JP2003210172A

JP2003210172A - Ｎｍｄａ受容体サブユニット遺伝子調節領域を用いた精神分裂病の発症危険度及び／又は重症化因子の検出方法

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Publication number: JP2003210172A
Application number: JP2002010344A
Authority: JP
Inventors: Takeo Yoshikawa; 武男吉川; Masanari Itokawa; 昌成糸川
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2003-07-29
Anticipated expiration: 2022-01-18
Also published as: JP3712195B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤ
Ａ）受容体の遺伝子構造を解析することにより、精神分
裂病との関連性を解明し、その結果得られた知見に基づ
いて、精神分裂病の診断に有用な方法やその方法に使用
するプライマー及びキットを提供することを目的とす
る。【解決手段】ヒト核酸試料からヒトＮ−メチル−Ｄ−ア
スパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子を得、その
上流のプロモーター領域に存在する２塩基（ＧＴ）_ｎ／
（ＣＡ）_ｎ反復配列の繰返し数を測定することを特徴と
する精神分裂病の発症危険度及び/又は重症化因子の検
出方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＮ−メチル−
Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体２Ａサブユニッ
ト（ＮＲ２Ａ）遺伝子の調節領域及びその検出方法に関
し、より詳細には、ヒトＮＲ２Ａ遺伝子上流に存在する
２塩基（ＧＴ）_ｎ／（ＣＡ）_ｎ反復配列の繰返し数を測
定することを特徴とする精神分裂病の発症危険度及び／
又は重症化因子の検出方法及びそのためのキットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】精神分裂病は、複雑な遺伝的背景を有す
る一般的且つ重篤な精神的疾患である。薬理学的又は他
の生物学的研究によって種々の発症機構の仮説や原因と
なる遺伝子の候補が提唱されているが、精神分裂病の正
確な病因については未だ明らかではない(Gainetdinov
R.R. et al. Trends Neurosci. 24, 527-533 (2001)及
びGlenthoj B.Y. & Hemmingsen R. Acta Psychiatr Sca
nd Suppl. 395, 105-112(1999)参照)。

【０００３】これまで、精神分裂病の罹患しやすさと関
連する遺伝子多型としては、ドーパミンＤ３受容体の９
番目のセリン／グリシンの多型が報告されている（Will
iamsJ. et al., Mol. Psychiatry, 1998, 3, 141-14
9）。しかしながら、上記一塩基多型では、罹患危険率
が１．１５倍上昇するという弱い効果しかもたないこと
と、細胞実験レベルでの病態への関与が不明であること
が問題である。

【０００４】また、カテコールアミンの生合成経路の律
速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子
の第一イントロン内に存在するマイクロサテライトＤＮ
Ａの特定の対立遺伝子が精神分裂病と関連していること
が報告されている（特表平１１−５０４８０９号公報参
照）。該特定の対立遺伝子は、精神分裂病の１つの決定
因子と考えられるが、極めて頻度が低いため、その他の
重要な危険因子についても検討する必要がある。

【０００５】さらに、精神分裂病では、ＮＭＤＡ型グル
タミン酸受容体の機能低下を示唆する間接証拠があり、
「ＮＭＤＡ受容体機能低下説」が唱えられている。これ
は、フェンシクリジン（ＰＣＰ）やケタミン等のＮＭＤ
Ａ受容体複合体の非競合型アンタゴニストを正常人に投
与した場合に、精神分裂病の臨床的特徴と極めて類似し
た行動及び認識の欠如が認められることに基づいてい
る。これらの症状は、正常な機能の過剰やひずみとして
概念化され、典型的には、幻覚や妄想を含む陽性症状(P
ositive symptoms)と、正常な機能の減少や欠損を反映
すると考えられている感情鈍麻や自閉性等からなる陰性
症状(Negative symptoms)を含んでいる。ＮＭＤＡ受容
体のアンタゴニスト（拮抗薬）は精神分裂病患者の症状
を悪化させることもできる(Javitt D.C. & Zukin SR. A
m.J. Psychiatr. 148, 1301-1308 (1991)及びMalhotra
A.K. et al. Neuropsychopharmacology 17, 141-150 (1
997)参照)。

【０００６】ヒトＮＭＤＡ受容体複合体は、陽イオンチ
ャンネル型の受容体であって、活性化されるとナトリウ
ム、カリウムイオンだけでなくカルシウムイオンに対し
ても高い透過性を示す。この受容体複合体を構成するサ
ブユニットには、ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２
Ｃ、ＮＲ２Ｄ、ＮＲ３Ａ及びＮＲ３Ｂという７種類が存
在し、ＮＲ１と４種類のＮＲ２サブユニット及び２種類
のＮＲ３サブユニットの何れか１つとでヘテロダイマー
を形成する(Dingledine R. et al. Pharmacol.Rev. 51,
7-61 (1991)参照)。ＮＲ２Ａサブユニットは思春期以
降に発現し、成人期を通じて安定して維持される(Watan
abe M. et al. Neuroreport 3, 1138-1140 (1992)参
照)。精神分裂病の患者の４分の３は１６〜２５歳の間
に発病し、上述したＮＭＤＡ受容体複合体の非競合型ア
ンタゴニストは、思春期以前の個体には精神異常の特徴
を誘導しない(Baldridge E. B. & Bessen H.A. Emerg.
Med. Clin. North Am. 8, 541-550 (1990)及びReich D.
L. & Silvag G. Can. J. Anaesth. 36, 186-197 (1989)
参照)。

【０００７】しかし、このように精神分裂病との関連性
が示唆されるヒトＮＭＤＡ受容体については、これまで
具体的な分子異常は同定されておらず、特にＮＲ２Ａサ
ブユニットは精神分裂病の病態生理学にとって重要な候
補であるだけでなく、分子的レベルでの解析が必要とさ
れている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＮＭＤＡ受
容体の遺伝子構造を解析することにより、精神分裂病と
の関連性を解明することを目的とする。また、その結果
得られた知見に基づいて、精神分裂病の診断に有用な方
法やその方法に使用するプライマー及びキットを提供す
ることを目的とする。

【０００９】さらに、このような遺伝子の解析に基づい
て、精神分裂病の新規な治療薬をスクリーニングする方
法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】精神分裂病は思春期以降
に発病することから、本発明者等はＮＭＤＡ受容体のう
ち思春期以降に発現する２Ａサブユニットに注目し、こ
のＮＲ２Ａ遺伝子の構造を詳細に研究した。その結果Ｎ
Ｒ２Ａ遺伝子上流のプロモーター領域に存在するマイク
ロサテライト反復配列（２塩基（ＧＴ）_ｎ／（ＣＡ）_ｎ
反復配列）が多型性を有し、このマイクロサテライト反
復配列多型の種類と、精神分裂病の罹患しやすさ、及び
／又は症状の重症化との間に顕著な相関関係があること
を見出すことによって本発明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明の第１の視点において、
ヒト核酸試料からヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸
受容体２Ａサブユニット遺伝子を得、その上流のプロモ
ーター領域に存在する２塩基（ＧＴ）_ｎ／（ＣＡ）_ｎ反
復配列の繰返し数を測定することを特徴とする精神分裂
病の発症危険度及び/又は重症化因子の検出方法が提供
される。

【００１２】前記検出方法の好ましい実施形態におい
て、ヒト核酸試料がヒト血液から抽出したＤＮＡである
ことを特徴とする。

【００１３】更に好ましい実施形態において、前記検出
方法は、ヒト核酸試料から得られたヒトＮ−メチル−Ｄ
−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の上流
領域を増幅し、増幅されたＤＮＡの２塩基ＧＴ反復配列
の繰返し数を測定することを特徴とする。

【００１４】別の好ましい実施形態において、前記ヒト
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニッ
ト遺伝子の上流領域の増幅が、配列番号５に示す塩基配
列のうち連続する１０〜３０の塩基配列からなるセンス
プライマーと、配列番号６に示す塩基配列のうち連続す
る１０〜３０の塩基配列からなるアンチセンスプライマ
ーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅を行うこ
とを特徴とする。

【００１５】更に別の好ましい実施形態において、前記
センスプライマーと、前記アンチセンスプライマーとを
用いて増幅されたＤＮＡ断片は８０〜２００塩基対であ
ることを特徴とする。

【００１６】本発明の第２の視点において、配列番号３
に示す塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号
４に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーとか
らなるプライマー対が提供される。このプライマー対
は、前記精神分裂病の発症危険度、及び/又は重症化因
子の検出に用いることができる。

【００１７】本発明の第３の視点において、配列番号５
に示す塩基配列のうち連続する１０〜３０の塩基配列か
らなるセンスプライマーと、配列番号６に示す塩基配列
のうち連続する１０〜３０の塩基配列からなるアンチセ
ンスプライマーとを含むことを特徴とする、ヒトＮ−メ
チル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝
子の上流領域に存在する２塩基（ＧＴ）_ｎ／（ＣＡ）_ｎ
反復配列の繰返し数を測定するためのキットが提供され
る。

【００１８】好ましい実施形態において、前記キットに
含まれるセンスプライマーが配列番号３に示す塩基配列
からなり、アンチセンスプライマーが配列番号４に示す
塩基配列からなることを特徴とする。

【００１９】本発明の第４の視点において、下記一般式
（１）５’Ｘ（ＧＴ）_ｎＹ３’ （１） (式中、Ｘは配列番号１に示す塩基配列であり、Ｙは配
列番号２に示す塩基配列であり、ｎは１〜１００の整数
である）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と、こ
れと機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含むこと
を特徴とする組換えベクターが提供される。この組換え
ベクターを用いて、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン
酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の転写促進物質及び／
又は抑制物質をスクリーニングすることができる。

【００２０】

【発明の実施の形態】本明細書において使用する「対立
遺伝子」(allele)とは、特定の遺伝形質に関する２つ或
はそれ以上の遺伝子の択一的な型の一つ一つの遺伝子型
のことをいう。被験者が２つの同一の対立遺伝子を持つ
場合には「ホモ接合性」(homozygous)と呼ばれ、２つの
異なる対立遺伝子を持つ場合には「ヘテロ接合性」(het
erozygous)と呼ばれる。また、「遺伝子型」(genotype)
とは、着目する遺伝子座の対立遺伝子の組合せをいう。
対立遺伝子型及び遺伝子型の統計的解析には、例えばモ
ンテカルロ法（ＣＬＵＭＰプログラム、Sham P.C. & Cur
tis P. Ann. Hum. Genet. 59, 97-105 (1995)参照）を
用いて行うことができ、ＣＬＵＭＰプログラムは、htt
p://linkage.rockefeller.edu/.から入手できる。

【００２１】「連鎖不平衡」(linkage disequilibrium)
とは、２つの対立遺伝子が所定の母集団において非独立
的に遺伝することが認められるような場合をいう。２つ
の対立遺伝子が独立して遺伝する場合の予想される頻度
は、第１の対立遺伝子の頻度と第２の対立遺伝子の頻度
との積となるが、このような場合を「連鎖平衡」(linka
ge equilibrium)という。「ハプロタイプ」(haplotype)
とは、２以上の対立遺伝子が一緒に遺伝する（連鎖不平
衡）一組の対立遺伝子のことをいう。連鎖不平衡の強さ
を調べるにはハプロタイプの構築、頻度の推定が必要で
ある。連鎖不平衡係数Ｄ(disequilibrium coefficient)
は、Ｄ＝ｈ−ｐ１ｐ２で表され、ｈはハプロタイプの頻
度、ｐ１、ｐ２は２つの遺伝子座における２つの対立遺
伝子の頻度である。Ｄは正の値になったときに連鎖不平
衡が強いということができる。Hardy-Weinberg平衡、２
つの遺伝子座の連鎖不平衡及びハプロタイプ頻度の推定
は、Arlequinソフトウエア(Schneider等)を用いて行う
ことができ、http://anthropologie.unige.ch/arlequin
/methods.htmlから入手することができる。

【００２２】「多型」(polymorphism)とは、遺伝子又は
その一部において２以上の型が存在することをいう。多
型部位は一塩基対の場合（ＳＮＰ）も、或は一定の長さ
の塩基対の場合もある。「マイクロサテライト」(micro
satellite)とは、ゲノム上で比較的豊富に存在する１〜
６塩基程度の反復配列をいう。ヒトゲノムには多くの場
所に分散して２塩基の反復配列(ＧＴ)_ｎ／（ＣＡ）_ｎの
存在が知られており、個体によってこの反復回数に相違
が見られるケース（多型）が多く観察されている。これ
らのマイクロサテライト反復配列は、遺伝子の転写活性
を調節する機能的役割を有することも報告されている。

【００２３】（ＮＲ２Ａ遺伝子上流に存在するマイクロ
サテライト反復配列を含むＤＮＡ断片）本発明に係るマ
イクロサテライト反復配列を含むＤＮＡ断片は、ヒト１
６番染色体(16p13.3)におけるＮＲ２Ａ遺伝子上流のプ
ロモーター領域に存在する。図１はこのＮＲ２Ａ遺伝子
の構造とマイクロサテライト反復配列及びその他の一塩
基多型の存在する位置を示したものである。このマイク
ロサテライト反復配列（ＧＴ）_ｎの繰返し数は、本発明
者等の調べた被験者集団においては、１１〜３９回の範
囲内で変動し、最も高頻度で見出される対立遺伝子は２
４回の繰返し数を有していた。本明細書の以下の実施例
において詳細に説明するように、（ＧＴ） _ｎの繰返し数
が２５回以上の対立遺伝子を有する被験者は精神分裂病
に罹患しやすく、及び／又は症状の重症化を示す。ま
た、上記繰返し数が増加するに従って、ＮＭＤＡ受容体
遺伝子の転写活性が低下することが、この２塩基ＧＴ反
復配列を含むＤＮＡ断片と機能的に結合したレポーター
遺伝子の発現量を測定することによって示された。これ
らの結果は、精神分裂病の診断や治療或は新規な治療薬
の開発においても、上記２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮ
Ａ断片の有用性を示すものである。

【００２４】これらのＤＮＡ断片としては、例えば、ヒ
トＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニ
ット遺伝子上流に存在する２塩基ＧＴ反復配列を含むＤ
ＮＡ断片であって、下記一般式（１）５’Ｘ（ＧＴ）_ｎＹ３’ （１）（式中、Ｘは配列番号１に示す塩基配列であり、Ｙは配
列番号２に示す塩基配列であり、ｎは１〜１００の整数
である）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片があ
る。上記一般式（１）において、配列番号１に示した塩
基配列Ｘは、２塩基ＧＴ反復配列の上流の単一なゲノム
塩基配列であり、配列番号２に示した塩基配列Ｙは、２
塩基ＧＴ反復配列の下流の単一なゲノム塩基配列であ
る。配列Ｙは、ヒトＮＭＤＡ受容体遺伝子のプロモータ
ー配列と転写開始部位（ｍＲＮＡの５’末端に対応する
配列）を含む。（ＧＴ）_ｎが２５回以上繰返す反復配列
は精神分裂病患者において多く認められることから病気
との関連性が示唆される。このＤＮＡ断片の下流に種々
のレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子や緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子等を連結し、脳由来
の培養細胞に導入することにより、これらのレポーター
遺伝子の発現産物（例えば、蛍光強度）に基づいて、精
神分裂病と関連性の高いＮＲ２Ａ遺伝子の発現調節機構
を容易に解析することができる。

【００２５】上記レポーター遺伝子を含むベクターは、
当業者において公知のものの中から適宜選択して使用す
ることができる。例えば、真核細胞のプロモーター配列
とエンハンサー配列を除去したプラスミドに組換えホタ
ルルシフェラーゼ遺伝子とポリアデニル化部位等を備え
たベクターが市販されている（プロメガ社製、ルシフェ
ラーゼレポーターベクター等）。これらのベクターのマ
ルチクローニング部位に上記一般式（１）で表された塩
基配列からなるＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｎ
Ｒ２Ａ遺伝子の発現に関わる制御因子の機能を迅速且つ
簡単に解析することができる。これらの組換えベクター
をトランスフェクトした細胞では、レポーター遺伝子上
流に適切な方向性で挿入したＮＲ２Ａ遺伝子のプロモー
ター活性を、発現させたレポーター遺伝子産物の量（例
えばルシフェラーゼの酵素活性量）として測定すること
ができる。

【００２６】このプロモーター活性の評価は、精神分裂
病の診断や治療の方針を作成するにあたり、或は新規な
医薬品の開発にとって極めて重要な手がかりとなる。例
えば、試験管内の培養細胞系において、該ＤＮＡ断片に
含まれるＮＲ２Ａ受容体遺伝子の発現調節領域に働いて
その転写を促進又は抑制するような物質（薬剤）のスク
リーニングが可能となる。これによって精神分裂病の新
規な治療薬を探索することができる可能性がある。

【００２７】具体的なスクリーニング方法としては、
（ａ）候補化合物の存在下で培養した脳由来の細胞に、
上記一般式（１）で表された塩基配列からなるＤＮＡを
ルシフェラーゼ遺伝子と機能的に結合させた組換えベク
ターで形質転換し、一定時間培養後に該形質転換細胞の
蛍光強度を検出する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で検出
された蛍光強度を、前記候補化合物非存在下での蛍光強
度と比較して、その蛍光強度を増強したり低下させたり
する候補化合物を選択する工程、を含む。前記候補化合
物としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸又はその誘
導体、合成又は天然化合物などが挙げられるがこれらに
限定されない。上記培養細胞の種類や培養方法、或はレ
ポーター遺伝子の種類やそれに対応した検出方法等は当
業者において容易に最適化することができる。

【００２８】（２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数の測定方
法、その方法に用いるプライマー対及びキット）以下の
実施例において詳細に説明するように、本発明は、ヒト
ＮＲ２Ａ遺伝子上流のプロモーター領域に存在する２塩
基ＧＴ反復配列の繰返し数と精神分裂病との関連性に関
する知見に基づいて、精神分裂病の発症危険度（罹患し
やすさ）及び／又は症状の重症化因子を検出する方法、
その方法に用いるプライマー対及びキットを提供する。

【００２９】一つの実施形態において、上記精神分裂病
の発症危険度及び／又は症状の重症化因子の検出方法
は、（ａ）被験者から核酸を含む試料を取得する工程、
（ｂ）該試料中におけるヒトＮＭＤＡ受容体２Ａサブユ
ニット（ＮＲ２Ａ）遺伝子の上流領域を増幅する工程、
及び（ｃ）該上流領域に存在する２塩基ＧＴ反復配列の
繰返し数を測定する工程を含み、該２塩基ＧＴ反復配列
が、少なくとも一方の対立遺伝子において２５回以上繰
り返すと、被験者が精神分裂病に罹患しやすく、及び／
又は症状が重症化しやすいことを示唆する。

【００３０】本発明の検出方法は、被験者のゲノムＤＮ
Ａを含む核酸試料を用いて行う。これらの試料は被験者
の組織、細胞、血液等を含む。特に、簡単な採血によっ
て容易に得られる血液細胞（例えば静脈血から得られる
白血球）が好ましい。その他、繊維芽細胞、上皮細胞、
ケラチノサイトなどのような他の細胞も使用できる。更
に、毛髪や皮膚等の乾燥試料を用いて行うこともでき
る。

【００３１】本発明の検出方法によれば、被験者からの
核酸試料はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や連結酵素
連鎖反応（ＬＣＲ）等の適当な方法により増幅される。
ＤＮＡを増幅するための種々の方法は当業者に公知であ
り、例えば、所望のＤＮＡ断片をクローン化したり、Ｐ
ＣＲ、ＬＣＲ、鎖置換増殖方法(Walker G. et al. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 392-396 (1992))、転写
反応に基づいた増殖方法（ Kwoh D. et al. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA. 86, 1173-1177 (1989))、自己持続
複製反応(Guatelli J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 87, 1874-1878 (1990))、Ｑ−βレプリカーゼシ
ステム(Lizardi P. et al. Bio/Technology 6, 1197-12
02 (1988))、核酸配列に基づいた増殖反応（ＮＡＳＢ
Ａ）(LewisR. Genetic Engineering News 12, 1 (199
2))、修復連鎖反応（ＲＣＫ）等により行うことができ
るがこれらに限定されない。

【００３２】増殖反応産物は、種々の方法により検出す
ることができ、例えば、塩基配列の決定、一本鎖立体配
置の解析、分子量の測定、及び制限酵素切断後の分子量
測定等が含まれる。これらの２以上の技術を組合せて行
う事もまた可能である。分子量の測定は最も簡便な方法
として特に好ましく、当業者に公知の種々の方法があ
る。例えば、ポリアクリルアミド電気泳動やキャピラリ
ー電気泳動、或は質量分析法(WO 94/16101, Cohen et a
l. Adv. Chromatogr. 36, 127-162 (1996), Griffin et
al. Appl. Biochem. Biotechnol. 38, 147-159 (199
3))によっても行うことができる。

【００３３】一本鎖立体配置多型（ＳＳＣＰ）による検
出技術もまた、アクリルアミドゲル等に基づく分離方法
であるが、非変性条件下で行われる。好適なキャピラリ
ー電気泳動によって行うこともできる。この技術は、種
々のＤＮＡ断片をそれらの立体配置（コンフォメーショ
ン）に従って識別し得る(Orita et al. Proc. Natl.Aca
d. Sci. USA. 86, (1989), Cotton Mutat. Res. 285, 1
25-144 (1993), Hayashi Genet. Anal. Tech. Appl. 9,
73-79 (1992))。

【００３４】本発明の好ましい実施形態において、以下
の配列番号３及び配列番号４に示した塩基配列のプライ
マー対を用いるＰＣＲ法により、２塩基ＧＴ反復配列を
含むＤＮＡ断片を増幅する。 5'-ATTCTGGCTCCCTGAGATCAGAG-3'（配列番号３） 5'-GCTGGGTACAGTTATCCCCCT-3'（配列番号４）このプライマー対はそれぞれ２３塩基及び２１塩基の一
本鎖ＤＮＡであって、本発明に係る２塩基ＧＴ反復配列
の上流及び下流領域と特異的に結合し、その結果、約１
３０塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。増幅されたＤＮ
Ａ断片は塩基配列の決定又はＤＮＡ分子量の解析の何れ
の方法によっても２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定
することができる。増幅されたＤＮＡ断片の長さはプラ
イマー対の設計によって任意の長さにすることができる
が、ＤＮＡ断片の長さがあまりに短いと塩基配列の決定
が難しく、又その長さがあまり長いと分子量の解析が困
難となる。増幅反応は、当業者にとって公知の技術であ
る４種類のデオキシヌクレオチドリン酸（ｄＮＴＰｓ）
及びＴａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を含む。

【００３５】ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅は、２ヶ
所以上のゲノム領域を同時に増幅する複合増幅(multipl
ex amplification)を含む。例えば、ＰＣＲ産物の大き
さが異なるようにプライマーを設計することによってＤ
ＮＡ断片を同時に増幅し、及び解析することは当業者に
とって公知である。或は、異なるＤＮＡ断片を増幅する
際に、異なった標識（例えば蛍光波長の異なる色素）を
持ったプライマーを用いることでもそれぞれを別々に検
出することができる。その他、当業者において公知の技
術を用いて２ヶ所以上のゲノム領域を同時に増幅するこ
とができる。

【００３６】本発明の特に好ましい態様において、増幅
されたＤＮＡ断片は、その長さを測定することによって
検出され得る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、こ
のような方法として当業者において周知であり、電気泳
動用のゲルはポリアクリルアミドゲルの他にも適当なも
のを選択して使用することができる。アクリルアミドを
使用する場合は、変性条件で3〜8％、好ましくは4-5％
濃度のゲルが使用できる。その他、高性能ポリマーで作
成されたキャピラリー電気泳動装置を用いることも可能
である。適切な分子量マーカーを使用することによっ
て、このような電気泳動の結果からそのＤＮＡ断片の大
きさを正確に測定することは当業者において容易に行う
ことができる。

【００３７】質量分析法は、増幅されたＤＮＡ断片の分
子量を検出する方法であり、大量の試料を高速で処理で
きる方法として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ (matrix
assisted laser desorption ionization time-of-fligh
t/mass spectrometry)がある。増幅されたＤＮＡ断片か
ら塩、緩衝液、界面活性剤、タンパク質等の不純物を除
去した後、ＭＡＬＤＩプレートへスポットして質量分析
される。即ち、ＤＮＡ断片はレーザー光照射によりイオ
ン化される。電荷を帯びた産物は質量分析機内に作られ
た電場内へ遊離し加速される。加速された電荷分子は真
空空間を飛行し、測定板へと到達する。計測されるのは
レーザー光照射から測定板までの飛行時間(time of fli
ght)であり、この飛行時間は定められた電場空間、飛行
空間においては荷電分子の質量／電荷により一義的に決
まる。

【００３８】本発明に係るＮＲ２Ａ遺伝子の上流領域に
存在する２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮＡ断片を増幅す
るためのプライマー対は、２塩基ＧＴ反復配列の両端の
単一な塩基配列部分にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドプライマー対を公知の方法で化学合成して用いる
ことができる。これらの各プライマーは、２５〜２５０
０塩基対離れた領域においてハイブリダイズすることが
できるが、増幅産物の塩基配列の決定又は分子量の解析
を容易にするため、増幅産物の大きさが１００〜５００
塩基対であることが好ましい。より好ましくは、増幅産
物の大きさは８０〜２００塩基対である。配列番号５に
示した塩基配列は、２塩基ＧＴ反復配列の５’上流領域
の塩基配列であり、この配列の中から連続する１０〜３
０塩基の任意の一本鎖のＤＮＡ配列を選択してセンスプ
ライマーとすることができる。配列番号６に示した塩基
配列は、２塩基ＧＴ反復配列の３’下流領域の塩基配列
であり、この配列の中から連続する１０〜３０塩基の任
意の一本鎖のＤＮＡ配列を選択してアンチセンスプライ
マーを合成することができる。これらのオリゴヌクレオ
チドプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれ
ば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを、更に好
ましくは配列番号３及び配列番号４に示したそれぞれ２
３塩基及び２１塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いることができる。これらのプライマーは増幅された
ＤＮＡ断片の検出を容易にするために標識することがで
きる。標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、
蛍光色素、ストレプトアビジン、アビジン、磁気ビー
ズ、抗原及び抗体等が用いられる。

【００３９】ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容
体２Ａサブユニット遺伝子上流に存在する２塩基（Ｇ
Ｔ）_ｎ／（ＣＡ）_ｎ反復配列の繰返し数を測定するため
のキットには、これらのプライマー対を含むことができ
る。これらのプライマー対のほかに当業者にとって公知
の他の構成試薬、例えば、ＤＮＡの抽出や精製用の試薬
を含んでいても良い。その他、４種類のデオキシヌクレ
オチドリン酸（ｄＮＴＰｓ）やＴａｑポリメラーゼ等の
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等も含まれ得る。

【００４０】（２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数と精神分
裂病との関連性）精神分裂病患者及び対照被験者の各対
立遺伝子について測定された２塩基ＧＴ反復配列の繰返
し数の結果から、この２塩基ＧＴが２５回以上繰り返す
と、精神分裂病に罹患しやすいことが分かる。例えば、
図２は、本発明の実施例において解析された精神分裂病
患者と対照者における（ＧＴ）_ｎの対立遺伝子の分布を
表すが、被験者対立遺伝子の中で最も頻度が高いのは２
４回の繰返しであること及び２５回以上の繰返しを有す
る対立遺伝子は、対象者よりも精神分裂病患者に多いこ
とが理解される。

【００４１】本発明の検出方法を用いた精神分裂病の診
断は、１つの対立遺伝子型だけでも、または複数の対立
遺伝子からなる遺伝子型を調べることによってもでき
る。例えば、（ＧＴ）_ｎの繰返し数の測定や、この繰返
し数が一定の範囲内にあるものをグループとして同定す
ることもできる。（ＧＴ）_ｎの繰返し数は一定の範囲に
わたって分布するため、多くの種類の対立遺伝子が存在
することになるが、これらをその繰返し数が２５回以上
のＬ型と、２４回以下のＳ型に分類することによって、
便宜上２つの対立遺伝子として解析することができ、更
に連鎖不平衡やハプロタイプの解析を行うために適して
いる。このような２つの対立遺伝子型に分類することが
遺伝学的に妥当であることは後述する実施例において詳
細に示される。実施例に示した表２はこのような分類に
従って行った症例対照法の結果を示す。表２に示したデ
ータに基づいて説明すると、遺伝子型がＬ／Ｌというタ
イプの個人は、健常人対照群では１０％の頻度である
が、精神分裂病の患者では１９％の頻度で存在すること
から、Ｌ／Ｌという遺伝子型を有する個人は他の遺伝子
型に比べて精神分裂病の発症の可能性が約１.９倍高い
ということができる。

【００４２】本発明に係るマイクロサテライト反復配列
の多型と精神分裂病患者の症状の重症度については、本
発明の方法により測定された精神分裂病患者の２塩基Ｇ
Ｔ反復配列の繰返し数と、臨床的な症状を観察すること
によって明らかにすることができる。臨床的症状の観察
は、精神科の医師により、米国精神医学会の精神疾患の
診断・統計マニュアル第４版（ＤＳＭ−IV）に基づいて
診断され、例えば、ＰＡＮＳＳ法を用いて行うことがで
きる。

【００４３】また、本発明の検出方法は、他の任意の測
定方法と組合せて診断の正確性を向上することができ
る。他の方法は、遺伝子検査であっても血清タンパク質
の検査であっても何れでも良い。例えば、同じＮＲ２Ａ
遺伝子の近傍に存在する一塩基多型との組合せでもよい
し、他の遺伝子（ＮＭＤＡ受容体遺伝子であるか否かを
問わない）であっても良い。或は、血清中の神経伝達物
質の濃度測定と組み合わせることもできる。

【００４４】（薬理遺伝学）また、すでに精神分裂病を
発症している患者にとっては、その病因を解析すること
により、適切な治療方針の可能性を見出すことができ、
個人の遺伝的背景に基づいた薬理遺伝学を可能とする。
例えば、本発明に係るマイクロサテライト反復配列につ
いてＬ／Ｌ型の遺伝子型を有する精神分裂病患者または
患者グループは、ＮＭＤＡ受容体の機能低下が病因とな
っている可能性があり、また、他の遺伝子型の患者に比
べて症状が重症化しやすいことを予見でき、これらの知
見に基づいて適切な治療薬や治療方針を計画することが
できる。例えば、神経伝達物質の１つであるグリシン
は、アロステリック様の作用でＮＭＤＡ受容体を活性化
し、精神分裂病のある種の陰性症状を改善することが知
られている。本発明の方法により、精神分裂病の病因と
してＮＭＤＡ受容体の機能の低下を検出することができ
れば、ＮＭＤＡ受容体を活性化することによる治療方法
等が考えられ得る。

【００４５】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００４６】[実施例１] 被験者精神分裂病の診断は、米国精神医学会の精神疾患の診断
・統計マニュアル第４版（ＤＳＭ−IV）に基づいた。少
なくとも２人の経験豊かな精神科医が診察を行って、一
致した結果を基に患者と診断した。血縁関係のない精神
分裂症の患者は、175人の男性（平均年齢44.9±12.4）
と128人の女性（平均年齢46.2±13.9）から構成され
た。対照被験者は、精神病でないことが文書で証明され
た病院のスタッフ、及び精神科医の簡単な面接によって
精神医学的に問題の無いことが示された企業勤務者から
集められ、121人の男性（平均年齢42.9±8.8）と184人
の女性（平均年齢42.7±15.1）を含んだ。家系に基づい
た関連性の検討を行うため、49人の精神分裂病患者とそ
の両親を別に収集した。すべての被験者は日本中部に在
住した。本発明における遺伝子解析は、理化学研究所と
東京医科歯科大学の倫理委員会によって許可されたもの
であり、すべての被験者はインフォームドコンセントを
与えた。

【００４７】[実施例２] ＮＲ２Ａ遺伝子の構造と多型
の解析ＮＲ２ＡｃＤＮＡの５’末端を決定するためにMarathon
-Ready cDNA kit (クロンテック社、Palo Alto, Califo
rnia)と、ＮＲ２ＡｃＤＮＡに特異的な２種類のプライ
マーＧＳＰ１： 5'-TCATCTCCAGGGCTGATGGCTGCGG-3'（配
列番号７）及びＧＳＰ２：5'-ATTCTCAGCGCTCACCCGGTCCC
AT-3' （配列番号８）とを用いてｃＤＮＡの５’末端の
高速増幅(ＲＡＣＥ)を行い、５’−ＲＡＣＥ断片をクロ
ーニング及び塩基配列を決定した。さらに、26人の精神
分裂病患者のＮＭＤＡ、ＮＲ２Ａサブユニット遺伝子の
すべてのエクソン、スプライシングの境界領域及び５’
上流領域をＰＣＲ直接塩基配列決定(PCR-direct sequen
cing)することによってＤＮＡ多型のスクリーニングを
行った。プロモーター上流領域に存在する（ＧＴ） _ｎ反
復配列は、ＰＣＲ産物をＴＡベクター（インビトロジェ
ン社、Carlsbad, California）にクローン化し、それら
の塩基配列を決定した。

【００４８】マイクロサテライト反復配列多型を含むゲ
ノムＤＮＡ断片を増幅するために、非標識の上流プライ
マー：5'-ATTCTGGCTCCCTGAGATCAGAG-3'（配列番号３）
と蛍光標識した下流プライマー：5'-GCTGGGTACAGTTATCC
CCCT-3'（配列番号４）とを用いた。ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）は、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造株式会社製）を用いて、初期変性を９４℃で１
分間行ったあと、９４℃で１５秒間、６３℃で３０秒
間、７２℃で４５秒間のサイクルを４０回、最後に７２
℃で２分間の伸長反応を１回行った。ＰＣＲ産物はジー
ンスキャン（GeneScan）ソフトウエアを搭載したＡＢＩ
３７００ＤＮＡシーケンサー（ＰＥアプライドバイオシ
ステム社）を用いて塩基配列を決定した。-1245位のＣ
からＴへの一塩基多型、1275位のＧからＡへの一塩基多
型、及びイントロン１０の101位のＣからＴへの一塩基
多型は、ＰＣＲに基づいた制限酵素断片長多型(ＲＦＬ
Ｐ)によって解析した。

【００４９】その結果、ＮＲ２ＡｃＤＮＡの５’末端
は、これまで報告されていた塩基配列（GenBank Acc. N
o. NM_000833.2）よりも１３５塩基対(bp)長いことを見
出した。ＮＲ２Ａ遺伝子のゲノム構造はｃＤＮＡの塩基
配列と、GenBankに登録された対応するゲノム領域を含
むＢＡＣ(bacterial artificial chromosome)クローン
の塩基配列とを比較して決定した。これらのＢＡＣクロ
ーンの登録番号はAC007596（エクソン１〜３を含む）、
AC026423（エクソン４を含む）及びAC006531（エクソン
５〜１４を含む）である。ＮＲ２Ａゲノム遺伝子は、図
１に示したように１４個のエクソンからなり、ヒト１６
番染色体の16p13.3に少なくとも１３１キロ塩基対(kb)
にわたって存在する。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）はエク
ソン３にあり、終止コドンはエクソン１４にある。この
ＮＲ２Ａゲノムの遺伝子構造に基づいて、血縁関係のな
い２６人の精神分裂病患者のＮＭＤＡ、ＮＲ２Ａサブユ
ニット遺伝子のすべてのエクソン、スプライシングの境
界領域及び第１エクソンの上流1094塩基対までの領域に
ついて変異のスクリーニングを行った。その結果、以下
の５ヶ所の多型部位が認められた：-1245位のＣからＴ
への一塩基多型（-1245C>T）、５’調節領域の（ＧＴ）
_ｎの反復配列、-351位のＧからＡへの一塩基多型(-351G
>A)、1275位のＧからＡへの一塩基多型(1275G>A)、及び
イントロン１０の101位のＣからＴへの一塩基多型(IVS1
0+101C>T)である（塩基配列の番号は翻訳開始コドンの
Ａを＋１とし、イントロン部分は除いて計数した。但
し、５’調節領域の（ＧＴ）_ｎの反復回数はｎ＝２６と
した。図１参照）。（ＧＴ）_ｎの３’末端は-679位に位
置した。調べた試料の中で、（ＧＴ）_ｎの反復回数は１
１個から３９個であった。-351位のＧからＡへの一塩基
多型は、２６人の患者のうち１人のヘテロ対立遺伝子に
存在する稀な多型であった。

【００５０】[実施例３] マイクロサテライト反復配列
多型及びＳＮＰｓの遺伝子型と精神分裂病との相関性の
統計的解析 -351G>Aを除き、すべての塩基配列の変異を日本人の精
神分裂病患者303人と対照者305人の試料について分類し
た。-1245C>T、1275G>A、及びIVS10+101C>Tの一塩基多
型についての遺伝子型及び対立遺伝子型を比較したが、
精神分裂病と対照群とで有意な差は認められなかった
（それぞれ、Ｐ＝0．36、0．73及び0．97）。すべての
遺伝子型分布は、Hardy-Weinberg平衡の範囲内であっ
た。これらの一塩基多型の間の連鎖不平衡解析の結果
は、1275G>AとIVS10+101C>Tとの間には強い連鎖不平衡
（精神病患者について：Ｄ＝0．036、Ｄ’（標準化した
Ｄ）＝0．708、Ｐ＜0．00001；対照者について：Ｄ＝
0．038、Ｄ’＝0．702、Ｐ＝0．00001）を示したが、-1
245C>Tと1275G>A（Ｐ＞0．05）及び-1245C>TとIVS10+10
1C>T（Ｐ＞0．05）との間には連鎖不平衡は認められな
かった。

【００５１】

【表１】ＮＲ２Ａ遺伝子内に存在する一塩基多型の分布

【００５２】ヒトＮＲ２Ａ遺伝子の５’上流調節領域に
存在するマイクロサテライト反復配列の対立遺伝子型(a
llele)及び遺伝子型(genotype)の比較は、モンテカルロ
法により、ＣＬＵＭＰのプログラムを用いて行った。そ
の結果、これらの対立遺伝子型と精神分裂病との間に顕
著な相関（Ｐ＝0．0178）が認められた。

【００５３】精神分裂病患者及び対照正常人の５’上流
のプロモーター領域における２塩基ＧＴ反復配列の繰返
し数の分布を図２に示した。繰返し数が２４回よりも多
い対立遺伝子の頻度は、対照群よりも精神分裂病患者の
方が大きいことから、このマイクロサテライト対立遺伝
子をその長さによって２つのクラスに分類した。すなわ
ち、その繰返し数が２５回以上のＬ型と、その繰返し数
が２４回以下のＳ型である（図２参照）。Ｌ型とＳ型の
対立遺伝子は、それぞれ-1245Ｃと-1245Ｔの一塩基多型
と連結していた（精神分裂病患者についてＤ（Ｄ’）＝
0．011（0．500）、Ｐ＝0．015；対照者についてＤ
（Ｄ’）＝0．011（0．778）、Ｐ＝0．004）。これらの
結果は、マイクロサテライト反復配列について上記Ｌ型
及びＳ型という２種類の対立遺伝子への分類が遺伝学的
に妥当であることを示し、このことは更に後述する機能
的解析によっても支持される。

【００５４】Ｌ型及びＳ型の２種類の対立遺伝子の分類
に従って行った症例対照法の結果を表２に示した。その
結果、この２種類の対立遺伝子に関する遺伝子型の分布
は、精神分裂病の患者と対照群とで著しく異なっていた
（CLUMP P=0.0035）。精神分裂病患者の試料の遺伝子型
は、Ｌ／Ｌ型（Ｐ＝0．004、χ^２＝8．42、ｄｆ＝１、
オッズ比＝1．98、95％信頼区間＝1．24〜3．11）、及
び（Ｌ／Ｌ＋Ｌ／Ｓ）型（Ｐ＝0．007、χ^２＝7．22、
ｄｆ＝１、オッズ比＝1．55、95％信頼区間＝1．12〜
2．13）の数が著しく多く、Cochran-Armitage直線性傾
向テストの結果、少なくとも１つのＬ型の対立遺伝子の
存在によって、精神分裂病の危険性が著しく増加するこ
とが分かった（Ｐ＝0．003、χ^２＝9．07、ｄｆ＝
２）。更に、精神分裂病患者におけるＬ型の対立遺伝子
の頻度は、対照群のそれと明らかに異なった（Ｐ＝0．0
004、及びBonferroni相関後のＰ＝0．0008、χ^２＝12．
5、ｄｆ＝１、オッズ比＝1．54、95％信頼区間＝1．21
〜1．95）（表２参照）。

【００５５】

【表２】マイクロサテライト反復配列の遺伝子型及び対
立遺伝子型の分布

【００５６】-1245C>Tの一塩基多型と（ＧＴ）_ｎの２種
類の対立遺伝子によって規定されるハプロタイプの分布
は、精神分裂病と対照群とで著しく異なった（ＣＬＵＭ
Ｐ通常のカイ二乗Ｐ＝0．0016）。-1245ＣとＬ型の（Ｇ
Ｔ）_ｎからなるハプロタイプは精神分裂病において過度
に存在していた（Ｐ＝0．001、χ^２＝10．2、ｄｆ＝
１）。このことは、マイクロサテライト反復配列の周辺
のゲノム領域が精神分裂病の素因を与えることが確認さ
れた。

【００５７】被験者である日本人集団は均一であると考
えられるが、内在的な層別化のために症例対照法の結果
に問題があり擬陽性の結果が得られる恐れもある。そこ
で、これを検証するため49の精神分裂病家系（精神分裂
病患者とその両親）を用いて系統不平衡テスト（ＰＤ
Ｔ、Martin E.R. et al. Am. J. Hum. Genet. 67, 147-
154 (2000)参照）を行い、その結果を下記表３に示し
た。ＰＤＴを行うためのソフトウエアはhttp://wwwchg.
mc.duke.edu.から入手した。系統不平衡テスト（ＰＤ
Ｔ：pedigree disequilibrium test）は、多くの対立遺
伝子の分析から生ずる統計的数値の上昇を、包括値(glo
bal score)を計算することにより是正することができ
る。この包括値を求めた結果、マイクロサテライト反復
配列多型は全体として精神分裂病と関連していることが
分かった（Ｐ＝0．026、χ^２＝24．6、ｄｆ＝13）。表
３に示したように、Ｌ型に分類される（ＧＴ）_２５と
（ＧＴ）_２７の２つの対立遺伝子は、両親から患者であ
る子孫に過度に伝達され、統計的な有意性（Ｐ＝0．00
3）と傾向（Ｐ＝0．070）を示した。

【００５８】

【表３】マイクロサテライト反復配列の系統不平衡テス
ト（ＰＤＴ）結果

【００５９】[実施例４] プロモーター活性の測定のた
めのルシフェラーゼアッセイ上記マイクロサテライト反復配列はＮＲ２Ａ遺伝子の上
流の発現調節領域に存在していたため、この２塩基（Ｇ
Ｔ）_ｎがプロモーター活性に及ぼす影響を、試験管内に
おけるレポーターアッセイシステムを用いて検討した。
（ＧＴ）_ｎの繰返しが１２、２４及び３９であるホモ接
合体ＤＮＡから、以下のプライマー対を用いて２塩基
（ＧＴ）_ｎを含むプロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅
した。

【００６０】5'-ATTCTGGCTCCCTGAGATCAGAG-3'（配列番
号３） 5'-AAGCCCTAGGAGCTCCCCTCCA-3'（配列番号９）

【００６１】増幅したそれぞれのＤＮＡ断片は、エンハ
ンサーのないｐＧＬ３−ｂａｓｉｃプラスミド（プロメ
ガ社、Madison, Wisconsin）に結合した。マイクロサテ
ライト反復配列のない組換え体も同時に構築した。ヒト
神経芽細胞腫細胞を２４穴プレートにそれぞれ１×１０
^５個ずつプレーティングし、１０％牛胎児血清添加した
ダルベッコ最小必須培地（シグマ社製、St. Louis, Mis
souri）で増殖させた。この培養細胞に、各プロモータ
ー断片を持ったｐＧＬ３−ｂａｓｉｃプラスミド１μｇ
を、内部標準として用いたｐＲＬ−ＴＫプラスミド０．
１μｇと共にLipofectAMINE 2000（Invitrogen社製）を
用いて共形質転換（co-transfection）した。４８時間
後、細胞を収集し、溶解してPicagene Dual Seapansy k
it reagents (Toyo B-Net社製)とLumat LB 9507蛍光光
度計（Berthold Direct, Chicago,Illinois）を用いて
蛍光強度を測定した。

【００６２】その結果を図３に示した。図３の横軸に示
した繰返し数の（ＧＴ）_ｎ反復配列を含むプロモーター
の転写活性を、レポーター遺伝子の発現産物であるルシ
フェラーゼ活性を指標として縦軸にプロットした。レポ
ーター遺伝子の転写活性は、（ＧＴ）_ｎの長さが長くな
るに従って抑制されていることが分かった。最も一般的
な繰返し回数である２４回の反復回数を有するプラスミ
ドのプロモーター活性は、（ＧＴ）_ｎ繰返し配列を持た
ない組換え体の約半分であった。（ＧＴ）_３９の組換え
体の活性は（ＧＴ）_ｎ繰返し配列を持たない組換え体の
活性の約３９％であった。

【００６３】[実施例５] ＭＫ８０１結合アッセイ脳内において、ＮＭＤＡ受容体は皮質層で最も大量に発
現されており、皮質層における受容体調節不全が精神分
裂病の病理と関係づけられている。従って、遺伝子型の
決定された死後脳の皮質層におけるＮＭＤＡ受容体の結
合部位の数を、トリチウム標識したＭＫ８０１リガンド
を用いて調べた。ＭＫ８０１（(+)-5-methyl-10,11-dih
ydro-5H-dibenzo[a,d]cycloheptane-5,10-imine）はＮ
ＭＤＡ受容体のチャンネル孔に結合する非競合的なアン
タゴニストであって高い親和性を有する。脳の解剖は、
Toru等の方法(Toru M et al. Acta. Psychiatr. Scand.
78, 121-137 (1988))に従って行った。トリチウム標識
したＭＫ８０１結合実験はKornhuber等の方法の変法に
より行った。即ち、神経細胞膜の標品(0.2 mg/ml)を1 m
lのアッセイバッファー中で、3 nM [³H]MK801 (Perkin
Elmer, Boston, MA),10μM glycine (シグマ社)及び10
μMの非標識ＭＫ８０１と共に３０℃、１５時間インキ
ュベートした。その後、反応液をワットマンＧＦ／Ｂ濾
紙（ケント社、UK）で濾過することによってインキュベ
ートを停止した。

【００６４】その結果を図４に示した。図４に示したよ
うに、２つのＬ型対立遺伝子を有する被験者（Ｌ／Ｌ）
は、Ｓ型のホモ接合性対立遺伝子を有する被験者（Ｓ／
Ｓ）に比べて、図中の（ａ）前頭皮質、（ｂ）頭頂皮
質、（ｃ）側頭皮質、及び（ｄ）後頭皮質における[³H]
MK801への特異的結合が１１％〜５％減少していた。全
皮質層のデータをまとめると、図４（ｅ）に示したよう
にＬ／Ｌ遺伝子型の被験者試料はＳ／Ｓ遺伝子型の被験
者試料よりも著しく結合部位が少なかった。

【００６５】[実施例６]精神分裂病の臨床症状と（Ｇ
Ｔ）_ｎの長さとの相関本発明者等は次に、（ＧＴ）_ｎの繰返し数によって規定
される遺伝子型と精神分裂病の臨床的表現型との関係に
ついて調べた。精神分裂病の症状の重症度を評価するた
めに、患者の遺伝子型を知らない２人の精神科医の一致
した診断によるＰＡＮＳＳ法を用いた。その結果を図５
に示した。図５に示したように、より長い繰返し数を有
するホモ接合性の対立遺伝子を持つ被験者は、陽性及び
陰性症状共に大きなスコアを示した。（ＧＴ）_２３／
（ＧＴ）_２３、（ＧＴ）_２４／（ＧＴ）_２４、及び（Ｇ
Ｔ）_２５／（ＧＴ）_２５のホモ接合性の対立遺伝子を持
った患者は、（ＧＴ）_２２／（ＧＴ）_２２のホモ接合性
の対立遺伝子を持った患者に比べて、それぞれ50％、69
％及び106％の陽性症状の増加を示した。（ＧＴ）_ｎの
長さと陽性症状の相関係数（ｒ）は0．986（Ｐ＝0．00
7）であった。同様に、（ＧＴ）_ｎの繰返し数と陰性症
状の重症度とのあいだにも正の相関性が認められた（ｒ
＝0．882、Ｐ＝0．05）。

【００６６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ヒトＮＲ２Ａ遺
伝子のプロモーター領域にある２塩基（ＧＴ）_ｎ／（Ｃ
Ａ）_ｎ反復配列の繰返し数を調べることにより、被験者
が精神分裂病に罹患しやすく、及び／又は症状が重症化
しやすいか否かが示される。この方法は精神分裂病の診
断や治療薬の選択等、個人の遺伝的素因に基づいた医療
の提供を可能とする。また、本発明の一般式（１）で表
される塩基配列からなるＤＮＡ断片は、精神分裂病患者
におけるＮＲ２Ａ遺伝子の発現調節機構の研究や、ＮＲ
２Ａ遺伝子の発現調節に効果のある薬剤のスクリーニン
グに有用である。

【００６７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Method for detecting an increased risk and/or symptom severity for schizophrenia using regulatory region of NMDA receptor 2A subunit gene <130> RJH13-157N <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 attctggctc cctgagatca gaggagtggg ttcccgtacg ggggtggcga ggcacaggga 60 gaagcattgg agcagactct 80 <210> 2 <211> 807 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cggcgcgcct gtgcgtggag ggggataact gtacccagcg cgaggcactg ggggaggagg 60 aagcggtagc agagatctga ataattgatt cttcagccgc accagacgcc cgggagcggg 120 cggagagcgt ggttccaaca ccacggacag cagcgcgcgc cgccgcaggc gcccccgtcg 180 ccagccagcc acctatcctg gccttatttg ccgccgtgcg ctctcggaac gggtggccgc 240 gctccgcgtc gccgccgagg gactgcgggg tctgtctcga cccacctagg agagaggctg 300 cgggcaggag acgctttcgc ccgccggagc tcgaagcctc ttgggcttga gcgggggcta 360 ctgcgtctcg ccggctgaga acaagtccct aagttggtgt ggagggcgcc gctaccttcc 420 ttctcctctt cctcggaggc gaccgcagca gaaagacgcc ccgggaaccc ggctttgcca 480 gtgctgtgaa ccagggtgtc caggcgctca ccggactccc gctgggaagt ggggagccga 540 acgcccggcg cggagctggc ccagcagcga agggcccgga gggagctgcc tttccccgcc 600 cgcgcctctc tcggccgggg accgcgggga tccccggcca cacgcgagcg cgctcccaca 660 ctcacacaca cactcgccct caaacacacc agcccggagc tgggttgcgg agagggtgct 720 ccggcgcgct cagaggaccg ggcagttgcc gtccggagtg gggcaggaag cggagctagg 780 gatcttggag gggagctcct agggctt 807 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:non-labeled upstream primer <400> 3 attctggctc cctgagatca gag 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fluorescently labeled downstream primer <400> 4 gctgggtaca gttatccccc t 21 <210> 5 <211> 364 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcaaaacctc ttagaattta agaccccttt ccttccaagg cctgaaaggc agacaggcgt 60 tggagataca ggtgaatata aaaggggcag agctcctccc ttgaccatgt atttcatgcc 120 cagtcgctag aattcaagtc aaccaagccc tcacacaccc gggccgtccc atgttctctg 180 gctcacctct tctggtagct tagaagtggc agcctcaggg aggcttctgt ttggtagaac 240 ttagaaggaa gcatgtggga aatgcagatg tctttgcttt taggattctg gctccctgag 300 atcagaggag tgggttcccg tacgggggtg gcgaggcaca gggagaagca ttggagcaga 360 ctct 364 <210> 6 <211> 492 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggttcacagc actggcaaag ccgggttccc ggggcgtctt tctgctgcgg tcgcctccga 60 ggaagaggag aaggaaggta gcggcgccct ccacaccaac ttagggactt gttctcagcc 120 ggcgagacgc agtagccccc gctcaagccc aagaggcttc gagctccggc gggcgaaagc 180 gtctcctgcc cgcagcctct ctcctaggtg ggtcgagaca gaccccgcag tccctcggcg 240 gcgacgcgga gcgcggccac ccgttccgag agcgcacggc ggcaaataag gccaggatag 300 gtggctggct ggcgacgggg gcgcctgcgg cggcgcgcgc tgctgtccgt ggtgttggaa 360 ccacgctctc cgcccgctcc cgggcgtctg gtgcggctga agaatcaatt attcagatct 420 ctgctaccgc ttcctcctcc cccagtgcct cgcgctgggt acagttatcc ccctccacgc 480 acaggcgcgc cg 492 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GSP1 <400> 7 tcatctccag ggctgatggc tgcgg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:GSP2 <400> 8 attctcagcg ctcacccggt cccat 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:downstream primer <400> 9 aagccctagg agctcccctc ca 22

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ａサブユニット遺伝子
の構造と多型部位を示した図である。塩基配列の位置
は、翻訳開始コドンのＡを＋１として計数し、表示し
た。箱型はエクソンを表示し、内部の数字はエクソンの
大きさ（塩基対）を示す。水平方向の矢印は、該当領域
の塩基配列がGenBankに登録されているＢＡＣクローン
の番号を示す。

【図２】精神分裂病患者と対照者における（ＧＴ）_ｎの
対立遺伝子の分布を表す。対立遺伝子の大きさ（横軸）
はＧＴ反復配列の繰返し数を示す。

【図３】（ＧＴ）_ｎのプロモーター活性に及ぼす影響を
示す。ルシフェラーゼ活性（縦軸）は、２４回の繰返し
数を有する組換え体の蛍光強度に対する相対値で示す。
それぞれの値は、４回の独立した形質転換実験（３重測
定）の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。

【図４】死後脳の大脳皮質におけるトリチウム標識ＭＫ
８０１の結合を表す。結合部位の数は、Ｓ／Ｓ遺伝子型
（５人の精神分裂病患者及び７人の正常人）及びＬ／Ｌ
遺伝子型（１人の精神分裂病患者及び１人の正常人）の
個人の（ａ）前頭部、（ｂ）頭頂部、（ｃ）側頭部、
（ｄ）後頭部及び（ｅ）全体の皮質について測定した。
結合部位の数は、それぞれの部位について１４人の被験
者平均値に対する百分率（％）で表した。Ｐ＝0．0054

【図５】症状の重症度とＧＴ反復配列の長さの関係を表
す。データ（縦軸）は、ＰＡＮＳＳ法による陽性及び陰
性度の平均値±ＳＥＭを表す。診断された患者の数は、
（ＧＴ）_２２／（ＧＴ）_２２遺伝子型については１人、
（ＧＴ）_２３／（ＧＴ） _２３遺伝子型については２人、
（ＧＴ）_２４／（ＧＴ）_２４遺伝子型については５人、
及び（ＧＴ）_２５／（ＧＴ）_２５遺伝子型については５
人である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA11 CA02 CA05 HA14 4B063 QA18 QA19 QQ03 QQ43 QR38 QR62 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト核酸試料からヒトＮ−メチル−Ｄ−ア
スパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子を得、その
上流のプロモーター領域に存在する２塩基（ＧＴ）_ｎ／
（ＣＡ）_ｎ反復配列の繰返し数を測定することを特徴と
する精神分裂病の発症危険度及び／又は重症化因子の検
出方法。
【請求項２】前記ヒト核酸試料がヒト血液から抽出した
ＤＮＡである、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】ヒト核酸試料から得られたヒトＮ−メチル
−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の
上流領域を増幅し、増幅されたＤＮＡの２塩基ＧＴ反復
配列の繰返し数を測定する、請求項１又は２に記載の検
出方法。
【請求項４】配列番号５に示す塩基配列のうち連続する
１０〜３０の塩基配列からなるセンスプライマーと、配
列番号６に示す塩基配列のうち連続する１０〜３０の塩
基配列からなるアンチセンスプライマーとを用いたポリ
メラーゼ連鎖反応により増幅を行う請求項１〜３何れか
一項に記載の検出方法。
【請求項５】前記センスプライマーと、前記アンチセン
スプライマーとを用いて増幅されたＤＮＡ断片が８０〜
２００塩基対である請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】配列番号３に示す塩基配列からなるセンス
プライマーと、配列番号４に示す塩基配列からなるアン
チセンスプライマーとからなるプライマー対。
【請求項７】請求項６記載のプライマー対を用いた請求
項１〜５何れか一項に記載の検出方法。
【請求項８】配列番号５に示す塩基配列のうち連続する
１０〜３０の塩基配列からなるセンスプライマーと、配
列番号６に示す塩基配列のうち連続する１０〜３０の塩
基配列からなるアンチセンスプライマーとを含むことを
特徴とするヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体
２Ａサブユニット遺伝子の上流領域に存在する２塩基
（ＧＴ）_ｎ／（ＣＡ）_ｎ反復配列の繰返し数を測定する
ためのキット。
【請求項９】前記センスプライマーが配列番号３に示す
塩基配列からなり、前記アンチセンスプライマーが配列
番号４に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項
８に記載のキット。
【請求項１０】下記一般式（１）５’Ｘ（ＧＴ）_ｎＹ３’ （１） (式中、Ｘは配列番号１に示す塩基配列であり、Ｙは配
列番号２に示す塩基配列であり、ｎは１〜１００の整数
である）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と、こ
れと機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含むこと
を特徴とする組換えベクター。
【請求項１１】請求項１０記載の組換えベクターを用い
た、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサ
ブユニット遺伝子の転写促進物質及び／又は抑制物質の
スクリーニング方法。