JPH06510903A - 自己免疫疾患の診断および治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫疾患の診断および治療 置型の背景 本発明はタイプ■糖尿病のような自己免疫疾患の試験および治療に関する。本発 明は、本発明者がタイプ■糖尿病と主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１分 子（別名は本明細書中で呼ぶＨＬＡクラス１分子）との関連を見いだしたことに よりなされた。

Ｔ−リンパ球は、ＨＬＡの結合溝中で自己タンパク質と外来タンパク質をｍ１１ し、ＨＬＡに支配される免疫応答を生じる。ＨＬＡクラスＩが結合したペプチド は、ＣＤＢ＋サプレッサーもしくは細胞障害性Ｔ−細胞により認識されるが、Ｈ ＬＡクラスＨに結合したペプチドはＣＤｄ＋ヘルパーＴ−細胞に認識される。細 胞外コンパートメント中のペプチドは、エンドサイト−シスにより抗原提示細胞 に取り込まれ、次いでＨＬＡクラス■複合体と一緒になったペプチドとして提示 される。対照的に、内部で合成された抗原（おそらく「自己ペプチド」として合 成される）は、小胞体中に輸送され、そこで優先的にＨＬＡクラス■に結合する 。ＨＬＡクラスＩの発現は通常全ての細胞に普遍的に存在する。最近、一連の実 験により、原形質タンパク質を小胞体に輸送する過程に関与する経膜輸送遺伝子 （ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅｓ）が突き 止められ、マツピング研究により、クロモシームにおけるそれらの遺伝子の存在 部位はＨＬＡクラス■領域であることが判明した。これらのペプチド供給因子遺 伝子（ＡＴＰ依存依存性輸送タンパク−コード遺伝子ても知られティる）、特ｉ 、：ＲＩＮＧ　４．ｌＩＡＭｌ、　Ｍｔｐｌ、　ＨＡＭ２．　Ｍｔｐ２゜および Ｙ３は、多剤耐性ファミリーの輸送因子のメンバーであり、種間で高度に保存さ れている。それらの同定は、内在性のペプチド輸送遺伝子内の削除により、表面 ＨＬＡクラスＩを欠失させた（即ち、ＨＬＡクラスＩを提示しない）誘導変異細 胞ラインのシリーズにより可能であった。

タイプ■糖尿病は、ランゲルハンス氏島内のベータ細胞がＴ−細胞の介在によす 破壊され、種々の自己ペプチドに対する免疫応答を伴うことを特徴とする自己免 疫疾患である。自已叉応性のメカニズム、および既に突き止められていたこの病 気とＨＬＡクラス■遺伝子との関連、に関して種々の提案がなされている。

タイプＩ糖尿病の危険をもつヒトの同定は、高血糖症に何年も先立って、異常な 自己抗体か、インシュリン、島細胞、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、並びに 他の多くの自己タンパク質に対して出現することにより可能である。自己抗体の パターンは、最終的な病気への移行および／または危険性を予知する。「前糖尿 病」並びに一致しないタイプＩ糖尿病の一卵性双生児についての最近の分析は、 自己抗原の異常な自己提示に支配されたＴ−細胞の発生上の欠陥を明らかにし、 これは病気の進行を予測するものであった。

發墾Ｑ橿栗 本発明者は、ヒトおよびマウスにおけるタイプＩ糖尿病および他の自己免疫疾患 は抗原提示の異常を伴うＨＬＡクラス■分子の誤った発現を伴うことを見いだし た。糖尿病のＴ−細胞は自己抗原に対してあたかも外来抗原であるかのごとく応 答し、欠陥的自己寛容の発生を介在する。本発明者は、この欠陥はベータ細胞の 自己免疫に存在すると提唱する（マウスにおいてベータミクログロブリン遺伝子 を削除してＨＬＡクラスＩ発現を阻止すると、リンパ球介在インシュリン炎のた めに高血糖症をひきおこすとしてもである）。本発明者の証拠によると、ヒトタ イプＩ糖尿病におけるＨＬＡクラスＩの異常に低い発現は、クラス１分子との複 合体形成により細胞表面上にタンパク質またはそのペプチドフラグメントを提示 することに関与する一つもしくはそれ以上のタンパク質の変異遺伝子のためであ る。自己免疫疾患患者が寛容を誘導するために自己抗原を適切に提示しえないこ の異常は、例えば、−もしくはそれ以上のペプチド輸送遺伝子中のクラスＩ遺伝 子の変異−または自己タンパク質を細胞表面に輸送して複合体を形成させてＨＬ Ａクラス■とともに提示するために、該自己タンパク質を切断（「プロセシング 」）する役割をもつプロテオシームの−もしくはそれ以上の遺伝子中の、クラス Ｉ遺伝子の変異による可能性がある。

この発見は異常なＨＬＡクラスＩ提示にもとづいた、自己免疫疾患の新規診断法 の基礎を提供し、さらに、任意のタンパク質抗原に対する寛容を誘導する新規方 法を提供し、これらの方法は全て該抗原をＨＬＡクラスＩに結合した抗原を投与 することを基本とする。

従って、本発明は第一の観点において、＠Ｕ、例えばヒト患者を・自己免疫疾患 をひきおこす素因について試験する方法を提供し、該方法は該哺乳類の細胞、例 えばＢリンパ球上に提示されたＨＬＡクラスＩを測定して、発現レベルの低下を そのような素因の指標とすることからなる。自己免疫疾患は、好ましくはタイプ Ｉ糖尿病であるが、しかし全身性紅斑性狼蒼（ＳＬＥ）、関節リウマチ、グレー プズ病、上皮小体機能低下症、甲状腺機能低下症、多発性硬化症、アジ・ノン病 、小児脂肪便症（Ｃｅｌｉａｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）、シツカ°シンドローム（Ｓ ｉｃｃａ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アジソンズ重症筋無力症、特発性マントレニア ス腎症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　ｍａｎｔｒａｎｅｏｕｓ　ｎｅｐｈｒｏｐａｔ ｈｙＬ視神経炎、グッドパスチャーズ・シンドローム、天庖癒、橋本甲状腺炎、 悪性貧血、または強直性を椎炎であってもよい。

関連する観点において、本発明は哺乳類が自己免疫疾患を生じる素因を調べる方 法を提供し、該方法は最初に該哺乳類から生物学的サンプルを得、次いで該サン プルについて、遺伝子の欠失または削除が存在するかいなかを調べることよりな り、そのような遺伝子がコードするものは、クラスＩの成分または内在性タンパ ク質を小胞体に輸送もしくは加工してＨＬＡクラスＩを提示する過程に関与する タンパク質、またはクラスＩの提示に必要な他の工程のいづれかに関与するタン パク質である。この方法の好ましい態様においては該哺乳類はヒトの胎児であり 、そして該タンパク質はＡＴＰ依存依存性輸送タンパクコち、ペプチド供給因子 タンパク質）またはプロテオシーム（ｐ　ｒ　ｏ　ｔ　ｅ　ｏ　ｓ　ｏｍｅ）も しくはその成分である。欠損または削除遺伝子の測定は、任意の慣用手段で行う ことができ、例えば、ウェスタンプロット分析、ｍＲＮＡのノーザンプロット分 析、細胞表面タンパク質のフェノタイプ決定、または制限酵素処理フラグメント の長さの多様性の分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇ ｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　（ＲＦＬＰ）　ａｎａｌｙｓｉｓ）　Aま たはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）で行うことができる。

本発明はまた、哺乳類、例えばヒト患者を治療して、自己免疫疾患の発生を抑制 する方法の基礎も提供する：好ましくはそのような治療を初期段階の、最も容易 に寛容状態を誘導できる時に実施する。この方法は哺乳類の血液循環細胞上に提 示される自己抗原と複合体を形成するＨＬＡクラスＩの量を増加させることを含 む。このことを達成する一つの方法は、哺乳類の循環細胞上に提示されるＨＬＡ クラスＩの量を増加させることである。このＨＬＡクラスＩと複合体を形成した 自己抗原の提示の増大は、該哺乳類の細胞上に適切な自己抗原の提示を可能とし 、自己寛容を増加させそして自己免疫疾患を発生する傾向を減少させる。このよ うなＨＬＡクラスＩの提示の増大は種々の方法で達成できる。一つの好ましい態 様においては、哺乳類をＨＬＡクラスＩを内在性タンパク質もしくはそのフラグ メントと結合して提示させる細胞で処理することである。そのような細胞は自己 細胞、例えば、患者のリンパ球（例えばＢ細胞またはマクロファージ）をＤＮＡ で形質転換したものであって、該ＤＮＡは一つもしくはそれ以上のタンパク質を コードするもので、該タンパク質は内在性タンパク質がＨＬＡクラスＩ提示のた めに小胞体に加工もしくは輸送されることに関与するものまたは該複合体がうま く細胞表面に移動するための加工もしくは輸送に関与するものであってよく。

そのようなタンパク質は好ましくは次のものを含むＡＴＰ依存依存性輸送タンパ クコＲＩＮＧ　３．　ＲＩＮＧ　４．　ＲＩＮＧ　１１．　ＨＡＭｌ、　ＨＡｌ ［２，１ｌｔｐ　１．１ｌｔｐ　２またはＹ３　（これら輸送タンパク質の命名 は種間により異なり、しかもいまだ全世界的に合意されていない；種間で命名が 異なるものの、これまでの証拠はこれらのタンパク質の種間のホモロジーは極め て高い）、または内在性ペプチドをプロセシングする役を有する切断タンパク質 （プロテオシーム複合体）である。プロテオシーム複合体は大型（分子量約２５ ０．０００）の、酵素活性フラグメントの集合であり、自己タンパク質をプロセ シングし、一般に長さ約６ないし１４アミノ酸の断片に切断して、それらが小胞 体内に入ってクラスＩとの複合のための表面に輸送されるようにする。プロテオ シーム遺伝子はＨＬＡクラス■に関連し、Ｋｅｌｌｙら（１９９１）Ｎａｔｕｒ ａ、頁−に記載されている。別の例では、細胞は膿Ｊ激剤でクラスＩの発現を増 大するように刺激されたものでもよい。

ＨＬＡクラスＩの患者循環細胞上への提示量を増大させるたの方法は、該患者ま たは該患者の培養中の細胞にＨＬＡクラスＩ発現を刺激する物質を投与すること である；そのような物質には、インターフェロン、例えばベーターおよびガンマ −インターフェロン、インターロイキン、およびトキソイド、例えばジフテリア のトキソイド、腫瘍壊死因子、ＢＣＧ、および百日咳トキソイドが含まれる。

採用できる他の方法は、ＨＬＡクラスＩの提示を刺激するウィルスまたはバクテ リアによる感染である。

ＨＬＡクラスＩの提示を患者細胞に増大させる他の方法は、他のヒト（好ましく はタイプが適合するヒト）からＨＬＡクラスＩを提示する細胞を得、該細胞を患 者に投与することである。別の方法は、哺乳類に細胞表面上でクラスエと複合体 を形成する自己抗原もしくはそのフラグメントを投与して、クラスＩを安定化さ せ、かつ該哺乳類の免疫系に抗原を提供することである。好ましくは、抗原はタ ンパク質のペプチドフラグメントであり、好ましくは、該ペプチドの長さは６な いし１４アミノ酸であり、この長さ範囲のペプチドフラグメントがクラス■と複 合体を形成することが知られている。ペプチドは経口もしくは静注により投与し てもよく、または哺乳類からの細胞をペプチドとインキュベートして、それから 哺乳類に再注入してもよい。

自己寛容の誘導におけるクラスＩの役割の発見は、任意のタンパク質に対して、 それが自己のものであわ、外来性のものであれ、患者の寛容の減少を生じること ができる。寛容の誘導は、寛容を誘導すべきタンパク質がＨＬＡクラスＩと結合 して提示されている細胞または抗原−クラスＩ複合体自体を患者に投与すること により達成される。この方法は、例えば患者が、例えば他の患者もしくは他の種 からの心臓もしくは腎臓のようなアログラフトの受容者である場合に利用できる 。採用できる一つの方法はＨＬＡクラスＩの提示されている細胞（好ましくは患 者のＢ細胞のような自己細胞）を、寛容を誘導させるべきタンパク質をコードす るＤＮＡでトランスフェクトし、次いでこの細胞を患者に導入して、該タンパク 質のＨＬＡクラスＩとの提示により自己寛容を誘導させることである。

本発明の他の態様および利点は、好ましい態様の説明および請求の範囲の記載か ら明らかであろう。

詳細ｌ説咀 最初に図面の説明を行う。

区面 図１は糖尿病およびコントロール個体からのリンパ球上のＨＬＡクラスＩの比較 を示すグラフである。

図２はＮＯＤマウス（糖尿病のモデル）がＨＬＡクラスＩ抗原の提示が顕著に減 少した牌臓細胞を有することを示すグラフのセットである。

図３はβ２ミクログロブリン欠乏マウスの島がリンパ球浸潤を生じていることを 示す顕微鏡写真である。

図４はＦＡＣ３で得られたグラフのセットであり、正常および糖尿病マウスのリ ンパ球と、ＣＤ４５アイソフオームに対する抗体との反応性を示す。

図５は、糖尿病リンパ球がヒトコントロールの正常な発現に比較して、ＲＩＮＧ 　４　ＡＴＰ依存依存性輸送タンパクコ現を欠失していることを示すノーザンプ ロットである。

図６は、ＮＯＤマウスのＲＦＬＰサザンプロットであり、正常および糖尿病患者 からのリンパ球のＡＴＰ依存依存性輸送タンパクコードするＤＮＡを比較してい る。図は糖尿病動物でのＲＩＮＧ　４の大幅な削除を明確に示している。

図７は、種々の自己免疫疾患を有する患者から採取した細胞上のクラス■の減少 した発現を示す棒グラフである。

最初に、前糖尿病および糖尿病のマウスおよびヒトのＨＬＡクラスＩ発現が減少 していることを証明する実験を記載する。

゛を糖尿病及び糖　病のＮＯＤマウス　びヒトにおけるＨＬＡクラス■発　減ｌ 」ＨＬＡクラス■特異的モノクローナル抗体（Ｗ６／３２）を用いた細胞表面フ ェノタイプ分析を利用して、インシュリンおよび島の両者に対する自己抗体を血 清中に含む６人の危険性の高い前糖尿病者：４名の糖尿病双子：および２０名の 長期糖尿病者：からの末梢血リンパ球を、ＨＬＡクラス１発現に関してアッセイ した。免疫蛍光分析のためのヒトリンパ球はフィコール勾配を用いた標準的技術 で調製した。フローサイトメトリー（ＦＡＣ３）は、赤血球および屑を排除しＴ 細胞、Ｂ細胞およびマクロファージのみを含むようにセットしたゲートを用いて 行った。ＨＬＡクラスＩ発現は、長期のタイプＩ糖尿病患者および他のグループ の何人かの患者から採取してニブシュタイン−パールウィルスで形質転換した１ ０株のＢ細胞においても測定した。

図１を参照すると、６例の高度危険性糖尿病の全て、４名の糖尿病双生児、およ び２０名の長期糖尿病者のうちの１９名において、ＨＬＡクラスＩ発現はを意に 減少しており、そして長期糖尿病からのＥＢＶ形質転換したＢ細胞株の全１０株 においても減少していた。

これと著しく対照的に、危険性の低い前糖尿病（即ち、インシュリンに対する自 己抗体を有するが、島に対する自己抗体を有しない者）、４名の非糖尿病不一致 タイプＩ糖尿病Ｉ双生児、１０名の一親等縁者、３９名のコントロール個体、お よび正常個体からのＥＢＶ形質転換細胞１０株では、正常レベルのＨＬＡクラス Ｉ抗原の発現を示し、そのレベルは他の群に比べて有意に高かった。双生児の結 果は、クラスＩの表面への発現は遺伝子型（ジェノタイプ）とは独立している可 能性を示す。

ＮＯＤマウスはタイプＩ糖尿病の十分に確立されたモデルであり、明らかな高血 糖の数週間前にインシュリンおよび／または島細胞に対する自己抗体の似たよう な生産、ならびに層破壊の前に島を取り囲む慢性的リンパ球浸潤を生じる。ＮＯ ＤマウスのＨＬＡクラスＩハブロタイブ（Ｈ−２座）はＨ−２に’およびＨ−２ Ｄ’である。前糖尿病ＮＯＤの牌細胞をフローサイトメトリーで分析した。肺臓 細胞は、明らかな高血糖の６および２０週間前にテストした。図２を参照すると 、１０匹のＮＯＤマウスにおいて肺臓細胞の６±２．３％がＨ−２に’モノクロ ーナル抗体クローン（３１−３−４５）と結合し、これと比較して陽性コントロ ールのＢＡＬＢ／ｃマウスからの陽性肺臓細胞は８８±１５．８％であった。

Ｈ−２に’に関する平均抗原密度も、ＮＯＤの肺臓細胞においてＢＡＬＢ／ｃ牌 臓細胞に肺臓て有意に減少していた（ｐ＝０．００１）。ＮＯＤの肺臓細胞上で 、Ｈ−２Ｄｂ発現の同様な減少も存在した。Ｈ−２Ｄ’に対するＨｌ　４１−３ １モノクローナル抗体を用いて、ＮＯＤ牌臓肺臓の５２±１５％が陽性であり、 これと比較してＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２５）（ｎ＝１０）からの陽性肺臓 細胞は９４±５．６％であった。Ｈ−２’ハブロタイブＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ ＝１０）は、このＨ−２Ｄゝに対する抗体を用いて３８±７，８％陽性であり、 ＮＯＤ牌臓肺臓もまた、このＨＬＡクラスＩ抗原の発現が激しく減少しているこ とを示した。従って、ヒトおよびマウスの両者共にＨＬＡクラスＩ発現の減少が 、ＮＯＤマウスの肺臓細胞および糖尿病ヒトの末梢血リンパ球において観察され た他の自己免　患におけるＨＬＡクラス１発現の減ｔＪＨＬＡクラスＩ特異的モ ノクローナル抗体を用いた」己作業を、次の自己免疫疾患患者からの末梢血リン パ球に対して行ったニジニーグレン症候群：関節リウマチ：タイプ■条内分泌異 常（ｔｙｐｅ　Ｉ　ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｆａｉｌｕｒｅ）　；多発性 硬化症；　ＳＬＥ　；甲状腺機能低下症：橋本病およびグレープズ病。非自己免 疫性タイプ■糖尿病患者のＭＨＣクラスＩの発現が正常であったことと対照的に 、自己免疫疾患患者から得たリンパ球では、全ての場合にクラス１発現の減少か 認められた自　免　タイプＩ糖　に対してｉｎ　ｖｉｖｏでのＨＬＡクラスＩ　 現の人工岨阻也往土分里乾ゑ 次に以下の実験を行って、ＨＬＡクラスＩ発現の欠陥自体がタイプ■糖尿病を生 じることを調べた。

β２−ミクログロブリン欠損に関して同型接合体であるマウスは、検出可能なβ ２−ミクログロブリンを発現せず、さらにその細胞表面にＨ−２に主要組織適合 性抗原を殆ど完全に欠失しており、Ｈ−２Ｄ主要組織適合性抗原を（欠失してい る。年齢１年を越えた１０匹のマウスの高血糖症および体重を調べた。いずれも １．５年以上の年齢の１０匹の同型接合性欠失マウスは高血糖を有し、さらに同 じ年齢の正常同腹子と比べて体重が有意に少なかった（表１）。

表１ β２−ミクログロブリン欠損によりＨＬＡクラス■を欠失したマウスの血糖値と 体重 上代の遺伝子型 一／−＋／− 血糖値（■％）　体重（ダラム）　血糖値（■％）　体重（ダラム）３３９　ｊ ｌ　８０　３２ ３６８　２１　８２　３ｇ （＋／＋マウスは糖尿病ではなく正常な血糖値と体重を有する） ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて、β２ミクログロブリン欠失に関し て同型接合体であるマウスの一匹の島細胞に対して組織学検査を行った。図３は 、糖尿病のマウスおよびヒトの場合に典型的に見られるとおり、島がＣＤ４＋リ ンパ球浸潤で取り囲まれていることを示す。解剖時において、このマウスは血糖 値か３４５ｍｇ％に増大し、そして残存する少ない島はリンパ球の巣に隠れてい た。

糖尿病マウスからの血清のテストは、リンパ球の浸潤を明らかにし、この病気の 自己免疫的メカニズムのさらなる証拠を提供した。さらに、これらのホモロガス な組み換えマウスはＣＤ８細胞を有しないので、この新規自己免疫モデルは島の 破壊かＣＤ８細胞なしに行われる可能があり、従ってＣＤ４もしくはナチュラル キラー細胞の介在による島の攻撃が中心的そして恐らく独占的役割を有すること を示唆している。血糖値の上昇開始はＮＯＤマウスにおける高血糖よりも遅い時 点の１年経過後に生じるようであるが、このデータは自己に対する寛容の確立に 関するＥ（ＬＡクラスＩの機能的重要性を明らかにしている。しかも、ＨＬＡク ラスＩ上の自己ペプチドの提示の全般的欠陥の存在は、臨床的に検出可能な自己 免疫の非常に中心的形態であるタイプ■糖尿病の出現に十分である。

ＨＬＡクラスＩの　下はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける自己に・　る細胞　害性と関 連を　る：不一致タイプ■　双　１によるレッスン糖尿病細胞上に減少して発現 されるＨＬＡクラスＩ分子の表現型が、内在性抗原を提示する機能の点で正常で あるかまたは障害をもっているかを調べるため、次の実験を行った。従来、非糖 尿病の一卵性双生児のマクロファージおよびＢ細胞を先天性糖尿病双生児からの Ｔ細胞と一緒に培養すると、自己成分を用いて行った同様のインキュベーション （即ち、オートロガス・ミクスト・リンホサイト・リアクション：ＡＭＬＲ）と 比べて、増殖の増大を生じることが知られていた。対照的に、糖尿病双生児の非 Ｔ細胞による非糖尿病双生児Ｔ細胞への刺激の誘発は、非糖尿病者の抗原提示細 胞による刺激より少なかった。さらに、ＨＬＡが同一である非糖尿病双生児から の刺激因子による糖尿病双生児Ｔ細胞の増殖は、上記の糖尿病者の抑制されたＡ ＭＬＲを実質的に上回り、そしてコントロールＴ細胞の自己への増殖も若干上回 ることも知られていた。

上記観察を、自己免疫におけるＨＬＡクラスエの役割の発見と一致させる説明は 、」占こおいて非糖尿病者の抗原提示細胞と糖尿病者のＴ細胞との間で観察され たいくぶん過剰応答的しかし「同系の」ミクスト・リンホサイト・リアクション は、それまで認識されなかった内在性ペプチドの適切な提示か、非糖尿病者の刺 激細胞上でＨＬＡクラスエにより提示されたことによって、該リアクション（Ｍ ＬＲ）中において実際にアロ抗原応答が弱められたことを示しているということ である。従って、糖尿病双生児Ｔ細胞は、正常に提示された非糖尿病双生児ペプ チドを、以前の暴露および寛容誘導がなかったため、初めて外来性のものとして 認識上たのであろう。

ＡＭＬＲでは観察されないＭＬＲの特徴的結果は、細胞障害性エフェクター細胞 の発生である。非糖尿病抗原提示細胞と糖尿病Ｔ細胞の間の同系ＭＬＲが、細胞 障害性エフェクター細胞を発生させたか否かを調べるため、次のアッセイを行っ た。糖尿病不一致双生児対の間で、刺激細胞を交換したＡＭＬＲを設定した。

代表的アッセイを表２に示す。ＡＭＬＲ増殖を７日行った後、応答しているＴ細 胞を収穫し、クロム標識した自己および双生児標的に対して自己反応性である可 能性のあるＴ細胞として用い、第二の細胞障害性Ｔリンパ球アッセイを行った。

表２は、非糖尿病双ｍ１１激因子に対するＡＭＬＲにおいて、過剰増殖した糖尿 病双生児Ｔ細胞が、「同系」双生児標的は溶解したが自己標的は溶解しなかった ことを示す。予想したとおり、糖尿病双生児Ｔ細胞は糖尿病標的に対する自己細 胞障害性を生産できず、そして自己刺激した非糖尿病双生児Ｔ細胞は自己を溶解 しなかった。これらの結果は、以前に観察された、照射された非糖尿病双生！＋ １激因子と一緒に培養したときの、糖尿病双生児Ｔ細胞の過剰増殖は、それまで 認識されなかった自己ペプチドの提示に対して二次的に生じることを示唆してい る。最も重要なことは、ポリクローン性のＨＬＡクラスＩ抗体により標的ＨＬＡ クラスＩを遮蔽すると自己ＣＴＬ生産を阻止できたことで、このことは糖尿病双 生児Ｔ細胞の障害性はＨＬＡクラスＩエピトープに対していることを示唆する。

対照的に、コントロールＣＴＬアッセイはこのポリクローン性の抗体により有意 に阻止されなかった。これらのデータは、糖尿病双生児Ｔ細胞に自己抗原に対す る自己反応性が存在し、ＨＬＡクラス■陽性の自己細胞上に正しく提示された自 己ペプチドとの関係で解明されたことを示している。

表２ ＡＭＬＲアッセイ　標的からの特異的Ｃｒ放出％応答側　刺激側　標的　エフェ クターと標的細胞の比率Ｔ細胞　非Ｔ細胞　１：１　５：１　１０：１　４０： １＾、糖尿病双子　糖尿病双子　糖尿病双子　１．３土０：４　ｏ、：ｑ±０． ４　４．５±０．３　５．４±０．２非糖尿病双子　非糖尿病双子　非糖尿病双 子２．１±０．５　２．１±０．４　２．５±３．１　４．８±０．２糖尿病双 子　非糖尿病双子　非糖尿病双子１６２±１．９２０．１±１．５４０．０±２ ．０５９．０±６．２非糖尿病双子　糖尿病双子　糖尿病双子　１．０±０．６ 　０．９±０．１２゜５±０．１　０．２±０．６ＨＬＡクラス■抗体による標 的細胞の処理Ｂ、糖尿病双子　非糖尿病双子　非糖尿病双子１．３ｆ０．１　２ ．９±０．６　４．２ｆ１．７１７．１±１．２１１−■１１−鴫−響□Ｒ雫■ １−−−−□□糖尿病および非糖尿病双生児Ｔ細胞は、自己または一卵性双生児 からの同系照射非Ｔ細胞と１：ｌの比率で既に報告されたようにして（＃９７８ ）　７日間刺激した。

７日目に、ＡＭＬＲで応答したＴ細胞をフィコール上に収穫して、ＣＴＬアッセ イを行った。標的リンパ球は、ドナーからの凍結リンパ球をアッセイの２４時間 前に解凍したものを用いた。標的の標識は、ｌＸｌ０’細胞あたり５０−１５０ μＣｉの濃度の５ｌ（ｒのＮａｔＣｒＯａで、緩やかに振とうしながら、３７℃ で１時間行った。標的細胞を２回穏やかに洗浄してから、同系の刺激されたＴ細 胞と上３己七率で、１０時間−緒に培養した。アッセイの最後に培養上清１００ ラムダを採取上てガンマ線カウンターでカウントした。上記の実験は３連で行っ た。

Ｂ部においては、標的細胞を１：１００希釈の無菌のポリクローンマウス抗ヒト ＨＬＡクラスＩ而清（＃９７８）で、室温にて３０分間処理し、洗浄し、そして 培養プレートに添加して細胞障害性アッセイを行った。

糖尿病における欠　Ｔ細胞発生は、ＨＬＡクラスＩ発現および内在性ペプチドの 壜工の亥化９；次ｎ精黒工轟ゑ 糖尿病のヒトにおいては、Ｔ細胞発生の欠陥があり、糖尿病リンパ球はＣＤ４５ 、ＬＦＡ−３、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭＳＣＤ２等の多くの表面マーカーを低い平 均抗原密度で発現したリンパ球の数を不釣り合いに増加して発現し、明るい蛍光 を発する細胞の正常な第二ピークの欠失もしくは減少をもたらすことが報告され ている。ヒトにおいては、暗いピークのリンパ球様細胞の亜集団は、共通してナ イーブ細胞もしくはサプレッサーインデューサー細胞とよばれ、これに対して明 るく蛍光を発する細胞はメモリー細胞もしくはヘルパー−インデューサー細胞と 呼ばれいてる。より最近明らかにされたところでは、糖尿病において暗い細胞か 明るい細胞より増加することは、病気の程度を示すだけでなく、自己免疫発生に ともないナイーブ細胞からメモリーＴ細胞への正常な転移か阻止されたことに付 随するものであることが明らかになった。

最近、異なるＣＤ４５のアイソフィームを識別するネズミモノクローナル抗体に より、マウス白血球共通抗原が規定された。抗体ＣＤ４５Ｒ−１（ＹＣＤ４５Ｒ −１）は、エクソンＡおよびエクソンＢを含むかエクソンＣは含まないＣＤ４５ の高分子量アイソフオームに特異的である。ＣＤ４５Ｒ−１で染めたマウスの正 常ＢＡＬＢ／ｃの末梢血リンパ球は発現の不均一さくｈｅｔｅ　ｒｏｇｅｎｅ　 １ｔｙ）を示し、予測された蛍光強度の２モ一ト性分布（暗いピークと明るいピ ーク）を生じる（図４Ａ）。これと明らかに対照的に、ＮＯＤの末梢血からのリ ンパ球は、殆ど全く高密度のＣＤ４５Ｒを含んでいない。ＨＬＡクラスＩの発現 を欠いているβ２−ミクログロブリン欠損マウスは、専ら低密度のＣＤ４５Ｒ集 団を発現し、従って、ＨＬＡクラスＩの提示がリンパ球の成熟に中心的役割を有 することを示唆している（図４Ｃ）。さらに、ＮＯＤマウスおよびＨＬＡクラス Ｉβ２−ミクログロブリン欠失マウスの分析は、全ての末梢血リンパ球に関して ＩＣＡＭおよび他の二つのＣＤ４５抗体による高密度ピークを欠いていることを 明らかにし、従って、適切に提示されたＨＬＡクラス■が末梢血リンパ球の発達 を促す可能性のあるリガンドとして、中心的役割をもっことが示唆された。

ＡＴＰ依存性＠送タンパク　をコードするｍＲＮＡのアッセイ図５を参照すると 、標準的ｍＲＮＡのノーサンプロットアッセイを行って、ＡＴＰ依存依存性輸送 タンパク一つ、ＲＩＮＧ　４の発現を、ヒト腫瘍細胞ライン、長期間糖尿病から の末梢血リンパ球、および正常コントロールについて検出した。ヒト腫瘍細胞ラ インにおいて、多量のｍＲＮＡが検出された（レーン１）。

長期糖尿病の末梢血リンパ球中のＲＩＮＧ　４　ｍＲＮＡは、有意に欠損してい た（レーン２．　３．　５および６）。正常コントロール個体からのリンパ球中 には、ＲＩＮＧ　４　ｍＲＮＡは存在した（レーン４）。

ＲＦＬＰ分析 図６を参照すると、ＲＩＮＧ　４　ＤＮＡをプローブとして、ＮＯＤマウスＤＮ ＡについてＲＦＬＰ分析を実施し、結果をＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６コ ントロールＤＮＡと比較した。ＮＯＤ　（Ｈ−２に’　Ｉ−Ａ”）　、ＢＡＬＢ ／ｃ（Ｈ−２’）およびＣ５７ＢＬ／６　（Ｈ−２’　）　マウスから調製した 牌細胞からのＤＮＡを、種々の酵素で切断し、レーンあたり５μｇのＤＮＡをア ガロースゲルにのせた。サザン転写を行い、遺伝子のスクリーニングとＲＩＮＧ 　４によるフィルターの探査（ブロービング）を行った。レーン１．２．３．４ ．５．６．７のＤＮＡは泳動した（レーン８のＤＮＡはアガロースゲル中で適切 に泳動せず、ゲル上端の溝に止まった）。レーン１．４および７はＢＡＬＢ／ｃ を：レーン２および５はＣ５７ＢＬ／６を：そしてレーン３．６および９はＮＯ Ｄを示す。写真により、レーン１．２．３または４．６．７において、ＢｓｔＥ ＩＩまたはＢａｍＨＩにより、同じようにプローブされたバンドが観察された。

レーン９はＮＯＤのＡＴＰ依存性輸送因子の大幅な削除を示し、即ち、レーン７ のＢＡＬＢ／ｃ　ＤＮＡに比べると、ＸｂａＩで切断したＮＯＤ　ＤＮＡのレー ン９においてプローブされたバンドのサイズは有意に小さかった。

治療 上記のとおり、本発明の発見は自己免疫疾患の治療を可能にし、特定のタンパク 質抗原に対する寛容が望まれる治療、例えば、同種移植拒絶反応の防止を可能に する。これらの治療のあるものをさらに詳細に説明する。

遺伝子治療 患者が、自己抗原のクラスＩとの複合体形成のための輸送もしくは加工またはそ のような複合体（ＭＨＣクラスＩ：内在性ペプチドおよびベータ２ミクログロブ リン）の細胞表面への成功的加工に関与するタンパク質の一つの欠失または削除 、またはクラスＩ遺伝子それ自体の欠失または削除のため、タイプ■糖尿病のよ うな自己免疫疾患を患いまたはそのような疾患の傾向を有する場合、治療の一つ ので様は細胞を消失もしくは欠失している遺伝子で形質転換し、それらの細胞を 患者に再導入することである。それらの細胞の機能的タンパク質は、内在性の細 胞質タンパク質を小胞体に加工もしくは輸送して、ＨＬＡクラス■と複合体を形 成させ、細胞表面に提示させるであろう：これは自己寛容を誘導し自己免疫疾患 の発生を抑制するであろう。この治療方法は、理想的には疾患の進行段階の前に 実施され、例えば、好ましくはタイプ■糖尿病の場合は、抗インシュリン抗体お よび抗−島抗体を有して危険度が高いが、未だ島細胞の破壊が生じていない患者 において、実施される。

最初の工程は、失われもしくは欠失した遺伝子を同定することである。一旦、そ のような遺伝子の同定か行われたなら、クラスＩと複合体を形成した抗原を提示 する能力を有する細胞を消失もしくは欠失している遺伝子で、標準的真核細胞の トランスフェクション技術を用いてトランスフェクションする。トランスフェク ションされる細胞は好ましくは患者自身の細胞であり、そして好ましくはＢ細胞 も（−＜はマクロファージのようなリンパ球細胞であり、これらは抗原を提示す る細胞である。Ｂ細胞は永久細胞ラインの出現を避けるために一過的トランスフ ェクションすることができ、そのばあい、トランスフェクションされた自己のＢ 細胞の導入は、Ｂ細胞の死滅に合わせて周期的に、例えば数カ月置きに行う必要 がある。その代わりに、患者のＢ細胞から不滅細胞ラインを、例えばＥＢＶウィ ルスによる感染により製造することかできる。そのような細胞は、抗生物質に感 受性にしておき、寛容を与えた後に患者に抗生物質を投与して該細胞を殺し、ネ オプラズムを形成する危険を避けることができる。

他の個体からのリンパ球を、共通的自己抗原に対する寛容誘導のために用いるこ とも可能である。好ましくは、リンパ球は標準的適合性試験を用いてＨＬＡの適 合を調べた個体から得られる。リンパ球を提供する個体は、そのＨＬＡクラスＩ 抗原の提示が正常であり、それによりクラスＩｉ示の欠陥のために患者の細胞上 に提示されない該抗原が提供者の細胞上に提示されるものでなければならない。

提供者の細胞は血液の精製フラクションとしてまたは全血として提供できる。

もし、リンパ球フラクションを使用するなら、Ｉ　Ｘ　１０”程度の桁の細胞の 月毎の注入が、自己寛容を誘導しそしてトランスフェクションもしくは他の自己 免疫疾患の発生を防止するために十分であろう。さらに、これらの細胞は注入の 前に竪射して、移植片対宿主反応を防止しまたはいかなる感染病の感染を防止で きる：なぜなら死滅細胞も依然としてＨＬＡクラスＩ結合裂（ｂｉｎｄｉｎｇ　 ｃｌｅｆｔ）中に既に加工された抗原を提示するからである。

永久的および一時的Ｂ細胞のトランスフェクションを行う方法の例としては、次 のように実施できる。

多作耐性輸送因　による７″久的トランスフエクシヨン最初のステップは、クラ スＩ遺伝子、プロテオシーム遺伝子、またはＡＴＰ依存性輸送因子遺伝子の消失 若しくは欠陥によって、クラスＩを出現させることに欠陥を有するため、自己免 疫疾患の素因ををしまたはそのような疾患を患っている患者からのＢ細胞または リンパ球の単離である。そのような患者からのｍＲＮＡを分析して、欠損または 消失している遺伝子を突き止める。患者がら単離したＢ細胞を標準的方法により ＥＢＶで永久細胞化して、患者細胞を基礎とした腫瘍細胞ラインを得る。そのよ うな細胞ラインの確立および永久化に続いて、抗生物質感受性を与える遺伝子を 用いて、細胞を「自殺用」抗生物質に対して感受性になるようトランスフェクシ ョンする。

次に、消失または欠失している輸送遺伝子の発現を可能にするためのＢ細胞ライ ンのトランスフェクションは、以下のように実施できる。トランスフェクション は、消失または欠失しているタンパク質をコー　ドするｃＤＮＡ分子を用いて実 施でき、そのようなｃＤＮＡは翻訳開始コドンから上流に位置する７２塩基対を 含み、ポリアデニル化部位から２塩基対下流で停止する。このｃＤＮＡをｐｃＮ ＮＡ　Ｉ／ＮＥＯ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなベクター内に、サイトメ ガロウィルスプロモーターおよびエンハンサ−による転写支配下に挿入する。

形質転換の３ないし４週間後、形質転換体を調べて、フローサイトメトリーによ り、表面にＨＬＡクラスＩ抗原を発現しているものを同定する：このことは例え ばヒトの全てのＨＬＡクラスＩを認識するモノクローナル抗体例えばＷ６／３２ を用いて行うことができる。

例えば、Ｒ３Ｖ、５　［ｃＤＮＡの転写かラウス肉腫ウィルスの５’　ＬＴＲ（ １ｏｎｇ−ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）によって誘導されるコのような他の 発現ベクターももちろん同様に使用できる。このベクターでは、Ｒ３Ｖ、５　（ ＤＰＴ）グアニンホスフすリポシルトランスフェラーセ遺伝子か、ミコフェノー ル酸に対する耐性を与える。

有効なトランスフェクションおよびＨＬＡクラスＩ抗原の発現に関するスクリー ニングの後、患者に再融合させるための、そのような抗原を最大限に発現するサ プラインか確立されるであろう。注入、および自己寛容が成立されたとの判断が なされた後、細胞が感受性となった抗生物質を患者に投与して細胞を殺す。

ゴしたトランスフェクション工程は通常の技術であればどのようなものを用いて も行うことができる。一般には、上述したどのベクターにおいても、輸送体遺伝 子をコードするｃＤＮＡの挿入に、ＨｉｎｄＩ［［およびＮｏｔＩおよびＸｂａ Ｉなどのフランキングポリリンカー制限酵素切断部位を利用することができる。

トランスフェクションはエレクトロポレーション装置（ＢＩＯＲＡＤ）　用い、 １２５０ボルト、３個のコンデンサー、最小時間および最大減衰時間で行うこと がテキル。細胞を約５Ｘ１０’細胞／ｍｌの濃度でエレクトロポレーションの前 に２日間培養する。続いて、エレクトロポレーション用キュベツト中の０．　５ ｍｌ培養液（ＲＰＭ１１６４０／　１５％胎児ウシ血清）に５Ｘ１０’細胞／ｍ ｌの濃度で細胞を懸濁し、氷水バス中に置く。エレクトロポレーション後、細胞 を１０分間室温で静置し、新鮮な培養液に再懸濁し、多穴プレートに分注する・ キュベツト当たりのＤＮＡ量は３−２０μｇとする。

エレクトロポレーションから５日後に、ｐｃＤＮＡｌに対してはＧ４１８（Ｇｉ ｂｃｏ）を、Ｒ３Ｖ、５に対してはＮＥＯおよびキサンチン（１０μｇ／ｍｌ） を直接食むミコフェノール酸（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を使用して、正しくトランスフ ェクションされた細胞系の選択を開始する。選択を２週間行った後に、多くのウ ェルで増殖する薬Ｍ耐性の細胞集団のそれぞれについて調べる。エレクトロポレ ーションから５週間後に、トランスフェクションされた細胞集団のフローサイト メトリーによる分析を開始する。その後２−３日間、細胞を３−８Ｘ１０５細胞 ／ｍｌに保ち、常法に従って間接蛍光によって染色する。ＨＬＡクラス■を多量 に発現している細胞系をサブクローン化し、選択した細胞集団を患者に投与する ためにサンプル化した。

ｌＸｌ０’からｌＸｌ０’細胞／回の静脈内投与によって患者を弱く免疫化する 。受容者由来のＴ細胞が適切なＴ細胞の増殖を行っているかについてサンプリン グすることによって、自己寛容の再成立をモニターする。適切なＴ細胞の増殖と は、例えば、ＣＤ４５またはＩＣＡＭまたはその他の記憶細胞マーカーの高いピ ークの再生成、まだ不変的トランスフェクションをされていない自己抗原提示細 胞に対する毒性Ｔ細胞の欠如をいう。

一過性トランスフェクション 自己寛容の再生成のためのまた別の方法は、新たに単離された、Ｂ細胞のような 抗原提示細胞に一過性トランスフェクションを施す方法である。既に概要を示し たように、新鮮な、ヘパリン処理した血液から新たに単離したＢ細胞を精製する ：各患者から約７０ｃｃの血液を採集する。Ｔ細胞をロゼツト形成させたヒツジ 赤血球細胞のロゼツト非形成画分からＢ細胞が得られ、これらのＢ細胞は、マク ロファージを破壊することによって増える。一過性トランスフェクションは、不 変的トランスフェクションに用いられる方法と同様に行われるが、より高い用量 の細胞（例えば、■ドーズあたりｌＸｌ０’−ＩＸＩＯ”細胞）を同じ患者にで 直ちに（６時間以内）再融合させる点か異なる。細胞は同一の患者由来のものな ので外来治療で導入することができる。

ペプチド　の　による治療 先に述べた通り、クラスエの欠陥またはクラス■提示に関与する蛋白質をコード する遺伝子の一つの欠陥が、細胞表面上におけるペプチド抗原の適切な提示を妨 げるような場合、治療戦略の一つは該ペプチドを提供することである。そのよウ ナ治療の第一段階は、クラスＩとの複合体として提示されない単数または複数の ペプチドを同定することである。これは、通常の技術に従って、患者から細胞、 例えば末梢血液リンパ球を単離し、ＨＬＡクラスＩと複合体を形成しているペプ チドを該リンパ球から抽出して抽出パターンのグラフを作成することによって行 う。そのような方法については、例えば、Ｍａｄｄｅｎら（１９９１）、Ｎａｔ ｕｒｅ、３５３：３２１；ＶａｎＢｌｅｅｋら（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ。

主±８：２１３；およびＲｕｄｅｎｓｋｙら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５３ ６２２に記載されている。

次の段階は、この抽出パターンを正常なコントロールと比較し、患者から失われ ているペプチドを同定することである。コントロールには存在するが患者には存 在しないこれらのピークの配列を決定し、標準的な技術に従ってペプチドを合成 し、上述したように投与する。

自己　に・　る　” 非自己抗原に対する寛容は、ＨＬＡクラス■抗原提示細胞に寛容が誘導されるべ き蛋白質をコードするＤＮＡをトランスフェクションさせ、トランスフェクショ ンされた細胞を患者に投与することによって引き起こすことができる。これによ って、自己ペプチドのＨＬＡクラスＩ提示の寛容を誘導する経路に、導入された 蛋白質が人工的に取り込まれる。細胞は外来性の蛋白質に対して、まるでそれが 内因性の蛋白質であるかのようにクラスエ抗原を提示し、該抗原に対する寛容を 誘導する。この技術は、同種移植を行う前に同種移植片抗原に対する寛容を誘導 して拒絶反応を防ぐのに用いることができる。

その他の態様も特許請求の範囲に含まれる。

浄書（内容に変更なし） Ｌｏｇ蛍光 ＦＩＧ、２ ｔｌ姦隼 鯉里°辻 ＬＡＮＥｌ　２　３　４　５　６　７　８　９ＮＢＣＮＢＣＮＢＣＮ ・咋　・・− ＦＩＧ、　６ 手続補正書

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＬＡクラスＩを提示させるために内在性タンパク質を小胞体に輸送するこ とに関与するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換されたことを特徴とする 、ＨＬＡクラスＩを提示する細胞。
2. ２．自己由来の細胞である、請求項１の細胞。
3. ３．タンパク質が、ＡＴＰ依存性輸送タンパク質である、請求項１の細胞。
4. ４．前記ＤＮＡが、ＲＩＮＧ３．ＲＩＮＧ４．ＨＡＭ１．Ｍｔｐ１．Ｙ３．ＨＡ Ｍ２またはＭＡＰ２をコードする、請求項３の細胞。
5. ５．ＨＬＡクラスＩを提示させるための内在性タンパク質の細胞内処理（プロセ ッシング）に関与するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された、ＨＬＡ クラスＩを提示する細胞。
6. ６．自己免疫疾患を抑制するために哺乳類を処理するための医薬を製造するため の、ＨＬＡクラスＩ発現を刺激する物質の用途。
7. ７．前記物質がインターフェロンである、請求項６の用途。
8. ８．前記物質がトキソイドである、請求項６の用途。
9. ９．自己免疫疾患を抑制するために哺乳類を処理するための医薬を製造するため の、ＨＬＡクラスＩを提示する細胞の用途。
10. １０．処理される哺乳類がヒト患者であり、そしてＨＬＡクラスＩを提示する細 胞が、該患者よりもＨＬＡクラスＩの発現レベルの高い他人から得られるもので ある、請求項９の用途。
11. １１．哺乳類の細胞の表面上でＨＬＡクラスＩ分子と複合体を形成して該クラス Ｉを安定化させて、該抗原を該哺乳類の免疫系に提示する抗原の、自己免疫疾患 を抑制するために哺乳類を処理するための医薬を製造するための用途。
12. １２．抗原がペプチドである、請求項１１の用途。
13. １３．ペプチドが約６ないし１８アミノ酸の長さのものてある、請求項１２の用 途。
14. １４．哺乳類の自己免疫疾患を発生する素因を試験する方法であって、該哺乳類 の細胞上のＨＬＡクラスＩの提示を測定し、その提示レベルが低いことを該素因 の指標とする、上記方法。
15. １５．自己免疫疾患がタイプＩ糖尿病である、請求項１４の方法。
16. １６．細胞が末梢血リンパ球である、請求項１４の方法。
17. １７．哺乳類の自己免疫疾患を発生する素因を試験する方法であって、該哺乳類 から生物学的サンプルを得；そして該サンプルについて、ＨＬＡクラスＩの提示 のために内在性タンパク質を小胞体に輸送することに関与するタンパク質をコー ドする遺伝子の欠失または削除が存在するか否かを調べる、 ことよりなる上記方法。
18. １８．該タンパク質がＡＴＰ依存性輸送タンパク質である、請求項１７の方法。
19. １９．表面上にＨＬＡクラスＩと結合してタンパク質を有する細胞の、該タンパ ク質に対する免疫寛容を患者に誘導するための処置に用いる医薬を製造するため の用途。
20. ２０．該タンパク質が同種移植（アログラフト）に存在する非自己タンパク質で ある、請求項１９の用途。
21. ２１．該細胞が該タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトされたもの である、請求項１９の用途。
22. ２２．該細胞が自己のＢ細胞である、請求項２１の用途。