JP3778936B2 - インシュリン依存性糖尿病(iddm)患者に作用する免疫反応および免疫治療分子 - Google Patents
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Description
この明細書中でアミノ酸配列は明細書の末尾で定義された配列番号(SEQ ID NO)をいう。
この明細書で、特に断らない限り「含む(comprise、comprisesまたはcomprising)」とは当該要素あるいは整数、または要素あるいは整数の群の包含をいい、他の要素あるいは整数、または要素あるいは整数の群の排除をいうものではない。
インシュリン依存性糖尿病は、恐らくβ細胞自己抗原を認識するT細胞によって伝達されるインシュリン分泌β細胞の破壊をもたらす重大な疾患である。IDDMに特徴的なT細胞伝達β細胞破壊に関連する重要な抗原は2種の主要な異性体の形態のGAD65およびGAD67として存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamic acid decarboxylase:GAD)である。これら2種の異性体はアミノ酸配列のレベルで約65%の類似性を有している。IDDMまたはこの疾患の危険性の高い患者は自己抗体をもっており、自己反応性T細胞はGADインシュリンまたは両方の自己抗原に反応する。特発性IDDMの動物モデルであるMODマウスにおいて、GADは最有力の早期標的抗原である(Tisch et al., Nature 366:72-75, 1993)。β細胞自己免疫に関与する病原性自己抗原のイムノドミナントエピトープの同定はIDDMの予防のための診断および治療方針の方法改善につながるものである。
本発明の糸口になる研究において、本発明者らはGADおよびプロインシュリン分子のイムノドミナントエピトープを同定し、現在の診断操作を改善し、さらにIDDMの治療および予防組成物および処置方法を開発しようとした。
本発明においては、ペプチドは、ヒトGAD65(アミノ酸残基506−518)およびヒトプロインシュリン(アミノ酸残基24−36)と高い類似性を有する13個のアミノ酸領域に基づいて合成された。この類似性の領域はヒトGAD67およびマウスプロインシュリンおよびマウスGAD類に及んでいる(Fig.1)。これらのペプチド類の免疫反応性は本発明により前臨床または臨床IDDMの患者の末梢血細胞または末梢血から得られたT細胞の相互作用に基づいて同定され、これによって、新しい領域のIDDMの診断、治療および予防方法の基礎を形成することになる。
従って、本発明の1つの態様は、配列 式:
X1X2X3
(式中、X1およびX3は、同一または異なって、それぞれ0〜40個の天然または非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよく;
X2は、ヒトGAD65のアミノ酸506〜518を含むかまたはそれらの誘導体、および/またはヒトプロインシュリンのアミノ酸24〜36を含むかまたはそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している10〜100個の残基のアミノ酸配列である)
を含み、ペプチド分子が前臨床または臨床インシュリン依存性糖尿病(Insulin-Dependent Diabetes Mellitus:IDDM)患者からの細胞とインキュベートしたとき、T−細胞と反応し得、T−細胞機能を修飾し得ることを特徴とする組換または合成のペプチド分子またはそれらの化学的均等物を提供するものである。
好ましい細胞は、これに限定されるものではないが、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells:PBMCs)、抗凝固性全血および組織生検細胞である。
「ペプチド」の意味はポリペプチドあるいはタンパク質またはそれらの部分という意味を含む。
好ましい具体例において、X2は約10より少なくなく約50より大きくないアミノ酸残基であり、より好ましくは約10より少なくなく約30より大きくないアミノ酸残基であり、最も好ましくは約10より少なくなく約15より大きくないアミノ酸残基である。
特に好ましいX2の具体例は、下記の配列:
FFYTPKTRREAED[SEQ ID NO:1]、または
FWYIPPSLRTLED[SEQ ID NO:2]
のいずれかを有するものである。
好ましい具体例によれば、配列
式:X1X2X3
(式中、X1およびX3は、同一または異なって、それぞれ0〜15個の天然または非−天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよく;
X2は、FFYTPKTRREAEDおよびFWYIPPSLRTLEDまたはそれらの誘導体あるいは化学的均等物から選ばれる)を含み、ペプチド分子が前臨床または臨床IDDM患者からの細胞とインキュベートしたとき、T−細胞と反応し得、かつT−細胞機能を修飾し得ることを特徴とする組換または合成ペプチド分子またはそれらの化学的均等物を提供し、適当な試験方法によって反応性を測定する。
好ましい細胞はこれに限定されるものではないが、PBMCs、抗凝固性全血および/または組織生検細胞であり、適当な試験方法によって反応性を測定する。
本発明のペプチドは組換または化学的合成手段によって製造することができる。本発明の好ましい態様によれば、臨床的または前臨床的IDDM患者からのT細胞と優先的に免疫学的に反応し得る組換ペプチド提供するものであり、これは本発明のペプチド配列をコードしたカセットで形質転換された宿主細胞の発現によつて製造される。このペプチドは、別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合することができる。別法として、ペプチドはメリフィールド固相合成方法などの化学的合成技術によって製造することができる。この合成または組換ペプチドはGAD活性またはプロインシュリン活性を保持していてもよいし、していなくてもよい。さらに、上記式を有する合成ペプチドは好ましい具体例を示しているが、本発明はまた、天然由来のペプチドまたはそれらのフラグメントの生物学的に純粋な製剤に及ぶ。「生物学的に純粋な」とは、重量%で少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、さらに好ましくは少なくとも約90%またはそれ以上の活性または他の適切な手段を含む製剤を意味する。
この明細書で用いられる「前臨床的(症状発現前)」とは、膵島(β)細胞自己免疫の遺伝性および/または免疫マーカーを有するIDDM患者のだれかの一親等の親類であってもよくまたそうでなくてもよい。「免疫マーカー」とは、膵島(β)細胞自己抗原と反応し得る循環抗体および/またはT細胞を含むとりわけ当業者に公知のパラメーターを意味する。
この明細書に用いられる「誘導体」とは、ペプチドが誘導される天然分子中の天然由来のアミノ酸配列に関して、なんらかの単一または複数のアミノ酸の置換、削除および/または付加を含むことを意味し、ペプチドと結合した他の分子のなんらかの単一または複数の置換、削除および/または付加を含み、炭水化物、脂質および/または他のタンパク質性部分を含むことを意味する。従って、このような誘導体は変化したグリコシル化様式のグリコシル化または非グリコシル化形態または分子を含む。
この明細書で用いられる「T細胞と反応し、かつT細胞機能を修飾する」とは、T細胞の活性化、T細胞の不活性化および/またはT細胞の死滅を含むことをいう。
本発明はまた、当該ペプチドの化学的類似体であって、これに限定されるものではないが、ペプチド合成中の側鎖の修飾、非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の組み込み、ペプチドまたはそれらの類似体に構造的拘束を課す架橋結合体または他の方法の使用を包含する。
本発明の意図する側鎖の修飾の例は、アルデヒドとの反応ついでNaBH4を用いる還元による還元的アルキル化;メチルアセトイミデートによるアミド化;酸無水物によるアシル化;シアナートによるアミノ基のカルバモイル化;2,4,6トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化;無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化;およびピリドキサール−5'−ホスフェートによるリジンのピリドキシル化ついでNaBH4による還元、などのアミノ基の修飾を含む。
アルギニン残基のグアニジン基は2,3−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試剤によるヘテロ環縮合生成物の形成によって修飾してもよい。
カルボキシル基はO−アシルイソウレア形成を経てカルボジイミド活性化ついで、例えば対応するアミドなどへの誘導体化によって修飾してもよい。
スルヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシルメチル化;システイン酸への過ギ酸酸化;他のチオール化合物による混合ジスルヒドの形成;マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドによる反応;4−クロロ水銀ベンゾエート、4−クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル水銀クロリド、2−クロロ水銀−4−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を用いる水銀誘導体の形成;アルカリ性pHでのシアナートによるカルバモイル化などの方法によって修飾することができる。
トリプトファン残基は、例えば、N−ブロモスクシンイミドによる酸化又は2−ヒドロキシ−5−ニトロベンジルブロミド若しくはスルフェニルハライドによるインドール環のアルキル化により修飾することができる。他方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により改変し、3−ニトロチロシン誘導体を形成することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化又はジエチルピロカーボネートによるN−カルベトキシ化によって行うことができる。
ペプチド合成において導入する、非天然アミノ酸及び誘導体の例には、ノルロイシン、4−アミノ酪酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−5−フェニルペンタン酸、6−アミノヘキサン酸、t−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4−アミノ−3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、2−チエニルアラニン及び/又はアミノ酸のD−異性体の使用が含まれるがこれらに限定されない。
例えば、n=1〜6である(CH2)nスペーサー(spacer)基を有する二官能イミドエステル、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなホモ二官能性架橋剤、及びN−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分と、マレイミドのような基特異的反応性部分又はジチオ部分(SH)又はカルボジイミド(COOH)を、通常含んでいるヘテロ二官能性分子試薬を使用して、三次元コンフォメーションを安定化させるために架橋剤を使用することができる。さらにペプチドは、例えば、Cα及びNα−メチルアミノ酸の導入、アミノ酸のCα原子とCβ原子との間の二重結合の導入、及びN−末端とC−末端との間、2つの側鎖間、又は側鎖とN−末端もしくはC−末端との間の、アミド結合の形成のような共有結合の導入による環状ペプチド又は類似体の形成によって、立体配座的に束縛することができる。
本発明はまた、患者の処置における、本発明のペプチド又はその誘導体の使用を提供する。この態様において、このような処置方法には、患者由来の自己抗体又は自己反応性細胞を除去するための吸着剤としてのその使用、又はIDDM自己抗原に対する自己反応性T細胞若しくは自己抗体の反応性を除去若しくは減少させるための、又は治療剤のために若しくは治療剤として使用するT細胞系若しくはクローンを生じさせるための免疫寛容または他の機構を脱感作し、又は誘導する手段としての、患者への直接投与におけるその使用を包含する。
本発明のこの態様によれば、患者における自己反応性T細胞および/またはIDDM自己抗原に対する自己抗体の存在または機能を除去または実質的に減少させるためのペプチドまたはその化学的均等物を十分な量、期間および条件下で投与することを含む処置方法であって、上記ペプチドが、
式:X1X2X3
(式中、X1およびX3は、同一または異なって、それぞれ0〜40個の天然または非−天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得;
X2は、ヒトGAD65のアミノ酸506〜518を含むかまたはそれらの誘導体、および/またはヒトプロインシュリンのアミノ酸24〜36を含むかまたはそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している10〜100個の残基のアミノ酸配列である)を含み、前臨床またはインシュリン−依存性糖尿病(Insulin-Dependent Diabetes Mellitus:IDDM)患者からの細胞とインキュベートしたとき、T−細胞と反応し得、かつ−T細胞機能を修飾し得るものであることを特徴とする方法を提供する。好ましい細胞には、末梢血単核球細胞(PBMC)、抗凝固性全血及び組織生検細胞が含まれるがこれらに限られない。
本明細書において意図される処置の方法には、以下の例が含まれるがこれらに限られない。処置の第1の例は、有効量の合成ペプチド又はその誘導体を用いる脱感作又は耐性導入であり、GAD及び/又はプロインスリン及び/又は他のIDDM抗原のT細胞認識、又は、これらに対する応答を改変し、及び/又はT細胞抑制若しくは調節を誘導する。これは、ある紫外線波長、特にUV−Bの公知の作用を使用することによって達成され、皮膚又は粘膜を介する、あるいは全身的な投与によって抗原呈示を改変する。有効量のペプチド又はその誘導体を、GAD又はプロインスリンペプチド又はポリペプチドに対する末梢血T細胞反応性を示している患者の皮膚に対して上皮に適用する。UV−B照射に皮膚を暴露した後、GAD又はプロインスリンに対するT細胞反応性が抑制される時まで処置を繰り返す。
処置の第2の例は、目的のペプチド又はその誘導体の有効量を使用して、GAD及び/又はプロインスリン及び/又は他のIDDM抗原のT細胞認識、又は、これらに対するT細胞応答を改変する、粘膜を介した耐性の誘導、及び/又はペプチド又はその誘導体の有効量を使用してGAD及び/又はプロインスリン及び/又は他のIDDM抗原のT細胞認識、又はこれらに対するT細胞応答を改変する、T細胞抑制の誘導、及び/又は、経口、エアロゾル又は経鼻、とりわけ粘膜投与の手段による、ペプチド又はその誘導体の投与によるT細胞抑制の誘導である。
別の処置には、TNFα又はβのような、しかしこれらに限定されない1又はそれ以上のサイトカインと共に、皮膚に当該ペプチドを適用することが含まれる。さらなる処置には、免疫寛容を誘導するための、皮下又は静脈内経路による、可溶性ペプチドの全身的投与が含まれる。別の処置には、T細胞免疫化が含まれ、該処置においては、標準的な手法によってGAD又はプロインスリンペプチド又はポリペプチド又はその断片に対するT細胞系を作出し、細胞をグルタルアルデヒド又はパラホルムアルデヒド等の試薬による固定によって弱毒化(attenuated)し、滅菌条件下で洗浄し、一定期間且つ自己抗原に対する外因性T細胞応答の抑制をもたらす条件下で患者に再注入する。これらの解決手段は、前臨床(症状発現前)IDDMである無症状の患者、又は臨床(症状が発現したばかりの)患者におけるIDDMの進行の阻止、並びに膵臓、膵島細胞又はインスリン産生細胞の移植を受けた患者におけるIDDMの再発に適用可能である。これらの解決手段はまた、Stiff Man Syndrome(SMS)及びGAD及び/又はプロインスリンが自己抗原となる他の疾患にも適用可能である。
本発明によれば、有効量のペプチドは、1回の投与量あたり、0.1μg〜10mgであり、好ましくは1回の投与量あたり1.0μg〜1mgである。投与量は、単独投与、又は単独又は時間ごとの、日ごとの、週ごとの又は月ごとの又は他の適当な時間での複数の投与からなるプロトコルを構成し得る。投与は、静脈内、皮下、上皮、注入、経口、局所、鼻内、エアロゾル、坐剤又は腹腔内投与のような、しかしこれらに限られない、いずれの便利な手段によるものでもよい。ペプチドを単独でか、又は1又はそれ以上の、ペプチドの活性又は作用を促進する分子のような活性分子、例えばリポ多糖(LPS)、コレラトキシンβ−鎖、リンパ球機能関連抗原−3(LFA−3)、他のアジュバント及び特に腫瘍壊死因子α(TNFα)、腫瘍壊死因子β(TNFβ)、又は白血病阻害因子(LIF)と共に投与してよい。
さらなる態様において、本発明は、IDDM抗原に対する患者の細胞の反応性を測定するための、本明細書記載のペプチドの使用を包含する。このペプチド又はその誘導体を、分画されていないか、分画されたか又は継続的な細胞系として得られる、末梢血又は組織生検に由来する細胞と共に、溶液に加えるか、又は固体の担体に結合させることができる。次に、自己抗原に対する反応性をトリチウム化したチミジンを導入するような標準的な増殖アッセイ、標的細胞からのマーカー放射能の放出などの標準的な細胞毒性アッセイ、表面マーカー、サイトカインなどの発現した又は分泌された分子の測定、又は当技術分野で周知の、他の標準的な細胞の反応性のアッセイにより測定する。
本発明のこの態様によれば、IDDM自己抗原に対する患者の反応性を分析する方法が提供される。この方法は、式:
X1X2X3
[式中、X1とX3は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ0〜40の天然又は非天然アミノ酸残基を含んでなるアミノ酸配列であり;
X2は、ヒトGAD65のアミノ酸506〜518若しくはその誘導体及び/又はヒトプロインスリンのアミノ酸24〜36若しくはその誘導体に、由来するか、相同であるか、又はその範囲内において隣接する、10〜100残基のアミノ酸配列であって;
該ペプチド分子は、症状発現前又は臨床的インスリン依存性糖尿病(IDDM)を有する患者に由来する細胞とインキュベーションしたときに、T細胞と反応し、T細胞機能を改変することが可能である]
で示されるペプチド又はその化学的等価物を接触させること、及び適当なアッセイにより反応性を測定することを含んでなる。このアッセイによれば、いずれの種類の細胞も使用し得るが、PBMC細胞、抗凝固性全血細胞又は組織生検細胞から選択するのが好ましい。
好ましくは、本発明は、IDDM自己抗原に対する患者の反応性を分析する方法を包含する。該方法は、式:
X1X2X3
(式中、X1とX3は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ0〜15の天然又は非天然アミノ酸残基を含んでなるアミノ酸配列であり;
X2は、FFYTPKTRREAEDおよびFWYIPPSLRTLED又はその誘導体若しくは化学的等価物から選択され;
該ペプチドは、症状発現前又は臨床的IDDMを有する患者に由来する細胞とインキュベーションしたときに、T細胞と反応し、T細胞機能を改変することが可能である]
で示されるペプチド又はその化学的等価物を接触させること、及び適当なアッセイによる反応性の測定を含んでなる。好ましくは、細胞には、末梢血単核球細胞(PBMC)、抗凝固性全血及び組織生検細胞が含まれるがこれらに限られない。
本発明の別の態様においては、T細胞を分析するための診断キットが提供される。標準的な96ウェルプレートを、ELISAにおいて使用するように、抗原と共に又は抗原なしで、γ−インターフェロン(γ−IFN)のようなT細胞サイトカインに対するモノクローナル抗体(MAb)でプレ-コートする。別法として、抗原を、一部の抹消血、抹消血単球細胞又はT細胞と共に可溶性の形態で加える。1日又はそれ以上インキュベーションし、上清(媒体及び血漿を含む)及び細胞を洗浄し、ウェルを再び洗浄して、プレートを、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビ大根ペルオキシダーゼとコンジュゲートした、抗γ−IFNのようなサイトカインに対する標識第2MAbで顕色化を行う。次に、発色反応と読み取りシステムが利用できる。別法として、可溶性サイトカイン(例えば、γ−IFN)を、ELISAのような標準的アッセイにより上清中で測定する。さらにこの方法は、ELISPOT技術により、単独の細胞レベルで、産生したサイトカインを示すウェルの底の個々のスポットを顕微鏡で見ることが可能であり、それによってペプチド-エピトープ反応性T細胞の頻度を測定することが可能になる。
ここに、以下の、限定を意図しない図面及び実施例を引用して本発明をさらに記載する。
図面において:
第1図は、プロインスリン及びGADの、マウスとヒトとの間の類似領域の比較を示す。類似部分を枠で囲み;枠内の同一部分に影を付した。成熟インスリンB−鎖のC−末端とプロインスリン開裂部位を、それぞれ縦線と矢印で示した。
第2図は、At-risk(危険性のある)IDDM(実施例1に記載)の、又はコントロール(対照)の患者から得た末梢血単核球細胞の、以下のペプチドによる刺激後の、デルタスコアとして表した細胞増殖のレベルを示すグラフである。ヒトGAD65(残基506〜518);ヒトプロインスリン(残基24〜36);無関係な対照ペプチド;又はテタヌストキソイド(CSL社、メルボルン、オーストラリア)。
第3図は、前臨床(症状発現前)及びコントロールの患者におけるプロインスリン(アミノ酸24〜36)及びインスリン(アミノ酸1〜15)に対するpbmcの増殖(mean+sem)を示すグラフである。
第4図は、前臨床(症状発現前)及びコントロールの患者における、プロインスリン(アミノ酸24〜36)及びインスリンβ−鎖(アミノ酸1〜15)に対するIFN−γ応答(mean+sem)を示すグラフである。
第5図は、前臨床及びコントロールの患者における、プロインスリン(アミノ酸24〜36)及びインスリンβ−鎖(アミノ酸1〜15)に対するIL10応答(mean+sem)を示すグラフである。
下記の1文字記号および3文字省略番号はアミノ酸残基に用いられている。
実施例1
被験者
IDDMリスク(At-risk:危険性のある)を有する被験者は、オーストラリア、ビクトリアのメルボルン前糖尿病ファミリー・スタディーより得た。各被験者は、少なくとも1人のIDDMの1親等の親類がおり、膵島細胞抗体(ICA)≧20JDFユニットおよび/またはインスリン自己抗体(IAA)≧100nU/mlを有することに基づいて選ばれた。すべての被験者は、絶食時に血中グルコースおよびグリコヘモグロビンが正常になる患者であって、6カ月間隔で抗体および代謝物テストを繰り返した。
コントロール被験者は、HAL−DRマッチングされ、無症候かつIDDM歴のないものを採用した。
すべての被験者は実験について告知され署名して承諾した。実験は、ロイヤル・メルボルン病院ならびにウォルター・アンド・エリザ・ホール・インスティチュート・オブ・メディカル・リサーチの倫理委員会によって認可された。被験者の詳細を表1に示す。
実施例2
HLA型判定およびICA、IAA、GAD、Ab、FPIRアッセイ
HLA型判定:
それぞれTリンパ球およびBリンパ球の集団を用いて、HLAクラスI(A、B、C)およびHLAクラスII(DR、DQ)の型判定を行った。CD8(クラスI)対するモノクローナル抗体またはクラスIIβ鎖(クラスII)上の単形性決定基でコーティングした磁性ビーズ(Dynal製)を用いて抗凝固血液から該細胞を単離した。クラスIに対しては240アロ血清を用い、クラスIIに対しては240アロ血清を用いる標準のミクロリンパ球毒性アッセイにて富化細胞集団を型判定した。
抗体アッセイ:
O型血液のドナーの膵臓における間接的免疫蛍光法を用いてICAをアッセイした。JDFユニットで、陽性の血清の2倍希釈および各アッセイにおける標準血清との比較を行って力価を定量した。該アッセイはインターナショナル・ダイアビーティーズ・ワークショップおよび熟達プログラムに含まれている。
国際的に標準化されている放射結合アッセイによってIAAを試験した。正常コントロール血清の上限は、インスリン結合40nU/血清mlである。
子ブタ脳抽出物を用い、免疫沈降法にてGADの酵素活性を測定することによりGAD抗体を試験した。72人の健康な被験者の平均プラス3SD、460nU/mlを用いて正常領域を決定した。
第1相インスリン放出(First Phase Insulin Release:FPIR):
3分間のグルコース(0.5g/体重kg)静注完了後1分および3分の時点での血清インスリン濃度の合計としてFPIRを算出した。
実施例3
T細胞増殖アッセイ
IDDMリスク被験者およびHLA−DRマッチングコントロールから血液を同じ時間(30分以内)に採取し、日常的変化へ操作による人工物の影響を低減するために同様に処理した。Ficoll-Paque(ファルマシア・バイオテック製)密度遠心分離により、ヘパリン化全血から末梢血管単核細胞を単離し、洗浄し、次いで、20mMのHepes(CSL・リミテッド製)、10-5Mの2−メルカプトエタノール(BDH)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)および10% v/v自己血漿を含むRPMI1640培地(バイオサイエンシーズ・プチ・リミテッド製)に再懸濁する。200μl(2×105細胞)のアリコートを96ウエルの丸底プレート(Falcon製)に移し、最終濃度10、2および0.4μg/mlとなるようにした次のペプチドとともに6個ずつインキュベートする:ヒトGAD65(506−518)、ヒトプロインスリン(24−36)(アプライド・バイオシステムズ・モデル431Aセンセサイザー(ABI、フォスター・シティ、CA)を用いて合成したもの)および無関係な対照ペプチド(CRFDPQFALTNIAVRK)(マクロモレキュラー・リソーシーズ、フォート・コリンズ、CO)。最終濃度1.8、0.18および0.018LfU/mlの破傷風トキソイド(CSL・リミテッド製、メルボルン、オーストラリア)を陽性対照として用いた。細胞は含むが抗原は含まない12個の“自己のみ”のウエルをバックグラウンドコントロールとしてインキュベートした。5%v/vCO2湿潤インキュベーターにて37℃で6日間プレートをインキュベートした;最後の6時間、各ウエルに0.25μCiの[3H]チミジン(ICN)を加えた。次いで、細胞を採取してガラス繊維フィルターに乗せ、取り込まれた放射活性をβ粒子計数装置で測定した(パッカード・モデル2000液体シンチレーションカウンター)。細胞増殖のレベルを、デルタスコア(DS=抗原の存在下に取り込まれた、1分あたりの平均カウント数(cpm)−“自己のみ”ウエルの平均cpm)で示した。
実施例4
T細胞増殖応答
プロインスリンおよびGAD由来の類似の13量体ペプチドに対するT細胞増殖応答をに10組のHLA−DRマッチングしたリスク被験者およびコントロール被験者ついて比較した。HLA−DRマッチングは、MHCクラスII対立遺伝子に結合するペプチドの特異性のためだけでなく、MHCクラスIIとIDDMの間の公知の関連性のためからも、重要であると考えられた。したがって、T細胞応答は、MHC特異性よりもむしろIDDMを反映するものである。最高濃度のどのペプチドに対する応答も、IDDMリスク被験者の方がコントロール被験者よりも有意に大きかった(プロインスリン,p<0.008;GAD,p<0.018−ウィルコクソンのワン・テイルド(one-tailed)一対分析)。結果を表2にまとめる。
プリインスリン配列に対する反応性は、ほとんど完全にIDDMリスク被験者に限定されたが、一方、幾つかのコントロールもまたGADペプチドに応答した(表2、図2)。両方のグループが同様に破傷風に応答し、無関係なコントロールペプチドに反応した被験者はなかった。
これらの6つの組(#1,2,3,5,6,7)について、ウエル中の細胞数を2倍にして(4×105個/ウエル)、別にアッセイを行った。3つのケースにおいて、培地の消耗により信頼できない結果をもたらした。他の3つのうち2つのケースにおいて(#5および6)、結果は表にしたと一致したが、#3においては、リスク被験者は、細胞数の多い方が、両方の抗原に対して、より大きな反応性を示した。
実施例5
T細胞サイトカイン分泌アッセイ
18組のIDDMリスクおよびHLA−DRマッチングコントロールからなる第2の集団において、実施例3で示したPBMCsを、実施例3と同様な条件下にて、それぞれ0.5、5および50μg/mlのヒトプロインスリン24−36およびヒトインスリンB鎖1−15とともにインキュベートした。実施例3で述べたような、[3H]チミジン摂取による増殖を測定するために6日後に細胞を採取することに加えて、IFN−γおよびインターロイキン(IL−)10を標準的ELISA法で測定するために、2日後に細胞上のインキュベーション培地をサンプリングした。
実施例6
T細胞応答
18組のHLA−DRマッチングIDDMリスク被験者およびコントロール被験者について、ヒトプロインスリン24−36およびヒトインスリンB1−15に対するT細胞増殖応答ならびにIFN−γおよびIL−10分泌応答を比較した。実施例4に述べたように、IDDMリスク被験者がプロインスリンペプチド(図3)に対して有意に大きな(p=0.003)増殖応答を示した。さらに、プロインスリンペプチドに応答してIFN−γおよびIL−10の両方の分泌が、マッチングしたコントロール被験者と比較して、有意に(それぞれp=0.005およびp=0.001)増加した(図4,5)。
当業者であれば、特記されたもの以外にも、本明細書に記載の発明に変化や修飾を加え得ることが理解されよう。このような変化や修飾のすべてが本発明に包含されることを理解すべきである。また本発明には、明細書中に言及あるいは提示したすべてのステップ、特徴、組成物および化合物が、個々に、あるいは集合的に包含され、該ステップあるいは特徴の2つ以上のいずれの組み合わせのすべてもまた本発明に包含される。
配列表
(2)配列番号1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:核酸
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO.1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:核酸
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列:SEQ ID NO.2:
Claims (5)
- ヒトプロインシュリンのアミノ酸24〜36:FFYTPKTRREAEDからなる、前臨床または臨床インシュリン依存性糖尿病(Insulin-Dependent Diabetes Mellitus:IDDM)患者からの細胞とインキュベートしたとき、T細胞と反応し得、かつT細胞機能を修飾し得ることを特徴とする組換または合成のペプチド分子。
- 患者のIDDM自己抗原に対する反応性を検査する方法であって、上記方法が、請求項1に記載の組換または合成のペプチド分子を前臨床または臨床IDDM患者からの細胞と接触させ、増殖試験方法、細胞毒試験方法、細胞反応性またはそれらの組み合わせによって反応性を測定することを特徴とする方法。
- 細胞がPBMCs、抗凝固全血および/または組織生検細胞から選ばれるものである、請求項2記載の方法。
- 請求項1に記載のペプチド分子を前臨床または臨床IDDM患者からの細胞と接触させ、増殖試験方法、細胞毒試験方法、細胞反応性またはそれらの組み合わせによって反応性を測定することを特徴とする、患者のIDDM自己抗原に対する反応性を検査するための診断剤。
- 細胞がPBMCs、抗凝固全血および/または組織生検細胞から選ばれるものである、請求項4記載の診断剤。
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