JPWO2015083685A1 - Ｄｌｇ１／ＳＡＰ９７遺伝子のスプライシングバリアント、及びスプライシングバリアントを利用した統合失調症の検出 - Google Patents

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Abstract

統合失調症に関連するDlg1/SAP97遺伝子の新規スプライシングバリアント、及び該スプライシングバリアントの発現レベルを測定することにより統合失調症を発症するリスクを判定する方法の提供。Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルを測定することを含む統合失調症のリスクを判定する方法であって、前記スプライシングバリアントの発現レベルが健常者に比較して低い場合に、統合失調症のリスクが高いと判定し、発現レベルが健常者に比較して高い場合に、統合失調症のリスクが低いと判定する方法。

Description

本発明は、統合失調症に関連するDlg1/SAP97遺伝子の新規スプライシングバリアントに関する。
統合失調症は約１％の高頻度で思春期以降に発症する重篤な精神疾患で、幻覚・妄想、精神運動興奮などの陽性症状、無為・自閉、感情鈍麻などの陰性症状及び認知機能障害といった多彩な精神症状が生じる。その病態にはグルタミン酸神経伝達の異常が関係していると考えられている。これまで本発明者らのグループは、N-methyl-D-aspartate(NMDA)型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるフェンサイクリジン(PCP, 1-(1-phenylcyclohexyl)piperidine)をラットに投与したときに、統合失調症モデルが成立する臨界期以降に、大脳皮質においてRNA量が上昇する応答遺伝子を解析し、Dlg1/SAP97を単離した(非特許文献１を参照)。Dlg1/SAP97は様々なドメインによって、alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl isoxazole-4-propionate (AMPA)、カイニン酸、NMDA型グルタミン酸受容体及びその他のシナプスタンパク質のサブユニットと相互作用することが示されており、発現の変化による統合失調症への影響が考えられる。さらにこれまで本発明者らが報告した小規模ゲノムDNAサンプルによるヒトDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型(SNPs)解析から、一部のSNPと統合失調症との関連が示唆された(非特許文献２及び非特許文献３を参照）。
Hiraoka S et al., Eur Neuropsychopharm (2010 Mar;20(3)), 176-186 Sato J et al., J Neural Transm (2008) 115:1355-1365 Uezato A et al., Behav Brain Funct (2012 8:2)
本発明は、統合失調症に関連するDlg1/SAP97遺伝子の新規スプライシングバリアント、及び該スプライシングバリアントの発現レベルを測定することにより統合失調症を発症するリスクを判定する方法の提供を目的とする。
本発明者らは、これまでに関連が示唆されたDlg1/SAP97内の1箇所のSNP（Uezato A et al., Behav Brain Funct (2012 8:2)）と、新たにデータベースから遺伝子発現に影響を与える領域にあると考えられる5 SNPsを加えた計6 SNPsについて、日本人の統合失調症患者2012人及び日本人の健常者2170人のゲノムDNAを用いてSNP解析を行い、発症との関連を検討した。この大規模ゲノムDNAサンプルによるヒトDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型(SNPs)解析から、一部のSNPと統合失調症との関連が確認された。また、Dlg1/SAP遺伝子のこれまで発見されていなかった特定のスプライシングバリアントの脳内での発現量に統合失調症において有意な差が見出された。さらに、特定のSNPとDlg1/SAP遺伝子スプライシングバリアントの脳内での発現との関連が示された。これらの結果は、統合失調症におけるグルタミン酸神経伝達機能障害仮説を分子レベルで支持する。さらに、これらの新知見は、統合失調症のあらたな診断法の開発や疾患罹患脆弱性の解明に寄与するものである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルを測定することを含む統合失調症のリスクを判定する方法であって、前記スプライシングバリアントの発現レベルが健常者に比較して低い場合に、統合失調症のリスクが高いと判定し、発現レベルが健常者に比較して高い場合に、統合失調症のリスクが低いと判定する方法。
[２] 統合失調症のリスクが、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクである、[１]の方法。
[３] Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントが配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、[１]又は[２]の方法。
[４] Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルが、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3bの塩基配列の310番目の塩基の位置の一塩基多型と関連しており、該位置の塩基がTである場合に、スプライシングバリアントの発現レベルが低下する、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５] 血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] プローブ又はプライマーを用いてmRNAを測定する、[５]の方法。
[７] 血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質を測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[８] Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質に対する抗体を用いてタンパク質を測定する、[７]の方法。
[９] [６]の方法に用いる、血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定するためのプローブ又はプライマーであるヌクレオチド。
[１０] [８]の方法に用いる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントに対する抗体。
[１１] 配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアント。
[１２] [１１]のスプライシングバリアントをコードするDNA又はRNAである核酸。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-251488号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
Dlg1/SAP97遺伝子に新規なエキソンが挿入されることにより発現し得る新規スプライシングバリアントであるエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルは統合失調症の発現と関連している。従って、被験体におけるエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定することにより、統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。すなわち、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが正常に発現する場合、統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクは低いが、エキソン挿入スプライシングバリアントの発現レベルが低いと統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクが高くなる。
ヒトDlg1/SAP97遺伝子の遺伝子構造と解析したSNPsの位置を示す図である。 ヒトDlg1/SAP97のスプライシングバリアントを示す図である。既知のスプライシングバリアントを transcript variant１〜5で示し、新規に見出されたスプライシングバリアントをnewで示す。新たなスプライシングバリアントは、エキソン3bを含み、終始コドンが出現する。 新規なエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントとDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型との関係を示す図である。新規エキソン(exon 3b)内に図２に示したSNP IV-4が存在する。アミノ酸置換をともなうSNPであるが、スプライシングの選択自体にも影響をあたえるESEのコンセンサスが変化する。その結果、アリルが新規バリアントの発現量を規定する。 一塩基多型と死後脳におけるDlg1/SAP97遺伝子の発現の関係を示す図である。 死後脳におけるSAP97 exon 3b (+)/exon 3b (-)比を示す図である。 Dlg1/SAP97 エキソン3b(+)及びエキソン3b(-)のmRNA組織分布（アガロース電気泳動結果）を示す図である。 Dlg1/SAP97遺伝子SNPsの連鎖不平衡解析の結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、ヒトDlg1/SAP97(synapse-associated protein 97)遺伝子に、新規なエキソンが挿入されることにより、発現するスプライシングバリアントを分析し、統合失調症の発症のリスクを評価、判定するための検査を行い、統合失調症の発症のリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。評価、判定とは予測ともいう。また、また、統合失調症の悪性化のリスクを評価、判定するための検査を行い、統合失調症の発症のリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。さらに、統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクを評価、判定するための検査を行い、統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。本発明において、統合失調症のリスクは、統合失調症を発症するリスク、統合失調症が悪性化するリスク、及び統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクを含む。
ヒトDlg1/SAP97遺伝子は、alpha-amino-3-hydroxy- 5-methyl isoxazole- 4-propionate (AMPA)、カイニン酸、NMDA型グルタミン酸受容体及びその他のシナプスタンパク質のサブユニットと相互作用することが報告されている遺伝子である。
統合失調症は、幻覚や妄想を主症状とする代表的な精神疾患であり、認知機能等の精神機能に影響し、認知機能障害等の精神機能障害が生じる。統合失調症の臨床診断は、例えば、DSM-IVに基づいて行われる。
ヒトDlg1/SAP97遺伝子に、新規なエキソンが挿入されることにより、発現するスプライシングバリアントの発現レベルは、ヒトDlg1/SAP97遺伝子の一塩基多型（SNPs）と関連している。ヒトDlg1/SAP97遺伝子の遺伝子構造と一塩基多型(SNPs)の位置を図１に示す。図１において、Exon 3bと記載された丸印は遺伝子上流の遺伝子調節配列とスプライシングサイレンサー配列の位置を表し、ボックスで表された部位はエキソンを示している。このうち、点が付されたボックスは非翻訳領域を示し、線（縦線、横線、斜線）が付いている部分はドメインコード領域を示す。図１において、エキソンとイントロンのサイズ(塩基数)を数字で示す。解析したSNPsは、IV-1: rs13064360、IV-2: rs113174552、IV-3: rs147083146、IV-4: rs3915512、IV-5: rs338213、I-3: rs9843659で表される。ここで、「rsXXXXXX（Ｘは任意の数字）」は、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のSNPデータベース(dbSNP BUILD137)のリファレンス番号であるrs番号を示す。
本発明において、統合失調症を発症するリスク等を判定するために用いるスプライシングバリアントは、図１のヒトDlg1/SAP97遺伝子において、エキソン3aと4の間にエキソン3b(95 bp)が挿入されることにより発現するスプライシングバリアントである。エキソン3a及び4はDlg1/SAP97タンパク質においてL27ドメインを形成しているが、エキソン3aと4の間にエキソン3bが挿入されると、終始コドンが出現し、本来のL27ドメインが中断され、C末端側に特異的な15アミノ酸を含む、全長65アミノ酸からなるペプチドが生じる。本発明においては、この65アミノ酸からなるペプチドを検出することにより、統合失調症を発症するリスク等を判定する。図２に、新たに見出されたエキソン3aと４の間にエキソン3b(95 bp)が挿入されることにより発現するスプライシングバリアント及び既に報告されている５つのスプライシングバリアント（transcript variant１〜５）の構造を示す。新たに見出されたエキソン3bが挿入されることにより発現するスプライシングバリアントをエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントという。
該スプライシングバリアントの発現は、Dlg1/SAP97遺伝子の特定の一塩基多型と関連している。
本発明者らは、Dlg1/SAP97遺伝子の複数の一塩基多型（SNPs）が統合失調症と関連していることを見出した。複数の一塩基多型として、図１に記載のIV-1: rs13064360、IV-2: rs113174552、IV-3: rs147083146、IV-4: rs3915512、IV-5: rs338213、I-3: rs9843659が挙げられる。このうち、IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がスプライシングバリアントの発現レベルと関連している。すなわち、IV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位の塩基により、前記スプライシングバリアントの発現レベルが変化する。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型は、エキソン3aと4の間のエキソン3b中のexonic splicing enhancer(ESE)のコンセンサス配列部分にある。
図３にエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントと遺伝子多型との関係を示す。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型は、Dlg1/SAP97遺伝子に挿入されるエキソン3bの塩基配列の310番目の塩基の位置にあり、その一塩基多型部位の塩基はA又はTである。図３Aは、一塩基多型部位の塩基がAの場合を示し、一塩基多型部位を含むトリプレットコドンはAAAとなり発現するペプチドのアミノ酸はリジン（K）となる（Kアレル）。配列番号１にDlg1/SAP97に挿入されるエキソン3bのKアレルの塩基配列を示し、配列番号２にエキソン3bを含む65アミノ酸からなる推定全アミノ酸配列（Kアレル）を示す。図３Bは、一塩基多型部位の塩基がTの場合を示し、一塩基多型部位を含むトリプレットコドンはAUAとなり発現するペプチドのアミノ酸はイソロイシン（I）となる（Iアレル）。配列番号３にDlg1/SAP97に挿入されるエキソン3bのIアレルの塩基配列を示し、配列番号４にエキソン3bを含む65アミノ酸からなる推定全アミノ酸配列（Iアレル）を示す。一塩基多型により、配列番号２で表される65アミノ酸からなるアミノ酸配列の64番目のアミノ酸はリジン（K）となり、配列番号４で表される65アミノ酸からなるアミノ酸配列の64番目のアミノ酸はイソロイシン（I）となる。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がAの場合（Kアレル）、エキソン3bがエキソン3aと4の間に挿入され、転写産物が翻訳されると終始コドンの出現により、本来のDlg1/SPA97タンパク質のN末端側65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが生じる。しかしながら、IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がTの場合（Iアレル）、エキソン3b内にあるexonic splicing enhancer(ESE)のコンセンサス配列が変わり、エキソン3bはスキップされやすくなり、正常なスプライシングが起こり、65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントは生じにくくなる。本願発明においては、配列番号２で表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなるエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントを測定すればよい。
IV-4: rs3915512で表される一塩基多型と統合失調症との間に関連があり、その結果、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルと統合失調症と間に関連が生じる。ここでDlg/SAP97遺伝子の一塩基多型と統合失調症が関連している、あるいはエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルが関連しているとは、一塩基多型のアレルと該一塩基多型を保持する被験体が統合失調症を発症するリスク、統合失調症が悪性化するリスク、あるいは統合失調症による認知機能障害等の精神機能障害を起こすリスクが統計学的に関連していることをいい、あるいはエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルと被験体が統合失調症を発症するリスク、あるいは統合失調症による認知機能障害等の精神機能障害を起こすリスクが統計学的に関連していることをいう。すなわち、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが正常に発現する場合、統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクは低いが、エキソン挿入スプライシングバリアントの発現レベルが低いと統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクが高くなる。
本発明においては、被験体の生体試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントレベルを測定し、レベルにより、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクを判定する。
本発明を適用することのできる被験体は、統合失調症を発症しているか否かが判明していない被験体又は統合失調症を発症していることが判明している被験体である。前者については、被験体が統合失調症を発症するリスク、統合失調症による認知機能等の低下のリスクを判定することができ、後者については統合失調症が悪化するリスク、統合失調症による認知機能等の低下のリスク、あるいは治療効果の判定を行うことができる。被験体の年齢は限定されない。また、統合失調症には、発症年齢が17歳以下の児童期、青年期で発症する若年発症統合失調症と18歳以上で発症する統合失調症があるが、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントを発現レベルによりいずれの統合失調症についても判定することができる。
生体試料として、全血、血清、血漿等の血液試料を用いることができ、末梢血を採取し、試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアント発現レベルを測定すればよい。
発現レベルの測定は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントのmRNAレベルを測定してもよいし、エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質を測定してもよい。
mRNAレベルの測定には、生体試料として細胞を含む全血を用い血球細胞中のmRNAを測定すればよい。エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質の測定には、全血、血清、血漿を用いるのが好ましい。
mRNAを測定する場合、被験体の生体試料から全RNAを抽出する。全RNAの抽出は、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等の公知の方法により行うことができる。mRNAの測定は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントのmRNAの塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて発現の程度を測定すればよい。発現の程度は、マイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法、定量しようとする遺伝子又はその断片をターゲットとした定量PCR法等で測定することができる。例えば、公知の定量PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、Taqman PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、MAGE法(Micro-analysis of Gene Expression)（特開2000-232888号）等が挙げられる。該mRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーを使用し、上記方法を用いて、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントmRNAの量を測定すればよい。測定に用いるプローブ又はプライマーの塩基長は、10〜50bp、好ましくは15〜25bpである。DNAマイクロアレイ（DNAチップ）は、前記遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをガラス板、石英板等の適当な基板上に固定化することにより作製することができる。固定化は公知の方法で行うことができる。本発明は、スプライシングバリアントのmRNAを測定するためのプローブ又はプライマーであるヌクレオチドも包含する。
エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントタンパク質の測定は、生体試料中に存在する翻訳されたタンパク質を測定すればよい。タンパク質の定量はエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントに対する抗体を用いた免疫測定法、質量分析等により行うことができるが抗体を用いた方法が好ましい。抗体は公知の方法により、作製することができ、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も用いることができる。免疫測定法としては、イムノクロマトグラフィー法、ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)法、ラテックスビーズ凝集法、ラジオイムノアッセイ等の免疫凝集法などが挙げられるが、これらには限定されない。抗体は必要に応じて、酵素、蛍光物質、不溶性担体粒子、放射性同位元素等により標識して用いるが、抗体の標識は公知の方法により行うことができる。
本発明は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントタンパク質に特異的に結合する抗エキソン挿入SAP97スプライシングバリアント抗体も含む。
上記方法で、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定した場合に、発現レベルが低い場合、被験体は統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクが高いと判定することができ、発現レベルが高い場合、統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクが低いと判定することができる。ここで、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルが低いとは、統合失調症を発症していない健常者に比較して低いことをいい、発現レベルが高いとは、統合失調症を発症していない健常者に比較して高いことをいう。例えば、あらかじめ健常者の生体試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定し、その値をカットオフレベルとして比較することができる。
本発明は、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントタンパク質を包含する。エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質は、配列番号２に表す65アミノ酸のアミノ酸配列からなる。また、配列番号２に表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１若しくは２個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質であるタンパク質もエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントに包含される。また、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。本発明は、さらに上記エキソン挿入スプライシングバリアントタンパク質をコードするDNA及びRMAである核酸も包含する。
本発明はさらに、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定するための、少なくともmRNAレベルを測定するプローブ又はプライマーを含むキット、あるいは少なくとも抗エキソン挿入SAP97スプライシングバリアント抗体を含むキットを包含する。該キットにより、生体試料中のエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現レベルを測定し、被験体の統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。
なお、上記の一塩基多型を解析することによっても、統合失調症を発症するリスク等を判定することができる。
一塩基多型は、一塩基多型部位の塩基の種類、すなわちアレルを決定することにより分析することができ、１対の染色体上の一方の染色体について決定する場合も、両方の染色体について決定する場合も含まれ、両方の染色体について決定することにより、一塩基多型部位においてホモ接合性かヘテロ接合性かの遺伝子型を決定することができる。被験体から単離した試料に含まれる特定のアレルに対立する各々のアレルを検出することにより、遺伝子型を決定することができる。一方のアレルのみが検出された場合は当該アレルをホモに有するホモ接合性であり、２つのアレルが検出された場合には該２つのアレルをヘテロに有するヘテロ接合性である。
本発明においては、Dlg/SAP97遺伝子の一塩基多型部位における変異を検出することにより、被験体の統合失調症の発症のリスク、統合失調症の悪性化のリスク及び統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。
本発明の方法により、統合失調症の発症のリスクが高いと評価、判定され、あるいは、統合失調症による認知機能等の精神機能の低下のリスクが高いと判定された被験体に対して、適切な時期に抗精神病薬を投与し、統合失調症の発症を予防し、あるいは既に統合失調症に罹患している被験体の統合失調症を治療し、認知機能等の精神機能を改善することが可能である。治療に用いる抗精神病薬として、クロルブロマジン、レボメブロマジン、チオリダジン、フルフェナジン等の型抗精神病薬、リスペリドン、ペロスピロン、オランザピン、クエチアピン、アリピプラゾール等の非定型抗精神病薬が挙げられる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
1. 遺伝子関連解析
ケース・コントロール解析に対して、日本人の統合失調症患者2012人(男性1111人: 47.2±14.1歳, 女性901人: 49.2±14.7歳)及び日本人の健常者2170人(男性889人: 39.2±13.8歳, 女性1281人: 44.6±14.1歳)から採取した末梢血由来のgenomic DNAを解析対象とした。伝達不平衡試験は、ケース・コントロール解析にも含まれている日本人の統合失調症患者(男性124人, 女性87人)、親401人を解析対象とした。なお、臨床診断はDSM-IVに基づいて行われた。
SNP解析
これまでのヒトDlg1/SAP97の小規模SNP解析において統合失調症と有意な関連が見出されたSNP I-3: rs9843659の他に、Dlg1/SAP97遺伝子の構造上、遺伝子の上流10 kbを含んだ領域において、遺伝子発現に影響を与えると考えられるエンハンサー領域、インスレーター機能、及びスプライシングに関係する配列に関与する可能性のあるSNPsを選択した。解析したSNPsは、IV-1: rs13064360、IV-2: rs113174552、IV-3: rs147083146、IV-4: rs3915512、IV-5: rs338213、I-3: rs9843659にそれぞれ相当する。TaqMan SNP Genotyping Assay method (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて、これらのSNPsのgenotypeを調べた。得られたPCR産物をTA cloning後にオートシーケンサーを用いて塩基配列を確認した。
一部のSNPについては、SAP97遺伝子の脳内発現への影響を検討した。
統計学的解析
ケース・コントロール解析では、Fisherの正確検定、多重検定補正、及びハーディ・ワインベルグ平衡(HWE)からの逸脱を評価するカイ二乗検定にPLINK 1.07 software package (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/)を用いた。Linkage disequilibrium (LD) ブロックの作成と伝達不平衡試験にHaploview (ver. 4.2) (www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)、ハプロタイプ相関分析にUNPHASED (http://unphased.sourceforge.net/)を用いた。メタ解析にはRプロジェクトプログラム(http://www.r-project.org/)のCase-control And TDT Meta-Analysis Packageを使用した。
2. 死後脳解析
対象は、統合失調症34例（うち発症年齢17歳以下が8例、18歳以上が26例）、双極性障害33例（うち発症年齢17歳以下が7例、18歳以上が26例）、非精神疾患対照群が34例である（理化学研究所との共同研究）。
TaqMan Real Time PCR 法(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて個々の死後脳組織におけるDlg1/SAP97遺伝子のmRNAレベルでの発現を検出した。本発明者が発見した新規エキソン3bを含む転写産物と含まない転写産物の両者を定量解析した。また、同エキソンに存在するSNPのジェノタイプを個別的にジェノミックDNA検体を用いて同定した。
結果
Dlg1/SAP97の統合失調症における遺伝子関連解析（ケース・コントロール解析）を行った。健常者における4 SNPsすべてにおいて、HWEからの有意な逸脱は認められなかった。疾患患者においては、SNP IV-4とI-3でHWEが有意に逸脱していた。SNP IV-4においてのみ、genotype頻度とallelic頻度で有意差があった。今回のサンプルでは有意差が認められなかったが、先行研究において疾患との関連が示唆されていたSNP I-3については、家系サンプルにおける伝達不平衡試験も含めてメタ解析を行ったところ、有意差が認められた。
疾患群と健常者群をそれぞれ性別で分けて比較したところ、genotype頻度ではSNP IV-1、IV-4及びI-3の女性に、allele頻度ではSNP IV-1とIV-4の女性において有意な差が認められた。SNP IV-1及びIV-4のgenotype頻度、SNP IV-1のallele頻度では多重検定においても有意差が認められた。
疾患群を発症年齢が17歳以下と18歳以上に分けて健常者群と比較した。その結果、SNP IV-1及びIV-4の発症が18歳以上のグループでのみ、有意な差が認められた。SNP IV-4のallele頻度では多重検定においても有意差が認められた。
個々のSNPの結果から連鎖不平衡の検定を行い、SNP IV-4とIV-5が1つのハプロタイプブロックを形成している可能性があることがわかった。さらに、ハプロタイプ相関分析を行い、それぞれSNPsの間での相関を調べた。アレルの組み合わせが５％以上組み合わせのみ採用されている。その結果、LDブロックではハプロタイプブロックを形成していないと考えられるSNP IV-1とIV-4で、2つのアレルの組み合わせ(C-AとC-T)全体で見たときに有意な差が認められた。2つの組み合わせをそれぞれ見たとき、よりP値が低かったC-Tで多重検定を行っても有意な差は認められた。SNP IV-4とIV-5の間では3つの組み合わせ(A-A, A-G及びT-G)が全体で５%以上となり、3つの全体でのP値が0.05以下となった。そのうち最もP値が低かったT-Gにおいて多重検定でも有意な差が認められた。さらに、LDブロックでr2の高いDlg1/SNP IV-4とI-3の組み合わせで分析したところ、A-Cの組み合わせにおいて多重検定でも有意な差が認められた。
現在、精神疾患に関してGWAS (Genome-wide association)とCNV (copy number variants)の研究から得られた情報が非常に注目されている。Dlg1/SAP97が存在している3q29では欠失が知られており、統合失調症とのオッズ比は63.0となっている(Gejman PV et al., Annu Rev Genet (2011) 12:121-144)。稀なCNVで非特異的なリスク因子ではあるが、強いオッズ比が出ている。したがって、Dlg1/SAP97をコードする領域はCNVでも統合失調症の関連が示唆される。本解析では、ケース・コントロール解析による疾患に関連するSNPsの探索に加えて、複数のSNPsの組み合わせによる疾患への影響も検討した。本実施例の大規模サンプルで行った、疾患との関連が見られたSNP IV-4は、exonic splicing enhancer (ESE)と考えられる配列上にある。SNP IV-4はエキソン3aと4の間のイントロンにあり、exonic splicing enhancer (ESE)のコンセンサスをみたす配列となるアレルが、統合失調症の罹患プロテクティブアレルとなることが統計的に有意に示された。
本発明者らは、ヒト死後脳由来cDNAからエキソン3bを新規エキソンとして同定し、選択的スプライシングによってこのエキソンを含む転写産物の塩基配列と推定されるタンパク質の一次構造を決定した。エキソン3aに引き続いてエキソン3bが挿入された転写産物が翻訳されると、終始コドンの出現により本来のDlg1/SAP97タンパク質のN末端側65アミノ酸配列のみを有する新規バリアントタンパク質が生じる。さらに、このエキソン3b内に存在するSNPIV-4のアレルの選択によりアミノ酸置換が生じうるとともに、ESEのコンセンサスのちがいにより選択的スプライシングの調節にも決定的な影響を与える（図３）。図３AはIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位がAである場合を示し、対応するアミノ酸はリジン（K）となる。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がAの場合（Kアレル）、エキソン3bがエキソン3aと4の間に挿入され、転写産物が翻訳されると終始コドンの出現により、本来のDlg1/SPA97タンパク質のN末端側65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが生じる。図３BはIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位がTである場合を示し、対応するアミノ酸はイソロイシン（I）となる。IV-4: rs3915512で表される一塩基多型がTの場合（Iアレル）、exonic splicing enhancer(ESE)のコンセンサス配列を満たさなくなると、エキソン3bはスキップされやすくなり、エキソン3aと4が接続する通常のスプライシングが起こり、65アミノ酸配列のみを有するエキソン挿入SAP97スプライシングバリアントは生じにくい。図３Aの場合をエキソン3bが発現するという意味でExon 3b(+)といい、図３Bの場合は、エキソン3bがスキップされ発現しないという意味でExon 3b(-)という。
実際に死後脳の発現とアレルに強い関係を見出した。死後脳組織における統合失調症のDlg1/SAP97遺伝子の発現を検討し、対照群に比較して統合失調症早期発症群においてexon 3bを含む転写産物の低下を見出した。図４は、一塩基多型と死後脳におけるDlg1/SAP97遺伝子の発現の関係を示し、ヒト死後の組織のDlg1/SAP97遺伝子の発現をRT-PCRにより測定した結果である。図４中、横軸はExon 3b (-)の発現（相対値）を示し、縦軸はExon 3b (+)の発現（相対値）を示す。Exon 3b(+)の発現の場合に、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントが発現する。図４中、■はIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位がA/Aである場合、◆はT/Aである場合、▲はT/Tである場合を示す。図４に示すように、アレルがA/A又はT/Aの場合、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現が増大する。このことは、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現がIV-4: rs3915512で表される一塩基多型部位の塩基と関連していることを示す。
健常対照群死後脳のうちの遺伝子型がA/Tヘテロ群の、exon3b (+) mRNAの配列比を、TAクローニング法をもちいて解析した結果は表１の通りであった。
Figure 2015083685
この結果は、ヘテロ群では、脳で発現するexon3b (+) mRNAの由来染色体がヒトによって異なることを意味する（T由来の発現の全くないヒトもいれば、A/Tがほぼ等分で発現しているヒトもいる）。
図５は、死後脳におけるSAP97 exon 3b (+)の転写産物の発現量を示す。縦軸はSAP97 exon 3b (+)の転写産物の発現量を示し、横軸はコントロール群、早期発症統合失調症群、非早期発症統合失調症群、早期発症双極性障害群、非早期発症双極性障害群のそれぞれの遺伝子型(A/A、T/A、T/T)を示す。図５に示すように、T/T型では、exon 3bを含むバリアントの発現が低下している。この結果は、アレルがA/A又はT/Aの場合、エキソン挿入SAP97スプライシングバリアントの発現が増大するという図４の結果に合致している。
さらに、各組織におけるエキソン3b(+)及びエキソン3b(-)の発現をRT-PCRにより調べた。図６にmRNA組織分布（アガロース電気泳動結果）を示す。
図７には、Dlg1/SAP97遺伝子SNPsの連鎖不平衡解析の結果を示す。Haploview を用いて4 SNPsでのLDブロックを作成した。図７Aは4 SNPsでのD'を示し、図７Bは4 SNPsでのr2を示す。
エキソン3aと4はL27ドメインを形成し、SAP97はL27ドメインを介して重合することが報告されているため、アレルの違いがsplicingに影響し、SAP97タンパク質の発現・構造や、グルタミン酸受容体との相互作用に変化が生ずることから、統合失調症の発症及び脆弱性にかかわる可能性が示唆される。
本発明の方法により、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクを評価、判定することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

  1. Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルを測定することを含む統合失調症のリスクを判定する方法であって、前記スプライシングバリアントの発現レベルが健常者に比較して低い場合に、統合失調症のリスクが高いと判定し、発現レベルが健常者に比較して高い場合に、統合失調症のリスクが低いと判定する方法。
  2. 統合失調症のリスクが、被験体の統合失調症を発症するリスク、統合失調症の悪性化のリスク、又は統合失調症による認知機能等の低下のリスクである、請求項１記載の方法。
  3. Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントが配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントの発現レベルが、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3bの塩基配列の310番目の塩基の位置の一塩基多型と関連しており、該位置の塩基がTである場合に、スプライシングバリアントの発現レベルが低下する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. プローブ又はプライマーを用いてmRNAを測定する、請求項５記載の方法。
  7. 血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質を測定することにより、前記スプライシングバリアントの発現レベルを測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  8. Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントタンパク質に対する抗体を用いてタンパク質を測定する、請求項７記載の方法。
  9. 請求項６に記載の方法に用いる、血液試料中の、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントのmRNAを測定するためのプローブ又はプライマーであるヌクレオチド。
  10. 請求項８記載の方法に用いる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアントに対する抗体。
  11. 配列番号２に表される65アミノ酸のアミノ酸配列からなる、Dlg1/SAP97遺伝子のエキソン3aとエキソン4の間にエキソン3bが挿入することにより発現するスプライシングバリアント。
  12. 請求項１１に記載のスプライシングバリアントをコードするDNA又はRNAである核酸。
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