JP2008546788A - 前立腺癌に対するワクチンに関する方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、人に投与することによりヒトＰＳＡに対する免疫応答をもたらす、非ヒト霊長類ＰＳＡを含む前立腺癌に対するワクチンに関する方法及び組成物を提供することである。より全般的に言えば、本発明の目的は、人における非ヒト霊長類異種抗原（例えば、タンパク質）の使用に関する方法及び組成物において、使用する非ヒト霊長類異種抗原に関して、人の生来の自己抗原に対して最適な免疫応答を誘発するために、該非ヒト霊長類異種抗原とヒト自己抗原との間の種差が相対的に少ない、方法及び組成物を提供することである。

Description

本願は、２００５年６月２１日に出願した同時係属中の米国仮出願第６０／６９２２３８号に基づく優先権を請求する。

本発明は、全般的にワクチンに関した方法及び組成物に関し、より特定すれば、前立腺癌に対するワクチンに関した方法及び組成物に関する。

背景技術を考察する前に、その考察中の括弧［］付き番号は、本明細書の末尾に列挙した以下の書誌参考文献における番号付き参考資料を指すことに留意されたい。

背景に関して言えば、米国では、前立腺癌は、最も診察頻度の高い形態の癌であり、男性において癌の第２の死因である［２］。局所腫瘍に対する現行の治療モダリティには、外科手術及び放射線療法が挙げられ、概ね成績が良い。しかし、現行のホルモン療法は一時的にしか有効でない［３］ため、転移疾患の治療にはそれ程有益ではない。したがって、前立腺癌の新たな治療法が求められている。

ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に基づく免疫療法は、特に、転移疾患の予防及びアジュバント治療に対して非常に有望な、１つの潜在的な新療法手段である［４、５］。ＣＴＬは、標的細胞の表面上にあるクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との複合体において、短鎖ペプチド（８〜１０アミノ酸）の形態を取る抗原を認識する。こうした細胞を直接溶解できるため、ＣＴＬは腫瘍免疫療法にとって魅力的である。

前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、ＣＴＬによる前立腺癌細胞の特異的破壊のための腫瘍抗原として提案されてきた。前立腺に対する発現の厳密な組織特異性、前立腺癌細胞による継続的発現、並びに生化学的、遺伝的及び細胞生物学的な入手可能データの豊富さすべてのために、ＰＳＡは、前立腺癌免疫療法の潜在的標的として特徴付ける上で優れた候補である。

幾種かのＰＳＡ系ワクチンが、進行前立腺癌の患者においてＰＳＡに対する免疫応答を刺激するために、最近実施した臨床試験で評価された。これらのワクチンは、ＰＳＡを発現する組換えワクシニアウィルス（ｒＶ−ＰＳＡ）［６〜９］、リポソーム中に処方した組換えＰＳＡタンパク質［１０］、及び組換えＰＳＡタンパク質をパルス導入した［１１］、又はＰＳＡコードＲＮＡをトランスフェクトした［１２］自家樹状細胞であった。

ＣＤ８＋Ｔ細胞
ＣＤ８＋Ｔ細胞の主要な生物学的機能は、体内の病原体感染細胞を除去することである。感染細胞のＴ細胞による認識に関わる機構は、現在では分子レベルで良く確立されており、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）と主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）に結合した抗原由来ペプチドとの相互作用に依存する。該細胞が産生するすべてのタンパク質抗原は、最終的に分解され、生成ペプチドが、細胞表面上のＭＨＣ Ｉ分子により提示される。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生
Ｔ細胞の発生は胸腺で起こり、その際、各Ｔ細胞クローンが最終的に特異なＴＣＲを発現するように、ＴＣＲのα及びβ遺伝子セグメントが再編成される［１３］。表面ＴＣＲを産生する発生中の胸腺細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８コレセプターを発現し、自己ペプチド−ＭＨＣリガンドに対する各ＴＣＲの特異性及び親和性に依存して、複雑な成熟過程を受ける。自己ペプチド−ＭＨＣ分子に親和性のないＴＣＲを発現する胸腺細胞は、プログラム細胞死の機構により死滅する。胸腺中の細胞上に発現される自己ペプチド−ＭＨＣリガンドに対し、親和性の強いＴＣＲを発現する潜在的に有害な胸腺細胞は、物理的削除［１４］、機能的不活性化［１５］、又は受容体編集［１６］を介して除去される。胸腺間質細胞上の自己ペプチド−ＭＨＣリガンドに対し、低いが有意な親和性を示すＴＣＲを発現する胸腺細胞だけが、胸腺選択に生き残る［１７］。

ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の再循環及び生存
Ｔ細胞のＴＣＲが高い親和性を示す外来ペプチド−ＭＨＣリガンドに、未だ接触したことのない該Ｔ細胞は、「ナイーブ」Ｔ細胞と呼称される。こうした細胞は、健康な若年成人における二次リンパ器官中のＴ細胞の大半を占める。ナイーブＴ細胞は、脾臓、リンパ節、及び粘膜リンパ器官（腸のパイアー斑など）を含めた二次リンパ器官中を継続的に再循環する［１８、１９］。個々のナイーブＴ細胞は、二次リンパ器官中を平均して数カ月循環すると推定される［２０、２１］。この通常寿命中でのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の生存は、自己ペプチド−ＭＨＣ複合体の低親和性ＴＣＲ認識［２２］、及びＩＬ−７受容体を介したシグナル伝達［２３、２４］によって維持されている。ＴＣＲ及びＩＬ−７受容体を介したシグナルは、ナイーブＴ細胞の生存に必要であるが、こうしたシグナルによって、該Ｔ細胞が正常数のＴ細胞を含有する宿主中で増殖することはない。対照的に、Ｔ細胞欠損宿主中に移入されると、ナイーブＴ細胞は増殖する。この「恒常性維持的」増殖も、ＩＬ−７［２３、２４］、及び自己ペプチド−ＭＨＣ複合体の低親和性ＴＣＲ認識［２５］に依存するが、ＩＬ−２にも、ＣＤ２８共刺激性（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）受容体にも依存しない［２６］。若年者では、新たなナイーブＴ細胞が、胸腺により恒常的に産生され、二次リンパ器官に移送されることにより、老化したナイーブＴ細胞と置き換わる。対照的に、胸腺産生力が低下又は欠失した年配者では、老化細胞を残存するナイーブＴ細胞の増殖によって置き換え得る。

ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
二次リンパ器官のＴ細胞領域中を移動するナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、体内の任意の細胞中、最高量のＭＨＣ分子を構成的に発現する大型で形状不規則な樹状細胞（ＤＣ）の濃密な網目に接触する［２７］。感染や組織損傷がない場合、二次リンパ器官中の全ＤＣ集団は、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの共刺激性分子の低発現を特徴とする休止状態で存在する［２８］。この状態では、ＤＣは、ナイーブＴ細胞の生存を維持する、低親和性の自己ペプチド−ＭＨＣリガンドの提示において重要な役割を演じることはほぼ確かである。

感染の場合、多様なウィルス性又は細菌性産物が、パターン認識受容体［２９］、例えば、ＤＣを含めた先天性免疫系の細胞上にあるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって認識される。ＴＬＲシグナル伝達はＤＣの活性化を起こし、その結果、共刺激性分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現量増加、並びに炎症性サイトカインの産生が起こる［３０］。次いで、活性化されたＤＣは、病原体由来ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞へ提示することにより機能する。ＴＬＲを介したシグナルに加え、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、最大限に増殖し、細胞傷害性エフェクター細胞に分化するために、共刺激性ＣＤ２８受容体及びＩＬ−１２受容体を介した追加のシグナルも必要とする［３１〜３３］。これらのすべてのシグナルは、活性化ＤＣによりナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞へ提供することができる［３４］。

ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビボで抗原に曝されてから早くも４８時間後に、ＤＮＡ複製及び細胞分裂の兆候を示す［３５〜３７］。これらの事象の後、抗原特異的Ｔ細胞の個数が、この後数日間に亘り指数関数的に増加する。刺激に応じて、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の個数は、抗原で活性化してから７〜１５日後に、二次リンパ器官中で最高値に達する（図２．３）［３５、３８〜４３］。

インビトロ実験では、ナイーブな抗原刺激Ｔ細胞による細胞分裂は、ＩＬ−２の自己分泌産生により推進される［４４］。しかし、意外にもナイーブＴ細胞の抗原推進増殖は、インビボでＩＬ−２にわずかにしか依存しない［４５〜４９］。したがって、ＩＬ−２以外に、他のシグナル又は増殖因子も、インビボでＴ細胞増殖を推進できるにちがいない。

インビボでのＴ細胞増殖は、ＤＣからの共刺激性シグナルにより厳重に調節される。抗原刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ２８がリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６と相互作用することができないマウスでは、激減する［３７、４５、５０］。ＣＤ４０リガンドが欠損すると、Ｔ細胞増殖に類似の作用を示すが、それは、ＣＤ４０シグナル伝達が抗原提示細胞上にＣＤ８０及びＣＤ８６を誘導する事実と関係するとも思われる［５１］。共刺激性シグナルは、増殖因子の産生を強化することによってＴ細胞増殖を調節する。ＩＬ−２の抗原推進産生は、ＣＤ２８シグナル伝達が消失すると著しく損なわれる［４５］。

エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞
免疫応答が最高潮の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター機能を発現し、したがって「エフェクター細胞」と呼称されることもある［５２］。エフェクター細胞は、特徴的な１組の接着受容体を発現する。ナイーブ細胞と異なり、そうした細胞は、その決定的な特徴、即ち、適切なペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を表示する標的細胞を直接死滅させる能力に寄与する、パーフォリン及びグランザイムを発現する［５３］。エフェクターＴ細胞は、Ｔ細胞領域から離れ、多くの非リンパ組織、特に炎症を起こした抗原沈着部位の中へ移動する。細胞溶解能を有するエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の非リンパ器官中への移動は、あらゆる身体部分からのペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を表示する細胞を除去する有効な方法である。

二次リンパ器官中のエフェクターＴ細胞の個数は、最高潮の増殖後に激減する［３５、３８〜４３］。エフェクターＴ細胞の死因となる分子的根拠は、抗原刺激の性質に応じて変化する。抗原を単回投与した後のＴ細胞応答の場合、その死はＦａｓ非依存性であり、Ｂｃｌ−２感受性［５４］であって、増殖因子の欠乏によることはほぼ確かである［５５］。抗原が慢性的に提示される場合、ＴＣＲで媒介される活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）が起こり得る［５６］。この種のアポトーシスは、Ｆａｓに依存し、Ｂｃｌ−２から受ける阻害は弱い［５５］。

ＩＬ−２は、通常はＦａｓシグナル伝達を阻害するＦＬＩＣＥ阻害タンパク質の活性化を阻止することにより、ＡＩＣＤにおける役割を演じている［５７］。エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の死は、炎症により調節される。炎症がない場合、最高潮の増殖後における二次リンパ及び非リンパ器官からの抗原特異的Ｔ細胞は、ほぼ完全に喪失する［５８］。対照的に、ＬＰＳやＩＬ−１などのアジュバントと共に抗原を注入した後では、より多数の細胞が喪失期から生き残る［３５、５８、５９］。

記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞
最高潮の増殖後に非常に大多数のエフェクター細胞が死滅するが、それでも、抗原が炎症との関わりで初回に提示された場合、抗原経験Ｔ細胞の安定集団が長期間生き残る［５２］。多くの点から、記憶細胞は、基礎活性化状態に戻ったエフェクター細胞と見なすことができる。実際のところ、数連の証拠から、エフェクター細胞が記憶細胞の前駆体であることが示唆される［６０、６１］。

ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と異なり、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生存のためにＭＨＣクラスＩ分子に依存しない［６２］。大部分の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞は周期を経ていないが、小比率のその記憶集団は、ＭＨＣクラスＩ非依存的に常に増殖している［４７、６２］。この増殖は、抗原特異的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数が経時的に不変であるので、死滅と均衡している。いくつかの知見によれば、ＩＬ−１５はこの過程である役割を演じている。記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原非依存的増殖は、ＩＬ−１５の注入により促進され［６３］、ＩＬ−１５に対する抗体の注入により阻止される［４７］。その上、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５欠乏マウスでは減少している［６４］。ＩＬ−１５は、先天性免疫応答中に非Ｔ細胞により産生されるので、ＩＬ−１５が他の感染に応答して産生される結果、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞が維持される可能性がある［６３、６５］。

前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、前立腺の線房及び導管に沿った円柱上皮細胞により、専ら産生されるカリクレイン様セリンプロテアーゼである［６６〜６８］。ＰＳＡは、前立腺管の内腔中に分泌され、約０．５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲のやや高濃度で精漿中に存在する［６９］。生理学的には、ＰＳＡは、主要なゲル形成タンパク質のセメノゲリンＩ及びＩＩ、並びにフィブロネクチンを切断し、精子の運動性を増加させるように、精漿中で機能する［６７、７０、７１］。ＰＳＡは、アミノ酸２６１個の不活性プレプロＰＳＡ前駆体として翻訳される。プレプロＰＳＡは、プレ領域（シグナルペプチド）及びプロペプチドを構成する追加の２４残基を有する。プロペプチドを放出すると、酵素活性のある、アミノ酸２３７個の成熟細胞外形態が生成する。ＰＳＡ同様に前立腺組織中で選択的に発現されるヒト腺性カリクレイン２（ｈＫＬＫ２）は、プロＰＳＡの活性化を担っている［７２］。ＰＳＡは、６９位アスパラギンに結合したＮ結合型オリゴ糖を含有することが示された［７３］。

ＰＳＡはまた、低濃度で血中に放出される。前立腺癌の臨床的証拠がない健常男性では、血清中で検出されるＰＳＡの濃度は、普通４ｎｇ／ｍｌ未満である［７４〜７６］。酵素活性なＰＳＡは、α１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）と共有結合複合体を形成することにより、血中で不活性化される［７７、７８］。酵素不活性な（内部にクリップされた）ＰＳＡは、プロテアーゼ阻害剤と複合体を形成することができず、血中を遊離非複合形として循環する［７９］。

ＰＳＡは器官特異的であり、その結果、前立腺良性増殖性（ＢＰＨ）組織、前立腺原発癌組織、及び前立腺転移癌組織の上皮細胞により産生される［６６、８０］。正常な前立腺上皮細胞、及びＢＰＨ組織は、悪性前立腺組織より多量のＰＳＡタンパク質を実際に産生する［８１、８２］。したがって、ＰＳＡは、腫瘍細胞の方が多量に産生する従来型の腫瘍マーカーではなく、むしろ外傷又は疾患に起因する前立腺構造の異常で、該酵素の間質中への「漏出」、次いで毛細血管及びリンパ管を経て血流中への「漏出」が増加する恐れがある。

臨床におけるＰＳＡの最も一般的な使用は、前立腺癌療法をモニターするためである。患者が徹底した前立腺摘除を受けた場合、血清ＰＳＡ濃度は、産生源組織がすべて除去済みなため、検知不能な濃度まで減少するはずである［８３、８４］。外科手術後にＰＳＡ濃度が増加するのは、その疾患が再発したことを示す［８３、８５、８６］。ＰＳＡは、前立腺癌患者における放射線療法及び抗アンドロゲン（ホルモン）療法の好成績も反映する［８７〜８９］。

対癌プラスミドＤＮＡワクチン
近年になって幾種もの腫瘍ワクチン戦略が開発されてきた。その大部分は、免疫系が認識できる腫瘍抗原の特定に依存している。ＤＮＡワクチンの接種は、腫瘍抗原に対する体液性、細胞性双方の免疫応答を誘発するそのような一手法を代表する。動物モデルを用いた試験によれば、防御的な抗腫瘍免疫応答を誘発するために、ＤＮＡワクチンの接種を使用する妥当性が実証された。しかし、人間の癌細胞が発現する大部分の腫瘍抗原は、免疫原性が弱いため、臨床状況でＤＮＡワクチンの効力を増強するための戦略の開発が必要となる。ＤＮＡワクチンの免疫学の理解、及びＣＴＬ活性に関するＤＮＡワクチンの効力の増加に使用される戦略の最近の進歩を以下に考察する。

ＤＮＡワクチンの免疫学
ＤＮＡワクチンは、単純なプラスミドＤＮＡ発現ベクターを普通意味する。それには、真核性プロモーターとポリアデニル化配列との間に挿入された所望の抗原、細菌性の抗生物質耐性遺伝子及び細菌性の複製起点をコードするｃＤＮＡが含有される。真核性プロモーター及びポリアデニル化配列は、哺乳類細胞中で適切な抗原発現を行うために必要であり、抗生物質耐性遺伝子及び複製起点は、細菌中でのベクターの産生を可能とする。

筋肉内（ｉ．ｍ．）又は皮内（ｉ．ｄ．）接種で裸プラスミドＤＮＡを投与した後、宿主細胞は該ＤＮＡを取り込み、被コード抗原を産生し、次いで該抗原が免疫応答標的として機能する［９０〜９３］。抗原のインビボでの発現は、普遍的に活性であり、広範囲の細胞型で抗原産生を推進すると見込まれる、強力なウィルスプロモーターの使用により通常実現される。ヒトサイトメガロウィルスの前初期エンハンサー−プロモーター（ＣＭＶプロモーターの名で知られている）は、しばしば好ましいプロモーターである［９４］。ＤＮＡワクチンを接種すると、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の誘導などの調節構成要素、及びナイーブ抗原を認識する抗体の産生などのエフェクター構成要素からなる適応的免疫応答、並びにエフェクターのＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が発生する。該リンパ球は、クラスＩ主要組織適合分子（ＭＨＣクラスＩ）により細胞表面上に提示される抗原由来ペプチドに向けて誘導される。

タンパク質抗原をコードするＤＮＡのＣＴＬ応答を発生する潜在能力は、精製組換えタンパク質による免疫がＣＴＬを効率的に誘発しないので、非常に注目を集めた（［９５、９６］で総説されている）。その基本的機構に関するマウスにおける研究によって、ＤＮＡ分子によるヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の直接活性化は、ＤＮＡワクチンによるＣＴＬの初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）の成功に寄与することが明らかとなった。後者の要件は、やや重複的であると示唆された（以下を参照されたい）。

ここで、認められたＤＮＡワクチンの免疫原性を解明しつつある重要知見を以下に要約する。

ＤＮＡワクチンを接種した後のＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、樹状細胞（ＤＣ）などの骨髄由来ＡＰＣにより開始されることが示された［９７〜９９］。当該ＡＰＣは、プラスミドＤＮＡで直接トランスフェクトすることができ、次いで細胞内で抗原が産生されるか、又は他細胞が発現し、放出した抗原を取り込むこともある（後者の機構は、交差提示／交差初回抗原刺激と呼称される）［１００〜１０２］。双方の場合とも、抗原は、ＡＰＣ内部のタンパク質分解性消化で処理され、生成したペプチドは、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の初回抗原刺激をするために、ＭＨＣクラスＩ分子により細胞表面上に提示される。これらの２機構中いずれがインビボで主要であるかは、なお論争の対象であり、異なるＤＮＡ投与法の間で変化し得る［１０２〜１０４］。

それでも、抗原のある種の修飾（ユビキチン［１０５］又は熱ショックタンパク質［１０６、１０７］との結合を含む）によって、従来型又は交差初回抗原刺激のＭＨＣクラスＩ提示経路への標的誘導を改善し得る（［１０８］に総説されている）。

プラスミドＤＮＡの主鎖は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから構成され、特定の隣接ヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼称される）を有する免疫賦活性ヌクレオチド配列を含有することが示された［１０９〜１１１］。真核生物対原核生物においては、ＣｐＧジヌクレオチドの利用頻度及びメチル化パターンが異なるため、このような配列は、哺乳類ＤＮＡより細菌ＤＮＡにおいて約２０倍普遍性が高い［１１２、１１３］。ＣｐＧモチーフは、マウスのマクロファージ、ＤＣ及びＢ細胞上に発現されるが、人間では形質細胞様ＤＣ及びＢ細胞上にしか発現しない［１１５〜１１７］、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）［１１４］を介して作用することが示された。ＴＬＲ９とＣｐＧ含有プラスミドＤＮＡとの直接相互作用の結果、ＡＰＣ上での共刺激性分子の上方調節、並びに、先天性免疫系の多様な細胞が分泌する炎症性サイトカインＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮα／β及びＩＦＮγの誘導が起こることが示された［１１８〜１２１］。

ＡＰＣの活性化は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の効率的な初回抗原刺激にとって重要であることが知られており、したがって、ＤＮＡワクチンの主鎖におけるある種のＣｐＧモチーフの存在が、ＣＴＬ誘導に寄与することが提案された［１２２］。意外にも、ＴＬＲ９シグナル伝達経路が欠損したマウス（ＴＬＲ９−／−又はＭｙＤ８８−／−マウス）をＤＮＡで反復免疫した結果、プラスミドＤＮＡによるＡＰＣの直接刺激がこうしたマウスでは観察できなかったという事実にも関わらず、野生型マウスの場合と同様に、正常なＣＴＬ応答が発現する［１２３、１２４］。この知見から、ＣｐＧモチーフによるＡＰＣの活性化は、ＤＮＡワクチンに関しては重複的とも思われ、ＡＰＣのインビボで必要な活性化は、恐らく、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を介して間接的に起こり得ることが示唆される（［１２５］に総説されている）。実際のところ、ＣＤ４＋Ｔ細胞が枯渇している、又はＣＤ４＋Ｔ細胞区画が欠損しているマウス（ＣＤ４−／−又はＭＨＣクラスＩＩ−／−のノックアウトマウス）におけるＤＮＡ免疫実験では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在が、エフェクターＣＴＬ応答の発生にとって決定的な要件であることが実証された［１２６〜１２８］。

動物モデルにおける対癌ＤＮＡワクチン
防御的抗腫瘍応答を発現する際のＤＮＡワクチンの有用性は、マウスにおけるモデル腫瘍抗原を用いて初めて実証された。ＳＶ４０ラージＴ抗原［１４６］、β−ガラクトシダーゼ［１４７］、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）［１４８］、ヒトパピローマウィルスＥ７［１４９］、又はヒトＰＳＡ［１５０］をコードするプラスミドによるＤＮＡ免疫は、対応する抗原を発現する同系腫瘍細胞の致死性接種から、マウスを防御することが示された。枯渇試験によって、腫瘍拒絶におけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の役割が証明された［１４７、１４９］。まとめると、これらの試験によって、腫瘍細胞を標的とした抗原特異的免疫応答を誘発するために、ＤＮＡワクチンを使用することの妥当性が実証されている。しかし、これらの試験に使用した抗原はすべて、事実、自己抗原を示す「正規の」腫瘍抗原より、通常はるかに免疫原性が高い外来タンパク質であった。

臨床的に見られそうな腫瘍抗原にもっと類似した腫瘍抗原に対して、ＤＮＡワクチンの効力試験を可能にする数種のマウスモデルを確立した。こうした手法は、組織特異的にモデル腫瘍抗原を発現するトランスジェニックマウスの使用［１５１、１５２］、又はヒト腫瘍抗原のマウス対応抗原を標的とするＤＮＡワクチンの試験［１５３、１５４］に依存している。

ＭＡＧＥファミリーに属する、ヒト腫瘍特異抗原に相当するマウス抗原である、Ｐ８１５Ａ抗原［１５５］に対するＤＮＡ免疫は、ＣＴＬを誘導し、マウスを致死的腫瘍接種から防御することが示された［１５３］。この知見から、大部分の正常組織中で静止（ｓｉｌｅｎｔ）している天然腫瘍特異抗原に対して、Ｔ細胞が容易に誘導できることが示唆された。

対照的に、天然の腫瘍関連抗原は、免疫原性が本来低いことが示された。ヒト癌原遺伝子Ｈｅｒ２をコードするＤＮＡワクチンは、野生型マウスにおいて抗体応答を容易に誘発したが、その同じワクチンは、Ｈｅｒ２トランスジェニックマウスにおいてわずかしか抗体応答を誘発せず、弱い腫瘍防御を示した［１５２］。同様な結果は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ応答についても得られた。ラットｎｅｕ ＤＮＡワクチンによる免疫は、野生型マウスにおいて防御的ＣＴＬ応答を誘発したが、トランスジェニック動物では無効で、ＣＴＬ応答が認められなかった［１５６］。ラットｎｅｕ ＤＮＡワクチンが、野生型マウスにおいてＣＴＬ応答を誘発できることは、ｎｅｕ由来ＣＴＬエピトープと、マウスＨｅｒ２相当物（ｃ−ｅｒｂＢ−２）の対応配列とのアミノ酸配列の差異で恐らく説明できよう［１５６、１５７］。したがって、ｎｅｕ由来エピトープを認識できるＣＤ８＋Ｔ細胞は、野生型マウス中に存在するが、ｎｅｕトランスジェニックマウス中では、胸腺選択中に枯渇したか、又は末梢においてアネルギー化していることはほぼ確かである。

こうした知見と対応して、マウスメラニン細胞分化抗原のＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２（チロシナーゼ関連タンパク質）、及びｇｐ１００に対するＤＮＡ免疫も、失敗に終わった［１５４、１５８、１５９］。興味深いことには、同じ試験によって、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２又はｇｐ１００をコードする異種（ヒト）ＤＮＡでマウスを免疫すると、免疫応答が誘発され、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞による同系腫瘍接種から防御がなされた。抗腫瘍免疫は、ヒトＴＲＰ−１のワクチン接種時には抗体で、ヒトのＴＲＰ−２及びｇｐ１００の場合にはＣＤ８＋Ｔ細胞で媒介された（［１６０］に総説されている）。こうした知見の重要な結論は、同系（マウス）遺伝子による免疫が、Ｔ細胞又は抗体の応答を誘発しないのに対し、異種（ヒト）遺伝子による免疫では、人間、マウスの両タンパク質を認識できる抗体及びＣＴＬが生成できることである。ＣＴＬ応答については、このような交差反応性の基礎をなす機構が、ｇｐ１００の場合、ＭＨＣクラスＩ抗原との結合能が向上した、ヒト配列中の異常（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）エピトープのランダム創生を表わすことが示された［１６１］。したがって、ヒトｇｐ１００をコードするＤＮＡワクチンは、この「ヒト」エピトープを目標とし、対応するマウス内生配列（「マウス」エピトープ）も認識できるＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する［１５９、１６２］。交差反応性抗体応答については、異種配列内の強力なヘルパーエピトープの存在が示唆された［１６３］。この目的のために、動物モデルにおけるＤＮＡワクチンに関する研究により、腫瘍防御に関して有望な結果が示された。しかし、臨床状況をより多く反映している治療手段としてＤＮＡワクチンを使用するには、なお課題が残っている。胸腺中でのＴ細胞成熟中におけるＴ細胞全種（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の形成の基礎となる機構の理解、及び「自己」腫瘍抗原反応性のＣＴＬの正確なマッピングをすれば、特に腫瘍関連抗原に対してより強力な免疫応答を誘発できる、ＤＮＡワクチンの合理的設計の補助に更になるはずである。

ＤＮＡワクチンの効力増強
マウスにおける試験によって、抗原特異的ＣＴＬがＤＮＡワクチンで誘導される頻度は、ウィルス誘発応答と比較して約１０分の１であり、ＤＮＡで単回免疫した後のエフェクターＣＴＬの一次応答は、わずかに遅れて免疫してから１２〜１５日で最高となる［１６４、１６５］。ＣＴＬ一次応答のこうした定性的差異は、プラスミドＤＮＡ投与後に産生する微量の抗原、及びインビボでのＡＰＣの非効率的ターゲッティングに部分的に起因すると思われ、このことは相俟って、ナイーブＴ細胞の頑強な初回抗原刺激及び増殖を保証するには不十分である。

汎用されている塩水中ＤＮＡのｉ．ｍ．又はｉ．ｄ．注入と比較した場合、産生抗原量を増加させ、及び／又はインビボでのＡＰＣのターゲッティングを改善する、数種のＤＮＡ送達手法が開発されてきた。これらの技法には、ＤＮＡ被覆金粒子の皮内への微粒子銃接種、常在する抗原提示ランゲルハンス細胞のターゲッティング（「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」とも呼称される）［９１、１０２］、ＤＮＡを表面に吸着したポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）の使用［１６６、１６７］、又はｉ．ｍ．若しくはｉ．ｄ．ＤＮＡ投与後の注入部位におけるパルス電界の印加（インビボ電気穿孔とも呼称される）が含まれる［１６８〜１７１］。ここで、裸ＤＮＡの末梢リンパ節中への直接注入が、従来のｉ．ｍ．又はｉ．ｄ．接種経路で得られる応答より定性的にも定量的にも優れている、強力なＣＴＬ応答を誘発することが示されたことは、注目に値する［１７２］。この知見は、ＤＮＡ免疫後におけるナイーブＴ細胞の初回抗原刺激の有効性は、二次リンパ器官における抗原刺激の強度及び持続期間と相関することを示唆している。

ＤＮＡワクチンの免疫原性は、プラスミドがコードする抗原の様々な修飾によっても増強することができる。コードＤＮＡ配列のコドン最適化によって、ＤＮＡワクチンの接種後、抗原発現が増加する結果、抗体及びＣＴＬの優れた応答が生じることが示された［１７３、１７４］。抗原をユビキチン単量体［１０５］又は熱ショックタンパク質［１０６、１７５］に連結すると、抗原特異的ＣＴＬ応答が増加したが、その増加は、従来型又はクロスプライミング型のＭＨＣクラスＩ提示経路に対する、これら融合タンパク質のターゲッティングの改善を介して起こると推測される。

ＤＮＡワクチンによる免疫応答の誘発を最適化する別の戦略は、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導が、エフェクターＣＴＬ及び抗体の応答の発生に相当寄与するという事実に基づいている（セクション４．１を参照されたい）。強力なヘルパーエピトープを含有する微生物抗原又はウィルス抗原と、腫瘍抗原とを連結することによってヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の支援を得ると、ＤＮＡワクチンの接種後、腫瘍抗原に対する抗体及びＣＴＬの応答が増加することが示された（［１７６］に総説されている）。

腫瘍抗原特異的なＣＴＬ応答を強化することを目的とした、このような腫瘍抗原−「ヘルパー」抗原融合構築体の設計には、更に検討が必要であることに言及することは重要である。免疫優性の現象として知られている、大型抗原由来のごく少数のペプチドエピトープへＣＴＬ応答が天然では集中することが、ＤＮＡワクチンについても観察される［１７７、１７８］。したがって、ＣＴＬ応答が、「ヘルパー」抗原由来のエピトープではなく、腫瘍抗原由来のエピトープに対して発現することを保証するために、融合体の「ヘルパー」部分にある潜在的なＣＴＬエピトープはすべて、除去すべきである［１７９、１８０］。

ＴＬＲ９−／−及びＭｙＤ８８−／−マウスにおける最近の実験によって、プラスミドＤＮＡ主鎖によるＡＰＣの活性化は、免疫応答の誘発に必須ではないことが実証された［１２３、１２４］が、ＡＰＣのＣｐＧ媒介刺激は、ＤＮＡワクチンにある種のアジュバント効果を与えることができよう。合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の形態で与えられるＣｐＧモチーフは、ＤＮＡワクチン接種後の抗体及びＣＴＬ応答をより良好に促進するアジュバントとして作用することが示された（［１８１］に総説されている）。ＣｐＧ−ＯＤＮのアジュバント効果は、ＤＮＡワクチンの低用量と組み合わせると非常に顕著であるが、それより高用量のＤＮＡワクチンを用いるとわずかに過ぎない［１８２］。マウスにおいて最適な免疫賦活活性を与えるＣｐＧ−ＯＤＮは、霊長類で機能するものとは配列が異なることを強調することは、重要である［１８３］。

ＤＮＡワクチンの効力を強化する他の数種の戦略は、サイトカイン及び共刺激性分子を含めた多様な免疫賦活分子の使用に集中してきた（［１８４、１８５］に総説されている）。これらのアジュバントは、組換えタンパク質の形態で、又は選択したその分子をコードする別個のプラスミドとして投与することができる。このような手法を支える論理は、サイトカイン／共刺激性分子を介して追加のシグナルを与えることによる、Ｔ細胞の初回抗原刺激の促進に共通して基づいており、そうではなくてプラスミドＤＮＡワクチンを単独で使用した場合、最適とはならない恐れがある。この手法の成績良好な適用例には、ＩＬ−１２発現性プラスミドと共にＣＥＡコードプラスミドで免疫したマウスにおける、腫瘍の攻撃に対して防御を向上させる抗体及びＣＴＬ応答の強化［１８６］と、抗原コードＤＮＡワクチン及びマウスの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するプラスミドの併用投与後における抗体／ＣＴＬ応答の強化が含まれる（［１８７］、［１８８］）。

前記戦略はすべて、全般的に、モデル抗原をコードするＤＮＡワクチンの免疫原性を増加させることが示されたが、適切なマウスモデル、及びより重要には臨床状況において、免疫原性の弱い「自己」腫瘍抗原に対して、ＤＮＡ接種後のＣＴＬの初回抗原刺激又は抗体応答を向上させるために選択される戦略は、未だ確固として確立されてはいない。

臨床状況における対癌ＤＮＡワクチン
ここでは、ＨＰＶ関連肛門異形成［２１３］、転移性結腸直腸癌［２１２］、Ｂ細胞リンパ腫［２１４］、転移性メラノーマ［２１５、２１６］、及び前立腺癌［２１１、２１７］の患者において、腫瘍関連抗原を標的としたＤＮＡワクチンに関して最近行ったいくつかの第Ｉ相臨床試験を考察する。これらの試験では、ＤＮＡワクチン接種の分野内での現在の進歩を良く代表している、異なったＤＮＡ送達技法及びアジュバントを多種採用した。

これらの試験の大多数では、標準的な段階的用量増加方式に従ったが、個々の患者にはＤＮＡワクチンの段階的用量増加をしなかった。ＤＮＡワクチンの接種は単剤療法として適用し、当該患者は、試験参加前の少なくとも３週間以内に他種の療法をまったく受けていなかったが、但し前立腺癌の試験については、患者はホルモン療法を同時に受けていた［２１７］。

これらの試験に登録した患者数が限られていたため、その試験すべてにおける主目的は、プラスミドＤＮＡ投与の安全性の評価、ワクチンが用量依存的に誘発する免疫応答のモニター、及びワクチン誘発免疫応答と臨床的便益との相関性の評価であった。

総合すると、これらの試験によって、ＤＮＡの反復投与は十分に許容され、注入１回当たり最大２ｍｇに達するＤＮＡ用量でも用量制限的な毒性は認められないことが示された［２１２］ので、ＤＮＡによる反復免疫は安全な処置であることが実証された。

免疫応答の誘発に関しては、「外来」抗原は、「自己」腫瘍関連抗原より免疫原性が強いことが示された。ヒトパピローマウィルスＥ７由来のＣＴＬエピトープ（複数も）をコードするＤＮＡワクチンの接種によって、被験者１２人中１０人に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで検出されるＴ細胞応答が誘発された［２１３］。ＣＥＡ及びＢ型肝炎表面抗原（このＨｂｓＡｇは、対照「外来」抗原として試験中に含めてある）をコードする二重発現プラスミドは、反復免疫された患者８人中６人にＨｂｓＡｇ特異的抗体応答を誘発した［２１２］。マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域に対するリンパ増殖性応答又は抗体応答も、キメラＩｇ分子をコードするプラスミドＤＮＡでワクチン接種した患者１２人中８人に認められた［２１４］。対照的に、自家腫瘍関連抗原に対する免疫応答率は、相対的に低かった。前記試験において、ＣＥＡ特異的抗体応答は認められず、患者１７人中４人しかＣＥＡに対するリンパ増殖性応答を発現しなかったが、この結果は、プラスミドＤＮＡ免疫の用量又は投与計画と明確な関係を示さなかった［２１２］。同様に、キメラＩｇ分子で免疫された患者は、自家腫瘍由来のイディオタイプ（Ｉｄ）決定基に対して、１２人中１人しか一時的Ｔ細胞応答を発現しなかった［２１４］。修飾ｇｐ１００抗原をコードするＤＮＡで免疫されたメラノーマ患者では、ｇｐ１００由来ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬエピトープに対するＣＴＬ応答は検出されなかった［２１５］が、これは、同じＤＮＡ構築体をコードする組換え家禽ポックスウィルスが、以前実施の試験で患者１４人中４人にＣＴＬ活性を誘発することが示された［２１８］という事実と相容れない。新規なチロシナーゼ由来ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに対する一時的ＣＴＬ応答は、このエピトープをコードするプラスミドＤＮＡをリンパ節中へ注入されたメラノーマ患者、全体で２４人中１１人に認められた［２１６］。

ＤＮＡワクチンと、ＰＳＭＡを発現する組換えアデノウィルスとの反復投与を組み合わせた試験では、すべての患者が、ＰＳＭＡプラスミドＤＮＡ注入に対して陽性のＤＴＨ応答を最終的に発現したため、ＰＳＭＡに対する細胞免疫応答の誘発が示唆されたが、こうした結果は、従来型の他のインビトロアッセイによりそれ以上確認されなかった［２１７］。

ホルモン不応性前立腺癌の患者におけるＤＮＡワクチン接種に関して、本発明者等が最近行った臨床試験では、患者９人中２人にＰＳＡ特異的なＴ細胞免疫応答が認められたが、両応答者ともＤＮＡの最高試験用量を受けたコホートに属していた［２１１］。腫瘍関連抗原に対するＴ細胞免疫応答が用量依存的に誘発される傾向は、これらのうち数種の試験で認められた［２１１、２１４］が、ＣＴＬの存在を確証することを目的とした、反応性Ｔ細胞のエピトープ特異性は、未だ決定されていない。

単剤療法としてのＤＮＡワクチン接種の臨床的便益は、わずかに過ぎず、それには以下のことが含まれていた。即ち、Ｂ細胞リンパ腫の患者１人が、骨髄の腫瘍退行を体験したこと［２１４］、高度な肛門性器異形成の被験者３人が、部分的な組織応答を得たこと［２１３］、前立腺癌の患者２人が、血清ＰＳＡ濃度の減少で判定した場合、疾患の安定化を示したこと［２１１］、及びチロシナーゼに対して検出可能な免疫応答を示したメラノーマ患者１１人が、免疫応答を示さなかった患者１３人と比較して、優れた生存率を示したこと［２１６］である。臨床的便益とワクチン誘発免疫応答との相関性は、後者の２試験においてしか認められなかった［２１１、２１６］。

要約すると、ＤＮＡワクチンの反復接種は、人間のＴ細胞免疫応答の誘発に必要と思われる高ＤＮＡ用量（１ｍｇ程度）でも、臨床状況において良好な安全性プロファイルを示した。低い応答頻度は、これらの試験に登録した進行段階の患者の低下した免疫状態から、部分的には生じた恐れがある。今後の臨床試験では、寛解期中の、又は残留疾患がごくわずかの患者に集中することができ、その場合、ＤＮＡワクチンのより明確な臨床的便益が表れ易い。

異種ワクチン
自己抗原より外来抗原に対して免疫応答を誘発する方が、当然ながら容易である。その理由から、抗原をできる限り外来性にし、それでもなお自己タンパク質に対して免疫を誘発することが、有益である。これを実施する一戦略は、ナイーブな自己タンパク質に外来タンパク質を結合することである。このための汎用タンパク質は、キーホールリンペットシアノゲンである。ＫＬＨに対する免疫応答の誘発は、結合しているタンパク質に対して免疫応答を誘発することがしばしばある。

別の戦略は、ナイーブな自己タンパク質に類似しているが、別の動物種から採取したタンパク質を使用することである。これは、異種タンパク質と呼称される。この戦略は、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）と称する前立腺抗原を用いてなされた。Ｗｏｌｃｈｏｋ等は、マウスにヒトＰＳＭＡを使用し、マウスにおいてマウスＰＳＭＡに対する良好な免疫応答を誘発した。現在、ヒトにおいてげっ歯類異種ＰＳＭＡを用いた臨床試験が行われている。

異種タンパク質を使用する戦略は、他の種において使用されてきた。ヒトチロシナーゼは、メラノーマのイヌを免疫するために使用された。一般に、当該の種は、種間の差異が大きくなるように選択されてきた。

公表資料には、免疫応答を誘発するための異種性又は異種抗原の使用が記載されている。これには、ヒトＰＳＡがマウスにおいて使用された場合のような、異種抗原の偶発的だが、未認知の使用が含まれる。それには、異種抗原の意図的な使用も含まれる。異種抗原の意図的な使用の一例は、対メラノーマワクチン用のヒト抗原によるイヌの免疫である（Ｂｅｒｇｍａｎら、２００３、「異種ヒトチロシナーゼでＤＮＡワクチンを接種した後における進行性悪性メラノーマのイヌの長期生存：第１相試験（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｆｔｅｒ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｈｕｍａｎ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ：ａ ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：１２８４−１２９０）。こうした公表資料には、ナイーブ自己抗原に対して最適な免疫応答を誘発するために、異種タンパク質とナイーブタンパク質との種間差が最小限となる異種タンパク質の使用については記載がない。

ヒトタンパク質ＰＳＡは、１９７０年代に発見され、その特性が決定された。該ＰＳＡタンパク質は、１９７９年に初めて精製された。抗ウサギ血清が該タンパク質から調製され、組織が分析された。ヒトＰＳＡは、前立腺組織だけに見出され、他の組織には見出されなかった。Ｗａｎｇら、「ヒト前立腺特異抗原の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）」、１９７９、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．１７：１５９−６３。他者は、他の組織中により少量のヒトＰＳＡを見出した。それは、肺及び乳房の腫瘍における他の上皮様細胞中に低濃度で発現する。Ｚａｒｇｈａｍｉら、「肺腫瘍における前立腺特異抗原ｍＲＮＡの発現頻度（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｍＲＮＡ ｉｎ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒｓ）」、１９９７、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １０８（２）：１８４−９０。Ｓｍｉｔｈら、「前立腺特異抗原のメッセンジャーＲＮＡは非前立腺細胞中に発現される：微小転移巣の検出との関係（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｎｏｎ−ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）」、１９９５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１２）：２６４０−４４。

ヒト前立腺特異抗原に対する遺伝子は、１９８９年に配列が決定された。Ｄｉｇｂｙら、「ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の遺伝子：構造及びカリクレイン様遺伝子との連鎖（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）ｇｅｎｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｔｏ ｋａｌｌｉｆｒｅｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ）」、１９８９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７（５）：２１３７。Ｋｌｏｂｅｃｋら、「ヒト前立腺特異抗原のゲノム配列（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）」、１９８９ ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７（１０）：３９８１。

ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ）ＰＳＡは、Ｇｅｎｅｂａｎｋにおいて記録されている。一配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８３に列挙されている。別の配列は、１９８８年に公表され、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｘ０７７３０として寄託された（Ｓｃｈｕｌｚら、「完全な成熟ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を包含するｃＤＮＡの配列及び非スプライシングリーダー配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍａｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）ａｎｄ ａｎ ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」。１９９８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（１３）：６２２６）。更に別のヒトｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＢＣ０５６６６５として列挙されている。

非ヒト霊長類（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ）カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）の前立腺特異抗原前駆体ｃＤＮＡのｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＡＹ６４７９７６として公表されている。

その上、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）前立腺特異抗原のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｘ７３５６０として公表されている。

前出３遺伝子の比較によって、ヒトＰＳＡと、アカゲザル又はカニクイザルのＰＳＡ ｃＤＮＡとの間に３０塩基対の差異のあることが示されている。この差異は３．８％である。生成アミノ酸の差異は、ヒトＰＳＡと比較してアカゲザルＰＳＡで９．９％であり、ヒトと比較してカニクイザルＰＳＡで１０．７％である。

添付した３ページのＤＮＡ配列の比較（図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ）から、ヒトＰＳＡのｃＤＮＡ遺伝子配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＢＣ０５６６６５のｃＤＮＡ）、Ｍａｃｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ ＰＳＡのｃＤＮＡ遺伝子配列、及びＭａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ ＰＳＡのｃＤＮＡ遺伝子配列の間の相同性が示されている。

前記で考察した科学文献は別として、公開及び交付された特許を検討すると、関連する以下の特許及び公開特許出願が明らかとなる。

米国公開出願第２００４０１４１９５８号は、治療用ワクチン接種の新規な方法を開示し、ＣＴＬエピトープを表示する外来ペプチドとの自己ペプチド又はタンパク質の使用を考察している。これはキメラタンパク質であろう。この出願は、ナイーブタンパク質に対する交差反応免疫を誘発するために、外来タンパク質全体の使用を扱っていない。

米国特許第５９２５３６２号は、ヒト前立腺特異抗原により抗腫瘍応答を引き出す方法を開示している。この特許は、２部構成を必要とする前立腺癌ワクチンについて記載している。一方はヒトＰＳＡであり、他方は、その場でヒトＰＳＡを産生する発現系である。これはヒトＰＳＡを発現するＤＮＡワクチンである。この特許は、異種ＰＳＡのＤＮＡワクチンの使用については記載していない。

米国特許第６１６５４６０号は、ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する免疫応答の生成を開示している。この特許は、ＰＳＡのＤＮＡワクチンについて記載している。１クレームでは、ＰＳＡを発現するために使用するポックスウィルスベクターが記載されている。この特許は、ヒトＰＳＡを明示しておらず、異種ＰＳＡの記載がない。別のクレームでは、ＰＳＡ（又はＰＳＡ ＣＴＬエピトープ）の使用に続く、追加ＰＳＡの第２投与が教示されている。これは、異なるＰＳＡ発現ベクター又はＰＳＡタンパク質自体による追加免疫を含めた、従来型のワクチン追加免疫戦略である。第３のクレームでは、ＣＴＬエピトープ単独の使用が記載されている。ワクチンの評価に使用した動物モデルは、ヒトＰＳＡを用いるアカゲザルモデルであったが、人間においてアカゲザルＰＳＡを使用するという正反対の手法に関する記載はない。

米国特許第６８１８７５１号、第６８００７４６号、第６７５９５１５号、第６６６４３７７号、第６６５７０５６号、第６６３０３０５号、第６６２０９２２号、第６６１３８７２号、第６３２９５０５号、第６２６２２４５号、第６２６１５６２号、第６８５４２０６号のすべては、前立腺癌の診断、前立腺特異ペプチドに対するモノクローナル抗体の生成、及び前立腺癌の免疫療法を目的とした、該前立腺特異ペプチドの使用を記載している。こうした特許は、免疫原として異種ＰＳＡの使用を論じていない。

米国特許第６６９９４８３号は、前立腺癌ワクチンにおいてヒト前立腺癌３細胞系の使用を採用した癌治療を開示している。該細胞系は、人間由来であり、広範囲の抗原を表示する。この特許は、異種細胞系、異種ＰＳＡの使用、又はＤＮＡワクチンの使用を記載していない。

前記考察から、ワクチンに関して、異種手法を含めた非常に多様な手法が、科学文献において検討されてきた。

本発明のために、関連する要点の概要を見直す。

非ヒト抗原を人間の中に導入すると、ヒト免疫応答が非ヒト抗原に対する抗体を産生することは知られている。

ある種の限定された特定例では、特定例の非ヒト抗原を人間の中に導入すると、ヒト免疫応答が特定例の類似ヒト抗原に対する抗体を産生すると考えられている。

前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を有するのは、霊長類だけである。人間はヒトＰＳＡを有し、非ヒト霊長類は非ヒト霊長類ＰＳＡを有する。マウス、イヌなどの種は、カリクレインタンパク質であるセリンプロテアーゼを有するが、そうしたものは、ＰＳＡとは見なせないほど十分にＰＳＡとは異なっている。

非ヒト霊長類には、とりわけアカゲザル及びチンパンジーが含まれる。

ヒトＰＳＡは、アミノ酸約２６０個の配列を有する（図２、セクション「ｈｕＰＳＡ」を参照されたい）。アカゲザルＰＳＡは、アミノ酸約２６０個の配列を有する（図２、セクション「ｒｈＰＳＡ」を参照されたい）。アカゲザルＰＳＡのアミノ酸配列中のアミノ酸約１０％は、ヒトＰＳＡのアミノ酸配列中のアミノ酸と異なる。

ヒトＰＳＡとアカゲザルＰＳＡなどの異種ＰＳＡとの間には類似性かあるが、ヒトＰＳＡとアカゲザルＰＳＡとの差異は、ヒトＰＳＡを検出する臨床検査では、アカゲザルＰＳＡなどの異種ＰＳＡが検出されそうにないほどの有意差である。

人間の前立腺癌に特に注目すると、ヒト前立腺癌の治療には前立腺全体の外科的除去が必要である。更に前立腺癌を治療するには、外科的除去を免れた前立腺細胞を死滅させることが試される。この点から、抗前立腺ワクチンは、外科的除去を免れた前立腺細胞すべてを死滅させるように設計すべきである。

ヒト前立腺細胞はヒトＰＳＡを産生し、ヒト前立腺癌に対するワクチンは、ヒトＰＳＡを産生するヒト細胞を死滅させるヒト免疫応答を誘発すべきである。このようにして、外科手術を免れた前立腺細胞は、ヒト前立腺癌に対するワクチンによるワクチン接種の結果、死滅することになろう。

従来技術から見て、使用する異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない異種抗原を、その人に使用することが望ましかろうということは、本発明を生んだ本発明者等の一洞察である。

本発明を生んだ本発明者等の別の洞察は、使用する非ヒト霊長類異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種抗原を、その人に使用することが望ましかろうということである。

本発明を生んだ本発明者等のより特定の洞察は、使用する非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原に関して、ある人における生来の自己ＰＳＡ抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原とそのヒト自己ＰＳＡ抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原を、その人に使用することが望ましかろうということである。

本発明を生んだ本発明者等の更により特定の洞察は、ヒトＰＳＡに対してアミノ酸相同性が≧８８％で≦９８％（又は、２〜１２％の差）である非ヒトＰＳＡを用いて、人間におけるヒトＰＳＡに対し免疫応答を誘発する方法を提供することが、望ましかろうということである。

より具体的には、主題の方法は、非ヒト霊長類から単離したＰＳＡを得ること、及び該非ヒト霊長類ＰＳＡを分子的に変化させて、そのアミノ酸相同性をヒトＰＳＡに対して最適な相同性均衡に調節することを包含する。より具体的には、非ヒト霊長類ＰＳＡのアミノ酸配列が、人間において非ヒト霊長類ＰＳＡに対する免疫応答を誘発するのに十分なだけヒトＰＳＡのアミノ酸配列と異なるが、人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を生じるのに十分なだけ類似している相同性を有するように、最適な相同性均衡を取ることが好ましい。

本発明は、ＤＮＡ配列の発現により、ヒトＰＳＡとの相同性が８８％〜９８％のアミノ酸配列を有するタンパク質が産生される前記ＤＮＡ配列も包含する。本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡワクチンなどのポリヌクレオチドワクチンにおける、該ＤＮＡ配列の使用も包含する。

人工作製ＰＳＡではなく非ヒト霊長類ＰＳＡを使用する論理は、セリンプロテアーゼ活性を維持するタンパク質の自然選択における変化すべてによって、類似の立体配座を有するタンパク質が選択されることである。これは、該タンパク質の立体配座依存性の領域に対する免疫応答は、ヒトＰＳＡ及び霊長類異種ＰＳＡとの間で類似又は同一である可能性がそれだけ高いことを意味する。

本発明によれば、ワクチンの送達は、例えば、トランスフェクションの化学促進剤を用いる、若しくは用いない注入、微粒子銃、又は電気穿孔を含めた多様な方法によりなし得る。

したがって、前記一団の従来技術が、非ヒト動物モデルにおいていくつかの免疫応答を引き出すために異種抗原を使用することは、周知であることを示しているが、前記従来技術は、所望の特徴を以下の通り組み合わせた、対前立腺癌ワクチンに関する方法及び組成物を教示することも、示唆することもない。即ち、（１）外科的除去を免れた前立腺細胞を死滅させるように設計されている抗前立腺ワクチンは、（２）ヒトＰＳＡを産生するヒト細胞を死滅させるヒト免疫応答を誘発し、（３）ホルモン療法に限定されることがなく、（４）使用する異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない異種抗原を、その人に使用し、（５）使用する非ヒト霊長類異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種抗原を、その人に使用し、（６）使用する非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原に関して、ある人における生来の自己ＰＳＡ抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原とそのヒト自己ＰＳＡ抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原を、その人に使用する。前記所望の特性は、以下のその説明から明らかにされるように、本発明の対前立腺癌ワクチンに関する独特の方法及び組成物によって提供される。従来技術に対する本発明の他の利点も、明白にされよう。

本発明の目的は、外科的除去を免れた前立腺細胞のすべてを死滅させるように設計されている、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、ヒトＰＳＡを産生するヒト細胞を死滅させるヒト免疫応答を誘発する、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、ホルモン療法に限定されない、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、使用する異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない異種抗原を、その人に使用する、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することである。

本発明のなお更なる目的は、使用する非ヒト霊長類異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種抗原を、その人に使用する、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することである。

本発明の更に別の目的は、使用する非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原に関して、ある人における生来の自己ＰＳＡ抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原とそのヒト自己ＰＳＡ抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原を、その人に使用する、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することである。

本発明の一態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とを含む物質組成物が提供される。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とで構成されるワクチンが、人間のために提供される。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡが、ヒトＰＳＡに対して抗体を産生するヒト免疫応答を誘発するワクチンが提供される。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類ＰＳＡの使用が提供される。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡを含有するヒト細胞に対して、ヒトＰＳＡ免疫応答が細胞傷害性細胞性免疫を起こすワクチンが提供される。

本発明の別の態様に従えば、人間を治療する方法が、ある人に非ヒト霊長類ＰＳＡを入れるために、その人に非ヒト霊長類ＤＮＡ配列を導入するステップを含む。

本発明の別の態様に従えば、人間において抗原に対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製する該抗原を用意するために、非ヒト霊長類ＤＮＡ配列の使用が提供される。本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、ＰＳＡに対する非ヒト霊長類ＤＮＡ配列の使用が提供される。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する抗体を産生するヒト免疫応答を誘発するために、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含む、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含み、ヒト免疫応答がヒトＰＳＡに対する抗体の産生を起こす、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡを含有する細胞に対する細胞傷害性細胞性免疫を含む免疫応答を誘発するために、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含む、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含み、ヒト免疫応答が、ヒトＰＳＡを含有する細胞に対して細胞傷害性細胞性免疫を起こす、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類抗原を発現する核酸ワクチンをヒト細胞中に送達する方法であって、核酸ワクチンのある量をヒト組織に投与するステップ、及び電界を該ヒト組織に印加するステップを含み、それにより、非ヒト霊長類抗原を発現する該核酸ワクチンが、該ヒト組織における細胞中に送達される方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する核酸ワクチンをヒト細胞中に送達する方法であって、核酸ワクチンのある量をヒト組織に投与するステップ、及び電界を該ヒト組織に印加するステップを含み、それにより、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する該核酸ワクチンが、該ヒト組織における細胞中に送達される方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列を含む、人間のためのＤＮＡワクチンが提供される。

本発明の別の態様に従えば、人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法であって、人に非ヒトＰＳＡを導入するステップを含み、該非ヒトＰＳＡが、ヒトＰＳＡと８８％以上で９８％以下の範囲にあるアミノ酸相同性を備える方法が提供される。

本発明の別の態様に従えば、人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法であって、非ヒトＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列を人に導入するステップを含む方法が提供される。該非ヒトＰＳＡ遺伝子配列は、人において非ヒトＰＳＡとして発現される。導入される該非ヒト遺伝子配列は、ヒトＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列と塩基対相同性を備え、その相同性は、８８％以上で９８％以下の範囲にある。好ましくは、請求項１８に記載の方法。該相同性は、９２％以上で９９％以下の範囲にある。

本発明の別の態様に従えば、ヒト抗原に対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類抗原を発現するベクターの使用が提供される。一観点では、該ベクターはＤＮＡベクターであってもよい。別の観点では、該ベクターはＲＮＡベクターであってもよい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するための、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現するベクターの使用が提供される。一観点では、該ベクターはＤＮＡベクターであってもよい。別の観点では、該ベクターはＲＮＡベクターであってもよい。

これらの事項は、本発明の更に他の目的と一緒に、本発明を特徴付ける、新規性に関する多様な特徴と共に、本開示に添付され、その一部を形成する特許請求の範囲に特に指摘されている。本発明、その操作上の利点、及びその使用で実現される特定の目的に関する理解を深めるために、添付の図面、及び本発明の好ましい実施形態が例示されている記載事項を参照すべきである。

本発明の以下の詳細な説明の調査を済ませば、本発明の理解が深まり、前記目的並びに前記以外の目的がより明白となろう。このような説明では、添付してある以下の図面を参照している。

使用する異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない異種抗原を、その人に使用する方法及び装置が提供される。

関連する種間差は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び２に図示されている。

本発明の一態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とを含む物質組成物が提供される。以下の実施例１を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とを備える、人間のためのワクチンが提供される。以下の実施例１を参照されたい。

（実施例１）
ここでは、組換え非ヒト霊長類ＰＳＡを含有するワクチン製剤を作製する、各ステップの説明がなされている。

組換え非ヒト霊長類ＰＳＡを含有するワクチン製剤は、ワクチン用の標準的アジュバントを用いて製剤することができる。一製剤は、抗原（組換えアカゲザルＰＳＡ）９０ｍｇ、０．７ｍｇ／ｍｌのアルミニウム、及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含有することができる。この製剤は、以下の方法によって作製することができる。

まず、３種の溶液を作製する。

第１に、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹの製品）を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に希釈し、最終アルミニウム濃度を２．１％とすることにより、２．１ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム混合物を作製する。後者の混合物中に使用されるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの容量は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ付随の挿入書きを参照することにより決定される。

第２に、組換えアカゲザルＰＳＡを１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液中で最終濃度２７０ｍｇ／ｍｌに希釈する。

第３に、３％塩化ナトリウム水溶液（４２０ｍＭ）を調製する。

第１溶液及び第２溶液（ａｈｙｄｒｏｇｅｌ溶液及び組換えアカゲザルＰＳＡ溶液）を等容量（例えば、各１ｍｌ）で混合する。その混合物を徹底的に反転させながら４℃、３０分間静かに混合する。

最後に、混合物中のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（例えば、各１ｍｌ）の容量に等しい容量の塩化ナトリウムを添加することにより、ワクチン混合物を希釈し、塩化ナトリウム濃度を１４０ｍＭにする。このように作製して得た最終ワクチン混合物は、非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とを含む物質組成物を提供する。

実施例１で用いる組換えアカゲザルＰＳＡの産生は、昆虫細胞中に組換えアカゲザルＰＳＡタンパク質を発現させることにより、実現される。手短に言うと、ｒｈＰＳＡ遺伝子配列を、ｈｉｓタグ及びプロテアーゼシグナル切断部位のための配列と一緒にした融合遺伝子として、バキュロウィルス中にクローニングする。組換えｒｈＰＳＡタンパク質は、転写及び翻訳により産生される。

製剤中で用いる組換えｒｈＰＳＡタンパク質は、バキュロウィルス感染昆虫細胞の溶解物からアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製後、ｈｉｓタグをプロテアーゼで切断し、サイズ排除クロマトグラフィーを経て、逐次透析によるリフォールディングを行う。逐次透析は、尿素濃度を減少させながら緩衝液中で実施することができる。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡが、ヒトＰＳＡに対する抗体を産生するヒト免疫応答を誘発するワクチンが提供される。上記の実施例１を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類ＰＳＡの使用が提供される。上記の実施例１を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡを含有するヒト細胞に対して、ヒト免疫応答が細胞傷害性細胞性免疫を起こすワクチンが提供される。上記の実施例１を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、人間を治療する方法には、非ヒト霊長類ＤＮＡ配列を含有するベクターをある人に導入し、その人において非ヒト霊長類ＰＳＡを発現させるステップが含まれる。該ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターでもよい。ベクターの例は、哺乳類発現用のプラスミド、ウィルスＲＮＡ若しくはＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、又は、哺乳類細胞中に導入すると、非ヒト霊長類ＰＳＡの発現を起こす他の核酸構築体である。下記の実施例２を参照されたい。

（実施例２）
一方法では、ＣＭＶプロモーターの制御下で非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する、プラスミドを含有するＤＮＡワクチンが調製される。該プラスミドは、細菌性複製起点及びカナマイシン抵抗性遺伝子などの抗生物質抵抗性遺伝子のような、プラスミドの産生に必須の他のＤＮＡ配列を含有する。該プラスミドは、半強度リン酸緩衝塩水などの適切な担体中、０．５〜５μｇ／μｌの濃度で混合される。投与には、半インチの２７ゲージ針を付けたツベルクリン型シリンジ中に該プラスミド混合物を装入する。該プラスミド混合物２０〜５０μｌを三角筋上の皮膚中又は前腕上に皮内注入する。

次いで、平行２列の針付き電極（直径０．３ｍｍの針、列間距離４ｍｍ、１列中の針間距離１ｍｍ、１列中針４本、及び針長さ３ｍｍ）を、注入部位の各側に１列の針を置いて皮膚中深さ２〜３ｍｍまで挿入する。次いで、電気穿孔パルスを挿入電極に印加する。パルスの１手順は、１１２５Ｖ／ｃｍを２パルス、持続時間５０マイクロ秒、及びパルス間隔０．１２５秒、続いて０．５秒後に、２７５Ｖ／ｃｍを８パルス、持続時間１０ミリ秒、及びパルス間隔０．１２５秒からなる。

本発明の別の態様に従えば、人間における抗原に対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類ＤＮＡ配列を含有するベクターの使用が提供される。上記の実施例２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類ＤＮＡ配列を含有するベクターの使用が提供される。上記の実施例２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する抗体を産生するヒト免疫応答を誘発するために、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含む、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。非ヒト霊長類ＰＳＡ、及び非ヒトＰＳＡを発現するベクターについては、上記の実施例１及び２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡ、又は非ヒトＰＳＡを発現するベクターを人に導入するステップを含み、ヒト免疫応答がヒトＰＳＡに対する抗体の産生を起こす、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。非ヒト霊長類ＰＳＡ、及び非ヒトＰＳＡを発現するベクターについては、上記の実施例１及び２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡを含有する細胞に対する細胞傷害性細胞性免疫を含む免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類ＰＳＡ、又は非ヒトＰＳＡを発現するベクターを人に導入するステップを含む、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。非ヒト霊長類ＰＳＡ、及び非ヒトＰＳＡを発現するベクターについては、上記の実施例１及び２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡ、又は非ヒトＰＳＡを発現するベクターを人に導入するステップを含み、ヒト免疫応答が、ヒトＰＳＡを含有する細胞に対して細胞傷害性細胞性免疫を起こす、人間において前立腺癌を治療する方法が提供される。非ヒト霊長類ＰＳＡ、及び非ヒトＰＳＡを発現するベクターについては、上記の実施例１及び２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、非ヒトＰＳＡを発現する核酸ワクチンをヒト細胞中に送達する方法であって、核酸ワクチンのある量をヒト組織に投与するステップ、及び電界を該ヒト組織に印加するステップを含み、それにより、非ヒト霊長類抗原を発現する該核酸ワクチンが、該ヒト組織における細胞中に送達される方法が提供される。上記の実施例２、及び下記の実施例３を参照されたい。

（実施例３）
電界の印加は、電気穿孔法を行うことによって使用することができる。適切な電気穿孔法は、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６０１０６１３号、第６６０３９９８号及び第６７１３２９１号に開示されている。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する核酸ワクチンをヒト細胞中に送達する方法であって、核酸ワクチンのある量をヒト組織に投与するステップ、及び電界を該ヒト組織に印加するステップを含み、それにより、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する該核酸ワクチンが、該ヒト組織における細胞中に送達される方法が提供される。上記の実施例２及び３を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、非ヒト霊長類ＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列を含む、人間のためのＤＮＡワクチンが提供される。

本発明の別の態様に従えば、人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法であって、人に非ヒトＰＳＡを導入するステップを含み、該非ヒトＰＳＡが、ヒトＰＳＡと８８％以上で９８％以下の範囲にあるアミノ酸相同性を備える方法が提供される。非ヒトＰＳＡについては、上記の実施例１を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法であって、非ヒトＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列を人に導入するステップを含む方法が提供される。該非ヒトＰＳＡ遺伝子配列は、人において非ヒトＰＳＡとして発現される。導入される該非ヒト遺伝子配列は、ヒトＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列と塩基対相同性を備え、その相同性は、８８％以上で９８％以下の範囲にある。好ましくは、該相同性は、９２％以上で９９％以下の範囲にある。上記の実施例２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒト抗原に対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類抗原を発現するベクターの使用が提供される。一観点では、該ベクターはＤＮＡベクターであってもよい。別の観点では、該ベクターはＲＮＡベクターであってもよい。上記の実施例２を参照されたい。

本発明の別の態様に従えば、ヒトＰＳＡに対する免疫応答を得ることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するための、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現するベクターの使用が提供される。一観点では、該ベクターはＤＮＡベクターであってもよい。別の観点では、該ベクターはＲＮＡベクターであってもよい。上記の実施例２を参照されたい。

ヒトＰＳＡを産生するヒト細胞を攻撃することを目的とした、ヒト免疫系の刺激における非ヒト霊長類ＰＳＡ（例えば、アカゲザルＰＳＡ）の有用性は、図３及び４に例示した証拠により証明されている。

図４は、ｐＶＡＸ／ｒｈＰＳＡをトランスフェクトした単球由来のヒト樹状細胞による刺激に対するヒトＴ細胞の応答を示す。未成熟ヒト単球性樹状細胞は、ヒト単球のサイトカインにおける増殖により調製した。ヒト単球由来樹状細胞に、ｐＶＡＸ／ｒｈＰＳＡをトランスフェクトした。該細胞は、ポリＩ：Ｃを含む培地中でのインキュベーションにより成熟した。成熟後、該細胞を用いて、インビトロ免疫において自家性ヒトＴ細胞を刺激した。再刺激２回の後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてヒトＰＳＡ特異性を評価した。特異的Ｔ細胞は、対照のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて刺激したＴ細胞と比較した。その応答は、アカゲザルＰＳＡ形質導入ヒト樹状細胞で刺激された細胞における、ヒトＰＳＡ特異的Ｔ細胞の応答を示す。このことは、インビトロ免疫において、アカゲザルＰＳＡで刺激されたヒトＴ細胞は、ヒトＰＳＡを含有するヒト細胞を攻撃することを示唆するように応答することを示している。

ヒト樹状細胞の前記トランスフェクションについては、トランスフェクトされた細胞がアカゲザルＰＳＡを実際に発現していることを実証するために、ウェスタンブロットを行った。より具体的には、図３は、ｐＶＡＸ／ｒｈＰＳＡ（アカゲザルＰＳＡを発現するプラスミド）及び対照プラスミド（ｐＶＡＸ）をトランスフェクトした、ヒト樹状細胞におけるアカゲザルＰＳＡの発現を示す。ウェスタンブロットから、アカゲザルＰＳＡに対して予想される３０キロダルトンのタンパク質の発現が示される。その発現のために、ｐＶＡＸ／ｒｈＰＳＡ及び対照プラスミドを、電気穿孔によって未成熟ヒト樹状細胞中に形質導入した。細胞を２４時間後にウェスタンブロットで分析し、アカゲザルＰＳＡを３０キロダルトンのバンドとして検出した。

本発明の使用法及び操作法に関しては、前記開示から明白であり、したがって、使用法及び操作法に関する考察は、これ以上述べる必要はない。

前立腺の外科的除去を免れた人の前立腺細胞を死滅させるために有利に使用し得る、対前立腺癌ワクチンに関する新規で改良された方法及び組成物を提供することにより、本発明が上記の目的すべてを実現することは、前記から明白である。本発明を用いれば、ヒトＰＳＡを産生するヒト細胞の死滅を生じるヒト免疫応答を誘発させる、対前立腺癌ワクチンに関する方法及び組成物が提供される。本発明を用いれば、ホルモン療法に限定されない、対前立腺癌ワクチンに関する方法及び組成物が提供される。本発明を用いれば、使用する異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない異種抗原を、その人に使用する、対前立腺癌ワクチンに関する方法及び組成物が提供される。本発明を用いれば、使用する非ヒト霊長類異種抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種抗原とそのヒト自己抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種抗原を、その人に使用する、対前立腺癌ワクチンに関する方法及び組成物が提供される。本発明を用いれば、使用する非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原（例えば、タンパク質）に関して、ある人における生来の自己ＰＳＡ抗原に対し最適な免疫応答を誘発するために、非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原とそのヒト自己ＰＳＡ抗原との間に種間差が相対的に少ない非ヒト霊長類異種ＰＳＡ抗原を、その人に使用する、対前立腺癌ワクチンに関する方法及び組成物が提供される。

したがって、現状の判断から本発明のうちで最も実用的で好ましい実施形態（複数も）に関して特に且つ詳細に、本発明を図面で示し、十分に前記してきたが、サイズ、材料、形状、形態、機能及び操作法、組立て並びに使用における変更を含むが、それだけに限らないその多くの改変が、本明細書に示した原理及び概念から逸脱せずになし得ることは、当業者であれば明白であろう。
（参考文献）

ヒトＰＳＡのｃＤＮＡ、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の非ヒト霊長類ＰＳＡのｃＤＮＡ、及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）の非ヒト霊長類ＰＳＡのｃＤＮＡ間における、従来技術由来のｃＤＮＡの比較を示す図である。 ヒトＰＳＡのｃＤＮＡ、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の非ヒト霊長類ＰＳＡのｃＤＮＡ、及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）の非ヒト霊長類ＰＳＡのｃＤＮＡ間における、従来技術由来のｃＤＮＡの比較を示す図である。 ヒトＰＳＡのｃＤＮＡ、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の非ヒト霊長類ＰＳＡのｃＤＮＡ、及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）の非ヒト霊長類ＰＳＡのｃＤＮＡ間における、従来技術由来のｃＤＮＡの比較を示す図である。 ヒトＰＳＡが、アミノ酸２６１個の配列を備え（第１セクション「ｈｕＰＳＡ」中）、アカゲザルＰＳＡが、アミノ酸２６１個の配列を備える（第１セクション「ｒｈＰＳＡ」中）ことを示す図である。図２は、ヒトＰＳＡのＤＮＡ配列が、ヌクレオチド７８６個の配列を備え（第２セクション「ｈｕＰＳＡ」中にあって、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｘ７３５６０）、アカゲザルＰＳＡのＤＮＡ配列が、７８６個の配列を備える（第２セクション「ｒｈＰＳＡ」中にあって、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｘ０７７３０）ことも示す。 ｐＶＡＸ／ｒｈＰＳＡ（アカゲザルＰＳＡを発現するプラスミド）及び対照プラスミド（ｐＶＡＸ）を形質移入したヒト樹状細胞における、アカゲザルＰＳＡの発現を示す図である。 ｐＶＡＸ／ｒｈＰＳＡをトランスフェクトした単球由来のヒト樹状細胞による刺激に対する、ヒトＴ細胞の応答を示す図である。

Claims (25)

1. 非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とを含む物質組成物。
2. 非ヒト霊長類ＰＳＡと、人間に投与するための医薬として許容可能な担体とを含む、人間のためのワクチンである、請求項１に記載の物質組成物。
3. 前記物質組成物がワクチンであり、非ヒト霊長類ＰＳＡが、ヒトＰＳＡに対して抗体を産生するヒト免疫応答を誘発する、請求項１に記載の物質組成物。
4. 前記物質組成物がワクチンであり、ヒト免疫応答が、ヒトＰＳＡに対する抗体の産生を生じる、請求項１に記載の物質組成物。
5. 前記物質組成物がワクチンであり、ヒト免疫応答が、ヒトＰＳＡを含有するヒト細胞に対して、細胞傷害性細胞性免疫を生じる、請求項１に記載の物質組成物。
6. ヒトＰＳＡに対する免疫応答を与えることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するための、非ヒト霊長類ＰＳＡの使用。
7. 人間において抗原に対する免疫応答を与えることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するための、抗原に対する非ヒト霊長類ＤＮＡ配列の使用。
8. ヒトＰＳＡに対する免疫応答を与えることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するための、ＰＳＡに対する非ヒト霊長類ＤＮＡ配列の使用。
9. 人に非ヒト霊長類ＰＳＡを供与するために、前記人に非ヒト霊長類ＤＮＡ配列を導入するステップを含む、人間を治療する方法。
10. ヒト免疫応答を誘発するために、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含む、人間において前立腺癌を治療する方法。
11. 人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含み、ヒト免疫応答が、ヒトＰＳＡに対する抗体の産生を生じる、人間において前立腺癌を治療する請求項１０に記載の方法。
12. ヒトＰＳＡを含有する細胞に対する細胞傷害性細胞性免疫を含む、免疫応答を誘発するために、人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含む、人間において前立腺癌を治療する請求項１０に記載の方法。
13. 人に非ヒト霊長類ＰＳＡを導入するステップを含み、ヒト免疫応答が、ヒトＰＳＡを含有する細胞に対して、細胞傷害性細胞性免疫を生じる、人間において前立腺癌を治療する請求項１０に記載の方法。
14. 非ヒト霊長類抗原を発現する核酸ワクチンをヒト細胞中に送達する方法であって、
    核酸ワクチンのある量をヒト組織に投与するステップ、及び
    電界をヒト組織に印加するステップ、
    を含み、それにより、非ヒト霊長類抗原を発現する核酸ワクチンが、ヒト組織における細胞中に送達される方法。
15. 非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する核酸ワクチンをヒト細胞中に送達する方法であって、
    核酸ワクチンのある量をヒト組織に投与するステップ、及び
    電界をヒト組織に印加するステップ、
    を含み、それにより、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現する核酸ワクチンが、ヒト組織における細胞中に送達される方法。
16. 非ヒト霊長類ＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列を含む、人間のためのＤＮＡワクチン。
17. 人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法であって、人に非ヒトＰＳＡを導入するステップを含み、非ヒトＰＳＡが、ヒトＰＳＡと８８％以上で９８％以下の範囲にあるアミノ酸相同性を備える方法。
18. 人間においてヒトＰＳＡに対する免疫応答を誘発する方法であって、非ヒトＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列を人に導入するステップを含み、前記非ヒトＰＳＡ遺伝子配列は、人において非ヒトＰＳＡとして発現され、導入される前記非ヒト遺伝子配列は、ヒトＰＳＡの遺伝子由来の遺伝子配列と塩基対相同性を備え、前記相同性は、８８％以上で９８％以下の範囲にある方法。
19. 相同性が、９２％以上で９９％以下の範囲にある、請求項１８に記載の方法。
20. ヒト抗原に対する免疫応答を与えることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類抗原を発現するベクターの使用。
21. 前記ベクターがＤＮＡベクターである、請求項２０に記載のベクターの使用。
22. 前記ベクターがＲＮＡベクターである、請求項２０に記載のベクターの使用。
23. ヒトＰＳＡに対する免疫応答を与えることを目的として、人間に投与するワクチンを調製するために、非ヒト霊長類ＰＳＡを発現するベクターの使用。
24. 前記ベクターがＤＮＡベクターである、請求項２３に記載のベクターの使用。
25. 前記ベクターがＲＮＡベクターである、請求項２３に記載のベクターの使用。

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