをベースとするペプチドのすべてがＤＲＢ１＊０４０１分子
に対して高い相対アフィニティーで結合することが判明した。その後、これらの
ペプチドをＲＡ患者及び健康なドナーからの末梢血Ｔ細胞による認識について試
験した。モチーフをベースとするペプチドのすべてがＲＡ患者において容易に認
識された。このことから、ＲＡ中に高頻度でＨＣ ｇｐ−３９特異的Ｔ細胞が存
在することが示唆された。２６３−２７５に対する応答が最も顕著であった。１
８人のＲＡ患者中８人がこのペプチドに対して応答した（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ
ら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：１１１５−１１２５，１９９７）
。従って、ＨＣ ｇｐ−３９は関節中の免疫認識に対する標的である。
【００１１】 前記タンパク質の関節疾患に対する重要性がＢａｌｂ／ｃマウスにおけその関
節炎発現性(arthritogenicity)により更に立証された。ＩＦＡ中に混合したタン
パク質をμｇ量胸部に１回注入すると、ＲＡを連想させる慢性関節炎症が引き起
こされた（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：
１１１５−１１２５，１９９７）。
節炎発現性(arthritogenicity)により更に立証された。ＩＦＡ中に混合したタン
パク質をμｇ量胸部に１回注入すると、ＲＡを連想させる慢性関節炎症が引き起
こされた（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら，Ａｒｔｈｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４０：
１１１５−１１２５，１９９７）。
【００１２】 最近、新規なヒト軟骨細胞タンパク質ＹＫＬ−３９が単離され、公知となった
（Ｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９４１５−１９４２０，１９
９６）。前記タンパク質はＨＣ ｇｐ−３９（ＹＫＬ−４０）と有意な配列同一
性を有する。ＨＣ ｇｐ−３９の別の同族体はヒトマクロファージより分泌され
、キトトリオシダーゼと呼ばれている（Ｂｏｏｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２７０，２６２５２−２６２５６，１９９５）。ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−
２７５）ペプチドに相当する配列ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（配列番号３）は
それぞれ、ＹＫＬ−３９タンパク質（２６６−２７８）内のＨＳＦＴＬＡＳＡＥ
ＴＴＶＧ（配列番号２）として、マクロファージキトトリオシダーゼ（２６９−
２８２）内のＲＳＦＴＬＡＳＳＳＤＴＲＶＧ（配列番号４）として同定されてい
る（表１）。
（Ｈｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９４１５−１９４２０，１９
９６）。前記タンパク質はＨＣ ｇｐ−３９（ＹＫＬ−４０）と有意な配列同一
性を有する。ＨＣ ｇｐ−３９の別の同族体はヒトマクロファージより分泌され
、キトトリオシダーゼと呼ばれている（Ｂｏｏｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２７０，２６２５２−２６２５６，１９９５）。ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−
２７５）ペプチドに相当する配列ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（配列番号３）は
それぞれ、ＹＫＬ−３９タンパク質（２６６−２７８）内のＨＳＦＴＬＡＳＡＥ
ＴＴＶＧ（配列番号２）として、マクロファージキトトリオシダーゼ（２６９−
２８２）内のＲＳＦＴＬＡＳＳＳＤＴＲＶＧ（配列番号４）として同定されてい
る（表１）。
【００１３】 キトトリオシダーゼペプチドＣｈｉ（２６９−２８２）は、タンパク質内のＴ
細胞エピトープを選択するために以前使用したＤＲＢ１＊０４０１ペプチド結合
モチーフを含む。対照的に、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）ペプチドはこの０
４０１モチーフを含まない。
細胞エピトープを選択するために以前使用したＤＲＢ１＊０４０１ペプチド結合
モチーフを含む。対照的に、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）ペプチドはこの０
４０１モチーフを含まない。
【００１４】 ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）反応性Ｔ細胞の寛容化はＲＡ患者にとっ
て有効であり得ることは明らかである。また、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７
５）の模擬エピトープも同様の機能を有し得、寛容を誘導するために使用され得
る。模擬エピトープが少なくとも同一寛容化能力を有することが好ましい。
て有効であり得ることは明らかである。また、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７
５）の模擬エピトープも同様の機能を有し得、寛容を誘導するために使用され得
る。模擬エピトープが少なくとも同一寛容化能力を有することが好ましい。
【００１５】 Ｔ細胞媒介軟骨破壊を治療するために寛容誘導療法を効果的に使用するために
は、免疫反応に関与するＴ細胞を活性化する自己抗原から患者を脱感作し得るＴ
細胞反応性ペプチドを同定することが強く要望されている。
は、免疫反応に関与するＴ細胞を活性化する自己抗原から患者を脱感作し得るＴ
細胞反応性ペプチドを同定することが強く要望されている。
【００１６】 ＹＫＬ−３９ペプチドは０４０１モチーフを含まないが、驚くことにＹＫＬ−
３９（２６６−２７８）エピトープはＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）の模
擬エピトープである。
３９（２６６−２７８）エピトープはＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）の模
擬エピトープである。
【００１７】 従って、前記エピトープは、慢性関節リウマチ患者においてＨＣ ｇｐ−３９
（２６３−２７５）、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）またはその模擬エピトー
プに対する反応性を用いて自己反応性Ｔ細胞を寛容化するために使用される。
（２６３−２７５）、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）またはその模擬エピトー
プに対する反応性を用いて自己反応性Ｔ細胞を寛容化するために使用される。
【００１８】 本発明の目的は、好ましくはＴ細胞媒介軟骨破壊を患っている患者中の軟骨抗
原に対して全身性免疫寛容、特に特異的Ｔ細胞寛容を誘導し得るペプチドを提供
することである。本発明のペプチドの特徴は、１つ以上のアミノ酸配列ＦＴＬＡ
ＳＡＥＴＴ（配列番号１）を含むことである。より具体的には、本発明のペプチ
ドはＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧ（配列番号２）を含む。
原に対して全身性免疫寛容、特に特異的Ｔ細胞寛容を誘導し得るペプチドを提供
することである。本発明のペプチドの特徴は、１つ以上のアミノ酸配列ＦＴＬＡ
ＳＡＥＴＴ（配列番号１）を含むことである。より具体的には、本発明のペプチ
ドはＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧ（配列番号２）を含む。
【００１９】 本発明のペプチドのマルチマー、例えば本発明のペプチドのダイマーまたはト
リマーも本発明の範囲に包含される。本発明のマルチマーは、多数の同一ペプチ
ドからなるホモマーであっても、異なるペプチドからなるヘテロマーであっても
よい。
リマーも本発明の範囲に包含される。本発明のマルチマーは、多数の同一ペプチ
ドからなるホモマーであっても、異なるペプチドからなるヘテロマーであっても
よい。
【００２０】 本発明のペプチドの特徴的なアミノ酸配列は、ランダムなアミノ酸配列により
フランキングされ得る。ペプチドに対して安定化作用を有し、よってそのバイオ
アベイラビリティーを高めるフランキング配列が好ましい。
フランキングされ得る。ペプチドに対して安定化作用を有し、よってそのバイオ
アベイラビリティーを高めるフランキング配列が好ましい。
【００２１】 ヒト軟骨糖タンパク質３９はＲＡ患者における標的自己抗原であり、特定Ｔ細
胞を活性化して炎症反応を起こすかまたは媒介する。ＨＣ ｇｐ−３９誘導ペプ
チドは主にＲＡ患者由来の自己反応性Ｔ細胞により認識されたが、健康なドナー
由来のＴ細胞ではまれにしか認識されなかった。このことから、ＨＣ ｇｐ−３
９はＲＡにおいて自己抗原であることが示される。ＨＣ ｇｐ−３９の関節炎発
現性はＢａｌｂ／ｃマウスにおいて更に確認された。Ｂａｌｂ／ｃマウスに前記
タンパク質を１回皮下注射すると、動物において関節炎兆候が生じた。ＨＣ ｇ
ｐ−３９により誘発される病気の進行の特徴は、再発が前肢及び／または後肢で
周期的に起こることであり、軽度な関節炎がより重篤な状態に次第に進行した。
また、罹患関節が対称的に分布していると共に、関節炎、特にＲＡにおいて病気
の悪化を連想させる再発も見られた。
胞を活性化して炎症反応を起こすかまたは媒介する。ＨＣ ｇｐ−３９誘導ペプ
チドは主にＲＡ患者由来の自己反応性Ｔ細胞により認識されたが、健康なドナー
由来のＴ細胞ではまれにしか認識されなかった。このことから、ＨＣ ｇｐ−３
９はＲＡにおいて自己抗原であることが示される。ＨＣ ｇｐ−３９の関節炎発
現性はＢａｌｂ／ｃマウスにおいて更に確認された。Ｂａｌｂ／ｃマウスに前記
タンパク質を１回皮下注射すると、動物において関節炎兆候が生じた。ＨＣ ｇ
ｐ−３９により誘発される病気の進行の特徴は、再発が前肢及び／または後肢で
周期的に起こることであり、軽度な関節炎がより重篤な状態に次第に進行した。
また、罹患関節が対称的に分布していると共に、関節炎、特にＲＡにおいて病気
の悪化を連想させる再発も見られた。
【００２２】 驚くことに、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）ペプチドが寛容原として有効で
あることが知見された。前記ペプチドは該ペプチドの片側もしくは両側で延長さ
れ得、そのペプチドがなお同一の免疫機能を発揮することは当業者には自明であ
る。延長部分は、タンパク質ＹＫＬ−３９の天然配列と類似のアミノ酸配列であ
り得る。
あることが知見された。前記ペプチドは該ペプチドの片側もしくは両側で延長さ
れ得、そのペプチドがなお同一の免疫機能を発揮することは当業者には自明であ
る。延長部分は、タンパク質ＹＫＬ−３９の天然配列と類似のアミノ酸配列であ
り得る。
【００２３】 本発明のペプチドは、ペプチド合成のための公知の有機化学法により、例えば
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．
Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５：１６１−２１４（１９
９０）に記載されている固相ペプチド合成法により製造され得る。本発明のペプ
チドは組換えDNA法によっても製造され得る。本発明のペプチドまたは前記ペプ
チドのマルチマーをコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する。好適な発現
ベクターは複製及び発現のために必要な制限領域を含む。前記発現ベクターを宿
主細胞において発現させ得る。好適な宿主細胞は、例えば細菌、酵母細胞及び哺
乳動物細胞である。前記した技術は当業界で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋｅら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a Laborato
ry Manual)」，コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）発行を参照され
たい。
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）及びＩｎｔ．
Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５：１６１−２１４（１９
９０）に記載されている固相ペプチド合成法により製造され得る。本発明のペプ
チドは組換えDNA法によっても製造され得る。本発明のペプチドまたは前記ペプ
チドのマルチマーをコードする核酸配列を発現ベクターに挿入する。好適な発現
ベクターは複製及び発現のために必要な制限領域を含む。前記発現ベクターを宿
主細胞において発現させ得る。好適な宿主細胞は、例えば細菌、酵母細胞及び哺
乳動物細胞である。前記した技術は当業界で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋｅら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a Laborato
ry Manual)」，コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）発行を参照され
たい。
【００２４】 前記ペプチドは、エキソペプチダーゼ触媒加水分解を減少させるＣ−及び／ま
たはＮ−末端修飾により安定化され得る。前記修飾には、Ｃ末端アシル化（例え
ば、アセチル化＝Ａｃ−ペプチド）、Ｎ末端アミド導入（例えば、ペプチド−Ｎ
Ｈ２）、アシル化とアミド導入の組合せ（例えば、Ａｃ−ペプチド−ＮＨ２）、
及びＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸の導入（Ｐｏｗｅｌｌら，Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍ．Ｓｃｉ．，８１：７３１−７３５，１９９２）が含まれ得る。
たはＮ−末端修飾により安定化され得る。前記修飾には、Ｃ末端アシル化（例え
ば、アセチル化＝Ａｃ−ペプチド）、Ｎ末端アミド導入（例えば、ペプチド−Ｎ
Ｈ２）、アシル化とアミド導入の組合せ（例えば、Ａｃ−ペプチド−ＮＨ２）、
及びＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸の導入（Ｐｏｗｅｌｌら，Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍ．Ｓｃｉ．，８１：７３１−７３５，１９９２）が含まれ得る。
【００２５】 他の修飾は、エンドペプチダーゼによる加水分解の防止に向けられている。こ
の修飾の例は、Ｌ−アミノ酸に代わるＤ−アミノ酸の導入、修飾アミノ酸、ペプ
チド内の環化、修飾ペプチド結合、例えば還元ペプチド結合Ψ［ＣＨ２ＮＨ］及
び例えばペプトイド（Ｎ−アルキル化グリシン誘導体）（Ａｄａｎｇら，Ｒｅｃ
ｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ．，１１３：６３−７８，１９９４
及びＳｉｍｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９
３６７−９３７１，１９９２）の導入である。
の修飾の例は、Ｌ−アミノ酸に代わるＤ−アミノ酸の導入、修飾アミノ酸、ペプ
チド内の環化、修飾ペプチド結合、例えば還元ペプチド結合Ψ［ＣＨ２ＮＨ］及
び例えばペプトイド（Ｎ−アルキル化グリシン誘導体）（Ａｄａｎｇら，Ｒｅｃ
ｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ．，１１３：６３−７８，１９９４
及びＳｉｍｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９
３６７−９３７１，１９９２）の導入である。
【００２６】 本発明のペプチドは、自己反応性Ｔ細胞により認識され且つ自己反応性Ｔ細胞
を刺激し得るＴ細胞エピトープである。この自己反応性Ｔ細胞は、例えば自己免
疫疾患を患っている患者の血液中で認められ得る。
を刺激し得るＴ細胞エピトープである。この自己反応性Ｔ細胞は、例えば自己免
疫疾患を患っている患者の血液中で認められ得る。
【００２７】 本発明によれば、配列番号１または配列番号２のペプチドを含む標的自己抗原
上に存在するＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープに類似しているペプチドは
、Ｔ細胞媒介軟骨破壊（例えば、関節炎、より具体的には慢性関節リウマチ）を
患っている哺乳動物、特にヒトにおいて前記自己抗原に対して特異的Ｔ細胞寛容
を誘導するための治療において使用するのに非常に適している。場合により、前
記治療は他の薬剤、例えばスルファサラジン、抗マラリア薬（クロロキン、ヒド
ロキシクロロキン）、注射または経口金剤、メトトレキセート、Ｄ−ペニシラミ
ン、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノラートのようなＤＭＡＲＤ（
病気修飾抗リウマチ薬）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系消炎剤）、コルチコイド
、または自己免疫患者の病気の進行に影響を与えることが公知の他の薬物と組合
わせてもよい。
上に存在するＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープに類似しているペプチドは
、Ｔ細胞媒介軟骨破壊（例えば、関節炎、より具体的には慢性関節リウマチ）を
患っている哺乳動物、特にヒトにおいて前記自己抗原に対して特異的Ｔ細胞寛容
を誘導するための治療において使用するのに非常に適している。場合により、前
記治療は他の薬剤、例えばスルファサラジン、抗マラリア薬（クロロキン、ヒド
ロキシクロロキン）、注射または経口金剤、メトトレキセート、Ｄ−ペニシラミ
ン、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノラートのようなＤＭＡＲＤ（
病気修飾抗リウマチ薬）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系消炎剤）、コルチコイド
、または自己免疫患者の病気の進行に影響を与えることが公知の他の薬物と組合
わせてもよい。
【００２８】 本発明のペプチドは、自己抗原以外の抗原に対して反応性であるが自己抗原、
すなわち配列番号１または配列番号２のペプチドを含むタンパク質またはその一
部と同一組織中に存在するリンパ球をモジュレートするためにも使用され得る。
抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することにより、自己免疫疾患はバイスタンダー抑
制により治療され得る。より一般的には、モジュレートされる細胞は造血細胞で
ある。通常、寛容原として機能させるためには、ペプチドは少なくとも２つの条
件を満たしていなければならない。すなわち、該ペプチドは免疫モジュレート能
力を有していなければならず、通常より大きなタンパク質の一部として局所的に
発現されなければならない。
すなわち配列番号１または配列番号２のペプチドを含むタンパク質またはその一
部と同一組織中に存在するリンパ球をモジュレートするためにも使用され得る。
抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導することにより、自己免疫疾患はバイスタンダー抑
制により治療され得る。より一般的には、モジュレートされる細胞は造血細胞で
ある。通常、寛容原として機能させるためには、ペプチドは少なくとも２つの条
件を満たしていなければならない。すなわち、該ペプチドは免疫モジュレート能
力を有していなければならず、通常より大きなタンパク質の一部として局所的に
発現されなければならない。
【００２９】 従って、本発明は、炎症性自己免疫疾患を患っている患者を本発明のペプチド
を含む医薬製剤を投与することにより治療する方法を提供する。前記患者は、グ
レーブス病、若年性関節炎、原発性糸球体腎炎、変形性関節症、シェーグレン症
候群、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、アジソン病、原発性胆汁性硬化症、ぶ
どう膜炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症または糖尿病
のような病気を患っている。よって、本発明のペプチドは前記病気を患っている
患者において寛容を誘導するための薬剤の製造の際に使用され得る。
を含む医薬製剤を投与することにより治療する方法を提供する。前記患者は、グ
レーブス病、若年性関節炎、原発性糸球体腎炎、変形性関節症、シェーグレン症
候群、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、アジソン病、原発性胆汁性硬化症、ぶ
どう膜炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症または糖尿病
のような病気を患っている。よって、本発明のペプチドは前記病気を患っている
患者において寛容を誘導するための薬剤の製造の際に使用され得る。
【００３０】 本発明のペプチドによる自己免疫疾患の治療は、バイスタンダー抑制が非関連
であるが共局在する抗原に対して誘導される事実を利用している。調節細胞は、
免疫応答をダウンモジュレートし得るサイトカインのような多面発現性タンパク
質を抗原特異的に分泌する。
であるが共局在する抗原に対して誘導される事実を利用している。調節細胞は、
免疫応答をダウンモジュレートし得るサイトカインのような多面発現性タンパク
質を抗原特異的に分泌する。
【００３１】 本発明によれば、関節軟骨のＴ細胞媒介破壊を患っている患者は１つ以上の本
発明のペプチド及び医薬的に許容され得る担体を含む治療用組成物で治療され得
る。本発明の医薬組成物を投与すると、攻撃されている関節軟骨中の自己抗原タ
ンパク質及び１つ以上の本発明のペプチドのアミノ酸配列により特徴づけられる
かまたは模倣される同定ＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを示す他の自己
抗原に対して全身免疫寛容、特に前記患者の特異的自己反応性Ｔ細胞の寛容が誘
導される。こうして、誘導寛容により、攻撃されている関節軟骨における局所炎
症応答が低下する。
発明のペプチド及び医薬的に許容され得る担体を含む治療用組成物で治療され得
る。本発明の医薬組成物を投与すると、攻撃されている関節軟骨中の自己抗原タ
ンパク質及び１つ以上の本発明のペプチドのアミノ酸配列により特徴づけられる
かまたは模倣される同定ＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを示す他の自己
抗原に対して全身免疫寛容、特に前記患者の特異的自己反応性Ｔ細胞の寛容が誘
導される。こうして、誘導寛容により、攻撃されている関節軟骨における局所炎
症応答が低下する。
【００３２】 本発明の医薬組成物中に使用される非常に好適なペプチドは、最高全長５５ア
ミノ酸配列によりフランキングされるＹＫＬ−３９（２６８−２７６）またはＹ
ＫＬ−３９（２６６−２７８）を含むペプチドである。より好ましくは、ペプチ
ドは２５アミノ酸長を有する。更に好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列はＦＴ
ＬＡＳＡＥＴＴまたはＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧである。
ミノ酸配列によりフランキングされるＹＫＬ−３９（２６８−２７６）またはＹ
ＫＬ−３９（２６６−２７８）を含むペプチドである。より好ましくは、ペプチ
ドは２５アミノ酸長を有する。更に好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列はＦＴ
ＬＡＳＡＥＴＴまたはＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧである。
【００３３】 本発明のペプチドは、自己反応性Ｔ細胞に対して特定の効果を有し、よって免
疫系の他の成分は免疫抑制薬の非特異的抑制効果と比較して無傷のまま残るとい
う利点を有する。本発明のペプチドによる治療は安全であり、有毒な副作用は生
じない。
疫系の他の成分は免疫抑制薬の非特異的抑制効果と比較して無傷のまま残るとい
う利点を有する。本発明のペプチドによる治療は安全であり、有毒な副作用は生
じない。
【００３４】 全身免疫寛容は高〜低用量の本発明のペプチドを投与することにより獲得され
得る。ペプチドの用量は、投与経路、投与回数、患者の年令及び全身健康状態及
び食事に依存する。
得る。ペプチドの用量は、投与経路、投与回数、患者の年令及び全身健康状態及
び食事に依存する。
【００３５】 通常、体重１ｋｇあたり０．０１〜１０，０００μｇ、好ましくは０．０５〜
５００μｇ、より好ましくは０．１〜１００μｇのペプチドが使用され得る。
５００μｇ、より好ましくは０．１〜１００μｇのペプチドが使用され得る。
【００３６】 医薬的に許容され得る担体は当業者に公知であり、例えば滅菌食塩水、ラクト
ース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチ
ン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油及び水が含まれる。他の担体は、例えば所望
によりリポソーム中に埋没されるＭＨＣクラスＩＩ分子であってもよい。
ース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチ
ン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油及び水が含まれる。他の担体は、例えば所望
によりリポソーム中に埋没されるＭＨＣクラスＩＩ分子であってもよい。
【００３７】 更に、本発明の医薬組成物は１つ以上の佐剤を含み得る。好適な佐剤には、特
に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アンフィゲン(amphigen)、トコフ
ェノール、モノホスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチド及びサポニン（例えば
、Ｑｕｉｌｌ Ａ）が含まれる。好ましくは、本発明の寛容療法に使用される佐
剤は粘膜上皮に結合する粘膜適用用佐剤、例えばコレラ毒素Ｂ−サブユニットま
たはカルボマーである。佐剤の量は佐剤自身の種類に依存する。
に水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アンフィゲン(amphigen)、トコフ
ェノール、モノホスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチド及びサポニン（例えば
、Ｑｕｉｌｌ Ａ）が含まれる。好ましくは、本発明の寛容療法に使用される佐
剤は粘膜上皮に結合する粘膜適用用佐剤、例えばコレラ毒素Ｂ−サブユニットま
たはカルボマーである。佐剤の量は佐剤自身の種類に依存する。
【００３８】 更に、本発明の医薬組成物は１つ以上の安定剤、例えばソルビトール、マンニ
トール、スターチ、スクロースデキストリンやグルコースのような炭水化物、ア
ルブミンまたはカゼインのようなタンパク質、アルカリホスフェートのような緩
衝剤を含み得る。
トール、スターチ、スクロースデキストリンやグルコースのような炭水化物、ア
ルブミンまたはカゼインのようなタンパク質、アルカリホスフェートのような緩
衝剤を含み得る。
【００３９】 好適な投与経路は、例えば筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、
経口投与及びスプレーのような鼻腔内投与である。
経口投与及びスプレーのような鼻腔内投与である。
【００４０】 本発明の別の目的は、関節軟骨の破壊に関与する自己反応性Ｔ細胞を検出する
方法及び前記方法に使用される試験キットを提供することである。従って、本発
明のペプチドは、慢性炎症及び関節軟骨の破壊に関与する活性化自己反応性Ｔ細
胞の存在を検出するための診断方法に使用するのに特に適している。
方法及び前記方法に使用される試験キットを提供することである。従って、本発
明のペプチドは、慢性炎症及び関節軟骨の破壊に関与する活性化自己反応性Ｔ細
胞の存在を検出するための診断方法に使用するのに特に適している。
【００４１】 本発明の診断方法は、 ａ）個体の血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップ、 ｂ）前記ＰＢＭＣを適当な条件下で培養するステップ、 ｃ）前記ＰＢＭＣ培養物を１つ以上の本発明のペプチドの存在下でインキュベー
トするステップ、及び ｄ）個体中の活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を示すＴ細胞の応答、例えば増殖応
答を検出するステップ を含む。
トするステップ、及び ｄ）個体中の活性化自己反応性Ｔ細胞の存在を示すＴ細胞の応答、例えば増殖応
答を検出するステップ を含む。
【００４２】 Ｔ細胞の増殖応答の検出は、例えば３Ｈ−チミジンの取込みにより検出され得
る。
る。
【００４３】 本発明の範囲には、１つ以上の本発明のペプチドを含む試験キットも包含され
る。前記試験キットは本発明の診断方法で使用するのに適している。
る。前記試験キットは本発明の診断方法で使用するのに適している。
【００４４】 下記実施例は本発明を例示するもので、本発明の範囲を限定するものと解釈す
べきでない。
べきでない。
【００４５】 （図の説明） 図１ａ、ｂ及びｃは、３つの異なるＨＣ ｇｐ−３９−特異的ハイブリドーマ
（８Ｂ１２、１４Ｇ１１、２０Ｈ５）とＹＫＬ−３９（２６６−２７８）の交差
反応性を示す。
（８Ｂ１２、１４Ｇ１１、２０Ｈ５）とＹＫＬ−３９（２６６−２７８）の交差
反応性を示す。
【００４６】 （ＣＶＲ０２７１Ｂ＝ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）、ＫＶ０４３２Ｂ
＝ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）、ＣＣ０３３２Ｂ＝Ｃｈｉ（２６９−２８２
）、ＫＶ０４３１Ａ＝ＹＫＬ−３９（２６２−２７４）。ＨＣＤＡ．８Ｂ１２．
１Ｄ８、１４Ｇ１１．１Ｈ７及び２０Ｈ５．４Ｆ６．２Ｆ６はＨＣ ｇｐ−３９
（２６３−２７５）に対して特異的なＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１−制限ハイブ
リドーマである。）Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化をＩＬ−２産生として表す。
＝ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）、ＣＣ０３３２Ｂ＝Ｃｈｉ（２６９−２８２
）、ＫＶ０４３１Ａ＝ＹＫＬ−３９（２６２−２７４）。ＨＣＤＡ．８Ｂ１２．
１Ｄ８、１４Ｇ１１．１Ｈ７及び２０Ｈ５．４Ｆ６．２Ｆ６はＨＣ ｇｐ−３９
（２６３−２７５）に対して特異的なＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１−制限ハイブ
リドーマである。）Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化をＩＬ−２産生として表す。
【００４７】 図２は、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）またはＹＫＬ−３９（２６６−
２７８）によるインビボ寛容化を示す。
２７８）によるインビボ寛容化を示す。
【００４８】 Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５０、１０または２μｇのＨＣ ｇｐ−３９（２６３
−２７５）またはＹＫＬ−３９（２６６−２７８）を鼻腔内投与後ＨＣ ｇｐ−
３９（２６３−２７５）で免疫化して寛容化した。サリンで予備処理したかまた
は未処理のままとしたマウスをコントロールとして加えた。
−２７５）またはＹＫＬ−３９（２６６−２７８）を鼻腔内投与後ＨＣ ｇｐ−
３９（２６３−２７５）で免疫化して寛容化した。サリンで予備処理したかまた
は未処理のままとしたマウスをコントロールとして加えた。
【００４９】 （実施例） 実施例１：配列のアラインメント ヒト軟骨細胞タンパク質ＹＬＫ−３９は、ＨＣ ｇｐ−３９（ＹＫＬ−４０）
と有意な配列同一性を有する。ＨＣ ｇｐ−３９の別の同族体はヒトマクロファ
ージにより分泌され、キトトリオシダーゼと呼ばれている（Ｂｏｏｔら、１９９
５）。ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）、配
列番号３）に相当する配列はそれぞれ、ＹＫＬ−３９タンパク質（２６６−２７
８）内のＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧとして、マクロファージキトトリオシダー
ゼ（２６９−２８２）内のＲＳＦＴＬＡＳＳＳＤＴＲＶＧ（配列番号４）として
同定された（表１）。Ｃｈｉ（２６９−２８２）は、以前タンパク質内のＴ細胞
エピトープを選択するために使用したＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１ペプチド結合
モチーフを含む。対照的に、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）ペプチドはこのモ
チーフを含まない。すべてのペプチドを合成した。
と有意な配列同一性を有する。ＨＣ ｇｐ−３９の別の同族体はヒトマクロファ
ージにより分泌され、キトトリオシダーゼと呼ばれている（Ｂｏｏｔら、１９９
５）。ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧＶＧ（ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）、配
列番号３）に相当する配列はそれぞれ、ＹＫＬ−３９タンパク質（２６６−２７
８）内のＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧとして、マクロファージキトトリオシダー
ゼ（２６９−２８２）内のＲＳＦＴＬＡＳＳＳＤＴＲＶＧ（配列番号４）として
同定された（表１）。Ｃｈｉ（２６９−２８２）は、以前タンパク質内のＴ細胞
エピトープを選択するために使用したＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１ペプチド結合
モチーフを含む。対照的に、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）ペプチドはこのモ
チーフを含まない。すべてのペプチドを合成した。
【００５０】
【表１】
【００５１】 実施例２：ペプチドのＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１への結合 実施例１のペプチドを、ＤＲＢ１＊０４０１コード化分子の結合について試験
した。ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子をホモ接合性ＥＢＶ−形質転
換したヒトＢリンパ芽球細胞系Ｈｕｌｙ１３８ＩＣ２から精製し、競合ペプチド
ＨＬＡ−ＤＲ結合アッセイを基本的にＶｅｒｈｅｉｊｄｅｎら（１９９７）に記
載されているように実施した。ＤＲＢ１＊０４０１コード化分子の結合に対する
所与ペプチドのアフィニティーはマーカーペプチドとの競合に関連した。この相
対的結合アフィニティーを、シグナルが５０％に減少するペプチド濃度（ＩＣ５ ０ ）として定義した。ＨＡ−Ｆペプチドはポジティブコントロール（赤血球凝集
素３０７−３１９；ＰＫＦＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ；３０９位のＹはＦで置換され
ている；配列番号５）である。このペプチドはＤＲＢ１＊０４０１分子に対して
高いアフィニティーを有することが知られている。
した。ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４０１）分子をホモ接合性ＥＢＶ−形質転
換したヒトＢリンパ芽球細胞系Ｈｕｌｙ１３８ＩＣ２から精製し、競合ペプチド
ＨＬＡ−ＤＲ結合アッセイを基本的にＶｅｒｈｅｉｊｄｅｎら（１９９７）に記
載されているように実施した。ＤＲＢ１＊０４０１コード化分子の結合に対する
所与ペプチドのアフィニティーはマーカーペプチドとの競合に関連した。この相
対的結合アフィニティーを、シグナルが５０％に減少するペプチド濃度（ＩＣ５ ０ ）として定義した。ＨＡ−Ｆペプチドはポジティブコントロール（赤血球凝集
素３０７−３１９；ＰＫＦＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ；３０９位のＹはＦで置換され
ている；配列番号５）である。このペプチドはＤＲＢ１＊０４０１分子に対して
高いアフィニティーを有することが知られている。
【００５２】 予期したように、Ｃｈｉ（２６９−２８２）ペプチドがＤＲＢ１＊０４０１分
子に対して高アフィニティーで結合することが判明した（表２参照）。有効ＤＲ
Ｂ１＊０４０１ペプチド結合モチーフを持たないＹＫＬ−３９（２６６−２７８
）ペプチドはＤＲ４（Ｂ１＊０４０１）に対して非常に高いアフィニティーで結
合した。
子に対して高アフィニティーで結合することが判明した（表２参照）。有効ＤＲ
Ｂ１＊０４０１ペプチド結合モチーフを持たないＹＫＬ−３９（２６６−２７８
）ペプチドはＤＲ４（Ｂ１＊０４０１）に対して非常に高いアフィニティーで結
合した。
【００５３】
【表２】
【００５４】 実施例３：Ｔ細胞ハイブリドーマの刺激 ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）に対して特異的なハイブリドーマを、対
応配列の認識について試験した。
応配列の認識について試験した。
【００５５】 ３つの異なるＨＣ ｇｐ−３９特異的ハイブリドーマ細胞系とＹＫＬ−３９ま
たはキトトリオシダーゼペプチドの交差反応性を試験するために、５×１０４個
のハイブリドーマ細胞及び２×１０５個のＤＲＢ１＊０４０１特異性を有する照
射（１２０００ＲＡＤ）ＥＢＶ−形質転換したＢ細胞を丸底微量滴定プレートの
ウェルにおいて１５０μｌ容量でインキュベートした。１対のウェルに、ペプチ
ド抗原（ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８
）、キトトリオシダーゼ（２６９−２８２）またはコントロールペプチド）を５
０μｌ容量で添加した。４８時間後、培養上清１００μｌを、マウスＩＬ−２に
対して特異的なＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによ
りＩＬ−２産生についてアッセイした。
たはキトトリオシダーゼペプチドの交差反応性を試験するために、５×１０４個
のハイブリドーマ細胞及び２×１０５個のＤＲＢ１＊０４０１特異性を有する照
射（１２０００ＲＡＤ）ＥＢＶ−形質転換したＢ細胞を丸底微量滴定プレートの
ウェルにおいて１５０μｌ容量でインキュベートした。１対のウェルに、ペプチ
ド抗原（ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８
）、キトトリオシダーゼ（２６９−２８２）またはコントロールペプチド）を５
０μｌ容量で添加した。４８時間後、培養上清１００μｌを、マウスＩＬ−２に
対して特異的なＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによ
りＩＬ−２産生についてアッセイした。
【００５６】 合成ペプチドＹＫＬ−３９（２６６−２７８）はＨＣ ｇｐ−３９（２６３−
２７５）と類似の応答を生じ、Ｃｈｉ（２６９−２８２）は応答を生じなかった
ことが判明した。このデータから、３つの異なるハイブリドーマを使用した３種
のＴＣＲはＤＲＢ１＊０４０１コード化分子（図１ａ、ｂ、ｃ）で提示したとき
ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）またはＹＫＬ−３９（２６８−２７８）間
を識別しないが、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）及びＣｈｉ（２６９−２
８２）間を識別することが示唆される。このデータから、ＹＫＬ−３９（２６６
−２７８）はＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）の模擬エピトープであること
が示される（図１ａ、ｂ、ｃ）。
２７５）と類似の応答を生じ、Ｃｈｉ（２６９−２８２）は応答を生じなかった
ことが判明した。このデータから、３つの異なるハイブリドーマを使用した３種
のＴＣＲはＤＲＢ１＊０４０１コード化分子（図１ａ、ｂ、ｃ）で提示したとき
ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）またはＹＫＬ−３９（２６８−２７８）間
を識別しないが、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）及びＣｈｉ（２６９−２
８２）間を識別することが示唆される。このデータから、ＹＫＬ−３９（２６６
−２７８）はＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）の模擬エピトープであること
が示される（図１ａ、ｂ、ｃ）。
【００５７】 実施例４：ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）のＰＢＭＣによる認識 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（スウェーデン
国ウプサラに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いる標準遠心によりヘパリン処理
した末梢血から単離した。細胞を２４ウェルプレートのウェルに５×１０５細胞
／ｍｌの濃度で懸濁させた。細胞を培地単独または１０もしくは５０μｇ／ｍｌ
のペプチド抗原（ＹＫＬ−３９（２６６−２７８））の存在下でインキュベート
した。培養物を５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下３７℃で６日間インキュベートした。
次いで、細胞を懸濁し、１００もしくは１５０μｌ容量の培地を９６ウェル丸底
プレートのウェルに４倍に分配した。次いで、細胞を０．５μＣｉ（１．８５×
１０４Ｂｑ）［３Ｈ］チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ）でパルスし、１８時間後取り
込まれた放射能を測定した。表３に示す結果は刺激指数（ＳＩ）（抗原特異的カ
ウント数／バックグラウンドカウント数）として表示する。
国ウプサラに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いる標準遠心によりヘパリン処理
した末梢血から単離した。細胞を２４ウェルプレートのウェルに５×１０５細胞
／ｍｌの濃度で懸濁させた。細胞を培地単独または１０もしくは５０μｇ／ｍｌ
のペプチド抗原（ＹＫＬ−３９（２６６−２７８））の存在下でインキュベート
した。培養物を５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下３７℃で６日間インキュベートした。
次いで、細胞を懸濁し、１００もしくは１５０μｌ容量の培地を９６ウェル丸底
プレートのウェルに４倍に分配した。次いで、細胞を０．５μＣｉ（１．８５×
１０４Ｂｑ）［３Ｈ］チミジン（［３Ｈ］ＴｄＲ）でパルスし、１８時間後取り
込まれた放射能を測定した。表３に示す結果は刺激指数（ＳＩ）（抗原特異的カ
ウント数／バックグラウンドカウント数）として表示する。
【００５８】 表３ａから、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）エピトープがＲＡ患者において
簡単に認識されると結論づけることができる。表３ｂは、ＹＫＬ−３９（２６６
−２７８）のＰＢＭＣによる認識がＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）及びＨ
Ｃ ｇｐ−３９の認識と一致し、更にＹＫＬ−３９（２６６−２７８）の認識が
ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）の認識よりも通常より顕著であることを示
している。
簡単に認識されると結論づけることができる。表３ｂは、ＹＫＬ−３９（２６６
−２７８）のＰＢＭＣによる認識がＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）及びＨ
Ｃ ｇｐ−３９の認識と一致し、更にＹＫＬ−３９（２６６−２７８）の認識が
ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）の認識よりも通常より顕著であることを示
している。
【００５９】
【表３】
【００６０】 実施例５：寛容誘導 ペプチド抗原による寛容誘導をモニターするのに適したＨＣ ｇｐ−３９（２
６６−２７５）特異的ＤＴＨアッセイを開発した。Ｂａｌｂ／ｃマウスをフロイ
ント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）で
免疫化することが、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）ペプチドで攻撃後ＤＴ
Ｈ応答を誘導する際に有効であることが判明した。このペプチドを用いるＤＴＨ
システムを、ＨＣ ｇｐ−３９（１５２−２７５）ペプチドの鼻腔内投与による
ＤＴＨ応答のモジュレーションを検出するために使用した。ＨＣ ｇｐ−３９（
２６３−２７５）ペプチドの鼻腔内投与によりＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７
５）誘導ＤＴＨ応答が用量依存的にダウンモジュレートしたことが判明した。し
かしながら、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）を鼻腔内投与するとＤＴＨ応答が
更に強くダウンモジュレートした。このことから、ＹＫＬ−３９（２６６−２７
８）がＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）で誘導したペプチド特異的応答を効
率的に寛容し得ることが示される（表４，図２ａ、ｂ、ｃ）。
６６−２７５）特異的ＤＴＨアッセイを開発した。Ｂａｌｂ／ｃマウスをフロイ
ント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）で
免疫化することが、ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）ペプチドで攻撃後ＤＴ
Ｈ応答を誘導する際に有効であることが判明した。このペプチドを用いるＤＴＨ
システムを、ＨＣ ｇｐ−３９（１５２−２７５）ペプチドの鼻腔内投与による
ＤＴＨ応答のモジュレーションを検出するために使用した。ＨＣ ｇｐ−３９（
２６３−２７５）ペプチドの鼻腔内投与によりＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７
５）誘導ＤＴＨ応答が用量依存的にダウンモジュレートしたことが判明した。し
かしながら、ＹＫＬ−３９（２６６−２７８）を鼻腔内投与するとＤＴＨ応答が
更に強くダウンモジュレートした。このことから、ＹＫＬ−３９（２６６−２７
８）がＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）で誘導したペプチド特異的応答を効
率的に寛容し得ることが示される（表４，図２ａ、ｂ、ｃ）。
【００６１】
【表４】
【配列表】
【図１Ａ】 ＨＣ ｇｐ−３９−特異的ハイブリドーマ（８Ｂ１２）とＹＫＬ−３９（２６
６−２７８）の交差反応性を示す。
６−２７８）の交差反応性を示す。
【図１Ｂ】 ＨＣ ｇｐ−３９−特異的ハイブリドーマ（１４Ｇ１１）とＹＫＬ−３９（２
６６−２７８）の交差反応性を示す。
６６−２７８）の交差反応性を示す。
【図１Ｃ】 ＨＣ ｇｐ−３９−特異的ハイブリドーマ（２０Ｈ５）とＹＫＬ−３９（２６
６−２７８）の交差反応性を示す。
６−２７８）の交差反応性を示す。
【図２】 ＨＣ ｇｐ−３９（２６３−２７５）またはＹＫＬ−３９（２６６−２７８）
によるインビボ寛容化を示す。
によるインビボ寛容化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/564 Ｂ 33/564 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 BA02 BA08 BA20 BA42 CA59 MA59 MA66 NA14 ZA962 ZB072 4H045 AA10 AA30 BA15 BA16 CA40 EA22 EA50 FA33
Claims (8)
- 【請求項１】 アミノ酸配列ＦＴＬＡＳＡＥＴＴ（配列番号１）を含む９−
５５アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチド。 - 【請求項２】 アミノ酸配列ＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧ（配列番号２）を
含む請求の範囲第１項に記載のペプチド。 - 【請求項３】 最高２５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有する請求の範
囲第１項または第２項に記載のペプチド。 - 【請求項４】 アミノ酸配列ＦＴＬＡＳＡＥＴＴ（配列番号１）またはアミ
ノ酸配列ＨＳＦＴＬＡＳＡＥＴＴＶＧ（配列番号２）を有する請求の範囲第１項
または第２項に記載のペプチド。 - 【請求項５】 治療用物質として使用するための請求の範囲第１項〜第４項
のいずれかに記載のペプチド。 - 【請求項６】 １つ以上の請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のペ
プチド及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物。 - 【請求項７】 自己免疫疾患、特に関節炎を患っている患者の自己抗原に対
して特異的なＴ細胞寛容を誘導するための医薬組成物の製造のための１つ以上の
請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のペプチドの使用。 - 【請求項８】 １つ以上の請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のペ
プチド及び検出剤を含む診断組成物。
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