ES2320089T3 - Generacion de respuesta inmunes para antigenos especificos de prostata (spa). - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica para uso en la estimulación de una respuesta inmune anti-PSA en un hombre, que comprende: Una primera composición que comprende un portador farmacéutico y un primer vector poxvirus recombinante que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un segmento de ADN que codifica esencialmente el antígeno específico de próstata autoantigénico (PSA) o una célula T citotóxica que provoca su epítopo ligado operablemente a un promotor y capaz de expresión en el hombre para estimular una respuesta inmune al PSA o epítopo en la introducción del primer vector poxvirus en el hombre, en donde el primer poxvirus es virus de la viruela aviar, viruela del canario o viruela de paloma: y Una segunda composición, para ser puesta en contacto con el hombre en por lo menos un intervalo de tiempo periódico después de la primer composición, que comprende un portador farmacéutico y un segundo vector poxvirus recombinante que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un segmento de ADN que codifica esencialmente el PSA autoantigénico o una célula T citotóxica que provoca su epítopo ligado operablemente a un promotor y capaz de expresión en el hombre para estimular una respuesta inmune para el PSA o epítopo en la introducción del segundo vector poxvirus en el hombre, en donde el segundo poxvirus es el virus de la viruela aviar, virus de canario o viruela de paloma y es diferente del primer poxvirus.

Description

Generación de respuestas inmunes para antígenos específicos de próstata (SPA).

Campo de la invención

La presente invención se relaciona de manera general con la generación de respuestas inmunes celulares y humorales para un antígeno específico de próstata de mamífero (SPA).

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Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y es la segunda causa más común de muerte por cáncer (Carter, et al., 1990; Armbruster, et al., 1993). Si se detecta en una etapa temprana, el cáncer de próstata es potencialmente curable. Sin embargo, una mayoría de casos se diagnostican en etapas tardías cuando ya ha ocurrido la metástasis del tumor principal (Wang, et al., 1982). Aun el diagnostico temprano es problemático debido a que no todos los individuos que dan positivo en estas detecciones desarrollan cáncer. El tratamiento actual para el cáncer de próstata incluye prostatectomía radical, terapia de radiación, o terapia hormonal. Ninguna terapia sistémica ha probado claramente la supervivencia en casos de enfermedad refractaria hormonal. Con la intervención quirúrgica, no siempre se alcanza la erradicación completa del tumor y la re-ocurrencia observada del cáncer (12-68%) es dependiente de la etapa inicial de tumor (Zietman, et al., 1993). Así, son deseables método métodos alternativos de tratamiento que incluyen profilaxis o prevención.

El antígeno específico de próstata (SPA) es un miembro de 240 aminoácidos de la familia de gen glandular kallikrein. (Wang, et al., 1982; Wang, et al., 1979; Bilhartz, et al., 1991). El PSA es una proteasa serina, producida por tejido prostático normal, y secretada exclusivamente por las células epiteliales que recubren los conductos y ácinos prostáticos (Wang, et al., 1982; Wang, et al., 1979; Lilja, et al., 1993).el antígeno específico de próstata se puede detectar en niveles bajos en el suero de machos saludables sin evidencia clínica de cáncer de próstata. Sin embargo, durante estados neoplásicos, los niveles circulantes de este antígeno se incrementan dramáticamente, se correlacionan con la etapa clínica de la enfermedad (Schellhammer, et al., 1993; Huang, et al., 1993; Kleer, et al., 1993; Oesterling, et al., 1991). El antígeno específico de próstata es ahora el marcador más ampliamente utilizado para el cáncer de próstata. La especificidad del tejido de este antígeno hace al PSA un antígeno o potencial objetivo para inmunoterapia específica activa (Armbruster, et al., 1993; Brawer, et al., 1989), especialmente en pacientes que han experimentado una prostatectomía radical en la que solo el tejido que expresa PSA en el cuerpo debe estar en los depósitos metastáticos. Estudios recientes que utilizan inmunización in Vitro han mostrado la generación de células CD4 y CD8 específicas para PSA (Peace et al., 1994; Correale et al., 1995). Sin embargo, aunque las respuestas de los linfocitos citolíticos naturales débiles se han asociado ocasionalmente documentados en pacientes con cáncer de próstata (Choe, et al., 1987), intentos para generar una respuesta inmune e in vivo han tenido éxito limitado. Por ejemplo, varios intentos para inmunizar activamente pacientes con células adenocarcinoma de próstata mezclados con Bacillus Calmette-Guerin (BCG) han mostrado poco o ningún beneficio terapéutico (Donovan, et al., 1990).la capacidad para provocar una respuesta inmune como un resultado de la exposición PSA in vivo podría ser extremadamente útil. La WO-A-95/04548 se refiere al uso de PSA en la producción de una respuesta
inmune.

El virus Vaccinia se ha utilizado en la erradicación de la viruela a nivel mundial. Este virus expresa un amplio rango de genes insertos, que incluyen varios genes asociados a tumores tal como p97, HER-2/neu, p53 y ETA (Paoletti, et al., 1993). Otros poxvirus que se han sugerido como útiles para la expresión de múltiples genes incluyen avipox tal como viruela aviar. Las citoquinas expresadas por virus vaccinia recombinantes incluyen IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, TNF-\alpha y IFN-\gamma (Paoletti, et al., 1993). Los poxvirus recombinantes, por ejemplo virus vaccinia, se consideran para uso en terapia de cáncer debido a que ha mostrado en modelos animales que la co-presentación de un inmunógeno débil con proteínas poxvirus altamente inmunogénicas pueden provocar una fuerte respuesta inmune contra el producto de gen insertado (Kaufman, et al., 1991; Paoletti, et al., 1993; Kantor, et al., 1992a; Kantor, et al., 1992b; Irvine, et al., 1993; Moss, et al., 1993). Un virus vaccinia recombinante que contiene el gen del antígeno carcinoembriónico humano ha completado recién los ensayos clínicos de fase 1 en pacientes con carcinoma sin evidencia de toxicidad diferente de la observada con la vacuna de viruela tipo intacta (Kantor, et al.,
1992b).

Actualmente, modelos para la evaluación de terapéuticos para la próstata incluyen el modelo canino (McEntee, et al., 1987), y el modelo de rata Dunning (Isaacs, et al., 1986); ninguno de estos modelos, sin embargo, son prácticos para el estudio de las vacunas de PSA recombinantes debido a la muy baja homología de la rata y el PSA canino para el PSA humano (Karr, et al., 1995; Schroder, et al., 1982). En contraste, la glándula de próstata de macaco es estructuralmente funcionalmente similar a la próstata humana (Wakui, et al., 1992). En el nivel molecular, hay 94% de homología entre la secuencias de ácido nucleico o aminoácidos del PSA de macaco PSA (Gauthier, et al., 1993) y aquellas secuencias de antígeno específico de próstata humana (Karr, et al., 1995; Lundwall, et al., 1987). Así, el PSA humano es esencialmente un autoantígeno en el macaco. De acuerdo con lo anterior, el macaco puede servir como un modelo para reacciones anti-PSA inmunes autólogas.

Resumen de la invención

La presente invención se define en y por las reivindicaciones adjuntas.

Hemos descubierto que al utilizar un vector vírico recombinante, preferiblemente un vector poxvirus que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un antígeno específico de próstata que codifica el segmento de ADN (PSA), o una célula T citotóxica que provoca un epítopo de éste, ligado operablemente a un promotor capaz de expresión en el anfitrión, se puede generar una respuesta inmune celular y humoral específica para el PSA. El método comprende preferiblemente introducen una cantidad suficiente del vector poxvirus dentro del anfitrión para estimular la respuesta inmune, y poner en contacto el anfitrión con PSA adicional en intervalos periódicos después. El PSA adicional, o una célula T-citotóxica que provoca un epítopo de éste, se puede agregar al utilizar un Segundo vector de poxvirus de un género de viruela diferente. En otra modalidad, el PSA adicional se puede agregar a poner en contacto el anfitrión con un PSA mediante una variedad de otros modelos, que incluyen una modalidad preferida que agrega PSA. El PSA se puede formular con un adyuvante o en una formulación liposómica.

En una modalidad adicional, una respuesta inmune para PSA se puede generar al poner en contacto al anfitrión inicialmente con una cantidad suficiente de PSA, o una célula T- citotóxica que provoca un epítopo de éste, para estimular una respuesta inmune y en intervalos periódicos después poner en contacto el anfitrión con un PSA adicional. El PSA adicional, o una célula T citotóxica que genera su fragmento, se puede agregar utilizando un vector poxvirus como se discutió anteriormente.

También hemos descubierto que las células T-citotóxicas humanas específicas para PSA se pueden producir utilizando una célula T citotóxica que provoca un epítopo del PSA y que estas células tienen la capacidad de lisar las células de carcinoma de próstata humana que expresan PSA.

Como se utiliza aquí el término "antígeno específico de próstata" incluye la proteína intacta sea purificada a partir de una fuente intacta o hecha por tecnología recombinante, así como también cualquier polipéptido, muteína o su porción derivada que es capaz de generar una respuesta inmune para un PSA correcto conformacionalmente intacto. Por ejemplo, uno puede hacer sustituciones de aminoácidos conservadoras en la molécula sin afectar adversamente la capacidad de utilizar el recombinante para generar un anticuerpo que también reconocerá el PSA intacto.

El poxvirus se selecciona del grupo de poxvirus que consisten de viruela aviar, viruela de canario y viruela de paloma. El avipox más preferido es de la viruela aviar.

Los vectores víricos Vaccinia pueden provocar una fuerte respuesta de anticuerpo. Así mientras son posibles numerosos refuerzos con vectores vaccinia, su uso repetido puede no ser preferido en ciertos casos. Hemos descubierto que al utilizar viruela de diferente género para refuerzo, se puede minimizar este problema sensible.

Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, RIBI Detox, QS21, y adyuvante incompleto de Freund. También se pueden utilizar formulaciones liposómicas.

Células T citotóxicas humanas específicas para PSA producidas de acuerdo con la presente invención se pueden aislar a partir de un anfitrión humano. Estas células se pueden utilizar en ensayos de fármacos, utilizar para mapear células T-citotóxicas que provocan epítopos de antígeno o en terapia celular adoptiva.

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Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra un Western blot de PSA de células V-PSA BSC-40 infectadas con rV-PSA. Las líneas 2-4 son extractos de fluido de sobrenadante de células infectadas durante la noche con rV-PSA en un MOI de 1, mientras las líneas 7-9 son extractos de las células infectadas correspondientes. Las líneas 1 y 7 son extractos de sobrenadantes y extractos de células infectadas V-Wyeth. El Blot se desarrolla utilizando un MAb específico para PSA humano. Este blot ilustra que las células infectadas con rV-PSA expresa auténticamente y secretan la proteína PSA 33 kD.

La Figs. 2A, 2B y 2C muestran la manifestación o inmunización de rV-PSA. En la Fig. 2A, el área de lesiones se mide 7 días luego de cada inoculación de macaco con V-Wyeth (círculos abiertos) o rV-PSA (círculos cerrados). En la Fig. 2B, la duración de la lesión se monitorea como tiempo de desaparición scab. En Fig. 2C, en la figura el alcance de la inflamación del folículo linfático se registra y se caracteriza como muy inflamado (3+), es decir, más de dos ganglios axilares inflamados; inflamación (2+), es decir, uno de los dos ganglios fácilmente palpables; marginalmente inflamado (1+), es decir, un ganglio es únicamente palpable; o ninguna inflamación (0), 7 días luego de la inoculación con virus vaccinia. Cada símbolo representa un mono.

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Descripción detallada de la invención

Hemos inducido una repuesta inmune específica para PSA en el modelo de macaco al colocar el gen PSA en un vector vírico recombinante, es decir, un vector de viruela.

Adicionalmente, una respuesta inmune para PSA se puede generar al poner en contacto el anfitrión inicialmente con una cantidad suficiente de PSA, una célula T citotóxica que provoca su epítopo, para estimular una respuesta inmune y en intervalos periódicos después de poner en contacto el anfitrión con un PSA adicional. PSA, o una célula T citotóxica que genera su fragmento, o se puede agregar utilizando un vector del virus de la viruela.

Un fragmento de ADN que codifica el cuadro de lectura abierto del PSA humano se puede obtener, por ejemplo, a partir de ARN total extraído de línea celular de adenocarcinoma de próstata metastásico humano, LNCaP.FGC (CRL 1740, American Type Cell Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. mediante PCR de transcriptasa inversa utilizando cebadores de oligonucleótido específicos de PSA 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTACCACCTGCA. 3' (SEQ. ID. NO.:1), 5' TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3' (SEQ. ID. NO.:2). La secuencia de nucleótido de cADN PSA se ha publicado (Lundwall, et al., 1987).

Se puede obtener PSA humano recombinante utilizando un sistema de expresión de baculovirus de acuerdo con el método de Bei et al., J. Clin. Lab. Anal., 9:261-268 (1995), cuya descripción se incorpora aquí como referencia.

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Vector Vírico

Se conocen técnicas básicas por el experto en el arte para preparar virus de AND recombinante que contienen una secuencia de AND heteróloga que codifica el antígeno auto-asociado al carcinoma o la célula T citotóxica que provoca el epítopo e involucran, por ejemplo, recombinación homologa entre las secuencias de ADN víricas que flanquean las secuencia de ADN en un plasmado donantes y secuencias homologas presentes en el virus pariente (Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419 (1982)). Por ejemplo, vectores víricos recombinantes tal como un vector poxvírico se pueden utilizar en el suministro del gen. El vector se puede constituir por ejemplo mediante etapas conocidas en la técnica, por ejemplo análogas a los métodos para crear recombinantes sintéticos del virus de la viruela aviar descrito en la patente U.S. Pat. No. 5,093,258, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. Otras técnicas incluyen utilizar un sitio de endonucleasa de restricción única que está naturalmente presente o insertado artificialmente en el vector vírico padre para insertar el ADN heterólogo.

Los vectores avipox utilizados en la presente invención son viruela aviar, viruela de canario y viruela de palomas. El avipox preferido es el virus de la viruela aviar.

Por ejemplo, la secuencia de gen de ADN a ser insertada en el virus se puede ubicar en un plasmado donante, por ejemplo, una construcción de plásmido E. coli, dentro del cual el ADN es homólogo a una sección de ADN tal como aquella del sitio de inserción del poxvirus en donde el ADN a se insertado se ha insertado. De manera separada la secuencia de gen de ADN a ser insertada se liga a un promotor. El enlace promotor-gen se posiciona en la construcción del plásmido de tal manera que el enlace promotor-gen se flanquea en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN que flanquea una región del ADN de viruela que es la región de inserción deseada. Con un vector vírico de viruela padre, se utiliza un promotor de viruela. La construcción de plásmido resultante se amplifica luego mediante crecimiento dentro de bacterias E. coli y se aísla. Preferiblemente, el plásmido también contiene un origen de replicación tal como el origen E. coli, y un marcador tal como un gen de resistencia antibiótica para selección y propagación en E. coli.

Segundo, el plásmido aislado que contiene la secuencia del gen de ADN a ser insertado se transfecta en un cultivo celular, por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo, junto con el virus pariente, por ejemplo, poxvirus. La recombinación entre el AND de viruela homólogo en el plásmido y el genoma vírico resulta respectivamente en un poxvirus recombinante modificado por la presencia de la construcción promotor-gen en su genoma, en un sitio que no afecta la viabilidad del virus.

Como se anoto anteriormente, el gen se inserta en una región, (región de inserción), en el virus que no afecta la viabilidad del virus del virus recombinante resultante. El experto puede identificar fácilmente tales regiones en un virus al, por ejemplo, probar aleatoriamente segmentos de ADN de virus para regiones que permiten la formación recombinante sin afectar seriamente la viabilidad del virus del recombinante. Una región que se puede utilizar fácilmente y está presente en muchos virus es el gen timidina quinasa (TK). Por ejemplo, el gen TK se ha encontrado en todos los genomas de poxvirus examinados [leporipoxvirus: Upton, et al., J. Virology, 60:920 (1986) (shope fibroma virus); capripoxvirus: Gershon, et al., J. Gen. Virol., 70:525 (1989) (Kenya sheep-1); orthopoxvirus: Weir, et al., J. Virol., 46:530 (1983) (vaccinia); Esposito, et al., Virology, 135:561 (1984) (monkeypox and variola virus); Hruby, et al., PNAS, 80:3411 (1983) (vaccinia); Kilpatrick, et al., Virology, 143:399 (1985) (Yaba monkey tumor virus); avipoxvirus: Binns, et al., J. Gen. Virol. 69:1275 (1988) (fowlpox); Boyle, et al., Virology, 156:355 (1987) (fowlpox); Schnitzlein, et al., J. Virological Methods, 20:341 (1988) (fowlpox, quailpox); entomopox (Lytvyn, et al., J. Gen. Virol. 73:3235-3240 (1992)].

En la viruela aviar, en adición a la región TK, otras regiones de inserción incluyen, por ejemplo, el fragmento BamHI J [Jenkins, et al., AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998 (1991)] el fragmento EcoRi-HindIII, el fragmento EcoRV-HindIII, el fragmento BamHI y el fragmento HindIII establecidos en la Solicitud EPO No. 0 308 220 A1. [Calvert, et al., J. of Virol 67:3069-3076 (1993); Taylor, et al., Vaccine 6:497-503 (1988); Spehner, et al., (1990) and Boursnell, et al., J. of Gen. Virol. 71:621-628 (1990)].

En adición al requerimiento de que el gen se inserta dentro de una región de inserción, la expresión exitosa del gen insertado por el poxvirus modificado requiere la presencia de un promotor ligado operablemente al gen deseado, es decir, en la relación apropiada con el gen insertado. El promotor se debe colocar de tal manera que este se ubique en la dirección 5' del gen a ser expresado. Los promotores se conocen bien en la técnica y se pueden seleccionar fácilmente dependiendo del anfitrión y el tipo de célula que usted desee como objetivo. Por ejemplo en poxvirus, se pueden utilizar promotores poxvíricos, tal como vaccinia 7.5 K, 40 K o promotores de viruela aviar tal como FPV C1A. También se pueden utilizar elementos mejoradores en combinación para incrementar el nivel de expresión. Adicionalmente, el uso de promotores inducibles, que también se conocen en la técnica, se prefiere en algunas modalidades.

Una respuesta inmune específica para PSA se puede generar al administrar entre aproximadamente 10^{5}-10^{9} pfu del poxvirus recombinante, construido como se discutió anteriormente con un anfitrión, más preferiblemente uno utiliza 10^{7} pfu. El anfitrión preferido es un humano. Por lo menos un intervalo después de esto, que es preferiblemente uno a tres meses después, la respuesta inmune se refuerza al administrar antígeno adicional al anfitrión más preferiblemente existe por lo menos un segundo "refuerzo" preferiblemente uno a tres meses después del primer refuerzo. El antígeno se puede administrar utilizando el mismo vector poxvirus. El antígeno puede preferiblemente ser administrado utilizando un segundo vector poxvirus de un genero de viruela diferente, o se puede administrar directamente utilizando, por ejemplo, un adyuvante o liposoma. Citoquinas, por ejemplo, IL-2, IL-6, IL-12 o moléculas co-estimuladoras, por ejemplo B7.1, B7.2, se pueden utilizar como adyuvantes biológicos y se pueden administrar sistemáticamente al anfitrión o co-administrar por vía de inserción de genes que codifican las moléculas dentro del vector de viruela recombinantes.

Adyuvantes incluyen, por ejemplo, RIBI Detox (Ribi Immunochemical), QS21 y adyuvante incompleto de Freund.

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Generación de células T-Citotóxicas

Las células T citotóxicas específicas para PSA se pueden establecer a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un anfitrión inmunizado como se discutió anteriormente. Por ejemplo, el PBMC se puede separar al utilizar gradiente de medio de Separación de Linfocito (Organon Teknika, Durham, N.C., USA) como se describió previamente [Boyum, et al., Scand J. Clin Lab Invest 21: 77-80 (1968)]. El PBMC lavado se resuspende en un medio complete, por ejemplo, RPMI 1640 (GIBCO) complementado con 10% de suero AB humano agrupado (Pel-Freeze Clinical System, Brown Dear, Wis., USA), 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina (GIBCO). El PBMC en una concentración de aproximadamente 2\times10^{5} células en un medio complete en un volumen de, por ejemplo, 100 \mul se agrega en cada pozo de una placa de ensayo de fondo plano 96 pozos (Costar, Cambridge, Mass., USA).

El antígeno o los péptidos se agregan en los cultivos en una concentración final de aproximadamente 50 \mug/ml y se incuban a 37ºC. en una atmósfera húmeda que contiene 5% CO_{2} durante 5 días. Después de la remoción del péptido que contiene medio, se proporcionan cultivos con IL-2 humano fresco (10 U/ml) después de 5 días y repleto con medio que contiene IL-2 cada 3 días. Los cultivos principales se reestimulan con el mismo péptido (50 \mug/ml) en el día 16. Se agrega PBMC irradiado autólogo (4,000 rad) 5\times10^{5} en un volumen de aproximadamente 50 \mul de medio completo como células que presentan antígeno (APC). Aproximadamente cinco días después, se proporcionan cultivos con medio que contiene IL-2 humano como se describió previamente. La célula se reestimula durante 5 días en intervalo de 16 días.

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Mapeo de Epítopo

Se pueden utilizar células T- citotóxica para determinar el epítopo del PSA que provoca una célula T citotóxica. Por ejemplo, uno puede cortar el PSA en numerosos fragmentos de péptido. Alternativamente, los fragmentos se pueden sintetizar químicamente. Las células T citotóxica de pueden luego colocar en placas y agregar diferentes fragmentos a diferentes pozos. Solo las células T que reconocen uno de los fragmentos de péptido pre-seleccionados como un epítopo continuaran expandiéndose, permitiendo por lo tanto fácil identificación.

Estos fragmentos se pueden utilizar luego para provocar células T citotóxicas en cambio de utilizar una proteína completa. Adicionalmente, uno puede preparar otros fragmentos que contienen el epítopo para mejorar su capacidad para provocar una respuesta de célula T citotóxica. Modificaciones de estos fragmentos se conocen bien el la técnica e incluyen el uso de conjugados, a residuos de aminoácidos específicos tales como cistinas, etc.

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Ensayo de Fármaco

También se pueden utilizar células T citotóxicas para detectar compuestos que mejoran la capacidad del antígeno para crear una respuesta de célula T citotóxica. Por ejemplo, las células T citotóxicas se pueden incubar con un epítopo seleccionado, por ejemplo, en una placa de microtítulo. El compuesto a ser probado, por ejemplo un fármaco, se agrega luego al pozo y se mide el crecimiento de las células T. la expansión de células T indican que el compuesto de prueba mejora la respuesta de células T. tales compuestos también se pueden evaluar adicionalmente.

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Terapia

La célula T citotóxica se puede cultivar para amplificar su número y luego inyectar de nuevo en el anfitrión mediante una variedad de medios. Generalmente, entre 1\times10^{5} y 2\times10^{11} células T citotóxicas por infusión se administran en, por ejemplo, una a tres infusiones de 200 a 250 ml cada una durante un periodo de 30 a 60 minutos. Después de la terminación de las infusiones, se puede tratar al paciente con interleuquina-2 recombinante con una dosis de 720,000 IU por kilogramo de peso corporal intravenosamente cada ocho horas; algunas dosis se pueden omitir dependiendo de la tolerancia del paciente al fármaco. Adicionalmente, después de infusión, el antígeno adicional o fragmentos que contienen células T que provocan epítopos se pueden medir al paciente para expandir adicionalmente el número de células T. El antígeno o epítopo se puede formular con un adyuvante y/o pueden estar en una formulación
liposómica.

Las células T citotóxicas también se pueden modificar mediante la introducción de un vector vírico que contiene un TNF que codifica ADN y se reintroduce en una anfitrión en un esfuerzo para mejorar la actividad anti-neoplásica de la células. También se pueden utilizar otras citoquinas.

El vector recombinante se puede administrar utilizando cualquier ruta aceptable, que incluye, por ejemplo, escarificación e inyección, por ejemplo, inyección intradérmicas, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperi-
toneal.

Para administración parenteral, los vectores recombinantes se inyectaran típicamente en solución acuosa estéril o no acuosa, suspensión o emulsión en asociación con un portador farmaceutícamente aceptable tal como solución salina fisiológica.

En los siguientes ejemplos y ejemplos de referencia, la discusión de los vectores diferente de viruela aviar, viruela de canario y viruela de paloma son solo para comparación e ilustración.

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Ejemplo de referencia 1

Construcción de Vectores Virus de viruela

Se ha desarrollado un número de virus de viruela como vectores víricos vivos para la expresión de proteínas heterólogas (Cepko et al., Cell 37:1053-1062 (1984); Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626-4630 (1987); Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3896-3900 (1987); Panicali & Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931 (1982); Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419 (1982)). El virus de la viruela aviar y el virus de la viruela de paloma están disponibles con los números de acceso del ATCC VR-229 y VR-363,
respectivamente.

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Vectores de ADN para recombinación In Vivo con un virus padre

Los genes que codifican antígenos de carcinoma deseados se insertan en el genoma de un virus de viruela en tal una forma que les permiten ser expresados mediante ese virus junto con la expresión del complemento normal de las proteínas de virus padres. Esto se puede lograr al construir primero un vector donante de ADN para recombinación in vivo con un virus de viruela.

En general, el vector donante de ADN contiene los siguientes elementos:

(i)

Un origen de replicación procariótico, de tal manera que el vector se puede amplificar en un anfitrión procariótico;

(ii)

Un gen que codifica un marcador que permite la selección de células anfitrión procarióticas que contienen el vector (por ejemplo, un gen que codifica resistencia antibiótica);

(iii)

Por lo menos un gen que codifica una proteína deseada ubicada adyacente a un promotor de trascripción capaz de dirigir la expresión de gen; y

(iv)

Secuencias de ADN homologas a la región del genoma del virus padre en donde el gen externo se insertara, flanqueando la construcción del elemento (iii).

Métodos para construir plásmidos donantes para la introducción de múltiples genes externos dentro del virus de la viruela se describen en WO91/19803, cuyas técnicas se incorporan aquí como referencia. En general, todos los fragmentos de ADN para construcción del vector donante, que incluyen fragmentos que contienen los promotores transcripcionales y fragmentos que contienen las secuencias homologas para la región del genoma del virus padre dentro del que se inserta genes externos, se pueden obtener de fragmentos de ADN clonados o ADN genómicos. Los plásmidos donantes pueden ser mono-, di-, o multivalentes (es decir, pueden contener uno o más secuencias de gen externo insertadas).

El vector donante contiene preferiblemente un gen adicional que codifica un marcador que permitirá la identificación de virus recombinantes que contienen ADN externo insertado. Varios tipos de genes marcadores se pueden utilizar para permitir la identificación y aislamiento de virus recombinantes. Estos genes incluyen aquellos que codifican resistencia química o antibiótica (por ejemplo, ver Spyropoulos et al., J. Virol, 62:1046 (1988); Falkner and Moss., J. Virol., 62:1849 (1988); Franke et al., Mol. Cell. Biol., 5:1918 (1985), así como también el genes de E. coli lacZ, que permite la identificación de placas víricas recombinantes mediante ensayo calorimétrico (Panicali et al., Gene, 47:193-199 (1986)).

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Integración de secuencias de ADN externo dentro del genoma vírico y aislamiento de recombinantes

La recombinación homologa entre el ADN de plásmido donante y el AND vírico en células infectadas resulta en la formación de virus recombinante que incorpora los elementos deseados. Células anfitrionas apropiadas para recombinación in vivo son generalmente células eucarióticas que se pueden infectar por el virus y transfectar por el vector plásmido. Ejemplos de tales células adecuadas para uso con un virus del fibroblastos de embrión de pollo, células HuTK143 (humanas), y CV-1 y células BSC-40 (ambas células de riñón de mono). La infección de las células con virus de viruela y la transfección de estas células con vectores de plásmido se logra mediante técnicas estándar en el arte (Panicali and Paoletti, U.S. Pat. No. 4,603,112, WO89/03429).

Luego de recombinación in vivo, la progenie vírica recombinante se puede identificar mediante una de varias técnicas. Por ejemplo, si el vector donante de ADN se diseña para insertar genes externos dentro del gen timidina quinasa (TK) del virus padre, virus que contiene ADN integrado serán TK y se pueden seleccionar sobre esta base (Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415 (1982)). Alternativamente, la co- integración de un gen que codifica un marcador o gen indicador con el gen externo de interés, como se describió anteriormente, se puede utilizar para identificar la progenie recombinante. Uno de los genes indicadores preferidos es el gen de E. coli lacZ: virus recombinante que expresa \beta-galactosidasa se puede seleccionar utilizando un substrato cromogénico para la enzima (Panicali et al., Gene, 47:193 (1986)).

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Caracterización de los Antígenos víricos expresados por virus recombinantes

Una vez se han identificado virus recombinantes, se puede utilizar una variedad de métodos para ensayar la expresión del polipéptido codificado por el gen insertado. Estos métodos incluyen ensayo de placa negra (un inmunoensayo de enzima in situ desarrollado sobre placas víricas), análisis Western blot, radioinmunoprecipitación (RIPA), e inmunoensayo de enzima (EIA).

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Ejemplo 1

Generación de respuesta inmune específica PSA Materiales y Métodos Virus Vaccinia Recombinante

Un fragmento de ADN 786 bp que codifica el cuadro de lectura abierto del antígeno específico de próstata humana se amplifica mediante transcriptasa inversa PCR (GeneAmp RNA PCR Kit, Perkin Elmer, Norwalk, Conn.) de un ARN extraído de la línea celular de metastásico de próstata metastásico humano, LNCaP.FGC (CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md.). La secuencia de aminoácido predicha derivada de la secuencia de codificación PSA se muestra por ser casi idéntica a la secuencia publicada (Lundwall, et al., 1987), diferenciándose solo en un cambio de asparagina a tirosina en la posición 220. El fragmento de ADN PSA, que contiene la secuencia de codificación completa para PSA, 41 nucleótidos de la región no convertida 5', y 520 nucleótidos de la región no convertida 3', se insertan en el sitio de división de endonucleasa de restricción Xba I del vector de transferencia de virus vaccinia pT116. El plásmido resultante, designado pT1001, contiene el gen PSA bajo el control del promotor 40K del virus vaccinia (Gritz, et al. 1990) y el gen E. coli lacZ bajo el control de promotor C1 del virus de la viruela aviar (Jenkins, et al., 1991). Los genes externos se flanquean mediante secuencias de ADN de la región Hind III M del genoma vaccinia. Un aislado purificado de en placa del la cepa Wyeth (New York City Board of Health) de vaccinia se utiliza como el virus padre en la construcción de virus vaccinia recombinante. La generación de virus vaccinia recombinante se logra por vía de recombinación homologa entre las secuencias vaccinia en el genoma vaccinia de Wyeth y las secuencias correspondientes en pT1001 en células RK_{13} infectadas con vaccinia (CCL 37, ATCC) transfectadas con pT1001. El virus recombinante se identifica utilizando un ensayo cromogénico, desarrollado sobre placas víricas in situ, que detecta la expresión del producto de gen lacZ en la presencia de indonil-beta-D-galactosida halogenada (Bluo-gal), como se describió previamente (Panacali, et al., 1986). Se purifica en virus recombinantes azules apropiados mediante cuatro rondas de purificación por placa. Los virus de depósito se preparan al clarificar lisatos de células RK_{13} identificados seguidos por centrifugación a través de un filtro de sacarosa
al 36%.

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Caracterización del Virus Recombinantes Análisis Southern de Recombinación de ADN

El genoma vaccinia recombinante se analiza mediante extracción de ADN, digestión de endonucleasa de restricción con Hind III, e inmunotransferencia Southern como se describió previamente (Kaufman et al., 1991).

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Análisis Western de expresión de Proteína

Se infectan células BSC-40 confluentes con el virus vaccinia tipo intacto padre (designado V-Wyeth) o vaccinia PSA (designado rV-PSA) en un MOI de 1 en medio in Eagle modificado de Dulbecco que contiene 2% de suero bovino fetal. Después de infección durante la noche, se remueve el medio de las células, y se precipita una alícuotas de metanol para ensayar para la presencia de PSA secretado. Las células infectadas se lisan en amortiguador de lisis hipotónico (150 mM NaCl, 0.05% EDTA, 10 mM KCl, 1 mM PMSF) y luego se sonican el medio de cultivo y los lisatos celulares se les practican electroforesis sobre un SDS gel de acrilamida 10%. Las proteínas se les hace inmunotransferencia a nitrocelulosa, y el blot se incuba con anticuerpo de conejo específico para PSA (P0798, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavan, y luego se incuban con anticuerpo secundario etiquetado fosfatasa anticonejo de cabra (AP, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Md.) y desarrollado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Generación de Líneas de Células B

Se determinan líneas de células linfoblastoides B (BLCL) autólogas de mono al infectar 1\times10^{5} PBMC aislados frescamente en 100 ml de RPMI 1640 complementado con L-glutamina, gentamicina, y 10% FCS (Biofluids, Rockville, Md.) con 100 ml de sobrenadante de células S594 (suministradas amablemente por el Dr. M. D. Miller, Harvard Medical School, New England Regional Primate Research Center, Southborough, Mass.), que contiene el herpesvirus de babuino Herpes papio, en una placa de fondo plano de 96 pozos (Costar, Cambridge, Mass.). Luego de la transformación, las células se expanden y el medio se cambia una vez por semana.

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Inmunización de Mono

Doce macacos machos jóvenes (Macaca mulatta), edades de 1 a 2 años, se asignan a tres grupos de vacunación de cuatro animales cada uno. Se realizó prostatectomía a un animal de cada grupo. Se inmunizan animales 3 veces en los días 1, 29, y 57. Se administra a los cuatros animales dosis de 1\times10^{7} o 1\times10^{8} PFU de rV-PSA por escarificación de piel. Se administra V-Wyeth (1\times10^{8} PFU) a cuatro animales como controles. Los animales se alojan y se mantienen en el Laboratorio de Investigación Toxicológica, Universidad de Illinois de Chicago (TRL/UIC) de acuerdo con las directrices del Comité de Uso y Cuidado Animal del Instituto Nacional para el Cáncer y las directrices para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio (Department of Health and Human Services Publication NIH 85-23, revised 1985 by the FDA Center for Biologics Evaluation and Research Office of Biological Product Review, Division of Product Quality Control, Pathology and Primatology Laboratory, Bethesda,
Md.)

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Toxicología

Se desarrollan exámenes físicos en animales sedados con cetamina ((Ketamine.RTM. HCl, 10 mg/kg I.M.). Se registran peso y temperaturas réctales para cada mono sobre una base semanal. Se observa el sitio de vacunación y se mide la inflamación y eritema se miden con calibrador. Cada animal se examina para linfadenopatia regional, hepatomegalia, y esplenomegalia. También se registra cualquier otra anormalidad.

Se obtiene sangre por venopunción de la vena femoral de animales sedados con cetamina antes y después de cada inmunización. Se desarrolla una evaluación de química renal y hepática, diferencial, y conteo de sangre completa sobre cada mono por TRL/UIC. Los resultados se comparan con valores normales de primate (Kantor et al., 1992b). Los niveles circulantes de PSA antes y después de inmunización se analizan por radio inmunoensayo (Tandem^{TM}, Hybritech, San Diego, Calif.).

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Medición de Títulos de Anticuerpo

Antes de cada inmunización y dos semanas después de cada inmunización, se cuantifica el anticuerpo anti- PSA por ELISA. Placas de Microtítulo se cubren con PSA purificado (100 ng/pozo, Calbiochem, La Jolla, Calif.), ovalbúmina (100 ng/pozo, Sigma), o 1\times10^{7} PFU/pozo de V-Wyeth inactivado por UV en PBS. Las placas se bloquean con 2% BSA en PBS, se secan y se almacenan a menos 20ºC hasta que se utilizan. Las placas se incuban con suero diluido 1:5, así como también un anticuerpo monoclonal para PSA (DAKO M750, Dinamarca) como un control estándar, durante 24 horas a 4ºC. las placas se lavan varias veces con PBS que contiene 1% BSA, y se incuban a 37ºC durante 45 min con antisuero específico de cadena pesada IgG o IgM antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (1:8000) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Ala.) y anticuerpo detectado por sistema de sustrato HRP (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Md.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia de cada pozo se lee en 405 nm utilizando un lector ELISA de microplaca Bio-Tek EL310
(Winooski,Vt.).

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Ensayo Linfoproliferativo

Se colocan en placas BLCL de mono autólogo en una densidad de 3\times10^{6} células/pozo en placas de 24 pozo con 160 mg/pozo de PSA purificada (Fitzgerald, Concord, Mass.) o 160 mg/pozo ovalbúmina (Sigma) a 37ºC. durante 24 horas. Luego las células se \gamma-irradian (14000 rad), se cosechan, se lavan y se suspenden en una concentración final de 1\times10^{7}/ml. Células PBMC de mono fresca de sangre heparinizada, de 6 semanas a 7 meses después de la ultima inmunización, se aíslan en medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, West Chester, Pa.). Se evalúan las respuestas Linfoproliferativas mediante co-cultivo de 1.5\times10^{5} células con 5\times10^{5} células/pozo de BLCL autólogo en 0.2 ml de RPMI 1640 complementado con 10% de suero de becerro fetal inactivado por calor en placas de 96 pozo de fondo plano (Costar) durante 5 días. El PBMC se cultiva con 2\times10^{7} PFU/ml de V-Wyeth inactivado por UV como un antígeno recuperado o 2 mg/ml de Con-A como controles positivos. Las células se etiquetan durante 12-18 h final de la incubación con 1 mCi/pozo [^{3}H]timidina (New England Nuclear, Wilmington, Del.) y se cosecha con un cosechador de células PHD (Cambridge Technology, Cambridge, Mass.). La radioactividad incorporada se mide mediante conteo de centelleo líquido (LS 6000IC; Beckman, Duarte, Calif.). Los resultados de los pozos triplicados se promedian y se reportan con media\pmSEM.

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Resultados Generación y Caracterización de Virus Recombinante

El fragmento de cADN que codifica el cuadro de lectura abierto del PSA humano se obtiene por PCR de transcriptasa inversa utilizando cebadores de oligonucleótido específicos del PSA 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTAC
CACCTGCA 3' (SEQ. ID. NO.:1), 5' TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3' (SEQ. ID. NO.:2), y se liga en el vector pT106 de transferencia de virus vaccinia. Este vector contiene un fuerte promotor temprano/tardío del virus vaccinia (designado P40) en la dirección 5' del sitio de clonación múltiple para controlar la síntesis del producto de gen insertado. La ligación y orientación del fragmente de ADN PSA, así como también la posición del promotor se verifican por secuenciamiento y PCR. La construcción de vector quimérico se inserta dentro de sitio M Hind III del genoma de virus vaccinia mediante precombinación homologa como se informo anteriormente (Kaufman, et al., (1991)), y se confirma por sondeo de análisis Southern con ADN radioetiquetado ^{32} P que corresponde a la secuencias PSA y las secuencias vaccinia en la región M Hind III (datos no mostrados). La secuencia de cADN completa de PSA en el clon del virus vaccinia se muestra por ser casi idéntica a las secuencias publicadas (Lundwall, et al., 1987).

La expresión de la proteína recombinante se confirma por análisis western blot de fluidos de sobrenadante y extractos de proteína de células BSC-40 infectadas con rV-PSA. Estas células se utilizan rutinariamente para la evolución de productos vaccinia recombinantes (Moss, et al., 1993). Incubación de blot de sobrenadantes de células de células infectadas con rV-PSA con anticuerpo anti-PSA de conejo revelan un polipéptido inmunoreactivo único de aproximadamente 33,000 daltons (Fig. 1, líneas 2-4). De manera similar, la incubación de los blots de extracto de proteínas de células infectadas con rV-PSA revela una única banda del mismo peso molecular (Fig. 1, líneas 7-9). Esto es consistente con el tamaño predicho de la molécula PSA (Armbruster, et al., 1993; Wang, et al., 1982). Los blots de sobrenadante celular (línea 1) o blot de extractos de proteína (línea 6) de células infectadas con V-Wyeth cepa padre permanecen negativas para expresión de PSA. Estos resultados demuestran así que un virus vaccinia recombinante puede expresar fielmente el producto de gen PSA humano.

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Modelo de Macaco

La glándula de próstata del macaco es estructural y funcionalmente similar a la próstata humana (Wakui, et al., 1992). En el nivel molecular, hay 94% de homología entre las secuencias de ácido nucleico y aminoácido del PSA de macaco (Gauthier, et al., 1993) y el antígeno específico de próstata humano (Karr, et al., 1995; Lundwall, et al., 1987). El PSA se esencialmente un autoantígeno en el macaco.

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Diseño Experimental

La tabla 1 delinea el protocolo utilizado en la inmunización de 12 macacos con rV-PSA o V-Wyeth de control mediante escarificación de piel. Se inmunizan tres grupos de 4 animales con rV-PSA en 1\times10^{7} PFU/dosis, rV-PSA en 1\times10^{8} PFU/dosis, o V-Wyeth a 10^{8} PFU/dosis 3 veces en intervalos de 4 semanas. Estas dosis se seleccionan para comprobar la dosis máxima tolerada para seguridad así como también para obtener la máxima respuesta mediada por células y humoral para el PSA.

El macaco se divide en tres grupos: V-Wyeth, de dosis alta, rV-PSA, de dosis baja, y rV-PSA de dosis alta. Un animal en cada grupo se prostatectomiza quirúrgicamente para colocar en paralelo dos situaciones con respecto a la terapia potencial en humanos: (a) próstata intacta, con enfermedad principal y/o metastásica; o (b) pacientes prostatectomizados con depósitos metastáticos de cáncer de próstata. La presencia de una glándula de próstata intacta puede servir de manera concebible como un deposito "de antígeno", que induce energía a trabes de la persistencia del antígeno, o en mascara los efectos inmunológicos al secuestrar anticuerpos o células reactivas.

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Consecuencia Física de la Inmunización

El área de las lesiones inducidas por rV-PSA o V-Wyeth se analiza 7 días luego de cada inoculación. En general, más se observa más induración después de la primera inoculación, comparado con la segunda inoculación (Fig. 2A). Después de la tercera inoculación, no hay inflamación del sitio de vacunación. La duración de la lesión luego de cada inmunización es más corta después de cada inoculación (Fig. 2B). La inflamación del folículo linfático regional luego de la vacunación es mayor en la mayoría de los monos luego de la primera inmunización, comparado con la segunda, o tercera inmunización (Fig. 2C). En general, no se observa diferencias en estos parámetros con el uso del rV-PSA o V-Wyeth. Los monos que reciben V-Wyeth se comparan con aquellos que reciben rV-PSA con respecto a síntomas constitucionales. Se observan leves elevaciones de temperatura en todos los animales luego de vacunación. No hay evidencia de perdida de peso, hepatomegalia o esplenomegalia en ninguno de los animales, y no hay diferencias entre animales tratados con V-Wyeth o rV-PSA (datos no mostrados). Los animales se prueban para química renal y hepática y conteo de sangre completa, diferencial. Los conteos de sangre completa permanecen dentro de los límites normales a través del estudio en ambos en animales inmunizados con V-Wyeth y rV-PSA (Tabla 2). Se evalúan funciones renales y hepáticas antes de la inmunización y 12 semanas luego de la inmunización principal (Tabla 3). Los parámetros analizados incluyen fosfatasa alcalina, nitrógeno urea en sangre, aminotransferasa analina, aminotransferasa aspartato, deshidrogenasa lactato, y niveles de creatina y creatina quinasa. No hubo diferencia significativa entre animales que reciben de V-Wyeth o rV-PSA. No hubo PSA detectable en la circulación de ninguno de estos monos después de cualquier inmunización (el limite de detección es 0.1 ng/ml). En este momento, que es 54 semanas luego de todas las inmunizaciones, no se observan toxicidad en los monos de ninguno de los grupos, incluyendo aquellos que se prostatectomizan.

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Respuesta Humoral Específica de PSA

Como se indica en la Tabla 1, a los monos 1-4 se les administra V-Wyeth mientras que a los monos 5-12 se les administra rV-PSA. El suero de cada uno de estos monos se analiza por ELISA para inmunoreactividad para PSA o V-Wyeth UV inactivo, y ovalbúmina como antígeno de control. El suero obtenido de monos antes de vacunación es negativo para reactividad al PSA (Tabla 4, PI). Quince días luego de la inmunización principal, los monos en los grupos 1\times10^{8} y 1\times10^{7} dosis de rV-PSA desarrollan anticuerpos IgM de bajo título específicos para PSA (se determinan títulos en una dilución de suero de 1:5). Aunque se analizan otros isótopos de anticuerpo (IgG, IgA, IgM), solo el IgM se induce por rV-PSA a través del periodo de observación de 270 días. El título de anticuerpo se reduce durante 4 semanas antes de la siguiente inoculación. Antes de la segunda vacunación en el día 29, 3 de 4 animales en el grupo 1\times10^{7} rV-PSA permanecen positivos para anticuerpos PSA, mientras 4 de 4 animales permanecen positivos en el grupo 1\times10^{8} rV-PSA. Los títulos de anticuerpo Anti-PSA incrementado después de la segunda vacunación en el día 29, permanecen estáticos después de la tercera vacunación en el día 57. 270 días después de la inmunización principal, todos los animales son negativos para anticuerpo IgM PSA. Los animales permanecen negativos para IgG específico para PSA a través del periodo de observación (datos no mostrados). No hubo correlación entre la dosis rV-PSA y el título IgM anti-PSA, ni hubo un efecto evidente de prostatectomía. Todos los sueros de monos son negativos para IgG o IgM para ovalbúmina en todos los puntos de tiempo; como un control positive, sin embargo el título IgG en todos los tres grupos de tratamiento con el virus vaccinia fue mayor de 1:2000 tan temprano como 29 días después de la inmunización principal (datos no mostrados).

En general, el virus vaccinia es un patógeno humano débil (Paoletti et al., 1993). Luego de la vacunación, es común eritema local, induración, fiebre de bajo grado, y linfadenopatia regional. El virus se replica en las células epidérmicas de la piel y el virus usualmente se depura dentro de 14. Catorce monos, que se les ha dado V-Wyeth o rV-PSA, exhiben los síntomas constitucionales de menor grado usuales de una infección por el virus vaccinia (Fig. 2). No hay evidencia de ningún efecto adverso como se indica por cambios en conteos celulares, diferenciales, química renal y hepática (Tablas 2-3).los monos parecen saludables, sin ningún signo físico de toxicidad, a través de la 54 semanas de observación.

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Aunque la construcción del rV-PSA es incapaz de provocar una respuesta IgG anti-PSA, respuestas, IgM específicas de PSA se observan en todos los ratones rV-PSA inmunizados independiente del nivel de dosis (Tabla 4). Estas respuestas de anticuerpo son de bajo título, vida corta y no se pueden reforzar, indicando la inducción de una respuesta principal pero no memoria de células B o maduración por afinidad.

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Ensayo Linfoproliferativo Específico del PSA

Se analizan respuestas de células T- específicas de PSA en monos inmunizados con rV-PSA o V-Wyeth utilizando un ensayo linfoproliferativo. Como se observa en la Tabla 5, el PBMC de todos los monos analizados responde, independiente si ellos reciben rV-PSA o V-Wyeth, al mitógeno linfocito concanavalin-A, así como también con la recuperación de V-Wyeth inactivado por UV de antígeno. Respuestas diferenciales para PSA versus ovalbúmina o medio solo se observan en 1 animal (número 6) en el grupo de 1\times10^{7} PFU rV-PSA. Todos los PBMC de animales en el grupo 1\times10^{8} PFU rV-PSA, sin embargo, responden a PSA en este ensayo. Este experimento se repite 5 veces con resultados similares y los datos mostrados en la Tabla 5 son de PBMC aislado de monos 270 días después de la inmunización principal. No se observan diferencias en respuestas de células T específicas de PSA en los monos prostatectomizados.

Para investigar las respuestas mediadas por células para la administración de ensayos linfoproliferativo rV-PSA se desarrollan utilizando PBMC de animales que reciben la vacuna recombinante. Uno de cuatro monos que reciben la menor dosis de rV-PSA (1\times10^{7} PFU) y cuatro de cuatro que reciben la mayor dosis (1\times10^{8} PFU) mantienen respuestas de células T específicas para proteína PSA hasta 270 días luego de inmunización principal como se indica por el ensayo linfoproliferativo (Tabla 5). La Prostatectomía parece no tener efecto en las respuestas celular o humoral de monos que reciben rV-PSA. La evidencia de respuesta de células T específicas de PSA en monos que le faltan epítopos de anticuerpo maduros se puede deber a dos eventos distintos luego de vacunación con rV-PSA: un evento independiente de célula T, que conduce a la producción IgM, y un evento dependiente de célula T, que conduce a respuestas linfoproliferativa específicas.

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TABLA 1 Protocolo de inoculación de macaco con el virus vaccinia tipo intacto y PSA recombinante

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1

100

TABLA 2

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2

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TABLA 3 Valores de química de suero medio en macaco que reciben vacuna tipo intacta o recombinante

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3

TABLA 4 Respuesta IgM^{a} de primate para inoculación con rV-PSA

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4

TABLA 5 Respuestas de células T linfoproliferativas específicas de PSA de células PBMC de macaco 270 días luego de inoculación con rV-PSA

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5

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Ejemplo II

Identificación de Epítopos de Células T Específicos (PSA) de Antígeno específico de Próstata Potencial

En razón a que la secuencia de aminoácido completa del PSA humano se conoce y los motives consensus HLA A2 clase humana se han descrito, se han realizado estudios para identificar una serie de péptidos que podrían unir potencialmente las moléculas A2 clase 1. El A2 se selecciona en razón a que es la molécula HLA clase 1 más común que se representa en aproximadamente el 50% de los Caucásicos Norteamericanos y el 34% de los Afroamericanos. La secuencia de péptido de PSA se examina así para coincidir con los motivos consesus para los péptidos de unión HLA A2. Los péptidos solo se seleccionan si su secuencia diverge suficientemente del gen kallikrein (HGK) glandular humano relacionado con PSA y la secuencias de antígeno kallikren pancreático (PKA).

Las secuencias de aminoácidos del PSA se exploran utilizando un algoritmo predictivo que combina una búsqueda para anclar residuos con cesión numérica a todos los recibos en todas las posiciones. El ensayo de unión de células T2 se utiliza luego para determinar qué péptidos se unen a las moléculas HLA A2 humanas. Como se puede ver en la Tabla 6, los péptidos PSA 141-150, 154-163 y 146-154 clasifican positivo en este ensayo (Nijman, H. W., et al., Eur. J. Immunol. 23:1215-1219, 1993). Tabla 7 da la secuencia de aminoácido de estos péptidos y se compara con las secuencias correspondientes de HGK y PKA.

TABLA 6

7

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TABLA 7

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8

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Ejemplo III

Comprobación de Células T Humanas Citolíticas para PSA que expresa Células Neoplásicas Humanas

PBMC de donantes saludables normales que expresan alelo clase 1 HLA A2 se utilizan en un intento por determinar si los péptidos específicos de PSA son inmunogénicos para humanos. Los péptidos 141-150 y 154-163 se utilizan en este estudio. La metodología utilizada para la determinación de estas líneas celulares involucra pulsar PBMC con péptido e IL-2 como se describió previamente (Tsang, K. Y., et al. JNCI, in press and in U.S. application Ser. No. 08/396,385, cuya descripción se incorpora aquí como referencia). Las líneas celulares son capaces de ser comprobadas de 5/6 donantes normales utilizando 141-150 péptido PSA y de 6/6 donantes normales utilizando 154-163 péptidos PSA. Más aún, el PBMC se obtiene de dos pacientes con cáncer de próstata. Las líneas de células T se comprueban de estos cultivos PBMC utilizando 154-163 péptidos. Algunas de estas líneas de células T se han fenotipado. Como se observa en la Tabla 8, una línea de células designada T-866, que se deriva da pulsar con 141-150 péptidos, contiene cantidades apreciables de células positivas CD4+/CD8+ dobles y otras líneas celular, designada T-1538, derivada de pulsar 154-163 péptidos, muestra un fenotipo similar. Cuatro de las líneas de células T derivadas de tres individuos diferentes se ensaya luego por su capacidad para lisar las células humanas (Tabla 9).como se observa en la Tabla 9, la línea de células T designada T-866, derivada del péptido 141-150, es capaz de lisar células T2 cuando se pulsa con el péptido apropiado (141-150). No se observa lisis utilizando la línea de células de cáncer de colon humano negativas para PSA COLO-205. Mientras que el 80% de la lisis se observa utilizando línea de célula de cáncer de próstata humana que contiene LNCAP PSA. Cuando se emplea el objetivo NK K562, que mide lisis no específica debido a actividad de las células NK, solo se obtiene 23% de lisis. Se observan resultados similares empleando una línea de células T diferente obtenida del mismo paciente que se deriva de pulsar el péptidos 154-163 PSA. Dos líneas de células T adicionales que se derivan de 154-163 también se analiza. Uno es de un donante normal (T-1538) y el otro es de un paciente con cáncer de próstata (T-PC2). Como se puede ver en la Tabla 9, que emplea ambas de estas líneas de células T, la lisis mejorada se observa cuando la línea de células T2 se pulsa con el péptido 154-163 y la lisis mejorada se observa cuando se emplea línea de célula específica de próstata que expresa PSA LNCAP, según se compara con COLO-205 o K562. Estos estudios demuestran que las líneas de células T se pueden comprobar utilizando los péptidos y protocolos generados aquí que pueden tener la capacidad de lisar las células de carcinoma de próstata humano que expresan PSA.

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TABLA 8

10

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TABLA 9

11

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La siguiente es una lista de publicaciones referidas en la anterior específicación:

Armbruster, D. A. Prostate-specific antigen: biochemistry, analytical methods, and clinical application. Clinical Chemistry, 39:181-195, (1993).

Bilhartz, D. L., Tindall, D. J., and Oesterling, J. E. Prostate-specific antigen and prostatic acid phosphatase: biomolecular and physiological characteristics. Urology, 38:95-102, (1991).

Brawer, M. K., and Lange, P. H. Prostate-specific antigen and premalignant change: implications for early detection. CA Cancer Journal Clinic, 39:361-375, (1989).

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Chatterjee, M. B., Foon, K. A., and Kohler, H. Idiotypic antibody immunotherapy of cancer. Cancer Immunology and Immunotherapy, 38:75-82, (1994).

Cheever, M. A., Chen, W., Disis, M. T., and Peace, D. J. T-cell immunity to oncogenic proteins including mutated RAS and chimeric BCR-ABL. Annals of the New York Academy of Science, 690:101-112, (1993).

Choe, B. K., Frost, P., Morrison, M. K., and Rose, N R. Natural killer cell activity of prostatic cancer patients. Cancer Investigations, 5:285-291, (1987).

Conry, R. M., Salch, M. N., Schlom, J., and LoBuglio, A. F. Breaking tolerance to carcinoembryonic antigen with a recombinant vaccinia virus vaccine in man. American Association of Cancer Research (Abstract), (1994).

Correale, P., Zaremba, S., Nieroda, C., Zhu, M. Z., Schmitz, J., Schlom, J., and Tsang, K. Y. In vitro stimulation of human cytotoxic T lymphocytes specific for peptides derived from prostate specific antigen. 9th International Congress of Immunology (Abstract), (1995).

Disis, M. L., Smith, J. W., Murphy, A. A., Chen, W., and Cheever, M. A. In vitro generation of human cytolytic T-cells specific for peptides from the HER-2/neuprotooncogene protein. Cancer Research, 54:1071-1076, (1994).

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Foon, K. A., Chakraborty, M., John, W., Sherratt, A., Kohler, H., and Bhattacharya-Chatterjee, M. Active immunity to the carcinoembryonic antigen (CEA) in patients treated with an anti-idiotype monoclonal antibody vaccine. Society for Biological Therapy (Abstract), (1994).

Gauthier, E. R., Chapdelaine, P., Tremblay, R. R., and Dube, J. Y. Characterization of rhesus monkey prostate specific antigen cDNA. Biochimica Biophysica Acta, 1174:207-210, (1993).

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: THERION BIOLOGICS CORPORATION, ET AL

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENERACIÓN DE RESPUESTA INMUNES PARA ANTÍGENO ESPECÍFICO DE PRÓSTATA (PSA)

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

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(A)

DIRECCIÓN: SEWAL P. BRONSTEIN; DIKE, BRONSTEIN, ROBERTS & CUSHMAN

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 130 WATER STREET

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(C)

CIUDAD: BOSTON

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(D)

ESTADO: MASSACHUSETTS

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(E)

PAÍS: US

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 02129

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(v)

FORMA LEGIBLE EN COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: PC IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 26 JUNIO 1996

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(C)

CLASIFICACIÓN

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/500,306

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 JULIO 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: RESNICK, DAVID S.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34,235

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 45394-PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (617) 5233400

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (617) 523-6440

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENACIÓN: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTAGAAGCC CCAAGCTTAC CACCTGCA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENCADENACIÓN: desconocida

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(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTAGATCAG GGGTTGGCCA CGATGGTGTC CTTGATCCAC T

\hfill

41

Claims (8)

1. Composición farmacéutica para uso en la estimulación de una respuesta inmune anti-PSA en un hombre, que comprende:

Una primera composición que comprende un portador farmacéutico y un primer vector poxvirus recombinante que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un segmento de ADN que codifica esencialmente el antígeno específico de próstata autoantigénico (PSA) o una célula T citotóxica que provoca su epítopo ligado operablemente a un promotor y capaz de expresión en el hombre para estimular una respuesta inmune al PSA o epítopo en la introducción del primer vector poxvirus en el hombre, en donde el primer poxvirus es virus de la viruela aviar, viruela del canario o viruela de paloma: y

Una segunda composición, para ser puesta en contacto con el hombre en por lo menos un intervalo de tiempo periódico después de la primer composición, que comprende un portador farmacéutico y un segundo vector poxvirus recombinante que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un segmento de ADN que codifica esencialmente el PSA autoantigénico o una célula T citotóxica que provoca su epítopo ligado operablemente a un promotor y capaz de expresión en el hombre para estimular una respuesta inmune para el PSA o epítopo en la introducción del segundo vector poxvirus en el hombre, en donde el segundo poxvirus es el virus de la viruela aviar, virus de canario o viruela de paloma y es diferente del primer poxvirus.

2. Composiciones farmacéuticas para uso en estimulación de una respuesta inmune anti-PSA en un hombre, que comprende:

Una primera composición que comprende un portador farmacéutico y un vector poxvirus recombinante que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un segmento de ADN que codifica esencialmente el PSA autoantigénico o una célula T citotóxica que provoca su epítopo ligado operablemente a un promotor y capaz de expresión en el hombre para estimular una respuesta inmune para el PSA o epítopo en la introducción del vector poxvirus en el hombre, en donde el poxvirus es virus de la viruela aviar, viruela del canario o viruela de paloma; y

Una segunda composición, para ser puesta en contacto con el hombre en por lo menos un intervalo de tiempo periódico después de la primer composición, que comprende un portador farmacéutico y esencialmente PSA autoantigénico o una célula T citotóxica que provoca su epítopo.

3. Composiciones farmacéuticas para uso en estimulación de una respuesta inmune anti-PSA en un hombre, comprende:

Una primera composición que comprende un portador farmacéutico y esencialmente PSA autoantigénico o una célula T citotóxica que provoca su epítopo; y

Una segunda composición, para ser puesta en contacto con el hombre en por lo menos un intervalo de tiempo periódico después de la primer composición, que comprende un portador farmacéutico y un vector poxvirus recombinante que tiene por lo menos un sitio de inserción que contiene un segmento de ADN que codifica esencialmente el PSA autoantigénico o una célula T citotóxica que provoca su epítopo ligado operablemente a un promotor y capaz de expresión en el hombre para estimular una respuesta inmune para el PSA o epítopo en la introducción del vector poxvirus en el hombre, en donde el poxvirus es virus de la viruela aviar, viruela de canario o viruela de paloma.

4. Composiciones farmacéuticas como se reivindica en la reivindicación 2, en donde el PSA o la célula T que provoca su epítopo se formula con un adyuvante o está en una formulación liposómica.

5. Composiciones farmacéuticas como se reivindica en la reivindicación 4, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de RIBI Detox, QS21 y adyuvante incompleto de Freund.

6. Composiciones farmacéuticas como se reivindica en la reivindicación 4, en donde el adyuvante es un adyuvante biológico.

7. Composiciones farmacéuticas como se reivindica en la reivindicación 6, en donde el adyuvante biológico se selecciona del grupo que consiste de una citoquina, por ejemplo interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-12 (IL-12), y moléculas co-estimuladoras, por ejemplo B7.1. B7.2.

8. Composiciones farmacéuticas como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el segundo vector poxvirus recombinante tiene un gen insertado que codifica un adyuvante biológico se selecciona del grupo que consiste de una citoquina, por ejemplo interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-12 (IL-12), y moléculas co-estimuladoras, por ejemplo B7.1. B7.2. con lo cual el adyuvante biológico se co-expresa en administración al humano.