MX2008016524A - Biomarcadores para la progresion de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Biomarcadores para la progresion de la enfermedad de alzheimer.

Info

Publication number
MX2008016524A
MX2008016524A MX2008016524A MX2008016524A MX2008016524A MX 2008016524 A MX2008016524 A MX 2008016524A MX 2008016524 A MX2008016524 A MX 2008016524A MX 2008016524 A MX2008016524 A MX 2008016524A MX 2008016524 A MX2008016524 A MX 2008016524A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
disease
alzheimer
lrrk2
genotype
progress
Prior art date
Application number
MX2008016524A
Other languages
English (en)
Inventor
Graeme Bilbe
Yunsheng He
Joanne Meyer
Baltazar Gomez-Mancilla
Giorgio Rovelli
Rainer R Kuhn
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of MX2008016524A publication Critical patent/MX2008016524A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Se describe el polimorfismo genético de LRRK2 (cinasa 2 repetitiva rica en leucina)-T1602S se asocia significativamente a la conversión del deterioro cognoscitivo moderado (MCI) a la enfermedad de Alzheimer (AD), en los pacientes con el genotipo TT que están en mayor riesgo de progresar a la enfermedad de Alzheimer. El LRRK2-T2352 también mostró una tendencia a la conversión a la enfermedad de Alzheimer, en los pacientes con el genotipo CC que tienden a progresar a la enfermedad de Alzheimer. Similar al alelo APOE-E4, en presencia de una variante de BuChE-K, un LRRK2-T1602S y un LRRK2-T2352 mostraron una mayor asociación al índice de conversión del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer. En otro estudio en los pacientes de la enfermedad de Alzheimer tratados con placebo, LRRK2-T1602S y LRRK2-T2352 mostraron una misma tendencia de asociación. Los pacientes con enfermedad de Alzheimer con el genotipo TT de LRRK2-T1602S o con el genotipo CC de LRRK2-T2352 tendieron a disminuir más rápidamente el funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses, especialmente en presencia de una variante de BuChE-K. La asociación entre los dos polimorfismos de LRRK2 y el progreso de la enfermedad de Alzheimer mostró que LRRK2 puede desempeñar una función en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, especialmente en el progreso de la enfermedad, y que los polimorfismos de LRRK2 se pueden utilizar como marcadores biológicos de este progreso.

Description

BIOMARCADORES PARA LA PROGRESION DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Campo de la Invención Esta invención se refiere generalmente a la prueba analítica de muestras de tejido in vitro, y más particularmente a los aspectos de polimorfismos genéticos del gen de la cinasa 2 repetitiva rica en leucina (LRRK2). Antecedentes de la Invención El diagnóstico específico de la terapia (a.k.a., Theranostics) es un campo de la tecnología médica emergente, que proporciona las pruebas útiles para diagnosticar una enfermedad, elegir el régimen de tratamiento correcto y supervisar la respuesta de un sujeto. Es decir, los Theranostics son útiles para predecir y determinar la respuesta al fármaco en sujetos individuales, es decir, medicina individualizada. Las pruebas de Theranostic son también útiles para seleccionar los sujetos para los tratamientos que son particularmente probables beneficiosos del tratamiento o proporcionar una indicación temprana y objetiva de la eficacia del tratamiento en sujetos individuales, para poder alterar el tratamiento con un mínimo de retraso. El progreso en farmacogenéticos, que establecen correlaciones entre las respuestas a fármacos específicos y el perfil genético de pacientes individuales, es fundamental para el desarrollo de nuevos procesos Theranostics. Como tal, hay una necesidad en la técnica de la evaluación de las variaciones de paciente-a-paciente en la secuencia del gen y la expresión del gen. Una forma común del perfil genético se apoya en la identificación de las variaciones de la secuencia del ADN llamadas polimorfismos del nucleótido simple ("SNPs"), que son un tipo de mutación genética que conduce a la variación de paciente-a-paciente en respuesta individual del fármaco. Por consiguiente hay una necesidad en la técnica de identificar y caracterizar mutaciones genéticas, tales como SNPs, que son útiles para identificar los genotipos de los sujetos asociados a la sensibilidad del fármaco, a efectos secundarios, o a la dosis óptima. Breve Descripción de la Invención Los polimorfismos del gen de la cinasa 2 de repetitiva rica en leucina (LRRK2) se pueden utilizar como biomarcadores de la progresión de la enfermedad de Alzheimer (AD). En particular, las mutaciones del gen de LRRK2 que causan un cambio en la proteína (tal como T1602S y T2352, en particular T2352M) pueden tener un impacto en la enfermedad de Alzheimer y se pueden utilizar como un biomarcador de la progresión de la enfermedad de Alzheimer y edad-de-inicio de la enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, la invención proporciona el uso de un agente de modulación de LRRK2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer a una población de pacientes seleccionada. Se selecciona la población de pacientes en base de los polimorfismos en el gen de LRRK2 que son indicativos de la progresión del deterioro cognoscitivo moderado (MCI) a la enfermedad de Alzheimer. En una modalidad, el agente de modulación de LRRK2 es un compuesto heterocíclico que retarda la progresión del paciente del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer. En otra modalidad, el agente de modulación de LRRK2 es un compuesto heterocíclico que retarda la progresión del paciente de la enfermedad de Alzheimer moderada a la enfermedad de Alzheimer severa. En otra modalidad, el polimorfismo en el gen de LRRK2 puede ser T1602S o T2352. La invención también proporciona los métodos para predecir la progresión de la enfermedad de Alzheimer o edad-de-inicio de la enfermedad de Alzheimer. Breve Descripción de los Dibujos La figura del dibujo representa las modalidades preferidas a modo de ejemplo, pero no a forma de limitante. La figura 1 es una representación de la estructura de la proteína de LRRK2 y localización de dos polimorfismos de LRRK2 comunes (T1602S y T2352M). Descripción Detallada de la Invención El progreso a los datos de la enfermedad de Alzheimer de un estudio de 3-4 años en pacientes con deterioro cognoscitivo moderado (MCI) fue utilizado para investigar el efecto de los dos polimorfismos de LRRK2 comunes, T1602S y T2352, en el índice de progresión a la enfermedad de Alzheimer. Para verificar los resultados, probamos además la correlación entre los dos polimorfismos de LRRK2 comunes y el funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses en los pacientes con la enfermedad de Alzheimer tratados con alistados en otro estudio. Encontramos que LRRK2-T1602S fue asociado perceptiblemente a la conversión del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer. Los pacientes con deterioro cognoscitivo moderado con genotipo de TT estaban en mayor riesgo de progresar a la enfermedad de Alzheimer. El LRRK2-T2352 también mostró una tendencia de conversión a la enfermedad de Alzheimer. Los pacientes con deterioro cognoscitivo moderado con genotipo de CC tendieron a progresar a la enfermedad de Alzheimer. Similar al alelo de APOE-E4, en presencia de una variante de BuChE-K, LRRK2-T1602S y LRRK2-T2352 mostraron una mayor asociación con el índice de conversión del deterioro cognoscitivo moderado a AD. En el estudio con los pacientes con enfermedad de Alzheimer tratados con placebo, LRRK2-T1602S y LRRK2-T2352 mostraron una misma tendencia de la asociación observada en el estudio del deterioro cognoscitivo moderado. Los pacientes de la enfermedad de Alzheimer con el genotipo de TT de LRRK2-T1602S o del genotipo de CC de LRRK2-T2352 tendieron a declinar más rápidamente en su funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses, especialmente en la presencia de una variante de BuChE-K. La asociación entre los dos polimorfismos de LRRK2 comunes y la progresión de la enfermedad de Alzheimer muestra que LRRK2 puede desempeñar un papel en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, especialmente la progresión de la enfermedad y donde los polimorfismos de LRRK2 se pueden utilizar como biomarcadores de esta progresión. El gen de LRKK2 humano (SEC ID NO:1) está situado en el sitio PARK8 en el cromosoma 12q 12. El gen tiene múltiples dominios. La proteína de LRKK2 (SEC ID NO:2) es un receptor que interactúa con la cinasa de proteína (RIP). La mutación G2019S es la mutación patógena más común de LRRK2 (5-6% de dominante autosomal y ~1% de casos esporádicos de inicio tardío). La mutación de G2019S está situada en el dominio de la cinasa del gen de LRKK2. La fig. 1 muestra la estructura de la proteína LRRK2 y la localización de dos otros polimorfismos comunes. Nos centramos en los polimorfismos T1602S y T2352M, porque (1) son polimorfismos comunes; y (2) son polimorfismos antisentido. La frecuencia de alelo menor es como sigue: T1602S = 30%; T2352M = 34%. El cambio del aminoácido causado por los polimorfismos es como sigue: T1602S - Thr - > Ser (1602 A>T); T2352M - Thr - > Met (2352 C>T). Según análisis del desequilibrio de acoplamiento (LD), T1602S y T2352M están en LD (D' = 0.979) fuerte. Debe apreciarse que ciertos aspectos, modos, modalidades, variaciones y características de la invención están descritos abajo en varios niveles de detalle para proporcionar una comprensión substancial de la presente invención. Los varios aspectos de la presente invención se relacionan con los métodos diagnóstico/Theranostic y kits que utilizan las mutaciones de LRRK2 de la invención para identificar a individuos predispuestos a la enfermedad o para clasificar a individuos con respecto a la sensibilidad del fármaco, efectos secundarios, o dosis óptima del fármaco. En otros aspectos, la invención proporciona los métodos para la validación del compuesto y un sistema informático para almacenar y analizar los datos relacionados a las mutaciones de LRRK2 de la invención. Por consiguiente, varias modalidades particulares ilustran estos aspectos siguientes. Definiciones. Las definiciones de ciertos términos según lo utilizado en esta especificación se proporcionan abajo. Las definiciones de otros términos se pueden encontrar en el glosario proporcionado por U.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project (http://www.ornl.gov/sci/ techresources/Human Genome/glossary/). Al practicar la presente invención, muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología y ADN recombinante se utilizan. Estas técnicas son bien conocidas y se explican en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-MI, Ausubel, ed. (1997); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I y II, Glover D, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Clonlng; the series, Methods in Enzymol. (Academic Press, Inc, 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); and Methods in Enzymology, Vols. 154 y 155, Wu & Grossman, and Wu, eds., respectivamente. Según lo utilizado adjunto, el término "alelo" significa una forma particular de un gen o de una secuencia de ADN en una localización cromosómica específica (sitio). Según lo utilizado adjunto, el término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quiméricos, y los fragmentos del anticuerpo biológicos funcionales son suficientes para el enlace del fragmento de anticuerpo a la proteína. Los anticuerpos se pueden utilizar en análisis para determinar la presencia de proteínas y péptidos variables donde los polimorfismos genéticos de la invención están en la región de codificación del gen. Según lo utilizado adjunto, el término "respuesta clínica" significa cualquiera o todo de lo siguiente: una medida cuantitativa de la respuesta, de ninguna respuesta, y de una respuesta adversa • (es decir, efectos secundarios). Según lo utilizado adjunto, el término "ensayo clínico" significa cualquier estudio de investigación diseñado para recoger datos clínicos sobre respuestas a un tratamiento particular, e incluye pero no se limita a, ensayos clínicos de fase I, de fase II y de fase III. Los métodos estándares se utilizan para definir la población de pacientes y para alistar a los sujetos. Según lo utilizado adjunto, el término "cantidad efectiva" de un compuesto es una cantidad suficiente alcanzar un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, por ejemplo, una cantidad que resulta en la prevención o una disminución de los síntomas asociados a una enfermedad que se esté tratando, por ejemplo, las enfermedades asociadas a los polinucleótidos mutantes de LRRK2 y a los polipéptidos mutantes identificados adjunto (particularmente la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson). La cantidad de compuesto administrada al sujeto dependerá del tipo y de la severidad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos. También dependerá del grado, severidad y del tipo de enfermedad. El experto en la técnica podrá determinar dosificaciones apropiadas dependiendo de éstos y de otros factores. Generalmente, una cantidad efectiva de los compuestos de la presente invención, suficiente para alcanzar un efecto terapéutico o profiláctico, va de aproximadamente 0.000001 mg por kilogramo de peso corporal por día a aproximadamente 10,000 mg por kilogramo de peso corporal por día. Preferiblemente, los intervalos de dosificación son de aproximadamente 0.0001 mg por kilogramo de peso corporal por día a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. Los compuestos de la presente invención se pueden también administrar conjuntamente entre sí, o con uno o más compuestos terapéuticos adicionales. Según lo utilizado adjunto, la "expresión" incluye pero no se limita a uno o más de lo siguiente: transcripción del gen en el precursor de mARN; empalmar u otro proceso del precursor de mARN para producir mARN maduro; estabilidad de mARN; traducción del mARN maduro en la proteína (incluyendo el uso del codón y disponibilidad de tARN); y glicosilación y/o otras modificaciones del producto de traducción, si es requerido para la expresión y función apropiadas. Según lo utilizado adjunto, el término "gen" significa un segmento de ADN que contiene toda la información para la biosíntesis regulada de un producto de ARN, incluyendo promotores, exones, intrones, y otras regiones sin traducir que controlan la expresión. Según lo utilizado adjunto, el término "genotipo" significa una secuencia 5 ' a 3 ' sin fase de pares de nucleótido encontrados en uno o más sitios polimórficos en un lugar geométrico en un par de cromosomas homólogos en un individuo. Según lo utilizado adjunto, el genotipo incluye un genotipo completo y/o un genotipo secundario.
Según lo utilizado adjunto, el término "sitio" significa una localización en un cromosoma o una molécula de ADN que corresponde a un gen o una característica física o fenotípica, en particular el gen de LRRK2.
Según lo utilizado adjunto, el término "agente de modulación de LRRK2" es cualquier compuesto que altera (por ejemplo, aumenta o disminuye) el nivel de expresión o el nivel de actividad biológica del polipéptido de LRRK2 comparado al nivel de expresión o al nivel de actividad biológica del polipéptido de LRRK2 en ausencia del agente de modulación de LRRK2. El agente de modulación de LRRK2 puede ser una molécula pequeña, polipéptido, carbohidrato, lípido, nucleótido, o una combinación de los mismos. El agente de modulación de LRRK2 puede ser un compuesto orgánico o un compuesto inorgánico. Según lo utilizado adjunto, el término "mutante" significa cualquier variación hereditaria del tipo silvestre que es el resultado de una mutación, por ejemplo, polimorfismo de un solo nucleótido. El término "mutante" se utiliza alternativamente con los términos "marcador", "biomarcador", y "blanco" a lo largo de la especificación.
Según lo utilizado adjunto, el término "afección médica" incluye, pero no se limita a, cualquiera afección o enfermedad manifestada como uno o más síntomas físicos y/o psicológicos para los cuales el tratamiento es deseable, e incluye enfermedades previa y nuevamente identificadas y otros trastornos. Según lo utilizado adjunto, el término "par del nucleótido" significa los nucleótidos encontrados en un sitio polimorfico en dos copias de un cromosoma de un individuo. Según lo utilizado adjunto, el término "sitio polimorfico" significa una posición dentro de un sitio en el cual por lo menos dos secuencias alternativas se encuentren en una población, el más frecuente de los cuales tenga una frecuencia no mayor de 99%. Según lo utilizado adjunto, el término "en fase" significa, cuando es aplicado a una secuencia de pares del nucleótido para dos o más sitios polimorficos en un lugar, se conoce la combinación de los nucleótidos presentes en estos sitios polimorficos en una sola copia del lugar. Según lo utilizado adjunto, el término "polimorfismo" significa cualquier variante de secuencia presente a una frecuencia de > 1% en una población. La variante de secuencia puede estar presente a una frecuencia perceptiblemente mayor que 1% tal como 5% o 10% o más. También, el término se puede utilizar para referir a la variación de secuencia observada en un individuo en un sitio polimórfico. Los polimorfismos incluyen sustituciones del nucleótido, inserciones, eliminaciones y microsatélites y pueden, pero no necesariamente, resultar en diferencias detectables en la expresión del gen o función de la proteína. Según lo utilizado adjunto, el término "polinucleótido" significa cualquier ARN o ADN, que puedan ser ARN o ADN sin modificar o modificados. Polinucleótidos incluye, sin limitación, ADN de uno y de doble-filamento, ADN que es una mezcla de regiones de un solo o doble filamento, ARN de un solo y doble filamento, ARN que es mezcla de regiones de un solo y doble filamento, y moléculas híbridas que abarcan el ADN y ARN que pueden ser de un solo-filamento o, más generalmente, de doble-filamento o una mezcla de regiones de un solo- y doble-filamento. Además, el polinucleótido refiere a regiones de triple-filamento que abarcan el ARN o ADN o ambos ARN y ADN. El término polinucleótido también incluye ADNs o ARNs que contienen una o más bases y ADNs o ARNs con estructuras modificadas para la estabilidad o por otras razones. Según lo utilizado adjunto, el término "polipéptido" significa cualquier polipéptido que abarca dos o más aminoácidos unidos el uno al otro por enlaces del péptido o enlaces del péptido modificado, es decir, isosteres del péptido. El polipéptido refiere a ambas cadenas cortas, referidas comúnmente como péptidos, glicopéptidos u oligómeros, y a cadenas más largas, designadas generalmente como las proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos el gen codificado. Los polipéptidos incluyen secuencias del aminoácido modificadas por procesos naturales, tales como proceso post-traducción, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura de investigación voluminosa. Según lo utilizado adjunto, el término "ácido nucleico de SNP" significa una secuencia del ácido nucleico, que abarca un nucleótido que es variable dentro de una secuencia del nucleótido de otra manera idéntica entre los individuos o grupos de individuos, así existiéndose como alelos. Tales ácidos nucleicos SNP son preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 500 nucleótidos en longitud. Los ácidos nucleicos SNP pueden ser parte de un cromosoma, o pueden ser una copia exacta de una parte de un cromosoma, por ejemplo, por la amplificación de tal parte de un cromosoma a través de PCR o a través de la clonación. Los ácidos nucleicos de SNP se refieren de aquí en adelante simplemente como "SNPs". Un SNP es la ocurrencia de la variabilidad del nucleótido en una sola posición en el genoma, en donde dos bases alternativas ocurren a una frecuencia apreciable (es decir, > 1%) en la población humana. Un SNP puede aparecer dentro de un gen o dentro de regiones intergénicas del genoma. Las sondas del SNP según la invención son los oligonucleótidos que son complementarios a un ácido nucleico de SNP. Según lo utilizado adjunto, el término "sujeto" significa que el sujeto es preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano, pero puede también ser un animal, por ejemplo, animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, mono (por ejemplo, mono cinmologous, ratas, ratones, cerdos de guinea y similares). Según lo utilizado adjunto, la administración de un agente o fármaco a un sujeto o paciente incluye la auto-administración y la administración por otro medio. Debe también apreciarse que los varios modos del tratamiento o prevención de afecciones médicas como se describe están pensados para entenderse como "sustanciales", que incluye el total pero también menos que el total del tratamiento o prevención, y en donde algún resultado biológico o médicamente relevante se alcanza. Agentes de Modulación de LRRK2. En una modalidad, el agente de modulación LRRK2 puede ser un inhibidor del compuesto heterocíclico de la proteína de LRRK2 (SEC ID NO:2). En varias modalidades, el compuesto heterocíclico puede ser ácido (3-amino-propil)-amida 5-[5-Metoxi-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrolo-3-carboxílico; ácido (3-amino-propil)-amida 5-[6-Metoxi-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrolo-3-carboxílico; ácido (3-amino-propil)-amida 5-[7-Metoxi-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrolo-3-carboxílico; ácido (2-dietilamino-etil)-amida 5-[5-Metoxi-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrolo-3-carboxílico; o ácido (2-dietilamino-etil)-amida 5-[5-dimetilsulfamoil-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrolo-3-carboxílico. En otras modalidades, el compuesto heterocíclico puede ser 3-[1-( 3, 5- Di metí 1-1 H-pirrol-2-il)-metil-(Z)-ilideno]-5-metoxi-1 ,3-dihidro-indol-2-ona; 3-[1 -(1 H-lndol-2-il)-met-(Z)-ilideno]-5-metoxi-1 ,3-dihidro-indol-2-ona; 5-Metoxi-3-[1 -(4,5,6,7-tetrahidro-1 H-indol-2-il)-met-(Z)-ilideno]-1 ,3-dihidro-indol-2-ona; ácido metil éster 3-[1-(3,5-Dimetil-1 H-pirrol-2- il)-met-(Z)-ilideno]-5-metoxi-2-oxo-2,3-dihidro-indol-4-carboxílico; ácido etil éster 3-[1-(3,5-Dimetil-1 H-pirrol-2-il)-met-(Z)-ilideno]-5-metoxi-2-oxo-2,3-dihidro-indol-4-carboxílico¡ ácido metil éster 3-[1 -(3,5-Dimetil-1 H-pirrol-2-il)-met-(Z)-ilideno]-5-metoxi- 2-0X0-2, 3-dihidro-¡ndol-4-carboxílico; o ácido 3-[1 -(3,5-Dimetil-1 H-pirrol-2-il)-met-(Z)-ilideno]-5-metoxi-2-oxo-2,3-dihidro-indol-4-carboxílico. Alternativamente, el compuesto heterocíclico se puede seleccionar de: [Compuesto 12]; [Compuesto 13]; o [Compuesto 14] Las características farmacológicas de los agentes de modulación de LRRK2 se pueden evaluar, por ejemplo, en los experimentos de Drug Pull-Down. Los compuestos heterocíclicos anteriores pueden mostrar actividad en experimentos de Drug Pulí- Down en concentraciones debajo de 20 µ?. El compuesto mostró un valor Cl50 de ~1 µ?. El gen de LRRK2 (SEC ID NO: 1) puede desempeñar un papel en la progresión del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer y la progresión de la enfermedad de Alzheimer moderada a la enfermedad de Alzheimer más severa. Por lo tanto, los agentes de modulación de LRRK2 pueden utilizarse para tratar a pacientes con MCI o la enfermedad de Alzheimer, para retardar la progresión del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer o de la enfermedad de Alzheimer moderada a la enfermedad de Alzheimer más severa. Identificación y Caracterización de la Variación de Secuencia del Gen. Debido a su predominio y naturaleza extensa, los SNPs tienen el potencial de ser herramientas importantes para localizar los genes que están implicados en afecciones de enfermedad humanas. Vea por ejemplo, Wang et al, Science 280: 1077-1082 (1998). Está cada vez más claro que el riesgo de desarrollar muchos trastornos comunes y el metabolismo de medicaciones usadas para tratar estas afecciones son influenciados sustancialmente por variaciones genómicas subyacentes, aunque los efectos de cualquier variante puedan ser pequeños. Un SNP se dice que es "alélico" en que debido a la existencia del polimorfismo, algunos miembros de una especie pueden tener secuencia no mutada (es decir, el alelo original) mientras que otros miembros pueden tener una secuencia mutada (es decir, el alelo de la variante o mutante). Una asociación entre un SNP y un fenotipo particular no indica o no requiere necesariamente que el SNP sea causativo del fenotipo. En cambio, la asociación puede simplemente ser debido a la proximidad del genoma entre un SNP y esos factores genéticos realmente responsables de un fenotipo dado, tal que SNP y los factores genéticos estén estrechamente vinculados. Es decir, un SNP puede estar en desequilibrio de acoplamiento ("LD") con la variante funcional "real". El LD (a.k.a., asociación alélica) existe cuando los alelos en dos localizaciones distintas del genoma son más altamente asociados que lo esperado. Así, un SNP puede servir como marcador que tiene un valor en virtud de su proximidad a una mutación que cause un fenotipo particular. Al describir los sitios polimórficos de la invención, se hace referencia al filamento del sentido del gen por conveniencia. Según lo reconocido por el experto en la técnica, sin embargo, las moléculas de ácido nucleico que contienen el gen pueden ser moléculas de doble filamento complementarias y así la referencia a un sitio particular en el filamento del sentido se refiere también al sitio correspondiente en el filamento anti-sentido complementario. Es decir, se puede hacer referencia al mismo sitio polimórfico en cualquier filamento y un oligonucleótido se puede diseñar para someter a hibridación específicamente a cualquier filamento en una región blanco que contenga el sitio polimórfico. Así, la invención también incluye los polinucleótidos de un solo-filamento que son complementarios al filamento sentido de las variantes genómicas descritas adjunto. Identificación y Caracterización de SNPs. Varias y diversas técnicas se pueden utilizar para identificar y caracterizar los SNPs, incluyendo el análisis del polimorfismo de conformación de un solo-filamento (SSCP), análisis heteroduplex por cromatografía líquida de alto rendimiento que desnaturaliza (DHPLC) y dirigir de secuenciación del ADN y métodos de cómputo. Shi et al, Clin. Chem. 47:164-172 (2001). Existe una abundancia de información de secuencias en bases de datos públicas. Los métodos más comunes de clasificar SNP incluyen actualmente hibridación, extensión de cebador, y métodos de división. Cada uno de estos métodos se debe conectar a un sistema apropiado de detección. Las tecnologías de detección incluyen la polarización fluorescente (Chan et al., Genome Res. 9:492-499 (1999) ), detección luminométrica de liberación del pirofosfato (pirosecuenciación) (Ahmadiian et al., Anal. Biochem. 280:103-10 (2000) ), Análisis de división basado-(FRET) en la transferencia de energía de la resonancia de fluorescencia, DHPLC, y espectrometría de masas (Shi, Clin. Chem. 47:164-172 (2001); Patente EE.UU No. 6.300.076 B1). Otros métodos de detección y caracterización de los SNPs son los descritos en las Patentes EE UU Nos. 6.297.018 y 6.300.063. Los polimorfismos se pueden también detectar usando productos comercialmente disponibles, tales como INVADER™ technology (disponible de Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin, E.E.U.U.). En este análisis, un oligonucleótido "invasor" contra corriente específico y una sonda en sentido descendente parcialmente traslapada juntos forman una estructura específica cuando se unen completamente al ADN. Esta estructura es reconocida y cortada en un sitio específico por la enzima de Cleavase, dando por resultado la liberación de la aleta 5' del oligonucleótido de sonda. Este fragmento entonces sirve como el oligonucleótido "invasor" con respecto a blancos secundarios sintéticos y sondas de señal etiquetadas de manera fluorescente secundarias contenidas en la mezcla de reacción. Ver también, Ryan D et al, Molecular Diagnosis 4(2): 135-144 (1999) y Lyamichev V et al, Nature Biotechnology 17: 292-296 (1999), ver también Patentes Norteamericanas Nos. 5,846,717 y 6,001,567. La identidad de polimorfismos no se puede también determinar usando una técnica de detección de desigualdad incluyendo, pero sin limitarse a, el método de protección de ARNse usando ribosondas (Winter et al, Proc. Nati. Acad. Sci E.E.U.U. 82:7575 (1985); Meyers et al, Science 230:1242 (1985)) y proteínas que reconocen desigualdades del nucleótido, tales como la proteína E. coli mutS (Modrich P, Ann Rev Genet 25:229-253 (1991)). Alternativamente, los alelos variables se pueden identificar por el análisis del polimorfismo de conformación de un solo filamento (SSCP) (Orita et ah, Genomics 5:874-879 (1989); Humphries et al, in Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, R. Elles, ed., pp. 321-340 (1996)) o denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) (Wartell et al, Nucl Acids. Res. 18:2699-2706 (1990); Sheffield et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232-236 (1989)). Un método de extensión del cebador mediado-polimerasa se puede también utilizar para identificar los polimorfismos. Varios tales métodos se han descrito en la patente y la literatura científica e incluyen el método "Genetic Bit Analysis" (WO 92/15712) y el análisis de bit genético mediado por ligasa/polimerasa (Patente de Estados Unidos No. 5.679.524). Los métodos relacionados se describen en WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676, y Patentes de Estados Unidos Nos. 5.302.509 y 5.945.283. Los cebadores extendidos que contienen un polimorfismo se pueden detectar por espectrometría de masas según lo descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.605.798. Otro método de extensión del cebador es PCR de alelo-específico (Ruafio et al, Nucl Acids. Res. 17:8392 (1989); Ruafio et al, Nucl Acids. Res. 19: 6877-6882 (1991); WO 93/22456; Turki et al, J. Clin. Invest. 95:1635-1641 (1995)). Además, los sitios polimórficos múltiples pueden ser investigados simultáneamente amplificando regiones múltiples del ácido nucleico usando los sistemas de cebador de alelo-específico según lo descrito en la solicitud de patente PCT WO 89/10414. En una modalidad, aplicable a los resultados demostrados en los EJEMPLOS abajo, las muestras de sangre de pacientes se pueden colectar a la hora del estudio del paciente y el ADN fue extraído usando, por ejemplo, PUREGENE™ DNA Isolation Kit (D-50K). La clasificación del genotipo se puede realizar usando la tecnología de TaqMan® o con la técnica Third Wave Technologies Invader Assay. Oligonucleótidos con Haplotipo y Genotipo. La invención proporciona métodos y composiciones para el haplotipo y/o genotipo del gen en un individuo. Según lo utilizado adjunto, los términos "haplotipo" y "genotipo" significan el genotipo o haplotipo que. contiene el par del nucleotido o el nucleotido, respectivamente, que están presentes en uno o más de los sitios polimórficos descritos adjunto y pueden también incluir opcionalmente el par del nucleotido o el nucleotido presente en uno o más sitios polimórficos adicionales en el gen. Los sitios polimórficos adicionales pueden ser los sitios polimórficos actualmente conocidos o los sitios que se descubrieron posteriormente. Las composiciones de la invención contienen las sondas y cebadores del oligonucleótido diseñados para cruzar para hibridizar específicamente a una o más regiones blanco que contienen, o que están adyacentes a, un sitio polimórfico. Las composiciones del oligonucleótido de la invención son útiles en los métodos para clasificar el genotipo y/o el haplotipo de un gen en un individuo. Los métodos y composiciones para establecer el genotipo o haplotipo de un individuo en los sitios polimórficos descritos adjunto son útiles para estudiar el efecto de los polimorfismos en la etiología de las enfermedades afectadas por la expresión y la función de la proteína, estudiando la eficacia de los fármacos objetivo, prediciendo la susceptibilidad individual a las enfermedades afectadas por la expresión y la función de la proteína y prediciendo la respuesta individual a los fármacos que apuntan al producto del gen. Los oligonucleótidos con genotipo de la invención se pueden inmovilizar en o sintetizar en una superficie sólida tal como un microchip, perla, o cristal deslizante. Vea, por ejemplo, WO 98/20020 y WO 98/20019. Los oligonucleótidos con genotipo se pueden someter a hibridación a una región blanco localizada de uno a varios nucleótidos río abajo de uno de los sitios polimórficos identificados adjunto. Tales oligonucleótidos son útiles en los métodos de extensión del cebador mediados-polimerasa para detectar uno de los polimorfismos descritos adjunto y por lo tanto tales oligonucleótidos con genotipo son referidos adjunto como "oligonucleótidos de extensión del cebador". Método de clasificación de genotipo directo de la invención. Un método de clasificar genotipo de la invención puede implicar el aislar de un individuo una mezcla del ácido nucleico que abarca las dos copias de un gen de interés o fragmentos del mismo, y determinar la identidad del par del nucleotido en uno o más de los sitios polimórficos en las dos copias. Como será entendido fácilmente por el experto en la técnica, los dos "copia" de un gen en un individuo pueden ser el mismo alelo o pueden ser diversos alelos. En una modalidad particularmente preferida, el método de clasificar el genotipo abarca la determinación de la identidad del par del nucleotido en cada sitio polimórfico. Generalmente, la mezcla del ácido nucleico se aisla de una muestra biológica tomada del individuo, tal como una muestra de sangre o muestra de tejido. Las muestras convenientes de tejido incluyen sangre entera, semen, saliva, rasguños, orina, materia fecal, sudor, manchas bucales, piel y cabello. Método directo de clasificación del Haplotipo de la invención. Un método de clasificación del haplotipo de la invención puede incluir aislar de un individuo una molécula de ácido nucleico que contiene solamente una de las dos copias de un gen de interés, o un fragmento del mismo, y determinar la identidad del nucleótido en uno o más de los sitios polimórficos en esa copia. Los métodos clasificación del haplotipo directos incluyen, por ejemplo, la tecnología de CLASPER System™ (Patente Estadunidense No. 5.866.404) o el PCR de alelo de largo alcance específico (Michalotos-Beloin et al, Nucí. Acids. Res. 24: 4841-4843 (1996)). El ácido nucleico se puede aislar usando cualquier método capaz de separar las dos copias del gen o del fragmento. Como será apreciado fácilmente por los expertos en la técnica, cualquier clon individual proporcionará solamente la información del haplotipo en una de las dos copias del gen presentes en un individuo. En una modalidad, un par del haplotipo es determinado para un individuo identificando la secuencia en fase de nucleótidos en uno o más de los sitios polimórficos en cada copia del gen que está presente en el individuo. En una modalidad preferida, el método de clasificación del haplotipo abarca identificar la secuencia en fase de nucleótidos en cada sitio polimórfico en cada copia del gen. En los métodos de clasificar el genotipo y haplotipo, la identidad de un nucleótido (o par del nucleótido) en un sitio polimórfico se puede determinar amplificando las regiones blanco que contienen los sitios polimorficos directamente de una o ambas copias del gen, o fragmentos del mismo, y secuenciando las regiones amplificadas por métodos convencionales. El genotipo o haplotipo para el gen de un individuo se puede también determinar por la hibridación de una muestra de ácido nucleico que contiene una o ambas copias del gen para las configuraciones y sub-configuraciones del ácido nucleico tales como las descritas en la solicitud de patente PCT publicada WO 95/11995. Método de clasificación del genotipo indirecto usando Sitios Polimorficos en Desequilibrio de Acoplamiento con un Polimorfismo Blanco. Además, la identidad de los alelos presentes en cualquiera de los sitios polimorficos de la invención puede determinarse indirectamente por la clasificación del genotipo de otros sitios polimorficos en desequilibrio de acoplamiento con los sitios de interés. Según lo descrito arriba, dos sitios estarán en desequilibrio de acoplamiento si la presencia de una variante particular en un sitio es indicativa de la presencia de otra variante en un segundo sitio. Stevens JC, Mol. Diag. 4: 309-317 (1999). Los sitios polimorficos en desequilibrio de acoplamiento con los sitios polimorficos de la invención se pueden situar en regiones del mismo gen o en otras regiones genómicas.
Amplificación de una Región del Gen Blanco. Las regiones blanco no se pueden amplificar usando cualquier método de amplificación dirigido al oligonucleótido, incluyendo pero sin limitarse a la reacción de la cadena de polimerasa (PCR). (Patente Estadunidense No. 4.965.188), reacción de la cadena de ligasa (LCR) (Barany et al, Proc. Nati. Acad. Sci E.E.U.U. 88:189-193 (1991); solicitud de patente PCT publicada WO 90/01069), y análisis de la ligadura del oligonucleótido (OLA) (Landegren et al, Science 241:1077-1080 (1988)). Los oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas en tales métodos deben someterse a hibridación específicamente en una región del ácido nucleico que contiene o está adyacente al sitio polimórfico. Generalmente, los oligonucleótidos están entre 10 y 35 nucleótidos en longitud y preferiblemente, entre 15 y 30 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente, los oligonucleótidos son 20 a 25 nucleótidos de largo. La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores que son considerados y practicados rutinariamente por el experto en la técnica. Otros procedimientos de amplificación del ácido nucleico conocidos se pueden utilizar para amplificar la región blanco incluyendo los sistemas de amplificación basados en transcripción (Patente Estadunidense No. 5.130.238; EP 329.822; Patente Estadunidense No. 5.169.766, solicitud de patente PCT publicada WO 89/06700) y métodos isotérmicos (Walker et al, Proc. Nati. Acad. Sci. E.E.U.U. 89:392-396 (1992)).
Hibridación del Oligonucleótido de Alelo-Específico a un Gen Blanco. Un polimorfismo en la región blanco se puede probar antes o después de la amplificación usando uno de varios métodos basados en la hibridación conocidos en la técnica. Generalmente, los oligonucleótidos alelo-específicos se utilizan en la ejecución de tales métodos. Los oligonucleótidos alelo-específicos se pueden utilizar como pares de sondas diferentemente etiquetados, con un miembro del par mostrando una igualación perfecta a una variante de una secuencia blanco y el otro miembro mostrando una igualación perfecta a una variante diferente. En algunas modalidades, más de un sitio polimórfico se puede detectar inmediatamente el usar un grupo de oligonucleótidos alelo-específicos o pares de oligonucleótidos. Preferiblemente, los miembros del grupo tienen temperaturas de fusión dentro de 5°C, y preferiblemente dentro de 2°C, entre sí cual se someten a hibridación en cada uno de los sitios polimórficos que son detectados. La hibridación de un oligonucleótido alelo-específico a un polinucleótido blanco se puede realizar con ambas entidades en la solución, o tal hibridación se puede realizar cuando el oligonucleótido o polinucleótido blanco covalente o no covalente se fija a un soporte sólido. La unión se puede mediar, por ejemplo, por interacciones del anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidin-biotin, puentes de sal, interacciones hidrofóbicas, acoplamientos químicos, reticulación UV, hornada, etc. El oligonucleótido alelo-específico se puede sintetizar directamente en el soporte sólido o unirse al soporte sólido subsecuente a la síntesis. Los soportes sólidos convenientes para el uso en los métodos de detección de la invención incluyen sustratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel y similares, que pueden ser formados, por ejemplo, en pozos (como en placas de 96-pozos), deslizantes, hojas, membranas, fibras, trozos, placas, y granos. El soporte sólido puede ser tratado, revestido o derivarse para facilitar la inmovilización del oligonucleótido alelo-específico o del ácido nucleico blanco. Determinación de los genotipos y haplotipos de la población y su correlación a una característica. La invención proporciona un método para determinar la frecuencia de un genotipo o haplotipo en una población. El método comprende la determinación del genotipo o haplotipo de un gen presente en cada miembro de la población, en donde el genotipo o haplotipo comprende un par de nucleótido o un nucleótido detectado en uno o más de los sitios polimórficos en el gen, y el calculo de la frecuencia a la cual el genotipo o haplotipo se encuentra en la población. La población puede ser una población de referencia, una población familiar, una población del mismo sexo, grupo de población, o población característica (por ejemplo, grupo de individuos que exhiben una característica de interés tal como una condición o respuesta médica a un tratamiento terapéutico). En otro aspecto de la invención, los datos de frecuencia de los genotipos y/o haplotipos encontrados en una población de referencia se utilizan en un método para identificar una asociación entre una característica y un genotipo o haplotipo. La característica puede ser cualquier fenotipo detectable, que incluye sin limitarse a susceptibilidad a una enfermedad o respuesta a un tratamiento. El método implica la obtención de datos con respecto a la frecuencia de los genotipos o haplotipos de interés en una población de referencia, y la comparación de los datos con la frecuencia de los genotipos o haplotipos en una población que exhibe la característica. Los datos de frecuencia para una o ambos poblaciones de referencia y de la característica pueden ser obtenidos por los procesos de determinación de genotipo o haplotipo, cada uno individual en las poblaciones usando uno de los métodos descritos arriba. Los haplotipos para la población característica se pueden determinar directa o, alternativamente, por el método del genotipo o haplotipo de pronóstico descrito arriba. Los datos de frecuencia para las poblaciones de referencia y/o característica son obtenidos por el acceso previamente determinado a los datos de frecuencia determinados, que pueden estar en forma escrita o electrónica. Por ejemplo, los datos de frecuencia pueden estar presentes en una base de datos que sea legible por computadora. Una vez que se obtengan los datos de frecuencia, se comparan las frecuencias de los genotipos o haplotipos del interés en las poblaciones de referencia y de característica. Cuando se analizan los polimorfismos, un cálculo se puede realizar para corregir una asociación significativa que se pudo encontrar por elección. Para los métodos estadísticos útiles en los métodos de la invención, ver Statistical Methods in Biology, 3ra edición, Bailey NTJ, (Cambridge Univ. Press, 1997); Waterman MS, Introduction to Computational Biology (CRC Press, 2000) and Bioinformatics, Baxevanis AD & Ouellette BFF editors (John Wiley & Sons, Inc., 2001). En otra modalidad, los datos de frecuencia del haplotipo para diversos grupos se examina para determinar si son constantes con Hardy-Weinberg equilibrium. D.L. Hartl y col., Principies of Population Genomics, 3ra Ed. (Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 1997). En otra modalidad, el análisis estadístico es realizado por el uso de las pruebas estándares ANOVA con una corrección de Bonferoni o un método de muestreo repetitivo que simula la correlación del fenotipo del genotipo muchas veces y calcula un valor de significación. ANOVA se utiliza para probar la hipótesis con respecto a si una variable de respuesta está causada por o se correlaciona a una o más características o variables que se pueden medir. LD Fisher & G vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences, Ch. 10 (Wiley-lnterscience, New York, 1993). En una modalidad para pronosticar un par de haplotipos, el análisis incluye una etapa de asignación, como sigue: Primero, cada uno de los pares posibles de haplotipos se compara a los pares de haplotipos en la población de referencia. Generalmente, solamente un par de haplotipos en la población de referencia iguala al posible de haplotipos y ese par se asigna al individuo. Ocasionalmente, solo un haplotipo representado en los pares de haplotipos de referencia es consistente con un par posible de haplotipos para un individuo, y en tales casos se asigna al individuo un par de haplotipos que contiene este haplotipo conocido y un nuevo haplotipo derivado restando el haplotipo conocido del par posible de haplotipos. En otra modalidad, un genotipo o haplotipo detectable que está en desequilibrio de enlace con un genotipo o haplotipo de interés se puede utilizar como marcador sustituyente. Un genotipo que está en desequilibrio de enlace con otro genotipo se indica donde está más frecuente un genotipo o haplotipo particular para un gen dado en la población que también demuestra el genotipo marcador sustituyente potencial que esta en la población de referencia. Si la frecuencia es estadísticamente significativa, entonces el genotipo marcador es pronóstico del genotipo o haplotipo, y se puede utilizar como marcador sustituyente. Otro método para encontrar las correlaciones entre el contenido del haplotipo y las respuestas clínicas, utiliza los modelos proféticos basados en los algoritmos de optimización de minimización de errores, uno de los cuales es un algoritmo genético. Ver, R Judson, "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry" in Reviews in Computational Chemistry, Ch. 10, KB Lipkowitz & DB Boyd, eds. (VCH Publishers, New York, 1997) pp. 1-73. Anelación simulada (Press y col., Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing, Ch. 10 (Cambridge University Press, Cambridge, 1992), redes neuronales (E Rich & K Knight, Artificial Intelligence, 2nd Edition, Ch. 10 (McGraw-Hill, New York, 1991), métodos estándares de descenso de gradiente (Press y col., supra Ch. 10), o también se pueden utilizar otros métodos globales o locales de optimización (ver la discusión en Judson, supra). Correlación del genotipo o haplotipo objeto a la respuesta de tratamiento. En las modalidades preferidas, la característica es la susceptibilidad a una enfermedad, gravedad de una enfermedad, etapa de una enfermedad o respuesta a un fármaco. Tales métodos tienen aplicabilidad en el desarrollo de pruebas de diagnóstico y tratamientos terapéuticos para todas las aplicaciones farmacogenéticas donde hay el potencial para una asociación entre un genotipo y un resultado del tratamiento, incluyendo las mediciones de la eficacia, medidas farmacocinéticas y mediciones del efecto secundario. En otra modalidad preferida, la característica de interés es una respuesta clínica exhibida por un paciente a un cierto tratamiento terapéutico, por ejemplo, respuesta a un fármaco dirigido o a un tratamiento terapéutico para una condición médica.
Para deducir una correlación entre una respuesta clínica a un tratamiento y un genotipo o haplotipo, los datos del genotipo o haplotipo se obtienen en las respuestas clínicas exhibidas por una población de individuos que recibieron el tratamiento, más abajo "población clínica". Estos datos clínicos pueden ser obtenidos analizando los resultados de un ensayo clínico que ha sido realizado y/o diseñando con anterioridad y realizando uno o más nuevos ensayos clínicos. Los individuos incluidos en la población clínica generalmente se clasifican con una condición médica de interés, esta clasificación de los pacientes potenciales podría utilizar un examen físico estándar o una o más pruebas de laboratorio. Alternativamente, la clasificación de los pacientes podría utilizar el método de determinación de haplotipo para las situaciones donde hay una correlación fuerte entre el par de haplotipos y la susceptibilidad o gravedad de la enfermedad. El tratamiento terapéutico de interés se administra a cada individuo en la población de ensayo, y la respuesta de cada individuo al tratamiento se mide usando uno o más criterios predeterminados. Se contempla que en muchos casos, la población de ensayo exhibirá una gama de respuestas y que el investigador elegirá el número de grupos de respuesta (por ejemplo, baja, media, alta) compuesto por varias respuestas. Además, el gen para cada individuo en la población de ensayo es el que es sometido al método de determinación de genotipo y/o haplotipo, que se puede hacer antes o después de administrar el tratamiento. Estos resultados entonces se analizan para determinarse si alguna variación observada en la respuesta clínica entre los grupos del polimorfismo es estadísticamente significativa. Los métodos de análisis estadístico, que se pueden utilizar, se describen en L.D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, New York, 1993). Este análisis también puede incluir un cálculo del retroceso cuyos sitios polimórficos en el gen contribuyen más significativamente a las diferencias del fenotipo. En una modalidad, como un análisis de primer paso, las pruebas Fishers Exacs se realizan para evaluar la respuesta en función del genotipo. Después de que se hayan obtenido los datos clínicos y el polimorfismo, se crean las correlaciones entre la respuesta y el contenido individual del genotipo o haplotipo. Las correlaciones se pueden producir de varias maneras. En un método, los individuos agrupan en base a su genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) (también designado como grupo de polimorfismo), y entonces se calculan las desviaciones promedios y estándares de las respuestas clínicas exhibidas por los miembros de cada grupo de polimorfismo. A partir de los análisis descritos arriba, el experto que pronostica la respuesta clínica en función del contenido del genotipo o haplotipo puede construir fácilmente un modelo matemático. La identificación de una asociación entre una respuesta clínica y un genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) para el gen, puede ser la base para diseñar un método de diagnóstico para determinar los individuos respondan o no al tratamiento, o alternativamente, responderán a un nivel inferior y pueden requerir por lo tanto más tratamiento, es decir, una mayor dosis de una fármaco. El método de diagnóstico puede tomar una de varias formas: por ejemplo, prueba de ADN directo (es decir, sometimiento al método de determinación de genotipo o haplotipo de uno o más sitios polimórficos en el gene), una prueba serológica, o una medición de examen físico. El único requisito es que haya una buena correlación entre los resultados de prueba de diagnóstico y el genotipo o haplotipo subyacente. En una modalidad preferida, este método de diagnóstico utiliza el método de determinación de haplotipo de pronóstico descrito arriba. En una modalidad, se realiza el análisis usando un modelo logístico para considerar el género y edad además del tratamiento y estado del genotipo "altamente sensible" (al tratamiento terapéutico). Además, un modelo ANCOVA se puede aplicar usando el valor de línea base de las valoraciones pacientes de la respuesta como una co-variante cuantitativa. Asignación de un sujeto a un grupo de genotipo. Como será entendido por un experto, habrá cierto grado de incertidumbre implicado en la fabricación de esta determinación. Por lo tanto, las desviaciones estándares de los niveles del grupo de control serían utilizadas para hacer una determinación de probabilidad y los métodos de esta invención serían aplicables a una amplia gama de determinaciones basadas en la probabilidad del grupo de genotipo. Por lo tanto, por ejemplo y no a modo de limitación, en una modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética se encuentra dentro de 2.5 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces el individuo puede ser asignado a ese grupo de genotipo. En otra modalidad si el nivel medido del producto de expresión genética se encuentra dentro de 2.0 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control entonces el individuo puede ser asignado a ese grupo de genotipo. En aún otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética se encuentra dentro de 1.5 desviaciones estándares promedio de cualquiera de los grupos de control entonces el individuo puede ser asignado a ese grupo de genotipo. En otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética es 1.0 o menos desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los niveles de los grupos de control entonces el individuo puede ser asignado a ese grupo de genotipo. Por lo tanto este proceso permite la determinación, con varios grados de probabilidad, de que sujeto específico se debe colocar en el grupo, y tal asignación a un grupo de genotipo entonces determinaría la categoría de riesgo en la cual el individuo se debe colocar. Correlación entre la respuesta clínica y el genotipo o haplotipo. Para deducir una correlación entre la respuesta clínica a un tratamiento y un genotipo o haplotipo, es necesario obtener los datos con respecto a las respuestas clínicas exhibidas por una población de individuos que recibieron el tratamiento, más abajo "población clínica". Estos datos clínicos pueden ser obtenidos analizando los resultados de un ensayo clínico que se ha realizado con anticipación y/o los datos clínicos se pueden obtener diseñando y realizando uno o más nuevos ensayos clínicos. Los niveles estándares de control del producto de expresión genética, por lo tanto determinados en los diversos grupos de control, entonces serían comparados al nivel medido de un producto de expresión genética en un paciente dado. Este producto de expresión genética podía ser el mRNA característico asociado a ese grupo particular de genotipo o producto de expresión genética del polipéptido de ese grupo de genotipo. El paciente después podría ser clasificado o asignado a un grupo particular de genotipo basado en como similarmente, los niveles medidos fueron comparados a los niveles de control para un grupo dado. Sistema computarizado para almacenar o visualizar los datos de polimorfismo. La invención también proporciona un sistema informático para almacenar y visualizar los datos de polimorfismo determinados para el gen. El sistema informático comprende una unidad de tratamiento pór computadora, un monitor, y una base de datos que contiene los datos de polimorfismo. Los datos del polimorfismo incluyen los polimorfismos, genotipos y haplotipos identificados para un gen dado en una población de referencia. En una modalidad preferida, el sistema computarizado es capaz de producir una visualización que muestra los haplotipos organizados de acuerdo a sus relaciones evolutivas. Una computadora puede implementar cualquiera o todas las operaciones analíticas y matemáticas implicadas en la practica de los métodos de la presente invención. Además, la computadora puede ejecutar un programa que genere las vistas (o pantallas) visualizadas en un dispositivo de visualización y con el cuál puede interactuar el usuario para ver y analizar las grandes cantidades de información referentes al gen y a su variación genómica, incluyendo la localización del cromosoma, estructura genética, y familia genética, datos de expresión genética, datos de polimorfismo, datos genéticos de secuencia, y datos clínicos de población (por ejemplo, datos con respecto al origen etnogeográfico, respuestas clínicas, genotipos, y haplotipos para una o más poblaciones). Los datos de polimorfismo descritos en la presente se pueden almacenar como parte de una base de datos relacionada (por ejemplo, el caso de una base de datos Oracle o un conjunto de archivos planos ASCII). Estos datos de polimorfismo se pueden almacenar en el disco duro de la computadora o se pueden, por ejemplo, almacenar en un CD-ROM o en uno o más otros dispositivos de almacenamiento legibles por computadora. Por ejemplo, los datos se pueden almacenar en una o más bases de datos en comunicación con la computadora vía una red. Diagnóstico a base de ácido nucleico. En otro aspecto, la invención proporciona las sondas de SNP, que son útiles en la clasificación de los sujetos de acuerdo a sus tipos de variación genética. Las sondas de SNP de acuerdo a la invención son los oligonucleótidos, que distinguen entre SNPs en el análisis de distinción alélica convencional. En ciertas modalidades preferidas, los oligonucleótidos de acuerdo a este aspecto de la invención son complementarios a un alelo de ácido nucleico de SNP, pero no a cualquier otro alelo de ácido nucleico de SNP. Los oligonucleótidos de acuerdo a esta modalidad de la invención pueden distinguir entre SNPs de varias maneras. Por ejemplo, bajo condiciones de hibridación rigurosa, un oligonucleótido de longitud apropiada se hibridazara a un SNP, pero no a cualquier otro. El oligonucleótido se puede etiquetar usando una radioetiqueta o una etiqueta molecular fluorescente. Alternativamente, un oligonucleótido de longitud apropiada se puede utilizar como cebador para PCR, en donde el nucleótido terminal 3' es complementario a un alelo que contiene un SNP, pero no a cualquier otro alelo. En esta modalidad, la presencia o ausencia de la amplificación de PCR determina el haplotipo de SNP. Los fragmentos genómicos y de ADNc de la invención comprenden por lo menos un sitio polimórfico identificado en la presente, tienen una longitud de por lo menos 10 nucleótidos, y pueden extenderse hasta la longitud completa del gen. Preferiblemente, un fragmento de acuerdo a la presente invención está entre 100 y 3000 nucleótidos de longitud, y preferiblemente entre 200 y 2000 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente entre 500 y 1000 nucleótidos de longitud. Kits de la invención. La invención proporciona los kits de detección de ácido nucleico y polipéptido útiles para el método de determinación de haplotipo y/o genotipo del gen en un individuo. Tales kits son útiles para la clasificación de individuos con el fin de clasificar los individuos. Específicamente, la invención comprende los kits para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico que corresponde a un marcador de la invención en una muestra biológica, por ejemplo, cualquier líquido corporal que incluye, pero no se limita a, suero, plasma, nodos linfáticos, fluido quístico, orina, heces, fluido cerebroespinal, fluido de cavidad peritoneal o sangre, e incluyendo muestras de biopsia de tejido corporal. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente etiquetado capaz de detectar un polipéptido o mRNA que codifica un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención en una muestra biológica y los medios para determinar la cantidad de polipéptido o mRNA en la muestra, por ejemplo, un anticuerpo que une el polipéptido o una sonda de oligonucleótido que se une al ADN o mRNA que codifica el polipéptido. Los kits también pueden incluir las instrucciones para interpretar los resultados obtenidos usando el kit. En otra modalidad, la invención proporciona un kit que comprende por lo menos dos oligonucleótidos de determinación de genotipo empaquetados en envases separados. El kit también puede contener otros componentes tales como un amortiguador de hibridación (donde los oligonucleótidos se utilizan como sonda) empaquetado en un envase separado. Alternativamente, donde los oligonucleótidos se utilizan para amplificar una región objeto, el kit puede contener, empaquetado en envases separados, una polimerasa y un amortiguador de reacción optimizado para la extensión de cebador mediada por polimerasa, por ejemplo en el caso de PCR. En una modalidad preferida, tal kit puede comprender adicionalmente medios de recolección de muestra de ADN. Para los kits basados en anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo, (1) un primer anticuerpo, por ejemplo, unido a un soporte sólido, que se une a un polipéptido que corresponde a un marcador o a la invención; y, opcionalmente (2) un segundo y diverso anticuerpo que se une al polipéptido o primer anticuerpo y se conjuga a una etiqueta detectable. Para los kits basados en oligonucleótido, el kit puede comprender, por ejemplo, (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido etiquetado de manera detectable, que se hibridiza a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que corresponde a un marcador de la invención; o (2) al par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que corresponde a un marcador de la invención. El kit también puede comprender, por ejemplo, un agente de amortiguamiento, conservador o un agente estabilizante de proteína. El kit puede comprender adicionalmente los componentes necesarios para detectar la etiqueta detectable, por ejemplo, una enzima o sustrato. El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control, que se pueden probar y comparar a la muestra de prueba. Cada componente del kit puede ser incluido dentro de un envase individual y todos los envases pueden estar dentro de un solo paquete, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los análisis realizados usando el kit. Secuencias de ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención comprende uno o más polinucleótidos aislados. La invención también comprende las variantes alélicas de los mismos, es decir, formas alternativas naturales de los polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos mutantes que son idénticos, homólogos o relacionados a los codificados por los polinucleótidos. Alternativamente, las variantes artificiales se pueden producir por técnicas de mutagénesis o por las técnicas directas de síntesis bien conocidas en la técnica.
Por consiguiente, las secuencias de ácido nucleico capaces de hibridizarce a astringencia baja con cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido mutante de la presente invención, son consideradas dentro del alcance de la invención. Las condiciones estándares de baja astringencia se caracterizan bien en los textos de clonación de biología molecular estándares. Ver, por ejemplo Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2da Ed., ed., Sambrook, Fritsch, & Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II, D.N. Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, B.D. Hames & SJ. Higgins, eds (1984). Caracterización del nivel de expresión genética. Los métodos para detectar y medir los niveles de mRNA (es decir, nivel de transcripción genética) y los niveles de los productos de expresión genética del polipéptido (es decir, nivel de traducción genética) son bien conocido en la técnica e incluyen el uso de mícroarreglos de nucleótido y los métodos de detección de polipéptido que implican las técnicas de espectrometrías de masa y/o la detección y la cuantificación del anticuerpo. Ver también, Tom Strachan & Andrew Read, Human Molecular Genetics, 2nd Edition. (John Wiley and Sons, Inc. Publication, New York, 1999)).
Determinación de transcripción del gen objeto. La determinación del nivel del producto de expresión genética en una muestra biológica, por ejemplo, tejido o fluidos corporales de un individuo, se puede realizar de una variedad de maneras. El término "muestra biológica" tiene el propósito de incluir tejidos, células, fluidos biológicos y aislados de los mismos, aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentas dentro de un sujeto. Muchos métodos de detección de expresión usan ARN aislado. Para los métodos in vitro, cualquier técnica de aislamiento de RNA que no seleccione contra el aislamiento de mRNA, se puede utilizar para la purificación de RNA de las células. Vea, por ejemplo, Ausubel y col., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol. (John Wiley & Sons, New York, 1987-1999)). En una modalidad, se determina el nivel del producto de expresión de mRNA del gen objeto. Los métodos para medir el nivel de un mRNA específico son bien conocidos en la técnica e incluyen el análisis Western Blot, PCR de transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real o por hibridación a un arreglo o microarreglo de oligonucleótido. En otras modalidades preferidas, la determinación del nivel de expresión no se puede realizar por la determinación del nivel del producto de expresión de proteína o polipéptido del gen en los fluidos corporales o muestras de tejido que incluyen sin limitarse a, sangre o suero. Una gran cantidad de muestras de tejido se pueden procesar fácilmente usando las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de RNA de única etapa de la Patente Norteamericana No. 4,843,155.
El mRNA aislado se puede utilizar en los análisis de hibridación o amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern o Western, análisis de PCR y arreglos de sonda. Se prefiere el método de diagnóstico para la detección de los niveles de mRNA implicados en el contacto del mRNA aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridizarse a mRNA codificado por el gen que es detectado. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc integral, o una porción del mismo, por ejemplo un oligonucleótido de por lo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridizarse específicamente bajo condiciones rigurosas a un mRNA o ADN genómico que codifica un marcador de la presente invención. Otras sondas convenientes para el uso en los análisis de diagnóstico de la invención se describen en la presente. La hibridación de un mRNA con la sonda, indica que el marcador en cuestión se está expresando. En un formato, las sondas se inmovilizan en un superficie sólida y el mRNA se pone en contacto con las sondas, por ejemplo, en un arreglo de chip del gen Affymetrix (Affymetrix, Calif. USA). Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección conocidos de mRNA para el uso en la detección del nivel de mRNA codificado por los marcadores de la presente invención. Un método alternativo para determinar el nivel de mRNA que corresponde a un marcador de la presente invención en una muestra, implica el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, por RT-PCR (la modalidad experimental dispuesta en la Patente Norteamericana No. 4,683,202); reacción en cadena de ligasa (Barany y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991)), replica de secuencia auto-mantenida (Guatelli y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878 (1990)); sistema de amplificación de transcripción (Kwoh y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 1173-1 177 (1989)); replicasa Q-Beta (Lizardi y col., Biol. Technology 6: 1197 (1988)); réplica del círculo de rodamiento (Patente Norteamericana No. 5,854,033); o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico, si tales moléculas están presentes en números muy bajos. Según lo utilizado en la presente, los "cebadores de amplificación" se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden anelarse a las regiones 5' o 3' regiones de un gen (más y menos filamentos, respectivamente, o vice versa) y contienen una región corta entre ellas. En general, las cebadores de amplificación son de aproximadamente 10-30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50-200 nucleótidos de longitud. La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) es unidireccional para determinar los niveles de expresión genética, por ejemplo, de los genes de la invención, por ejemplo, los que contienen SNPs y el polimorfismos de interés. El análisis de RT-PCR utiliza una transcriptasa inversa de RNA para catalizar la síntesis de un filamento de ADN a partir de un filamento de RNA, incluyendo un filamento de mRNA. El ADN resultante puede ser detectado y cuantificado específicamente y este proceso se puede utilizar para determinar los niveles de especies específicas de mRNA. Un método para hacer esto es TAQMAN® (TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif, USA) y sacar provecho de actividad de nucleasa 5' de la polimerasa de ADN AMPLITAQ GOLD™ para dividir una forma específica de sonda durante una reacción de PCR. Esto es referido como una sonda de TAQMAN™. Ver Luthra y col., Am. J. Pathol. 153: 63-68 (1998); Kuimelis y col., Nucí. Acids Symp. Ser. 37: 255-256 (1997); y Mullah y col., Nucí Acids Res. 26(4): 1026-1031 (1998)). Durante la reacción, la división de la sonda separa un tinte reportero y un tinte extintor, dando por resultado la fluorescencia creciente del reportero. La acumulación de los productos de PCR es detectada directamente monitoreando el aumento en la fluorescencia del tinte reportero. Heid y col., Genome Res. 6(6): 986-994 (1996)). Cuanto más alto sea el número de copias de inicio del ácido nucleico objeto, más pronto el aumento significativo de la fluorescencia se observa. Ver Gibson, Heid & Williams y col., Genome Res. 6: 995-1001 (1996). Otras tecnologías para medir el estado de transcripción de los grupos de un producto de células de fragmentos de restricción de complejidad limitada para el análisis electroforético, tal como los métodos que combinan la digestión doble de la enzima de restricción con los cebadores de fase (ver, por ejemplo, EP 0 534858 A1), o los métodos que seleccionan los fragmentos de restricción con los sitios más cercanos a un extremo definido de mRNA. (ver, por ejemplo, Prashar & Weissman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93(2) 659-663 (19%)). Otros métodos muestrean estadísticamente los grupos de ADNc, tal como por secuenciación de suficientes bases, por ejemplo, 20-50 bases, en cada uno de los ADNcs múltiples para identificar cada ADNc, o secuenciando las etiquetas cortas, por ejemplo, 9-10 bases, que se generan en las posiciones conocidas en relación a un patrón definido de trayectoria final de mRNA. Ver, por ejemplo, Velculescu, Science 270: 484-487 (1995). Los niveles de ADNc en las muestras se cuantifican y la desviación media, promedio y estándar de cada ADNc se determina usando los medios estadísticos estándares bien conocidos por los expertos en la técnica. TJ. Bailey, Statistical Methods In Biology, 3rd Edition (Cambridge University Press, 1995). Detección de polipéptidos. Métodos de detección inmunológicos. La expresión de la proteína codificada por los genes de la invención se puede detectar por una sonda que detectablemente se etiquete, o que se puede etiquetar posteriormente. El término "etiquetada", con respecto a la sonda o anticuerpo, comprende el etiquetado directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento, es decir, por unión física, una sustancia detectable por la sonda o anticuerpo, así como el etiquetado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que se etiqueta directamente. Los ejemplos del etiquetado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario etiquetado con fluorescencia y el etiquetado extremo de una sonda de ADN con biotina tal que se pueda detectar con estreptavidina etiquetada con fluorescencia. Generalmente, la sonda es un anticuerpo que reconoce la proteína expresada. Una variedad de formatos se puede utilizar para determinar si una muestra contiene una proteína objeto que se une a un anticuerpo dado. Los métodos de inmunoanálisis útiles en la detección de los polipéptidos objeto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Dot Bloting, Western Blot, chips de proteína, análisis de unión de proteína competitiva y no competitiva, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunohistoquímica, clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS), y otros usados y descritos ampliamente en las literatura científica y de patente, y muchos utilizados comercialmente. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección conocidos de proteína/anticuerpo para el uso en la determinación de si las células expresan un marcador de la presente invención y de la concentración relativa del producto específico de expresión del polipéptido en sangre u otros tejidos del cuerpo. Las proteínas de los individuos se pueden aislar usando las técnicas que son bien conocidas por lo expertos en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteína utilizados pueden, por ejemplo, ser tal como los descritos en Harlow & Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)). Para la producción de anticuerpos a una proteína codificada por uno de los genes descritos, varios animales anfitriones pueden ser inmunizados por inyección con el polipéptido, o una porción del mismo. Tales animales anfitriones pueden incluir, sin limitarse a, conejos, ratones y ratas. Varios adyuvantes se pueden utilizar para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de anfitrión incluyendo, pero sin limitarse a, Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio; sustancias tensoactivas, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa del ojo de cerradura y dinitrofenol; y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como bacilo Camette-Guerin (BCG) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales (mAbs), que son poblaciones homogéneas de anticuerpos a un antígeno particular, se pueden obtener por cualquier técnica que proporcione la producción de las moléculas de anticuerpo por las líneas continuas de células en el cultivo. Éstas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); y la Patente Norteamericana No. 4,376,110; la técnica de hibridoma de célula B humana de Kosbor y col., Immunol. Today 4: 72 (1983); Colé y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 (1983); y la técnica de hibridoma de EBV de Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy (Alan R. Liss, Inc., 1985) pp. 77-96. Además, las técnicas desarrollas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (ver Morrison y col., Proc. Nati. Acad. ScL USA 81 : 6851-6855 (1984); Neuberger y col., Nature 312: 604-608 (1984); y Takeda y col., Nature 314: 452-454 (1985)), se puede usar empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de la especificidad apropiada de antígeno junto con genes de una molécula humana de anticuerpo de la actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diversas porciones se derivan de diversa especie animal, tal como los que tienen una formar derivada de una región variable o hipervariable de mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de los anticuerpos de cadena única (Patente Norteamericana No. 4,946,778; Bird, Science 242: 423-426 (1988); Huston y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); y Ward y col., Nature 334: 544-546 (1989)), se pueden adaptar para producir anticuerpos de única cadena expresados de manera diferente. Las técnicas útiles para la producción de "anticuerpos humanizados" se pueden adaptar para producir los anticuerpos a las proteínas, fragmentos o derivados de los mismos. Tales técnicas son descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,661,016; y 5,770,429. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden utilizar en métodos, tales como Western Blot o técnicas de inmunofluorescencia, para detectar las proteínas expresadas. En tales aplicaciones, es generalmente preferible inmovilizar el anticuerpo o proteínas en un soporte sólido. Los soportes convenientes o portadores en fase sólida incluyen cualquier soporte capaz de unir un antígeno o anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen cristal, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabro y magnetita. Un método útil, para la facilidad de la detección, es el ELISA de sandwich, del cual existen una cantidad de variaciones, que se piensan para utilizarse en los métodos y análisis de la presente invención. Según lo utilizado en la presente, el "análisis tipo sándwich" se piensa para comprender todas las variaciones en la técnica básica de dos sitios. La inmunofluorescencia y las técnicas de EIA están muy establecidas en la técnica. Sin embargo, otras moléculas reporteras, tales como radioisótopos, moléculas quimioluminescentes o bioluminescentes también se pueden utilizar. Será fácilmente evidente al experto cómo variar el procedimiento para adaptar el uso requerido. Todo el monitoreo genómico de la proteína, es decir, el "proteoma", puede ser realizado construyendo un microarreglo en cuyos sitios de unión comprende anticuerpos inmovilizados, preferiblemente monoclonales específicos a una pluralidad de especies de proteínas codificadas por el genoma celular. Preferiblemente, los anticuerpos están presentes para una fracción sustancial de las proteínas codificadas, o por lo menos para las proteínas relevantes a probar o confirmar un modelo de red biológica de interés. Según lo observado arriba, los métodos para hacer anticuerpos monoclonales son bien conocidos. Ver, por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies: A Laboratory ManuaF (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York, 1988)). En una modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales se presentan contra los fragmentos de péptido sintético diseñados en base a la secuencia genómica celular. Con tal arreglo de anticuerpos, las proteínas celulares se ponen en contacto con e arreglo y su unión se mide con los análisis conocidos en la técnica. Detección de polipéptidos. Electroforesis en gel de dos dimensiones. La electroforesis en gel de dos dimensiones es bien conocida en la técnica e implica comúnmente el enfoque isoeléctrico a lo largo de una primera dimensión seguida por la electroforesis de SDS-PAGE a lo largo de una segunda dimensión. Ver, por ejemplo, Hames y col., Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1990); Shevchenko y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 14440-14445 (1996); Sagliocco y col., Yeast 12: 1519-1533 (1996); y Lander, Science 274: 536-539 (1996). Detección de polipéptidos. Espectroscopia de masa. La identidad así como el nivel de expresión del polipéptido objeto se puede determinar usando la técnica de espectroscopia de masa (EM). La metodología de análisis basada en EM es útil para el análisis del polipéptido objeto aislado, así como el análisis del polipéptido objeto en una muestra biológica. Los formatos de EM para el uso en el análisis de un polipéptido objeto incluyen las técnicas de ionización (I), por ejemplo, pero sin limitarse, desabosrción láser asistida por matriz (MALDI), ionización por electrorocío continua o pulsada (ESI) y métodos relacionados, tales como rocío spray iónico o rocío térmico, e impacto de grupo masivo (MCI). Tales fuentes de iones se pueden igualar con los formatos de detección, incluyendo tiempo de reflectron lineal o no lineal de vuelo (TOF), polo cuadrado único o múltiple, sector magnético único o múltiple, resonancia de ciclotrón de ión de transformación Fourier (FTICR), trampa de iones y combinaciones de los mismos por ejemplo trampa de iones/TOF. Para la ionización, se pueden utilizar numerosas de combinaciones de matriz/longitud de onda (por ejemplo, desabsrorción láser asistida por matriz (MALDI)) o combinaciones de solventes (por ejemplo, ESI). Para el análisis de espectroscopia de masa (EM), el polipéptido objeto se puede solubilizar en un sistema apropiado de solución o reactivo. La selección de un sistema de solución o reactivo, un solvente por ejemplo, orgánico o inorgánico, dependerá de las características del polipéptido objeto y del tipo de EM realizada, y se basa en los métodos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Vorm y col., Anal. Chem. 61 : 3281 (1994) para MALDI; y Valaskovic y col., Anal. Chem. 67: 3802 (1995) , para ESI. La EM de los péptidos también se describen en, por ejemplo, Solicitud PCT Internacional No. WO 93/24834 y Patente Norteamericana No. 5,792,664. Se selecciona un solvente que minimiza el riesgo de que el polipéptido objeto sea descompuesto por la energía introducida para el proceso de vaporización. Un riesgo reducido de la descomposición del polipéptido objeto se puede alcanzar, por ejemplo, incrustando la muestra en una matriz. Una matriz conveniente puede ser un compuesto orgánico tal como un azúcar, por ejemplo, pentosa o un hexosa, o un polisacárido tal como celulosa. Tales compuestos se descomponen termolíticamente en C02 y H20 tal que no se forma ningún residuos que pueda conducir a las reacciones químicas. La matriz también puede ser un compuesto inorgánico, tal como nitrato de amonio, que se descompone esencialmente sin dejar ningún residuo. El uso de éstos y otros solventes es conocido por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,062,935. El rocío eléctrico se ha descrito por Fenn y col., J. Phys. Chem. 88: 4451-4459 (1984); y la Solicitud PCT No. WO 90/14148; y las solicitudes actuales se presentan brevemente en los artículos de revisión. Ver Smith y col., Anal. Chem. 62: 882-89 (1990); y Ardrey, Spectroscopy 4: 10-18 (1992). La masa de un polipéptido objeto determinada por EM se puede comparar a la masa de un polipéptido conocido correspondiente. Por ejemplo, donde el polipéptido objeto es una proteína mutante, el polipéptido conocido correspondiente puede ser la proteína no mutante correspondiente, por ejemplo, proteína de tipo silvestre. Con ESI, la determinación de los pesos moleculares en cantidades femtomolares de muestra es muy exacto debido a la presencia de picos múltiples de iones, que se pueden utilizar para el cálculo de masa. Los niveles sub-atomolares de la proteína se han detectado, por ejemplo, con EM de ESI ((Valaskovic y col., Science 273: 1199-1202 (1996)) y EM de MALDI (Li y col., J. Am. Chem. Soc. 118: 1662-1663 (1996)). Desabsorción láser asistida por matriz (MALDI). El nivel de proteína objeto en una muestra biológica, por ejemplo, fluido corporal o muestra de tejido, no se puede medir por medio de métodos de espectrometría de mas (EM) incluyendo, pero sin limitarse a, las técnicas conocidas en la técnica como desabsorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masa total de tiempo-de-vuelo (MALDI-TOF-EM) y las superficies mejoradas para la desabsorción/ionización láser, espectrometría de masa de tiempo-de-vuelo (SELDI-TOF-EM) según lo detallado adicionalmente abajo. Los métodos para realizar MALDI son bien conocido por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Juhasz y col., Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946 (1996), y ver también, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,777,325; 5,742,049; 5,654,545; 5,641,959; 5.654.545 y 5,760,393 para las descripciones de MALDI y protocolos de extracción retrasada. También se conocen los numerosos métodos para mejorar la resolución. MALDI-TOF-EM ha sido descrito por Hillenkamp y col., Biological Mass Spectrometry, Burlingame & McCIoskey, eds. (Elsevier Science Publ., Amsterdam, 1990) pp.49-60. Se puede utilizar una variedad de técnicas para la detección de marcador usando la espectroscopia de masa. Ver Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Hillenkamp, Ed., pp. 354-362 (1988); Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Karas & Hillenkamp, eds., pp. 416-417 (1988); Karas & Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 2299-2301 (1988); y Karas y col., Biomed Environ. Mass Spectrum 18: 841-843 (1989). El uso de rayos láser en TOF-EM se muestra, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4,694,167; 4,686,366, 4,295,046 y 5,045,694, que se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades. Otras técnicas de EM permiten la volatilización acertada de biopolímeros de alto peso molecular, sin fragmentación, y han permitido que una variedad amplia de macromoléculas biológicas sean analizadas por espectrometría de masa. Superficies mejoradas para la desabsorción/ionización láser (SELDI). Se utilizan otras técnicas que usan las nuevas composiciones del elemento de sonda de EM con las superficies que permiten que el elemento de sonda participe activamente en la captura y montaje de los analitos específicos, descritas como espectrometría de masa de afinidad (AEM). Ver las patentes de SELDI, Patentes Norteamericanas Nos. 5,719,060; 5,894,063; 6,020,208; 6,027,942; 6,124,137; y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0003465. Varios tipos de nuevos elementos de sonda de EM se han diseñado con las superficies mejoradas para la captura de afinidad (SEAC). Ver Hutchens & Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom. 7: 576-580 (1993). Los elementos de sonda de SEAC se han utilizado con éxito para recuperar y unir diversas clases de biopolímeros, particularmente proteínas, explotando su conocimiento con respecto a las estructuras superficiales de proteína y el reconocimiento molecular biospecífico. Los dispositivos de captura de afinidad inmovilizados en la superficie del elemento de sonda de EM, es decir, SEAC, determinan la localización y afinidad (especificidad) del analito para la superficie de sonda, por lo tanto el proceso analítico subsecuente de EM es eficiente.
Dentro de la categoría general de SELDI están tres subcategorías separadas: (1) las superficies mejoradas para la desabsorción clara (ENVÍE), donde el elemento de sonda, es decir, los medios que presentan la muestra, se diseñan para contener las moléculas absorbentes de energía (EAM) en lugar la de "matriz" para facilitar la desabsorción/ionización de los analitos agregados directamente (con claridad) a la superficie. (2) SEAC, donde el elemento de sonda, es decir, los medios que presentan la muestra, son diseñados para contener los dispositivos químicamente definidos y/o biológicamente definidos de la captura de afinidad para facilitar la unión específica o no específico o adsorción (llamada montaje o enlace) de los analitos a la superficie de sonda, por una variedad de mecanismos (principalmente no covalentes). (3) las superficies mejoradas para la unión y liberación fotoinestable (SEPAR), donde el elemento de sonda, es decir, los medios que presentan la muestra, se diseñan o modifican para contener uno o más tipos de moléculas reticuladas químicamente definidas para servir como dispositivos de montaje covalentes. Las especificidades químicas que determinan el tipo y número de puntos de unión fotoinestables de la molécula entre los medios que presentan la muestra de SEPAR (es decir, superficie del elemento de sonda) y el analito (por ejemplo, proteína) pueden implicar cualquiera de uno o más de un número de diversos residuos o estructuras químicas en el analito (por ejemplo los residuos, His, Lys, Arg, Tyr, Phe y Cys en el caso de las proteínas y péptidos). Otros aspectos del estado biológico. En varias modalidades de la invención, aspectos del estado de actividad biológica, o aspectos mezclados se pueden medir para obtener las respuestas al fármaco y trayectoria. Las actividades de las proteínas relevantes para la caracterización de la función celular se puede medir, y las modalidades de esta invención se pueden basar en tales mediciones. Las mediciones de la actividad se pueden realizar por medios funcionales, bioquímicos o de la comprobación apropiados para la actividad particular que es caracterizada. Donde la actividad implica una transformación química, la proteína celular se puede poner en contacto con los sustratos naturales, y el índice de transformación medido. Donde la actividad implica la asociación en unidades multiméricas, por ejemplo, asociación de un complejo de unión de ADN con ADN activado, la cantidad de proteína asociada o consecuencias secundarias de asociación, tales como cantidades de mRNA transcrito, se pueden medir. También, donde solamente una actividad funcional se conoce, por ejemplo, como en control de ciclo celular, la ejecución de la función se puede observar. No obstante se conocen y se miden, los cambios de las actividades de la proteína para formar los datos de respuesta analizados por los métodos de esta invención. En las modalidades alternativas y no limitantes, los datos de respuesta se pueden formar a partir de los aspectos mezclados del estado biológico de una célula. Los datos de respuesta se pueden construir de, por ejemplo, los cambios en ciertas abundancias de mRNA, los cambios en ciertas abundancias de proteína y los cambios en ciertas actividades de la proteína. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más detalladamente las modalidades preferidas de la invención. Estos ejemplos de ninguna manera se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención, según lo definido por las reivindicaciones anexas. Ejemplo 1 Asociación de los polimorfismos comunes en el gen LRRK2 con progreso de la enfermedad de alzheimer (ad) El objetivo de este ejemplo fue probar si las variaciones en el gen LRRK2 están asociadas al progreso de la enfermedad de Alzheimer (AD) en sujetos con deterioro cognoscitivo moderado (MCI). Probamos 2 polimorfismos comunes del gen LRRK2: T1602S y T2352M. Para el gen LRRK2 (SEC ID NO: 1), el análisis por pares del desequilibrio de enlace (LD) mostró que T1602S y T2352M están en LD fuerte (D' = 0.979). Para la mutación de T1602S, la frecuencia del alelo (para el alelo menor) se encontró que es como sigue para las poblaciones pacientes: PD = 27%, AD = 28%, MCI = 29%, ALS = 31%. Mutación de THR1602SER. Progreso de los datos de la enfermedad de Alzheimer de un estudio de 3-4 años en 537 sujetos usados para investigar el efecto de los dos polimorfismos comunes LRRK2 en la probabilidad del progreso de AD. La investigación con respecto al retraso de la diagnosis de la enfermedad de Alzheimer con el estudio Exelon (InDDex) fue un estudio longitudinal controlado por placebo de cuatro años para evaluar la eficacia de Exelon® en los individuos con deterioro cognoscitivo moderado (MCI). El ensayo clínico siguió a los pacientes que sufren de deterioro cognoscitivo moderado y se les administró Exelon® (rivastigmina) a dosis o placebo y fue seguida su conversión a la enfermedad de Alzheimer (AD). Feldman H y coo., Neurology 62: 1199-1201 (2004). El ensayo tuvo un componente de recolección de ADN opcional. En el estudio de InDDEx (MCI), encontramos que el genotipo TT (o Thr/Thr) del polimorfismo T1602S estuvo asociado significativamente a un índice de progreso más alto a la enfermedad de Alzheimer (Tabla 1). Tabla 1 índice de conversión de MCI a AD por el genotipo T1602S Genotipo LRRK2 (T1602S) Conversión Thr/Thr Thr/Ser Ser/Ser Indice 95% Cl Valor P* (n=38) (n=174) (n=217) de a AD riesgo* Si, % 34.21 14.94 17.05 3.009 (1.63, 0.0021 5.56) No% 65.79 85.06 82.95 *Riesgo proporcional Cox. Edad, género y años de la educación fueron incluidos en el modelo.
**Prueba Log-Rank por el tiempo de conversión.
Similar al alelo de APOE-E4, en presencia de una variante de BuChE-K, el polimorfismo de LRRK2 (T1602S) mostró una mayor asociación con el índice de conversión del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer. Para verificar estos resultados, probamos adicionalmente la correlación entre este polimorfismo común de LRRK2 y el funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses en los 178 pacientes de AD tratados con el placebo registrados en el estudio IDEAL. En el estudio IDEAL (AD), el polimorfismo de LRRK2 T1602S mostró una misma tendencia de la asociación observada en el estudio de MCI. Los pacientes de la enfermedad de Alzheimer con el genotipo de TT de T1602S tienden a disminuir más rápidamente el funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses, especialmente en presencia de una variante de BuChE-K.
Mutación de THR2352MET. Además, en el estudio de InDDeX, el genotipo CC (o Thr/Thr) de T2352 mostró una tendencia de asociarse a un índice de conversión más alto de deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer (Tabla 2).
Tabla 2 índice de conversión de MCI a AD por el genotipo T2352M Para verificar estos resultados, probamos adicionalmente la correlación entre los dos polimorfismos comunes LRRK2 (ver arriba) y el funcionamiento cognoscitivo durante los 6 meses en los 178 pacientes de AD tratados con placebo alistados en el estudio IDEAL. En el estudio IDEAL (AD), los polimorfismos de LRRK2 T1602S y T2352 mostraron una misma tendencia de la asociación observada en el estudio de MCI. Los pacientes de la enfermedad de Alzheimer con el genotipo CC de LRRK2-T2352 tendieron a disminuir más rápidamente el funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses, especialmente en presencia de una variante de BuChE-K. Por lo tanto, los polimorfismos comunes en el gen LRRK2 afectan el índice del progreso a la enfermedad de Alzheimer en sujetos con deterioro cognoscitivo moderado, sugiriendo que LRRK2 afecta la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.
Ejemplo 2 Análisis de variaciones genéticas de LRRK2 Mutación de GLY2019SER. En un estudio de pacientes, con los resultados confirmados por re-secuenciación , encontramos lo siguiente: Para la enfermedad de Parkinson (PD): 6 de los 483 pacientes llevaron la mutación de G2019S (1.24%). Para la enfermedad de Parkinson con la demencia (PDD): 1 de los 391 pacientes llevan la mutación de G2019S (0.26%). Para la enfermedad de Alzheimer (AD): Ninguno de los 373 pacientes llevaron la mutación de G2019S. Para la deterioro cognoscitivo moderado (MCI): Ninguno de los 448 pacientes llevaron la mutación de G2019S. Para la esclerosis lateral amiotrófica (ALS): Ninguno de los 483 pacientes llevan la mutación de G2019S. Solamente 4 de los 6 sujetos que llevan la mutación de G2019S tuvieron datos clínicos. Los 4 son hombres caucásicos. El progreso fue relativamente más rápido (mutante contra tipo silvestre, durante 26 semanas), con los siguientes resultados: UPDRSII: 1 contra 0.27. UPDRSIII: 4 contra -0.15. Concluimos que: Aproximadamente 1.24% casos de inicio tardío esporádico llevan la mutación, que es similar a la frecuencia descrita en la literatura. Solamente aproximadamente 0.26% de los casos de PDD llevan la mutación de G2019S. Esta mutación no es común en AD, MCI y ALS. La mutación se puede correlacionar a una disminución más rápida de la función motriz.
Equivalentes Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en la descripción de anexa anterior. Aunque cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos ahora serán descritos. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y reivindicaciones. En la especificación y las reivindicación anexas, las formas singulares incluyen las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según lo entendido comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación, patente, o solicitud de patente individual estuviera indicada como incorporada específica e individualmente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. La presente invención no debe estar limitada en términos de las modalidades particulares descritas en esta solicitud, que tienen el propósito de ser solo ilustrativas de los aspectos individuales de la invención. Muchas modificaciones y variaciones de esta invención pueden ser hechas sin apartarse de su espíritu y alcance, como es evidente para los expertos en la técnica. Los métodos y aparatos funcionalmente equivalentes dentro del alcance de la invención, además de los enumerados en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las descripciones anteriores. Tales modificaciones y variaciones tienen el propósito de estar dentro del alcance de las reivindicación anexas. La presente invención se debe limitar solamente a los términos de las reivindicación anexas, junto con todo el alcance de los equivalentes a los cuales tales reivindicación avalan.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Uso de un agente de modulación LRRK2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en una población de pacientes seleccionada, en donde la población de pacientes se selecciona en base a los polimorfismos en el gen de cinasa 2 repetitiva rica en leucina (LRRK2), que son indicativos del progreso del deterioro cognoscitivo moderado (MCI) a la enfermedad de Alzheimer.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de modulación LRRK2 es un compuesto heterocíclico.
3. El uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer retarda el progreso del deterioro cognoscitivo moderado (MCI) a la enfermedad de Alzheimer en el paciente.
4. El uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer retarda el progreso de la enfermedad de Alzheimer moderada a enfermedad de Alzheimer severa en el paciente.
5. El uso de la reivindicación 1, en donde el polimorfismo en el gen LRRK2 se selecciona del grupo que consiste de T1602S y T2352.
6. El uso de la reivindicación 5, en donde la ubicación de T1602S del paciente tiene un genotipo TT (Thr/Thr).
7. El uso de la reivindicación 5, en donde la ubicación de T2352 del paciente tiene un genotipo CC (Thr/Thr).
8. Un método para predecir el progreso de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que comprende las etapas de: (a) obtención de una muestra de tejido de un sujeto; (b) análisis de la muestra para determinar la presencia de un polimorfismo genético indicativo del progreso del deterioro cognoscitivo moderado (MCI) a enfermedad de Alzheimer en el sujeto; en donde la presencia de un polimorfismo genético indicativo del progreso del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer en el sujeto indica que el sujeto está en un riesgo creciente del progreso del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la muestra de tejido es una muestra de sangre.
10. El método de la reivindicación 8, en donde el polimorfismo genético se selecciona del grupo que consiste de T1602S y T2352.
11. El método de la reivindicación 8, que adicionalmente comprende la etapa de: (c) si el sujeto se diagnostica con un polimorfismo genético indicativo del progreso del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer, entonces se administra al sujeto un agente de modulación de LRRK2 para retardar el progreso del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer o de la enfermedad de Alzheimer moderada a la enfermedad de Alzheimer grave. RES U M E N Se describe el polimorfismo genético de LRRK2 (cinasa 2 repetitiva rica en leucina)-T1602S se asocia sig nificativamente a la conversión del deterioro cognoscitivo moderado (MCI ) a la enfermedad de Alzheimer (AD) , en los pacientes con el genotipo TT q ue están en mayor riesgo de prog resar a la enfermedad de Alzheimer. El LRRK2-T2352 también mostró una tendencia a la conversión a la enfermedad de Alzheimer, en los pacientes con el genotipo CC que tienden a progresar a la enfermedad de Alzheimer. Similar al alelo APOE-E4, en presencia de u na variante de BuChE-K, un LRRK2-T1 602S y un LRRK2-T2352 mostraron una mayor asociación al índice de conversión del deterioro cognoscitivo moderado a la enfermedad de Alzheimer. En otro estudio en los pacientes de la enfermedad de Alzheimer tratados con placebo, LRRK2-T1 602S y LRRK2-T2352 mostraron una misma tendencia de asociación . Los pacientes con enfermedad de Alzheimer con el genotipo TT de LRRK2-T1 602S o con el genotipo CC de LRRK2-T2352 tendieron a disminuir más rápidamente el funcionamiento cognoscitivo durante 6 meses, especialmente en presencia de una variante de BuCh E-K. La asociación entre los dos polimorfismos de LRRK2 y el progreso de la enfermedad de Alzheimer mostró que LRRK2 puede desempeñar una función en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer, especialmente en el prog reso de la enfermedad , y q ue los polimorfismos de LRRK2 se pueden utilizar como marcadores biológicos de este prog reso.
MX2008016524A 2006-06-20 2007-06-18 Biomarcadores para la progresion de la enfermedad de alzheimer. MX2008016524A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US81561006P 2006-06-20 2006-06-20
PCT/US2007/071421 WO2007149798A2 (en) 2006-06-20 2007-06-18 Biomarkers for the progression of alzheimer's disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2008016524A true MX2008016524A (es) 2009-03-09

Family

ID=38834281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2008016524A MX2008016524A (es) 2006-06-20 2007-06-18 Biomarcadores para la progresion de la enfermedad de alzheimer.

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20100035251A1 (es)
EP (1) EP2035582A2 (es)
JP (1) JP2009541336A (es)
KR (1) KR20090019848A (es)
CN (1) CN101473044A (es)
AU (1) AU2007261095A1 (es)
BR (1) BRPI0713738A2 (es)
CA (1) CA2657980A1 (es)
MX (1) MX2008016524A (es)
RU (1) RU2009101384A (es)
WO (1) WO2007149798A2 (es)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009042160B3 (de) * 2009-09-11 2011-04-14 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Verfahren zur Diagnose und/oder Vorhersage der Entwicklung von neurodegenerativen Erkrankungen
JP5781611B2 (ja) 2010-09-02 2015-09-24 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｌｒｒｋ２キナーゼ阻害剤としての２−（ベンジルオキシ）ベンズアミド類
CN103348243A (zh) 2010-11-30 2013-10-09 基因泰克公司 Lrrk2的分析方法和生物标记物
WO2012135631A1 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Arrien Pharmaeuticals Llc Substituted 5-(pyrazin-2-yl)-1h-pyrazolo [3, 4-b] pyridine and pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as protein kinase inhibitors
MX2014015769A (es) * 2012-06-29 2015-04-10 Pfizer 7h-pirrolo[2,3-d]pirimidinas 4-(amino-substituidas)novedosas como inhibidores de lrrk2.
GB201212084D0 (en) * 2012-07-06 2012-08-22 Randox Lab Ltd Tropomyosin isoforms related to alzheimers disease and mild cognitive impairment
WO2015092592A1 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Pfizer Inc. Novel 3,4-disubstituted-1h-pyrrolo[2,3-b]pyridines and 4,5-disubstituted-7h-pyrrolo[2,3-c]pyridazines as lrrk2 inhibitors
WO2017046675A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Pfizer Inc. Novel imidazo [4,5-c] quinoline and imidazo [4,5-c][1,5] naphthyridine derivatives as lrrk2 inhibitors
WO2017087905A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Denali Therapeutics Inc. Compound, compositions, and methods
CN105331721A (zh) * 2015-11-27 2016-02-17 首都医科大学宣武医院 检测pd致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒
US11028080B2 (en) 2016-03-11 2021-06-08 Denali Therapeutics Inc. Substituted pyrimidines as LRKK2 inhibitors
PT3472153T (pt) 2016-06-16 2021-12-31 Denali Therapeutics Inc Pirimidin-2-ilamino-1h-pirazóis como inibidores de lrrk2 para uso no tratamento de distúrbios neurodegenerativos
CN110891954A (zh) 2017-07-14 2020-03-17 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 富含亮氨酸的重复激酶2的抑制剂
EP3873471A4 (en) 2018-10-31 2022-06-15 Merck Sharp & Dohme Corp. N-HETEROARYL INDAZOLE DERIVATIVES AS LRRK2 INHIBITORS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND THEIR USES
US20220259188A1 (en) 2019-06-06 2022-08-18 Merck Sharp & Dohme Corp. 1-pyrazolyl, 5-, 6- disubstituted indazole derivatives as lrrk2 inhibitors, pharmaceutical compositions, and uses thereof
CN114736959B (zh) * 2022-05-09 2023-09-22 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） 轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用
CN117230184B (zh) * 2023-11-13 2024-03-19 深圳康美生物科技股份有限公司 基于飞行时间核酸质谱技术检测阿尔兹海默病基因的核酸组合及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2584489C (en) * 2004-10-21 2014-07-22 Gsf-Forschungszentrum Fur Umwelt Und Gesundheit Gmbh Kaspp (lrrke) gene, its production and use for the detection and treatment of neurodegenerative disorders

Also Published As

Publication number Publication date
RU2009101384A (ru) 2010-07-27
WO2007149798A3 (en) 2008-07-24
WO2007149798A2 (en) 2007-12-27
BRPI0713738A2 (pt) 2014-06-24
EP2035582A2 (en) 2009-03-18
US20100035251A1 (en) 2010-02-11
CA2657980A1 (en) 2007-12-27
AU2007261095A1 (en) 2007-12-27
CN101473044A (zh) 2009-07-01
JP2009541336A (ja) 2009-11-26
KR20090019848A (ko) 2009-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2008016524A (es) Biomarcadores para la progresion de la enfermedad de alzheimer.
EP1869214A2 (en) Biomarkers for pharmacogenetic diagnosis of type 2 diabetes
US20100249107A1 (en) Biomarkers for Alzheimer's Disease Progression
US20070065821A1 (en) Methods for the prediction of suicidality during treatment
CN104937113B (zh) 用于预测由基于抗精神病药物的治疗诱导的锥体外系症状(eps)的发病的方法
AU2005250142B2 (en) Biomarkers for the prediction of responsiveness to clozapine treatment
AU2006227283B2 (en) Biomarkers for efficacy of aliskiren as a hypertensive agent
RU2408363C2 (ru) Биомаркеры для оценки эффективности алискирена в качестве гипертензивного агента
WO2015083685A1 (ja) Ｄｌｇ１／ＳＡＰ９７遺伝子のスプライシングバリアント、及びスプライシングバリアントを利用した統合失調症の検出
KR20070022710A (ko) 클로자핀 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 바이오마커

Legal Events

Date Code Title Description
HH Correction or change in general
FA Abandonment or withdrawal