NO300594B1

NO300594B1 - Analogifremgangsmåte for fremstilling av polypeptid og fremgangsmåte for fremstilling av T-celler med spesifisitet mot polypeptidet

Info

Publication number: NO300594B1
Application number: NO904919A
Authority: NO
Inventors: Irun R Cohen; Dana Elias; Doron Markovits
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-11-13
Publication date: 1997-06-23
Also published as: FI905614A0; FI103976B1; US5671848A; ATE174689T1; CA2029861C; EP0417271A1; EP0417271B1; JPH04502920A; US5114844A; CA2029861A1; DE69032833T2; NO904919D0; EP0417271A4; JP3203323B2; AU639456B2; AU5546790A; DE69032833D1; NO904919L; JP2001010962A; WO1990010449A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte ved fremstilling av et i hovedsak rent polypeptid omfattende en sekvens med sammensetningen Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Gly-Asp og farmasøytisk akseptable salter derav, eller enhver modifikasjon derav som er immunologisk kryssreaktiv med dette, men som ikke er et fullstendig varmesjokk-protein. Polypeptidet fremstilles på i og for seg kjent måte ved standard peptidsyntese. Polypeptidet egner seg for å påvise eksistensen av en tendens til å utvikle eller initieringen av en prosess som fører til insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), og mer spesielt til påvisning av tilstedeværelse av et 65 KD varmesjokkprotein (hsp65) (eller et molekyl som er immunologisk kryssreaktivt med dette) eller antistoff eller T-celler som er reaktive med et slikt protein.

Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen jan brukes til å forhindre IDDM eller å behandle IDDM i dets begynnende stadier ved å tilføre hsp65 eller et immunologisk relatert protein eller fragment, eller ved å tilføre T-celler aktivert av et slikt protein eller fragment, idet slike T-celler er blitt behandlet for å nedsette deres effekt eller immunogenisitet, eller fragmenter av slike T-celler eller behandlede T-celler, hvor det forårsakes immunologisk toleranse overfor disse.

Hyppigheten av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) har øket flere ganger i de siste tiår i mange land, og det er beregnet at 1% av befolkningen som er i live i dag vil ha utviklet IDDM før de når en alder av 70 år. IDDM er forårsaket av en autoimmunprosess som ødelegger de insulinprodu-serende beta-celler. Diabetes blir klinisk påviselig kun etter at en hoveddel av beta-cellene ugjenkallelig har blitt ødelagt, kanske 90%, og individets levetid blir av-hengig av en eksogen tilførsel av insulin. Med andre ord, på tidspunktet for klinisk diagnose har den autoimmune prosess allerede gjort irreversibel skade, det meste av den uten merkbare symptomer.

Riktig behandling av den autoimmune prosess som er ansvar-lig for sykdommen bør i idealtilfelle begynne før pasienten har klare symptomer på diabetes og krever insulinerstatning for sin tapte evne til å produsere insulin. Avslutning av den autoimmune prosess ville resultere i at sykdommen kureres og forhindre behovet for eksogen insulin kun dersom sykdomsforløpet kunne stanses mens pasienten fremdeles har et tilstrekkelig antall beta-celler for å gi adekvate mengder av endogen insulin. Følgelig vil enhver form for terapi være mer efektiv dersom personene i risikoområdet kunne identifiseres mens de fremdeles var uten klare symptomer på IDDM og før pasientene krever eksogen insulin. Ca. 90% av nye tilfeller av IDDM opptrer utenfor familier med kjente tilfeller. Følgelig er assays som er egnet for masseutvel-gelse nødvendige for å påvise den subkliniske sykdomsprosess på et stadium før den blir irreversibel.

Heldigvis finnes det et stort antall dyremodeller for IDDM, innbefattende BB-rotter og NOD-mus (se f.eks. Rossini et al., Ann. Rev. Immunol., 3:289-320, 1985). Mange av dyrene utvikler autoimmun IDDM spontant og viser mange av trekkene ved IDDM hos mennesker.

Varmesjokkproteiner (hsp) er en familie av proteiner som dannes av celler eksponert til økede temperaturer eller andre stressfaktorer, hsp'ene omfatter proteiner med forskjellig molekylvekt, innbefattende 20KD, 65-68KD, 70KD, 90KD, 110KD og andre. Varmesjokkproteinene er universelle i naturen, de dannes av bakterier, gjær, planter, insekter og høyere dyr, inklusive mennesker, hsp-proteinmolekylene er sterkt konservert og utviser bemerkelsesverdig homologi mellom alle disse forskjellige organismer. På grunn av sin ekstreme konservering i løpet av evolusjonen, er varmesjokkproteiner antatt å utføre viktige funksjoner. De oppviser vanligvis øket syntese etter eksponering av celler til stress-stimuli, innbefattende varme, visse metaller, droger eller aminosyreanaloger. Ikke desto mindre er disse proteiners spesielle funksjoner foreløbig uklare.

For eksempel ble det i pasienter med systemisk lupus ery-thematose (SLE) observert antistoff mot et 90KD varmesjokkprotein (Minota et al., J. Clin. Invest., 81:106-109, 1988). Funksjonen av disse antistoffer mot hsp90 er ikke kjent.

hsp65 ble funnet å være involvert i adjuvant artritt i rotter, se van Eden et al., Nature, 331:171-173, 1988. Adjuvant artritt er en autoimmun artritt forårsaket ved å immunisere visse stammer av rotter mot Mycobacterium tuberculosis (MT)-organismer. Det ble funnet at sykdommen kunne overføres til immunologisk naive, bestrålte rotter ved en klon av T-lymfocytter som var reaktiv til en 9 aminosyrers peptidsekvens (180-188) av hsp65 av MT. Således syntes adjuvant artritt å være en autoimmun sykdom fremskaffet av anti-hsp65 T-lymfocytter. Det autoimmune angrep mot leddene ble tilskrevet partiell sekvenshomologi mellom 18 0-185 hsp65-og et segment av forbindelsesproteinet av brusk-brusk-proteoglykanet (se Cohen, Scientific American, 256:-52-60, 1988). Det ble også funnet at T-lymfocytter fra synovialvæsken hos pasienter med reumatoid artritt reagerte på hsp65 av MNT (se Res et al, Lancet, 11:478-480, 1988).

Det ble funnet at tilførsel av hsp65 til rotter før induksjon av adjuvant artritt forhindret senere utvikling av artritt. Således ble tilstedeværelsen av en immunrespons til hsp65 forbundet med artritt både i rotter og mennesker, og tilførsel av hsp65 kunne føre til resistens mot artritt.

Europeisk patentsøknad 262.710 beskriver polypeptider som er anvendelige for å lindre, behandle og diagnostisere autoimmun artritt og lignende autoimmune lidelser.

Den fullstendige primærstruktur, innbefattende nukleotid og avledet aminosyresekvens av det humane Pl-protein har nylig blitt publisert i Jindal, S. et al, "Primary Structure of a Human Mitochondrial Protein Homologous to the Bacterial and Plant Chaperonins and to the 65-Kilodalton Mycobacterial Antigen", Molecular and Cellular Biolo<g>y, 9, 5, 2279-2283, 1989. Dette protein, beskrevet å ha en molekylvekt på ca. 63 kDa, er det humane varmesjokkprotein referert til heri som hHSP65-proteinet. Denne publikasjons fullstendige innhold er herved inkorporert heri pr. referanse. Dette prote-ins struktur, gjengitt som fig. 3 heri, skal være identisk med den beskrevet i Jindal.

Eureopeisk patentsøknad 261.648 beskriver bruken av aktiverte T-celler som er spesifikke for en autoimmun sykdom ved behandling av slike lidelser. T-cellene blir fortrinnsvis først trykkbehandlet, underkastet et kjemisk fornetningsmiddel og/eller utsatt for et cytoskjelettødeleggelsesmiddel for å forbedre deres immunogenisitet. Hele den fullstendig behandlede celle eller en fraksjon derav kan bli brukt som vaksine mot den autoimmune sykdom for hvilken T-cellen er spesifikk.

I den kjente fremgangsmåte for å forårsake stans av autoimmune T-celler blir pasienten immunisert med en prøve av nedsatte eller avirulente T-celler av den spesielle autoimmune spesifisitet, eller fragmenter eller fraksjoner derav. Pasienten reagerer ved å aktivere regulatoriske T-celler av mist to typer: antiergotypiske T-celler som gjenkjenner T-celleaktiverings-markører og anti-idiotypiske T-celler som synes å gjenkjenne egen-antigenreseptorene til-stede på de patogene endogene autoimmune T-celler. T-celle-vaksinering er i forsøksdyr effektiv for å indusere permanent remisjon av etablert sykdom såvel som å forhindre sykdom. Howell et al, Science, 246:668-670, 1989, og Van-den-bark et al., Nature, 341:541-544, 1989, beskriver bruk av peptidsekvenser av en T-cellereseptor S-kjede for vaksinering av rotter mot eksperimentell autoimmun encephalo-myelitt, for derved å underbygge den konklusjon at den autoimmune T-celle-reseptor i seg selv kan virke som en målepitop for regulator-T-celler.

Selv om slik bruk av T-celler eller fragmenter var kjent for autoimmune sykdommer generelt, var det spesielle antigen som er spesifikt for IDDM ikke tidligere kjent og således var det ikke mulig å fremskaffe aktiverte T-celler for vaksinering mot IDDM før foreliggende oppfinnelse.

Ett av målene med polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe metoder for tidlig diagnose av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM).

Et annet mål for polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe kits for bruk i tidlig diagnose av IDDM.

Et ytterligere mål for polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er å anvende dem for å forhindre

IDDM.

Det er ytterligere et mål for peptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse å anvende dem for behandling av IDDM i dets tidlige stadier.

Det er videre et mål for peptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse å anvende dem i tolerogene blandinger for å forhindre eller behandle IDDM.

Det er videre et mål for polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse å bruke dem for å forhindre eller behandle IDDM.

Et ytterigere mål er med foreliggende oppfinnelse å fremskaffe T-celler eller fragmenter som er anvendelige for å forhindre IDDM eller behandle IDDM i dets tidlige stadier.

Det er et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse å bruke det IDDM-spesifikke antigen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse til å isolere T-celler som er spesifikke for dette, og derpå å karakterisere peptidsekvensen av reseptor-regionen av slike T-celler og bruke slike resep-torpeptider for å forhindre eller behandle IDDM.

Dyregrupper uttrykker i løpet av utvikling av IDDM hsp65-molekyler eller molekyler som er kryssreaktive med dette som finner vei inn i blodet eller urinen hos dyrene. De uttrykker også antistoff og T-celler rettet spesifikt mot slike molekyler. Således virker tilstedeværelsen av hsp65 (eller molekyler som er kryssreaktive med dette) eller antistoff eller T-celler spesifikke mot dette i blod eller urin som et assay for påvisning av IDDM-prosessen før ødeleggelsen av S-celler er fullstendig, og individet er dømt til livslang diabetes.

Tilstedeværelse eller utvikling av IDDM i en pasient kan diagnostiseres ved å teste for tilstedeværelse av hsp65 (eller molekyler som er kryssreaktive med dette) eller antistoff eller T-celler som er spesifikke mot dette.

Påvisning av begynnende diabetes gjør det mulig for en pasient å begynne tiltak som er rettet mot å avslutte den autoimmune prosess, f.eks. er tilføringen av hsp65, eller en aktiv epitop derav eller et annet molekyl (antigen) som er immunologisk kryssreaktivt med dette, effektivt for å indusere motstandsdyktighet mot den autoimmune prosess i IDDM. Tilføring av T-celller som er spesifikke mot slike antigener i nedsatt eller avirulent form, eller som er blitt behandlet for å forbedre deres antigenisitet, eller fragmenter eller aktive fraksjoner derav, vil også indusere motstandsdyktighet mot den autoimmune prosess involvert i

IDDM.

Det har blitt oppdaget at immunisering mot hsp65 eller den aktive isotop derav eller et annet molekyl (antigen) som er immunologisk kryssreaktivt med dette i et passende hjelpestoff kan indusere IDDM. Imidlertid kan vaksinering med et slikt antigen uten et effektivt hjelpestoff og fortrinnsvis med et tolerogent bæremiddel, danne en spesifikk toleranse mot antigenet. Dette danner effektivt en resistens mot den autoimmune prosess av IDDM. Det samme er tilfelle med hensyn til vaksinering med T-celler som er spesifikke for slike antigener i nedsatt eller avirulent form eller etter at de er behandlet for å forbedre deres antigenisitet, eller fragmenter eller aktive fraksjoner derav. Dersom det viser seg at pasienten allerede er i det prekliniske begynnende stadium av IDDM, kan injeksjon med et slikt antigen eller T-celle (eller fraksjon) danne en toleranse for dette antigen og således stoppe den autoimmune prosess før signifikant permanent skade er skjedd.

Kort beskrivelse av tegningene

Foreliggende oppfinnelse vil bli bedre forstått utfra den følgende korte beskrivelse av tegningene og den etterføl-gende detaljerte beskrivelse av de foretrukne utførelses-former. Fig. 1 viser mengden av hsp65, anti-hsp65, anti-insulin-antistoff og anti-ideotypisk antistoff i serumet fra NOD-mus som ikke utviklet IDDM. Fig. 2 er en kurve som viser at markert økning i hsp65 og anti-hsp65 opptrer før utvikling av åpenlys IDDM i NOD-mus som ikke utviklet sykdommen. Anti-insulin og ideotypisk (DM) antistoff opptrer før IDDM i mindre utstrekning. Fig. 3 viser nukleotidet og den avledede aminosyresekvens av det human Pl-protein, som er et hHSP65. Tall til venste angår nukleotidsekvensen relativt til koordinat 1 ved begyn-nelsen av det forsøksvise initieringskodon. Aminosyresekvensen er nummerert ved å starte med 1 på samme sted. 5' forlengelse av denne leseramme er vist i énbok-stavskode. Posisjonen for det innvendige EcoRI-sete (nt 712), som markerer begynnelsen på \22a-sekvensen, er angitt. Polyadenyleringssignalet 15 nt fra A-halen ved 3' ende er understreket. Den forsøksvise mitokondielle målse-kvens ved N-terminal ende og en keratinlignende aminosyre-sekvens ved C-terminal ende inneholdende repetisjoner av Gly-Gly-Met er innrammet. Positivt ladede aminosyrer i ledersekvensen er angitt (+). Fig. 4 er en kurve som viser graden av spontan reaktivitet av NOD/Lt T-celler mot human hsp65, MT-hsdp654 og MT-hsp70 som en funksjon av alder. Fig. 5 er en kurve som viser en T-celle proliferativ repons mot p277 og p278 som en funksjon av peptidkonsentrasjonene. Fig. 6 er et stolpediagram som viser proliferasjonen av C7 og C9 T-cellekloner som er i stand til å overføre akutt diabetes til unge prediabetiske NOD/Lt-mus, i respons til p277, MT hsp65 og plasmidkontroll. Fig. 7 viser resultatene av immunisering mot peptidene p277 og p278 ved motstand mot indusert diabetes. Punktene viser blodglukosenivået tre uker etter immunisering for hver mus i forsøksgruppene.

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

De følgende eksempler viser spesielle utførelsesformer og eksperimenter som angår peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse er tenkt kun som ikkebegrensende eksempler.

Eksempel 1

Produksjon av MT hsp65- molekylet

hsp-molekylet fra Mycobacterium tuberculosis ble overført til E. coli ved standard fremgangsmåter og renset som beskrevet av van Eden et al., Nature, 331:171-173, 1988. Slike genetisk manipulerte E. voli-celler vil danne vesent-lige mengder av MT hsp65. På grunn av den nære homologi mellom hsp fra forskjellige kilder er hsp65 av mammalisk eller human opprinnelse også efffektiv når det dannes ved genetisk manipulasjon eller isolering fra celler.

Eksempel 2

Produksjon av antistoff mot MT hsp65

Kaniner av en standard laboratoriestamme (New Zealand White) ble inokulert sukbutant i ryggen med 100 mikrogram MT hsp65 dannet i samsvar med eksempel 1 i 0,5 ml fysiologisk saltvann emulgert i 0,5 ml mineralolje (ufullstendig adjuvant). En månded senere ble kaninen forsterket med 100 mikrogram MT hsp65 i 1,0 ml fysiologisk saltvann, og to uker senere ble kaninene tappet og serum samlet. Kaninene ble forsterket på lignene måte eter to måneder og igjen tappet. Antistoff fra serum ble brukt for å påvise hsp65 i blodet og urinen hos forsøksdyr og mennesker.

Eksempel 3

Assay av hsp65

Et standard fastfase radioimmunoassay brukes for å påvise tilstedeværelse av hsp65 molekylet. Fleksible PVC-mikro-titerplater belegges med 100 /il testserum eller urin i 18 timer ved 4°C og vaskes med fosfatbufret saltvann (PBS). Kontrollkaninserum og anti-hsp65-serum (dannet i henhold til eksempel 2) blir så fortynnet 1:10 0 i PBS + 0,1% bovin serum albumin (BSA) , og 50 /xl tilsettes hver brønn og inkuberes i 2-3 timer ved 37°C. Brønnen vaskes deretter tre ganger i PBS. 12<5>I-geite-antikanin lg, 100.000 cpm pr. brønn, tilsettes, og brønnene holdes ved 37°C i to timer. Platene vaskes deretter fire ganger i PBS og tørkes, og brønnene telles i en gamma-teller. Verdier erholdt med anti-hsp65-serum 2 S.D. over gjennomsnittlig cpm erholdt med normalt kaninserum blir betraktet som positive for tilstedeværelse av hsp65.

Eksempel 4

Assav av anti- hsp65- antistoff

Antistoff mot hsp65 påvises på lignende måte, bortsett fra at antigenet bundet til platene ikke er testserum eller urin, men renset MT hsp65 dannet i samsvar med eksempel 1, 5/il pr. brønn. Serumet som skal undersøkes for anti-hsp65 antistoff fortynnes 1:50. Urin brukes ufortynnet. Serumet eller urinen tilsettes til brønnene som inneholder hsp65 og tilstedeværelsen av antistoff som binder seg til hsp65 påvises ved å bruke radiomerket geite-antimus lg for muse-prøver, og geite-antihuman lg for humane prøver. Det gjenværende av assayet foretas som beskrevet i eksempel 3. Positive resultater er definert som cpm større enn 2 S.D. over gjennomsnittlig cpm erholdt ved å bruke kontrollserum fra friske mus, rotter eller mennesker.

Eksempel 5

hsp65- molekyler og anti- hsp65- antistoffer viser utvikling av IDDM før utbrudd av dette

NOD-mus

Fjorten NOD-hunnmus ble, idet man begynte på dag 21, tappet med jevnte mellomrom i ca. 200 dager og undersøkt for utviklingen av IDDM. Serumene ble undersøkt for hsp65, anti-hsp65, anti-insulin antistoff og anti-ideotypiske antistoff mot DM idiotyp.

hsp65 ble undersøkt ved å bruke assayet fra eksempel 3. Tilstedeværelse av anti-hsp65 antistoff ble undersøkt i henhold til fremgangsmåten fra eksempel 4. Anti-insulin antistoffer er ideotypiske antistoffer som gjenkjenner reseptoren som binder insulinseter, enkelte ganger betegnet DM-idiotypiske antistoffer. Anti-idiotypiske antistoffer er

antistoffer mot DM-idiotypiske antistoffer, enkelte ganger betegnet som anti-DM-idiotypiske antistoffer. I EP 334687 tilhørende samme søkere som foreliggende oppfinnelse, er det beskrevet at tilstedeværelsen av DM-idiotypiske anti-stoffer eller anti-DM-idiotypiske antistoffer i serum eller urin hos en pasient er en positiv indikasjon på IDDM under utvikling eller aktiv IDDM. Slike antistoffer er ikke til-stede i serum eller urin fra friske pasienter. Fremgangsmåtene brukt for å undersøke for tilstedeværelse av anti-insulin antistoff eller anti-idiotypisk antistoff er som angitt i nevnte EP 334687, hvorav det fullstendige innhold herved er innlemmet pr. referanse.

Ti av NOD-musene utviklet IDDM og 4 forble fri for IDDM.

Fig. 1 viser resultatene ved testing av serum fra en mus som ikke utviklet IDDM, og fig. 2 viser resultatene ved undersøkelse av serum fra en av musene som utviklet IDDM. Det kan observeres at sammenlignet med den IDDM-frie mus utviklet musen som fikk IDDM på dag 185 av sin levetid en markert øket konsentrasjon av hsp65, som startet ved dag 85. hsp65-konsentrasjonen minket etter at IDDM faktisk opptrådde. Anti-hsp65 antistoff opptrådde flere uker etter tilsynekomsten av hsp65. Anti-insulin og anti-idiotypisk (DM) antistoff opptrådde meget senere. Således begynte økningen av hsp65 og anti-hsp65 før klinisk IDDM og virket som tidlige tegn på den subkliniske sykdomsprosess.

Tabell 1 viser de kumulative data erholdt fra de fjorten individuelle mus.

Gjennomsnittlig tid for utbrudd av IDDM var 150,5 dager i musene som utviklet sykdommen. Den gjenomsnittlige hsp65 serumtest var positiv 72,5 dager før IDDM og den gjennom-snittlige anti-hsp65-test var positiv 44 dager før IDDM. De anti-insulin- og anti-idiotypiske antistoff-tester var positive kun 29 og 19 dager før IDDM i gjenomsnitt. Forsø-kene var ikke signifikant positive i mus som unngikk IDDM. Følgelig er hsp65 og anti-hsp65 relativt tidlige indika-torer på endelig utvikling av IDDM.

Urin ble undersøkt for tilstedeværelse av hsp65 i NOD-mus ved ca. 10 0 dagers alder. Tabell 2 viser at urinen fra musene var positiv i de mus som faktisk utviklet IDDM.

BB- rotter

Tabell 3 viser at BB-rotter som ikke utviklet IDDM ikke hadde hsp65 eller anti-hsp65 i serumet eller urinen. Rotter som faktisk utviklet IDDM (på dag 90-100) var positive når de ble undersøkt 10 til 20 dager før utbruddet av IDDM. Assayene ble utført som beskrevet i eksempel 3 og 4.

Humane IDDM- pasienter

Serum var tilgjengelig fra fem pasienter ved forskjellige tider før de utviklet IDDM. Serumene ble erholdt fra disse personer 1/2 - 2 år før utbruddet av IDDM, fordi de var førsteledds-slektninger av kjente IDDM-pasienter og ble antatt å ha en risiko for å utvikle IDDM selv.

I tillegg til disse personer ble serum og urin fra fire nylig diagnostiserte IDDM-pasienter studert for hsp65. Kontrollserum og -urin ble erholdt fra ti pasienter med aktiv multippel sklerose og 35 barn observert ved et syke-hus for et antall problemer som ikke var relatert til IDDM. Resultatene er vist i tabell 4. Assayene ble utført i samsvar med fremgangsmåtene fra eksempel 3 og 4.

Fra tabellen ovenfor kan det ses at fire av fem av pre-IDDM-pasientene og to av fire av IDDM-pasientene var positive i hHSP65 og anti-hHSP65-assayene. Ingen av kontrollene var positive. Således kan anti-hsp65 fremskaffet i kaniner mot hsp65 av MT påvise hsp65 i humant serum og urin i sammenheng med utviklimgen av IDDM. Videre kan hsp65 av MT påvise humant antistoff. Som beskrevet ovenfor, kan antistoff dannet mot hsp65 av human eller annen opprinnelse, også brukes i disse assays, såvel som hsp65 erholdt fra humane eller andre kilder. Dette er mulig på grunn av den høye grad av konservering av hsp opp gjennom den biologiske utvikling.

At alle pre-IDDM og nye IDDM-pasienter ikke var positive forklares av det faktum at konsentrasjonene av hHSP65 og anti-hHSP65 har en tendens til å minke ved eller omkring den faktiske tid for utbrudd av IDDM, som vist i fig. 2. Således kan de negative pasienter ha tapt sin positivitet når de ble undersøkt nær eller ved utbruddet av IDDM.

Fra det ovenstående er det tydelig at humane pasienter vil være positive for hHSP65 (eller et molekyl kryssreaktivt med dette) eller anti-hHSP65 noen tid før utbrudd av IDDM. Assays for hHDP65 eller anti-hHSP65 er derfor egnede ved undersøkelse av populasjoner for dem som kan være i ferd med å utvikle IDDM.

hHSP65 som opptrer i blodet eller urinen hos idivider som er i ferd med å utvikle IDDM, kan komme fra flere kilder. Kildene kan være hHSP65 uttrykt normalt av friske beta-celler og frigjort når beta-cellene undergår viral infek-sjon eller toksisk angrep som et forstadium til immunologisk øde-leggelse, eller det kan frigjøres fra beta-cellene ved belastningen ved immunologisk ødeleggelse. hHSP65 kan også uttrykkes av cellene i immunsystemet under sin forlen-gede aktivitet mot beta-cellene. Selv om kildene for hHSP65 i systemet på det nåveærende tidspunkt ikke er nøyaktig

kjent, er det blitt bestemt at når hHSP65 frigjøres, stimu-leres individet til å danne antistoff mot hHSP65-molekylet.

Antistoff mot et udefinert molekyl på 60.000 i molekylvekt er blitt beskrevet hos enkelte nydiagnostiserte IDDM-pasienter av Bækkeskov et al. i Nature, 298: 167-168, 1982. Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt 64 KD antigenet er et hsp. Dessuten er 64 KD antigenet ikke kjent for å opptre i blod eller urin før utbruddet av IDDM. I motsetning til dette udefinerte 64KD beta-celleantigen er hsp65 et definert protein, hvis aminosyresekvens er kjent (Thole et al, Infec- tion and Immunity, 55:1466-1475, 1987). På lignende måte er aminosyresekvensen av hHSP65 vist og angitt i fig. 3 .

Eksempel 6

Studium av hannmus av stamme C57BL/ Ksi

C57BL/Ksj-mus utvikler IDDM ca. 2 uker etter å ha fått 5 påhverandre følgende daglige inokulasjoner av beta-celle-toksinet streptozotocin med doser på 4 0 mg/kg pr. dag.

I eksperimentene beskrevet heri ble grupper på 10 C57BL/ Ksj-hannmus, 3 måneder gamle, underkastet eller ikke underkastet lavdose streptozotocin-injeksjoner (40 mg/kg daglig x 5) for å indusere IDDM som opptrer ved dag 14) og ble undersøkt for utvikling av IDDM, som målt ved blodglukose høyere enn 25 0 mg%, og for tilsynekomsten av hsp65 og anti-hsp65 antistoff i blodet. Som vist i tabell 5 opptrådde hsp65 ved dag 10 (før klinisk manifestasjon av IDDM), fulgt av anti-hsp65.

Eksempel 7

Multiple murine molekyler er kryssreaktive med hsp65 av mycobacterier

For å identifisere pattedyrmolekylene gjenkjent av antistoffene til mycobakteriell hsp65, ble kanin-anti-hsp65 anti- serumet beskrevet ovenfor undersøkt, samt et monoklonalt antistoff betegnet som TB78. Dette antistoff ble utviklet og fremskaffet av dr. J. Ivanyi fra the MRC Tuberculosis Unit, Hammersmith Hospital, London. Dette antistoff er spesifikt for hsp65-molekylet fra M. tuberculosis. Tre typer av preparater ble undersøkt for sin binding av disse anti-stoffer: Klonet hsp65 av M. tuberculosis, serum fra NOD-mus som utviklet IDDM og friske kontroller, og lysater av rotte-fibroblaster behandlet med varmesjokk og kontroll fibroblastlysater.

hsp65 ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1. Embryoniske rotte-fibroblaster ble dyrket ved å bruke standard frem-

gangsmåter. For å indusere varmesjokkproteiner ble kulturer av fibroblaster inkubert ved 42,5°C i 2 timer, og deretter i 1/2 time ved 37°C. De varmesjokk-behandlede fibroblaster og kontrollfibroblastene ble dyrket ved 37°C og ca. 5 x IO<6 >celler hver ble så lysert ved å bruke en lysis-buffer be-stående av 0,1% SDS og 1% Triton sammen med proteaseinhibi-torer. Proteasekonsentrasjonen ble justert til 2 mg/ml ved Bradfordbestemmelse. Materialet ble satt i 10% polyakryl-amidgel, 100 ixg pr. brønn, for standard elektroforese under reduserende betingelser (2% 2-merkaptoetanol). Museserum fra friske kontrollmus og fra NOD-mus som utviklet IDDM ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 mg/ml. Hvert av disse serumpreparater ble separert ved polyakrylamidgel-elektroforese som ovenfor. De adskilte proteiner ble så overført over natten til nitrocellulosepapir ved standard fremgangsmåter. Papirene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med 1% hemoglobin (for blokkering) og så enten med normalt kaninserum eller med anti-hsp65 ved en fortynning på 1:100 eller med TB78 eller et kontroll-monoklonalt antistoff med fortynninger på 1:100 i 2 timer ved romtemperatur. Binding av antistoffene til ethvert av de adskilte bånd ble påvist ved inkubering med <125>I-radiomerket geite-antikanin lg eller geite-antimus lg, vasket og fremkalt ved autoradiografi. Molekylvektstandarder var innbefattet.

Det ble funnet at flere bånd ble oppvist av anti-hsp65-antitoffene. Mycobakteriell hsp65 ble påvist med både kanin-antiserumet og det monoklonale TB68. Antistoffene gjenkjente også et 65 KD-bånd i de murine fibroblaster som ble uttrykt på en forsterket måte etter varmesjokk. I de varmede fibroblastlysater var det også positive bånd ved 3 0 KD og 4 7 KD. Et ytterligere bånd ved ca. 25 KD ble bestemt i serumet fra NOD-musene som utviklet IDDM. Følgelig er pattedyrmolekyler på 65 KD, 47 KD, 30KD og 25 KD kryssreaktive med mycobakteriell hsp65.

Eksempel 8

Hsp65 uttrykkes i øyene i pankreas

Fordi utviklingen av IDDM følges av øket ekspresjon av hsp65 i blod og urin, ble det antatt at beta-cellene i øyene kunne være kilden for hsp65. For å undersøke denne teori ble kanin-anti-hsp65 testet for å se om det ville binde til øyceller.

En standard fremgangsmåte ble brukt for å fremstille frosne deler av rottepankreas, 6-8 ^m tykke. Delene ble overlagt med normalt kaninserum eller anti-hsp65-antiserum (absor-bert med leverpulver for å fjerne ikke-spesifikke antistoffer) fortynnet 1:50 og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, vasket grundig med PBS, og deretter inkubert i 5 minutter med 5% normalt geiteserum før inkubering med fluoresinmerket geite-antikanin lg i 30 min. ved romtemperatur, vasket med PBS og undersøkt under bruk av et fluo-rescens-mikroskop. Øyene ble lysende farget av anti-hsp65-antiserumet, men ikke av kontroll-kaninserumet. Følgelig uttrykker øyene hsp65.

Eksempel 9

Immunisering mot hsp induserer IDDM

Siden det ble funnet at øyceller uttrykker hsp65, ble det postulert at en anti-hsp-immunrespons ville skade beta-celler og derved indusere IDDM. C57BL/Ksj-hannmus, 8 uker gamle, eller NOD-hunnmus, 4 1/2 uker gamle, ble immunisert ved intraperitoneal injeksjon med 50/xg av hsp65 og under-søkt for hvorvidt de kunne utvikle IDDM som funnet ved blodglukose større enn 250 mg%. Ved 4 1/2 ukers alder var NOD-musene minst 3 måneder før spontan IDDM. C57BL/KSj-musene utvikler ikke spontan IDDM. Hsp65 ble tilført, emulgert i olje eller i PBS. Bovin serum albumin (BSA), emulgert i olje, ble brukt som kontroll. Resultatene er vist i tabell 6. Det ble funnet at hsp65 i olje, men ikke i PBS, induserte IDDM. Følgelig kan en immunrespons mot hsp65 fremskaffe IDDM, sannsynligvis fordi beta-cellene uttrykker et antigen som er kryssreaktivt med hsp65.

I et videre eksperiment ble stammer av normale mus som ikke utvikler IDDM spontant, som NOD-mus gjør, eller også etter lavdose streptozotocin, som C57BL/Ksj-mus gjør, inokulert intraperitonealt med 50 /zg av antigen, enten hsp65 eller bovin serum antigen (BSA), emulgert i ufullstendig Freunds adjuvant (olje). Musene ble tappet om morgenen 14 dager senere og blodglukose ble målt. IDDM ble diagnostisert ved en konsentrasjon av blodglukose større enn 200 mg%. Resultatene er vist i tabell 7. Det kan ses at immunisering med hspl65 kan indusere IDDM, selv i enkelte tilsynelatende normale stammer av mus, spesielt når det tilføres en passende dose. Dette støtter den konklusjon at hsp65 eller molekyler immunologisk kryssreaktive med hsp65 er mål-antigener i IDDM.

Eksempel 10

Hsp kan indusere resistens til induksjon av IDDM

Det er veletablert at antigen tilført uten et effektivt hjelpestoff eller med et tolerogent bæremiddel kan indusere immunologisk reaksjonsudyktighet, dvs. spesifikk toleranse overfor antigenet. Derfor ble mus som var blitt injisert med hsp65 i PBS undersøkt for å bestemme hvorvidt disse mus hadde fått motstandsdyktighet mot IDDM indusert av hsp65 i olje. Én måned etter å ha fått hsp65 i PBS, ble C57BL/Ksj-mus utsatt for hsp65 i olje, og ingen av disse mus utviklet IDDM som målt ved blodglukose større enn 250 mg% tre uker senere. I motsetning til dette utviklet 8 av 10 kontrollmus som ikke hadde fått hsp65 i PBS, IDDM etter å ha fått hsp65 i olje.

I et annet forsøk ble hsp65 gitt intraperitonealt til 3 0 dager gamle NOD-hunnmus i PBS, 15 dager før tilføring av 50 itg hsp65 i olje for å indusere IDDM. Tilstedeværelsen av IDDM ble målt ved blodglukosekonsentrasjoner større en 200 mg% 35 dager etter tilførsel. Tilstedeværelse av IDDM ble igjen målt når musene var 5 måneder gamle. Ved denne alder er det kjent at 5 0% av alle ubehandlede NOD-hunnmus har påviselig IDDM. Resultatene er vist i tabell 8.

Det kan således observeres at hsp65 kan brukes for å indusere toleranse mot en diabetogen immunprosess. Denne toleranse er ikke bare effektiv med hensyn til et immunogent angrep av hsp65, men den forblir effektiv som behandling mot den naturlige utvikling av spontan IDDM i NOD-mus.

Eksempel 11

Behandling av IDDM under utvikling ved å bruke hHSP65

Som vist i eksempel 10, kan hsp65 brukes for å indusere motstandsdyktighet mot den autoimmune prosess av IDDM. Dette synes å være forårsaket av en mekanisme av immunologisk toleranse mot hHSP65 av beta-cellene via eksponering til eksogen hsp65. Således kan hsp65 være nyttig ved behandling av IDDM før sykdommen blir klinisk synlig, og den autoimmune prosess kan stanses før signifikant permanent skade er skjedd. Resultatene av eksperimentet oppsummert i tabell 8, som viser at den naturlige utvikling av spontan IDDM i NOD-mus kan stanses, er et signifikant bevis på at hsp65, og spesielt hHSP65, kan brukes terapeutisk. Den autoimmune prosess begynner meget tidlig i NOD-mus. Ved 1 måneds alder kan insulitis allerede påvises. IDDM blir klinisk synlig ved 5 måneder i 50% av hunnmusene av denne stamme..Tilførsel av hsp65 i 3 0 dager gamle mus stopper denne naturlige utvikling. Dette fastslår at behandling kan være effektiv, selv etter at autoimmunitet mot øyene allerede har begynt.

Eksempel 12

T- cellerespons mot hHSP65 er assosiert med diabetes under utvikling

Det humane hsp65-gen vist i fig. 3 ble klonet for ekspresjon på vanlig måte og i hovedsak ren rekombinant human hsp65 ble erholdt fra dette.

Foreliggende forsøk etablerer at mus som spontant ødelegger sine beta-celler, har T-celleaktivitet mot rekombinant human hsp65. Miltcellesuspensjoner erholdt fra grupper på 5-7 NOD/Lt-hunnmus av forkjellig alder, ble undersøkt for T-celleproliferasjon, i hovedsak som beskrevet for T-celle-responser mot thyroglobulin (Maron, R. et al, J. Immunol., 131, 2316-2322 (1983)). Kort fortalt ble cellene inkubert ved 1 x IO<6> celler per ml i triplikat i 72 timer i 0,2 ml dyrkningsmedium i mikrotiterbrønner ved tilsteeværelse eller fravær av de følgende antigener ved 5 ztg/ml: human hsp65, MT hsp65, eller MT hsp70. Proliferasjon ble målt ved inkorporeringen av [<3>H] thymidin i DNA under de siste 12 timer av inkuberingen. Resultatene er vist som A cpm: gjennomsnittlig cpm av brønnene inneholdende testantigen minus gjennomsnittlig cpm av kontroilbrønnene dyrket uten tilsatt antigen ± standardavvik (SE). Kontroll-cpm'ene varierte fra 9.000 til 10.500. Utbruddet av IDDM i ca. 50% av musene var mellom 4 og 5 måneders alder, som angitt ved "IDDM" i fig. 4.

Resultatene av dette eksperiment som viser graden av spontan reaktivitet av NOD-Lt T-celler som en funksjon av alder til de forskjellige antigener, er nedtegnet i fig. 4. Ved 1 måneds alder, når NOD/Lt-mus har lite eller ingen insulitis, var det ingen påviselig T-cellereaktivitet mot noen av antigenene. Imidlertid, ved 2 og 3 måneders alder, sammen med økende insulitis, var det sterk og økende reaktivitet mot human hsp65, med relativt lavere reaktivitet mot MT hsp65 og ingen reaktivitet mot MT hsp70. Reaktivitet mot human hsp65 og MT hsp65 minket ved utbruddet av IDDM ved 4,5 måneder og minket ytterligere ved 6 måneder etter klinisk tilsynekomst av IDDM. Således synes T-cellerespon-sen mot human hsp65 å være assosiert med økningen i betacelle-skade som forekommer før utstrakt IDDM. Fallet i T-cellereaktivi-tet ved utbruddet av IDDM kan forklares med minket immunstimulering, ettersom beta-cellene og deres antigener er tapt.

Eksempel 13

T- celler som reagerer på human hsp65 forårsaker diabetes Suspensjoner av miltceller ble erholdt fra grupper på fem 3,5 måneder gamle hunnmus av stammene NOD/Lt, C57BL/6 eller C57BL/KS. En gruppe av NOD/Lt-mus (gruppe 2) hadde blitt gjort reaktive 9 dager tidligere ved intraperitoneal immu-ni-sering med 50 itg/ml av MT hsp65 i olje. Noen av miltcellene (gruppe 4, 6 og 8) ble aktiverte ved inkubering i 4 8 timer med 1,25 tig/ml Con A. Post-Con A-cellene ble så overført til vekstmedium som manglet Con A i ytterligere 5 dager med dyrkning. Miltcellene ble undersøkt for sin proliferative respons mot rekombinant human hsp65, rekombinant MT hsp65 eller mot kontroll E. coli antigen en uke etter aktivering, som beskrevet i eksempel 12. Kontroll E. coli ble transfektert med pEX2-plasmidet, som ikke inneholdt hsp65-genene. Antigenene ble brukt ved en konsentrasjon på 5 iig. Prolife-rative responser foretatt i triplikat er vist som stimuleringsindeksen (SI): Forhold mellom cpm av <3>H-thymidin inkorporert i miltcellene inkubert med testantigen og cpm av <3>H-thymidin inkorporert i kontrollkulturene uten tilsatt antigen. cpm av kontrollkulturenee var 5.000-7.000 og standardavvikene fra gjennomsnittlig cpm var alltid mindre enn 10% av gjennomsnittet. Cellenes evne til å danne diabetes ble undersøkt ved å aktivere enkelte av dem ved dyrkning med Con A i 48 timer. Grupper av prediabetiske, 1 måned gamle mottagende hunnmus ble inokulert intraperitonealt med 25 x IO<6> naive miltceller eller med Con A-aktiverte miltceller fra MT hsp65-aktiverte eller naive mus. De mottagende mus ble undersøkt for utvikling av akutt diabetes 21 dager senere, funnet ved hyperglycemi (blodglukose > 200 mg/dl) og histologisk funn av insulitis. Blodglukose ble målt ved å fjerne blod fra halevenen av enkelte mus ca. klokken 9 om morgenen, og konsentrasjonen av glukose ble målt ved å bruke et Diascan glukosemeter og forsøksstrimler (Boehringerwerke, Tyskland). Insulitis ble bestemt ved histologisk undersøkelse (hematoksylineosin og lys grønn farging foretatt ved the Histology Laboratory of The Weiz- mann Institute). Gradering av insulitis ble foretatt av en person som ikke var klar over forsøksplatenes identitet.

Resultatene er angitt i tabell 9. Forskjellene mellom responsene av NOD/Lt-miltcellene mot human hsp65 og MT hsp65 (gruppene 1-4) var tydelig større (P<0,01) enn reak-sjonen til NOD/LT-miltcellene mot E. coli kontrollantigen eller reaksjonene fra de andre musestammer (gruppene 5-7) mot hsp65-antigenene ved å bruke Student's T-test; ND, ikke bestemt. Resultatene angitt i Tabell 9 viser at T celle-responsene fra 3,5 måneders gamle NOD/Lt mus mot human hsp65 kunne forsterkes ved å immunisere musene til MT hsp65 (gruppe 2) eller ved å aktivere T celle-populasjonen med T celle-mitogenet concanavalin A (Con A; gruppe 4). Con A har blitt vist å preferensielt stimulere in vitro, aktiverte autoimmune T celler som foreligger i dyr in vivo. Således viser NOD/Lt T celler aktivert ved immunisering til MT hsp65 in vivo eller aktivert ved Con A in vitro en iboende respons til human hsp65.

Human hsp65 er ikke i seg selv et mitogen idet voksne mus fra stammer som ikke spontant utvikler IDDM, såsom C57BL/6 (gruppe 5 og 6) eller C57BL/KS (gruppe 7 og 8) , ikke viser T celle-reaktivitet etter Con A stimulering.

Endelig viser tabell 9 at aktivering av anti-human hsp65 T celle-populasjonen in vitro med Con A gjorde T cellene i stand til å overføre akutt diabetes til 1 måned gamle prediabetiske NOD/Lt mus (gruppe 2 og 4).

Assosiasjonen mellom T celle-reaksjonsevne til human hsp65 og diabetes er bekreftet i tabell 10. I eksperimentet som dannet data for tabell 10, ble T-celle-linjer erholdt ved gjentatt å stimulere miltcellene med MT hsp65 (5 /xg/ml) som beskrevet i Maron ( supra). Kloner ble isolert ved begren-sende fortynning av linjecellene. T celle-klonene ble undersøkt for sin mulighet til å overføre akutt diabetes i hovedsak som beskrevet med hensyn til tabell 9, bortsett fra at 5 X IO<6> Con A aktiverte celler ble overført intraperitonealt. De proliferative responser av klonene til antigenene ble målt som SI som beskrevet for tabell 9. Cpm av kontrollkulturene var 4500 til 6500 cpm og standardavvikene fra gjennomsnittlig cpm var alltid mindre enn 10%. Klonene ble funnet å reagere kraftigere mot human hsp65 enn mot MT hsp65 eller mot E. coli kontroll-antigen. I tillegg var klonene 27, C7og C9, som reagerte kraftig mot human hsp65, diabetogene, mens klon 21 som reagerte relativt svakt mot human hsap65 var ikke i stand til å overføre diabetes. Ettersom klonete T celler uttrykker antigenresep-torer av kun én spesifisitet, kan det konkluderes at akutt diabetes kan overføres til prediabetiske NOD/Lt mus med T celler som gjenkjenner en epitop på human hsp65, en epitop som er kryssreaktivt til en viss grad med en epitop på MT hsp65.

Eksempel 14:

Virulente T celler vaksinerer mot Spontan IDDM

Grupper på 5-7 prediabetiske, to måneders gamle hunner NOD/Lt mus ble enten gjort reaktive eller ikke ved intra-peretonial immunisering med 50 /xg av antigen i olje. Miltceller fra musene ble eller ble ikke aktivert ved inkubering med antigener (5 /xg/ml) eller Con A (1,25 fig/ ml) som beskrevet med hensyn til tabell 9 i eksempel 13. Cellene ble så overført (25X10<6>) intraperetonealt til grupper av 1 måneders gamle prediabetiske mus. Musene ble undersøkt

for akutt diabetes (hyperglycemi; blodglukose > 200 mg/dl)

3 uker senere på samme måte som beskrevet i eksempel 13. Spontan IDDM ble undersøkt ved 8 måneders alder ved hyperg-lycemia og insulitis. Resultatene av dette eksperiment er vist i tabell 11. Forskjellene fra kontrollgruppen (gruppe 1) var signifikante <*>p<0,01 som angitt. Tallene representerer de kumulative resultater fra 2-4 eksperimenter.

Som ventet var de ubehandlede kontrollmus (gruppe 1) ikke hyperglycemiske ved 7 ukers alder og spontan IDDM ble observert i 81% ved 8 måneders alder. I motsetning til dette ble akutt diabetes (blodglukose.over 200 mg/dl) over-ført ved å bruke miltceller av prediabetiske mus, forutsatt at miltcellene hadde blitt aktivert in vitro med MT hsp65 (gruppe 2) eller med Con A (gruppe 3).

Miltceller erholdt fra mus som hadde blitt gjort reaktive in vivo med MT hsp65, BSA eller MT hsp70 ble tilført etter aktivering med det respektive antigen in vitro. Akutt diabetes ble indusert med anti-MT hsp65 cellene (gruppe 6), men ikke med anti-BSA eller anti MT hsp70 cellene (gruppe 4 og 5) . I motsetning til de Con-A og MT hsp65-aktiverte celler som reagerer sterkt mot human hsp65 (tabell 8 og 9) , påviste proliferative assays av de BSA-eller de MT hsp70-reaktive celler ingen raktivitet mot MT hsp65 eller mot hsp65 (ikke vist). Således var overføringen av akutt diabetes spesifikk for cellepopulasjoner inneholdende T cellene som var responsive mot human hsp65.

Tabell 11 viser også at et tilfelle av akutt diabetes ble fulgt av en signifikant nedgang i tilfelle av spontan IDDM som utvikler seg ved 8 måneder. Inokulering av mus med anti-BSA eller anti-MT hsp70 miltceller, induserte hverken akutt diabetes eller forhindret spontant IDDM (gruppe 4 og 5) .

Egenskapen til akutt adoptivt overført diabetes å slutte spontan IDDM ble også observert i eksperimenter foretatt med anti-hsp65 T celle-klonene beskrevet ovenfor (tabell 9). 31 mus ble injisert med virulente kloner 27, C7 eller C9 og alle ble akutt diabetiske innen 1-2 uker. De kom seg alle spontant fra hyperglycemi innen 2 uker og kun 2 av de 31 utviklet spontan IDDM ved 8 måneders alder. I motsetning til dette utviklet 13 mus injisert med avirulent klon 21 ikke akutt diabetes og 6 av disse mus ble spontant diabe-

tiske ved 6 måneders alder (P<0,01).

Således er diabetes dannet ved adoptiv overføring av anti-humane hsp65 T celler transient. Imidlertid, ikke bare kom musene seg fra akutt diabetes, men de utviklet motstandsdyktighet mot utvikling av sen spontan IDDM. Således, i stedet for å akselerere utviklingen eller forsterke alvor-ligheten av naturlig IDDM, førte eksponering av prediabetiske mus til virulente T celler faktisk til erhvervelse av motstandsdyktighet mot den diabetiske prosess.

EKSEMPEL 15: Attenuerte T celler vaksinerer mot autoimmunitet mot Hsp65 og stanser IDDM

T-celle-vaksiner ble konstruert fra miltceller av 3 måneders gamle prediabetiske NOD/Lt mus ved å aktivere cellene ved inkubering med Con A eller MT hsp65 som beskrevet med hensyn til tabell 8 i eksempel 13, og derpå nedsetting av de aktiverte celler med gammastråling (1500R) eller med glutaraldehyd (0,3%, 15 minutter) som beskrevet i Lider et al, Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., 84,4577 (1987). Grupper på 15 eller 25 fire-ukers gamle prediabetiske NOD/Lt hunnmus ble så holdt uvaksinert eller ble vaksinert ved intraperitoneal inokulering med 10<7> behandlete miltceller. Ved 6 månederes alder ble 5 mus fra hver gruppe studert for den proliferative respons av deres T miltceller mot human hsp65 vist som stimuleringsindeksen (SI). Kontroll cpm uten tilsatt antigen var 2465+235 og 2246+185 for henholdsvis uvak-sinerte og vaksinerte mus. De gjenværende mus ble tappet for bestemmelse av antistoff mot human hsp65 i et standard fastfase radioimmunoassay (Schechter et al, J. Biol. Chem., 259, 6411-6419, (1984). For å påvise serum antistoff ble mikrotiterplatene belagt ved inkubering (50 /xg/ml) med hsp65 (for anti-hsps65), insulin (for anti-insulin) eller marsvin anti-insulin positive for DM ideotypen (for anti-ideotypiske antistoff). Tilstedeværelsen av disse antistoff mot disse antigener ble påvist ved å inkubere de belagte brønner med test-musesera (fortynnet 1:50) og ved å frem-kalle testen med 125I-merket geite anti-mus lg (Amersham, U.K.; IO<5> cpm per brønn). For å påvise hsp65 antigen (eller et antigen kryss-reaktivt med dette) ble brønnene inkubert med 1,5 /xl av testserum fortynnet 1:5, og derpå dekket med kanin anti-hsp65 lg (fortynnet 1:100). Binding ble målt ved å bruke <125>I-merket geite anti-kanin lg (Amersham) . Den relative titer viser cpm av bindingen til human hsp65 av serum fortynnet 1:100. Gjennomsnittlig cpm av serum anti-human hsp65 antistoff erholdt fra ikke-diabetiske 1 måneder gamle NOD/Lt mus, var 1450±194 cpm. Sera fra musene ble undersøkt for tilstedeværelse av hsp65 eller kryssreaktivt antigen ved å bruke et fastfase radioimmunoassay som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i tabell 12. De vaksinerte mus var signifikant forskjellige fra de ikke-vaksinerte kontroilmus med <*>p<0,01. Resultatene vist i tabell 12 viser at ellers virulente Con A- eller MT-hsp65 aktiverte T-celler kan nedsettes ved behandling med gammastråling (1500R) eller med glutaraldehyd (0,3%) og brukes for å vaksinere mot spontan IDDM. Likt det som har blitt vist i andre eksperimentelle sykdommer var bestrålte eller glutaraldehydbehandlete autoimmune T celler ikke virulente og dannet ikke akutt diabetes (data ikke vist). Forhindring av IDDM var assosiert med en markert reduksjon av den spontane T celle- og antistoff-reaktivitet av de vaksinerte .mus mot human hsp65.

Som beskrevet i de tidligere eksempler, er skade på øyene i NOD/Lt mus markert ved tilsynekomsten i serum av et protein, gjenkjent av anti-hsp65 antistoff. Idet dette serum antigen muligens stammer fra skadede betaceller var det av interesse å finne hvorvidt T celle-vaksinering hadde noen effekt på mengden av dette. Det kan observeres (tabell 12) at tilførsel av en T celle-vaksine reduserte markert mengden av hsp65 eller kryssreaktivt antigen som opptrer i serum ved 6 måneders alder. Denne minkning var assosiert med mangel på påviselig insulitis ved histologisk undersø-kelse (ikke vist).

Således kunne virulente anti-human hsp65 T-celler, aktivert med MT hsp65 eller Con A, bli undertrykket og brukt for å vaksinere NOD/Lt mus mot utviklingen av spontan IDDM. Den vaksinerte tilstand ble markert med en minkning i de immu-nologiske tegn på IDDM-prosessen: anti-human hsp65 T celler og antistoff. På samme tid var det en minkning i mengden av hsp65 eller serum antigen kryssreaktivt med hsp65 som kan forklares ved stansingen av insulitis.

EKSEMPEL 16: T-celle-vaksinering danner motstandsdyktighet

mot akutt indusert diabetes

I eksempel 9 er det vist at akutt diabetes, markert ved insulitis og hyperglycemi, kunne induseres i prediabetiske

NOD/Lt mus ved å immunisere dem med MT hsp65 i olje. Det ble også funnet at denne form for akutt diabetes var transient og førte faktisk til motstandsdyktighet mot sen spontan IDDM. Dette eksperiment undersøker effektene av immunisering mot human hsp65 og innvirkningen av T celle-vaksinering på akutt indusert diabetes.

Grupper på 4 uker gamle NOD/Lt hunnmus ble eller ble ikke vaksinert med 107 Con A aktiverte glutaraldehydbehandlete miltceller som beskrevet med hensyn til tabell 12 i eksempel 15. To uker senere ble musene tilført MT hsp65 eller human hsp65 (50 iig i olje) for å indusere akutt diabetes. Musene ble så undersøkt for utviklingen av spontan IDDM ved 8 måneders alder, ved å måle hyperglycemi og insulitis som beskrevet i eksempel 13. Resultatene er vist i tabell 13. Signifikante forskjeller <*>p<0,01.

Det kan observeres at de ikke-vaksinerte mus reagerte på human hsp65 eller på MT hsp65 og utviklet akutt transient diabetes. Dette ble fulgt av motstandsdyktighet mot spontan IDDM. De T-celle-behandlete mus var i motsetning til dette motstandsdyktige mot antigen-indusert akutt diabetes. De var også beskyttet mot spontan IDDM. Således danner T-celle-vaksinering effektivt motstandsdyktighet både mot akutt diabetes, indusert ved kunstig immunisering, og mot sen spontan IDDM.

EKSEMPEL 17: Peptidsyntese

Det ble antatt at nøkkelepitopen på det humane hsp65-molekyl var en aminosyresekvens som viser delvis, men ikke perfekt, homologi med MT hsp65-sekvensen. Idet det sist-nevnte virker mindre godt, er sekvensen av den tilsvarende epitop antatt å være noe forskjellig.

En serie av peptider som starter ved karboksylterminalen av den humane hsp65-sekvens, ble syntetisert ved å velge sek-vensene som viste små forskjeller mellom de myco-bakteri-elle og humane sekvenser. Ett slikt peptid har aminosyre-sekvens 437-460 av det humane hsp65 -molekyl vist i figur 3, det vil si: H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-OH. Dette peptid har blitt betegnet p277.

Kontroll peptid p278 overlapper karboksylenden av p277 med 3 aminosyrer, og har den følgende sekvens: H-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile-OH. Dette tilsvarer amonisyresekvensen 458-474 fra figur 3.

EKSEMPEL 18: Immunrespons mot p277 ved diagnose av

utviklende IDDM

Suspensjoner av miltceller fra prediabetiske 3 måneders gamle NOD/Lt hunnmus ble undersøkt for sine proliferative

responser mot p277 på den måte som er beskrevet i eksempel 12, og resultatene er vist i figur 5. Selvom disse mus ikke vil utvikle hard IDDM i ytterliger 1-3 måneder, viser deres milt-T celler en sterk respons mot p277, men ikke mot p278. Den optimale konsentrasjon av peptid i dette og andre in

vitro eksperimenter er 5 fig/ val.

EKSEMPEL 19: Patogene T celle- kloner reagerer mot p277 og

mot hsp65- varianter

Figur 6 viser at C7 og C9 T celle-klonene, som er i stand til å overførte akutt diabetes til unge prediabetiske NOD/Lt mus (se tabell 10 ovenfor), reagerer mot p277. Klonene blir funnet å reagere mot p277 såvel som mot det hele mycobakterielle hsp65, men ikke mot et kontrollprepa-rat av plasmidet som ikke inneholder hsp65-genet. Således kan det konkluderes at p277-peptidet inneholder en patogen epitop, fordi patogene T celler gjenkjenner det.

P277-epitopen er også tilstede i det mycobakterielle hsp65-molekyl, fordi C7 og C9 også reagerer på dette molekyl. Således er den mycobakterielle hsp65-sekvens, som er homo-log med p277, immunologisk funksjonell. Den mycobakterielle sekvens følger med substitusjonen fra den p277 humane sekvens understreket: H-Val- Ala-Gly-Gly-Gly-Val- Thr-Leu-Leu-Gln- Ala- Ala-Pro- Thr-Leu-Asp- Glu-Leu- Lys -- - Leu- Glu- Glv-Asp-OH. Det kan observeres at 13 av de 24 aminosyrer er substituert. Følgelig kan det konkluderes at de immuno-logiske egenskaper av p277-peptidet kan tolerere ca. 60% endringer i sekvensen. Selv om den minimale epitop skulle være 10 aminosyrer istedet for 24, er det ingen 10 aminosyresekvens av p277 som ikke er forskjellig med minst 4 til 6 aminosyrer fra den mycobakterielle sekvens.

EKSEMPEL 20: Peptid p277 kan bli brukt som behandling

mot diabetes

Det ble vist i eksempel 10 at hele hsp65-molekylet i ikke-immunogenisk form, kan indusere motstandsdyktighet i NOD/Lt mus mot akutt diabets, indusert ved immunisering til immunogent hsp65 i hjelpestoff. Figur 7 viser at p277, men ikke p278, også kan bli brukt for å erholde motstandsdyktighet mot indusert diabetes. Grupper på 7 fem ukers gamle prediabetiske NOD/Lt hunnmus ble behandlet med 50 /xg av p277 eller p278 i ufullstendig Freunds hjelpestoff. To uker senere ble musene immunisert med 50 /xg med immunogent hsp65 i ufullstendig Freunds hjelpestoff for å indusere akutt diabetes. Tre uker senere ble blodglukosen målt. Det kan observeres at ingen av musene behandlet med p277 ble hyperglycemiske (blodglukose på 200 mg/dl eller mer). I motsetning til dette, ble 5 av de 7 mus behandlet med peptid p278, diabetiske.

Behandlingen med p277 forhindret også utviklingen av spontan diabetes i alle 7 av disse mus, mens 8% av kontroll-musene som hadde blitt behandlet med et antall antigener, såsom bovin serum albumin eller hsp70, fortsatte å utvikle diabetes ved 7 måneders alder. Således førte behandling med p277 til motstandsdyktighet mot både indusert og spontan diabetes. Således kan et spesifikt peptid danne den tera-peutiske effekt observert med hele hsp65-molekylet tilført i ikke-immunogen form.

Selv om de ovenfor angitte data med p277 angår diabetes i NOD-mus, er det innlysende at peptidet, lik hele hsp65 molekylet eller ethvert annet molekyl som er immunogenisk kryssreaktivt med dette, kan bli brukt til diagnostisering eller behandling i mennesker. Dette er fordi diabets i NOD mus er kjent som en sikker modell for human IDDM. Imidlertid har det blitt angitt av Todd et al., Nature, 329:599,

(1987) at NOD-mus har et hovedhistokompatibilitets-kompleks (MHC) klasse II molekyl (IA) likt det av det humane DQS assosiert med human IDDM. Det kan derfor ventes at humane og NOD diabetogene T-celler begge bør gjenkjenne den samme peptidsekvens oppvist av MHC klasse II molekylet som man-gler asparaginsyre ved posisjon 57 av DQfi-kjeden. Dersom mennesker og NOD mus som utvikler diabetes ser et lignende peptid antigen, såsom p277, kan et slikt peptid bli brukt i mennesker såvel som i NOD- mus for diagnostisering og be-

handling av IDDM.

Det spesielle protein dannet av det humane legemet under utvikling av IDDM, som virker som en diagnostisk markør i henhold til foreliggende oppfinnelse for fremtidig utbrudd av IDDM, er det humane varmesjokkprotein som har en stør-relse på ca. 65 KD (eller et antigen kryssreaktivt med dette) . Nukleotidet og den avledete aminosyre-sekvens av det 65 KD humane varmesjokkprotein er angitt i figur 3. Dette protein vil nedenfor bli referert til som hHSP65. Andre proteiner kan også bli dannet in vivo som kryssreagerer med de samme antistoffer som binder 65 KD-proteinet. For eksempel ble 47 KD, 3 0 KD og 25 KD-molekylene i mus og rotter funnet også å kryssreagere med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for hsp65 molekylet fra M. tubercolosis. Et 47 KD- molekyl har også blitt oppdaget i rottefi-broplaster som er kryssreaktivt med et slikt antistoff. I betraktning av preserveringen over artsgrensene av varmesjokkproteiner, er det fullstendig ventet at disse også vil være tilstede i mennesker. Videre kan proteiner frigjort i blod og urin under utvikling av IDDM være et molekyl som er forskjellig fra hHSP65, men som er kryssreaktivt med dette. Dette kan være et overflateprotein funnet på betaceller eller også et fragment av et protein som har et epitop som er tilstede på hHSP65.

Følgelig er molekylet som virker som den diagnostiske

markør for tilstedeværelsen eller utviklingen av IDDM, hvis tilstedeværelse i blod eller urin blir påvist i samsvar med foreliggende oppfinnelse, ett som immunologisk reagerer med polyklonale antistoffer utviklet hHSP65 og fortrinnsvis med monoklonale eller polyklonale antistoff fremskaffet mot

p277-sekvensen av hHSP65. For formålet ved foreliggende beskrivelse og krav er uttrykket "hHSP65" tenkt å omfatte ikke bare det 65 KD humane varmesjokkprotein, men også et hvert annet relatert molekyl funnet i humant serum, som kryssreagerer med polyklonale antistoffer fremskaffet mot

et 65 KD varmesjokkprotein av en hver type. Denne defini-sjon er spesielt tenkt å innbefatte, selvom den ikke er begrenset til, 65KD, 30 KD, 25 KD og 47 KD proteinene som allerede har blitt oppdaget og er beskrevet heri.

På grunn av de strukturelle likheter av varmesjokkproteiner i naturen, kan tilstedeværelsen av den diagnostiske markør beskrevet heri bli påvist ved polyklonale eller monoklonale antistoff, spesielt fremskaffet mot varmesjokkproteinet i enhver organisme. For eksempel kan varmesjokkproteinet fra M. tubercolosis lett dannes i stor mengde ved genetiske manipuleringsteknikker. Dette protein kan bli brukt for å fremskaffe antistoff i kaniner eller mus. De polyklonale kanin anti MT-hsp65-antistoff kan bli brukt for å påvise tilstedeværelsen av hHSP65. På lignende måte kan monoklonale antistoff, erholdt fra milten hos mus immunisert mot MT hsp65, bli valgt ut som reagerer med MT hsp65. Slike monoklonale antistoff vil også kryssreagere med hHSP65. Foretrukkete monoklonale antistoff er slike fremstilt mot p277-proteinet, idet dette protein har blitt vist å inneholde en patogenisk aktiv epitop.

Ethvert spesifikt monoklonalt antistoff brukt i eksemplene i foreliggende søknad er kun for eksemplifiseringsformål. Det er ingen grunn til å anta at noe slikt monoklonalt antistoff spesielt fremstilt for sin egenskap å spesifikt reagere med et gitt antigen, ville være bedre enn noe annet i denne sammenheng.

Som angitt ovenfor kan ikke bare hHSP65-proteinet (eller etter et molekyl kryssreaktivt med dette) bli brukt som den diagnostiske markør, men antistoff mot hHSP65 kan også bli brukt som sådan. Antistoff som spontant dannes når hHSP65 eller relaterte proteiner frigjøres hos humane paseinter kan bli påvist. Et positivt assay for tilstedeværelsen av slike antistoff vil virke som en indikasjon på utviklende IDDM i samme grad som et assay for hHSP65 eller relaterte proteiner i seg selv vil fremme dette formål. Anti-hHSP65-antistoffene kan bli påvist ved å lete etter reaksjoner med ethvert hsp65-protein. Således vil MT hsp65 proteinet kryssreagere med anti-hHSP65-antistoff. Selvfølgelig er det foretrukne protein for bruk ved påvisning av tilstedeværelse av anti-hHSP65-antistoff hHSP65-proteinet, og mer foretrukket p277 sekvensen derav. Imidlertid kan den vanlige fagmann bestemme empirisk uten unødig eksperimentering, hvorvidt ethvert gitt protein eller proteinfragment vil kryssreagere med anti-hHSP65-antistoff. Enkle in vitro-tester kan bli brukt for å bestemme om noe slikt protein eller annet molekyl vil immunoreagere med anti-hHSP65-antistoff.

Mens p277-sekvensen har blitt vist å tilsvare en patogen epitop i NOD/Lt-mus i ekseperimentene beskrevet ovenfor, reagerer i en annen musestamme C57BL/6, hvor diabetes kan induseres av human hsp65 og hvis T-celler reagerer på human hsp65, T-cellene ikke på p277. Således er det tydelig at dette er ikke den eneste patogene epitop på hHSP65. Faktisk har det diagnostiske markørprotein funnet i blod og urin hos prediabetiske humane pasienter blitt karakterisert til å ha en molekylvekt på ca. 62 KD. Følgelig vil det være ventet at den spesielle epitop (human leukocytt antigen, HLA) som oppvises av hovedhistokompatibilitets-komplekset (MHC), være forskjellig fra individ til individ. Således, mens p277-sekvensen for tiden er foretrukket, vil den vanlige fagmann forstå at andre antigene sekvenser i hHSP65-proteinet vil finnes å ha samme eller relaterte effekt som p277. Foreliggende oppfinnelse er tenkt å dekke alle slike sekvenser.

De ovennevnte eksempler viser at ikke bare kan hsp65-proteinet eller kryssreaktive antigen og antistoff som er spesifikke for dette, bli brukt som den diagnostiske markør for begynnende diabetes, men også T-celler som er spesifikke for slike proteiner. Faktisk synes det som om tilsynekomsten av slike spesifikke T-celler kan gå foran tilsynekomsten av antistoff. Det er T-cellene som faktisk angriper betacellene i stedet for antistoffene. Den vanlige fagmann vil være klar over mange assays for T-celle-aktivitet mot et spesielt antigen. For eksempel kan perifere lymfocytter bli erholdt fra en forsøkspasient utsatt for hHSP65 eller et kryssreaktivt antigen og enhver av de forskjellige kjente effekter som opptrer ved aktivering, kan bli målt, såsom proliferasjon, cytokin- eller lymfokin-dannelse, enzymdannelse, kalsiumflux osv. Et hvert slikt assay ligger innenfor fagkompetansen.

Som bemerket ovenfor er hsp65 kjent for å være assosiert med adjuvant artritt i rotter og med reumatoid artritt i mennesker. Det vil ikke foreligge noen usikkerhet med hensyn til assayet av hsp65 eller anti-hsp65 ved å skille mellom personer som utvikler IDDM og de som lider av artritt fordi, ulik IDDM-prosessen, er artrittprosessen klart kjennetegnet av tydlige tegn og symptom er på artritt. Således ville påvisning av hsp65 eller anti-hsp65, uten tegn eller symptomer på artritt, virke til å lede oppmerk-somheten mot muligheten for subklinisk betacelle-ødeleggelse og begynnende IDDM. Ytterligere forsøk, såsom antistoff til betaceller, kunne så bli brukt for å bekrefte en diagnose av autoimmunitet mot betaceller.

Assosiasjonen av hsp90 med systemisk lupus erytematose (SLE) vil heller ikke blitt tatt feil av for IDDM prosessen, fordi SLE også er karakterisert ved klare tegn og symptomer på sykdom, mens IDDM-prosessen er klinisk taus.

Antistoff mot hsp65 eller relaterte proteiner kan bli brukt for diagnostisering av IDDM, hvor hsp65 eller et annet immunologisk kryssreaktivt molekyl, injiseres subcutant i en pasient, og inntreden av en påviselig hudreaksjon observeres. Alternativt kan hsp65 eller relatert molekyl, bli satt i kontakt med en pasients blod eller blodkomponent, og inntreden av en hver immunologisk reaksjon med antihHSP65, det vil si et hvert antistoff som kryssreagerer med hsp65 som er tilstede i pasientens blod, kan påvises med en hver kjent immunologisk metode. Slike velkjente immunoloogiske metoder innbefatter radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, ELISA, chemiluminescent assay og liknende.

I in vivo hudtesten blir hudreaksjonen ved injeksjonsstedet målt etter en tilstrekkeliug tidsperiode, f.eks. 24-72 timer etter tilførsel. Heving og/eller inflammasjon er grunnet en forsinket hypersensitivitetlignende reaksjon.

For in vitro serologiske forsøk, blir serum fra en pasient satt i kontakt med hsp65 eller et relatert molekyl. Dersom serumet inneholder antistoff mot antigene determinanter av hsp65, vil en immunologisk reaksjon intreffe som kan påvises og undersøkes ved hjelp av standard teknikker, såsom ELISA, agglutinering osv.

Enhver velkjent immunoassay-teknikk kan bli brukt for å påvise tilstedeværelsen av hHSP65, anti-hHSP65 eller hHSP65-spesifikke T-celler. Det bør forstås at når den vanlige fagmann blir klar over det faktum at tilstedeværelsen av anti-hHSP65 antistoff i serum fra en person, bestemt for eksempel ved hjelp av et assay med hsp65, er det en positiv indikasjon på utviklende eller eksisterende IDDM, vil slike fagfolk være klar over typene av immunoassaytek-nikker som kan bli brukt. Ved siden av radioimmunoassay (fast eller flytende fase) kan enhver konvensjonell immu-noassayteknikk bli brukt, såsom enzymtilknyttet immunosor-bent assay (ELISA), heterogent immunoassay (både kompetitivt og ikke-kompetitivt) som bruker markører forskjellige fra enzymer og radioisotoper, homogene immunoassays basert på fluorescensdemping og enzyminnretting, immunutfelling (innbefattende radial immun diffusjon) og agglutinerings-assay basert på visuell semikavntitativ påvisning eller kvantitativ turbidimetrisk påvisning. Assayet kan bruke en hver kjonvensjonell fastfase eller sandwich-assayteknikk.

På lignende måte kan kits bli fremstilt for å utføre enhver av de forskjellige assays som brukes for å utføre foreliggende oppfinnelse. Hvert slikt kit vil innbefatte alle av materialene som er nødvendige for å utføre et enkelt assay eller et fast antall assay. For eksempel kan et slikt kit for å bestemme tilstedeværelsen av anti-hHSP65-antistoff inneholde fastfaseimmobilisert hsp65 og et merket antistoff som er i stand til å gjenkjenne den ikke-variable region av anti-hHSP65-antistoffet som skal påvises, såsom merket antihuman Fab. Et kit for å bestemme tilstedeværelsen av hHSP65 kan innehode fastfaseimmobilisert antistoff som reagerer eller kryssreagerer med hHSP65 og et merket antistoff som er i stand til å reagere med en forskjellig epitop av hHSP65 enn den gjenkjent av det immobiliserte antistoff. Kittet bør også inneholde reagenser som er i stand til å utfølge immunkomplekser av hsp65 og anti-hHSP65-antistoff og kan inneholde retningslinjer for bruk av kittet og beholdere for å holde materialene i kittet. Enhver konvensjonell markør eller markering kan bli brukt, såsom et radioisotop, et enzym, en chromofor eller en fluorofor. En typisk radioisotop er jod-125 eller svovel-35. Typiske enzymer for dette formål innbefatter pepperrot-peroksydase, a-galactosidase og alkalisk fosfatase.

Diagnostiske blandinger i henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles ved å kombinere hsp65 med egnete hjelpestoff og hjelpekomponenter.

Som vist fra de ovennevnte eksperimenter, frigjører øyceller og varmesjokkerte fibroblaster molekyler som kryssreagerer med mycobakteriell hsp65. Det faktum at immunisering med mycobakteriell hsp65 kan forårsake IDDM, indikerer at et immunangrep mot antigener som er kryssreaktive med mycobakteriell hsp65, skader betaceller. En slik immunrespons kunne inntreffe som en primærhendelse etter uhensiktsmessig immunisering mot et kryssreaktivt hHSP65 eller en invader-ende mikrobe. Frigjøringen av hHSP65 eller relatert protein kunne også oppstå etter betacelle-skade påført av et virus eller toxiner. Således vil det bli forstått hvorfor tilsynekomsten av de hsp65-positive molekyler i blodet og urinen er et tidlig tegn på utviklende IDDM, fordi molekylene er frigjort fra betacellene som skadekomponenter. På lignende måte er anti-hHSP65-antistoff ett pålitelig tegn på utviklende IDDM, fordi en immunrespons mot hHSP65 i seg selv kan forårsake IDDM.

Om enten antistoffene mot hHSP65 opprinnelig er fremskaffet etter tilfeldig immunisering eller etter frigjøring av hHSP65 etter betacelle-skade påført av et virus eller toxiner, kan dannelsen av anti-hHSP65-antistoff eller anti-hHSP65 T-celler øke og videreføre prosessen av betacelle-ødeleggelse ettersom hHSP65 inneholdt på betacellene i seg selv vil bli angrepet.

Det er signifikant at spontan IDDM blir unngått etter gjenvinning fra et antall av akutt diabetes, enten overført av virulente anti-hsp65 T-celler eller indusert ved aktiv immunisering mot hsp65. Dette antyder at kinetikken og størrelsen av en autoimmun respons kan føre til sin egen regulering. Tydeligvis kan en påsnikende kronisk prosess "snike seg gjennom" det naturlige forsvar mot autoimmun sykdom, mens en kraftig autoimmun stimulans kan styrke reguleringen. Erhvervelsen av motstand mot en autoimmun sykdom ved en akutt episode av sykdommen i seg selv, blir regelmessig observert i rottemodellen for eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE). Etter spontant å ha kommet seg fra akutt EAE, indusert enten ved aktiv immunisering mot myelin basiske proteiner eller ved passiv overføring av aktiverte T-celler, oppviser rotter motstandsdytighet mot ytterligere forsøk på å indusere EAE. Det ble funnet at en episode av EAE-aktiverte mekanismer, muligens anti-ideotypisk suppresjon, er i stand til å kontrollere de virulente T-celler som var responsive mot myelin basisk protein.

T-celle-vaksinering som benytter svekkete autoimmune T-celler synes å være en måte å aktivere regulatoriske mekanismer på, uten å måtte betale prisen med akutt sykdom. Anti-ideotypiske og anti-ergotypiske T-celler av det slag demonstrert i T-celle-vaksinering mot EAE, dempet de autoimmune anti-hsp65 T-celler og forhinderer således klinisk utbrudd av IDDM.

Denne tankegang hjelper til å forklare hvordan induksjon av toleranse eller suppresjon av en immunrespons mot hHSP65 forhindrer eller leger den diabetiske prosess, selv etter at den har blitt påbegynt. Således kan lavmolekylvekts-molekyler (25, 30 eller 47 KD) som er kryssreaktive med hsp65, eller fragmenter, modifiserte peptidsekvenser, syntetiske peptider eller også organiske molekyler basert på fusjonsprotein-kopien og utformet for å tilfredsstille de fysiokjemiske krav av hsp65, bli brukt for å forhindre eller behandle IDDM-prosessen så lenge de er kryssreaktive med polyklonale antistoff, fremskaffet mot hHSP65 eller de fremskaffer antistoff som er kryssreaktive med hHSP65. P277-sekvensen av hHSP65 er et foretrukket stoff for dette formål. Videre kan hemmetd T-celler, som er spesifikke mot hHSP65 eller tilsvarende antigen, bli brukt til å indusere slik immunitet eller undertrykke slik immunrespons lik fragmenter eller aktive deler derav.

Hsp65-molekylet har blitt vist å være anvendelig som en terapeutisk fotbindelse som er effektiv mot fortsatt utvikling av IDDM ved å danne toleranse mot hHSP65 og således selvødeleggelsen av betacellene. Det aktive prinsipp for bruk i slik behandling av begynnende IDDM, kan være et hvert materiale som er immunologisk kryssreaktivt med hHSP65, det vil si det kryssreagerer enten med polyklonale antistoff fremskaffet mot hHSP65 eller det fremskaffer antistoff som er kryssreaktive med hHSP654. Slikt materiale, det være seg et peptid, protein, karbohydrat eller annen substans, dersom det tilføres på en tolerogen måte, vil virke til å indusere toleranse mot hHSP65 på grunn av sin kryssreaktivitet. Dersom substansen er et hsp65-protein, kan det komme fra enhver art. Substansen behøver ikke å være et fullstendig protein for å være immunologisk kryss-reaktivt med hHSP65. Det kan være et fragment av proteinet som opprettholder den antigene aktivitet av proteinet selv, såsom p277-sekvensen. Rutinemessig eksperimentering vil bestemme hvorvidt enhver gitt substans er kryssreasktiv med hHSP65. Dersom substansen kryssreagerer med et polyklonalt antistoff, fremskaffet mot hHSP65, eller dersom det fremskaffer antistoff som er kryssreaktive med hHSP65, er det tenkt å ligge innen bredden av foreliggende oppfinnelse, i den utstrekning det gjelder terapi av utviklende IDDM. Ytterligere verifisering av mulighetene hos en slik substans til å være virksom i human terapi, vil være ved hjelp av testing for induksjon av toleranse i musetesten beskrevet i eksempel 10. Slik eksperimentering vil være rutinemessig og vil ikke innbefatte unødig eksperimentering.

Den foretrukne forbindelse for behandling av human IDDM er hHSP65. Aminosyresekvensen av et humant varmesjokkprotein er angitt i figur 3. Dette protein kan bli brukt for dette formål. P277-sekvensen derav er et annet spesielt foretrukket molekyl for dette formål.

Ved siden av hsp65-proteinet beskrevet heri, kan salter, funksjonelle derivater, precursorer og aktive fraksjoner derav med egenskapen å immunologisk kryssreagere med hHSP65 også bli brukt. Sekvenser, slike som de fra figur 3, eller som de beskrevet i Van Eden et al, supra, hvor én eller flere aminosyrer er utelatt eller erstattet med andre aminosyrer, er tenkt å være omfattet av foreliggende oppfinnelse så lenge de har egenskapen å immunologisk kryssreagere med hHSP65.

Som brukt heri, angår uttrykket "salter" både salter av karboksylgrupper og syreaddisjonssalter av aminogrupper av proteinmolekylet. Salter av en karboksylgruppe kan bli dannet ved midler kjent i faget og innbefatter uorganiske salte, f.eks. natrium-, kalsium-, ammonium-, jern- eller zinksalter og liknende og salter med organiske baser som de dannet f.eks med aminer, såsom trietanolamin, arginin eller lysin, pipredin, procain og liknenede. Syreaddisjonssalter innbefatter, for eksempel salter med mineralsyrer, såsom f.eks. saltsyre eller svovelsyre og salter med organiske syrer, såsom f.eks. eddiksyre eller oxalsyre.

"Funksjonelle derivater" som brukt heri, dekker derivater som kan fremstilles fra de funksjonelle grupper som opptrer som sidekjeder på residuene eller de N- eller C-terminelle grupper, ved metoder kjent i faget, og er innbefattet i oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytisk akseptable, det vil si, de ødelegger ikke aktiviteten av proteinet, tilfører ikke toxiske egenskaper til blandinger inneholdende dette og innvirker ikke uheldig på de antigene egenskaper derav.

Disse derivater kan f.eks innbefatte alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acyl-derivater av frie aminogrupper av aminosyreresiduene dannet med acylenheter (f.eks. alkanoyl eller karboksyliske aroylgrupper) eller O-acyl-derivater av frie hydroksylgrup-per (f.eks. den til seryl- eller treonylresiduer) dannet med acylenheter.

"Precursorer" er forbindelser dannet før, og omdannet til, hsp65 i dyr eller mennesker.

Som "aktive fraksjoner" av det i hovedsak rene peptid, dekker foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller precursorer av polypeptidkjeden av en sekvens som angitt i krav 1, alene eller sammen med assosierte molekyler eller residuer bundet til dette, såsom sukker- eller fosfatresi-duer eller aggregater av proteinmolekylet eller sukkerresi-duene i seg selv, forutsatt at fraksjonen har egenskapen å immunologisk kryssreagere med peptidet. Ett eksempel på en slik aktiv fraksjon er p277-sekvensen av hHSP65.

Det er kritisk at det aktive prinsipp beskrevet ovenfor tilføres i en måte som vil indusere toleranse isetedet for å indusere en immunogen respons. Således bør det ikke til-føres i olje eller et hvert annet immunogent hjelpestoff. En foretrukket måte å tilføre det aktive prinsipp på, slik at det vil indusere toleranse, er å tilføre det med et baeremiddel som favoriserer induksjon av toleranse mot antigenet når antigen-bærerkonjugatet tilføres. Slike bæremidler er kjent som tolerogene bæremidler. Eksempler på kjente tolerogene bæremidler er polymerer av D-aminosyrer, polyetylenglykol, polymerer av sukkerenheter, selv-IgG-molekyler, selv-miltceller og fettsyremolekyler. Et antigen kan også tilføres i en monomer sterkt løselig form for å indusere toleranse. En annen kjent metode for å indusere toleranse mot et antigen er å tilføre dette oralt, selv uten noe bæremiddel, spesifikt valgt for sine tolerogene egenskaper. Spesielle tilføringsmåter for et antigen for å indusere toleranse er kjent for den vanlige fagmann og en hver slik måte kan bli brukt.

T-celle-preparatene som kan bli brukt for å forhindre eller behandle IDDM er erholdt fra T-celler som har blitt utviklet spesielt for de IDDM-spesifikke antigener beskrevet ovenfor, det vil si spesifikke mot det angitte peptid eller et antigen kryssreaktivt med dette, såsom p277. Disse spesifikke celler må også ha blitt aktivert enten ved inkubering i nærvær av et slikt antigen eller ved inkubering med et mitogen som er i stand til å indusere en immunrespons fra T-cellene, såsom concanavalin A. Slike aktiverte IDDM-spesifike T-celler er fortrinnsvis hemmet, såsom ved be-stråling. En foretrukket metode for effektnedsettelse, som også har den gunstige effekt å øke immunogenesiteten av T-cellene, er ved trykkbehandling ved hjelp av hydrostatisk trykk av tilstrekkelig styrke og tid for å forårsake øket immunogenisitet av T-cellen uten vesentlig tap av membran-protein fra disse. Alternativt kan trykket være av tilstrekkelig størrelse og varighet for å forårsake proteiner fra celleoverflaten å bli støtt bort fra cellene. Etter lav-hastighets-sentrifugering for å fjerne cellene, kan fragmentet erholdt etter høy-hastighets-sentrifugering bli brukt som vaksine, såvel som de oppløselige proteiner som er tilbake i supernatanten etter høy-hastighets-sentri-fugeringen. Alle disse teknikker er beskrevet i detalj i Europeisk patentpublikasjon 261.648 tilhørende foreliggende søker, hvis fullstendige innhold herved er innbefattet per referanse.

De IDDM-spesifikke aktiverte T-celler kan også behandles med et kjemisk fornetttende middel, såsom formaldehyd, glutaraldehyd eller et fotoaktiverbart psoralen fornettende middel, såsom 8-metoxypsoralen (se europeisk patentpublikasjon 333.606 tilhørende foreliggende søker, hvis fullstendige innhold herved er innbefattet per referanse).

Slike T-celler kan også behandles med et ødeleggelsesmiddel for cytoskjelettet, såsom cytokalsin eller colkisin. Både

trykkbehandling, kjemisk fornetter-behandling og behandling med ødeleggende midler for cytoskjelett-trinnene kan kombi-neres. I tillegg kan cellene som er behandlet på denne måte lyseres og kun de fikserte cellemembraner gjenvinnes og

brukes. Alle disse prosesser er beskrevet i detalj i europeisk patentskrift nr. 261.648.

Den varable region av T-cellereseptoren som er spesifikk for IDDM antigenet, kan isoleres og fortrinnsvis klones for ekspresjon og brukes som T-cellevaksinepreparatet på den måte som er beskrevet i Howell, supra, og Vandenbark, supra, for den autoimmune encephalomyelitis T-cellereseptor.

Når IDDM-antigenet er kjent, som beskrevet heri, kan alle disse kjente teknikker brukes for første gang med hensyn til IDDM. Alle slike teknikker kan utføres av den vanlige fagmann uten unødig eksperimentering når antigenet er kjent. Alle disse representerer ytterligere metoder for å bruke antigenet fremstilt ifølge foreligggende oppfinnelse.

En slik tolargen blanding kan tilføres som vaksine for å forhindre utvikling av IDDM, f.eks. i familiemedlemmer av IDDM-pasienter som genetisk kan ha en risiko for å utvikle IDDM. Fortrinnsvis blir blandingen imidlertid brukt for å stoppe fortsatt utvikling av IDDM i personer som har påviselig hHSP65 i blodet eller urinen, men fortrinnsvis før de har utviklet en immunrespons mot hHSP65. Induksjon av toleranse vil forhindre denne immunrespons og følgelig forhindre skaden (IDDM) forårsaket av en ukontrollert anti-hHSP65-respons. Imidlertid er det ikke for sent å bruke blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse som behandling, selv etter tilsynekomst av anti-hHSP65-antistoffer. Eksperimentene hvorav resultatene er vist i tabellene 8 og 13, fastslår at foreliggende oppfinnelse kan ha en stoppende effekt på immunresponsen, selv etter at autoimmunitet mot øyene allerede har begynt. Da den autoimmune prosess kan ta flere år hos mennesker, ville selv nedregulering av respon-sen være gunstig.

hsp65 eller relaterte molekyler (som beskrevet ovenfor) kan brukes som immunogen i farmasøytiske blandinger, spesielt vaksiner, for å lette og behandle IDDM, såvel som antigener i diagnostiske blandinger for diagnose av IDDM.

En annen måte å forbedre effektiviteten på som vaksine eller terapeutisk middel av hsp65 er ved kjente genetiske manipuleringsmetoder å konstruere mikroorganismer som uttrykker hsp65, enten som sådan eller som del av et fusjonsprotein eller som en multimer derav. Disse mikroorganismer kan i seg selv brukes ved fremstilling av en levende vaksine som vil fremskaffe ikke bare dannelsen av antistoff mot gjeldende mikroorganisme, men også vil være anvendelig for lindring og behandlig av IDDM. Eksempler på egnede manipulerte mikroorganismer er Vaccinia og Salmonella-stammer.

Den foregående beskrivelse av de spesielle utførelsesformer vil så fullstendig blottlegge oppfinnelsens generelle struktur at andre ved å anvende vanlig kunnskap lett kan modifisere og/eller tilpasse for forskjellige anvendelser slike spesielle utførelsesformer uten å fravike fra det generiske konsept, og følgelig er slike tilpasninger og modifikasjoner tenkt å være omfattet av betydningen og omfanget av ekvivalenter av de beskrevne utførelsesformer. Det vil forstås at betegnelsen eller terminologien heri er brukt for å beskrive og ikke for å begrense.

Claims

1. Analogifremgangsmåte ved fremstilling av et i hovedsak rent polypeptid omfattende en sekvens med sammensetningen Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Gly-Asp og farmasøytisk akseptable salter derav, eller enhver modifikasjon derav som er immunologisk kryssreaktiv med dette, men som ikke er et fullstendig varmesjokk-protein, karakterisert ved at peptidet fremstilles på i og for seg kjent måte ved standard peptidsyntese.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, hvor peptidet er peptidet med sekvensen Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Lau-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp, karakterisert ved at peptidet fremstilles på i og for seg kjent måte ved standard peptidsyntese .

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av T-celler med spesifisitet mot et polypeptid med en aminosyresekvens som angitt i kravene 1-3, karakterisert ved at en vertsorganisme injiseres med nevnte polypeptid for å danne T-celler med spesifisitet mot nevnte aminosyresekven, at nevnte T-celler isoleres på i og for seg kjent måte, og eventuelt at nevnte T-celler behandles med et hydrostatisk trykk, et kjemisk fornetningsmiddel og/eller et fornetningsmiddel for cytoskjelett.