ES2262176T3 - Peptido oligo-epitopo del antigeno especifico de la prostata. - Google Patents

Peptido oligo-epitopo del antigeno especifico de la prostata.

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ES2262176T3 ES97916850T ES97916850T ES2262176T3 ES 2262176 T3 ES2262176 T3 ES 2262176T3 ES 97916850 T ES97916850 T ES 97916850T ES 97916850 T ES97916850 T ES 97916850T ES 2262176 T3 ES2262176 T3 ES 2262176T3
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Abstract

LA INVENCION ES UN PEPTIDO OLIGO-EPITOPO ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO QUE INCLUYE MAS DE UN PEPTIDO EPITOPO AEP, QUE CONFORMA CON UNO O MAS MOTIVOS DE HLA HUMANO DE CLASE I. EL PEPTIDO OLIGO-EPITOPO ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO EN COMBINACION CON VARIAS MOLECULAS HLA DE CLASE I O POR INTERACCION CON VARIOS RECEPTORES DE CELULAS T PROVOCA RESPUESTAS INMUNOLOGICAS CELULARES AEP ESPECIFICAS. EL PEPTIDO OLIGO-EPITOPO ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO ES UTIL COMO INMUNOGENO EN LA PREVENCION O EL TRATAMIENTO DEL CANCER DE PROSTATA, EN LA INHIBICION DE CELULAS PROSTATICAS CANCEROSAS Y EN EL ESTABLECIMIENTO Y CARACTERIZACION DE LINEAS DE CELULAS T CITOTOXICAS AEP ESPECIFICAS.

Description

Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a la generación de respuestas inmunitarias celulares y humorales a un antígeno específico de la próstata (PSA) de mamíferos. Más específicamente, la presente invención se refiere a un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA) útil para la generación de linfocitos T específicos del PSA para la prevención o el tratamiento del cáncer de próstata.
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata es el cáncer diagnosticado más frecuentemente en los hombres y es la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer (Carter et al., 1990; Armbruster et al., 1993). Si se detecta en una etapa inicial, el cáncer de próstata es curable en potencia. Sin embargo, se diagnostican una mayoría de casos en fase terminal cuando ya ha tenido lugar la metástasis del tumor primario (Wang et al., 1982). Incluso es problemático el diagnóstico precoz debido a que no todos los individuos que dan positivo en la prueba en estas identificaciones desarrollan el cáncer. El tratamiento actual para el cáncer de próstata incluye la prostatectomía radical, la terapia con radiación o la terapia hormonal. Ninguna terapia general ha mejorado claramente la supervivencia en los casos de enfermedad resistente al tratamiento hormonal. Con la intervención quirúrgica, no siempre se consigue la erradicación completa del tumor y la recaída observada del cáncer (12 a 68%) depende de la etapa clínica del tumor inicial (Zietman et al., 1993). Por lo tanto, son deseables métodos alternativos de tratamiento que incluyan la profilaxis o la preven-
ción.
El antígeno específico de la próstata (PSA) es un miembro de la familia del gen glandular calicreína de 240 aminoácidos. (Wang et al., 1982; Wang et al., 1979; Bilhartz et al., 1991). El PSA es una serina proteasa, producido por el tejido prostático normal, y segregado exclusivamente por las células epiteliales que revisten los ácinos y los conductos prostáticos (Wang et al., 1982; Wang et al., 1979; Lilja et al., 1993). El antígeno específico de la próstata puede detectarse en bajas concentraciones en el suero de hombres sanos sin pruebas clínicas de cáncer de próstata. Sin embargo, durante los estados neoplásicos, las concentraciones en circulación de este antígeno aumentan drásticamente, correlacionándose con la etapa clínica de la enfermedad (Schellhammer et al., 1993; Huang et al., 1993; Kleer et al., 1993; Oesterling et al., 1991). El antígeno específico de la próstata es actualmente el marcador más extensamente utilizado para el cáncer de próstata. La especificidad para el tejido de este antígeno convierte al PSA en un antígeno diana potencial para la inmunoterapia activa específica (Armbruster et al., 1993; Brawer et al., 1989), específicamente en los pacientes que se han sometido a prostatectomía radical en los que el único tejido que expresa a PSA en el cuerpo estaría en los depósitos metastásicos. Recientes estudios que utilizan la inmunización in vitro han demostrado la generación de células CD4 y CD8 específicas para PSA (Peace et al., 1994; Correale et al., 1995). Sin embargo, aunque se han documentado ocasionalmente respuestas débiles de las células destructoras naturales en los pacientes con cáncer de próstata (Choe et al., 1987), los intentos de generar una respuesta inmunitaria in vivo han tenido éxito limitado. Por ejemplo, varios intentos para inmunizar activamente a pacientes con células de adenocarcinoma de próstata mezcladas con bacilo Calmette-Gurein (BCG) han demostrado poca o ninguna utilidad terapéutica (Donovan et al., 1990). La capacidad para provocar una respuesta inmunitaria como resultado de la exposición al PSA in vivo in vivo sería sumamente útil.
El virus de la vacuna se ha utilizado en la erradicación mundial de la viruela. Este virus se ha demostrado que expresa un amplio intervalo de genes insertados, incluyendo varios genes asociados al tumor tales como p97, HER2/neu, p53 y ETA (Paoletti et al., 1993). Otros virus de la viruela que se han sugerido como útiles para la expresión de múltiples genes incluyen la viruela aviar tal como la difteria aviar. Las citocinas expresadas mediante virus de vacuna recombinante incluyen IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, TNF-\alpha e INF-\gamma (Paoletti et al., 1993). Se está considerando la utilización de virus de la viruela recombinantes, por ejemplo los virus de vacuna, en la terapia del cáncer debido a que se ha demostrado en modelos animales que la presentación conjunta de un inmunógeno débil con las proteínas del virus de la viruela muy inmunógenas puede provocar una fuerte respuesta inmunitaria contra el producto génico insertado (Kaufman et al., 1991, Paoletti et al., 1993; Kantor et al., 1992a; Kantor et al., 1992b; Irvine et al., 1993; Moss et al., 1993). Un virus de vacuna recombinante que contiene el gen del antígeno carcinoembrionario humano acaba de completar las pruebas clínicas en fase I en pacientes de carcinoma sin otras pruebas de toxicidad aparte de las observadas con la vacuna natural contra la viruela (Kantor et al., 1992b).
Actualmente, los modelos para la evaluación de productos terapéuticos para la próstata incluyen el canino (McEntee et al., 1987) y la rata de Dunning (Isaacs et al., 1986); ninguno de estos modelos, sin embargo, es práctico para el estudio de las vacunas recombinantes para el PSA debido a la homología muy baja del PSA de rata y canino con el PSA humano (Karr et al., 1995; Schroder et al., 1982). En cambio, la glándula prostática del macaco de la India es similar en estructura y funcionamiento a la próstata humana (Wakui et al., 1992). En el contexto molecular existe el 94% de homología entre las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos del PSA del macaco de la India (Gauther et al., 1993) y las secuencias del antígeno específico de la próstata humano (Karr et al., 1995; Lundwall et al., 1987). Por lo tanto, el PSA humano es esencialmente un autoantígeno en el macaco de la India. Por consiguiente, el macaco de la India puede servir de modelo para las reacciones inmunitarias anti-PSA autólogo.
\newpage
Dado que el PSA comparte una extensa homología con los miembros de la familia del gen calicreína que se expresan en el tejido normal, es importante utilizar los péptidos epítopos mínimos para impedir la reactividad cruzada no deseada. Estos epítopos se han seleccionado por su divergencia con los miembros de la familia del gen cali-
creína.
Los estudios dados a conocer en el documento US nº de serie 08/500.306 han demostrado que dos péptidos epítopos de PSA (PSA-1 y PSA-3), decámeros seleccionados para conformar los motivos HLA humanos de clase 1-A2, pueden provocar respuestas a CTL tanto en donantes normales como en pacientes con cáncer de próstata. (Correale et al., 1995). La presente invención da a conocer las ventajas de los péptidos PSA-oligo-epítopo que comprenden más de un péptido epítopo de PSA para generar respuestas inmunitarias celulares específicas para PSA.
Ross et al., 1993 describe la inmunoterapia adoptiva de la etapa D2 del cáncer de próstata, resistente al tratamiento hormonal utilizando linfocitos T autólogos activados ex vivo.
Kurkela et al., 1995 describe la expresión del antígeno activo segregado, específico para la próstata humana por células de insecto infectadas por baculovirus recombinante.
Bridon y Dowell, 1995 se refiere a una comparación estructural del antígeno específico de la próstata y de la calicreína glandular humana utilizando modelado molecular.
El documento EP 0 652 014 describe el tratamiento de la hipertrofia prostática por anticuerpos específicamente reactivos contra el PSA humano.
El documento WO 95/04548 se refiere a una vacuna contra el cáncer de próstata capaz de provocar una respuesta inmunitaria para tumores de la próstata.
Sumario de la invención
El primer aspecto de la invención consiste en un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata aislado que comprende unidades repetitivas de más de un péptido epítopo del antígeno específico de la próstata aislado o los análogos peptídicos del mismo, en el que dicho péptido epítopo del antígeno específico de la próstata comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 aminoácidos consecutivos de más de una secuencia de aminoácidos FLTPKKLQCV (SEC. ID nº: 1), VISNDVCAQV (SEC. ID nº: 2), QVHPQKVTK (SEC. ID nº: 3), FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEC. ID nº: 4) o KLQCVDLHV (SEC. ID nº: 9), en el que más de un péptido epítopo del antígeno específico de la próstata aislado o de los análogos de este péptido se unen directamente mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos; y en el que el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata aislado (PSA-OP) genera una respuesta inmunitaria del antígeno específico de la próstata en una población de seres humanos con más de una molécula de tipo HLA clase I, comprendiendo dicha respuesta inmunitaria por lo menos la generación de linfocitos T citotóxicos específicos para PSA.
En una primera forma de realización cada péptido epítopo del antígeno específico de la próstata se fija al mismo o diferente tipo de molécula HLA de clase I.
En otra forma de realización tras la escisión de PSA-OP para producir fragmentos de la escisión de PSA-OP, los fragmentos de la escisión de PSA-OP se fijan a uno o más tipos de moléculas HLA de clase I.
En otra forma de realización los fragmentos de escisión de PSA-OP son producidos por lo menos por una proteasa.
En otra forma de realización los fragmentos de PSA-OP se fijan a uno o más tipos de molécula HLA de clase I seleccionados de entre el grupo constituido por HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 y HLA-B53.
En otra forma de realización el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende un primer péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA1): F L T P K K L Q C V (SEC. ID nº: 1), o análogo de éste y un segundo péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA3): V I S N D V C A Q V (SEC. ID nº: 2) o análogo de éste.
En otra forma de realización PSA1 y PSA3 están directamente unidos mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos, comprendiendo la secuencia enlazadora aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos.
En otra forma de realización el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende además un tercer péptido epítopo del antígeno específico de la próstata o un análogo adjunto al segundo péptido epítopo o análogo del antígeno específico de la próstata.
\newpage
En otra forma de realización el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende:
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1 
\vskip1.000000\baselineskip
o un péptido análogo de éste.
En otra forma de realización el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende una sustitución de valina o tirosina en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo constituido por 148, 149, 160 y 161, o una sustitución de tirosina en la posición 154, o estando constituido dicho análogo por una deleción de aminoácidos en una o más posiciones en la SEC. ID nº: 4, dichas posiciones para la deleción se seleccionan de entre el grupo constituido por 151, 152 y 153.
En otra forma de realización incluso la secuencia enlazadora de aminoácidos está constituida por Asp-Leu-His.
El segundo aspecto de la invención consiste en un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata que comprende más de un péptido epítopo del antígeno específico de la próstata o su análogo, enlazado directamente mediante un enlace peptídico o mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos de 1 a 10 aminoácidos, en el que el PSA-OP genera una respuesta específica para la próstata y comprende un primer péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA1): F L T P K K L Q C V (SEC. ID nº: 1), o el primer análogo de éste, teniendo dicho primer análogo una sustitución de valina en lugar de glutamina, cisteína o glutamina y cisteína, y un segundo péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA3): V I S N D V C A Q V (SEC. ID nº: 2), o el segundo análogo de éste, teniendo dicho segundo análogo una sustitución de valina en lugar de cisteína o una sustitución de tirosina en lugar de la primera valina y opcionalmente un tercer epítopo del antígeno específico de la próstata con la secuencia de aminoácidos Q V H P Q K V T K (SEC. ID nº: 3).
El tercer aspecto de la invención consiste en un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata que comprende una secuencia de aminoácidos que se basa en:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
En el que la valina está sustituida por un resto de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo constituido por la posición 148, la posición 149, la posición 160 y la posición 161 o en el que por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 151, 152 ó 153 se ha eliminado y en el que dicho PSA-OP genera una respuesta inmunitaria del antígeno específico de la próstata en una población de seres humanos con más de un tipo de molécula HLA de clase I.
\newpage
El cuarto aspecto de la invención consiste en un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata constituido por la secuencia de aminoácidos:
3
Otra forma de realización consiste en una composición que comprende el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata y por lo menos una molécula HLA de clase I o una célula que expresa por lo menos una molécula HLA de clase I.
Otra forma de realización consiste en una composición, en la que la molécula HLA de clase I se selecciona de entre el grupo constituido por HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 y HLA-B53.
Otra forma de realización consiste en una composición farmacéutica que comprende el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata y un diluyente, portador o excipiente portador farmacéuticamente aceptable.
Dicha composición puede comprender además un adyuvante, liposomas, interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, interferón, factor de necrosis tumoral, GM-CSF, ciclofosfamina o una combinación de éstos; o puede comprender además un péptido colaborador seleccionado de entre el grupo constituido por el péptido de la gripe, el toxoide tetánico, el epítopo CD4 del toxoide tetánico, la exotoxina A de Pseudomonas y poli-L-lisina.
Otra forma de realización consiste en una secuencia aislada de ADN del antígeno específico de la próstata que comprende una secuencia de ADN que codifica el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
Otra forma de realización consiste en un plásmido o vector vírico que comprende la secuencia del ADN del antígeno específico de la próstata o un vector vírico que comprende la secuencia de ADN de la SEC. ID nº: 14.
En otra forma de realización el vector es un plásmido de E. coli, un vector de Listeria, un virus de la viruela, un virus de la viruela aviar, un virus de la viruela caprina, un virus de la viruela porcina, un virus de la vacuna, baculovirus, adenovirus humano, SV40 o papiloma bovino.
En otra forma de realización una célula huésped comprende dicho plásmido o vector vírico, en la que la célula huésped expresa el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
En otra forma de realización la célula huésped une los fragmentos de escisión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata que puede además ser producido por una proteasa.
En otra forma de realización la célula huésped expresa además un tipo de molécula HLA de clase I seleccionado de entre el grupo constituido por HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 y HLA-B53 o la célula huésped expresa a HLA-A2 o HLA-A3 o a HLA-A2 y HLA-A3.
En otra forma de realización la célula huésped consiste en un antígeno que presenta la célula o una célula dendrítica.
Otra forma de realización consiste en un virus recombinante que comprende un virus en el que se inserta una secuencia de ADN aislada del antígeno específico de la próstata (PSA) que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, el virus recombinante produce la expresión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o sus fragmentos en una célula huésped.
Otra forma de realización consiste en dicho virus recombinante que comprende un virus seleccionado de entre el grupo constituido por virus de la viruela, virus de la viruela aviar, virus de la viruela caprina, virus de la viruela porcina, virus de la vacuna, baculovirus, plásmido de ADN, adenovirus humano, SV40 y papiloma bovino, en la que el virus recombinante produce la expresión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o de sus fragmentos en la superficie de las células huésped infectadas con éste y las células huésped infectadas provocan una respuesta inmunitaria dirigidas contra PSA, las células que expresan PSA, las células que expresan un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o las células que fijan fragmentos de escisión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
En otra forma de realización dicho virus recombinante comprende además una secuencia de ADN que codifica una molécula inmunopotenciadora, que se selecciona de entre el grupo constituido por péptido de la gripe, toxoide tetánico, epítopo CD4 del toxoide tetánico, exotoxina A de Pseudomonas y poli-L-lisina.
Otra forma de realización consiste en una composición farmacéutica que comprende el virus recombinante y un diluyente, portador o excipiente portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un modificador de la respuesta biológica seleccionado de entre el grupo constituido por interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12), interferón, factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), ciclofosfamida y combinaciones de los mismos.
Otra forma de realización consiste en la utilización del virus recombinante para la preparación de una composición destinada a la estimulación del sistema inmunitario de un mamífero contra el antígeno específico de la próstata a fin de impedir la creación y el crecimiento de las células de carcinoma positivas al PSA.
En otra forma de realización el virus recombinante es el virus de la vacuna de la cepa NYC o de la cepa v-WR que puede recombinarse con una cepa de virus de la vacuna humana atenuado.
En otra forma de realización el virus recombinante se combina con un adyuvante o con un modificador de la respuesta biológica seleccionado de entre el grupo constituido por interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12, interferón, factor de la necrosis tumoral (TNF), (GM-CSF) y ciclofosfamida.
Otra forma de realización de la invención consiste en el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata para su utilización en un método de inhibición o destrucción de las células tumorales positivas a PSA, comprendiendo dicho método:
A)
generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA in vitro por estimulación de los linfocitos procedentes de una fuente con una cantidad eficaz del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, solo o en combinación con una o más citocinas, dicha cantidad es eficaz para generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA; y
B)
transferir por adopción los linfocitos T citotóxicos específicos para PSA solos o en combinación con el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata a un mamífero en una cantidad suficiente para inhibir o destruir las células tumorales positivas a PSA.
Otra forma de realización de la invención consiste en el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata para su utilización en un método de inhibición o destrucción de las células tumorales positivas a PSA en un mamífero, comprendiendo dicho método:
A)
generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA in vitro mediante una cantidad eficaz del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, solo o en combinación con un adyuvante o liposomas; y
B)
los linfocitos T citotóxicos específicos para PSA generados de este modo inhiben o destruyen las células tumorales positivas a PSA en el mamífero.
En otra forma de realización el adyuvante utilizado en dicho método se selecciona de entre el grupo constituido por RIBI Detox, QS21, alúmina y adyuvante incompleto de Freund.
En otra forma de realización el oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata se utiliza en un método de generación de una respuesta inmunitaria al antígeno específico de la próstata en una población de personas con más de un tipo de molécula HLA de clase I, comprendiendo dicho método:
administrar una cantidad eficaz del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, solo o en combinación con un adyuvante o las células que presentan el antígeno pulsado del péptido, siendo dicha cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria específica para PSA en una población de personas con más de un tipo de molécula HLA de clase I.
En otra forma de realización se utiliza el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata para la preparación de un medicamento destinado a estimular el sistema inmunitario de un mamífero contra el antígeno específico de la próstata a fin de impedir la creación y el crecimiento de células de carcinoma positivas al PSA.
En las reivindicaciones adjuntas se describen más formas de realización de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta una transferencia Western del PSA de 40 células BSC infectadas con rV-PSA. Las bandas 2 a 4 son los extractos del fluido sobrenadante de las células infectadas durante la noche con rV-PSA a una MOI de 1, en tanto que las bandas 7 a 9 son los extractos de las células infectadas correspondientes. Las bandas 1 y 6 son los extractos del sobrenadante y los extractos celulares de las células infectadas con V-Wyeth. Se desarrolló la transferencia utilizando un MAb específico para PSA humano. Esta transferencia ilustra que las células infectadas con rV-PSA expresan y segregan auténticamente la proteína del PSA de 33 kD.
Las Figuras 2A, 2B y 2C presentan la manifestación de la inmunización de rV-PSA. En la Figura 2A, se midió el área de las lesiones 7 días después de cada inoculación de macacos de la India con V-Wyeth (círculos blancos) o rV-PSA (círculos negros). En la Figura 2B, se controló la duración de la lesión como el tiempo para la desaparición de la postilla. En la Figura 2C, se registró la extensión de la inflamación del ganglio linfático y caracterizó como muy inflamado (3+), es decir más de dos ganglios axilares inflamados; inflamado (2+), es decir uno o dos ganglios fácilmente palpables; poco inflamado (1+), es decir un ganglio era apenas palpable o no inflamado (0), 7 días después de la inoculación con virus de la vacuna. Cada símbolo representa un mono.
La Figura 3 presenta la secuencia de aminoácidos de un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
La Figura 4 presenta la secuencia de aminoácidos que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
La Figura 5 presenta la secuencia de ácidos nucleicos de una inserción (en la secuencia Kpn-I y la secuencia Xho-I) clonada en la vacuna recombinante que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA AA490-594), una señal de tráfico del retículo endoplasmático (señal E3/19K), y un péptido epítopo colaborador T universal, epítopo CD4 del toxoide tetánico (epítopo TT CD4). La inserción 5' \rightarrow 3' presenta la SEC. ID nº: 14. La inserción complementaria 3' \rightarrow 5' presenta la SEC. ID nº: 15.
Descripción detallada de la invención
La invención consiste en un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA). El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata se caracteriza por su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria celular específica contra PSA o una porción del mismo y contra las células que expresan o se unen al PSA o a una porción del mismo en un huésped mamífero.
En general, las proteínas del antígeno asociado al tumor, tal como la proteína PSA, son procesadas por las proteasas intracelulares en pequeños péptidos epítopos que se transportan a continuación a la superficie celular estrechamente unidas en una hendidura en la molécula HLA de clase I. Los linfocitos T reconocen estos pequeños péptidos epítopos solamente cuando están unidos en esta hendidura sobre la célula diana. Las moléculas de clase I del complejo con histocompatibilidad principal (MHC) se encuentran en la superficie de las células incluyendo las células tumorales y son las propias moléculas reconocidas juntamente con el antígeno por los linfocitos T citotóxicos.
Como se da a conocer en la presente memoria, los péptidos epítopos del PSA corto, compuestos por una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 9 a 10 aminoácidos se unen directamente dentro de la hendidura de la molécula HLA de clase I sin tratamiento intracelular. Dos de dichos péptidos epítopos de PSA, PSA-1 y PSA-3 están unidos por una molécula de tipo HLA específica de clase I, es decir, HLA de clase I-A2. Cada uno de estos péptidos epítopos de PSA produce linfocitos T citotóxicos específicos para PSA que lisan las células diana HLA de clase I-A2 de PSA^{+}.
Sin embargo, debido a los polimorfismos en el péptido que se unen a la hendidura de las moléculas de clase I existen variaciones entre los individuos en la capacidad de sus tipos de molécula de clase I para unirse a antígenos. Por lo tanto, mientras que los péptidos epítopos de PSA 9 mer y 10 mer son eficaces para generar linfocitos T citotóxicos en individuos con una HLA de clase I de tipo A2, los mismos péptidos epítopos de PSA 9 mer y 10 mer puede que no sean eficaces o puede que sean menos eficaces para generar linfocitos T citotóxicos en individuos con interacciones diferentes de los complejos HLA-péptido con diferentes moléculas receptoras de linfocitos T, que pueden diferenciar entre individuos.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata y sus análogos de la presente invención que comprende más de un péptido epítopo de PSA de 8 a 12 mer unido presenta la ventaja de provocar respuestas inmunitarias celulares en individuos con diversos tipos o alelo de molécula HLA de clase I. El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata es procesado por las proteasas extracelulares u otros mecanismos que permiten a los fragmentos de la escisión del péptido epítopo del PSA unirse a la hendidura de los mismos o varios tipos diferentes de molécula HLA de clase I.
Por lo tanto, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, en contraste con los péptidos epítopos de PSA individuales más cortos de aproximadamente 8 a 12 mer, es inmunógeno para un segmento amplio de población humana con tipos diferentes de molécula HLA de clase I y diferentes interacciones del receptor de linfocitos T con complejos de péptido y HLA de clase I.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende secuencias peptídicas que fijan el motivo de consenso para por lo menos un tipo de molécula HLA de clase I y contiene preferentemente secuencias peptídicas que fijan el motivo de consenso de más de un tipo de molécula HLA de clase I.
En una forma de realización, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende más de una secuencia peptídica del epítopo PSA de 8 a 12 mer que fija el motivo de consenso para uno o más de los tipos de molécula HLA de clase I, que incluyen pero no se limitan a HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, Aw68 y B53.
En otra forma de realización, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende las secuencias peptídicas de PSA que fijan el motivo de consenso para HLA-A2 y HLA-A3. Aún en otra forma de realización, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende secuencias peptídicas de PSA que fijan el motivo de consenso para HLA-A2, A.3, A11 y B53. El tipo HLA-A3 de molécula HLA de clase I está presente en el 26 y el 17% de caucasianos y negros norteamericanos respectivamente. El tipo HLA-A11 de molécula HLA de clase I está presente en el 40% de la población asiática y HLA-53 está presente en el 22% de los negros. Por lo tanto, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata es útil para generar una respuesta inmunitaria celular contra PSA en un amplio segmento de población humana con diferentes tipos de molécula HLA de clase I.
Cada uno de los péptidos del epítopo de PSA de aminoácidos con 9 y 10 mer son capaces de generar linfocitos T citotóxicos (CTL) in vitro y son capaces de pulsar células diana para la lisis por los CTL específicos para PSA. Estudios de modelado han demostrado que cada uno de los péptidos epítopos de PSA de 9 ó 10 mer se fija en la hendidura de una única molécula HLA de clase I, A2. La presente invención de enlace de varias combinaciones de péptidos epítopos de PSA de 8 a 12 mer considera un inmunógeno en lugar de dos o más inmunógenos por separado, a medida que el péptido oligo-epítopo es procesado eficazmente por las proteasas en la superficie celular que presentan el antígeno o en la superficie celular diana, o es procesado por otros mecanismos para formar fragmentos de la escisión del péptido epítopo de PSA más pequeños apropiados que interactúan o se unen con el mismo tipo de molécula de clase I o con una variedad de tipos de molécula de clase I en la generación de una respuesta celular específica para PSA en la mayoría de la población humana.
El péptido oligo-epítopo de PSA o sus análogos generan linfocitos T citotóxicos que inhiben o lisan células diana que expresan o han unido a éstas PSA y células diana que expresan o han unido a éstas un, preferentemente más de un péptido epítopo de PSA de 8 a 12 mer. Además, las células diana inhibidas o lisadas por los linfocitos T citotóxicos pueden presentar un tipo de molécula HLA de clase I o una variedad de tipos de molécula HLA de clase I.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, su análogo o equivalente operativo que comprende más de un péptido epítopo del PSA de 8 a 12 mer que conforma por lo menos el tipo de molécula HLA de clase I, preferentemente más de una molécula de tipo HLA de clase I. Un primer péptido epítopo del PSA que conforma un tipo de molécula HLA de clase I está junto a un segundo péptido epítopo de PSA que conforma un tipo de molécula HLA de clase I humana. Los primer y segundo péptidos epítopos pueden estar unidos directa u opcionalmente mediante una secuencia corta enlazadora de aminoácidos. Los péptidos están unidos por enlaces peptídicos.
Cada uno de los péptidos epítopos de PSA que comprenden el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata pueden variar en el número de aminoácidos pero típicamente comprenden aproximadamente 8 a aproximadamente 12 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 9 a aproximadamente 10 aminoácidos. En una forma de realización, el primer y segundo péptidos epítopos de PSA comprende cada uno aproximadamente 10 aminoácidos.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata puede comprender unidades repetitivas de cada péptido epítopo del PSA o combinaciones de unidades repetitivas. El número total de unidades repetitivas en el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata de cada péptido epítopo del PSA o combinaciones de péptidos epítopos de PSA puede ser aproximadamente 6 a aproximadamente 8.
Cuando se utiliza, la secuencia enlazadora de aminoácidos para unir los péptidos epítopos de PSA de 8 a 12 mer comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos. En una forma de realización, el enlazador comprende aproximadamente tres aminoácidos. En una forma de realización determinada, la secuencia enlazadora comprende Asp-His-Leu. La secuencia enlazadora de aminoácidos se puede escindir mediante actividad proteolítica.
En una forma de realización, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende uno o más péptidos de PSA1 con la SEC. ID nº: 1 o análogos de la misma y uno o más péptidos de PSA2 con la SEC. ID nº: 2 o sus análogos. En una forma de realización preferida, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende un péptido de PSA1 y un péptido de PSA2 unidos.
Además, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende uno o más péptidos epítopos de PSA adicionales unidos al segundo péptido epítopo de PSA. En una forma de realización, un tercer péptido de PSA comprende una secuencia de aminoácidos que se solapa con la secuencia en el terminal carboxilo del segundo péptido epítopo de PSA. El solapamiento en la secuencia puede ser mediante uno a tres aminoácidos. En una forma de realización, el solapamiento es mediante dos aminoácidos. En una forma de realización determinada, un tercer péptido epítopo de PSA comprende QVHPQKVTK (SEC. ID nº: 3) en el que la secuencia de solapamiento es QV.
En una forma de realización preferida, el péptido oligo-epítopo comprende la secuencia de aminoácidos: FLTPKK
LQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEC. ID nº: 4) y análogos y variantes de la misma. En una forma de realización, el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata comprende análogos con sustituciones que incluyen pero no se limitan a valina en una o más posiciones en las posiciones de restos de aminoácidos 148, 149, 160 y/o 161. Aún en otra forma de realización, el antígeno específico de la próstata comprende análogos con deleciones que incluyen pero no se limitan a la deleción de uno o más aminoácidos en las posiciones 151, 152 y 153.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata puede obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante, por síntesis química de péptidos o mediante escisión con la proteasa apropiada del PSA natural y aislado.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o los análogos del mismo de la invención pueden formularse en una composición farmacéutica en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable para su utilización como inmunógeno en un mamífero, preferentemente un hombre o primate. La composición puede comprender además uno o más constituyentes para potenciar la respuesta inmunitaria que incluyen pero no se limitan a los modificadores de la respuesta biológica tales como interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, interferón, factor de la necrosis tumoral, GM-CSF y ciclofosfamida. La composición también puede comprender por lo menos una molécula HLA de clase I o una célula que expresa por lo menos una molécula HLA de clase I en combinación con un péptido o más oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o sus análogos.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata se utiliza para la preparación de un medicamento que debe administrarse a un mamífero en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria celular específica para PSA. La eficacia del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata como inmunógeno puede determinarse mediante parámetros in vivo o in vitro como son conocidos en la materia. Estos parámetros incluyen pero no se limitan a los análisis de citotoxicidad específica para el antígeno, regresión de tumores de PSA^{+}, inhibición de las células cancerosas de PSA^{+}, producción de citocinas y similares.
El péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata puede administrarse en una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del mamífero. Pueden proporcionarse varias dosis durante un periodo de semanas tal como el indicado. El medicamento preparado a partir del PSA-OP o sus análogos puede administrarse solo o en combinación con adyuvantes, liposomas, citocinas, modificadores de respuesta biológica u otros agentes en la técnica que son conocidos por potenciar las respuestas inmunitarias.
El PSA-OP puede asimismo conjugarse con otros péptidos colaboradores o moléculas de portador mayores para potenciar la inmunogenicidad del péptido. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan al péptido de la gripe, a la toxoide tetánico, al epítopo CD4 del toxoide tetánico, a la exotoxina A de Pseudomonas, a la poli-L-lisina y similares.
La invención proporciona asimismo un método de generación de linfocitos T citotóxicos específicos para PSA in vivo o in vitro por estimulación de los linfocitos procedentes de una fuente con una cantidad eficaz de un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata solo o en combinación con una o más citocinas en el contexto de una molécula HLA de clase I para generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA. Las procedencias de los linfocitos incluyen pero no se limitan a los linfocitos de la sangre periférica, linfocitos de infiltración en el tumor, ganglios linfáticos y similares.
La invención comprende una secuencia de ADN y análoga y sus variantes que codifica un péptido o su análogo oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata. En una forma de realización la secuencia de ADN comprende:
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y análogos y variantes de la misma.
Están incluidas en el ámbito de la invención las sustituciones y deleciones dentro de la secuencia de ADN con la condición de que las modificaciones produzcan un péptido PSA-OP funcionalmente equivalente o un péptido con aumento de inmunogenicidad. En una forma de realización una secuencia de ADN se sustituye con los ácidos nucleicos apropiados que codifican análogos del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata basado en la degeneración del codón como son conocidos en la materia. Otras sustituciones en la secuencia de ADN incluyen pero no se limitan a la valina en una o más posiciones en la posición de los residuos de aminoácidos 148, 149, 160 y/o 161.
La invención comprende además vectores y plásmidos que comprenden una secuencia de ADN, análogo o una variante de la misma que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata. Los vectores pueden comprender además una o más secuencias de ADN que codifican péptidos colaboradores o molécula(s) portadora(s) grande(s) para aumentar la inmunogenicidad del PSA-OP. Estas secuencias de ADN adicionales codifican moléculas que comprenden, pero no se limitan al péptido de la gripe, toxoide tetánico, al epítopo CD4 del toxoide tetánico, a la exotoxina A de Pseudomonas, a la poli-L-lisina y similares. En una forma de realización, el vector comprende además un epítopo CD4 del toxoide tetánico.
De particular interés son los vectores víricos recombinantes que comprenden una secuencia de ADN, su análogo o variante que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o sus análogos. En una forma de realización, el vector vírico recombinante comprende además un epítopo CD4 del toxoide tetánico. En una forma de realización determinada, el vector vírico recombinante es una vacuna recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, una secuencia de ADN que codifica una señal de tráfico del retículo endoplasmático y una secuencia de ADN que codifica el epítopo CD4 del toxoide tetánico como se representa en la Figura 5.
Las células que pueden expresar el ADN que codifica el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o sus análogos transportados por vectores o plásmidos son células huésped procarióticas y eucarióticas e incluyen pero no se limitan a, E. coli, Listeria, especies de Bacillus, células COS, CV-1, células Vero, células BSC-40, células HuTk143, fibroblastos de embriones de pollo, células prostáticas, células tumorales, células que presentan el antígeno y similares. Cuando las células huésped sean una célula que presenta el antígeno tal como una célula dendrítica, monocitos, macrófagos y similares o una célula diana, la célula huésped debería expresar además por lo menos una molécula MHC de clase I. La molécula MHC de clase I puede expresarse en un gen endógeno o en un gen añadido de forma exógena a la célula huésped.
Los solicitantes han provocado una respuesta inmunitaria específica a PSA en el modelo de macaco de la India colocando el gen del PSA en un vector vírico recombinante, es decir, un vector de viruela tal como un virus de la vacuna.
Además, puede generarse una respuesta inmunitaria a PSA poniendo en contacto el huésped inicialmente con una cantidad suficiente de PSA, o con un linfocito T citotóxico que produzca epítopos de éste, para estimular una respuesta inmunitaria y a intervalos periódicos poner en contacto el huésped después con más PSA. El PSA adicional, o un linfocito T citotóxico que genera un fragmento del mismo, puede añadirse utilizando un vector vírico de la viruela.
Un fragmento de ADN que codifica el marco de lectura abierto de PSA humano puede obtenerse, por ejemplo, a partir del ARN total extraído de la línea celular del adenocarcinoma de próstata metastásico humano, LNCaP.FGC (CRL 1740, American Type Cell Culture (ATCC), Rockville, MD) por PCR de transcriptasa inversa utilizando cebadores de oligonucleótido específico para PSA 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTACCACCTGCA 3' (SEC. ID nº: 16), 5' TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3' (SEC. ID nº: 17). La secuencia del ADNc del PSA se ha publicado (Lundwall et al., 1987).
El PSA humano recombinante puede obtenerse utilizando un sistema de expresión de baculovirus según el método de Bei et al., J. Clin. Lab. Anal., 9.261-268 (1995).
Vector vírico
Las técnicas básicas para la preparación de virus de ADN recombinante que contienen una secuencia de ADN heteróloga que codifica el antígeno autoasociado al carcinoma o el epítopo que produce linfocitos T citotóxicos son conocidas por los expertos en la materia e implican, por ejemplo, la recombinación homóloga entre las secuencias del ADN vírico que flanquean la secuencia de ADN en un plásmido del donante y las secuencias homólogas presentes en el virus paterno (Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982)). Por ejemplo, los vectores víricos recombinantes, tal como el vector vírico de la viruela pueden utilizarse para administrar el gen. El vector puede construirse, por ejemplo, en etapas conocidas en la materia, p. ej., análogas a los métodos para crear recombinantes sintéticos del virus de la viruela descrito en la patente US nº 5.093.258. Otras técnicas incluyen la utilización de una única secuencia de la endonucleasa de restricción que está presente en la naturaleza o insertada artificialmente en el vector vírico paterno para insertar el ADN heterólogo.
Los virus de la viruela útiles en la puesta en práctica de la presente invención comprenden los virus de la viruela, de la viruela porcina, de la viruela aviar y de la viruela caprina.
El virus de la viruela comprende vacunas, ectromelia y la viruela del mapache. El virus de la viruela preferido es la vacuna.
La viruela aviar incluye la difteria aviar, la viruela del canario y la viruela de la paloma. La viruela aviar preferida es la difteria aviar.
La viruela caprina incluye la viruela de cabras y la viruela de ovejas.
Una viruela porcina preferida es la viruela del cerdo.
Otros vectores víricos que pueden utilizarse incluyen otros virus de ADN tales como el virus del herpes y adenovirus y los virus de ARN tales como los retrovirus y de la polio.
Por ejemplo, la secuencia génica de ADN que debe insertarse en el virus puede colocarse en un plásmido del donante, p. ej. un montaje del plásmido de E. coli, en el que el ADN homólogo a una sección de ADN, tal como la de la secuencia de inserción del virus de la viruela donde el ADN debe insertarse ha sido insertada. Independientemente la secuencia génica del ADN que debe insertarse está ligada a un activador. El enlace activador-gen está colocado en el montaje del plásmido de modo que el enlace activador-gen está flanqueado en ambos extremos por el ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una zona del ADN del virus de la viruela que es la zona de inserción deseada. Con un vector vírico de la viruela paterno, se utiliza un activador del virus de la viruela. El montaje del plásmido resultante se amplía a continuación por desarrollo en la bacteria de E. coli y se aísla. Preferentemente, el plásmido contiene asimismo un origen de replicación tal como el origen de replicación del E. coli y un marcador tal como un gen con resistencia a antibióticos para la selección y propagación en el E. coli.
En segundo lugar, el plásmido aislado que contiene la secuencia génica del ADN que debe insertarse está transfectado en un cultivo celular, p. ej. fibroblastos de embriones de pollo, junto con el virus paterno, p. ej. virus de la viruela. La recombinación entre el ADN del virus homólogo en el plásmido y el genoma vírico respectivamente produce un virus de viruela recombinante modificado por la presencia del montaje activador-gen en su genoma, en una secuencia que no afecta la viabilidad del virus.
Como se indicó anteriormente, el gen se inserta en una zona (zona de inserción), en el virus que no afecta la viabilidad el virus del virus recombinante resultante. El especialista experto puede identificar fácilmente dichas zonas en un virus, por ejemplo, al azar probando segmentos de ADN del virus para las zonas que permiten la formación recombinante sin afectar gravemente la viabilidad vírica del recombinante. Una zona que puede utilizarse fácilmente y está presente en muchos virus es el gen de la timidina cinasa (TK). Por ejemplo el gen de TK se ha encontrado en todos los genomas del virus de la polio examinados [leporipoxvirus: Upton et al., J. Virology, 60:920 (1986) (virus del fibroma de Shope); virus de la viruela caprina: Gershon et al., J. Gen. Virol., 70:525 (1989) (oveja-1 de Kenia); virus de la viruela: Weir et al., J. Virol., 46:530 (1983) (vacuna); Esposito et al., Virology, 135:561 (1984) (virus de la viruela de monos y de la viruela); Hruby et al., PNAS, 80:3411 (1983) (vacuna); Kilpatrick et al., Virology, 143:399 (1985) (virus del tumor del mono Yaba); virus de la viruela aviar: Binns et al., J. Gen. Virol. 69:1275 (1988) (difteria aviar); Boyle et al., Virology; 156:355 (1987) (difteria aviar); Schnitzlein et al., J. Virological Methods; 20:341 (1988) (difteria aviar, viruela de la codorniz); entomopox (Lytvyn et al., J. Gen. Virol., 73:3235-3240 (1992)].
En las vacunas, además de la zona TK, otras zonas de inserción incluyen, por ejemplo, el fragmento M de Hind III.
En la difteria aviar, además de la zona TK, otras zonas de inserción incluyen, por ejemplo, el fragmento J de BamHI [Jenkins et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998 (1991)] el fragmento EcoRI-HindIII, el fragmento EcoRV-HindIII, el fragmento BamHI y el fragmento HindIII indicado en la solicitud EPO nº 0 308 220 A1. [Calvert et al., J. of Virol. 67:3069-3076 (1993); Taylor et al. Vaccine 6:497-503 (1988); Spehner et al. (1990) y Boursnell et al., J. of Gen. Virol. 71 :621-628 (1990)].
En la viruela porcina las secuencias de inserción preferidas incluyen la zona del gen de timidina cinasa.
Además del requisito de que el gen se inserte en una zona de inserción, la expresión lograda del gen insertado por el virus de la viruela modificado requiere la presencia de un activador unido funcionalmente al gen deseado, es decir en la relación apropiada al gen insertado. El activador debe ser colocado de modo que se sitúe corriente arriba del gen que debe expresarse. Los activadores son bien conocidos en la materia y pueden seleccionarse fácilmente dependiendo del huésped y del tipo de célula a la que se quiera dirigir. Por ejemplo en los virus de viruela, deberían utilizarse activadores víricos de la viruela, tales como los activadores de la vacuna de 7,5 k o de la viruela aviar de 40 K tal como FPV C1A. Pueden utilizarse elementos potenciadores en combinación para aumentar el nivel de expresión. Además, en algunas formas de realización se prefiere la utilización de activadores inducibles, que son asimismo bien conocidos en la materia.
Puede generarse una respuesta inmunitaria específica para PSA administrándolo entre aproximadamente 10^{5} y 10^{9} pfu del virus de viruela recombinante, construido como se expuso anteriormente para un huésped, más preferentemente se utilizan 10^{7} pfu. El huésped preferido es un ser humano. Por lo menos un intervalo después, que es preferentemente uno a tres meses después, la respuesta inmunitaria se refuerza administrando más antígeno al huésped. Más preferentemente existe por lo menos un segundo "refuerzo" preferentemente uno a tres meses después del primer refuerzo. El antígeno puede administrarse utilizando el mismo vector vírico de la viruela. El antígeno puede administrarse preferentemente utilizando un segundo vector vírico de la viruela procedente de un género diferente de viruela, o puede administrarse directamente utilizando, por ejemplo, un adyuvante o liposoma. Pueden utilizarse citocinas, p. ej. IL-2, IL-6, IL-12 o moléculas coestimulantes, p. ej. B7.1, B7.2 pueden utilizarse como adyuvantes biológicos y pueden administrarse de manera generalizada al huésped o administrarse conjuntamente por inserción de los genes que codifican las moléculas en el vector de la viruela recombinante.
Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, RIBI Detox (Ribi Immunochemical), QS21 y adyuvante incompleto de Freund.
Generación de linfocitos T citotóxicos
Los linfocitos T citotóxicos específicos para PSA pueden crearse a partir de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) extraídas de un huésped inmunizado como se expuso anteriormente. Por ejemplo, pueden separarse las PBMC utilizando el gradiente del medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC, USA) como se describió anteriormente [Boyum et al., Scand J. Clin. Lab. Invest. 21:77-80 (1968)]. Las PBMC lavadas se vuelven a poner en suspensión en un medio completo, por ejemplo, RPMI 1640 (GIBCO) enriquecido con mezcla de sueros AB humanos al 10% (Pel-Freeze Clinical System, Brown Dear, WI, USA), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y 100 \mug/ml de estreptomicina (GIBCO). Las PBMC a una concentración de aproximadamente 2 \times 10^{5} células en medio completo en un volumen, por ejemplo, de 100 \mul se añaden a cada pocillo de una placa de ensayo con fondo plano de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA, USA). El antígeno o los péptidos se añaden a los cultivos a una concentración final de aproximadamente 50 \mug/ml y se incuban a 37ºC en una atmósfera humidificada que contiene CO_{2} al 5% durante 5 días. Tras la eliminación del medio que contiene el péptido, se proporcionan los cultivos con IL-2 humana reciente (10 U/ml) después de 5 días y se rellenan con medio que contiene IL-2 cada 3 días. Los cultivos primarios se vuelven a estimular con el mismo péptido (50 \mug/ml) el día 16. Se añaden 5 \times 10^{5} PBMC autólogas, irradiadas (4.000 rad) en un volumen de aproximadamente 50 \mul de medio completo como células presentadoras del antígeno (APC). Aproximadamente cinco días más tarde, los cultivos se proveen de medio que contiene IL-2 humana como se describió anteriormente. Se vuelven a estimular las células durante 5 días a intervalos de 16 días.
Cartografía de epítopos
Los linfocitos T citotóxicos de la presente invención pueden utilizarse para determinar el epítopo del PSA que produce un linfocito T citotóxico. Por ejemplo, se puede cortar el PSA en numerosos fragmentos de péptidos. Como alternativa, los fragmentos pueden sintetizarse químicamente. Los linfocitos T citotóxicos pueden colocarse en placas a continuación y añadirse diferentes fragmentos en diferentes pocillos. Únicamente los linfocitos T que reconocen uno de los fragmentos peptídicos preseleccionados como epítopo continuarán expandiéndose, permitiendo de este modo preparar la identificación.
Estos fragmentos pueden utilizarse a continuación para producir linfocitos T citotóxicos en lugar de utilizar la proteína completa. Además, se pueden preparar otros fragmentos que contienen el epítopo para aumentar su capacidad de producir una respuesta a los linfocitos T citotóxicos. Las modificaciones a estos fragmentos son bien conocidas en la materia e incluyen la utilización de conjugados, restos de aminoácidos específicos tales como cistinas, etc.
Análisis farmacéutico
El linfocito T citotóxico puede utilizarse asimismo para identificar compuestos que aumenten la capacidad del antígeno para crear una respuesta al linfocito T citotóxico. Por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos pueden incubarse con un epítopo seleccionado, por ejemplo, en una placa de microvaloración. El compuesto que debe analizarse, p. ej. un fármaco, se añade a continuación al pocillo y se mide el crecimiento de los linfocitos T. La expansión de linfocitos T indica que el compuesto de ensayo potencia la respuesta del linfocito T. Dichos compuestos pueden evaluarse más.
Terapia
Los linfocitos T citotóxicos pueden cultivarse para ampliar su número y a continuación se vuelven a inyectar en el huésped por varios medios. Generalmente, se administran entre 1 \times 10^{5} y 2 \times 10^{11} linfocitos T citotóxicos por infusión, por ejemplo, en una a tres infusiones de 200 a 250 ml cada una durante un periodo de 30 a 60 minutos. Una vez terminadas las infusiones, el paciente puede tratarse con interleucina-2 recombinante a una dosis de 720.000 UI por kilogramo de peso corporal por vía intravenosa cada ocho horas; pueden omitirse algunas dosis dependiendo de la tolerancia del paciente al fármaco. Además, tras la infusión, pueden administrarse más antígeno o fragmentos que contienen epítopo(s) que producen linfocitos T al paciente para expandir más el número de linfocitos T. El antígeno o epítopo puede formularse con un adyuvante y/o puede estar en una formulación liposómica.
Los linfocitos T citotóxicos pueden modificarse asimismo mediante la introducción de un vector vírico que contiene un ADN que codifica a TNF y reintroducirse en un huésped en un esfuerzo para aumentar la actividad antitumoral de las células. Pueden utilizarse asimismo otras citocinas.
Puede administrarse el vector recombinante utilizando cualquier vía aceptable, incluyendo, por ejemplo, escarificación e inyección, p. ej. intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal.
Para la administración parenteral, los vectores recombinantes se inyectarán típicamente en solución acuosa o no acuosa esterilizada, suspensión o emulsión junto con un portador farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica.
Ejemplo de referencia 1
Construcción de vectores Virus de la viruela
Se han desarrollado numerosos virus de la viruela como vectores víricos vivos para la expresión de proteínas heterólogas (Cepko et al., Cell 37:1053-1062 (1984); Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626-4630 (1987); Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3896-3900 (1987); Panicali & Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931 (1982); Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982)). Los virus de la viruela aviar y de la viruela porcina representativos están disponibles en la ATCC con los números de registro VR-229 y VR-363, respectivamente.
Vectores de ADN para recombinación in vivo con un virus paterno
Los genes que codifican antígenos deseados asociados al carcinoma se insertan en el genoma de un virus de viruela de tal manera que les permiten ser expresados por este virus junto con la expresión del complemento normal de las proteínas víricas paternas. Esto puede realizarse en primer lugar construyendo un vector donante del ADN para la recombinación in vivo con un virus de viruela.
En general, el vector donante de ADN contiene los elementos siguientes:
(i)
un origen procariótico de replicación, de modo que el vector pueda ampliarse en un huésped procariótico;
(ii)
un gen que codifica un marcador que permite la selección de células huésped procarióticas que contienen el vector (p. ej. un gen que codifica la resistencia a los antibióticos);
(iii)
por lo menos un gen que codifica una proteína deseada localizada junto al activador de la transcripción capaz de dirigir la expresión del gen;
(iv)
secuencias de ADN homólogas a la zona del genoma vírico paterno donde se inserta(n) el/los gen(es) extraño(s), flanqueando el montaje del elemento (iii).
Los métodos para construir plásmidos del donante para la introducción de múltiples genes extraños en un virus de viruela se describen en el documento WO 91/19803. En general, todos los fragmentos de ADN para la construcción del vector del donante, incluyen fragmentos que contienen activadores de la transcripción y fragmentos que contienen secuencias homólogas a la zona del genoma vírico paterno en los cuales los genes extraños deben insertarse, pueden obtenerse a partir del ADN genómico o de fragmentos de ADN clonados. Los plásmidos del donante pueden ser mono, di o multivalentes (es decir, pueden contener una o más secuencias génicas extrañas insertadas).
El vector donante contiene preferentemente un gen adicional que codifica un marcador que permitirá la identificación de virus recombinantes que contienen el ADN extraño insertado. Pueden utilizarse varios tipos de genes marcadores que permitan la identificación y el aislamiento de los virus recombinantes. Éstos incluyen los genes que codifican la resistencia a los antibióticos o a los productos químicos (p. ej. véase Syropoulos et al., J. Virol., 62:1046 (1988); Falkner y Moss, J. Virol., 62:1849 (1988); Franke et al., Mol. Cell. Biol., 5:1918 (1985), así como los genes tal como el gen lacZ de E. coli, que permiten la identificación de placas víricas recombinantes mediante ensayo calorimétrico (Panicali et al., Gene, 47:193-199 (1986)).
Integración de secuencias de ADN extrañas en el genoma vírico y aislamiento de recombinantes
La recombinación homóloga entre el ADN del plásmido del donante y el ADN vírico en una célula infectada da como resultado la formación de virus recombinantes que incorporan los elementos deseados. Las células huésped apropiadas para la recombinación in vivo son generalmente células eucarióticas que pueden ser infectadas por el virus y transfectadas por el vector del plásmido. Ejemplos de dichas células adecuadas para su utilización con un virus de viruela son los fibroblastos de embriones de pollo, las células HuTK143 (humanas) y CV-1, las células Vero y BSC-40 (mono). La infección de las células con el virus de la viruela y la transfección de estas células con vectores de plásmido está acompañada por técnicas habituales en la materia (Panicali y Paoletti, patente US nº 4.603.112, documento WO 89/03429).
Después de la recombinación in vivo, la descendencia vírica recombinante puede identificarse por una de varias técnicas. Por ejemplo, si el vector donante del ADN está diseñado para insertar genes extraños en el gen de la timidina cinasa (TK) del virus paterno, los virus que contienen el ADN integrado serán TK- y pueden seleccionarse sobre esta base (Mackette et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982)). Como alternativa, la integración conjunta de un gen que codifica a un gen marcador o indicador con el/los gen(es) extraño(s) de interés, como el descrito anteriormente, puede utilizarse para identificar la descendencia recombinante. Un gen indicador preferido es el gen lacZ de E. coli: los virus recombinantes que expresan a 6-galactosidasa pueden seleccionarse utilizando un sustrato cromógeno para la enzima (Panicali et al., Gene, 47:193 (1986)).
Caracterización de antígenos víricos expresados por virus recombinantes
Una vez se ha identificado un virus recombinante, pueden utilizarse una variedad de métodos para analizar la expresión del polipéptido codificado por el gen insertado. Estos métodos incluyen el análisis en placa negra (inmunoanálisis enzimático in situ realizado en placas víricas), análisis de transferencia Western, radioinmunoprecipitación (RIPA) e inmunoanálisis enzimático (EIA).
Ejemplo I
Generación de respuesta inmunitaria específica a PSA Materiales y métodos Virus de vacuna recombinante
Un fragmento de ADN de 786 bp que codifica el marco de lectura abierto completo del antígeno específico de la próstata humano se amplió por PCR de transcriptasa inversa (GeneAmp RNA PCR kit, Perkin Elmer, Norwalk, CT) a partir de ARN completo extraído de la línea celular del adenocarcinoma de próstata metastásico humano, LNCaP.FGC (CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD). La secuencia de aminoácidos prevista procedente de la secuencia de codificación del PSA se demostró que era casi idéntica a la secuencia publicada (Lundwall et al., 1987), diferenciándose solamente en un cambio de asparagina por tirosina en la posición 220. El fragmento de ADN del PSA, que contiene la secuencia de codificación completa para PSA, 41 nucleótidos de la zona 5' no traducida y 520 nucleótidos de la zona 3' no traducida, se insertó en la secuencia de escisión de la endonucleasa de restricción Xba 1 del vector de transferencia pT116 del virus de la vacuna. El plásmido resultante, denominado pT1001, contiene el gen del PSA bajo el control del activador de 40K del virus de la vacuna (Gritz et al. 1990) y el gen lacZ de E. coli bajo el control del activador C1 del virus de la viruela aviar (Jenkins et al., 1991). Los genes extraños están flanqueados por las secuencias de ADN de la zona M de Hind III del genoma de la vacuna. Una cepa purificada en placa procedente de la cepa Wyeth (New York City Board of Health) de la vacuna se utilizó como virus paterno en la construcción del virus de la vacuna recombinante. La generación de virus de la vacuna recombinante se realizó por recombinación homóloga entre las secuencias de la vacuna en el genoma de la vacuna de Wyeth y las correspondientes secuencias en pT1001 en las células RK_{13} infectadas con la vacuna (CCL 37, ATCC) transfectadas con pT1001. Otras líneas celulares para la generación del recombinante incluyen, pero no se limitan, a CV-1 y Vero. El virus recombinante se identificó utilizando un análisis cromógeno, realizado en placas víricas in situ, que detecta la expresión del producto génico lacZ en presencia de indolil-beta-D-galactósido halogenado (Bluo-gal), como se describió anteriormente (Panicali et al., 1986). Se purificaron virus recombinantes azules apropiados mediante cuatro rondas de purificación en placa. Se prepararon soluciones madre de virus clarificando lisados de células RK_{13} infectadas seguido de centrifugación a través de una almohadilla de sacarosa al 36%.
Caracterización de virus recombinante Análisis de Southern de recombinación del ADN
Se analizó el genoma de la vacuna recombinante mediante extracción del ADN vírico, y gestión de endonucleasa de restricción con Hind III y transferencia Southern como se describió anteriormente (Kaufman et al., 1991).
Análisis Western de la expresión proteica
Se infectaron células BSC-40 confluentes con virus de la vacuna natural paterno (denominado V-Wyeth) o vacuna-PSA recombinante (denominado rV-PSA) a una MOI de 1 en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 2%. Tras una infección durante la noche, se eliminó el medio de las células y se precipitó una alícuota con metanol para analizar la presencia del PSA segregado. Las células infectadas se lisaron en tampón de lisis hipotónico (NaCl 150 mM, EDTA 0,05%, KCl 10 mM, PMSF 1 mM) y a continuación se trataron con ultrasonidos. Se realizó la electroforesis de los lisados celulares y los medios de cultivo en un gel de acrilamida al 10% con SDS. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y la transferencia se incubó con un anticuerpo de conejo específico para PSA (P0798, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavaron y a continuación se incubaron con anticuerpo secundario marcado con fosfatasa anti-conejo de cabra (AP, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y se revelaron según las instrucciones del fabricante.
Generación de líneas de linfocitos B
Se crearon líneas celulares de linfoblastoide B (BLCL) autólogas de mono infectando 1 \times 10^{5} PBMC recién aisladas en 100 ml de RPMI 1640 enriquecido con L-glutamina, gentamicina y FCS al 10% (Biofluids, Rockville, MD) con 100 ml de sobrenadante de células S594 (proporcionadas gentilmente por el Dr. M.D. Miller, Harvard Medical School, New England Regional Primate Research Center, Southborough, MA) que contiene el virus del herpes de mandril Herpes papio, en una placa de 96 pocillos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA). Tras la transformación, se expandieron las células y se cambió el medio una vez a la semana.
Inmunización de monos
Doce macacos de la India (Macaca mulatta) macho jóvenes, de 1 a 12 años, se asignaron a tres grupos de vacunación de cuatro animales cada uno. Se prostatectomizó un animal de cada grupo. Los animales se inmunizaron 3 veces los días 1, 29 y 57. Se administraron dosis de 1 \times 10^{7} ó 1 \times 10^{8} PFU de rV-PSA a 4 animales por escarificación en la piel. Se administró V-Wyeth (1 \times 10^{8} PFU) a 4 animales como referencias. Los animales se alojaron y mantuvieron en el Toxicology Research Laboratory, University of Illinois en Chicago (TRL/UIC) según las normas del National Cancer Institute Animal Care and Use Committee y la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Department of Health and Human Services Publication NIH 85-23, revisada en 1985 por el FDA Center for Biologics Evaluation and Research Office of Biological Product Review, Division of Product Quality Control, Pathology and Primatology Laboratory, Bethesda, MD).
Toxicología
Se realizaron exploraciones físicas en animales sedados con ketamina (Ketamine® HCl, 10 mg/kg 1 M.). Se registraron las temperaturas rectales y los pesos en cada mono una vez a la semana. Se observó el punto de vacunación y se midieron con calibre el eritema y la inflamación. Se exploró en cada animal la linfadenopatía zonal, la hepatomegalia y la esplenomegalia. Se registraron asimismo algunas otras anomalías voluminosas.
Se extrajo sangre por venopunción de la vena femoral de animales sedados con ketamina antes y después de cada inmunización. Se realizó un recuento completo de sangre, evaluación química hepática y renal diferencial en cada mono por TRL/UIC. Se compararon los resultados con los valores de primates normales (Kantor et al., 1992b). Las concentraciones en circulación de PSA antes y después de la inmunización se analizaron por radioinmunoanálisis (Tandem^{TM}, Hybritech, San Diego, CA).
Medición de títulos de anticuerpo
Antes y 2 semanas después de cada inmunización, se analizó cuantitativamente por ELISA el anticuerpo anti-PSA. Se recubrieron placas de microvaloración con PSA purificado (100 ng/pocillo, Calbiochem, La Jolla, CA), ovoalbúmina (100 ng/pocillo, Sigma) o 1 \times10^{7} PFU/pocillo de V-Wyeth inactivado por UV en PBS. Se bloquearon las placas con BSA al 2% en PBS, se secaron y se almacenaron a -20ºC hasta que se utilizaron. Se incubaron las placas con suero diluido 1:5, así como un anticuerpo monoclonal para PSA (DAKO M750, Dinamarca) como patrón de referencia, durante 24 horas a 4ºC. Se lavaron las placas varias veces con PBS que contenía BSA al 1% y se incubaron a 37ºC durante 45 min. con IgG anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o antisuero específico con cadena pesada IgM (1:8.000) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) y el anticuerpo se detectó mediante sistema de sustrato HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante. Se leyó la absorbancia de cada pocillo a 405 nm utilizando un lector ELISA de microplacas Bio-Tek EL310 (Winooski, VT).
Análisis linfoproliferante
Se colocaron en placas las BLCL de mono autólogas a una densidad de 3 \times 10^{6} células/pocillo en placas de 24 pocillos con 160 mg/pocillo de PSA purificado (Fitzgerald, Concord, MA) o 160 mg/pocillo de ovoalbúmina (Sigma) a 37ºC durante 24 horas. Las células se irradiaron con rayos \gamma (14.000 rad), se recogieron, se lavaron y se volvieron a poner en suspensión a una concentración final de 1 \times 10^{7}/ml. Las PBMC de mono recientes de sangre heparinizada, se aislaron 6 semanas a 7 meses después de la última inmunización en medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, West Chester, PA). Se evaluaron las respuestas linfoproliferantes por cultivo conjunto con 1,5 \times 10^{5} células con 5 \times 10^{5} células/pocillo de BLCL autólogo en 0,2 ml de RMPI 1640 enriquecido con suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 10% en placas de 96 pocillos de fondo plano (Costar) durante 5 días. Se cultivaron las PBMC con 2 \times 10^{7} PFU/ml de V-Wyeth irradiadas con UV como antígeno de recuerdo o 2 mg/ml de Con-A como referencias positivas. Se marcaron las células durante las 12 a 18 h finales de la incubación con 1 mCi/pocillo de [^{3}H]timidina (New England Nuclear, Wilmington, DE) y se recogieron con un recogedor de células PHD (Cambridge Technology, Cambridge, MA). Se midió la radioactividad incorporada por recuento con centelleo líquido (LS MA 6000IC; Beckman, Duarte, CA). Se promediaron los resultados por triplicado de los pocillos y se publicaron como media \pm SEM.
Resultados Generación y caracterización de virus recombinante
El fragmento de ADNc que codifica el marco de lectura abierto de PSA humano se obtuvo por PCR con transcriptasa inversa utilizando cebadores de oligonucleótido específicos para PSA 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTAC
CACCTGCA 3' (SEC. ID nº: 16), 5' TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3' (SEC. ID nº: 17), y se ligaron en el vector de transferencia pT106 del virus de la vacuna. Este vector contiene un activador potente precoz/tardío del virus de la vacuna (denominado P40) corriente arriba de la secuencia de clonación múltiple para dirigir la síntesis del producto génico insertado. Se comprobaron la ligadura y la orientación del fragmento de ADN del PSA, así como la posición del activador por PCR y secuenciado. Se insertó el montaje del vector híbrido en el punto M de Hind III del genoma vírico de la vacuna mediante recombinación homóloga como se indicó anteriormente (Kaufman, et al., (1991)) y se confirmó mediante sondeo por análisis Southern con ADN radiomarcado con ^{32}P que corresponde a las secuencias de PSA y a las secuencias de la vacuna en la zona M de Hind III (datos no mostrados). La secuencia completa de ADNc del PSA en el clon vírico de la vacuna se demostró que era casi idéntica a las secuencias publicadas (Lundwall, et al., 1987).
Se confirmó la expresión de la proteína recombinante mediante análisis por transferencia Western de los fluidos sobrenadantes y los extractos proteicos de las células BSC-40 infectadas con rV-PSA. Estas células se utilizan de manera rutinaria para la evaluación de los productos recombinantes de la vacuna (Moss et al., 1993). La incubación de las transferencias del sobrenadante celular de las células infectadas con rV-PSA con anticuerpo anti-PSA de conejo pusieron de manifiesto un polipéptido inmunorreactivo único de aproximadamente 33.000 daltons (Figura 1, bandas 2 a 4). Asimismo, la incubación de las transferencias del extracto proteico de las células infectadas con rV-PSA puso de manifiesto una banda única del mismo peso molecular (Figura 1, bandas 7 a 9). Esto es coherente con el tamaño previsto de la molécula de PSA (Armbruster, et al., 1993; Wang, et al., 1982). Las transferencias del sobrenadante celular (banda 1) o las transferencias del extracto proteico (banda 6) de las células infectadas con V-Wyeth de la cepa paterna permanecieron negativas para la expresión de PSA. Estos resultados demuestran de este modo que un virus de vacuna recombinante puede expresar fielmente el producto génico de PSA humano.
Modelo de macaco de la India
La próstata del macaco de la India es estructural y operativamente similar a la próstata humana (Wakui, et al., 1992). En el contexto molecular, existe el 94% de homología tanto entre las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos del PSA del macaco de la India (Gauthier, et al., 1993) y el antígeno específico de la próstata humano (Kerr, et al., 1995; Lundwall, et al., 1987). El PSA humano es esencialmente un autoantígeno en el macaco de la India.
Diseño experimental
La Tabla 1 esboza el protocolo utilizado para la inmunización de 12 macacos de la India con rV-PSA o el V-Wyeth de referencia mediante escarificación en la piel. Se inmunizaron tres grupos de 4 animales con rV-PSA a razón de 1 \times 10^{7} PFU/dosis, rV-PSA a razón de 1 x 10^{8} PFU/dosis o V-Wyeth a 10^{8} PFU/dosis 3 veces a intervalos de 4 semanas. Se seleccionaron las dosis para determinar la dosis máxima tolerada de seguridad así como para obtener respuestas máximas humorales y mediadas por células a PSA.
Se dividieron los macacos de la India en 3 grupos: dosis alta de V-Wyeth, dosis baja de rV-PSA y dosis alta de rV-PSA. Se prostactectomizó quirúrgicamente un animal de cada grupo para llevar en paralelo dos situaciones con respecto a la terapia potencial en el hombre: (a) próstata intacta, con enfermedad primaria y/o metastásica; o (b) pacientes prostatectomizados con depósitos metastásicos de cáncer de próstata. La presencia de una glándula prostática intacta podría servir posiblemente como "drenaje" del antígeno, bien introduciendo anergía por persistencia del antígeno o enmascarando los efectos inmunológicos secuestrando las células reactivas o los anticuerpos.
Consecuencia física de la inmunización
Se analizó el área de las lesiones producida por rV-PSA o V-Wyeth 7 días después de cada inoculación. En general, se observó más crecimiento después de la primera inoculación en comparación con la segunda inoculación (Figura 2A). Después de la tercera inoculación, no hubo inflamación de la zona de vacunación. La duración de la lesión después de cada inmunización fue más corta después de cada inoculación (Figura 2B). La inflamación de la zona del ganglio linfático después de la vacunación fue mayor en la mayoría de los monos después de la primera inmunización, en comparación con la segunda o tercera inmunización (Figura 2C). En general, no se observaron diferencias en estos parámetros con la utilización de rV-PSA o V-Wyeth. Se compararon los monos que recibieron V-Wyeth con los que recibieron rV-PSA con respecto a los síntomas constitucionales. Se observaron elevaciones de temperatura suaves en todos los animales después de la vacunación. No existieron pruebas de pérdida de peso, hepatomegalia o esplenomegalia en ninguno de los animales y no existieron diferencias entre los animales tratados con V-Wyeth o rV-PSA (datos no mostrados). Se determinó el recuento de sangre completa en los animales, las químicas diferenciales y hepáticas y renales. Los recuentos de sangre completa permanecieron con límites normales en todo el estudio tanto en animales inmunizados con V-Wyeth como con rV-PSA (Tabla 2). Se evaluaron las funciones hepática y renal antes de la inmunización y 12 semanas después de la inmunización primaria (Tabla 3). Los parámetros analizados incluían las concentraciones de fosfatasa alcalina, nitrógeno de la urea en la sangre, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, lactato deshidrogenasa y creatina y creatina cinasa. No existió ninguna diferencia significativa entre los animales que reciben V-Wyeth o rV-PSA. No existió PSA detectable en la circulación de ninguno de estos monos después de ninguna inmunización (el límite de detección era de 0,1 ng/ml). En este periodo, que es de 54 semanas después de todas las inmunizaciones, no se observaron toxicidades en los monos de ninguno de los grupos, incluyendo los que se prostatectomizaron.
Respuestas humorales específicas a PSA
Como se indicó en la Tabla 1, se administró V-Wyeth a los monos 1 a 4, mientras que se administró rV-PSA a los monos 5 a 12. En cada uno de estos monos se analizaron en los sueros por ELISA la inmunorreactividad a PSA o V-Wyeth inactivado por UV y la ovoalbúmina como antígeno de referencia. Los sueros extraídos de los monos antes de la vacunación eran negativos a la reactividad a PSA (Tabla 4, PI). Quince días después de la inmunización primaria, los monos en las dosis tanto de 1 \times 10^{8} como 1 \times 10^{7} de los grupos de rV-PSA desarrollaron anticuerpos de IgM de bajo título específicos para PSA (los títulos se determinaron a una dilución de 1:5 del suero). Aunque se analizaron otros isotipos de anticuerpo (IgG, IgA, IgM), solamente se produjo IgM por rV-PSA en todo el periodo de observación de 270 días. Los títulos del anticuerpo disminuyeron durante las 4 semanas antes de la siguiente inoculación. Antes de la segunda vacunación el día 29, 3 de los 4 animales en el grupo de 1 \times 10^{7} de rV-PSA permanecieron positivos al anticuerpo de PSA, mientras que 4 de los 4 animales permanecieron positivos en el grupo de 1 \times 10^{8} rV-PSA. Los títulos del anticuerpo anti-PSA aumentaron después de la segunda vacunación el día 29, pero permanecieron estáticos después de la tercera vacunación el día 57. 270 días después de la inmunización primaria, todos los animales eran negativos al anticuerpo de IgM de PSA. Los monos permanecieron negativos a la IgG específica para PSA en todo el periodo de observación (datos no mostrados). No existió ninguna correlación entre la dosis de rV-PSA y el título de IgM anti-PSA, ni existió ningún efecto aparente de prostatectomía. Todos los sueros de los monos fueron negativos para IgG o IgM a ovoalbúmina en todos los puntos de tiempo; como referencia positiva, sin embargo, el título de IgG en los tres grupos de tratamiento para el virus de la vacuna fue mayor de 1:2000 tan pronto como 29 días después de la inmunización primaria (datos no mostrados).
En general, el virus de la vacuna es un patógeno humano débil (Paoletti et al., 1993). Después de la vacunación, son frecuentes el eritema local, endurecimiento, fiebre de pocos grados y linfadenopatía zonal. El virus se replica en las células epidérmicas de la piel y el virus desaparece normalmente a los 14 días. Todos los monos, si se les administraba V-Wyeth o rV-PSA, presentaban los síntomas habituales de constitución en grado bajo de una infección por el virus de la vacuna (Figura 2). No existieron pruebas de ningún efecto desfavorable como se indicó por los cambios en los recuentos sanguíneos, las químicas hepática y renal, diferenciales (Tablas 2 y 3). Los monos parecían sanos, sin ningún síntoma físico de toxicidad, en todas las 54 semanas de observación.
Aunque el montaje rV-PSA no pudo provocar una respuesta a IgG anti-PSA, las respuestas a IgM específicas para PSA se observaban en todos los monos inmunizados con rV-PSA independientemente de la concentración de la dosis (Tabla 4). Estas respuestas al anticuerpo eran de título bajo, de vida corta y no pudieron ser reforzadas, lo que indica la producción de una respuesta primaria pero no linfocitos B con memoria o maduración por afinidad.
Análisis linfoproliferante específico para PSA
Se analizaron las respuestas a los linfocitos T específicas para PSA en los monos inmunizados con rV-PSA o V-Wyeth utilizando un análisis linfoproliferante. Como se observa en la Tabla 5, las PBMC de todos los monos analizados respondieron, independientemente de si recibieron rV-PSA o V-Wyeth, al mitógeno concanavalina-A de linfocitos, así como con V-Wyeth inactivado por UV del antígeno de recuerdo. Se observaron respuestas diferenciales a PSA frente a medio solo u ovoalbúmina en 1 animal (número 6) en el grupo rV-PSA de 1 \times 10^{7} PFU. Todas las PBMC de los animales en el grupo rV-PSA de 1 \times 10^{8} PFU, sin embargo, respondieron al PSA en este análisis. Este experimento se repitió 5 veces con resultados similares y los datos presentados en la Tabla 5 son de las PBMC aisladas de monos, 270 días después de la inmunización primaria. No se observaron diferencias en las respuestas a los linfocitos T específicos para PSA en los monos prostatectomizados.
Para investigar las respuestas mediadas por las células a la administración de rV-PSA, se realizaron análisis linfoproliferantes utilizando las PBMC de los animales que recibieron la vacuna recombinante. Uno de los cuatro monos que recibió la dosis menor de rV-PSA (1 \times 10^{7} PFU) y cuatro de los cuatro que recibieron la dosis mayor (1 \times 10^{8} PFU) mantuvieron respuestas de linfocitos T específicos a la proteína de PSA hasta 270 días después de la inmunización primaria como se indicó mediante el análisis linfoproliferante (Tabla 5). La prostatectomía pareció no presentar ningún efecto sobre las respuestas humoral o celular de los monos que recibieron rV-PSA. Las pruebas de las respuestas a los linfocitos T específicos para PSA en los monos que carecen de isótopos de anticuerpo maduros podrían ser debidas a dos casos distintos después de la vacunación con rV-PSA: caso independiente de linfocitos T, que conduce a la producción de IgM y caso dependiente de linfocitos T, que conduce a respuestas linfoproliferantes específicas.
TABLA 1 Protocolo de inoculación de macacos de la India con el virus recombinante de PSA y de la vacuna natural
Mono Próstata Inmunógeno Dosis* (PFU)
1 Sí V-Wyeth 1\times10^{8}
2 Sí V-Wyeth 1\times10^{8}
3 Sí V-Wyeth 1\times10^{8}
4 No V-Wyeth 1\times10^{8}
5 Sí rV-PSA 1\times10^{7}
6 Sí rV-PSA 1\times10^{7}
7 Sí rV-PSA 1\times10^{7}
8 No rV-PSA 1\times10^{7}
9 Sí rV-PSA 1\times10^{8}
10 Sí rV-PSA 1\times10^{8}
11 Sí rV-PSA 1\times10^{8}
12 No rV-PSA 1\times10^{8}
* Todos los animales recibieron 3 inmunizaciones a intervalos de 4 semanas. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Recuento medio de WBC, hematocrito y recuento diferencial en macacos de la india que reciben vacuna recombinante o natural
V-Wyeth (n = 4) rV-PSA (n = 8)
Prueba Intervalos Antes de la Después de la Antes de la Después de la
normales inmunización^{a} inmunización^{b} inmunización inmunización
WBC 7-15 \times 10^{3} 5,0 \pm 0,8 5,1 \pm 0,5 5,2 \pm 0,7 5,8 \pm 0,9
Hematocrito 33-43 37,4 \pm 0,2 37,0 \pm 0,1 37,8 \pm 0,4 37,0 \pm 0,5
(vol. %)
Linfocitos 1-7 \times 10^{3} 2,8 \pm 0,7 3,9 \pm 0,5 2,2 \pm 0,4 3,5 \pm 0,8
SEGS^{c} (%) 3-69 2,0 \pm 0,2 0,78 \pm 0,2 2,9 \pm 0,6 1,9 \pm 0,3
Monocitos (%) 0-8 0,1 \pm 0,05 0,2 \pm 0,04 0,1 \pm 0,04 0,2 \pm 0,50
Eosinófilos (%) 0-8 0,1 \pm 0,02 0,2 \pm 0,10 0,1 \pm 0,03 0,1 \pm 0,02
^{a} 1 semana antes de la inmunización primaria
^{b} 12 semanas después de la inmunización primaria
^{c} linfocitos segmentados 
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TABLA 3 Valores medios del análisis medio del suero en macacos de la India que reciben vacuna recombinante o natural
V-Wyeth (n = 4) rV-PSA (n = 8)
Prueba Intervalos Antes de la Después de la Antes de la Después de la
normales inmunización^{a} inmunización^{b} inmunización inmunización
ALKP^{c} (u/l) 200-800 451 \pm 48 610 \pm 33 339 \pm 74 454 \pm 47
BUN^{d} (mg/dl) 12-30 19,0 \pm 3,0 17,8 \pm 0,9 17,1 \pm 0,6 20,5 \pm 1,0
ALT^{e} (u/l) 20-60 25,2 \pm 1,9 22,8 \pm 1,0 28,9 \pm 5,3 25,8 \pm 1,6
AST^{f} (u/l) 40-80 37,8 \pm 2,3 31,8 \pm 4,4 37,9 \pm 3,6 31,9 \pm 2,4
LDH^{g} (u/l) 200-500 194 \pm 20 212 \pm 21 236 \pm 41 194 \pm 13
TABLA 3 (continuación)
V-Wyeth (n = 4) rV-PSA (n = 8)
Prueba Intervalos Antes de la Después de la Antes de la Después de la
normales inmunización^{a} inmunización^{b} inmunización inmunización
Creatina 0,5 \pm 1,0 0,9 \pm 0,10 0,8 \pm 0,03 0,8 \pm 0,05 0,8 \pm 0,02
(mg/dl)
Creatina 500-2.000 662 \pm 112 466 \pm 119 498 \pm 120 563 \pm 81
cinasa (u/l)
^{a} 1 semana antes de la inmunización primaria
^{b} 12 semanas después de la inmunización primaria
^{c} fosfatasa alcalina
^{d} nitrógeno de la urea en la sangre
^{e} alanina aminotransferasa
^{f} aspartato aminotransferasa
^{g} lactato deshidrogenasa 
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TABLA 4 Respuesta del IgM^{a} de primates a la inoculación con rV-PSA
Días después de la inmunización^{b}
Mono Inmunógeno Dosis (PFU) PI^{d} 15 29^{c} 43 57^{e} 71 270
1 V-Wyeth 1\times10^{8} ND^{f} ND ND ND ND ND ND
2 V-Wyeth 1\times10^{8} ND ND ND ND ND ND ND
3 V-Wyeth 1\times10^{8} ND ND ND ND ND ND ND
4^{c} V-Wyeth 1\times10^{8} ND ND ND ND ND ND ND
5 rV-PSA 1\times10^{7} ND >40 5 20 >40 >40 ND
6 rV-PSA 1\times10^{7} ND >40 ND ND 20 20 ND
7 rV-PSA 1\times10^{7} ND >40 5 20 20 20 ND
8^{c} rV-PSA 1\times10^{7} ND >40 5 10 >40 >40 ND
9 rV-PSA 1\times10^{8} ND 20 5 20 10 10 ND
10 rV-PSA 1\times10^{8} ND 20 5 40 >40 NT^{g} ND
11 rV-PSA 1\times10^{8} ND >40 >40 >40 40 >40 ND
12^{c} rV-PSA 1\times10^{8} ND >40 20 40 20 20 ND
^{a} Todos los sueros de los monos fueron negativos para IgG a PSA en todos los puntos de tiempo;
\hskip0.1cm Todos los sueros fueron positivos para IgG al virus de la vacuna (>1:2.000) el día 71.
^{b} Los monos recibieron vacunaciones los días 1, 29 y 57. El suero (1:5) se analizó por ELISA. Los títulos se calcu-
\hskip0.1cm laron utilizando una D.O. de 0,4.
^{c} El animal se prostatectomizó.
^{d} PI, preinmune.
^{e} Se extrajeron muestras de sangre a los animales antes del refuerzo.
^{f} ND, no detectable; el límite de detección fue dilución <1:15.
^{g} NT, no analizado.
TABLA 5 Respuestas a los linfocitos T linfoproliferantes específicos para PSA de las PBMC de macacos de la India 270 días después de la inoculación con rV-PSA
Antígeno^{a}
Mono Inmunógeno Dosis (PFU) Medio Con A Ovoal UV-Wyeth PSA^{d}
1 V-Wyeth 1\times10^{8} 397 65.701 376 24.785 414
2^{b} V-Wyeth 1\times10^{8} NT NT NT NT NT
3 V-Wyeth 1\times10^{8} 450 84.860 522 18.859 413
4^{c} V-Wyeth 1\times10^{8} 532 107.840 553 16.571 387
5 rV-PSA 1\times10^{7} 412 85.276 408 6.040 539
6 rV-PSA 1\times10^{7} 401 96.368 404 7.776 3.134
7 rV-PSA 1\times10^{7} 417 90.801 522 10.908 434
8^{c} rV-PSA 1\times10^{7} 1.069 99.216 744 15.346 484
9 rV-PSA 1\times10^{8} 384 106.248 386 14.499 10.635
10 rV-PSA 1\times10^{8} 432 92.263 404 19.872 18.561
11 rV-PSA 1\times10^{8} 411 94.055 1.063 5.124 16.245
12^{c} rV-PSA 1\times10^{8} 420 124.896 392 11.944 12.945
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Las concentraciones de antígeno fueron: Con a (2 \mu g/ml); ovoalbúmina (100 \mu g/ml); UV Wyeth (2\times 10^{7} pfu/ml); y PSA (100 \mu g/ml). Cada valor representa un CPM medio de las muestras por triplicado. La desviación estándar nunca superó el 10%.\end{minipage}
^{b} NT, no analizado. Los linfocitos B no se transformaron para este animal.
^{c} Se prostatectomizó el animal.
^{d} Los valores en negrita son significativos en comparación con sus valores de referencia medios respectivos
\hskip0.1cm (p<0,001). 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo II
Identificación de epítopos de linfocitos T específicos potenciales para el antígeno específico de la próstata (PSA)
Dado que se conoce la secuencia completa de aminoácidos del PSA humano y se han descrito los motivos del consenso A2 de HLA de clase 1 humanos, se emprendieron estudios para identificar una serie de péptidos que se uniría potencialmente a las moléculas A2 de clase 1. Se seleccionó A2 ya que es la molécula HLA de clase 1 más frecuente que está representada en aproximadamente el 50% de los caucasianos norteamericanos y en el 34% de los americanos africanos. Se examinaron de este modo las compatibilidades de la secuencia peptídica de PSA con los motivos de consenso para los péptidos de unión de HLA A2. Los péptidos se seleccionaban únicamente si su secuencia divergía suficientemente de las secuencias del gen de la calicreína glandular humana (HGK) relacionada con el PSA y del antígeno de la calicreína pancreática (PKA).
Se escaneó la secuencia de aminoácidos del PSA humano utilizando un algoritmo pronóstico que combina una búsqueda de restos de anclaje con asignaciones numéricas a todos los restos en todas las posiciones. El ensayo de fijación de linfocitos T2 se utilizó a continuación para determinar qué péptidos se unen a las moléculas HLA A2 humanas. Como puede apreciarse en la Tabla 6, los péptidos de PSA 141 a 150, 154 a 163 y 146 a 154 puntuaron positivo en este ensayo (Nijman, H. W., et al., Eur. J. Immunol. 23:1215-1219, 1993). La Tabla 7 proporciona la secuencia de aminoácidos de estos péptidos y les compara con las secuencias correspondientes de HGK y
PKA.
TABLA 6 Ensayo de fijación del péptido de PSA
Antígeno MAb A2, 69
Ninguno 127,25^{a}
PSA 141-150 230,34
PSA 146-154 223,97
PSA 154-163 182,30
Se utilizaron péptidos a una concentración de 50 \mug/ml
^{a} Intensidad fluorescente media del canal.
Se utilizó la línea celular CIRA2 como referencia positiva para la tinción de anti-A2 [(241.15)]. 
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TABLA 7 Secuencia de aminoácidos del péptido de PSA
PSA 141-150 F L T P K K L Q C V (SEC. ID nº: 1)
HGK - - R - R S - - - - (SEC. ID nº: 7)
PKA - S F - D D - - - - (SEC. ID nº: 8)
PSA 146-154 K L Q C V D L H V V (SEC. ID nº: 9)
HGK S - - - - S - - L - (SEC. ID nº: 10)
PKA D - - - - - - K I - (SEC. ID nº: 11)
PSA 154-163 V I S N D V C A Q V (SEC. ID nº: 2)
HGK L L - - - M - - R A (SEC. ID nº: 12)
PKA I L P - - E - E K A (SEC. ID nº: 13) 
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Ejemplo III
Creación de líneas celulares T humanas citolíticas para el PSA que expresa a las células tumorales humanas
Las PBMC de donantes sanos normales que expresan alelos de HLA A2 de clase 1 se utilizaron en un intento para determinar si los péptidos específicos para PSA son inmunógenos para seres humanos. Se utilizaron los péptidos 141 a 150 y 154 a 163 en este estudio. La metodología utilizada para la creación de estas líneas celulares implica la pulsación de PBMC con péptido e IL-2 como se describió anteriormente (Tsang, K. Y., et al., 1995, J. Nat'l Cancer Inst., vol. 87(13):982-90 y en la solicitud US nº de serie 08/396.385). Se pudieron crear líneas de linfocitos T de 5 de cada 6 donantes normales utilizando 141 a 150 del péptido PSA y de 6 de cada 6 donantes normales utilizando los 154 a 163 del péptido PSA. Además, se extrajeron PBMC de dos pacientes de cáncer de próstata. Se crearon líneas de linfocitos T de estos cultivos de PBMC utilizando los 154 a 163 del péptido.
Algunas de estas líneas de linfocitos T se han fenotipado. Como se observa en la Tabla 8, una línea celular denominada T-866 (T-donante A), que procedía de la pulsación con los 141 a 150 del péptido, contiene cantidades apreciables de células positivas dobles a CD4+/CD8+ y otra línea celular denominada T-1538 (T-donante B), procedente de pulsar con los 154 a 163 del péptido, presenta un fenotipo similar.
Cuatro de las líneas de linfocitos T procedentes de tres individuos diferentes se analizaron a continuación en relación a su capacidad para lisar las células humanas (Tabla 9). Como se aprecia en la Tabla 9, la línea de linfocitos T denominada T-866, procedente del péptido 141 a 150, fue capaz de lisar los linfocitos T2 cuando se pulsaba con el péptido (141 a 150) apropiado. No se observó lisis utilizando la línea celular COLO-205 de cáncer de colon humano negativa a PSA. Mientras que el 80% de la lisis se observó utilizando la línea celular de cáncer de próstata humano LNCAP que expresa a PSA (ATCC CRL-1740). Cuando se emplea la diana K562 de NK, que mide la lisis no específica debido a la actividad de las células NK, solamente se obtuvo el 23% de lisis. Similares resultados se observaron empleando una línea de linfocitos T diferentes obtenida del mismo paciente que procedía pulsando con el péptido 154 a 163 de PSA. Se analizaron asimismo dos líneas de linfocitos T adicionales que procedían del péptido 154 a 163. Una era de un donante normal (T-1538) y la otra era de un paciente con cáncer de próstata (T-PC2; T-donante C). Como se puede apreciar en la Tabla 9, empleando ambas de estas líneas de linfocitos T, se observó aumento de la lisis cuando la línea de linfocitos T2 se pulsó con el péptido 154 a 163 y se observó aumento de la lisis cuando se empleaba la línea celular LNCAP específica de la próstata que expresa a PSA, en comparación con COLO-205 o K562. Estos estudios demuestran que las líneas de linfocitos T pueden crearse utilizando los péptidos y protocolos generados en la presente memoria que poseen capacidad para lisar las células de carcinoma de próstata humano que expresan a PSA.
TABLA 8 Análisis por citometría de flujo de linfocitos T específicos para el péptido de PSA
Linea de Péptido de CD3 CD4 CD8 CD4CD8 CD56
linfocitos T PSA
T-donante A 141-150 96 35 6,5 59 0
T-donante B 154-163 94 5,2 32 62 0
Los resultados se expresan en % de células positivas. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 9 Efectos citotóxicos de los linfocitos T específicos para el péptido de PSA
Liberación específica en % (lisis)
Línea de Péptido de
linfocitos T PSA T2 T2 + péptido LNCAP K562 COLO-205
T-donante A 141-150 10^{a} 40^{b} 80^{b} 23 7
T-donante A 154-160 16 35^{b} 60^{b} 22 10
T-donante B 154-160 10 40^{b} 29^{b} 3 10
T-donante C 154-160 15 35^{b} 35^{b} 2 8
^{a} Porcentaje de liberación específica de ^{111}In
\hskip0.1cm Análisis citotóxico de 24 horas (relación E:T, 25:1)
^{b} p<0,01 significativo
Ejemplo IV
Construcción y caracterización del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata
Dos péptidos 10-mer de PSA (PSA1 y PSA3) que se seleccionaron para conformar los motivos de HLA A2 de clase 1 provocaron las respuestas a CTL específicas de PSA tanto en donantes normales como en pacientes con cáncer de próstata. Un péptido de PSA más largo (de 30-mer), denominado péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA-OP) que comprende las secuencias de los péptidos PSA-1 y PSA-3 más cortas, se investigó la capacidad para mediar la actividad de los linfocitos T citotóxicos específicos para PSA (Tabla 10).
TABLA 10 Secuencia del péptido de PSA de 30 aminoácidos
6
Materiales y métodos Síntesis de péptidos
Se sintetizó PSA-OP en un sintetizador de péptidos modelo 432A de Applied Biosystems. Opera en una escala de 25 \mumoles y emplea la química f-moc y control de retroalimentación para controlar el acoplamiento de cada aminoácido sucesivo a la cadena en crecimiento. El péptido completado se escindió de la resina de síntesis con ácido trifluoroacético y tioanisol/etanoditiol como antioxidantes. Las sales ácidas se extrajeron con éter metilperbutílico y el péptido se liofilizó en agua para dar aproximadamente 64 mg en polvo. El polvo es soluble en 2 mg/ml en DMSO al 1% y las alícuotas filtradas y esterilizadas presentan un pico agudo único en la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa C18.
Cultivos celulares
Las líneas celulares LNCAP y DU-145 [HLA-A2+] de carcinoma de próstata se adquirieron en la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Los cultivos estaban extentos de micoplasma y se mantuvieron en medio completo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI1640, respectivamente (Life Technologies Inc. GIBCO BRL, Grand Island, NY), enriquecido con suero bovino fetal al 10% (FBS), glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y 100 \mu/ml de estreptomicina (Life Technologies, Inc.). La línea celular 174CEM.T2 (T2) (mutante de deleción de transporte) se describe en Anderson et al., 1993. La línea celular CIR-A2 se describe en Storkus et al., 1987. Los linfocitos T2 y las células CIRA2 se mantuvieron en medio completo de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) y medio completo RPMI1640, respectivamente.
Generación de líneas de linfocito T
Se extrajeron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) en sangre heparinizada de donantes sanos de HLA-A2 utilizando un gradiente de medio de separación de linfocitos (Organon Technika, Durham, NC). Se lavó 3 veces la fracción celular mononuclear y se volvieron a poner en suspensión las PBMC en medio completo: AIM V (Life Technologies, Inc.) enriquecido con suero AB humano al 5% (Valley Biomedical, Winchester, VA), glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (GIBCO). Las células (2 \times 10^{5}) en medio completo en un volumen de 100 \mul se pusieron en cada pocillo de una placa de ensayo de fondo plano de 96 pocillos (Corning, Costar Corp., Cambridge, MA). Los péptidos se añadieron a cultivos a una concentración final de 50 \mul/ml. Se incubaron los cultivos durante 5 días a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Después de la eliminación del medio que contenía el péptido, los cultivos a continuación se proveyeron con IL-2-(CETUS) humano (20 U/ml) durante 11 días, con medio que contenía IL-2 rellenándose cada 3 días. El tiempo de incubación de 5 días con el péptido más 11 días con IL-2 constituye un ciclo. Los cultivos primarios se volvieron a estimular con el mismo péptido (50 \mug/ml) el día 1 de cada ciclo. PBMC (1 \times 10^{6}) autólogas irradiadas (4.000 rad) se añadieron en un volumen de 100 \mul en medio completo (AIM-V) y se utilizaron como células presentadoras del antígeno.
Análisis citotóxicos
Se marcaron varias células diana con 50 \muCi de ^{111}In-oxiquinolina (Medi-Physics Inc., Arlington, IL) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron células diana (0,2 \times 10^{4}) en 100 \mul de medio completo (véase anteriormente) a cada uno de los 96 pocillos en placas de ensayo de fondo plano (Corning Costar Corp.). Las dianas marcadas se incubaron con péptidos a una concentración final de 50 \mug/ml durante 60 min. a 37ºC en CO_{2} al 5% antes de añadir células efectoras. Se pusieron en suspensión las células efectoras en 100 \mul de medio completo enriquecido con suero AB humano mezclado al 5% y se añadió a las células diana. Se incubaron las placas a 37ºC durante 16 horas. Se recogieron los sobrenadantes para recuento con rayos \gamma utilizando marcos recogedores (Skatron, Inc. Sterling, VA). Se realizaron determinaciones por triplicado y se calcularon las desviaciones estándar. Se realizaron todos los experimentos tres veces. Se calculó la lisis específica utilizando la fórmula siguiente:
\text{% de liberación específica} = \frac{\text{liberación observada (cpm)} - \text{liberación espontánea (cpm)}}{\text{liberación total (cpm)} - \text{liberación espontánea (cpm)}} \times 100
Se determinó la liberación espontánea en los pocillos a los que se añadió 100 \mul de medio completo, en lugar de células efectoras. Se obtuvo la radioactividad liberable total después del tratamiento de las células diana con Triton X-100 al 2,5%.
Se realizaron experimentos utilizando inhibidores de proteasa, utilizando células CIR-A2 como células diana pulsadas con 100 \mug/ml de PSA-OP durante 3 h. Se incubaron células diana pulsadas con péptido con inhibidores de proteasa. Los inhibidores de proteasa utilizados fueron E64, inhibidor de carboxipeptidasa, inhibidor de Plummer y captopril (inhibidor de la enzima transformadora de la angiotensina) a varias concentraciones (10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} M). Se determinó la actividad de CTL por el ensayo de CTL descrito anteriormente.
\newpage
Análisis limitativo por dilución
Se utilizaron análisis limitativos por dilución para la determinación de las frecuencias del precursor para PSA-1, PSA-3 y PSA-OP. Se sembraron números variables de PBMC en placas con fondo plano de 96 pocillos (Corning Costar) con 1 \times 10^{4} PBMC autólogas irradiadas con 4.000 rads y se incubaron con 50 \mug/ml de péptido de PSA. Las células se cultivaron en medio completo como se describió anteriormente. Se colocaron por lo menos 48 cultivos para cada dilución. Se incubaron los cultivos durante 5 días a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5% y a continuación se proveyó de medio reciente que contenía IL-2 humana durante 11 días, rellenándose el medio que contenía IL-2 cada 72 h. como se muestra a continuación para la generación de CTL. Después de dos ciclos de estimulación específica se analizó la actividad citotóxica en cada pocillo, frente a las células diana CIR-A2 con o sin incubación con péptido. Los análisis citotóxicos fueron similares al método descrito anteriormente. Las células K562 no marcadas se añadieron a los micropocillos que contenían células que respondían al tratamiento. Tras 1 h. de incubación a 37ºC, se añadieron células diana en cada pocillo y se incubaron durante 6 h. a 37ºC. Se calcularon las frecuencias del precursor por minimización de X^{2}.
Citometría de flujo
Análisis citométrico de flujo de un solo color: se lavaron 1 \times 10^{6} células tres veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) exenta de Ca^{2+} y Mg^{2} y a continuación se tiñeron durante 1 h. con 1 \mug de anticuerpo monoclonal (MAb) contra CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, HLA de clase II (HLA-DR) (Becton Dickinson, San José, CA). HLA de clase I (W6/32) (Seratec, Sussex, Inglaterra) y MOPC-21 (Cappel/Organon Teknika Corp., West Chester, PA) en un volumen de 100 \mul de albúmina de suero bovino al 1% que contiene PBS. Se lavaron a continuación las células tres veces con DPBS en frío y se incubaron durante otra hora en presencia de dilución 1:100 (volumen de 100 \mul de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1%) de inmunoglobulina (Ig) anti-ratón de cabra conjugada con fluoresceína (Kirkegaard y Perry Labs, Gaithersburg, MD). Se lavaron otra vez las células tres veces con DPBS y se volvieron a poner en suspensión en DPBS a la concentración de 1 \times 10^{6} célula/ml. Se analizaron las células inmediatamente utilizando un FACScan de Becton Dickinson equipado con un láser azul con excitación de 15 nW a 488 nm. Se recogieron datos de 10.000 células vivas y se utilizaron para generar resultados.
Análisis citométrico de flujo de dos colores: El procedimiento para el análisis citométrico de flujo de dos colores fue similar al utilizado para el análisis de un solo color con las siguientes excepciones. Los MAb utilizados fueron el conjugado de fluoresceína anti-CD4, el conjugado de ficoeritrina anti-CD8, el conjugado de fluoresceína IgG1 y el conjugado de ficoeritrina anti-IgG2a (Becton Dickinson). Se realizó la tinción simultáneamente durante 1 h. después de la cual se lavaron las células tres veces, se volvieron a poner en suspensión como anteriormente y se analizaron inmediatamente utilizando un FACSort de Becton Dickinson equipado con un láser azul con una excitación de 15 nW a 488 y el programa Lysis II.
Fijación del péptido a HLA-A2
La fijación de los péptidos PSA-1 y PSA-3 y PSA-OP a las moléculas HLA-A2 se evaluó por regulación por aumento de la expresión de estas moléculas en la superficie celular de linfocitos T2 como se demostró por citometría de flujo. Se incubaron 1 \times 10^{4} células en IMDM exento de suero con péptidos a la concentración de 50 \mug/ml en placas de cultivo de 24 pocillos a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se realizó la citometría de flujo para la fijación del péptido utilizando linfocitos T2 y análisis de un solo color. Una vez lavadas las células tres veces en DPBS como anteriormente, se incubaron durante 1 h. con MAb A2,69 específico para HLA-A2 (One lambda, Inc., Canoga Park, CA), utilizando 10 \mul de una dilución de operación 1\times por cada 10^{6} células. Se utilizó MOPC-21 (Cappel/Organon Teknika Corp.) como isótopo de referencia. Se lavaron las células a continuación tres veces y se incubaron con una dilución 1:100 de IgG anti-ratón marcada con fluoresceína (FITC) (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). Se realizó el análisis utilizando el FACScan como se describió anteriormente. Se mantuvieron las células en hielo durante toda la preparación celular y se tiñeron a menos que se indique de otro modo.
Tipificación de HLA
La fenotipia de HLA del donante A (HLA-A2,24; B27,35; C2,4; DR B1*0101,B1*1104; DQw B10501,B1*0301; DRw B3*0202) y del donante B (HLA-A2,29; B7,44; Cw5-; DR13,-; DQw6,-; DRw52,-) fue realizada por el banco de sangre de NIH en PMBC utilizando un análisis de microcitotoxidad dependiente del anticuerpo estándar y un panel definido de antisuero anti-HLA o análisis del ADN. Se obtuvieron los siguientes fenotipos de HLA para los donantes sanos utilizados para este estudio.
rv-PSA y rV-PSA-OP
Se generó el virus de vacuna recombinante que expresa a PSA (rV-PSA) por los métodos descritos en Hodge et al., 1995. El gen de PSA se aisló como clon del ADN complementario (ADNc) de un banco de ADNc de células de carcinoma de próstata humano. El ADNc de PSA se insertó bajo el control del activador de 40K de la vacuna en la zona M de Hind III del genoma del virus de la vacuna de la cepa Wyeth atenuado.
Se preparó un virus de la vacuna recombinante que expresa a PSA-OP por la misma metodología (Hodge et al., 1995).
Infección del virus de la vacuna de células de carcinoma de próstata
Las células diana DU-145 a la concentración de 1 \times 10^{7} por ml en medio RPMI-1640 completo con albúmina de suero bovino al 0,1% se incubaron con un volumen igual de virus de la vacuna (10 MOI) en el mismo medio a 37ºC durante 1,5 horas. Se sembraron las células a continuación a razón de 10^{5} células por ml en medio completo con FBS al 10%, en placas de cultivo de 24 pocillos a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 24 h. antes de ser utilizadas como dianas en experimentos de análisis citotóxico, se evaluó la producción de bPSA procedente de virus de la vacuna rV-PSA mediante el kit de inmunorradioanálisis adquirido en Tandem Co.
Análisis estadístico
Se realizó el análisis estadístico de diferencias entre los medios mediante una prueba de la t para datos emparejados de dos colas.
Resultados
Se crearon dos líneas de linfocitos T de diferentes donantes normales mediante estimulación in vitro con PSA-OP. Las líneas de linfocitos T fueron fenotípicamente CD4^{+}, CD8^{+} o CD4^{+}/CD8^{+} y CD56^{-} como se presentan en la Tabla 11.
TABLA 11 Análisis por citometría de flujo de marcadores de superficie en líneas de linfocitos T
Línea de CD3^{+} CD4^{+}/CD8^{-} CD4^{-}/CD8^{+} CD4^{+}/CD8^{+} CD56^{+}
linfocito T
T/PSA-OP-1 93,80(94,10) 5,83(109,00) 32,00(4.550,00) 62,00(139/110) neg
T/PSA-OP-2 95,86(167,77) 52,38(2.505,00) 41,55(2.151,00) 4,46(153/3.325) neg
\begin{minipage}[t]{155mm}Los resultados se expresan en porcentaje de células fluorescentes y (x/y) significa la intensidad fluorescente por célula. Se consideró la expresión del marcador negativa (neg) cuando era inferior a 4%. Los resultados se expresan en porcentaje de cada línea de linfocitos T reactiva con los mAb. Como rutina el 2,0 al 4,0% de células se tiñen cuando se tratan con MAb sin cebado o un isótopo relacionado con MAb de referencia.\end{minipage}
En la Tabla 12 se presentan el PSA-OP lisado por CTL humanos así como las células CIR-A2 pulsadas con PSA-1 o PSA-3.
TABLA 12 Actividad por CTL de las líneas de linfocitos T específicas para PSA-OP
Donante Sin péptido PSA-OP PSA-1 PSA-2 PSA-3
T/PSA-OP-1 7,9(2,7) 32,3*(0,87) 8,4(4,0) 1,8(0,30) 28,7*(1,12)
T/PSA-OP-2 0,0(0,06) 16,5* (1,0) 14,3*(0,6) 6,4(1,40) 16,5*(1,0)
\begin{minipage}[t]{155mm}T/PSA-OP-2 lisó específicamente las células CIR-A2 pulsadas con los péptidos PSA-OP, PSA-1 y PSA-3, mientras que la línea celular T/PSA-OP-1 solamente lisó a CIRA-2 cuando se pulsó con PSA-OP y PSA-3. Las células CIRA-2 han sido pulsadas con 50 \mu g/ml de péptido de PSA durante 3 h., antes de ser marcadas con ^{111}In y se han utilizado como diana en análisis citotóxico con CTL de 18 h. Los resultados se expresan en % de liberación específica (SD) a la relación E:T de 25:1.\end{minipage}
*P<0,02
Las CTL humanas lisaron asimismo a las células del cáncer de próstata humano PSA^{+} HLA-A2^{+} como se muestra en la Tabla 13.
TABLA 13 Actividad por CTL de líneas de linfocitos T específicas para PSA-OP frente a HLA-A2001+ y células de carcinoma de próstata humano que producen PSA
Donante LNCAP
12,5:1 25:1 Relación E:T
T/PSA-OP-1 32,54*(6,6) 50,4*(6,4)
T/PSA-OP-2 14,60*(3,7) 24,8*(1,6)
CTL creadas a partir de células de carcinoma de próstata LNCAP de lisis de los donantes 1 y 2.
10^{6} células LNCAP se han marcado con ^{111}In y se utilizan como dianas en el análisis citotóxico de CTL de 18 h.
Los resultados se expresan aquí en % de liberación específica (SD). P<0,016.
La línea celular de carcinoma de próstata HLA-A2^{+} DU-145 se infectó con virus de vacuna modificado genéticamente con el gen PSA o con el gen de PSA-OP. Las células DU-145 infectadas con el virus de la vacuna rV-PSA expresaron a PSA como se muestra en la Tabla 14.
TABLA 14 Producción de PSA por DU-145 infectadas con wt y virus de vacuna rV-PSA
Células de carcinoma prostático 4 horas 24 horas
[pg/ml] [pg/ml]
DU-145 (WT) 1,2 (0,15) 1,7 (1,20)
DU-145 (rV-PSA) 5,1 (0,50) 12,0 (4,50)
LNCAP ND 232,0 (4,60)
Producción de células DU-145 de PSA tras la infección por virus de la vacuna rV-PSA.
\begin{minipage}[t]{160mm}Las DU-145 se han incubado con virus de vacuna natural o rV-PSA (10 MOI) durante 4 y 24 h. antes de recoger el sobrenadante y de que se evalúe para la producción de PSA por detección de IRMA.\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{160mm}Kit de PSA (tandem). Se han utilizado células de carcinoma de cáncer de próstata LNCAP como referencia positiva ya que se conoce que producen grandes cantidades de PSA en 24 h.\end{minipage}
Los resultados se expresan en pg/ml (SD) por cada 10^{6} células.
Se determinó la capacidad de las líneas celulares de linfocitos T específicos para PSA-OP humanos para lisar las células prostáticas DU-145 infectadas con virus de la vacuna rV-PSA o rV-PSA-OP. Como se muestra en la Tabla 15, las
líneas de linfocitos T humanas lisaron las dianas infectadas con rV-PSA así como las dianas infectadas con 
\hbox{rV-PSA-OP.}
TABLA 15 Actividad por CTL de las líneas de linfocitos T específicos para PSA-OP contra la línea celular de próstata HLA-A2001+ DU -145, infectada con virus de vacuna, modificada genéticamente con el gen de PSA y el minigen PSA-OP
Línea de DU-145 DU-145 DU-145
linfocitos T [WT] [rV-PSA] [rV-PSA-OP]
12,5:1 25:1 12,5:1 25:1 12,5:1 25:1 Relación E:T
T/PSA-OP-1 15,0(3,8) 26,5(6,1) 31,8*(5,0) 45,7*(6,1) 32,5*(6,6) 50,4*(6,4)
T/PSA-OP-2 0,0(2,0) 6,2(4,9) 4,0*(2,1) 10,5*(2,8) 10,9*(1,4) 14,6*(3,7)
\begin{minipage}[t]{160mm}Las CTL creadas lisaron células de cáncer de próstata DU-145 tras la infección con el virus de vacuna rV-PSA y rV-PSA-OP. Las células DU-145 se han incubado con virus de la vacuna (10 MOI) natural o que llevan el gen de PSA o el minigen de PSA-OP durante 24 h. antes de ser marcadas e incubadas con células efectoras. La capacidad de las células infectadas con rV-PSA para producir PSA se evaluó mediante un kit de radioinmunoanálisis de Tandem. Los resultados se expresan en % de liberación específica (SD).\end{minipage}
*P<0,05.
Se determinó la capacidad de PSA-OP para unirse directamente a una molécula HLA de clase I-A2. Los resultados en la Tabla 16 demostraron que PSA-OP no se unió a HLA-A2 como se indica por la falta de regulación por aumento de la expresión de A2 en 174 células CEM-T2.
TABLA 16 Fijación de los péptidos de PSA a la molécula HLA de clase I A2001
Péptido \alm{1} de fijación a T2 *Fijación prevista
Ninguno 16,88 Neg
PSA [42-51] 51,44 Neg
PSA-OP 63,28 Neg
PSA-1 127,73 Pos
PSA-3 123,71 Pos
MTX [58-66] 157,86 Pos
PSA-OP no se une a las moléculas HLA de clase I A2001 en la superficie celular T2
*Fijación prevista basándose en los motivos publicados:
Pos = positivo Neg = negativo
\begin{minipage}[t]{160mm}\alm{1} Reacción de linfocitos T2 con mAb anti-HLA-A2 una vez las células se han incubado durante 24 h con péptidos de referencia y péptidos de PSA (50 \mu g/ml/10^{6} células), PSA [42-51] se consideró como péptido de referencia negativo ya que es inestable para unirse a HLA de clase I-A2 mientras PSA-1, PSA-3 y MTX [58-66] se consideraron como una referencia positiva. Los resultados se expresan en fluorescencia (intensidad media) y se eligió arbitrariamente 100 como un valor de corte para positividad.\end{minipage}
Dado que se demostró que el péptido de PSA-OP de 30 mer no se une directamente a las moléculas HLA de clase I-A2 pero estimuló a las células citotóxicas para lisar las dianas PSA^{+} HLA de clase I-A2, se emprendieron estudios para determinar si el péptido PSA-OP de 30 mer se escindía en péptidos más pequeños mediante actividad proteolítica que le permita interactuar con moléculas HLA de clase I-A2.
Se determinaron los efectos de los inhibidores de la proteasa sobre la destrucción mediada por CTL de las células CIR-A2 pulsadas con péptido de PSA-OP. Los resultados presentados en la Tabla 17 demuestran la disminución de citotoxicidad en presencia de inhibidores de proteasa. Estos resultados indican que el PSA-OP es escindido por proteasas sobre la superficie celular de las células diana en péptidos más cortos que, a su vez, interactúan con moléculas HLA-A2 y en consecuencia producen la lisis específica de CTL de las células diana CIR-A2.
TABLA 17 Efectos de inhibidores de proteasa sobre la destrucción mediada por CTL de células CIRA2 pulsadas con el péptido de PSA-OP
Péptidos pulsados PSA-OP del donante 1
en suero humano
Sin péptido Péptido de PSA-OP [50 \mug/ml]
Medio 7,7 (1,9) 26,1* (4,3)
E 64 [10^{-6}M] 11,9 (1,7) 13,7 (0,6)
De Plummer [10^{-5} M] 10,7 (2,0) 18,7* (2,4)
Captoprilo [10^{-6} M] 15,8 (2,1) 11,0 (2,6)
PCI [10^{5} M] 13,2 (1,6) 13,7 (3,2)
\begin{minipage}[t]{160mm}Los inhibidores extracelulares de carboxipeptidasa (E64, captoprilo y PCI) bloquean la lisis de las células CIR-A2 pulsadas con el péptido de PSA-OP por las CTL creadas.\end{minipage}
Los resultados se expresan en % de liberación específica (\pm SD) a una relación E:T de 25:1.
* P<0,03.
Los estudios de frecuencia del precursor (PF) demostraron que PF para PSA-1, solo, y PSA-3, solo, variaban de un donante a otro. En cambio, el PF para PSA-OP fue sorprendentemente similar de un donante a otro como se muestra en la Tabla 18.
TABLA 18 Estudio de frecuencia de precursor
% de microcolonias negativas
Donante 10.000 5.000 1.000 500 Número de precursores
Donante de
T/PSA-OP 2
Psa-OP 91,6 89,3 100,0 100,0 1/80006
PSA-1 47,9 75,0 93,7 95,8 1/14695
PSA-3 95,8 97,8 100,0 100,0 1/244200
Donante de
T/PSA-OP 3
PSA-OP 93,7 95,8 95,8 96,9 1/70229
PSA-1 93,7 97,9 100,9 100,0 1/181480
PSA-3 89,6 93,7 95,8 97,6 1/59279
\begin{minipage}[t]{160mm}Los precursores de CTL específicos para los péptidos PSA-OP, PSA-1 y PSA-3 están presentes en los PBL aislados de donantes masculinos de HLA-A2001^{+} después de dos ciclos de estimulación con péptidos de PSA. Se evaluaron los efectos citotóxicos de los precursores frente a CIRA2 pulsadas durante 3 h. con los péptidos de PSA respectivos en presencia de K562 en frío (10.000/pocillo).\end{minipage}
Por lo tanto, PSA-OP como inmunógeno ofrece distintas ventajas sobre la utilización de PSA-1 solo o PSA-3 solo en la producción de números coherentes de linfocitos T citotóxicos de un individuo a otro. Además, PSA-OP comprende más de una secuencia de péptido epítopo que puede satisfacer el motivo de consenso para una variedad de tipos de molécula HLA de clase I incluyendo HLA-A2, A3, A11, Aw68 y B53. HLA-A2 está presente aproximadamente en el 50% de los caucasianos norteamericanos y en el 34% de los americanos africanos. HLA-A3 está presente en el 26 y 17% de los caucasianos norteamericanos y americanos africanos, respectivamente. HLA-11 está presente en el 40% de la población asiática y HLA-B53 está presente en el 22% de los americanos africanos. Por consiguiente, PSA-OP puede ser útil como inmunógeno en la provocación de respuestas inmunitarias específicas a PSA en un amplio segmento de la población humana.
Ejemplo V
Células dendríticas infectadas con rV-PSA-OP para la generación de líneas de linfocitos T citotóxicos específicas (PSA)
El antígeno específico de la próstata (PSA) es una serina proteasa y miembro de la familia del gen calicreína. PSA, expresado en una mayoría de cánceres de próstata es una diana potencial para la inmunoterapia específica. Los estudios dados a conocer anteriormente han demostrado que 3 péptidos (PSA-1: FLPTKKLQCV, PSA-3: VISNDVCAQV y el péptido oligo-epítopo de PSA (PSA-OP): FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK), pueden provocar respuestas a CTL tanto en donantes normales como en pacientes con cáncer de próstata. Se investigó la capacidad de las células dendríticas (DC) infectadas con rV-PSA (montaje de la vacuna de PSA recombinante) o rV-PSA-OP (montaje de la vacuna de PSA-OP recombinante) para activar la generación in vitro de las CTL específicas para PSA autólogas. Las células dendríticas se expandieron en células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) cultivando in vitro durante 5 a 7 días en un medio que contenía GM-CSF e IL-4. Se crearon dos líneas de linfocitos T citotóxicos en un donante de HLA-A2 normal en 3 ciclos de estimulación in vitro (IVS) (en comparación con 6 a 7 IVS cuando se utilizaron las PBMC autólogas como células presentadoras del antígeno). La especificidad de estas líneas de linfocitos T se determinó por análisis citotóxicos utilizando células C1R-A2 pulsadas con péptido de PSA, células C1R-A2 infectadas con rV-PSA o rV-PSA-OP así como células LNCaP. Éstas lisaron las células C1R-A2 pulsadas con PSA-1, PSA-3 o PSA-OP y las células de cáncer de próstata positivas a PSA y a HLA-A2. Estas CTL lisaron asimismo las células diana infectadas con rV-PSA y rV-PSA-OP. La especificidad de la lisis se definió por la incapacidad de la CTL para lisar las dianas de carcinoma negativo a PSA, el bloqueo de la lisis con anticuerpo anti-HLA-A2 y la incapacidad de la diana K562 en frío para inhibir la lisis. Estos descubrimientos demuestran por primera vez (a) la capacidad para generar respuesta de CTL a los epítopos de PSA definidos utilizando las DC infectadas con rV-PSA y rV-PSA-OP; (b) la capacidad de las células LNCaP para procesar endógenamente a PSA para presentar el péptido en el contexto del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) para la lisis de CTL; y (c) la capacidad de las DC para procesar endógenamente rV-PSA y rV-PSA-OP para presentar los péptidos de PSA específicos en el contexto de MHC para la lisis mediada por linfocitos T.
Ejemplo VI
Tratamiento y presentación de PSA-OP por los motivos de consenso HLA-A2+ y HLA-A3+
El motivo de consenso de HLA de clase I-A2 humano está representado en aproximadamente 50% de la población de Estados Unidos. La HLA de clase I-A3 representa otro 25% de la población. Un péptido de PSA que se dirige a ambos motivos de HLA de clase I ofrece una única herramienta inmunoterapéutica.
Los resultados descritos anteriormente demostraron la utilidad del péptido de PSA-OP para crear líneas de linfocitos T citotóxicos de donantes de HLA-A2+.
La Tabla adjunta presenta datos de la secuencia para los péptidos de PSA específicos para el antígeno, PSA-1, PSA-3, PSA-9 y el péptido PSA-OP (que contienen todos las secuencias del péptido más pequeño). Los péptidos PSA-1 y PSA-3 son restringidos de clase I-A2 mientras que el péptido PSA-9 es de clase I-A3 restringido. Se utilizaron péptidos de PSA, PSA-9 y PSA-OP para crear líneas de CTL de dos donantes de HLA-A3+. Estas líneas celulares lisaron las células diana HLA-A3+.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 19 Péptido oligo-epítopo de PSA
Péptido Posición de Secuencia
aminoácidos en PSA
PSA-1 141-150 FLTPKKLQCV (SEC. ID nº: 1)
PSA-3 154-163 VISNDVCAQV (SEC. ID nº: 2)
PSA-9 162-170 QVHPQKVTK (SEC. ID nº: 3)
PSA-OP 141-170 FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEC. ID nº: 4)
\begin{minipage}[t]{160mm}Por lo tanto, se ha demostrado que el péptido de PSA-OP, péptido de 30 mer, se trata y se presenta en el contexto de ambos motivos de consenso HLA-A2+ y HLA-A3+ para generar CTL específicas del antígeno de PSA. Por consiguiente, el péptido de PSA-OP posee el potencial para ser utilizado en aproximadamente 75% de la población para la inmunoterapia específica basada en péptidos del cáncer de próstata.\end{minipage}
Referencias
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTES: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA ET AL.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDO OLIGO-EPÍTOPO DEL ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LA PRÓSTATA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
REMITENTE: MORGAN & FINNEGAN, L.L.P.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 345 PARK AVENUE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NUEVA YORK
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10154
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: DISQUETE, 3,50 PULGADAS, 1,44 MB
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: WORDPREFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-MAR-1997
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/618.936
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-MAR-1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: BROWN, KATHRIN M.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 34.556
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: 2026-4223PC
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 758-4800
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (212) 751-6849
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 421792
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu}
\sac{His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His}
\sac{Pro Gln Lys Val Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 90 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 90 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Phe Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LONGITUD: 9 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 RESTOS DE AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Pro Asn Asp Glu Cys Gly Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 246 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 246 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTAGAAGCC CCAAGCTTAC CACCTGCA 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
23

Claims (44)

1. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata aislado que comprende unidades repetitivas de más de un péptido epítopo del antígeno específico de la próstata aislado o los análogos peptídicos del mismo, en el que dicho péptido epítopo del antígeno específico de la próstata o análogo peptídico comprende aproximadamente 8 a aproximadamente 12 aminoácidos consecutivos de más de una secuencia de aminoácidos FLTPKKLQCV (SEC. ID nº: 1), VISNDVCAQV (SEC. ID nº: 2), QVHPQKVTK (SEC. ID nº: 3), FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTK (SEC. ID nº: 4) o KLQCVDLHV (SEC. ID nº: 9),
en el que dichos más de un péptido epítopo del antígeno específico de la próstata aislado o de los análogos peptídicos del mismo se unen directamente mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos; y
en el que el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata aislado (PSA-OP) genera una respuesta inmunitaria del antígeno específico de la próstata en una población de seres humanos que presenta más de un tipo de molécula HLA de clase I, comprendiendo dicha respuesta inmunitaria por lo menos la generación de linfocitos T citotóxicos específicos para PSA.
2. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 1, en el que cada péptido epítopo del antígeno específico de la próstata se une a los mismos o diferentes tipos de moléculas HLA de clase I.
3. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 1, en el que tras la escisión de PSA-OP para producir fragmentos de escisión de PSA-OP, los fragmentos de escisión de PSA-OP se unen a una o más tipos de moléculas HLA de clase I.
4. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 3, en el que los fragmentos de escisión de PSA-OP son producidos por lo menos por una proteasa.
5. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA-OP) según la reivindicación 3 ó 4, en el que los fragmentos de escisión de PSA-OP se unen a uno o más tipos de moléculas HLA de clase I seleccionados de entre el grupo constituido por HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 y HLA-B53.
6. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende un primer péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA1): F L T P K K L Q C V (SEC. ID nº: 1), o análogo de éste y un segundo péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA3): V I S N D V C A Q V (SEC. ID nº: 2) o análogo de éste.
7. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 6, en el que PSA1 y PSA3 están enlazados directamente por una secuencia enlazadora de aminoácidos, comprendiendo la secuencia enlazadora de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos.
8. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 6, que comprende además un tercer péptido epítopo del antígeno específico de la próstata o un análogo adjunto al segundo péptido epítopo del antígeno específico de la próstata o análogo.
9. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:
24
o un análogo de éste.
10. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 9, que comprende una sustitución de valina o tirosina en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo constituido por 148, 149, 160 y 161, o una sustitución de tirosina en la posición 154, o estando constituido dicho análogo por una deleción de aminoácidos en una o más posiciones en la SEC. ID nº: 4, seleccionándose dichas posiciones para la deleción de entre el grupo constituido por 151, 152 y 153.
11. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 7, en el que la secuencia enlazadora de aminoácidos está constituida por Asp-Leu-Lys.
12. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata aislado, que comprende más de un péptido epítopo del antígeno específico de la próstata, o un péptido análogo del mismo, enlazado directamente mediante un enlace peptídico o mediante una secuencia enlazadora de aminoácidos de 1 a 10 aminoácidos, en el que el PSA-OP genera una respuesta específica para la próstata y comprende un primer péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA1): F L T P K K L Q C V (SEC. ID nº: 1), o el primer análogo de éste, presentando dicho primer análogo una sustitución de valina en lugar de glutamina, cisteína o glutamina y cisteína, y un segundo péptido epítopo del antígeno específico de la próstata (PSA3): V I S N D V C A Q V (SEC. ID nº: 2), o el segundo análogo de éste, presentando dicho segundo análogo una sustitución de valina en lugar de cisteína o una sustitución de tirosina en lugar de la primera valina y opcionalmente un tercer epítopo del antígeno específico de la próstata con la secuencia de aminoácidos Q V H P Q K V T K (SEC. ID nº: 3).
13. Péptido oligo-epítopo de la próstata (PSA-OP), que comprende una secuencia de aminoácidos basada en:
25
en el que la valina está sustituida por un resto de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo constituido por la posición 148, la posición 149, la posición 160 y la posición 161 o en el que por lo menos uno de los aminoácidos en las posiciones 151, 152 ó 153 está eliminado y en la que dicho PSA-OP genera una respuesta inmunitaria del antígeno específico de la próstata en una población de seres humanos con más de un tipo de molécula HLA de clase I.
14. Péptido oligo-epítopo de la próstata (PSA-OP) constituido por una secuencia de aminoácidos:
26
15. Composición que comprende el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y por lo menos una molécula HLA de clase I o una célula que expresa por lo menos una molécula HLA de clase I.
16. Composición según la reivindicación 15, en la que la molécula HLA de clase I se selecciona de entre el grupo constituido por HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 y HLA-B53.
17. Composición farmacéutica que comprende el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un diluyente, portador o excipiente portador farmacéuticamente aceptable.
18. Secuencia aislada de ADN del antígeno específico de la próstata que comprende una secuencia de ADN que codifica el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
19. Secuencia aislada de ADN del antígeno específico de la próstata que comprende una secuencia de ADN que codifica el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 6.
20. Plásmido o vector vírico que comprende la secuencia de ADN del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 18 ó 19.
21. Vector vírico que comprende la secuencia de ADN de la SEC. ID. nº: 14.
22. Vector según la reivindicación 20 ó 21, en el que el vector es un plásmido de E. coli, el vector de Listeria, un virus de la viruela, un virus de la viruela aviar, un virus de la viruela caprina, un virus de la viruela porcina, un virus de la vacuna, baculovirus, adenovirus humano, SV40 o papiloma bovino.
23. Célula huésped que comprende un plásmido o vector vírico según la reivindicación 20, 21 ó 22, en la que la célula huésped expresa el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
24. Célula huésped según la reivindicación 23, en la que la célula huésped une los fragmentos de escisión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
25. Célula huésped según la reivindicación 24, en la que los fragmentos de escisión son producidos por una proteasa.
26. Célula según la reivindicación 24, en la que la célula huésped expresa además el tipo de molécula HLA de clase I seleccionado de entre el grupo constituido por HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A32, HLA-B7, HLA-B44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Aw68 y HLA-B53.
27. Célula huésped según la reivindicación 24, en la que la célula huésped expresa a HLA-A2 o HLA-A3 o HLA-A2 y HLA-A3.
28. Célula huésped según la reivindicación 24, en la que la célula huésped es una célula que presenta el antígeno.
29. Célula huésped según la reivindicación 28, en la que la célula huésped es una célula dendrítica.
30. Virus recombinante que comprende un virus en el que se inserta una secuencia de ADN aislada del antígeno específico de la próstata (PSA) que codifica un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el virus recombinante produce la expresión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o de sus fragmentos en una célula huésped.
31. Virus recombinante según la reivindicación 30, que comprende un virus seleccionado de entre el grupo constituido por virus de la viruela, virus de la viruela aviar, virus de la viruela caprina, virus de la viruela porcina, virus de la vacuna, baculovirus, plásmido de ADN, adenovirus humano, SV40 y papiloma bovino, en el que el virus recombinante produce la expresión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o de sus fragmentos en la superficie de las células huésped infectadas con éste y las células huésped infectadas provocan una respuesta inmunitaria dirigida contra el PSA, las células que expresan al PSA, las células que expresan a un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata o las células que unen fragmentos de escisión del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata.
32. Virus recombinante según la reivindicación 30 ó 31, que comprende además una secuencia de ADN que codifica una molécula inmunopotenciadora, que se selecciona de entre el grupo constituido por péptido de la gripe, toxoide tetánico, epítopo CD4 del toxoide tetánico, exotoxina A de Pseudomonas y poli-L-lisina.
33. Composición farmacéutica que comprende el virus recombinante según la reivindicación 30, 31 ó 32 y un diluyente, portador o excipiente portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un modificador de la respuesta biológica seleccionado de entre el grupo constituido por interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12), interferón, factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), ciclofosfamida y combinaciones de los mismos.
34. Utilización del virus recombinante según la reivindicación 30, 31 ó 32, para la preparación de una composición destinada a la estimulación del sistema inmunitario de un mamífero contra el antígeno específico de la próstata con el fin de impedir la creación y el crecimiento de las células de carcinoma positivas a PSA.
35. Utilización según la reivindicación 34, en la que el virus recombinante es el virus de la vacuna de la cepa NYC o de la cepa v-WR.
36. Utilización según la reivindicación 35, en la que el virus de la vacuna está recombinado con una cepa del virus de la vacuna humana atenuado.
37. Utilización según la reivindicación 34, 35 ó 36 en la que el virus recombinante se combina con un adyuvante o con un modificador de la respuesta biológica seleccionado de entre el grupo constituido por interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12, interferón, factor de la necrosis tumoral (TNF), (GM-CSF) y ciclofosfamida.
38. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su utilización en un método de inhibición o destrucción de las células tumorales positivas a PSA, comprendiendo dicho método:
A)
generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA in vitro por estimulación de los linfocitos procedentes de una fuente con una cantidad eficaz del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, solo o en combinación con una o más citocinas, siendo dicha cantidad eficaz para generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA; y
B)
transferir por adopción los linfocitos T citotóxicos específicos para PSA solos o en combinación con el péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata a un mamífero en una cantidad suficiente para inhibir o destruir las células tumorales positivas a PSA.
39. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su utilización en un método de inhibición o destrucción de las células tumorales positivas a PSA en un mamífero, comprendiendo dicho método:
A)
generar linfocitos T citotóxicos específicos para PSA in vitro mediante la administración de una cantidad eficaz del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, solo o en combinación con un adyuvante o liposomas; y
B)
los linfocitos T citotóxicos específicos para PSA generados de esta manera inhiben o destruyen las células tumorales positivas a PSA en el mamífero.
40. Péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según la reivindicación 39, en el que el adyuvante utilizado en dicho método se selecciona de entre el grupo constituido por RIBI Detox, QS21, alúmina y adyuvante incompleto de Freund.
41. Oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según las reivindicaciones 1 a 14, destinado a su utilización en un método de generación de una respuesta inmunitaria al antígeno específico de la próstata en una población de humanos con más de un tipo de molécula HLA de clase I, comprendiendo dicho método:
administrar una cantidad eficaz del péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata, solo o en combinación con un adyuvante o las células que presentan el antígeno pulsado por el péptido,
dicha cantidad es suficiente para generar una respuesta inmunitaria específica para PSA en una población de humanos con más de un tipo de molécula HLA de clase I.
42. Utilización de un péptido oligo-epítopo del antígeno específico de la próstata según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de un medicamento destinado a la estimulación del sistema inmunitario de un mamífero contra el antígeno específico de la próstata con el fin de impedir la creación y el crecimiento de las células de carcinoma positivas al PSA.
43. Composición según la reivindicación 17, que comprende además un adyuvante, liposomas, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interferón, factor de la necrosis tumoral, GM-CSF, ciclofosfamina o una combinación de éstos.
44. Composición según la reivindicación 17, que comprende además un péptido colaborador seleccionado de entre el grupo constituido por péptido de la gripe, toxoide tetánico, epítopo CD4 del toxoide tetánico, exotoxina A de Pseudomonas y poli-L-lisina.
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