ES2329427T3 - Generacion de linfocitos t citotoxicos humanos especificos para antigenos autoasociados a carcinoma y usos de los mismos. - Google Patents
Generacion de linfocitos t citotoxicos humanos especificos para antigenos autoasociados a carcinoma y usos de los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCUBRE AQUI QUE EMPLEANDO UN VECTOR VIRICO DE ADN RECOMBINANTE, PREFERENTEMENTE UN VECTOR DE POXVIRUS QUE CONTIENE AL MENOS UN SITIO DE INSERCION QUE CONTIENE UN SEGMENTO DE ADN QUE CODIFICA EL ANTIGENO AUTOASOCIADO DE CARCINOMA O UN EPITOPO DEL MISMO QUE ESTIMULA CELULAS T CITOTOXICAS, UNIDO OPERATIVAMENTE A UN PROMOTOR CAPAZ DE LA EXPRESION EN EL HOSPEDADOR, PUEDEN PRODUCIRSE CELULAS T CITOTOXICAS HUMANAS ESPECIFICAS PARA LOS ANTIGENOS AUTOASOCIADOS DE CARCINOMA. EL METODO COMPRENDE PREFERENTEMENTE INTRODUCIR UNA CANTIDAD SUFICIENTE DEL VECTOR DE POXVIRUS RECOMBINANTE EN UN HOSPEDADOR PARA ESTIMULAR LA PRODUCCION DE CELULAS T CITOTOXICAS, Y PONER POSTERIORMENTE EN CONTACTO EL HOSPEDADOR CON MAS ANTIGENO A INTERVALOS PERIODICOS. EL ANTIGENO EXTRA PUEDE AÑADIRSE EMPLEANDO UN SEGUNDO VECTOR DE POXVIRUS DE UN GENERO DE POXVIRUS DIFERENTE. EN OTRO ASPECTO, SE AÑADE ANTIGENO ADICIONAL PONIENDO EN CONTACTO EL HOSPEDADOR CON EL ANTIGENO. EL ANTIGENO PUEDE FORMULARSE CON UN COADYUVANTE O EN UNA FORMACION LIPOSOMAL. LAS CELULAS T PUEDEN AISLARSE. EL NUMERO DE CELULAS T PUEDE EXPANDIRSE PONIENDO EN CONTACTO LAS CELULAS T CITOTOXICAS AISLADAS ALTERNATIVAMENTE CON EL ANTIGENO AUTOASOCIADO DE CARCINOMA O UN EPITOPO DEL MISMO E IL RA EL TRATAMIENTO DE UN HOSPEDADOR QUE POSEE UN TUMOR QUE EXPRESA UN ANTIGENO AUTOASOCIADO DE CARCINOMA QUE COMPRENDE INTRODUCIR CELULAS T CITOTOXICAS ESPECIFICAS PARA EL ANTIGENO EN EL HOSPEDADOR Y EN AL MENOS UN INTERVALO PERIODICO POSTERIOR INTRODUCIR EN EL HOSPEDADOR UN EPITOPO ESTIMULADOR DE CELULAS T DEL ANTIGENO AUTOASOCIADO DE CARCINOMA.
Description
Generación de linfocitos T citotóxicos humanos
específicos para antígenos autoasociados a carcinoma y usos de los
mismos.
La presente invención se refiere en general a la
generación de linfocitos T citotóxicos humanos específicos de
antígenos autoasociados a carcinoma y a usos de los mismos, por
ejemplo en la cartografía de epítopos y terapia celular
adoptiva.
Se ha utilizado una serie de procedimientos para
tratar el crecimiento maligno de células tisulares en seres humanos
tales como los cánceres. Aunque con frecuencia los diferentes
procedimientos identificados han tenido éxito para tratar un cáncer
particular, una dificultad ha sido que hay numerosos cánceres
diferentes. Así, los fármacos que tratan un tipo de cáncer a menudo
son ineficaces contra un tipo de cáncer diferente.
Un procedimiento que intenta superar las
dificultades que resultan de las diferencias en los cánceres es la
inmunoterapia. Mediante dicho procedimiento, el sistema inmunitario
puede seleccionar y crear el procedimiento de tratamiento de un
cáncer específico. Poder seleccionar y/o identificar antígenos que
incluyen epítopos específicos que se pueden usar en dicho
procedimiento es extremadamente importante.
Ya se han identificado péptidos específicos que
se unen a moléculas MHC humanas para antígenos asociados a
melanomas. Darrow, T.L, y col., J. Immunol. 142:
3329-3335, (1989); Horn, S.S., y col., J.
Immunother. 10: 153-164, (1991); Cox, A.L, y
col., Science 264: 716-719 (1994); Olive, D.,
y col., Cancer Vaccine Symposium. Cancer Research Institue. Oct.
3-4 (1994). Se ha publicado que los complejos
peptídicos de MHC de clase I y/o clase II son reconocidos por los
linfocitos T humanos. La capacidad de activar los linfocitos T
mediante citoquinas o moléculas coestimuladoras es así
extremadamente importante.
Actualmente, también se está investigando
activamente la identificación de antígenos y epítopos asociados a
carcinoma humano que pueden ser reconocidos por linfocitos T
humanos. Entre dichos candidatos están moléculas tales como el
antígeno específico de la próstata (PSA), [Oesterling, J.E., J.
Urol. 145: 907-923, (1991); Peace, D.J., y
col., Cancer Vaccine Symposium. Cancer Research Institute. Oct.
3-5(1994)], neu/c-erbB2
[Fisk, B., y col., Int. J. Oncology 5: 51-63
(1994)] MUC-1 [loannides, C.G., y col., J.
Immunol. 151: 3693-3703, (1993)], ras de
mutación puntual [Tsang, K.Y., y col., Vaccine Research
(pendiente de publicación); Jung, S., y col., J. Exp. Med.
173: 273-276 (1991); Fenton, S., y col., J. Natl.
Cancer Inst. 85: 1294-1302, (1993)], p53 de
mutación puntual [Houblers, J.G.A., y col., Eur. J. Immunol. 23:
2072-2077, (1993)] y antígeno carcinoembrionario
(CEA) [Kantor, J., y col., J. Natl. Cancer Inst.
84:1084-1091, (1992); Kantor, J., y col., Cancer
Res. 52: 6917-6925, (1992); Ras, E., y col.,
European Immunology meeting, Barcelona, Junio (1994)]. Una
dificultad ha sido que muchos de estos antígenos son autoantígenos
normales, de los que no se espera, por tanto, que desencadenen una
respuesta inmunitaria del tipo que se necesita para procedimientos
terapéuticos.
Por ejemplo, mientras que el CEA humano se
expresa ampliamente en la gran mayoría de los carcinomas
colorrectales, gástricos y pancreáticos humanos, así como en
aproximadamente 50% de los cánceres de mama y 70% de los cánceres
de pulmón de células no pequeñas [Thompson, J.A., y col., J.
Clin. Lab. Anal. 5: 344-366, (1991)], el CEA
también se expresa, al menos en cierta medida, en el epitelio de
colon normal y en algunos tejidos fetales. Se ha secuenciado el gen
de CEA y se ha mostrado que es parte de la superfamilia de genes de
la inmunoglobulina humana, y por lo tanto comparte cierta homología
con otras moléculas encontradas en los tejidos humanos normales.
Thompson, J.A., y col., J. Clin. Lab. Anal. 5:
344-366, (1991); Oikawa, S., y col., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 144: 634-642, (1987). A
nivel de los aminoácidos, CEA comparte aproximadamente 70% de
homología con el NCA (antígeno de reacción cruzada no específico)
que se encuentra en los granulocitos normales. Thompson, J.A., y
col., ibid.
Sin embargo, la inmunogenicidad del CEA en seres
humanos normales o pacientes de cáncer es, en el mejor de los
casos, sospechosa. Aunque varias publicaciones reivindican
anticuerpos contra CEA en pacientes [Staab, H.J., y col., Br. J.
Cancer 42: 26-33, (1980); Mavligit, G.M., y
col., Cancer (Phila) 52: 146-149, (1983)],
otros reivindican que estas observaciones son artefactos [Collatz,
E., y col., Int. J. Cancer 8: 298-303,
(1971); Chester, K.A., y col., Clin. Exp. Immunol. 58:
685-693, (1984); Ura, Y., y col., Cancer
Lett. 24: 283-295, (1985)]. No existen informes
sobre la presencia o ausencia de respuestas de linfocitos T a
CEA.
Hay dos tipos de respuestas inmunitarias - las
respuestas específicas de antígeno que producen anticuerpos, y las
respuestas específicas de células que provocan linfocitos T
citotóxicos.
Sería extremadamente útil contar con
procedimientos mejorados para provocar una respuesta inmunitaria
contra autoantígenos.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos
provocados por un autoantígeno se pueden usar en la terapia celular
somática, en la identificación de epítopos y péptidos pequeños que
inducen una respuesta de linfocitos T citotóxicos y en ensayos de
fármacos para compuestos que potencian una respuesta de linfocitos T
citotóxicos específica.
La disponibilidad de los linfocitos T
citotóxicos humanos específicos para antígenos autoasociados a
carcinoma, también permite cartografiar epítopos reconocidos por
los linfocitos T. Estos epítopos a su vez se pueden usar para
sensibilizar o reforzar el sistema inmunitario para expandir la
población de linfocitos T in vivo o in vitro.
Después, las células in vitro, como se ha mencionado, se
pueden volver a transferir a un paciente, como se hace actualmente
en la terapia celular TIL, y usar para tratar un tumor que expresa
el antígeno.
Los autores de la invención han descubierto que
usando un vector vírico de ADN recombinante, un vector de virus de
la viruela que tenga al menos un sitio de inserción que contenga un
segmento de ADN que codifique el antígeno autoasociado a carcinoma,
o un epítopo del mismo que provoque linfocitos T citotóxicos,
operativamente unido a un promotor capaz de expresión en el
huésped, se pueden producir linfocitos T citotóxicos humanos
específicos para los antígenos autoasociados a carcinoma. El
procedimiento comprende introducir una cantidad suficiente del
vector de virus de la viruela recombinante en un huésped para
estimular la producción de linfocitos T citotóxicos, y después
poner en contacto el huésped con antígeno adicional a intervalos
periódicos. El antígeno adicional se puede añadir usando un segundo
vector de virus de la viruela de un género de viruela diferente.
Los autores de la invención también han
descubierto que los linfocitos T citotóxicos humanos específicos de
antígenos autoasociados a carcinoma se pueden producir usando un
epítopo del antígeno autoasociado a carcinoma que provoca
linfocitos T citotóxicos. El procedimiento preferiblemente comprende
introducir el epítopo que provoca linfocitos T en un huésped, para
estimular la producción de linfocitos T citotóxicos. Si es
necesario, después, con el fin de reforzar la producción de
linfocitos T citotóxicos, el huésped se pone en contacto con
epítopo adicional que provoca linfocitos T usando un vector de virus
de la viruela, a intervalos periódicos.
Los antígenos autoasociados a carcinoma
incluyen, por ejemplo, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno
prostático específico (PSA), TAG-72,
IL-2r y neulc-erbB-2. Para
los propósitos de la invención, el antígeno autoasociado es CEA.
También se pueden usar epítopos de los antígenos
autoasociados a carcinoma que provocan linfocitos T citotóxicos.
Para CEA los epítopos preferidos comprenden péptidos representados
en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
y 10.
El poxvirus se selecciona del grupo de los
poxvirus constituido por los poxvirus de la viruela porcina,
aviar, ovina y ortoviruela. Los virus de la ortoviruela preferidos
incluyen el virus vacunal, virus de la viruela de conejo y virus de
la viruela de mapache. Los poxvirus de la viruela aviar preferidos
incluyen los de la viruela de aves de corral, viruela del canario y
viruela de la paloma. Un poxvirus de la viruela aviar más preferido
es la viruela de aves de corral. El poxvirus de la viruela porcina
preferido es el de la viruela del cerdo.
Los vectores víricos del virus vacunal pueden
producir una respuesta de anticuerpos fuerte, de modo que aunque se
pueden dar numerosos refuerzos con vectores virus vacunal, no se
prefiere su uso preferido. Los autores de la invención han
descubierto que usando viruelas de diferentes géneros para
reforzar, se puede minimizar este problema de sensibilidad. De
acuerdo con la presente invención, con el fin de evitar dichos
problemas, preferiblemente, cuando el primer vector o el vector del
poxvirus inicial es virus vacunal, el segundo y posteriores vectores
de poxvirus se seleccionan de los poxvirus de un género diferente
tal como los de la viruela porcina, viruela aviar, viruela caprina
distinto de virus vacunal.
Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, RIBI
Detox, Q521, y adyuvante incompleto de Freund. También se pueden
usar formulaciones liposomiales.
Los linfocitos T citotóxicos humanos específicos
para un antígeno autoasociado a carcinoma producidos de acuerdo con
la presente invención, se pueden aislar de un huésped humano. Estas
células se pueden usar en ensayos de fármacos, se pueden usar para
cartografiar epítopos de antígenos que provocan linfocitos T
citotóxicos o en terapia celular adoptiva.
La fig. 1A y fig. 1B muestran la citotoxicidad
de líneas de linfocitos T [denominadas V24T (Figura 1A) y V6T
(Figura 1 B)] obtenidas de pacientes inmunizados con
rV-CEA; e inducidas por el péptido CEA
CAP-1. La actividad de los CTL se determinó en un
ensayo de liberación de ^{111}In de 18 h usando células T2 como
diana, incubadas con el péptido CAP-1 (50
\mug/ml);
L fig. 2 representa la secreción de
TNF-alfa por la línea celular
T-VAC24 en respuesta a la estimulación de linfocitos
B autólogos pulsados con péptido de CEA. Se cribó la secreción de
TNF-alfa en el líquido sobrenadante usando un ELSIA
durante una incubación de 3 días de células V24T con linfocitos B
autólogos y péptido CEA
(50 \mug/ml).
(50 \mug/ml).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los autores de la invención han inducido
inmunidad de linfocitos T contra CEA en pacientes con carcinoma,
poniendo el gen del CEA en un vector vírico recombinante, es decir
un vector de viruela tal como el virus vacunal. El virus vacunal
es un vector preferido por varias razones. Entre éstas están: (a)
su amplio uso en seres humanos en la erradicación de la viruela;
(b) su capacidad para infectar una amplia variedad de células,
incluyendo células presentadoras de antígeno profesionales, y
expresan el producto del gen insertado de una forma que tiene el
potencial para ser procesado en el contexto de moléculas MHC de
clase I y/o clase II; y (c) estudios con modelos animales han
mostrado que el uso de un virus vacunal con CEA humano recombinante
(designado rV-CEA) es superior al uso de CEA
soluble en la inducción de los efectos antitumorales en tumores
establecidos que expresan CEA. Kantor, J., y col., J. Natl.
Cancer Inst. 84:1084-1091, (1992). Estos
descubrimientos se correlacionan con la aparición de CTL
específicos de CEA en animales inoculados con
rV-CEA. Kantor, J., y col., véase antes.
Los estudios con modelos animales demuestran que
rV-CEA puede realmente infectar células de mamífero
in vivo hasta un nivel para inducir las respuestas
inmunitarias y demuestran la falta de toxicidad.
También se ha administrado
rV-CEA a monos rhesus y se ha mostrado que induce
respuestas de linfocitos T específicos de CEA sin toxicidad. Kantor,
J., y col. Cancer Res. 52: 6917-6925,
(1992).
Las líneas de linfocitos T citotóxicos también
se pueden generar usando un epítopo de un antígeno autoasociado a
carcinoma que provoca linfocitos T citotóxicos.
Tal como se usa en el presente documento, un
antígeno autoasociado a carcinoma se refiere a un antígeno que es
nativo para el animal y se asocia con tumores malignos. Para los
propósitos de la invención, el antígeno autoasociado es CEA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la materia conocen las técnicas
básicas para preparar virus de ADN recombinantes que contienen una
secuencia de ADN heteróloga que codifica el antígeno autoasociado a
carcinoma o epítopo que provoca linfocitos T citotóxicos, e
implican, por ejemplo, la recombinación homóloga entre las
secuencias de ADN víricas que flanquean las secuencias de ADN en un
plásmido donante y secuencias homólogas presentes en el virus
parental (Mackett, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:
7415-7419 (1982)). Por ejemplo, se pueden usar
vectores víricos recombinantes tales como el vector vírico de la
viruela para el suministro del gen. El vector se puede construir,
por ejemplo, mediante pasos conocidos en la materia, p. ej. análogos
a los procedimientos para crear recombinantes sintéticos del virus
de la viruela de las aves de corral, descrito en la patente de
EE.UU. nº 5.093.258. Otras técnicas incluyen el uso de un sitio de
endonucleasa de restricción único que está presente de forma
natural o artificial en el vector vírico parental, para insertar el
ADN heterólogo.
Los virus de la viruela útiles para poner el
práctica la presente invención, incluyen los virus de ortoviruela,
de viruela porciona, viruela aviar y viruela ovina.
Los ortopoxvirus incluyen el vacunal, los de la
ectomelia, y el del mapache. El ortopoxvirus preferido es el
vavunal.
La viruela aviar incluye viruela de aves de
corral, viruela del canario y viruela de la paloma. La viruela aviar
preferida es la viruela de aves de corral.
Una viruela porcina preferida es la viruela del
cerdo.
Por ejemplo, la secuencia génica de ADN que se
va a insertar en el virus se puede poner en un plásmido donante, p.
ej., una construcción de plásmido de E. coli, en el que se ha
insertado el ADN homólogo a una sección de ADN tal como la del
sitio de inserción del virus de la viruela en el que se va a
insertar el ADN. Por separado, la secuencia génica de ADN que se va
a insertar se liga a un promotor. La unión de
promotor-gen está situada en la construcción de
plásmido de modo que la unión de promotor-gen está
flanqueada por ambos extremos por el ADN homólogo a una secuencia
de ADN que flanquea una región del ADN de la viruela que es la
región de inserción deseada. Con un vector vírico de la viruela
parental, se usa un promotor de viruela. Después, la construcción
de plásmido resultante se amplifica por crecimiento dentro de la
bacteria E. coli y se aísla. Preferiblemente, el plásmido
también contiene un origen de replicación tal como el origen de
replicación de E. coli, y un marcador tal como un gen de
resistencia a antibióticos para la selección y propagación en E.
coli.
Segundo, el plásmido aislado que contiene la
secuencia génica de ADN que se va a insertar, se transfiere a un
cultivo celular, p. ej., fibroblastos embrionarios de pollo, junto
con el virus parental, p. ej., virus de la viruela. La
recombinación entre el ADN de la viruela homólogo en el plásmido y
el genoma vírico respectivamente, da como resultado un virus de la
viruela recombinante modificado por la presencia de la construcción
de promotor-gen en su genoma, en un sitio que no
afecta a la viabilidad del virus.
\newpage
Como se ha indicado antes, el gen se inserta en
una región (región de inserción) en el virus que no afecta a la
viabilidad vírica del virus recombinante resultante. El experto en
la materia puede identificar fácilmente dichas regiones en un
virus, por ejemplo, ensayando aleatoriamente en segmentos del ADN
vírico regiones que permitan la formación recombinante sin afectar
gravemente a la viabilidad vírica del recombinante. Una región que
se puede usar fácilmente y está presente en muchos virus es el gen
de la timidina quinasa (TK). Por ejemplo, se ha encontrado el gen
de TK en todos los genomas de un poxvirus examinados
[leporipoxvirus: Upton, y col., J. Virology, 60:920 (1986)
(virus del fibroma de Shope); capripoxvirus: Gershon, y col., J.
Gen. Virol., 70:525 (1989) (Kenya sheep-1);
ortopoxvirus: Weir, y col., J. Virol., 46:530 (1983) (virus
vacunal); Esposito, y col., Virology, 135:561 (1984)
(poxvirus de mono y virus de la viruela); Hruby, y col.,
PNAS, 80:3411 (1983) (virus vacunal); Kilpatrick, y col.,
Virology, 143:399 (1985) (virus del tumor del mono de Yaba);
avipoxvirus: Binns, y col., J. Gen. Virol. 69:1275 (1988)
(viruela de las aves de corral); Boyle, y col., Virology,
156:355 (1987) (viruela de las aves de corral); Schnitzlein, y col.,
J. Virological Methods, 20:341 (1988) (viruela de las aves
de corral, quailpox); entomopox (Lytvyn, y col., J. Gen.
Virol. 73:3235-3240 (1992)].
En el virus vacunal, además de la región de TK,
otras regiones de inserción incluyen, por ejemplo, HindIII
M.
En el poxvirus de las aves de corral, además de
la región de TK, otras regiones de inserción incluyen, por ejemplo,
BamHI J [Jenkins, y col., AIDS Research and Human
Retroviruses 7:991-998 (1991)], el fragmento
EcoRI-HindIII, fragmento BamHI, fragmento
EcoRV-HindIII, fragmento BamHI y el fragmento
HindIII expuesto en la solicitud EPO nº 0308220 A1.
[Calvert, y col., J. of Virol. 67:3069-3076
(1993); Taylor, y col., Vaccine 6:497-503
(1988); Spehner, y col., (1990) y Boursnell, y col., J. of Gen.
Virol. 71:621-628 (1990)].
En el poxvirus de la viruela del cerdo los
sitios de inserción preferidos incluyen la región del gen timidina
quinasa.
Además del requisito de que el gen sea insertado
en una región de inserción, la expresión satisfactoria del gen
insertado por el virus de la viruela modificado requiere la
presencia de un promotor operativamente unido al gen deseado, es
decir, en la relación adecuada con el gen insertado. El promotor
debe colocarse de forma que esté situado secuencia arriba del gen
que se va a expresar. Los promotores son conocidos en la materia y
se pueden seleccionar fácilmente dependiendo del tipo de huésped y
célula que se desee que sea el objetivo. Por ejemplo, en los virus
de la viruela deben usarse promotores poxvíricos, tales como los
promotores de virus vacunal 7,5 K, 40 K o del poxvirus de la viruela
de las aves de corral tal como FPV C1 A. También se pueden usar
elementos potenciadores en combinación para aumentar el nivel de
expresión. Además, en algunas realizaciones se prefiere el uso de
promotores inducibles, que también son conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los linfocitos T citotóxicos específicos del
antígeno autoasociado deseado, se pueden generar por administración
de entre aproximadamente 10^{5}-10^{9} ufp del
virus de la viruela recombinante, construido como se ha descrito
antes, a un huésped. El huésped preferido es un ser humano. Sin
embargo, también se puede usar un mamífero transgénico, p. ej.
ratón, que tenga un sistema inmunitario como el humano. Después de
al menos un intervalo, que preferiblemente es de 1 a 3 meses más
tarde, se refuerza la respuesta inmunitaria por administración al
huésped de antígeno adicional o un epítopo del mismo estimulador de
linfocitos T. Más preferiblemente, hay al menos un segundo
"refuerzo", preferiblemente de 1 a 3 meses después del primer
refuerzo. El antígeno se puede administrar preferiblemente usando
un segundo vector de virus de la viruela de un género de viruela
diferente, o se puede administrar directamente usando, por ejemplo,
un adyuvante o liposoma. Se pueden usar citoquinas, p. ej.,
IL-2 o moléculas coestimuladoras, p. ej., B7.1,
B7.2, como adyuvante biológico, y se pueden administrar
sistémicamente al huésped o coadministrar por inserción de los genes
que codifican las moléculas en el vector de la viruela
recombinante.
Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, RIBI Detox
(Ribi Immunochemical), QS21 y adyuvante incompleto de Freund.
Los linfocitos T citotóxicos se pueden aislar de
células mononuclares de la sangre periférica (PBMC) obtenidas del
huésped. Por ejemplo, las PBMC se pueden separar usando un gradiente
de medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC,
EE.UU.) como se ha descrito previamente [Boyum, y col., Scand. J.
Clin. Lab. Invest. 21:77-80 (1968)]. Las PBMC
lavadas se vuelven a suspender en un medio completo, por ejemplo,
RPMI 1640 (GIBCO) complementado con suero AB humano mezcla al 10%
(Pel-Freeze Clinical System, Brown Dear, WI,
EE.UU.), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100
\mug/ml (GIBCO). Se añaden aproximadamente 2 x 10^{5} células
en medio completo en un volumen, por ejemplo, de 100 \mul a cada
pocillo de una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo plano
(Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). Se añaden el antígeno o los
péptidos en los cultivos a una concentración final de
aproximadamente 50 \mug/ml y se incuban a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contiene CO_{2} al 5%. Se suministra a los
cultivos IL-2 humana reciente (10 U/ml) después de
5 días y se rellenan con medio que contiene IL-2
cada 3 días. Los cultivos primarios se vuelven a estimular con el
mismo péptido (50 \mug/ml) el día 16. Se añaden 5 x 10^{5} PBMC
autólogas irradiadas (4.000 rad) en un volumen de aproximadamente
50 \mul de medio completo como células presentadoras de antígeno
(APC). Aproximadamente 5 días después, se suministra a los cultivos
medio que contiene mIL-2 humana como se ha descrito
previamente. Las células se vuelven a estimular durante 5 días a
intervalos de 16 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Los linfocitos T citotóxicos de la presente
invención se pueden usar para determinar el epítopo del antígeno
autoasociado a carcinoma que provoca un linfocito T citotóxico. Por
ejemplo, se puede cortar el antígeno (proteína) en numerosos
fragmentos peptídicos. Alternativamente, los fragmentos se pueden
sintetizar químicamente. Después, los linfocitos T citotóxicos se
pueden sembrar en placa y añadir diferentes fragmentos a diferentes
pocillos. Sólo los linfocitos T que reconozcan uno de los
fragmentos peptídicos preseleccionados como un epítopo continuarán
expandiéndose, permitiendo así una fácil identificación.
Estos fragmentos después se pueden usar para
provocar linfocitos T citotóxicos en lugar de usar la proteína
entera. Adicionalmente, se pueden preparar otros fragmentos que
contengan el epítopo para potenciar su capacidad para provocar una
respuesta de linfocitos T citotóxicos. Las modificaciones de estos
fragmentos son conocidas en la técnica e incluyen el uso de
conjugados, restos aminoácidos específicos tales como cistinas,
etc.
\vskip1.000000\baselineskip
El linfocito T citotóxico también se puede usar
para seleccionar compuestos que potencien la capacidad del antígeno
para crear una respuesta de linfocitos T citotóxicos. Por ejemplo,
los linfocitos T citotóxicos se pueden incubar con un epítopo
seleccionado, por ejemplo, en una placa de microtitulación. El
compuesto que se va a ensayar, p. ej., un fármaco, se añade después
al pocillo y se mide el crecimiento de los linfocitos T. La
expansión de los linfocitos T indica que el compuesto de ensayo
potencia la respuesta de los linfocitos T. Dichos compuestos se
pueden evaluar más.
\vskip1.000000\baselineskip
El linfocito T citotóxico se puede cultivar para
amplificar su número y después volver a inyectar en el huésped por
una variedad de medios. En general, se administran entre 1 x
10^{5} y 2 x 10^{11} linfocitos T citotóxicos por infusión, por
ejemplo, en 1 a 3 infusiones de 200 a 250 ml cada una, a lo largo de
un periodo de 30 a 60 minutos. Después de completar las infusiones,
el paciente se puede tratar con interleuquina-2
recombinante con una dosis de 720.000 UI por kilogramo de peso
corporal, por vía intravenosa cada 8 horas; se pueden omitir
algunas dosis dependiendo de la tolerancia del paciente al fármaco.
Además, después de la infusión, se puede administrar al paciente
antígeno adicional o fragmentos que contienen epítopo(s) que
provocan linfocitos T, para expandir más el número de linfocitos T.
El antígeno o epítopo se pueden formular con un adyuvante y/o pueden
estar en una formulación liposomial.
Los linfocitos T citotóxicos también se pueden
modificar por introducción de un vector vírico que contiene un ADN
que codifica el TNF y reintroducir en un huésped en un esfuerzo para
potenciar la actividad antitumoral de las células. También se pueden
usar otras citoquinas.
Para la administración parenteral, los vectores
recombinantes o los linfocitos T citotóxicos normalmente se
inyectarán en una disolución, suspensión o emulsión estéril acuosa o
no acuosa, en asociación con un vehículo parenteral
farmacéuticamente aceptable tal como disolución salina
fisiológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
1
Se han desarrollado una serie de virus de la
viruela como vectores víricos vivos para la expresión de proteínas
heterólogas (Cepko y col., Cell 37:1053-1062
(1984); Morin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:4626-4630 (1987); Lowe y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 84:3896-3900 (1987); Panicali
& Paoletti, Proc. Natl. Acad Sci. USA,
79:4927-4931 (1982); Machett y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 79:7415-7419 (1982)). Están
disponibles virus de la viruela de las aves de corral y de la
viruela del cerdo representativos con los números de acceso en ATCC
VR-229 y VR-363. Está disponible un
virus vacunal-CEA recombinante con el número de
acceso en ATCC VR2323.
\vskip1.000000\baselineskip
Se insertan genes que codifican los antígenos
asociados a carcinoma deseados en el genoma de un virus de la
viruela de forma que se permita que sean expresados por este virus
junto con la expresión del complemento normal de las proteínas del
virus parental. Esto se llevar a cabo construyendo primero un vector
donante de ADN para la recombinación in vivo con un virus de
la viruela.
\newpage
En general, el vector donante de ADN contiene
los siguientes elementos:
(i) un origen de replicación procariota, de modo
que el vector se puede amplificar en un huésped procariota;
(ii) un gen que codifica un marcador que permite
la selección de células huésped procariotas que contienen el vector
(p. ej., un gen que codifica la resistencia a antibiótico);
(iii) al menos un gen que codifica una proteína
deseada localizada adyacente a un promotor de la transcripción capaz
de dirigir la expresión del gen; y
(iv) secuencias de ADN homólogas a la región del
genoma del virus parental en la que se insertarán el o los genes
extraños, que flanquea la construcción del elemento (iii).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen procedimientos para construir
plásmidos donantes para introducir múltiples genes extraños en
virus de la viruela en el documento WO91/19803. En general, todos
los fragmentos de ADN para la construcción del vector donante,
incluyendo fragmentos que contienen promotores de la transcripción y
fragmentos que contienen secuencias homólogas a la región del
genoma del virus parental en el que se van a insertar los genes
extraños, se pueden obtener de ADN genómico o fragmentos de ADN
clonados. Los plásmidos donantes pueden ser mono, di o
multivalentes (es decir, pueden contener una o más secuencias de
genes extraños insertadas).
El vector donante preferiblemente contiene un
gen adicional que codifica un marcador que permitirá la
identificación de los virus recombinantes que contienen el ADN
extraño insertado. Se pueden usar varios tipos de genes marcadores
para permitir la identificación y aislamiento de virus
recombinantes. Estos genes incluyen los que codifican resistencia a
antibiótico o resistencia química (p. ej., véase, Spyropoulos y
col., J. Virol., 62:1046 (1988); Falknerand Moss., J.
Virol., 62:1849 (1988); Franke y col., Mol. Cell. Biol.,
5:1918 (1985), así como genes tales como el gen lacZ de
E. coli, que permite la identificación de placas víricas
recombinantes por ensayo colorimétrico (Panicali y col.,
Gene, 47:193-199 (1986)).
\vskip1.000000\baselineskip
La recombinación homóloga entre el ADN
plasmídico donante y ADN vírico en una célula infectada da como
resultado la formación de virus recombinantes que incorporan los
elementos deseados. Las células huésped adecuadas para la
recombinación in vivo generalmente son células eucariotas que
pueden ser infectadas por el virus y transfectadas por el vector
plasmídico. Ejemplos de tales células adecuadas para usar en un
virus de la viruela son fibroblastos embrionarios de pollo, células
HuTK143 (humanas), y células CV-1 y
BSC-40 (ambas de riñón de mono). La infección de
células con el virus de la viruela y transfección de estas células
con vectores plasmídicos se lleva a cabo mediante técnicas estándar
en la materia (Panicali and Paoletti, patente de EE.UU. nº
4.603.112, WO89/03429).
Después de la recombinación in vivo, la
progenie vírica recombinante se puede identificar por una de varias
técnicas. Por ejemplo, si el vector donante de ADN se diseña para
insertar genes extraños en el gen de la timidina quinasa (TK) del
virus parental, los virus que contengan el ADN integrado serán TK y
se pueden seleccionar basándose en esto (Mackett y col., Proc.
Natl. Acad Sci. USA, 79:7415 (1982)). Alternativamente, la
cointegración de un gen que codifica un marcador o gen indicador
con el gen o genes extraños de interés, como se ha descrito antes,
se puede usar para identificar la progenie recombinante. Un gen
indicador preferido es el gen lacZ de E. coli: los
virus recombinantes que expresan
\beta-galactosidasa se pueden seleccionar usando
un sustrato cromogénico para la enzima (Panicali y col.,
Gene, 47:193 (1986)).
Después de la recombinación in vivo, la
progenie vírica recombinante se puede identificar por una de varias
técnicas. La presencia de ADN extraño integrado se puede detectar
por hibridación con una sonda de ADN marcada específica para el ADN
insertado. Sin embargo, las técnicas de selección preferidas se
basan en la cointegración de un gen que codifica un gen marcador o
indicador junto con el gen de interés, como se ha descrito antes.
Un gen indicador preferido es el gen lacZ de E. coli
que codifica la enzima \beta-galactosidasa. La
selección de virus recombinantes que expresan la
\beta-galactosidasa se puede hacer usando un
sustrato cromogénico para la enzima. Por ejemplo, los virus
recombinantes se detectan como placas azules en presencia del
sustrato
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa
u otras
halogenado-indolil-\beta-D-galactosidasa
(p. ej., BluGal^{TM}).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que se ha identificado un virus
recombinante, se puede usar una variedad de procedimientos para
ensayar la expresión del polipéptido codificado por el gen
insertado. Estos procedimientos incluyen ensayo en placa negra (un
inmunoensayo enzimático in situ realizado sobre placas
víricas), análisis de transferencia Western,
radioinmunoprecipitación (RIPA), e inmunoensayo enzimático
(EIA).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
La línea celular de adenocarcinoma colónico
murino MC-38 fue suministrada por el laboratorio del
Dr. S. Rosenberg (National Cancer Institute, Bethesda, MD). La línea
celular derivada que expresa CEA humano, denominada
MC-38-CEA-2, se
desarrolló por la transducción del gen de CEA humano por el vector
de expresión retrovírico pBNC y se ha descrito previamente. Robbins,
PF, y col., Cancer Res 1991; 51:3657-62.
\vskip1.000000\baselineskip
El baculovirus-CEA recombinante
(bV-CEA) ha sido descrito previamente como
BVCEA-140. Salgaller, ML, y col., Cancer
Res. 1993; 53:2154-61. bV-CEA
codifica la longitud completa del gen de CEA humano y expresa varias
especies de pesos moleculares distintos en el intervalo de 140 kDa
a 110 kDa. Estos productos reflejan la heterogenicidad genética de
las proteínas de bV-CEA recombinante, debido a la
recombinación homóloga entre los 3 dominios repetidos de CEA.
bV-CEA se purificó a partir del extracto de células
enteras de células de Spodoptera frugiperda infectadas como se ha
descrito previamente. Salgaller, ML, y col., Cancer Res.
1993; 53:2154-61. Previamente se había demostrado
que bV-CEA contiene al menos 10 epítopos de CEA por
reactividad con diferentes anticuerpos monoclonales. Bei, R., y
col., Mole. Immunolo. 1994; 31:771-780. Se
mostró que bV-CEA contiene sólo carbohidratos de
manosa superiores sencillos así como carbohidratos biantenarios e
híbridos biantenarios, mientras que el CEA nativo también contiene
azúcares complejos triantenarios y tetraantenarios. Bei, R, y col.,
Mole. lmmunolo. 1994; 31:771-780.
bV-V se ha descrito previamente. Salgaller, ML, y
col., Cancer Res. 1993; 53:2154-61. Es el
baculovirus recombinante que contiene sólo el vector lanzadera sin
inserto de CEA.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus vacunal-CEA
recombinante se generó como han descrito previamente Kantor, J., y
col., Cancer Res. 1992; 52:6917.25.
\vskip1.000000\baselineskip
El CEA humano purificado comercialmente,
denominado nCEA para CEA nativo, se adquirió en Vitro
diagnostic (Littleton, CO). Se obtuvo de un adenoma de hígado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron ratones C57BL/6 hembra de 6 a 8
semanas de edad para los diferentes regímenes de inmunización. Los
animales fueron inmunizados con CEA purificado nativo (nCEA) o
recombinante (bV-CEA). En cada grupo de 10
animales, se administró por vía subcutánea CEA humano,
bV-CEA purificado o PBS sólo en adyuvante, 3 veces
en intervalos de 14 días. Cada animal recibió 25 \mug de proteína
purificada para cada inmunización. Los inmunógenos se emulsionaron
en 25 \mug de monofosforil-lípido A (MPL) +
dicorinomicolato de trehalosa (TDMC) + adyuvante esqueleto de pared
celular (CWS) (RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT) en 200
\mul de disolución salina tamponada de fosfato (PBS) (Biofluids
Inc., Rockville, MD).Se sensibilizaron otros grupos de animales con
virus vacunal-CEA recombinante
(rV-CEA) seguido de inmunización con las proteínas
purificadas. Se inocularon 10 animales en cada grupo por
escarificación de la cola con 1x10^{7} unidades formadoras de
placa (ufp) de rV-CEA en 10 \mul de PBS.
Posteriormente los animales se reforzaron 2 veces con 14 días de
separación con 25 \mug de nCEA, bV-CEA purificado
o PBS en adyuvante; es decir, se usó el adyuvante RIBI para todas
las inmunizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron ratones hembra C57BL/6 como se
ha descrito antes. Se recogió suero 7 días después de la última
inmunización y se ensayó la presencia de anticuerpos
anti-CEA por ELISA (ensayo de inmunoabsorción con
enzimas ligadas). Brevemente, se diluyeron el
bV-CEA así como el bV-V y el nCEA en
PBS y se incubó 1 \mul de la mezcla durante la noche a 37ºC en
placas de microtitulación de poli(cloruro de vinilo)
(Dinatech, Chantilly, VA). Los pocillos se trataron con albúmina de
suero bovino al 5% (BSA) en PBS durante 1 h a 37ºC y se añadieron
sueros con diferentes diluciones. Después de 1 h de incubación a
37ºC, las placas se lavaron con BSA al 1% en PBS. Se añadió
anticuerpo de anti-ratón de cabra acoplado con
peroxidasa (Gibco BRL) seguido de incubación durante 1 h a 37ºC.
Después de lavar, se añadió diclorhidrato de
o-fenilendiamina en presencia de H_{2}O_{2}.
Después de desarrollarse el color, la reacción se paró con 50 \mul
de H_{2}SO_{4} y se leyó la absorbancia a 490 nm. El título del
suero se definió como el factor de dilución necesario para alcanzar
una densidad óptica (D.O.) de 1,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron ratones C57BL/6 como se ha
descrito antes para analizar la inducción de la activación de
linfocitos T mediante un ensayo que mida la proliferación de
linfocitos. Un mes después de la última inmunización, se extirparon
los bazos, se dispersaron mecánicamente a través de tamices de malla
y se lavaron 2 veces en medio RPMI 1640 exento de suero (Gibco,
Gaithersburg, MD). Se separaron los eritrocitos y las células
muertas por centrifugación con un gradiente de Ficoll Hypaque
(densidad = 1,119 g/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo).
Después se redujeron las células adherentes de la población
mononuclar por incubación (30 min, a 37ºC) y paso sobre columnas de
nailon-lana (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale,
CA) dando como resultado una fracción enriquecida en linfocitos T.
Los linfocitos T se lavaron y se volvieron a suspender en medio
RPMI-1640 complementado con HEPES 15 mM (pH 7,4),
suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 5%,
L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM,
piruvato sódico 1 mM, estreptomicina 100 U/ml (todo de Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) y \beta-mercaptoetanol 5 X
10^{-5} (Sigma Chemical Co.).
Los linfocitos T (2 X 10^{5}/pocillo) se
incubaron en presencia de esplenocitos singeneicos normales,
irradiados (5 X 10^{5}/pocillo) como células presentadoras de
antígeno con o sin diferentes estímulos, tales como concanavalina A
(ConA) (Sigma, Chemical Co.), nCEA (Vitro Diagnostic),
bV-CEA, u ovalbumina purificada (Sigma Chemical Co.)
La incubación se llevó a cabo en placas de fondo plano de 96
pocillos (Costar Corp., Cambridge, MA) durante hasta 3 días (ConA)
o 5 días (antígenos). Los cultivos se pulsaron con
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) (DuPont/NEN
Research Products, Wilmington, DE) durante las 18-24
horas finales de la incubación. Las células se recogieron con un
cosechador de células PhD (Cambridge Technology, Cambridge, MA) y la
radiactividad incorporada se midió por espectroscopía de centelleo
de líquidos (contador LS 3801; Beckman Instruments, Duarte, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Siete días después de la última inmunización, se
transplantó 2 x 10^{5} células tumorales
MC-38-CEA-2 por
inyección subcutánea. Se controló semanalmente en los animales la
presencia de tumor. Los tumores se midieron mediante calibrador en 2
dimensiones y los volúmenes se calcularon usando la fórmula
(ancho^{2} + largo)/2.
\vskip1.000000\baselineskip
Primero se evaluó en lo ratones la capacidad del
nCEA para actuar como un refuerzo en ratones a los que se había
administrado previamente rV-CEA. Como se ha
mencionado en Materiales y Procedimientos, se usó adyuvante RIBI en
todas las inyecciones en este estudio en el que se usó como
inmunógeno nCEA, bV-CEA o PBS de control. Cuando se
administró a los ratones una administración de
rV-CEA seguida de 2 refuerzos de PBS, los títulos
de anticuerpos contra nCEA fueron modestos, es decir 1:250. Se
observaron títulos similares cuando los sueros inmunológicos se
ensayaron contra bV-CEA. Cuando los ratones
recibieron una inyección de rV-CEA seguido de 2
administraciones de nCEA, los títulos de anticuerpos fueron al menos
10 veces mayores tanto contra nCEA (1:3.450) como
bV-CEA (1:4.500). Estudios previos han mostrado que
cuando se dio a los ratones 3 administraciones de nCEA, los títulos
de anticuerpos tenían un promedio de 1:1.600 contra nCEA y 1:2.950
contra bV-CEA. Después se llevaron a cabo estudios
para determinar si el esquema de inmunización de una inmunización de
rV-CEA seguido de 2 inmunizaciones de nCEA podía
potenciar las respuestas de linfocitos T específicos contra CEA. Los
resultados de estos experimentos se dan en la Tabla 1, como
respuestas proliferativas de linfocitos T contra nCEA,
bV-CEA, así como contra antígeno de control
ovoalbúmina y ConA. Estos resultados también se dan como "índice
de estimulación de linfocitos" (LSI) en la Tabla 2. El LSI es la
incorporación de ^{3}H-timidina del antígeno de
ensayo dividido entre la incorporación de
^{3}H-timidina del antígeno de control
ovoalbúmina. Como puede verse en las tablas 1 y 2, cuando los
ratones fueron inmunizados 3 veces con PBS, 3 veces con nCEA, o 1
vez con rV-CEA y 2 veces con PBS, o 1 vez con
rV-CEA y 2 veces con nCEA, los valores de LSI para
la ConA estaban en el intervalo de 110 a 240. Sin embargo, cuando
se analizaron los esplenocitos de ratones inmunizados usando 10
\mug/ml de nCEA, la respuesta de proliferación a 1 inmunización de
rV-CEA más 2 inmunizaciones de PBS era 1,9 frente a
un valor de LSI de 26,6 cuando los ratones recibieron
rV-CEA más 2 inmunizaciones de nCEA. Debe
observarse también que cuando se ensayaron los esplenocitos de
ratones inmunizados contra 100 \mug de nCEA, el LSI de los
esplenocitos de los ratones que recibieron 3 inmunizaciones de nCEA
era 39,6 frente a 72,7 de los ratones que recibieron 1 inyección de
rV-CEA y 2 inyecciones de nCEA. Se observaron
resultados similares cuando se ensayó en los esplenocitos de
ratones inmunizados las respuestas de proliferación usando
bV-CEA como un inmunógeno. Estos estudios
demostraron que el nCEA sólo puede provocar respuestas de linfocitos
T contra CEA y también se puede usar (quizás de forma más eficaz)
en combinación con rV-CEA para provocar respuestas
de células T anti-CEA específicas.
También se llevaron a cabo estudios sobre el uso
de diferentes protocolos de inmunización para inmunizar ratones
contra la estimulación de células tumorales que expresan CEA. La
transducción usando un vector retrovírico de la línea celular de
carcinoma de colon murino con CEA se ha descrito previamente.
Robbins, PF, y col., Cancer Res. 1991;
51:3657-62. Brevemente, estos tumores expresan CEA y
crecerán en ratones singénicos y matarán a los animales
transplantados. Horan Hand, P., y col., Cancer Immunology
Immunotherapy 1993; 36:65-75. Como puede verse
en la Tabla 3, cuando los ratones recibieron tumores transducidos
con CEA después de inmunización con PBS, 7/9 ratones tenían tumores
el día 49 después del transplante. Cuando se dio a los ratones 1
administración de rV-CEA seguido de 2
administraciones de PBS, se obtuvieron resultados similares, es
decir 7/10 ratones tenían tumores. Sin embargo, cuando se dio a los
ratones 3 administraciones de nCEA, o 1 administración de
rV-CEA seguido de 2 administraciones de nCEA, sólo
1/10 ratones tenía tumores en ambos grupos de inmunización.
Después se llevaron a cabo estudios para
determinar si el CEA obtenido de baculovirus podía dar resultados
similares a los obtenidos con nCEA. Los títulos medios de
anticuerpos de los ratones que recibían 1 administración de
rV-CEA seguido de 2 administraciones de
bV-CEA eran 1:14.800 contra bV-CEA y
eran mucho mayores que la media de 1:250 de los ratones que
recibían sólo rV-CEA. Además, también se mostró que
los anticuerpos inducidos reaccionaban con nCEA (1:8.600). Como
control adicional en todos estos experimentos, se usaron extractos
de baculovirus que carecían del gen de CEA (bV-V) y
no presentaron reactividad. Este control se usó para descartar la
posibilidad de que se dirigieran respuestas de linfocitos B contra
las proteínas de baculovirus en oposición a las respuestas
específicas de CEA. Estudios previos han mostrado que cuando se daba
a los ratones 3 administraciones de bV-CEA, los
títulos de anticuerpos medios eran 1:3.100 contra nCEA y 1:12.400
contra bV-CEA. Bei, R., y col., Mole.
Immunolo. 1994, 31: 771-780.
Como se muestra en las Tablas 4 y 5, se
analizaron las respuestas linfoproliferativas y los LSI
consiguientes de esplenocitos de ratones que recibieron diferentes
protocolos de inmunización de rV-CEA y/o
bV-CEA. Como se muestra en las Tablas 4 y 5, se
observaron respuestas proliferativas de linfocitos T similares para
todos los grupos de inmunización para la estimulación con
ovoalbúmina o medio de cultivo sólo. Además, se observaron
resultados de LSI similares en todos los grupos de inmunización
usando ConA. Como se ve en la Tabla 5, se vio un LSI de 9,5 usando
esplenocitos de ratones a los que se dio 3 administraciones de
bV-CEA, después de estimulación con
bV-CEA 10 \mug/ml. Sin embargo, cuando se dio a
los ratones 1 administración de rV-CEA y después 2
administraciones de bV-CEA, se vieron respuestas de
proliferación de linfocitos T de 36,7. También se vio una
potenciación similar de la respuesta de linfocitos T cuando se
inmunizó con rV-CEA más bV-CEA en
oposición a 3 administraciones de bV-CEA, cuando se
usó nCEA para la estimulación. Mientras que los linfocitos de
ratones a los que se administró bV-CEA 3 veces
provocaron menor LSI después de estimulación con nCEA comparado con
los que se estimularon con bV-CEA. Se obtuvieron
respuestas proliferativas de linfocitos T y humoral cuando se usó
el mismo adyuvante que carecía
de TDCM para inmunizar ratones con bV-CEA después de sensibilización con rV-CEA (no se muestran datos).
de TDCM para inmunizar ratones con bV-CEA después de sensibilización con rV-CEA (no se muestran datos).
Después, se llevaron a cabo estudios para
determinar si se podían usar diferentes protocolos de inmunización
que usaban bV-CEA para proteger a los ratones contra
la exposición a tumores transducidos con CEA. Como puede verse en
la Tabla 6, tanto a intervalos de tiempo de 35 como de 49 días, el
protocolo de inmunización usando una sola inyección de
rV-CEA seguido de 2 inmunizaciones de
bV-CEA era más eficaz que el uso de 3 inmunizaciones
de bV-CEA en términos tanto del número de ratones
con tumores como del volumen medio del tumor.
Como puede verse en los estudios descritos
antes, bV-CEA y nCEA parecen comparables en términos
de inducción de respuestas de linfocitos T y respuestas de
anticuerpos solos o combinados con rV-CEA. Además,
ambos eran capaces de proteger a ratones frente la exposición a
tumor con células tumorales que contenían CEA cuando se usaba
combinado con rV-CEA. Sin embargo, debe señalarse
que cuando se usó bV-CEA sólo como un inmunógeno,
la respuesta proliferativa de linfocitos T in vitro tras la
estimulación con nCEA era menor comparado con los estimulados por
bV-CEA y a pesar del alto nivel de anticuerpos
anti-nCEA. Este resultado puede deberse a las
diferencias de glicosilación entre las dos moléculas.
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Líneas celulares de carcinoma colorrectal: SW403
(HLA-A2, A3), HT-29
(HLA-A1, A9), SW837 (HLA-, A19), SW1417
(HLA-A3,-) se adquirieron en la American Type
Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.): Los cultivos estaban
exentos de micoplasma y se mantuvieron en medio completo: DMEM
(GIBCO, Grand Island, NY, EE.UU.) complementado con suero bovino
fetal al 10% (FBS), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y
estreptomicina 100 \mug/ml (GIBCO). La línea celular T2 (mutante
de deleción de transporte) (28) fue un generoso regalo del Dr. Peter
Cresswell (Yale University School of Medicine, New Haven, CT,
EE.UU.) y se mantuvo en medio Dulbecco modificado con Iscove (IMDM)
que contenía FBS al 10%.
Las líneas de linfocitos B transformadas por EBV
denominadas B-Vac24 y B-Vac01, y
B-Vac24 transfectada con vector retrovírico que
codifica una construcción de CEA denominada
B-Vac24/CEA se mantuvieron en medio RPMl1640
complementado con suero AB humano mezcla al 10% (Pel Freeze Clinical
System, Brown Dear, WI, EE.UU.), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml
y estreptomicina 100 \mug/ml (GIBCO).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo un barrido de la secuencia peptídica del
CEA para las correspondencias con los patrones consenso para los
péptidos de unión a HLA-A2. Se seleccionaron
péptidos de 9, 10 y 11 unidades para la síntesis, si (a) se
ajustaban al respectivo patrón consenso y (b) divergían
suficientemente de NCA y BGP de modo que se pudiera anticipar una
respuesta antigénica. Se sintetizó un péptido NCA que no satisfacía
ninguno de los patrones consenso para HLA-A2 humano
como control. Las síntesis se llevaron a cabo en un sintetizador de
péptidos Applied Biosystem Modelo 432A personal y los productos se
disolvieron en disolución acuosa, se esterilizaron por filtración y
se congelaron a -70ºC con una concentración de 2 mg/ml. La pureza de
los péptidos era >90% cuando se analizaron por cromatografía de
líquidos de alto rendimiento (HPLC). Los péptidos de CEA están
listados en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la unión de los péptidos de CEA a la
molécula HLA-A2 por aumento de la expresión de
HLA-A2 de células T2 como se demostró por
citometría de flujo. El ensayo de unión del péptido a células T2 se
ha publicado recientemente. Nijman, H.W., y col. Eur. J.
lmmunol. 23:1215-1219, (1993). Brevemente, se
incubaron partes alícuotas de 0,5-1 x 10^{6}
células T2 en IMDM exento de suero con péptidos en una concentración
de 50 \mug/ml en placas de cultivo de 24 pocillos a 37ºC en
CO_{2} al 5% durante una noche. Las células T2 se lavaron y se
tiñeron con un anticuerpo A2, 28 específico de
HLA-A2 (nº 189 HA-1, One Lambda,
Inc. Canoga Park, CA, EE.UU.) usando 10 \mul de 1x dilución de
trabajo/10^{6} células. Se usó MOPC-104E
(Cappel/Organon Teknika Corp., West Chester, PA) como isotipo de
control. Después, las células se lavaron 3 veces y se incubaron con
una dilución 1:100 de IgM anti-ratón Phycoprobe PE
(Biomeda Corp., Foster City, CA). Los análisis se llevaron a cabo
usando el FACScan como antes. Las células se mantuvieron en hielo
durante toda la preparación y tinción de las células, salvo que se
exprese lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas de linfocitos B se generaron por un
procedimiento estándar, Blumberg, R.S., y col., J. Infect.
Dis. 155: 877-880, (1987) usando el líquido
sobrenadante de la línea celular de mono tití B95-8
que contenía EBV. Se usó suero AB humano mezclado en todos los
cultivos celulares en este estudio. Las líneas de linfocitos B
inmortalizados por EBV se transdujeron con una construcción
retrovírica de expresión de CEA. Robbins, P.F., y col. Cancer
Res. 51: 3657-3662, (1991). La transducción se
llevó a cabo por cocultivo de linfocitos B inmortalizados por EBV
con líneas de células PA317-CEA de empaquetamiento
de retrovirus anfotrófico productivamente transducidas como
describen Tsang y col. Tsang, K.Y., y col., J. Immunother.
13: 143-152, (1993). Se seleccionaron transductores
de linfocitos B inmortalizados por EBV en medio que contenía G418 en
una concentración activa de 0,7 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) se obtuvieron de sangre heparinizada de pacientes con
carcinoma metastático en un ensayo clínico en fase I, usando vacuna
recombinante en la que el gen de CEA se había insertado en un virus
vacunal atenuado (rV-CEA). Kantor, J., y col., J.
Natl. Cancer Inst. 84: 1084-1091, (1992);
Kantor, J., y col., Cancer Res. 52:
6917-6925,(1992). Se obtuvieron PBMC antes y después
de la administración de 3 inyecciones de rV-CEA en
intervalos mensuales de 10^{5} ufp (Vac 7), 10^{6} ufp (Vac 6),
y 10^{7} ufp (Vac 24) por inyección. Las PBMC de los pacientes se
separaron usando un gradiente en medio de separación de linfocitos
(Organon Teknika, Durham, NC, EE.UU.) como se ha descrito
previamente. Boyum, A., Cand. J. Clin. Lab. Invest.
21:77-80 (1968). Las PBMC lavadas se volvieron a
suspender en medio completo: RPMI 1640 (GIBCO) complementado con
suero AB humano mezclado al 10% (Pel-Freeze Clinical
System, Brown Deer, Wi, EE.UU.), glutamina 2 mM, penicilina 100
U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml (GIBCO). Se añadieron 2 x
10^{5} células en medio completo en un volumen de 100 \mul a
cada pocillo de una placa de ensayo de fondo plano de 96 pocillos
(Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). Se añadieron péptidos a los
pocillos en una concentración final de 50 \mug/ml. Los cultivos
se incubaron durante 5 días a 37ºC en una atmósfera humidificada que
contenía CO_{2} al 5%. Después de separar el medio que contenía
péptidos, luego se suministró a los cultivos IL-2
humana (10 U/ml) durante 11 días, rellenándose el medio que contenía
IL-2 cada 3 días. Las incubaciones de 5 días de
péptido más 11 días de IL-2 constituyen 1 ciclo. Los
cultivos primarios se volvieron a estimular con el mismo péptido
(50 \mug/ml) el día 16 para empezar el siguiente ciclo. Se
añadieron 5 x 10^{5} PBMC autólogas irradiadas (4.000 rad) en un
volumen de 50 \mul en medio completo como células presentadoras de
antígeno (APC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcaron diferentes células diana con 50
\muCi de 111-Indio (^{111}In) oxina
(Medi-Physics Inc., Arlington, IL, EE.UU.) durante
15 min. Se añadieron células diana (0,5 x 10^{4}) en 100 \mul a
cada uno de los 96 pocillos de placas de ensayo con fondo en U
(Costar). Las dianas marcadas se incubaron con péptidos en una
concentración final de 50 \mug/ml durante 60 min a 37ºC en
CO_{2} antes de añadir las células efectoras. Las células
efectoras se suspendieron en 100 \mul de medio completo
complementado con suero AB humano mezclado al 10% y se añadieron a
las células diana, y las placas después se incubaron a 37ºC en
CO_{2} al 5% durante 12 a 18 h. Se recogió el líquido sobrenadante
para el recuento gamma usando marcos Skatron Harvestor (Sterling,
VA, EE.UU.). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Se
calculó la lisis específica usando la siguiente fórmula:
% de lisis =
\frac{\text{liberación observada (cpm - liberación espontánea
(cpm))}}{\text{liberación total (cpm) - liberación espontánea
(cpm)}} x
100
La liberación espontánea se determinó a partir
de los pocillos a los que se añadieron 100 \mul de medio completo.
La radiactividad liberable total se obtuvo después de tratamiento de
las dianas con Triton X-100 al 2,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionó en los líquidos sobrenadantes de
linfocitos T expuestos durante 3 días a péptidos y APC en medio
exento de IL-2 con una relación de respondedor a
estimulantes 4:1 (4 x 10^{6} : 10^{6} células/ml) la secreción
de TNF-\alpha usando el kit de inmunoensayo con
enzimas ligadas (Gensyme, Cambridge, MA, EE.UU.). Los resultados se
expresaron en pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento para el análisis por citometría
de flujo monocolor se ha publicado previamente. Guadagni y col.,
Cancer Res. 50:6248-6254 (1990). Brevemente,
se lavaron 1 x 10^{6} células 3 veces con PBS de Dulbecco exento
de Ca^{2+} (DPBS) y después se tiñeron durante 1 h con 1 \mug de
AcM contra CD3 (Beckton Dickinson, San Jose, CA), CD4 (Becton
Dickson), CD8 (Becton Dickinson), HLA de clase 1 (W6/32)
(Sera-Lab, Sussex, England), HLA de clase II (DR)
(Beckton Dickinson), y MOPC-21 (Cappel/Organon
Teknika Corp., West Chester, PA) en un volumen de 100 \mul de PBS
que contenía albúmina de suero bovino al 1%. Se usó AcM
anti-CEA COL-1 como 100 \mul de
líquido sobrenadante del cultivo. Después, las células se lavaron 3
veces con DPBS frío y se incubaron durante 1 h adicional en
presencia de dilución 1:100 (volumen de 100 \mul de PBS que
contenía albúmina de suero bovino al 1%) de Ig
anti-ratón de cabra conjugada con fluoresceína
(Kirkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD). Las células se
volvieron a lavar 3 veces con DPBS y se volvieron a suspender en
DPBS en una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. Las células se
analizaron inmediatamente usando un FACScan Beckton Dickinson
equipado con un láser azul con una excitación de 15 nW a 488 nm. Los
datos se recogieron de 10.000 células usando el sistema "live
gate", se almacenaron y se usaron para generar resultados.
El procedimiento para el análisis por citometría
de flujo de doble color era similar al análisis monocolor con las
siguientes excepciones. Los anticuerpos usados eran conjugado de
fluoresceína anti-CD4, conjugado de ficoeritrina
anti-CD8, anti-IgG, conjugado de
fluoresceína y conjugado de ficoeritrina
anti-IgG_{2a} (Becton Dickinson). La tinción se
hizo simultáneamente durante 1 h, después de la cual las células se
lavaron 3 veces, se volvieron a suspender como antes, y se
analizaron inmediatamente usando un separador FACSort de Becton
Dickinson equipado con un láser azul con una excitación de 15 nW a
488 nm equipado con el programa Lysis^{TM}II.
\vskip1.000000\baselineskip
El fenotipado de HLA de pacientes lo realizó
generosamente el Tissue Typing QC Laboratory, Naval Medical Research
Institute usando un ensayo de microcitoxicidad dependiente de
anticuerpo estándar y un panel definido de antisueros
anti-HLA. Los fenotipos de HLA eran los siguientes:
paciente Vac24 [HLA-A2.24 (9); B 44 (12,w4), 51
(5,W4); DR 4,11 (5); DQ 3,7 3); DR w52,53]; paciente VacO1
[HLA-A28.31; B14.35; DR1, 4; DQ1.3; Drw53]; paciente
Vac23 [HLA-A1, 26 (10); B8 (w6), 60 (40,w6); CW3.7;
DR0103, 15 (2); DQ5 (1),6(1)]; paciente Vac32
[HLA-A3, 68(28); B7 (w6),51 (5,w4); CW7; DR4,
15 (2); DQ1,8(3); DRw53]; paciente
Vac6[HLA-A2,24(9); B13(W4);
CW6; DR7, 8; DQ4; DR53], y paciente Vac7 [HLA-A2;
B7(W6); CW7: DR15(2), 17(3); Dal,2; DR52].
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc del gen de HLA-A2.1 y el
gen de \beta2-microglobulina humana en el vector
del virus vacunal se obtuvieron del Dr. D. Cole (Surgery Branch,
NCI, NIH). Estos genes se insertaron en el gen de TK en el plásmido
pSCII, permitiendo que se produjera la recombinación homóloga con el
gen de TK vírico. O'Neil, B.H., y col., J. Immunol. 151:
1410-1418, (1993). Se incubaron las células diana en
una concentración de 1 x 10^{7}/ml en medio RPMI1640 completo
complementado con BSA al 0,1%, con un volumen igual de virus vacunal
(10^{8} unidades formadoras de placa/ml) en el mismo medio a 37ºC
durante 1,5 h. Después, las células se ajustaron a una concentración
de 5 x 10^{5}/ml en medio completo y se incubaron durante 3 h a
37ºC. La coinfección de
vacunal-HLA-A2 y
vacunal-\beta2-microglobulina se
hizo con una multiplicidad de infección de 10:1.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estadístico de las diferencias entre
medios se hizo mediante un ensayo T pareado.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que se conoce la secuencia entera de
aminoácidos del CEA humano y se han descrito los patrones consenso
de HLA de clase I A2 [Falk, K., y col., Nature 351:
290-296(1991); Hunt, D.F., y col.,
Science 255: 1261-1263, (1992)], se llevaron
a cabo estudios para identificar una serie de péptidos que se
unirían potencialmente a moléculas A2 de clase I. Se escogieron A2
puesto que es la molécula HLA de clase I más común, que está
representada en aproximadamente 50% de los caucasianos
norteamericanos y 35% de los afroamericanos. Lee J.,
Springer-Verlag, New York 6: 154, (1990). Por lo
tanto se examinó en la secuencia peptídica de CEA las
correspondencias con los patrones consenso para los péptidos que se
unen a HLA-A2. Los péptidos se seleccionaban si
además su secuencia divergía lo suficiente de las secuencias de NCA
y BGP relacionados con CEA. La secuencia de aminoácidos de CEA
humano (nº de acceso a GeneBank M17303) se seleccionó usando un
algoritmo de predicción [Parker, K.C., y col., J. Immunol.
152: 163-175, (1994)] que combina una búsqueda para
restos de anclaje con asignaciones numéricas a todos los restos en
todas las posiciones. Se sintetizaron 10 péptidos usando este
algoritmo, con una longitud en el intervalo de 9 a 11 aminoácidos.
6 de estos péptidos también contenían el patrón de
HLA-A2 de leucina o isoleucina en la posición 2 y
valina o leucina en el C terminal. Otro péptido
(CAP-7) también tenía el patrón para la unión a
HLA-A3. DiBrino, M., y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. 90: 1508-1512, (1993). Todos los péptidos
se seleccionaron para tener una homología mínima con las regiones
paralelas de NCA y BGP, después de la alineación óptima de estas
últimas secuencias con CEA. Los péptidos de 9, 10 u 11 aminoácidos
que cumplían estos criterios se seleccionar para la síntesis y
purificación; se denominaron CAP (Péptido de antígeno
carcinoembrionario)-1 a 10 (SEQ ID NOS:
1-10). Sus secuencias de aminoácidos y posiciones en
la molécula de CEA se dan en la Tabla 7. La designación positiva (P)
o negativa (N) (Tabla 7) se refieren a la unión prevista a
HLA-A2.
El ensayo de unión a células T2 se ha usado para
predecir los patrones consenso de HLA-A2 humano.
Nijman, H.W., y col., Eur. J. Immunol.
23:1215-1219 (1993). En este ensayo, la unión a un
péptido adecuado da como resultado el aumento de la expresión de
HLA-A2 de superficie en células T2, que se puede
cuantificar por FACScan usando un anticuerpo
anti-HLA-A2. Como puede verse en la
Tabla 7, 7 de los péptidos de CEA (CAP-1 a
CAP-7) tenían puntuación positiva para la unión a T2
(los péptidos se denominaron CAP-1 a 10
retrospectivamente basándose en su unión cuantitativa a T2). Puesto
que el péptido 571-579 (denominado
CAP-1) demostró el nivel más alto de unión a T2,
también se sintetizó y ensayó el péptido que reflejaba el análogo de
NCA (el péptido de NCA correspondiente obtenido después de la
alineación óptima de NCA y CEA); este péptido, denominado
NCA-1, mostró unión de fondo a T2 (Tabla 7). Esto
estaba de acuerdo con el hecho de que una sustitución de aminoácido
en NCA había abolido uno de los restos de anclaje de A2 (Leu por Arg
en la posición 2).
En un intento de establecer líneas de linfocitos
T de pacientes que habían recibido la construcción
rV-CEA, se obtuvieron PBL de 3 pacientes
(denominados Vac6, Vac7 y Vac24) que expresaban el alelo
HLA-A2 y se pulsaron alternativamente con péptido
CAP-1 50 \mug/ml e IL-2 (10 U/ml)
como se describe en la sección de procedimientos. En los 3 casos se
pudieron establecer las líneas de células T que eran citotóxicas
para las células T2 cuando se pulsaron con el péptido
CAP-1. La figura 1 muestra los resultados de estos
ensayos usando las líneas de linfocitos T de los pacientes V24 y V6.
Se eligió la línea de linfocitos T del paciente Vac24 para otro
estudio.
Los PBL del paciente Vac24 (antes y después de
vacunación con 3 dosis de 10^{7} ufp de rv-CEA a
intervalos mensuales) se pusieron en placas de 96 pocillos y se
pulsaron con el péptido CAP-1 y después
IL-2 como se describe en la sección de
procedimientos. Cada exposición a péptido y a IL-2
se consideró un ciclo de estimulación. Como se ve en la Tabla 8, 1,
2 ó 3 ciclos de péptido CAP-1 e IL-2
no dieron como resultado el crecimiento de células en ninguno de
los 96 pocillos usando los PBL de preinmunización. A diferencia de
esto, después de un ciclo de estimulación de los PBL después de
vacunación del mismo paciente, 66 de los 96 pocillos (68%)
demostraron crecimiento de células, que se mantuvo durante 4 ciclos
de estimulación. Es interesante que después de 4 ciclos de
estimulación de PBS preinmunización, 2/96 pocillos (2%) presentaban
crecimiento celular. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis
de que existe una población minoritaria de linfocitos T en este
pacientes capaz de reconocer un epítopo de CEA específico
(571-579), y que estas células se expandían
clonalmente como resultado de la administración
de rV-CEA.
de rV-CEA.
También se encontraron suficientes PBS antes y
después de vacunación con rV-CEA con una dosis de
10^{7} ufp de 2 pacientes no HLA-A2: Vac32 (HLA
A1,26) y Vac23 (HLA A3,68). Puesto que no se tiene una base o la
base es pequeña para predecir qué péptidos pueden unirse a estos
haplotipos, se usaron 9 de los péptidos de CEA en un intento de
establecer líneas de linfocitos T. Usando el péptido
CAP-1 con IL-2 como se ha descrito
antes, no se pudieron establecer líneas de linfocitos T a partir de
los PBL de preinmunización del paciente Vac32 o Vac23 (Tabla 9).
Sin embargo, usando PBL de después de inmunización con
rV-CEA, las líneas de linfocitos T se establecieron
después de 3 ciclos de estimulación en 25/48 pocillos (52%) para el
paciente Vac32 y en 21/48 pocillos (43%) para el paciente Vac23
(Tabla 9).
Se observó un contraste similar en los PBL de
antes de vacunación frente a después de vacunación de los pacientes
Vac32 y Vac23 con una mezcla de péptidos de CEA
CAP-4, 6 y 7 (Tabla 9). Se usaron combinaciones como
un cribado inicial para conservar los PBL. Es significativo,
quizás, que los PBL de Vac32 (HLA-A3 positivo)
mostraron pruebas de crecimiento celular en presencia de
CAP-7, el péptido que lleva el patrón de unión de
HLA-A3. Debe observarse que estos resultados
sugieren que un péptido que muestra que se une a
HLA-A2 también puede estimular líneas de linfocitos
T después de unión a algunos antígenos no A2; las posibles razones
de esto se discutirán a continuación con detalle. Sin embargo, se
decidió primero caracterizar las respuestas de linfocitos T en el
paciente Vac24 debido a la importancia implicada de la unión de MHC
y la activación de linfocitos T. No obstante, es prometedor que los
PBL de 5/5 pacientes mostraron signos de respuesta de linfocitos T
frente al péptido CAP-1 después de inmunización con
rV-CEA.
Se llevaron a cabo estudios de citometría de
flujo para el fenotipado de las líneas celulares V24T, V6T y V7T.
Los resultados se muestran en la Tabla 10. Las células dieron
tinción doble positiva tanto para CD8 como DC4 y las líneas
celulares V24T y V6T, mientras que la línea celular V7T era
CD8^{+}.
Para determinar si la línea de linfocitos T de
Vac24 (denominada V24T) podía producir la lisis de linfocitos B
autólogos que presentaran el péptido CAP-1, los
linfocitos B del paciente Vac24 primero se transformaron con el EBV
y después se pulsaron (es decir, se incubaron) con el péptido
CAP-1. Como se ve en la Tabla 11, las células V24T
eran capaces de producir la lisis de linfocitos B autólogos cuando
se pulsaban con CAP-1, pero cuando un linfocito B
transformado por EBV alogénico (no HLA-A2) era
pulsado con el mismo péptido, no se observaba lisis. Cuando se usó
el péptido NCA-1 que reflejaba la región análoga en
la molécula NCA para pulsar los linfocitos B de Vac24, no se
observó lisis con las células V24T. Como se muestra en la Tabla 7,
esto no era inesperado puesto de 3 de los 9 aminoácidos de
NCA-1 diferían de los de CAP-1,
incluyendo un resto de anclaje.
Se llevaron a cabo estudios para determinar si
el péptido CAP-1 podía inducir la secreción del
TNF-\alpha de las células V24T citolíticas. Como
se muestra en la figura 2, la incubación de las células V24T con
linfocitos B autólogos pulsados con el péptido CAP-1
dio como resultado la producción de sustancial
TNF-\alpha, mientras que los péptidos de control
CAP-9 y CAP-10 no pudieron mostrar
este efecto.
Aunque los resultados anteriores indican que los
linfocitos B autólogos presentan el péptido CAP-1 a
las células de Vac24, dando como resultado la lisis de los
linfocitos B, no indican que las APC humanas puedan procesar
endógenamente la molécula de CEA entera de una forma que se una a
las moléculas HLA-A2 para la presentación en la
superficie celular. Para ayudar a contestar esta cuestión, se
transdujeron linfocitos B transformados por EBV del paciente Vac24
con el gen de CEA humano entero usando un vector retrovírico (véase
Procedimientos). Como se ve en la Tabla 12, las células
transducidas con CEA ahora expresan CEA y el proceso de transducción
no tenía efecto en la expresión de moléculas de HLA de clase I y
clase II (células que las llevan).
Como se muestra en la Tabla 13, los linfocitos B
autólogos transducidos con el gen de CEA ahora pueden servir como
dianas para los CTL de V24. Por lo tanto, estos resultados
demuestran que un producto del gen de CEA puede ser procesado
endógenamente por linfocitos B autólogos y presentado en la
superficie celular en el entorno con MHC de clase I para inducir la
lisis de linfocitos T. La cuestión que queda ahora es si las células
de carcinoma humano pueden actuar de la misma forma que las APC y
por lo tanto servir como dianas potenciales para las células V24T.
Como se ve en la Tabla 13, las células de carcinoma alogénico no A2
SW1417 y HT-29, que no expresan CEA sustancial, no
pueden servir como dianas, mientras que las células de carcinoma
SW403 A2 positivas que expresan CEA
son lisadas.
son lisadas.
Para demostrar más la naturaleza restringida de
HLA-A2 de las células V24T en la lisis de células de
carcinoma humano, se usó la línea de células de carcinoma humano
SW837 no A2, CEA positivas. Estas células no se infectaron, se
infectaron con virus vacunal natural, o se infectaron con virus
vacunal recombinante que contenía el gen de HLA-A2.
Como se ve en la tabla 14, sólo las células de carcinoma infectadas
con rV-A2.1 recombinante expresaban A2, y sólo
estas células eran susceptibles de lisis con células V24T. Estos
estudios demuestran además la naturaleza restringida de
HLA-A2 de la lisis específica de CEA de las células
V24T.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Esta invención se ha descrito con detalle
incluyendo sus realizaciones preferidas. Sin embargo, los expertos
en la técnica apreciarán, tras la consideración de esta descripción,
que se pueden hacer modificaciones y mejoras en la misma sin salirse
de la invención como se expone en las reivindicaciones.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Schlom, Jeffrey Panicali, Dennis
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENERACIÓN DE LINFOCITOS T CITOTÓXICOS HUMANOS ESPECÍFICOS PARA ANTÍGENOS AUTOASOCIADOS A CARCINOMA Y SUS USOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: SEWALL P. BRONSTEIN; DIKE, BRONSTEIN, ROBERTS & CUSHMAN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 130 WATER STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: BOSTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MASSACHUSETTS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 02109
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Relase nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Resnick, David S.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.235
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 44933
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 523-3400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 523-6440
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 200291 STRE UR
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Un conjunto de composiciones farmacéuticas
para generar linfocitos T citotóxicos humanos específicos para un
antígeno carcinoembrionario humano, que comprende:
(a) un primer vector de poxvirus para ser
introducido en un huésped en una cantidad suficiente para estimular
la producción de linfocitos T citotóxicos conteniendo dicho primer
vector de poxvirus un segmento de ADN que codifica un antígeno
carcinoembrionario humano (CEA) o un epítopo de CEA que produce
linfocitos T citotóxicos operativamente unido a un promotor capaz de
expresarse en el huésped; y
(b) una composición de refuerzo que comprende:
un segundo vector de poxvirus de un género diferente de dicho
primer vector de poxvirus, conteniendo dicho segundo vector de
viruela el segmento de ADN que codifica el CEA humano o el epítopo
de CEA que crea linfocitos T citotóxicos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 1, en el que el primer poxvirus se selecciona del
grupo de los poxvirus constituido por poxvirus de la viruela
porcina, viruela aviar, viruela ovina y ortopoxvirus.
3. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 2, en el que el ortopoxvirus es el virus
vacunal.
4. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 2, en el que el poxvirus de la viruela aviar es el
de la viruela de aves de corral, viruela del canario o viruela de la
paloma.
5. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 2, en el que el poxvirus de la viruela porcina es el
de la viruela del cerdo.
6. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector del
poxvirus es un ortopoxvirus y el segundo vector de poxvirus se
selecciona del grupo de poxvirus constituido por las de la viruela
porcina, viruela aviar y viruela ovina.
7. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 6, en el que el ortopox es el virus vacunal y el
segundo vector de poxvirus es el de la viruela aviar.
8. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 7, en el que el poxvirus de la viruela aviar es el de
la la viruela de aves de corral.
9. El conjunto de composiciones de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el antígeno de CEA que provoca
linfocitos T citotóxicos es un péptido seleccionado del grupo que
consiste en los SEQ ID NOS: 1-7.
10. El conjunto de composiciones de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que las composiciones se formulan con
un adyuvante o están en una formulación liposómica.
11. El conjunto de composiciones de la
reivindicación 10, en el que el adyuvante se selecciona del grupo
constituido en RIBI Detox, QS21 y adyuvante incompleto de
Freund.
12. Uso, en la preparación de composiciones para
generar linfocitos T citotóxicos humanos específicos para antígenos
carcinoembrionarios humanos, de:
(a) un primer vector de poxvirus para
introducir en un huésped una cantidad suficiente para estimular la
producción de linfocitos T citotóxicos, conteniendo dicho primer
vector de poxvirus un segmento de ADN que codifica un antígeno
carcinoembrionario humano (CEA) o un epítopo de CEA que provoca
linfocitos T citotóxicos, operativamente unido a un promotor capaz
de expresión en el huésped; y
(b) una composición de refuerzo que comprende:
un segundo vector de poxvirus de un género diferente de dicho
primer vector de poxvirus, conteniendo dicho segundo vector de
poxvirus el segmento de ADN que codifica el CEA humano o el
epítopo del CEA que provoca linfocitos T citotóxicos.
\vskip1.000000\baselineskip
13. El uso de la reivindicación 12, en el que el
primer poxvirus se selecciona del grupo de los poxvirus constituido
por poxvirus de la viruela porcina, viruela aviar, viruela ovina y
ortoviruela.
14. El uso de la reivindicación 13, en el que el
ortopoxvirus es el virus vacunal.
15. El uso de la reivindicación 13, en el que el
poxvirus de la viruela aviar es el de la viruela de aves de corral,
viruela del canario o viruela de la paloma.
16. El uso de la reivindicación 13, en el que la
poxvirus de la viruela porcina es el de la viruela del cerdo.
17. El uso de la reivindicación 12, en el que el
primer vector del poxvirus es un ortopoxvirus y el segundo vector
de poxvirus se selecciona del grupo de poxvirus constituido por los
de la viruela porcina, viruela aviar y viruela ovina.
18. El uso de la reivindicación 17, en el que el
ortopoxvirus es el virus vacunal y el segundo poxvirus es el de la
viruela aviar.
19. El uso de la reivindicación 18, en el que el
poxvirus de la viruela aviar es el de la viruela de aves de
corral.
20. El uso de las reivindicaciones 12 a 19, en
el que el antígeno que provoca los linfocitos T citotóxicos de CEA
es un péptido seleccionado del grupo que consiste en los SEQ ID NOS:
1-7.
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