JPH11500719A - インシュリン依存性糖尿病（ｉｄｄｍ）患者に作用する免疫反応および免疫治療分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般に前臨床または臨床インシュリン依存性ＩＤＤＭ患者の抗体またはＴ細胞と免疫学的に相互作用し得るペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質などの分子に関する。これらの分子は前臨床または臨床インシュリン依存性ＩＤＤＭ患者のＴ細胞と優先的に免疫反応し得、ＩＤＤＭの診断剤、治療剤および予防剤に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）患者に作用する 免疫反応および免疫治療分子 本発明は、前臨床または臨床インシュリン依存性ＩＤＤＭ患者の抗体またはＴ 細胞と免疫学的の相互作用し得るペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質など の分子に関する。これらの分子は前臨床たは臨床インシュリン依存性ＩＤＤＭ患 者のＴ細胞と優先的に免疫反応し得、診断剤、治療剤および予防剤に有効である 。 この明細書中でアミノ酸配列は明細書の末尾で定義された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）をいう。 この明細書中で、特に断らない限り「含む（comprise、comprisesまたはcompr ising）」とは当該要素あるいは整数、または要素あるいは整数の群の包含をい い、他の要素あるいは整数、または要素あるいは整数の群の排除をいうものでは ない。 インシュリン依存性糖尿病は、恐らくβ細胞自己抗原を認識するＴ細胞によっ て伝達されるインシュリン分泌β細胞の破壊をもたらす重大な疾患である。ＩＤ ＤＭに特徴的なＴ細胞伝達β細胞破壊に関連する重要な抗原は２種の主要な異性 体の形態のＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７として存在するグルタミン酸デカルボキ シラーゼ（glutamic acid decarboxylase：ＧＡＤ）である。これら２種の異性 体はアミノ酸配列のレベルで約６５％の類似性を有している。ＩＤＤＭまたはこ の疾患の危険性の高い患者は自己抗体をもっており、自己反応性Ｔ細胞はＧＡＤ インシュリンまたは両方の自己抗原に反応する。特発性ＩＤＤＭの動物モデルで あるＮＯＤマウスにおいて、ＧＡＤは最有力の早期標的抗原である(Tisch et al .，Nature 366:72-75，1993)。β細胞自己免疫に関与する病原性自己抗原のイム ノドミナントエピトープの同定はＩＤＤＭの予防のための診断および治療方針の 方法改善につながるものである。 本発明の糸口になる研究において、本発明者らはＧＡＤおよびプロインシュリ ン分子のイムノドミナントエピトープを同定し、現在の診断操作を改善し、さら にＩＤＤＭの治療および予防組成物および処置方法を開発しようとした。 本発明においては、ペプチドは、ヒトＧＡＤ６５（アミノ酸残基５０６−５１ ８）およびヒトプロインシュリン（アミノ酸残基２４−３６）と高い類似性を有 する１３個のアミノ酸領域に基づいて合成された。この類似性の領域はヒトＧＡ Ｄ６７およびマウスプロインシュリンおよびマウスＧＡＤ類に及んでいる（Ｆig .１）。これらのペプチド類の免疫反応性は本発明により前臨床または臨床ＩＤ ＤＭの患者の末梢血細胞または末梢血から得られたＴ細胞の相互作用に基づいて 同定され、これによって、新しい領域のＩＤＤＭの診断、治療および予防方法の 基礎を形成することになる。 従って、本発明の１つの態様は、配列 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜４０個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよく； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８を含むかまたはそれらの誘 導体、および／またはヒトプロインシュリンのアミノ酸２４〜３６を含むかまた はそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している１０〜１ ００個の残基のアミノ酸配列である） を含み、ペプチド分子が前臨床または臨床インシュリン依存性糖尿病（Insulin- Dependent Diabetes Mellitus：ＩＤＤＭ）患者からの細胞とインキュベートし たとき、Ｔ−細胞と反応し得、Ｔ−細胞機能を修飾し得ることを特徴とする組換 または合成のペプチド分子またはそれらの化学的均等物を提供するものである。 好ましい細胞は、これに限定されるものではないが、末梢血単核細胞（periph eral blood mononuclear cells：ＰＢＭＣ_S）、抗凝固性全血および組織生検細 胞である。 「ペプチド」の意味はポリペプチドあるいはタンパク質またはそれらの部分と いう意味を含む。 好ましい具体例において、Ｘ₂は約１０より少なくなく約５０より大きくない アミノ酸残基であり、より好ましくは約１０より少なくなく約３０より大きくな いアミノ酸残基であり、最も好ましくは約１０より少なくなく約１５より大きく ないアミノ酸残基である。 特に好ましいＸ₂の具体例は、下記の配列： ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１］、または ＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２］ のいずれかを有するものである。 好ましい具体例によれば、配列 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜１５個の天然また は非−天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよく； Ｘ₂は、ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤおよびＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤまた はそれらの誘導体あるいは化学的均等物から選ばれる）を含み、ペプチド分子が 前臨床または臨床ＩＤＤＭ患者からの細胞とインキュベートしたとき、Ｔ−細胞 と反応し得、かつＴ−細胞機能を修飾し得るをことを特徴とする組換または合成 ペプチド分子またはそれらの化学的均等物を提供し、適当な試験方法によって反 応性を測定する。 好ましい細胞はこれに限定されるものではないが、ＰＢＭＣ_s、抗凝固性全血 および／または組織生検細胞であり、適当な試験方法によって反応性を測定する 。 本発明のペプチドは組換または化学的合成手段によって製造することができる 。本発明の好ましい態様によれば、臨床的または前臨床的ＩＤＤＭ患者からのＴ 細胞と優先的に免疫学的に反応し得る組換ペプチド提供するものであり、これは 本発明のペプチド配列をコードしたカセットで形質転換された宿主細胞の発現に よつて製造される。このペプチドは、別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパ ク質と融合することができる。別法として、ペプチドはメリフィールド固相合成 方法などの化学的合成技術によって製造することができる。この合成または組換 ペプチドはＧＡＤ活性またはプロインシュリン活性を保持していてもよいし、し て いなくてもよい。さらに、上記式を有する合成ペプチドは好ましい具体例を示し ているが、本発明はまた、天然由来のペプチドまたはそれらのフラグメントの生 物学的に純粋な製剤に及ぶ。「生物学的に純粋な」とは、重量％で少なくとも約 ６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、 さらに好ましくは少なくとも約９０％またはそれ以上の活性または他の適切な手 段を含む製剤を意味する。 この明細書で用いられる「前臨床的（症状発現前）」とは、膵島（β）細胞自 己免疫の遺伝性および／または免疫マーカーを有するＩＤＤＭ患者のだれかの一 親等の親類であってもよくまたそうでなくてもよい。「免疫マーカー」とは、膵 島（β）細胞自己抗原と反応し得る循環抗体および／またはＴ細胞を含むとりわ け当業者に公知のパラメーターを意味する。 この明細書に用いられる「誘導体」とは、ペプチドが誘導される天然分子中の 天然由来のアミノ酸配列に関して、なんらかの単一または複数のアミノ酸の置換 、削除および／または付加を含むことを意味し、ペプチドと結合した他の分子の なんらかの単一または複数の置換、削除および／または付加を含み、炭水化物、 脂質および／または他のタンパク質性部分を含むことを意味する。従って、この ような誘導体は変化したグリコシル化様式のグリコシル化または非グリコシル化 形態または分子を含む。 この明細書で用いられる「Ｔ細胞と反応し、かつＴ細胞機能を修飾する」とは 、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の不活性化および／またはＴ細胞の死滅を含むことを いう。 本発明はまた、当該ペプチドの化学的類似体であって、これに限定されるもの ではないが、ペプチド合成中の側鎖の修飾、非天然アミノ酸および／またはそれ らの誘導体の組み込み、ペプチドまたはそれらの類似体に構造的拘束を課す架橋 結合体または他の方法の使用を包含する。 本発明の意図する側鎖の修飾の例は、アルデヒドとの反応ついでＮａＢＨ₄を 用いる還元による還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミド化； 酸無水物によるアシル化；シアナートによるアミノ基のカルバモイル化；２,４, ６トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベン ジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル 化；およびピリドキサール−５'−ホスフェートによるリジンのピリドキシル化 ついでＮａＢＨ₄による還元、などのアミノ基の修飾を含む。 アルギニン残基のグアニジン基は２,３−ブタンジオン、フェニルグリオキサ ールおよびグリオキサールなどの試剤によるヘテロ環縮合生成物の形成によって 修飾してもよい。 カルボキシル基はＯ−アシルイソウレア形成を経てカルボジイミド活性化つい で、例えば対応するアミドなどへの誘導体化によって修飾してもよい。 スルヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシル メチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物による混合ジスル ヒドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドによる反応 ；４−クロロ水銀ベンゾエート、４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル 水銀クロリド、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を 用いる水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアナートによるカルバモイル化 などの方法によって修飾することができる。 トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化又は２ −ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド若しくはスルフェニルハライドによ るインドール環のアルキル化により修飾することができる。他方、チロシン残基 は、テトラニトロメタンによるニトロ化により改変し、３−ニトロチロシン誘導 体を形成することができる。 ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル 化又はジエチルピロカーボネートによるＮ−カルベトキシ化によって行うことが できる。 ペプチド合成において導入する、非天然アミノ酸及び誘導体の例には、ノルロ イシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン 酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシ ン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタ ン酸、２−チエニルアラニン及び／又はアミノ酸のＤ−異性体の使用が含まれる がこれらに限定されない。 例えば、ｎ＝１〜６である（ＣＨ₂）_nスペーサー（spacer）基を有する二官能 イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル のようなホモ二官能性架橋剤、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ 反応性部分と、マレイミドのような基特異的反応性部分又はジチオ部分（ＳＨ） 又はカルボジイミド（ＣＯＯＨ）を、通常含んでいるヘテロ二官能性分子試薬を 使用して、三次元コンフォメーションを安定化させるために架橋剤を使用するこ とができる。さらにペプチドは、例えば、Ｃ_α及びＮ_α−メチルアミノ酸の導入 、アミノ酸のＣ_α原子とＣ_β原子との間の二重結合の導入、及びＮ−末端とＣ− 末端との間、２つの側鎖間、又は側鎖とＮ−末端もしくはＣ−末端との間の、ア ミド結合の形成のような共有結合の導入による環状ペプチド又は類似体の形成に よって、立体配座的に束縛することができる。 本発明はまた、患者の処置における、本発明のペプチド又はその誘導体の使用 を提供する。この態様において、このような処置方法には、患者由来の自己抗体 又は自己反応性細胞を除去するための吸着剤としてのその使用、又はＩＤＤＭ自 己抗原に対する自己反応性Ｔ細胞若しくは自己抗体の反応性を除去若しくは減少 させるための、又は治療剤のために若しくは治療剤として使用するＴ細胞系若し くはクローンを生じさせるための免疫寛容または他の機構を脱感作し、又は誘導 する手段としての、患者への直接投与におけるその使用を包含する。 本発明のこの態様によれば、患者における自己反応性Ｔ細胞および／またはＩ ＤＤＭ自己抗原に対する自己抗体の存在または機能を除去または実質的に減少さ せるためのペプチドまたはその化学的均等物を十分な量、期間および条件下で投 与することを含む処置方法であって、上記ペプチドが、 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜４０個の天然また は非−天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８を含むかまたはそれらの誘 導体、および／またはヒトプロインシュリンのアミノ酸２４〜３６を含むかまた はそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している１０〜１ ００個の残基のアミノ酸配列である）を含み、前臨床またはインシュリン−依存 性糖尿病（Insulin-Dependent Diabetes Mellitus：ＩＤＤＭ）患者からの細胞 とインキュベートしたとき、Ｔ−細胞と反応し得、かつＴ−細胞機能を修飾し得 るものであることを特徴とする方法を提供する。好ましい細胞には、末梢血単核 球細胞（ＰＢＭＣ）、抗凝固性全血及び組織生検細胞が含まれるがこれらに限ら れない。 本明細書において意図される処置の方法には、以下の例が含まれるがこれらに 限られない。処置の第１の例は、有効量の合成ペプチド又はその誘導体を用いる 脱感作又は耐性導入であり、ＧＡＤ及び／又はプロインスリン及び／又は他のＩ ＤＤＭ抗原のＴ細胞認識、又は、これらに対する応答を改変し、及び／又はＴ細 胞抑制若しくは調節を誘導する。これは、ある紫外線波長、特にＵＶ−Ｂの公知 の作用を使用することによって達成され、皮膚又は粘膜を介する、あるいは全身 的な投与によって抗原呈示を改変する。有効量のペプチド又はその誘導体を、Ｇ ＡＤ又はプロインスリンペプチド又はポリペプチドに対する末梢血Ｔ細胞反応性 を示している患者の皮膚に対して上皮に適用する。ＵＶ−Ｂ照射に皮膚を暴露し た後、ＧＡＤ又はプロインスリンに対するＴ細胞反応性が抑制される時まで処置 を繰り返す。 処置の第２の例は、目的のペプチド又はその誘導体の有効量を使用して、ＧＡ Ｄ及び／又はプロインスリン及び／又は他のＩＤＤＭ抗原のＴ細胞認識、又は、 これらに対するＴ細胞応答を改変する、粘膜を介した耐性の誘導、及び／又はペ プチド又はその誘導体の有効量を使用してＧＡＤ及び／又はプロインスリン及び ／又は他のＩＤＤＭ抗原のＴ細胞認識、又はこれらに対するＴ細胞応答を改変す る、Ｔ細胞抑制の誘導、及び／又は、経口、エアロゾル又は経鼻、とりわけ粘膜 投与の手段による、ペプチド又はその誘導体の投与によるＴ細胞抑制の誘導であ る。 別の処置には、ＴＮＦα又はβのような、しかしこれらに限定されない１又は それ以上のサイトカインと共に、皮膚に当該ペプチドを適用することが含まれる 。さらなる処置には、免疫寛容を誘導するための、皮下又は静脈内経路による、 可溶性ペプチドの全身的投与が含まれる。別の処置には、Ｔ細胞免疫化が含まれ 、該処置においては、標準的な手法によってＧＡＤ又はプロインスリンペプチド 又はポリペプチド又はその断片に対するＴ細胞系を作出し、細胞をグルタルアル デヒド又はパラホルムアルデヒド等の試薬による固定によって弱毒化（attenuat ed）し、滅菌条件下で洗浄し、一定期間且つ自己抗原に対する外因性Ｔ細胞応答 の抑制をもたらす条件下で患者に再注入する。これらの解決手段は、前臨床（症 状発現前）ＩＤＤＭである無症状の患者、又は臨床（症状が発現したばかりの） 患者におけるＩＤＤＭの進行の阻止、並びに膵臓、膵島細胞又はインスリン産生 細胞の移植を受けた患者におけるＩＤＤＭの再発に適用可能である。これらの解 決手段はまた、Stiff Man Syndrome（ＳＭＳ）及びＧＡＤ及び／又はプロインス リンが自己抗原となる他の疾患にも適用可能である。 本発明によれば、有効量のペプチドは、１回の投与量あたり、０.１μg〜１０ ｍgであり、好ましくは１回の投与量あたり１.０μg〜１ｍgである。投与量は、 単独投与、又は単独又は時間ごとの、日ごとの、週ごとの又は月ごとの又は他の 適当な時間での複数の投与からなるプロトコルを構成し得る。投与は、静脈内、 皮下、上皮、注入、経口、局所、鼻内、エアロゾル、坐剤又は腹腔内投与のよう な、しかしこれらに限られない、いずれの便利な手段によるものでもよい。ペプ チドを単独でか、又は１又はそれ以上の、ペプチドの活性又は作用を促進する分 子のような活性分子、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）、コレラトキシンβ−鎖、リン パ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、他のアジュバント及び特に腫瘍壊死因子 α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、又は白血病阻害因子（ＬＩＦ） と共に投与してよい。 さらなる態様において、本発明は、ＩＤＤＭ抗原に対する患者の細胞の反応性 を測定するための、本明細書記載のペプチドの使用を包含する。このペプチド又 はその誘導体を、分画されていないか、分画されたか又は継続的な細胞系として 得られる、末梢血又は組織生検に由来する細胞と共に、溶液に加えるか、又は固 体の担体に結合させることができる。次に、自己抗原に対する反応性を、トリチ ウム化したチミジンを導入するような標準的な増殖アッセイ、標的細胞からのマ ーカー放射能の放出などの標準的な細胞毒性アッセイ、表面マーカー、サイトカ インなどの発現した又は分泌された分子の測定、又は当技術分野で周知の、他の 標準的な細胞の反応性のアッセイにより測定する。 本発明のこの態様によれば、ＩＤＤＭ自己抗原に対する患者の反応性を分析す る方法が提供される。この方法は、式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ ［式中、Ｘ₁とＸ₃は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ０〜４０の天然又 は非天然アミノ酸残基を含んでなるアミノ酸配列であり； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８若しくはその誘導体及び／又 はヒトプロインスリンのアミノ酸２４〜３６若しくはその誘導体に、由来するか 、相同であるか、又はその範囲内において隣接する、１０〜１００残基のアミノ 酸配列であって； 該ペプチド分子は、症状発現前又は臨床的インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ ）を有する患者に由来する細胞とインキュベーションしたときに、Ｔ細胞と反応 し、Ｔ細胞機能を改変することが可能である］ で示されるペプチド又はその化学的等価物を接触させること、及び適当なアッセ イにより反応性を測定することを含んでなる。このアッセイによれば、いずれの 種類の細胞も使用し得るが、ＰＢＭＣ細胞、抗凝固性全血細胞又は組織生検細胞 から選択するのが好ましい。 好ましくは、本発明は、ＩＤＤＭ自己抗原に対する患者の反応性を分析する方 法を包含する。該方法は、式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ ［式中、Ｘ₁とＸ₃は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ０〜１５の天然又 は非天然アミノ酸残基を含んでなるアミノ酸配列であり； Ｘ₂は、ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ及びＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤ又はその 誘導体若しくは化学的等価物から選択され； 該ペプチドは、症状発現前又は臨床的ＩＤＤＭを有する患者に由来する細胞と インキュベーションしたときに、Ｔ細胞と反応し、Ｔ細胞機能を改変することが 可能である］ で示されるペプチド又はその化学的等価物を接触させること、及び適当なアッセ イによる反応性の測定を含んでなる。好ましくは、細胞には、末梢血単核球細胞 （ＰＢＭＣ）、抗凝固性全血及び組織生検細胞が含まれるがこれらに限られない 。 本発明の別の態様においては、Ｔ細胞を分析するための診断キットが提供され る。標準的な９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡにおいて使用するように、抗原 と共に又は抗原なしで、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）のようなＴ細胞サ イトカインに対するモノクローナル抗体（ＭＡb）でプレ‐コートする。別法と して、抗原を、一部の末梢血、末梢血単核球細胞又はＴ細胞と共に可溶性の形態 で加える。１日又はそれ以上インキュベーションし、上清（媒体及び血漿を含む ）及び細胞を洗浄し、ウェルを再び洗浄して、プレートを、アルカリホスファタ ーゼ又は西洋ワサビ大根ペルオキシダーゼとコンジュゲートした、抗γ−ＩＦＮ のようなサイトカインに対する標識第２ＭＡbで顕色化を行う。次に、発色反応 と読み取りシステムが利用できる。別法として、可溶性サイトカイン（例えば、 γ−ＩＦＮ）を、ＥＬＩＳＡのような標準的アッセイにより上清中で測定する。 さらにこの方法は、ＥＬＩＳＰＯＴ技術により、単独の細胞レベルで、産生した サイトカインを示すウェルの底の個々のスポットを顕微鏡で見ることが可能であ り、それによってペプチド‐エピトープ反応性Ｔ細胞の頻度を測定することが可 能になる。 ここに、以下の、限定を意図しない図面及び実施例を引用して本発明をさらに 記載する。 図面において： 第１図は、プロインスリン及びＧＡＤの、マウスとヒトとの間の類似領域の比 較を示す。類似部分を枠で囲み；枠内の同一部分に影を付した。成熟インスリン Ｂ−鎖のＣ−末端とプロインスリン開裂部位を、それぞれ縦線と矢印で示した。 第２図は、At-risk(危険性のある)ＩＤＤＭ（実施例１に記載）の、又はコン トロール(対照)の患者から得た末梢血単核球細胞の、以下のペプチドによる刺激 後の、デルタスコアとして表した細胞増殖のレベルを示すグラフである。ヒトＧ ＡＤ６５（残基５０６〜５１８）；ヒトプロインスリン（残基２４〜３６）；無 関係な対照ペプチド；又はテタヌストキソイド（ＣＳＬ社、メルボルン、オース トラリア）。 第３図は、前臨床(症状発現前)及びコントロールの患者におけるプロインスリ ン（アミノ酸２４〜３６）及びインスリン（アミノ酸１〜１５）に対するｐｂｍ ｃの増殖（mean＋sem）を示すグラフである。 第４図は、前臨床(症状発現前)及びコントロールの患者における、プロインス リン（アミノ酸２４〜３６）及びインスリンβ−鎖（アミノ酸１〜１５）に対す るＩＦＮ−γ応答（mean＋sem）を示すグラフである。 第５図は、前臨床及びコントロールの患者における、プロインスリン（アミノ 酸２４〜３６）及びインスリンβ−鎖（アミノ酸１〜１５）に対するＩＬ１０応 答（mean＋sem）を示すグラフである。 下記の１文字記号および３文字省略番号はアミノ酸残基に用いられている。 実施例１ 被験者 ＩＤＤＭリスク（At-risk：危険性のある）を有する被験者は、オーストラリ ア、ビクトリアのメルボルン前糖尿病ファミリー・スタディーより得た。各被験 者は、少なくとも１人のＩＤＤＭの１親等の親類がおり、膵島細胞抗体（ＩＣＡ ）≧２０ＪＤＦユニットおよび／またはインスリン自己抗体（ＩＡＡ）≧１００ ｎＵ／mlを有することに基づいて選ばれた。すべての被験者は、絶食時に血中グ ルコースおよびグリコヘモグロビンが正常になる患者であって、６カ月間隔で抗 体および代謝物テストを繰り返した。 コントロール被験者は、ＨＬＡ−ＤＲマッチングされ、無症候かつＩＤＤＭ歴 のないものを採用した。 すべての被験者は実験について告知され署名して承諾した。実験は、ロイヤル ・メルボルン病院ならびにウォルター・アンド・エリザ・ホール・インスティチ ュート・オブ・メディカル・リサーチの倫理委員会によって認可された。被験者 の詳細を表１に示す。 実施例２ ＨＬＡ型判定およびＩＣＡ、ＩＡＡ、ＧＡＤ、Ａｂ、ＦＰＩＲアッセイ ＨＬＡ型判定： それぞれＴリンパ球およびＢリンパ球の集団を用いて、ＨＬＡクラスＩ（Ａ、 Ｂ、Ｃ）およびＨＬＡクラスＩＩ（ＤＲ、ＤＱ）の型判定を行った。ＣＤ８（ク ラスＩ）に対するモノクローナル抗体またはクラスＩＩβ鎖（クラスＩＩ）上の 単形性決定基でコーティングした磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ製）を用いて抗凝固血 液から該細胞を単離した。クラスＩに対しては２４０アロ血清を用い、クラスII に対しては２４０アロ血清を用いる標準のミクロリンパ球毒性アッセイにて富化 細胞集団を型判定した。 抗体アッセイ： Ｏ型血液のドナーの膵臓における間接的免疫蛍光法を用いてＩＣＡをアッセイ した。ＪＤＦユニットで、陽性の血清の２倍希釈および各アッセイにおける標準 血清との比較を行って力価を定量した。該アッセイはインターナショナル・ダイ アビーティーズ・ワークショップおよび熟達プログラムに含まれている。 国際的に標準化されている放射結合アッセイによってＩＡＡを試験した。正常 コントロール血清の上限は、インスリン結合４０ｎＵ／血清mlである。 子ブタ脳抽出物を用い、免疫沈降法にてＧＡＤの酵素活性を測定することによ りＧＡＤ抗体を試験した。７２人の健康な被験者の平均プラス３ＳＤ、４６０ｎ Ｕ／mlを用いて正常領域を決定した。 第１相インスリン放出（First Phase Insulin Release:ＦＰＩＲ）： ３分間のグルコース（０．５g／体重kg）静注完了後１分および３分の時点で の血清インスリン濃度の合計としてＦＰＩＲを算出した。 実施例３ Ｔ細胞増殖アッセイ ＩＤＤＭリスク被験者およびＨＬＡ−ＤＲマッチングコントロールから血液を 同じ時間（３０分以内）に採取し、日常的変化や操作による人工物の影響を低減 するために同様に処理した。Ficoll-Paque（ファルマシア・バイオテック製）密 度遠心分離により、ヘパリン化全血から末梢血管単核細胞を単離し、洗浄し、次 いで、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ＣＳＬ・リミテッド製）、１０^-5Ｍの２−メルカ プトエタノール（ＢＤＨ）、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン （１００μg／ml）および１０％ v／v自己血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地（バ イオサイエンシーズ・プチ・リミテッド製）に再懸濁する。２００μl（２×１ ０⁵細胞）のアリコートを９６ウエルの丸底プレート（Falcon製）に移し、最終 濃度１０、２および０．４μg／mlとなるようにした次のペプチドとともに６個 ずつインキュベートする：ヒトＧＡＤ６５（５０６−５１８）、ヒトプロインス リン（２４−３６）（アプライド・バイオシステムズ・モデル４３１Ａセンセサ イザー（ＡＢＩ、フォスター・シティ、ＣＡ）を用いて合成したもの）および無 関係な対照ペプチド（ＣＲＦＤＰＱＦＡＬＴＮＩＡＶＲＫ）（マクロモレキュラ ー・リソーシーズ、フォート・コリンズ、ＣＯ）。最終濃度１.８、０.１８およ び０.０１８ＬfＵ／mlの破傷風トキソイド（ＣＳＬ・リミテッド製、メルボルン 、オーストラリア）を陽性対照として用いた。細胞は含むが抗原は含まない１２ 個の“自己のみ”のウエルをバックグラウンドコントロールとしてインキュベー トした。５％v／vＣＯ₂湿潤インキュベーターにて３７℃で６日間プレートをイ ンキュベートした；最後の６時間、各ウエルに０．２５μＣｉの［³Ｈ］チミジ ン（ＩＣＮ）を加えた。次いで、細胞を採取してガラス繊維フィルターに乗せ、 取り込まれた放射活性をβ粒子計数装置で測定した（パッカード・モデル２００ ０液体シンチレーションカウンター）。細胞増殖のレベルを、デルタスコア（Ｄ Ｓ＝抗原 の存在下に取り込まれた、１分あたりの平均カウント数（ｃｐｍ）−“自己のみ ”ウエルの平均ｃｐｍ）で示した。 実施例４ Ｔ細胞増殖応答 プロインスリンおよびＧＡＤ由来の類似の１３量体ペプチドに対するＴ細胞増 殖応答をに１０組のＨＬＡ−ＤＲマッチングしたリスク被験者およびコントロー ル被験者ついて比較した。ＨＬＡ−ＤＲマッチングは、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺 伝子に結合するペプチドの特異性のためだけでなく、ＭＨＣクラスIIとＩＤＤＭ の間の公知の関連性のためからも、重要であると考えらえた。したがって、Ｔ細 胞応答は、ＭＨＣ特異性よりもむしろＩＤＤＭを反映するものである。最高濃度 のどのペプチドに対する応答も、ＩＤＤＭリスク被験者の方がコントロール被験 者よりも有意に大きかった（プロインスリン，ｐ＜０．００８；ＧＡＤ，ｐ＜０ ．０１８−ウィルコクソンのワン・テイルド（one-tailed）一対分析）。結果を 表２にまとめる。 プロインスリン配列に対する反応性は、ほとんど完全にＩＤＤＭリスク被験者 に限定されたが、一方、幾つかのコントロールもまたＧＡＤペプチドに応答した （表２、図２）。両方のグループが同様に破傷風に応答し、無関係なコントロー ルペプチドに反応した被験者はなかった。 これらの６つの組（＃１，２，３，５，６，７）について、ウエル中の細胞数 を２倍にして（４×１０⁵個／ウエル）、別にアッセイを行った。３つのケース において、培地の消耗により信頼できない結果をもたらした。他の３つのうち２ つのケースにおいて（＃５および６）、結果は表にしたと一致したが、＃３にお いては、リスク被験者は、細胞数の多い方が、両方の抗原に対して、より大きな 反応性を示した。 実施例５ Ｔ細胞サイトカイン分泌アッセイ １８組のＩＤＤＭリスクおよびＨＬＡ−ＤＲマッチングコントロールからなる 第２の集団において、実施例３で示したＰＢＭＣｓを、実施例３と同様な条件下 にて、それぞれ０.５、５および５０μg／mlのヒトプロインスリン２４−３６お よびヒトインスリンＢ鎖１−１５とともにインキュベートした。実施例３で述べ たような、［³Ｈ］チミジン摂取による増殖を測定するために６日後に細胞を採 取することに加えて、ＩＦＮ−γおよびインターロイキン−（ＩＬ−）１０を標 準的ＥＬＩＳＡ法で測定するために、２日後に細胞上のインキュベーション培地 をサンプリングした。 実施例６ Ｔ細胞応答 １８組のＨＬＡ−ＤＲマッチングＩＤＤＭリスク被験者およびコントロール被 験者について、ヒトプロインスリン２４−３６およびヒトインスリンＢ１−１５ に対するＴ細胞増殖応答ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０分泌応答を比較し た。実施例４に述べたように、ＩＤＤＭリスク被験者がプロインスリンペプチド （図３）に対して有意に大きな（ｐ＝０.００３）増殖応答を示した。さらに、 プロインスリンペプチドに応答してＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の両方の分泌が 、マッチングしたコントロール被験者と比較して、有意に（それぞれｐ＝０.０ ０５およびｐ＝０.００１）増加した（図４，５）。 当業者であれば、特記されたもの以外にも、本明細書に記載の発明に変化や修 飾を加え得ることが理解されよう。このような変化や修飾のすべてが本発明に包 含されることを理解すべきである。また本発明には、明細書中に言及あるいは提 示したすべてのステップ、特徴、組成物および化合物が、個々に、あるいは集合 的に包含され、該ステップあるいは特徴の２つ以上のいずれの組み合わせのすべ てもまた本発明に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/564 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＰ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルーディ，ジョージ オーストラリア3146ビクトリア州 グレ ン・アイリス、オズボーン・アベニュー 10／３番 (72)発明者 ルー，アンドリュー オーストラリア3040ビクトリア州 エッセ ンドン、ワーナー・ストリート13番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜４０個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８を含むかまたはそれらの誘 導体、および／またはヒトプロインシュリンのアミノ酸２４〜３６を含むかまた はそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している１０〜１ ００個の残基を有するアミノ酸配列である） を含み、ペプチド分子が、前臨床または臨床インシュリン依存性糖尿病（Insuli n-Dependent Diabetes Mellitus：ＩＤＤＭ）患者からの細胞とインキュベート したとき、Ｔ細胞と反応し得、かつＴ細胞機能を修飾し得ることを特徴とする組 換または合成のペプチド分子またはそれらの化学的均等物。 ２．Ｘ₂が１０〜５０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項１記載のペ プチド分子。 ３．Ｘ₂が１０〜３０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項２記載のペ プチド分子。 ４．Ｘ₂が１０〜１５個のアミノ酸残基を含むものである、請求項３記載のペ プチド分子。 ５．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ を含むものである、請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド分子。 ６．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤ を含むものである、請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド分子。 ７．配列 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜１５個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得； Ｘ₂は、ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤおよびＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤまた はそれらの誘導体あるいは化学的均等物から選ばれる）を含み、ペプチド分子が 、前臨床または臨床ＩＤＤＭ患者からの細胞とインキュベートしたとき、Ｔ細胞 と反応し得、かつＴ細胞機能を修飾し得ることを特徴とする組換または合成のペ プチド分子またはそれらの化学的均等物。 ８．患者のＩＤＤＭ自己抗原に対する反応性を検査する方法であって、上記方法 が、 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜４０個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８を含むかまたはそれらの誘 導体、および／またはヒトプロインシュリンのアミノ酸２４〜３６を含むかまた はそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している１０〜１ ００個の残基のアミノ酸配列である）を含み、前臨床または臨床ＩＤＤＭ患者か らの細胞とインキュベートしたとき、Ｔ細胞と反応し得、かつＴ細胞機能を修飾 し得るペプチドまたはそれらの化学的均等物を上記患者からの細胞と接触させ、 適当な試験方法によって反応性を測定することを特徴とする方法。 ９．細胞がＰＢＭＣ_s、抗凝固全血および／または組織生検細胞から選ばれる ものである、請求項８記載の方法。 10．適当な試験方法が、増殖試験方法、細胞毒試験方法、細胞反応性またはそ れらの組み合わせである、請求項８または９記載の方法。 11．Ｘ₂が１０〜５０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項８記載の方 法。 12．Ｘ₂が１０〜３０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項１１記載の 方法。 13．Ｘ₂が１０〜１５個のアミノ酸残基を含むものである、請求項１２記載の 方法。 14．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ を含むものである、請求項８〜１２のいずれか１項記載の方法。 15．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤ を含むものである、請求項８〜１２のいずれか１項記載の方法。 16．患者のＩＤＤＭ自己抗原に対する反応性を検査する方法であって、上記方 法が、式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜１５個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり； Ｘ₂は、ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤおよびＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤまた はそれらの誘導体あるいは化学的均等物から選ばれる）を含み、前臨床または臨 床ＩＤＤＭ患者からの細胞とインキュベートしたとき、Ｔ細胞と反応し得、かつ Ｔ細胞機能を修飾し得る、ペプチドまたはその化学的均等物を上記患者からの細 胞と接触させ、適当な試験方法によって反応性を測定することを特徴とする方法 。 17．細胞がＰＢＭＣ_s、抗凝固全血および／または組織生検細胞から選ばれる ものである、請求項１６記載の方法。 18．適当な試験方法が、増殖試験方法、細胞毒試験方法、細胞反応性またはそ れらの組み合わせである、請求項１６または１７記載の方法。 19．式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜４０個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８を含むかまたはそれらの誘 導体、および／またはヒトプロインシュリンのアミノ酸２４〜３６を含むかまた はそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している１０〜１ ００個の残基のアミノ酸配列である） を含み、前臨床または臨床インシュリン依存性糖尿病（Insulin-Dependent Diab etes Mellitus：ＩＤＤＭ）患者からの細胞とインキュベートしたとき、Ｔ細胞 と反応し得、かつＴ細胞機能を修飾し得る、ペプチドまたはその化学的均等物を 上記患者からの細胞と接触させ、適当な試験方法によって反応性を測定すること による、患者のＩＤＤＭ自己抗原に対する反応性測定のためのペプチドまたは化 学的均等物の使用。 20．細胞がＰＢＭＣ_s、抗凝固全血および／または組織生検細胞から選ばれる ものである、請求項１９記載の使用。 21．適当な試験方法が、増殖試験方法、細胞毒試験方法、細胞反応性またはそ れらの組み合わせである、請求項１９または２０記載の使用。 22．Ｘ₂が１０〜５０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項１９記載の 使用。 23．Ｘ₂が１０〜３０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項２２記載の 使用。 24．Ｘ₂が１０〜１５個のアミノ酸残基を含むものである、請求項２３記載の 使用。 25．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ を含むものである、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の使用。 26．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤ を含むものである、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の使用。 27．式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜１５個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得； Ｘ₂は、ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤおよびＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤまた はそれらの誘導体あるいは化学的均等物から選ばれる）を含み、前臨床または臨 床ＩＤＤＭ患者からの細胞とインキュベートしたとき、Ｔ細胞と反応し得、かつ Ｔ細胞機能を修飾し得る、ペプチドまたはその化学的均等物を上記患者からの細 胞と接触させ、適当な試験方法によって反応性を測定することによる、患者のＩ ＤＤＭ自己抗原に対する反応性を検査するためのペプチドまたは化学的均等物の 使用。 28．細胞がＰＢＭＣ_s、抗凝固全血および／または組織生検細胞から選ばれる ものである、請求項２７記載の使用。 29．適当な試験方法が、増殖試験方法、細胞毒試験方法、細胞反応性またはそ れらの組み合わせである、請求項２７または２８記載の使用。 30．患者における自己反応性Ｔ細胞および／またはＩＤＤＭ自己抗原に対する 自己抗体の存在を除去または実質的に減少させるためのペプチドまたはその化学 的均等物を十分な量、期間および条件下で投与することを含む処置方法であって 、上記ペプチドが、 式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃ （式中、Ｘ₁およびＸ₃は、同一または異なって、それぞれ０〜４０個の天然また は非天然由来のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得； Ｘ₂は、ヒトＧＡＤ６５のアミノ酸５０６〜５１８を含むかまたはそれらの誘 導体、および／またはヒトプロインシュリンのアミノ酸２４〜３６を含むかまた はそれらの誘導体から誘導されるか、相同であるかまたは近接している１０〜１ ００個の残基のアミノ酸配列である）を含み、前臨床またはインシュリン依存性 糖尿病（Insulin-Dependent Diabetes Mellitus：ＩＤＤＭ）患者からの細胞と インキュベートしたとき、Ｔ細胞と反応し得、かつＴ細胞機能を修飾し得るもの であることを特徴とする方法。 31．Ｘ₂が１０〜５０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項３０記載の 方法。 32．Ｘ₂が１０〜３０個のアミノ酸残基を含むものである、請求項３１記載の 方法。 33．Ｘ₂が１０〜１５個のアミノ酸残基を含むものである、請求項３２記載の 方法。 34．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ を含むものである、請求項３０〜３３のいずれか１項記載の方法。 35．Ｘ₂がアミノ酸配列： ＦＷＹＩＰＰＳＬＲＴＬＥＤ を含むものである、請求項３０〜３３のいずれか１項記載の方法。 36．請求項１〜７に記載の組換ペプチドまたはその化学的均等物および１また はそれ以上の医薬的に許容され得る担体および／または希釈剤を含む医薬組成物 。