ES2289751T3 - Moleculas inmunorreactivas e inmunoterapeuticas que interaccionan en sujetos con diabetes mellitus insulinodependientes (dmid). - Google Patents

Moleculas inmunorreactivas e inmunoterapeuticas que interaccionan en sujetos con diabetes mellitus insulinodependientes (dmid). Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA EN GENERAL DE MOLECULAS TALES COMO PEPTIDOS, POLIPEPTIDOS Y PROTEINAS QUE INTERACCIONAN DE FORMA INMUNOLOGICA CON ANTICUERPOS O CELULAS T EN SUJETOS QUE PADECEN UNA DIABETES MELLITUS DEPENDIENTE DE INSULINA (IDDM) PRE-CLINICA O CLINICA. ESTAS MOLECULAS SON PREFERIBLEMENTE INMUNORREACTIVAS FRENTE A CELULAS T EN SUJETOS QUE PADECEN UNA IDDM PRE-CLINICA O CLINICA, Y RESULTAN UTILES PARA EL DESARROLLO DE AGENTES DE DIAGNOSTICO, TERAPEUTICOS Y PROFILACTICOS PARA LA IDDM.

Description

Moléculas inmunorreactivas e inmunoterapéuticas que interaccionan en sujetos con diabetes mellitus insulinodependientes (DMID).
La presente invención se refiere en general a moléculas tales como péptidos, polipéptidos y proteínas que interaccionan inmunológicamente con anticuerpos o células T en sujetos que tienen diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) preclínica o clínica. Estas moléculas son preferentemente inmunorreactivas para las células T en los sujetos que tienen DMID preclínica o clínica, y son útiles en el desarrollo de agentes diagnósticos, terapéuticos y profilácticos para DMID.
Las secuencias de aminoácidos se mencionan aquí mediante números de identidad de secuencia (SEQ ID NOs), que se definen al final de la memoria descriptiva.
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprender", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros expuestos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
La diabetes mellitus insulinodependiente es una enfermedad seria que resulta de la destrucción de las células \beta secretoras de insulina, probablemente mediada por las células T que reconocen autoantígenos en las células \beta. Un antígeno importante implicado en la destrucción de las células \beta mediada por las células T característica de DMID es la ácido glutámico descarboxilasa (GAD), que existe en dos isoformas principales, GAD 65 y GAD 67. Estas dos isoformas tienen aproximadamente un 65% de similitud de secuencias de aminoácidos. Los sujetos con DMID o con un riesgo elevado de enfermedad muestran respuestas de autoanticuerpos y de células T autorreactivas a GAD, insulina o ambos autoantígenos. En ratones NOD, un modelo animal de DMID espontánea, GAD es un antígeno objetivo dominante y temprano (Tisch et al Nature 366:72-75, 1993).
La identificación de el/los epítopo(s) inmunodominante(s) de los autoantígenos patógenos implicados en la autoinmunidad de las células \beta podría conducir a métodos mejorados de diagnóstico, así como a estrategias terapéuticas para prevenir la DMID.
En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores trataron de identificar epítopos inmunodominantes en las moléculas de GAD y de proinsulina para mejorar los procedimientos diagnósticos actuales y para desarrollar adicionalmente las composiciones terapéuticas y profilácticas y las aproximaciones de tratamiento para DMID.
El documento EP 0.171.886 describe compuestos antidiabéticos derivados de proinsulina humana.
De acuerdo con la presente invención, se sintetizaron péptidos basados en una región de trece aminoácidos de elevada similitud entre las secuencias de GAD 65 humana (números de residuos de aminoácidos 506-518) y proinsulina humana (números de residuos de aminoácidos 24-36), cuya región de similitud se extiende también a GAD 67 humana y a proinsulinas de ratón y GADs de ratón (Figura 1). La inmunorreactividad de estos péptidos se identifica de acuerdo con la presente invención en base a la interactividad de las células de sangre periférica o células T obtenidas de la sangre periférica de sujetos con DMID preclínica o clínica, por lo que se forma la base de una nueva variedad de procedimientos diagnósticos, terapéuticos y profilácticos para DMID.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID, y dicho método comprende poner en contacto un péptido que comprende la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X_{2}
en la que:
X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 100 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 y 36 inclusive de la proinsulina humana; y
en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen DMID preclínica o clínica, con células de dicho sujeto y determinar la reactividad mediante un ensayo apropiado.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID, y dicho método comprende poner en contacto un péptido que comprende la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X_{2}
en la que
X_{2} es FFYTPKTRREAED y en la que dicho péptido es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos con DMID preclínica o clínica, con células de dicho sujeto y determinar la reactividad mediante un ensayo apropiado.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un péptido que comprende la fórmula:
X_{2}
en la que:
X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 100 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 a 36 inclusive de la proinsulina humana; y
en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen DMID preclínica o clínica, para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID poniendo en contacto dicho péptido con las células de dicho sujeto y determinando la reactividad mediante un ensayo apropiado.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un péptido que comprende la fórmula:
X_{2}
en la que:
X_{2} es FFYTPKTRREAED y en la que dicho péptido es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos con DMID preclínica o clínica, para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID poniendo en contacto dicho péptido con las células de dicho sujeto y determinando la reactividad mediante un ensayo de proliferación.
Por lo tanto, la presente solicitud describe un péptido recombinante o sintético o sus equivalentes químicos de fórmula:
X_{1}X_{2}X_{3}
en la que:
X_{1} y X_{3} pueden ser iguales o diferentes, y cada uno es una secuencia de aminoácidos que comprende de 0 a 40 residuos de aminoácidos que se dan de forma natural o no natural; X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 100 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 a 36 inclusive o sus derivados de la proinsulina humana; y en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) preclínica o clínica. Las células preferidas incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) células de sangre completa anticoagulada y células de biopsias de tejidos.
La referencia a un "péptido" incluye la referencia a un polipéptido o proteína o a sus partes.
De forma adecuada, X_{2} comprende no menos de alrededor de 10 y no más de alrededor de 50 residuos de aminoácidos, más preferiblemente no menos de alrededor de 10 y no más de alrededor de 30 residuos de aminoácidos, e incluso más preferiblemente no menos de alrededor de 10 y no más de alrededor de 15.
De forma adecuada, X_{2} tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
F F Y T P K T R R E A E D [SEQ ID NO:1]. 
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, también se describe un péptido recombinante o sintético o su equivalente químico que comprende la secuencia:
X_{1}X_{2}X_{3}
\newpage
en la que
X_{1} y X_{2} pueden ser iguales o diferentes, y cada uno es una secuencia de aminoácidos que comprende de 0 a 15 residuos de aminoácidos que se dan de forma natural o no natural; X_{2} es F F Y T P K T R R E A E D o un derivado o equivalente químico suyo, y en la que dicho péptido es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos con DMID preclínica o clínica. Las células preferidas incluyen, pero no se limitan a, CMSPs, células de sangre completa anticoagulada o células de biopsias de tejidos.
El péptido de la presente invención se puede preparar mediante medios recombinantes o sintéticos químicamente. La solicitud describe un péptido recombinante que es preferentemente reactivo inmunológicamente con las células T de individuos con DMID clínica o preclínica, que se prepara mediante la expresión en una célula hospedadora transformada con un casete que codifica las secuencias peptídicas de la presente invención. El péptido se puede fusionar con otro péptido, polipéptido o proteína. De forma alternativa, el péptido se puede preparar mediante técnicas sintéticas químicas, tal como mediante el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield. El péptido sintético o recombinante puede mantener o no la actividad de GAD o la actividad de proinsulina. Además, aunque los péptidos sintéticos de la fórmula proporcionada anteriormente representan una realización preferida, la presente invención también se extiende a preparaciones biológicamente puras de los péptidos naturales o de sus fragmentos. "Biológicamente puras" se refiere a una preparación que comprende al menos alrededor del 60%, preferiblemente al menos alrededor del 70%, más preferiblemente al menos alrededor del 80% y aún más preferiblemente al menos alrededor del 90% o más determinado en peso, actividad u otros medios adecuados.
"DMID preclínica", como se usa aquí, se refiere a aquellos sujetos que pueden ser o pueden no ser familiares de primer grado de alguien con DMID que tienen marcadores genéticos y/o inmunitarios de autoinmunidad hacia las células (\beta) de los islotes pancreáticos. "Marcadores inmunitarios" se considera que incluye, entre otros parámetros conocidos para los expertos en la técnica, los anticuerpos circulantes y/o las células T reactivas con los autoantígenos de las células (\beta) de los islotes.
"Derivados", como se usa aquí, se considera que incluye cualquier sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos única o múltiple, respecto de la secuencia de aminoácidos natural en la molécula nativa de la que deriva el péptido, que incluye cualquier sustitución, deleción y/o adición única o múltiple de otras moléculas asociadas con el péptido, que incluyen carbohidratos, lípidos y/o otros restos proteicos. Tales derivados, por lo tanto, incluyen las formas o moléculas glicosiladas y sin glicosilar con patrones alterados de glicosilación.
La expresión "reaccionar con las células T y modificar la función de las células T", como se usa aquí, se considera que incluye la activación de las células T, la inactivación de las células T y/o la muerte de las células T.
La presente invención también describe análogos químicos de los péptidos en cuestión que incluyen, pero no se limitan a, las modificaciones de las cadenas laterales, la incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados, durante la síntesis del péptido y el uso de agentes entrecruzadores y otros métodos que imponen restricciones conformacionales en los péptidos o sus análogos.
Los ejemplos de las modificaciones de la cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen las modificaciones de grupos amino, tales como mediante alquilación reductora mediante reacción con un aldehído seguido de reducción con NaBH_{4}; amidinación con acetimidato de metilo; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS); acilación de los grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5'-fosfato seguido de reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidino de los residuos de arginina se puede modificar mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo se puede modificar mediante la activación con carbodiimida por medio de la formación de O-acilisourea seguido de derivatización posterior, por ejemplo, hasta una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo se pueden modificar mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación con ácido perfórmico hasta ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercúricos mediante el uso de 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros productos mercúricos; carbamoilación con cianato a pH alcalino.
Los residuos de triptófano se pueden modificar mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los residuos de tirosina, por otra parte, se pueden alterar mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo de imidazol de un residuo de histidina se puede conseguir mediante la alquilación con derivados de ácido yodoacético o la N-carbetoxilación con pirocarbonato de dietilo.
\newpage
Los ejemplos de incorporación de aminoácidos y derivados no naturales durante la síntesis peptídica incluyen, pero no se limitan a, el uso de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicocola, norvalina, fenilglicocola, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienilalanina y/o los isómeros D de los aminoácidos.
Se pueden usar agentes entrecruzadores, por ejemplo, para estabilizar conformaciones en 3D, mediante el uso de entrecruzadores homobifuncionales tales como los imidoésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH_{2})_{n}
con n = 1 a n = 6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que contienen habitualmente un resto aminorreactivo tal como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico de grupo, tal como un resto maleimido o ditio (SH) o carbodiimida (COOH). Además, se pueden restringir conformacionalmente los péptidos mediante, por ejemplo, la incorporación de C_{\alpha} y N_{\alpha}-metilaminoácidos, la introducción de enlaces dobles entre los átomos C_{\alpha} y C_{\beta} de los aminoácidos y la formación de péptidos o análogos cíclicos mediante la introducción de enlaces covalentes para formar un enlace amida entre los extremos N y C, entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el extremo N o C.
También se describe el uso de los péptidos o de sus derivados de la presente invención en el tratamiento de pacientes. A este respecto, tales métodos de tratamiento incluyen su uso como un adsorbente para eliminar los autoanticuerpos o células autorreactivas de un paciente, su uso en la administración directa a un paciente como medio de desensibilización o para inducir la tolerancia inmunológica u otros mecanismos para eliminar o disminuir la reactividad de las células T o de los autoanticuerpos autorreactivos hacia los autoantígenos de DMID, o para generar líneas o clones de células T para usarlas para o como agentes terapéuticos.
Se describe un método de tratamiento que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un péptido durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para eliminar o reducir sustancialmente la presencia o función en dicho sujeto de dichas células T y/o autoanticuerpos autorreactivos hacia autoantígenos de DMID, en el que el péptido comprende la fórmula:
X_{2}
en la que:
X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 1000 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 a 36 inclusive de la proinsulina humana; y
en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) clínica o preclínica. Las células preferidas incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (CMSPs), células de sangre completa anticoagulada y células de biopsias de tejidos.
El método de tratamiento contemplado aquí incluye, pero no se limita a, los siguientes ejemplos. Un primer ejemplo de tratamiento es la desensibilización o la inducción de tolerancia, mediante el uso de una cantidad eficaz de péptido sintético o su derivado para alterar el reconocimiento de las células T o la respuesta a GAD y/o proinsulina y/o otros antígenos de DMID, y/o inducir la supresión o la regulación de las células T. Esto se puede conseguir mediante el uso del efecto conocido de ciertas longitudes de onda ultravioletas, especialmente UV-B, para modificar la presentación del antígeno por medio de la administración cutánea o transmucosa o sistémica. Las cantidades eficaces de los péptidos o sus derivados se aplicarían de forma epicutánea en la piel de los sujetos que exhiben reactividad de las células T de sangre periférica hacia los péptidos o polipéptidos de GAD o proinsulina. Tras la exposición de la piel a la radiación UV-B, el tratamiento se repetiría hasta un momento en el que la reactividad de las células T hacia GAD o proinsulina se inhibiera.
Un segundo ejemplo de tratamiento es inducir la tolerancia mediada por la mucosa mediante el uso de una cantidad eficaz de los péptidos en cuestión o sus derivados para alterar el reconocimiento de las células T o la respuesta a GAD y/o proinsulina y/o otros antígenos de DMID, y/o inducir la inhibición de las células T mediante el uso de una cantidad eficaz de péptido o su derivado para alterar el reconocimiento de las células T o su respuesta a GAD y/o proinsulina y/o otros antígenos de DMID, y/o inducir la supresión de las células T mediante la administración del péptido o sus derivados mediante medios orales, en aerosol o intranasales, entre otras rutas de administración mucosa.
Otro tratamiento implica la aplicación de los péptidos en cuestión en la piel junto con una o más citocinas tales como, pero sin limitarse a, TNF\alpha o \beta. Un tratamiento adicional implica la administración sistémica de péptido soluble por medio de las vías subcutánea o intravenosa para inducir la tolerancia inmunológica. Aún otro tratamiento implica la inmunización de las células T, mediante la cual se generan líneas de células T hacia péptidos o polipéptidos de GAD o proinsulina o sus fragmentos mediante procedimientos estándar, células atenuadas mediante fijación con agentes tales como glutaraldehído o paraformaldehído, lavadas en condiciones estériles y reinyectadas a los pacientes durante un tiempo y en condiciones para provocar la inhibición de la respuesta de las células T endógenas a los autoantígenos. Estas aproximaciones son aplicables a la prevención de la progresión de DMID en sujetos asintomáticos con DMID preclínica o en sujetos con DMID clínica de inicio reciente, así como para la recurrencia de DMID en sujetos que han recibido trasplantes de páncreas, células de los islotes o células productoras de insulina. Estas aproximaciones son aplicables también al síndrome del hombre rígido (SMS) y otras enfermedades en las que GAD y/o la proinsulina es un autoantígeno.
De acuerdo con la presente invención, la cantidad eficaz de péptido es 0,1 \mug a 10 mg por dosis, y preferiblemente 1,0 \mug a 1 mg por dosis. Una dosis puede comprender una administración única o un protocolo que comprende la administración única o múltiple de forma horaria, diaria, semanal o mensual o con otros tiempos adecuados. La administración puede ser mediante cualquier medio conveniente tal como, pero sin limitarse a, administración intravenosa, subcutánea, epicutánea, mediante infusión, oral, tópica, intranasal, en aerosol, en supositorio o intraperitoneal. El péptido se puede administrar solo o en combinación con una o más moléculas activas, tales como las moléculas que facilitan la actividad o la acción del péptido, por ejemplo lipopolisacárido (LPS), cadena \beta de la toxina del cólera, antígeno 3 asociado a la función linfocitaria (LFA-3), otros adyuvantes y, en particular, factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), factor de necrosis tumoral \beta (TNF-\beta) o factor inhibidor de leucemia (LIF).
En una realización, la presente invención contempla el uso de los péptidos descritos aquí para medir la reactividad de las células de un sujeto al autoantígeno de DMID. Los péptidos o sus derivados se pueden añadir en disolución o unidos a un soporte sólido junto con células derivadas de sangre periférica o de biopsias de tejidos sin fraccionar, fraccionadas o derivadas como líneas celulares continuas. La reactividad hacia el autoantígeno se puede medir después mediante ensayos de proliferación estándar, tales como la incorporación de timidina tritiada, ensayos citotóxicos estándar tales como la liberación de radiactividad marcadora desde las células seleccionadas como objetivo, medidas de moléculas expresadas o secretadas tales como marcadores superficiales, citocinas u otros ensayos estándar de reactividad celular que se conocen en la técnica.
Según este aspecto de la presente invención, se proporciona un método para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID, y dicho método comprende poner en contacto un péptido que comprende la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X_{2}
en la que:
X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 100 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 y 36 inclusive de la proinsulina humana; y
en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) preclínica o clínica, y determinar la reactividad mediante un ensayo apropiado. De acuerdo con este ensayo, se puede usar cualquier tipo de células, pero se seleccionan preferiblemente de CMSPs, células de sangre completa anticoagulada o células de biopsias de tejidos.
Preferiblemente, la presente invención contempla un método para ensayar la reactividad de un autoantígeno de un sujeto con DMID, y dicho método comprende poner en contacto un péptido que comprende la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
X_{2}
en la que:
X_{2} es FFYTPKTRREAED y en la que dicho péptido es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos con DMID preclínica o clínica, y determinar la reactividad mediante un ensayo apropiado. Preferiblemente, las células incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (CMSPs), células de sangre completa anticoagulada y células de biopsias de tejidos.
La presente solicitud también describe un equipo diagnóstico para ensayar células T. Se revisten previamente placas de 96 pocillos estándar, como se usan en ELISA, con un anticuerpo monoclonal (MAc) contra una citocina de células T, tal como interferón-\gamma (IFN-\gamma) con o sin antígeno. De forma alternativa, se añade el antígeno en forma soluble junto con alícuotas de sangre periférica, células mononucleares de sangre periférica o células T. Se deja transcurrir la incubación durante uno o más días, se elimina el sobrenadante (que comprende el medio y el plasma) mediante lavado, las células se lavan de nuevo y las placas se revelan con un segundo MAc contra la citocina, tal como anti-IFN-\gamma conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano. Se pueden utilizar una reacción colorimétrica y sistemas de lectura. De forma alternativa, las citocinas solubles (p.ej.: IFN-\gamma) se miden en el sobrenadante mediante ensayos estándar tales como ELISA; además, es posible visualizar microscópicamente mediante la técnica ELISPOT puntos individuales en los fondos de los pocillos que representan la citocina producida por células individuales, por lo que se posibilita la determinación de la frecuencia de células T reactivas hacia el epítopo peptídico.
La presente invención se describirá adicionalmente a continuación con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En las Figuras:
La Figura 1 muestra una comparación de las regiones de similitud entre las proinsulinas y GADs de ratón y humano. Las similitudes están recuadradas; las identidades dentro de los recuadros están sombreadas. El extremo C-terminal de la cadena B de la insulina madura y el sitio de escisión de proinsulina están indicados mediante la línea vertical y la flecha, respectivamente.
La Figura 2 es una representación gráfica que muestra el nivel de proliferación celular expresado como el índice delta tras la estimulación de células mononucleares de sangre periférica tomadas de sujetos en riesgo de DMID (como se describe en el Ejemplo 1) o de sujetos de control con los siguientes péptidos: GAD65 humana (residuos 506-518); proinsulina humana (residuos 24-36); péptido de control irrelevante; o toxoide tetánico (CSL Ltd., Melbourne, Australia).
La Figura 3 es una representación gráfica que muestra la proliferación (media + EEM) de CMSP en respuesta a proinsulina (aa 24-36) e insulina (aa 1-15) en sujetos preclínicos y de control.
La Figura 4 es una representación gráfica que muestra la respuesta de IFN-\gamma (media + EEM) a proinsulina (aa 24-36) y cadena \beta de insulina (aa 1-15) en sujetos preclínicos y de control.
La Figura 5 es una representación gráfica que muestra la respuesta de IL10 (media + EEM) a proinsulina (aa 24-36) y cadena \beta de la insulina (aa 1-15) en sujetos preclínicos y de control.
Se usan las siguientes abreviaturas de una letra y de tres letras para los residuos de aminoácidos:
1
Ejemplo 1 
\global\parskip1.000000\baselineskip
Sujetos
Los sujetos en riesgo de DMID fueron del Estudio Familiar de Prediabetes de Melbourne, Victoria, Australia. Cada uno se incorporó basándose en que tuviera al menos un familiar de primer grado con DMID y anticuerpos contra las células de los islotes (ICA)\geq20 unidades JDF y/o autoanticuerpos contra insulina (IAA)\geq100 nU/ml. Todos tuvieron glucemia en ayunas y hemoglobina glicosilada normales, y se habían sometido a análisis de anticuerpos y análisis metabólicos repetidos a intervalos de seis meses.
Los sujetos de control estaban emparejados por HLA-DR, estaban asintomáticos y no tenían historial de DMID.
Todos los sujetos dieron un consentimiento informado y firmado, y el estudio fue aprobado por la Comisión de Etica del Hospital Real de Melbourne y el Instituto de Investigación Médica Walter and Eliza Hall. Los detalles de los sujetos se describen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Tipificación de HLA y ensayos de ICA, IAA, Ac de GAD, FPIR Tipificación de HLA
Se realizó la tipificación de la clase I de HLA (A, B, C) y la clase II de HLA (DR, DQ) mediante el uso de poblaciones de linfocitos T y B, respectivamente. Las células se aislaron de sangre anticoagulada mediante el uso de microesferas magnéticas (Dynal) revestidas con anticuerpos monoclonales hacia CD8 (clase I) o un determinante monomórfico de la cadena \beta de la clase II (clase II). Las poblaciones celulares enriquecidas se tipificaron en un ensayo de microlinfocitotoxicidad estándar mediante el uso de una batería de 240 alosueros para la clase I y 120 alosueros para la clase II.
Ensayos de anticuerpos
Se ensayaron los ICA mediante el uso de inmunofluorescencia indirecta en páncreas de donante del grupo sanguíneo O. Los títulos, en unidades JDF, se determinaron doblando la dilución de los sueros positivos y mediante comparación con sueros patrón utilizados en cada ensayo. El ensayo se ha incluido en todos los Talleres de Diabetes Internacionales y programas de aptitud.
Los IAA se ensayaron mediante un ensayo de unión radiactiva que se ha estandarizado internacionalmente. El límite superior para los sueros de control normales es 40 nU de insulina unida/ml de suero.
Los anticuerpos de GAD se ensayaron mediante inmunoprecipitación de la actividad enzimática de GAD de extracto de cerebro de lechón. Se usó la media más (tres) 3 DE de 72 sujetos sanos, 460 nU/ml, para definir el intervalo normal.
Liberación de insulina en la primera fase (FPIR)
Se calculó FPIR como la suma de las concentraciones de insulina sérica a los 1 y 3 minutos tras la finalización de la inyección de glucosa intravenosa (0,5 g/kg de peso corporal) a lo largo de 3 minutos.
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Ejemplo 3 Ensayo de proliferación de células T
Se extrajo sangre de sujetos en riesgo de DMID y controles emparejados por HLA-DR al mismo tiempo (en un periodo de 30 minutos) y se procesaron de forma similar para reducir el efecto de la variación diurna y los artefactos de manipulación. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre completa heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech), se lavaron y se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Biosciences Pty Ltd) que contenía Hepes 20 mM (CSL Ltd), 2-mercaptoetanol 10^{-5} M (BDH), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y un 10% v/v de plasma autólogo. Se transfirieron alícuotas de 200 \mul (2x10^{5} células) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo (Falcon) y se incubaron en duplicados de seis con los siguientes péptidos a concentraciones finales de 10, 2, y 0,4 \mug/ml: GAD65 humana (506-518), proinsulina humana (24-36) (sintetizada mediante el uso de un sintetizador modelo 431A de Applied Biosystems (ABI, Foster city, CA), y un péptido de control irrelevante (CRFDPQFALTNIAVRK) (Macromolecular Resources, Fort Collins, CO). Se usó como control positivo el toxoide tetánico (CSL Ltd, Melbourne, Australia) a concentraciones finales de 1,8, 0,18 y 0,018 LfU/ml. Se incluyeron doce pocillos "solamente autólogos" que contenían células pero sin antígeno como control de fondo. Las placas se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado que tenía un 5% v/v de CO_{2} durante 6 días; se añadieron 0,25 \muCi de [^{3}H]timidina (ICN) a cada pocillo durante las últimas 6 horas. Después se recogieron las células en filtros de fibra de vidrio y se midió la radiactividad incorporada mediante recuento de partículas \beta (contador de centelleo liquido modelo 2000 de Packard). Se expresó el nivel de proliferación celular como el índice delta (ID=cuentas medias por minuto (cpm) incorporadas en presencia de antígeno, menos las cpm medias de los pocillos "solamente autólogos").
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Respuestas proliferativas de las células T
Se compararon las respuestas proliferativas de las células T a los péptidos de 13 unidades monoméricas de proinsulina y GAD para diez pares de sujetos en riesgo y de control emparejados por HLA-DR. Se pensó que el emparejamiento por HLA-DR es importante no solamente debido a la especificidad de la unión peptídica a los alelos de la clase II de MHC, sino también debido a la asociación conocida entre la clase II de MHC y DMID. Por lo tanto, las respuestas de las células T reflejarían DMID más que la especificidad del MHC. Las respuestas a la concentración mayor de cada péptido fue significativamente mayor (proinsulina, p<0,008; GAD, p<0,018 - análisis pareado unilateral de Wilcoxon) entre los sujetos en riesgo de DMID que entre los sujetos de control. Los resultados se resumen en la Tabla 2.
La reactividad hacia la secuencia de proinsulina se limitó casi completamente a los sujetos en riesgo de DMID, mientras algunos controles también respondieron al péptido GAD (Tabla 2, Fig. 2). Ambos grupos respondieron de manera similar al tétanos, y ningún sujeto reaccionó al péptido de control no relacionado.
Para seis de estos pares (nºs 1, 2, 3, 5, 6, 7) el ensayo se realizó en una ocasión diferente, pero mediante el uso del doble de células (4x10^{5} por pocillo). El agotamiento de los medios proporcionó resultados poco fiables en tres casos. En dos de los otros tres (n^{os} 5 y 6), los resultados fueron coherentes con los tabulados aquí, mientras en el tercero (nº 3) el sujeto en riesgo exhibió una reactividad mayor a ambos antígenos con el número de células superior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Ensayos de secreción de citocinas por las células T
En una segunda cohorte de 18 individuos en riesgo de DMID y controles emparejados por HLA-DR, se incubaron las CMSPs indicadas en el Ejemplo 3 con proinsulina humana 24-36 y cadena B de insulina humana 1-15 a 0,5, 5 y 50 \mug/ml en las condiciones del Ejemplo 3. Además de recoger las células para la medida de la proliferación mediante la absorción de [^{3}H]-timidina después de 6 días, como en el Ejemplo 3, se tomaron muestras de los medios de incubación sobre las células después de 2 días para la medida de IFN-\gamma e interleucina (IL) 10 mediante métodos de ELISA estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Respuestas de las células T
Se compararon las respuestas proliferativas de las células T y las respuestas secretoras de IFN-\gamma e IL-10 hacia proinsulina humana 24-36 e insulina humana B 1-15 para 18 pares de sujetos en riesgo de DMID y sujetos de control emparejados por HLA-DR. Como para el Ejemplo 4, existió una respuesta proliferativa significativamente superior (p=0,003) de los sujetos en riesgo de DMID hacia el péptido de proinsulina (Figura 3). Además, se incrementaron significativamente tanto la secreción de IFN-\gamma como la de IL-10 en respuesta al péptido de proinsulina (p=0,005 y p=0,001, respectivamente) comparado con los sujetos de control emparejados (Figuras 4, 5).
2
3
4
5 
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: (Fuera de EE.UU.): AMRAD OPERATIONS PTY LTD
\hskip3,9cm
(Solo en EE.UU.): 
\;
HARRISON, L; HONEYMAN, M; 
\hskip6,8cm
RUDY, G; y LEW, A. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moléculas inmunorreactivas e inmunoterapéuticas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: MELBOURNE
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: VICTORIA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: AUSTRALIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 3000
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOPORTE INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT INTERNACIONAL
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-FEB-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PN1239/95
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-FEB-1995
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PN5172/95
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-SEP-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: HUGHES DR, E JOHN L
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: EJH/EK
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: +61 3 9254 2777
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: +61 3 9254 2770
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Trp Tyr Ile Pro Pro Ser Leu Arg Thr Leu Glu Asp}

Claims (20)

1. Un método para ensayar la reactividad de un sujeto hacia un autoantígeno de DMID, y dicho método comprende poner en contacto un péptido que comprende la fórmula:
X_{2}
en la que:
X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 100 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 y 36 inclusive de la proinsulina humana; y
en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen DMID preclínica o clínica, con células de dicho sujeto y determinar la reactividad mediante un ensayo apropiado.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que las células se seleccionan del grupo que comprende CMSPs, células de sangre completa anticoagulada y/o células de biopsias de tejidos.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que un ensayo apropiado incluye un ensayo de proliferación, ensayos citotóxicos, reactividad celular o su combinación.
4. Un método según la reivindicación 1, en el que X_{2} comprende de 10 a 50 residuos de aminoácidos.
5. Un método según la reivindicación 4, en el que X_{2} comprende de 10 a 30 residuos de aminoácidos.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que X_{2} comprende de 10 a 15 residuos de aminoácidos.
7. Un método según la reivindicación 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5, en el que X_{2} comprende la secuencia de aminoácidos: FFYTPKTRREAED.
8. Un método para ensayar la reactividad de un sujeto hacia un autoantígeno de DMID, y dicho método comprende poner en contacto un péptido que comprende la fórmula:
X_{2}
en la que
X_{2} es FFYTPKTRREAED y en la que dicho péptido es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos con DMID preclínica o clínica, con células de dicho sujeto y determinar la reactividad mediante un ensayo apropiado.
9. Un método según la reivindicación 8, en el que las células se seleccionan del grupo que comprende CMSPs, células de sangre completa anticoagulada y/o células de biopsias de tejidos.
10. Un método según la reivindicación 8 ó 9, en el que un ensayo apropiado incluye un ensayo de proliferación, ensayos citotóxicos, reactividad celular o su combinación.
11. El uso de un péptido que comprende la fórmula:
X_{2}
para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID poniendo en contacto dicho péptido con las células de dicho sujeto y determinando la reactividad mediante un ensayo apropiado,
en la que:
X_{2} es cualquier secuencia de aminoácidos de 10 a 100 residuos derivada de, homóloga a, o contigua con, los aminoácidos 24 a 36 inclusive de la proinsulina humana; y
en la que dicha molécula peptídica es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos que tienen DMID preclínica o clínica.
\newpage
12. El uso según la reivindicación 11, en el que las células se seleccionan del grupo que comprende CMPS, células de sangre completa anticoagulada y/o células de biopsias de tejidos.
13. El uso según la reivindicación 11 ó 12, en el que un ensayo apropiado incluye un ensayo de proliferación, ensayos citotóxicos, reactividad celular o su combinación.
14. El uso según la reivindicación 11, en el que X_{2} comprende de 10 a 50 residuos de aminoácidos.
15. El uso según la reivindicación 14, en el que X_{2} comprende de 10 a 30 residuos de aminoácidos.
16. El uso según la reivindicación 15, en el que X_{2} comprende de 10 a 15 residuos de aminoácidos.
17. El uso según la reivindicación 11 ó 12 ó 13 ó 14 ó 15 ó 16, en el que X_{2} comprende la secuencia de aminoácidos: FFYTPKTRREAED.
18. El uso de un péptido que comprende la fórmula:
X_{2}
en la que
X_{2} es FFYTPKTRREAED y en la que dicho péptido es capaz de reaccionar con las células T y modificar la función de las células T cuando se incuba con células de sujetos con DMID preclínica o clínica, para ensayar la reactividad de un sujeto a un autoantígeno de DMID poniendo en contacto dicho péptido con células de dicho sujeto y determinando la reactividad mediante un ensayo de proliferación.
19. El uso de un péptido según la reivindicación 18, en el que las células se seleccionan del grupo que comprende CMSPs, células de sangre completa anticoagulada y/o células de biopsias de tejidos.
20. El uso de un péptido según la reivindicación 18 ó 19, en el que un ensayo apropiado incluye un ensayo de proliferación, ensayos citotóxicos, reactividad celular o su combinación.
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