CN108414765B - 用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法 - Google Patents

用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108414765B
CN108414765B CN201710699674.9A CN201710699674A CN108414765B CN 108414765 B CN108414765 B CN 108414765B CN 201710699674 A CN201710699674 A CN 201710699674A CN 108414765 B CN108414765 B CN 108414765B
Authority
CN
China
Prior art keywords
disease
level
alzheimer
g72protein
biomarker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710699674.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108414765A (zh
Inventor
林洁欣
蓝先元
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Medical University
Original Assignee
China Medical University
Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Medical University, Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital filed Critical China Medical University
Publication of CN108414765A publication Critical patent/CN108414765A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108414765B publication Critical patent/CN108414765B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用G72蛋白质与SLC 7A 11 mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法。本发明揭示一种用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒。本发明也揭示用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，其中，所述生物标记水平选自于由下列所构成的群组：G72蛋白质水平、SLC 7A 11 mRNA表达水平以及它们的组合，以及使用所述试剂盒来诊断阿兹海默氏症的步骤包括：自被怀疑具有阿兹海默氏症的人类个体获得血液样品；检测所述血液样品中的所述生物标记水平；以及令所述血液样品中所检测到的生物标记水平与预设标准相比较，其中若所述血液样品中所检测到的生物标记水平高于所述预设标准，所述人类个体被认定为具有阿兹海默氏症。

Description

用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹 海默氏症的方法
【技术领域】
本发明是有关于一种用于诊断阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)的方法。特别地，本发明是有关于一种使用两种生物标记(biomarker)(G72蛋白质以及SLC7A11mRNA)来诊断阿兹海默氏症的方法。
【背景技术】
失智症(dementia)的盛行率在老年人族群中正逐渐增加，而阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退化性疾病(neurodegenerative disease)，它是最常见的失智症起因。阿兹海默氏症的早期检测对于所述疾病的后续治疗效果而言是非常重要的。阿兹海默氏症通常基于个人病史(person’s medical history)、家族病史(familymedical history)以及行为观察(behavioral observation)而被诊断。此外，典型的神经(neurological)与神经心理(neuropsycho logical)特征以及互斥性病况(alternativecondition)的存在与否也被作为诊断的依据。另一方面，利用计算机断层摄影(computedtomography,CT)或磁振造影(magnetic resonance imaging,MRI)以及利用单光子发射计算机断层摄影(single-photon emission computed tomography,SPECT)或正电子发射断层摄影(positron emission tomography,PET)所得到的先进医学成像则可被用来帮助排除其他的大脑病变或失智症的亚型(subtype)。
医疗机构针对执业医师已建立了诊断规范(diagnostic criteria)，以简化以及标准化诊断方法(diagnostic process)。例如，国家神经与沟通疾病以及中风研究所(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke,NINCDS)以及阿兹海默氏症暨相关疾病协会(Alzheimer’s Disease and RelatedDisorders Association,ADRDA)[现在被称为阿兹海默氏症协会(Alzheimer’sAssociation)]建立了最常被使用的有关阿兹海默氏症诊断的NINCDS-ADRDA规范(McKhannG.et al.(1984),Neurology,34:939-944)。
然而，上述的诊断方法是相当耗费时间的(time-consuming)并且须仰赖医师的经验。因此，对于阿兹海默氏症疾病诊断与治疗领域中的医学界人士而言，仍然存在需要去寻找能够导致快速、可靠以及准确的诊断阿兹海默氏症的生物标记。
现今，大多数阿兹海默氏症生物标记的研究主要着重于与所述疾病有关联的已知病理底物(pathological substrates)，诸如，淀粉样蛋白斑(amyloid plaques)以及神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)，它们分别由异常聚集的乙型淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)肽以及过度磷酸化的Tau(hyperphosphorylated Tau,pTau)所组成。许多研究已经显示：乙型淀粉样蛋白肽的主要种类[也就是一种42-氨基酸肽(Aβ1-42)]在带有阿兹海默氏症的病患的脑脊髓液(cerebrospinal fluid,CSF)中是显著降低的，而pTau在带有阿兹海默氏症的病患的CSF中则是增加的。虽然探讨利用这2种生物标记来诊断疾病的相关研究已经被执行，但这些研究结果并没有产生有用、明确的诊断方法。
N-甲基天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是在神经细胞中被发现的一种谷氨酸受体(glutamate receptor)以及离子通道蛋白质(ion channelprotein)。当谷氨酸盐(glutamate)以及甘氨酸(glycine)[或D-丝氨酸(D-serine)]与NMDAR结合时会使其被活化。所述经活化的NMDAR允许正电离子流过神经细胞的细胞膜。NMDAR对于突触可塑性(synaptic plasticity)、记忆(memory)以及认知功能(cognitivefunction)而言是重要的。NMDAR媒介的神经传导(NMDAR-mediated neurotransmission)的衰减会造成老化大脑中神经可塑性(neuronal plasticity)的缺乏以及认知不足(cognitive defic its)，进而导致临床劣变(deterioration)以及大脑萎缩(brainatrophy)。
目前已有许多方式可用来促进NMDAR活化，其中之一是通过抑制D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)的活性，DAAO是一种负责降解D-丝氨酸与D-丙氨酸(D-alanine)的过氧化体黄素酶(peroxisomal flavoenzyme)。通过抑制DAAO活性可提高D-氨基酸(D-amino acids)的水平，D-氨基酸是作用于NMDAR共促效剂位点(coagonist site)的神经传导物质(neurotransmitters)。编码D-氨基酸氧化酶活化剂(D-amino acid oxidaseactivator,DAOA)(也被称为G72)的基因具有灵长类特异性(primate specific)并且位于染色体13q32-q34上。G72蛋白质在NMDA信号的调节上可能扮演一个重要的角色。在一个先前研究中，C.H.Lin等人发现在带有精神分裂症(schizophrenia)的病患中末梢G72蛋白质表达(peripheral G72protein expression)显著高于健康个体所具者，这表示G72蛋白质的末梢表达具有潜力可供作为一种用于诊断精神分裂症的生物标记(C.H.Lin et al.(2014),Molecular Psychiatry,19:1-2)。
胱氨酸/谷氨酸反向运输蛋白系统xc -(cystine/glutamate antiporter systemxc -)是一种钠-非依赖性酸性氨基酸运输蛋白(sodium-independent acidic amino acidtransporter)，它会调节以1:1比率的方式将胱氨酸摄取进入细胞中并交换谷氨酸离开细胞。系统xc -由一个重链次单元(heavy chain subunit)(4F2hc,SLC3A2)以及一个轻链次单元(light chain subunit)(xCT,SLC7A11)所组成。当胱氨酸经由系统xc -被摄入后会在细胞内被还原成半胱氨酸(cysteine)，而半胱氨酸是一种用于合成抗氧化谷胱甘肽(glutathione,GSH)(它是大脑中最重要的抗氧化剂之一)的速率限制底物(rate-limitingsubstrate)。因此，系统xc -在谷氨酸(它是哺乳动物大脑中最大量的氨基酸神经传导物质)的释放中也扮演一个关键的角色。
就申请人所知，无论G72蛋白质或系统xc -中的任一者与阿兹海默氏症的相关性皆尚属未知。为了开发出一种用于诊断阿兹海默氏症的新颖的生物标记，申请人已进行实验与统计学分析，以判断G72蛋白质和/或SLC7A11 mRNA在阿兹海默氏症检测上的诊断准确性(diagnostic accuracy)。申请人经由研究分析结果而意外地发现到，G72蛋白质或SLC7A11mRNA各自单独可供应用作为一种用于检测阿兹海默氏症的潜在生物标记，而G72蛋白质以及SLC7A11 mRNA的组合则可以更可靠且有效地诊断阿兹海默氏症。
【发明内容】
于是，在第一个方面，本发明提供一种用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，其包含用于检测生物标记水平的试剂，所述生物标记水平选自于由下列所构成的群组：G72蛋白质水平、SLC7A11 mRNA表达水平以及它们的组合。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述生物标记水平是G72蛋白质水平。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述生物标记水平是SLC7A11 mRNA表达水平。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述生物标记水平是G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的组合。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述试剂包含会特异性地结合G72的以抗体为基础的结合部分。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述试剂通过下列方法学的任一者而被用来检测G72蛋白质水平：西方墨点免疫分析法、多重免疫分析法、酶结合免疫吸附分析法、放射免疫分析法、免疫放射量测定分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法以及免疫浊度测定法。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述以抗体为基础的结合部分使用选自于下列所构成的群组的可检测的标记而被标记：放射性标记、半抗原标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记以及抗原决定簇标签。
本发明所述用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，所述试剂通过下列方法学的任一者而被用来检测SLC7A11 mRNA表达水平：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、反转录聚合酶链反应、定量反转录聚合酶链反应、杂交、探针杂交以及基因表达阵列。
在第二个方面，本发明提供用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，其中，所述生物标记水平选自于由下列所构成的群组：G72蛋白质水平、SLC7A11 mRNA表达水平以及它们的组合，以及使用所述试剂盒来诊断阿兹海默氏症的步骤包括：自被怀疑具有阿兹海默氏症的人类个体获得血液样品；检测所述血液样品中的所述生物标记水平；以及令所述血液样品中所检测到的生物标记水平与预设标准相比较，其中若所述血液样品中所检测到的生物标记水平高于所述预设标准，所述人类个体被认定为具有阿兹海默氏症。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述生物标记水平是G72蛋白质水平。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述生物标记水平是SLC7A11 mRNA表达水平。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述生物标记水平是G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的组合。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述血液样品被拿来进行检测之前有先经过血液分离处理，以分离出血浆来供检测G72蛋白质水平之用。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述血液样品被拿来进行检测之前有先经过血液分离处理，以分离出血清来供检测G72蛋白质水平之用。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述试剂包含会特异性地结合G72的以抗体为基础的结合部分。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述试剂通过下列方法学的任一者而被用来检测G72蛋白质水平：西方墨点免疫分析法、多重免疫分析法、酶结合免疫吸附分析法、放射免疫分析法、免疫放射量测定分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法以及免疫浊度测定法。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述以抗体为基础的结合部分使用选自于下列所构成的群组的可检测的标记而被标记：放射性标记、半抗原标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记以及抗原决定簇标签。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述血液样品被拿来进行检测之前有先经过血液分离处理，以分离出白血球来供检测SLC7A11 mRNA表达水平之用。
本发明所述用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，所述试剂通过下列方法学的任一者而被用来检测SLC7A11 mRNA表达水平：聚合酶链反应、实时聚合酶链反应、反转录聚合酶链反应、定量反转录聚合酶链反应、杂交、探针杂交以及基因表达阵列。
【具体实施方式】
本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例和图式后，将变得明显。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
如本文中所用的，术语“阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)”意指从中年晚期开始表达记忆丧失(memory loss)、混淆(confusion)以及定向力障碍(disorientation)并且典型地在5到10年间导致死亡的一种进行性精神劣变(progressive mentaldeterioration)。在病理学上，阿兹海默氏症的特征在于细胞内神经原纤维(intracellular neurofibrils)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)以及老年斑(senile plaques)[它们由具有类淀粉核心(amylo id core)的粒状或丝状嗜银团块(granular or filamentous argentophilic masses)所组成]的增厚(thickening)、黏合(conglutination)以及变形(distortion)。
如本文中所用的，术语“诊断(diagnose)”、“诊断(diagnosis)”或“诊断(diagnosing)”意指区别或鉴定疾病(disease)、症状(syndrome)或病况(condition)，或区别或鉴定具有特殊的疾病、症状或病况的人。在本发明的一个示例性具体例中，测定与算法(algorithms)基于针对样品的分析而被用来诊断个体中的阿兹海默氏症。
为了寻找可供用于检测阿兹海默氏症的新颖生物标记，申请人比较健康个体与被鉴定为具有阿兹海默氏症的病患个体之间，在血液样品的G72蛋白质水平和/或SLC7A11mRNA表达水平上的差异性。申请人的研究结果显示，G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平这两者在AD组与对照组个体之间呈现出显著差异性，这表示G72蛋白质或SLC7A11mRNA可以作为一种用于检测阿兹海默氏症的生物标记。申请人进一步经由受试者操作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲线分析而意外地发现到，无论单独使用G72蛋白质或SLC7A11 mRNA作为生物标记皆可展现良好的诊断灵敏度(sensitivity)及特异性(specificity)，而若使用G72蛋白质以及SLC7A11 mRNA的组合来进行检测，则能够展现更为优异的诊断力来鉴别AD组与对照组的个体，进而达至更为可靠的阿兹海默氏症诊断效用。
于是，本发明提供一种用于诊断阿兹海默氏症的试剂盒，其包含用于检测生物标记水平的试剂，所述生物标记水平选自于由下列所构成的群组：G72蛋白质水平、SLC7A11mRNA表达水平以及它们的组合。
在本发明的一个较佳具体例中，所述生物标记水平是G72蛋白质水平。
在本发明的另一个较佳具体例中，所述生物标记水平是SLC7A11 mRNA表达水平。
在本发明的又另一个较佳具体例中，所述生物标记水平是G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的组合。
本发明也提供用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，其中，所述生物标记水平选自于由下列所构成的群组：G72蛋白质水平、SLC7A11 mRNA表达水平以及它们的组合，以及使用所述试剂盒来诊断阿兹海默氏症的步骤包括：
自被怀疑具有阿兹海默氏症的人类个体获得血液样品；
检测所述血液样品中的所述生物标记水平；以及
令所述血液样品中所检测到的生物标记水平与预设标准相比较，
其中若所述血液样品中所检测到的生物标记水平高于所述预设标准，所述人类个体被认定为具有阿兹海默氏症。
依据本发明，所述血液样品可以在任何时间下取自于所述人类个体，并且可以是禁食(fasting)或非禁食(non-fasting)的血液样品。在本发明的一个具体例中，所述血液样品是在上午被获得。在本发明的另一个具体例中，所述血液样品是在上午7时至9时之间而被获得的禁食的血液样品。
依据本发明，所述血液样品被拿来进行检测之前有先经过血液分离处理。在本发明的一个较佳具体例中，所述血液样品被进行血液分离处理以从所述血液样品中分离出血浆(plasma)或血清(serum)来供检测G72蛋白质水平之用。在本发明的又另一个较佳具体例中，所述血液样品被进行血液分离处理以从所述血液样品中分离出白血球(white bloodcells)来供检测SLC7A11 mRNA表达水平之用。
依据本发明，所述G72蛋白质水平与所述SLC7A11 mRNA表达水平可通过那些熟习此技艺者所详知的方法而被测定。
在某些具体例中，所述试剂可通过免疫分析法(immunoassay)而被用来检测G72蛋白质水平。示范性的免疫分析法可以包括西方墨点免疫分析法(western blotimmunoassay)、多重免疫分析法(multiplex immunoassay)、酶结合免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)、免疫放射量测定分析法(immunoradiometric assay,IRMA)、荧光免疫分析法(fluorescent immunoassay,FIA)、化学发光免疫分析法(chemiluminescentimmunoassay)以及免疫浊度测定法(immunonephelometry)。
所述试剂可包含会特异性地结合至G72蛋白质的以抗体为基础的结合部分。在本发明的一个具体例中，所述以抗体为基础的结合部分是抗体。
“以抗体为基础的结合部分(Antibody-based b inding moiety)”或“抗体(antibody)”包括免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecules)以及免疫球蛋白分子的免疫活性决定簇(immunologically active determinants)[例如，含有一个会特异性地结合至G72蛋白质的抗原-结合位点(antigen-binding site)的分子]。术语“以抗体为基础的结合部分”意欲要包括任何同型(isotype)(例如，IgG、IgA、IgM、IgE等等)的完整抗体以及它们的也会与G72蛋白质特异性地反应的片段。
在本发明中，所述以抗体为基础的结合部分可包括多克隆(polyclonal)、单克隆(monoclonal)抗体以及重组型抗体，或其他经纯化的抗体以及重组型抗体的制品，并且进一步意欲要包括人类化抗体(humanized antibodies)、双-特异性抗体(bi-specificantibodies)以及具有至少一个衍生自抗体分子的抗原-结合决定簇的嵌合分子(chimericmolecules)。
在本发明中，“以抗体为基础的结合部分”或“抗体”可包括捕捉抗体(captureantibody)以及检测抗体(detection antibody)。
如此处所用的，术语“捕捉抗体”意指抗体[不论单克隆抗体、多克隆抗体，或所述抗体的免疫反应片段(immunoreactive fragment)]，它能够结合至感兴趣的抗原(antigen)，并且借此而容许随后被施用的抗体能够辨识所述抗原。所述捕捉抗体可被用于异质性(固相)或均质性(液相)分析法[heterogeneous(solid phase)or homogeneous(solution phase)assay]中。所述捕捉抗体可被固定于固相之上。
如此处所用的，术语“检测抗体”意指具有可检测标记的抗体，所述可检测标记对于存在样品中之一或更多感兴趣的待测物(analytes)具有特异性[也就是结合或被结合至待测物，或与所述待测物形成复合物]。所述术语也涵盖对于一或更多感兴趣的待测物具有特异性的抗体，其中所述抗体可被结合以另一个包含有可检测标记的物种。可检测标记的实例包括，但不限于：放射性标记(radioactive label)、半抗原标记(hapten label)、荧光标记(fluorescent label)、化学发光标记(chemiluminescent label)、酶标记(enzymaticlabel)、核苷酸[例如，寡核苷酸(o ligonuc leotide)]标记、抗原决定簇标签(epitopetag)以及它们的组合。
半抗原标记的实例可包括生物素/链霉抗生物素蛋白(biotin/streptavidin)以及地高辛(digoxigenin)。
抗原决定簇标签的实例可包括T7、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5以及HIS。
抗体可使用传统技术而被片段化(fragmented)。术语“抗体的片段”意指抗体分子的经蛋白质水解切断的节段(segments)或被重组地制备的部分(proteolytically-cleaved or recombinantly-prepared portions)，它们能够选择性地与特定蛋白质相反应。
所述蛋白质水解切断的节段和/或被重组地制备的部分的非限制性实例包括Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、dabs以及含有通过一个肽连接子(peptide linker)而被接合的VL与VH领域的单链变异性抗体(scFv)。所述scFv’s可被共价地或非共价地连结，以形成具有两个或更多结合位点的抗体。
依据本发明，所述G72蛋白质水平与从所述可检测标记的抗体所放射出的信号强度呈正相关性。
在本发明的一个示范性具体例中，所述以抗体为基础的结合部分通过将抗体连结至酶而被可检测地标记。依次地，当所述酶被曝露至它的底物时，所述酶会以一种能够产生化学部分(chemical mo iety)的方式来与所述底物相反应，所述化学部分可通过例如分光亮度计的方式(spectrophotometric mean)、荧光标定的方式(fluorometric mean)或视觉的方式(visual mean)而被检测到。
依据本发明，可被用来与抗体的可检测标记相反应的酶包括，但不限于：苹果酸去氢酶(malate dehydrogenase)、葡萄球菌核酸酶(staphylococcal nuclease)、δ-V-类固醇异构酶(delta-V-steroid isomerase)、酵母乙醇去氢酶(yeast alcoholdehydrogenase)、α-甘油磷酸去氢酶(alpha-glycerophosphate dehydrogenase)、丙糖磷酸异构酶(triose phosphate isomerase)、辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、天冬酰氨酸酶(asparaginase)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、β-半乳糖酶(β-galactosidase)、核醣核酸酶(ribonuclease)、尿素酶(urease)、触酶(catalase)、葡萄糖-VI-磷酸去氢酶(glucose-VI-phosphatedehydrogenase)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)以及乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)。
在某些具体例中，所述抗体也可被标记以荧光化合物(fluorescent compound)。当经荧光标记的抗体被曝露在具有适当波长的光下时，它的存在可通过荧光而被检测到。适用于本发明的荧光化合物包括，但不限于：CYE染料(CYE dyes)、荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate,FITC)、玫瑰红(rhodamine)、藻红素(phycoerythrin)、柯里膦-O(coriphosphine-O,CPO)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PE)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)、邻苯二甲醛(o-phthaldehyde)、萤胺(fluorescamine)以及双联染料(tandem dyes)。
所述双联染料的实例包括PE-Cy5(PC5)、PE-Cy7(PC7)以及PE-德州红(PE-TexasRed)。
在某些具体例中，所述抗体可通过荧光放射金属(fluorescence emittingmetals)[诸如152Eu或其他的镧系元素(lanthanide series)金属]而被检测。这些金属可通过金属-螯合基团(metal-chelating groups)[诸如二乙三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)或乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)]而被附接至所述抗体上。
在某些具体例中，所述抗体可通过偶合至化学发光化合物(chemiluminescentcompound)而被检测。所述化学发光-抗体的存在接着通过检测在化学反应的过程当中所产生的发光而被测定。化学发光化合物的实例包括，但不限于：发光胺(luminol)、虫荧光素(luciferin)、异发光胺(isoluminol)、theromatic吖锭酯(theromatic acridiniumester)、咪唑(imidazole)、吖锭盐(acridinium salt)以及草酸酯(oxalate ester)。
另择地，也可使用其他各种免疫分析法中的任一者来进行检测。例如，若是放射性地标记抗体，可通过使用放射免疫分析法来检测所述抗体。检测放射性同位素的方法包括，但不限于：伽玛计数器(gamma counter)、闪烁计数器(scintillation counter)以及自动放射显影术(autoradiography)。所述抗体可通过放射性同位素而被检测。放射性同位素的实例包括，但不限于：3H、31P、35S、14C以及125I。
依据本发明，所述试剂可通过下列方法学中的至少一者而被用来检测SLC7A11mRNA表达水平：聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时聚合酶链反应(real time PCR)[又被称为定量聚合酶链反应(quantitative PCR,q-PCR)]、反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)、定量反转录聚合酶链反应(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)、杂交(hybridization)、探针杂交(probehybridization)以及基因表达阵列(gene expression array)。在本发明的一个具体例中，所述试剂通过使用定量反转录聚合酶链反应来检测SLC7A11 mRNA表达水平。
依据本发明，术语“预设标准(predetermined standard)”可意指针对健康个体的血液样品中的G72蛋白质水平或SLC7A11 mRNA表达水平的范围、数值或截断值(cutoffvalue)，它通过选定的方法而被测定。在健康个体的族群与具有阿兹海默氏症的个体之间的截断值可以通过那些熟习此技艺者而被测定。
术语“健康个体(healthy individual)”意指不具有与阿兹海默氏症有关联的任何症状或者不处于发展出阿兹海默氏症的风险中的个体，也就是所述个体在经过专业的执业医师进行评估之后被认为是健康的。
为了评估阿兹海默氏症的进展或者针对阿兹海默氏症的治疗的有效性，如在先前检查中所检测到的G72蛋白质水平与SLC7A11 mRNA表达水平也可被用来作为针对所述人类个体的参考资料。
在本发明的一个具体例中，有关于被怀疑具有阿兹海默氏症的人类个体中的G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的预设标准分别通过西方墨点免疫分析法以及RT-qPCR来作测定，并产生2.3285ng/mL的标准值以及12.185的标准ΔCT值(通过将SLC7A11的CT值减去选定的内控基因的平均CT值而被计算出)来分别作为针对G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的截断值。
依据本发明，阿兹海默氏症的存在也可以基于所检测到的G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的合并截断值而被测定。在某些具体例中，所述合并截断值可以通过使用统计学分析所公式化的方程式而被计算出来[诸如，判别函数分析(discriminantfunction analysis)、逻辑式回归分析(logistic regression analysis)、受试者操作特征曲线分析(receiver operating characteristic curve analysis)以及脊回归分析(ridge regression analysis)]。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例仅供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
实验个体：
下面的实验使用由研究伦理审查会(Institutional Review Board,IRB)所认可的操作程序并依据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的现行修订版的规范来进行。在向参与者进行完整的实验说明之后，有取得符合IRB规范的书面经告知的同意(informed consent)。
本实验共计有239位人类个体参加，每位参与者没有重大的脑血管病史且哈钦斯基缺血分数(Hachinski Ischemic Score)不大于4，同时除了阿兹海默氏症之外没有主要的神经性(neurological)、精神性(psychiatric)或医学(medical)的病况。再者，每位参与者没有物质(包括酒精)上的滥用或成瘾，没有妄想(delusion)、幻觉(halluc ination)或谵妄(delirium)的症状，同时也没有严重的视觉或听力损失，并且能够遵循所述操作程序。此外，为了排除潜在的干扰作用(confounding effect)，每位参与者已被确定为非吸烟者(non-smoker)并且依据诊断与统计手册第4版(Diagnostic and Statistical Manual-IV,DSM-IV)的标准而被判断为没有物质(包括酒精)上的滥用。
在所有239位参与者之中，有130位人类个体被鉴定为健康自愿者，并且在下文中被称为“对照组(control group)”。这些个体的年龄≥18岁、没有任何第I轴向或第II轴向的精神异常(psychiatric disorder)以及身体与神经皆为健康的，并且具有落在正常范围内的实验室评鉴(laboratory assessment)[包括尿液/血液常规检查(urine/bloodroutine)、生化试验(biochemical test)以及心电图学(electrocardiography)]结果。剩余的109位人类个体被鉴定为带有阿兹海默氏症的病患，并且在下文中被称为“AD组(ADgroup)”。这些带有阿兹海默氏症的病患符合下列条件：(1)满足经由国家神经与沟通疾病以及中风研究所以及阿兹海默氏症暨相关疾病协会(National Institute ofNeurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzhe imer'sDisease and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)所提出的有关很有可能为阿兹海默氏症(probable AD)的规范并且具有1或更高的临床失智量表(ClinicalDementia Rating,CDR)分数，以及(2)身体健康并且具有落在正常范围内的实验室评鉴(包括尿液/血液常规检查、生化试验以及心电图学)结果。
在130位对照组个体与109位AD组个体当中，来自对照组的40位个体以及来自AD组的70位病患依据年龄而被挑选与配对以供用于进一步分析。表1显示所有个体[“年龄-不相配的(age-unmatched)”]以及年龄相配的个体的子集合[“年龄-相配的(age-matched)”]的临床特征(也就是性别、年龄以及CDR分数)。
表1.人口统计学特征(demographic characteristics)
Figure BDA0001380025060000171
a表示平均值±标准偏差(standard deviation)。
实施例1.G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的分析以供用于阿兹海默氏症的诊断
实验方法：
A.血浆中的G72蛋白质水平的检测：
所有个体在经历至少8小时的禁食之后，在上午7时至9时的期间内，对所有个体进行血液取样。
血液取样方式通过使用静脉切开术(phlebotomy)而分别从对照组以及AD组的每一位个体中收集10mL周边静脉血液(peripheral venous blood)并放入至含有EDTA的血液收集管中。所述收集管在4℃下以1500×g予以离心历时10分钟。由此所得到的血浆被快速地移至另一个收集管中并且被立即地保存于-80℃下直到进一步分析。
血浆中的G72蛋白质水平使用西方墨点分析来检测，并依据下面的操作步骤来进行。首先，将上述收集到的血浆样品进行解冻，继而各取100μL的血浆样品并以
Figure BDA0001380025060000172
Blue Albumin以及IgG Depletion Kit(Sigma)予以处理，以去除血浆中的高丰富蛋白质(high-abundant protein)。然后，收集低丰富蛋白质(low-abundanceprotein)的分离部分。接着，对分离部分各取10μL并混合以4倍体积的样品缓冲液(samplebuffer)[含有500mM Tris-HCl(pH6.8)、16％SDS、80％甘油、400mM DTT以及0.08％溴酚蓝(bromophenol blue)]，借此而得到蛋白质样品。之后，取适量的蛋白质样品并使用12％SDS-PAGE分离凝胶来进行电泳，继而将凝胶片上被分离的蛋白质转印至孔径为0.45μm的聚二氟乙烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride(PVDF)membrane]。接着，将转印后的PVDF膜取出并在室温下以5％脱脂乳粉(nonfat dry milk){配于TBST[含有20mM Tris-HCl(pH7.6)、500mM NaCl以及0.1％Tween 20]中}进行封阻处理(blocking)历时1小时。之后，加入山羊抗-G72抗体(goat anti-G72antibody)(Cat.No.sc-46118,Santa CruzBiotechnology)作为一次抗体(primary antibody)(以TBST予以稀释1000倍)，并置于4℃下反应隔夜后，以TBST予以洗涤3次，每次15分钟。接着，加入HRP-结合抗-山羊IgG抗体(HRP-linked anti-goat IgG antibody)(Cat.No.sc-2030,Santa Cruz Biotechnology)作为二次抗体(以TBST予以稀释5000倍)，于室温下作用历时2小时后，以TBST予以洗涤3次。之后，使用ECL高级西方墨点分析检测套组(ECL Advance Western Blotting DetectionKit)(RPN2135,GE Healthcare)来进行化学发光染色(chemiluminescence staining)，并使用ImageQuant LAS 4000mini(GE Healthcare)来进行拍照。所得到的影像使用ImageQuantTMTL 7.0软件(GE Healthcare)来进行分析，通过测量每一色带的相对强度(relative intens ity)并且利用G72重组蛋白质(20或50ng，由中国医药大学附设医院的张颢腾教授友情捐赠，台中，台湾)予以标准化而被定量。所述西方墨点分析被重复进行2次。
B.白血球中的SLC7A11 mRNA表达水平的检测：
血液取样方式通过使用静脉切开术而分别从对照组以及AD组的每一位个体中收集10mL周边静脉血液并放入至含有EDTA的血液收集管中。所述收集管在4℃下以1500×g予以离心历时10分钟，移除血浆，继而将1X RBC溶解缓冲液(RBC lysis buffer)(GenepureTechnology Co.)加入至所述收集管而使得红血球(red blood cells,RBC)被溶解，接着以1500×g予以离心历时10分钟，借此而得到白血球(white blood cells,WBC)。
为了研究系统xc -的轻链次单元在白血球中的基因表达，使用定量反转录聚合酶链反应(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)来分析白血球中的SLC7A11 mRNA表达水平。有关RT-qPCR依据下面所述方式来进行：首先，总RNAs使用TRI试剂(Molecular Research Center,Inc.)依据制造商的操作指南从白血球中被分离。由此所得到的RNA被混合以DNase I，以避免DNA污染。RNA浓度通过使用ND-1000 UV-Vis分光亮度计(ND-1000UV-Visspectrophotometer)(Thermo Fisher Scientific Inc.)来测定260nm的吸光值。由此所得到的总RNAs分别被拿来进行下面的反转录反应(reverse transcription reaction)以合成第一链cDNA(first-strand cDNA)。
有关第一链cDNA的合成依据下面所述步骤来进行。简言之，将经分离的RNA的等分试样(2.5μg)加入0.5μg的随机六聚体与寡-dT的引物(random hexamer and oligo-dTprimers)，并于70℃下作用历时5分钟，以使RNA二级结构短暂地变性，继而转移至冰上快速冷却，以促进引物与RNA之间的退火(annealing)过程。之后，加入1500μM dNTP、20U RNase抑制剂(RNase inhibitor)、200U MMLV反转录酶(MMLV reverse transcriptase)(Promega)以及反转录酶缓冲液(reverse transcription buffer)并予以混合均匀(最终体积为20μL)。接着，将所形成的混合物置于37℃下作用历时90分钟以进行延伸反应(extension)，继而转移至70℃下作用历时10分钟以终止酶反应，借此而得到第一链cDNA。
实时PCR检测系统(Real-Time PCR Detection System)使用SYBR Green MasterMix来测量SLC7A11 mRNA表达。特别地，PCR的总反应体积为20μL，其中含有2μL的第一链cDNA(250ng)、10μL Master mix(Roche)以及各个浓度为600nM的引物(被用于扩增SLC7A11的引物对被列示于表2中)。PCR的操作条件是先在95℃下进行预-培育历时10分钟，以活化热启动DNA聚合酶(hot-start DNA polymerase)，接而进行45个循环如下：在95℃下进行变性反应(denaturation)历时15秒、在58℃下进行引物退火(primer annealing)以及延伸反应(extension)历时45秒。为了监测RT-qPCR反应的特异性，PCR产物通过熔点曲线分析(melting curve analysis)而被分析。所述RT-qPCR反应被执行2次。另外，作为负对照组(negative controls)的实验被进行，以确认没有交叉-污染(cross-contamination)。
另外，3个内控基因(housekeeping genes)被用来作为内生性对照组(endogenouscontrols)，包括甘油醛-3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(2对引物对被使用)、乙二型微球蛋白(beta-2-microglobulin,B2M)以及次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase,HPRT)的基因。这些被用于RT-qPCR的内控基因的引物对被列示于表2中。而有关这些内控基因的平均CT值用来计算出白血球中的SLC7A11的相对mRNA表达水平(ΔCT＝CT,目标–CT,内控)。
表2.用于RT-qPCR的引物对
Figure BDA0001380025060000211
C.G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的统计学分析：
有关AD组与对照组的基线特征(baseline characteristics)被计算。数值数据(numeric data)以平均值±标准偏差(Standard Deviation,S.D.)来表示。在AD组与对照组之间的p-数值通过t-试验(t-test)而被计算出，并且小于0.05的机率值(probabilityvalue)表示有统计学显著性(statistical significance)(p<0.05)。
有关G72蛋白质、SLC7A11 mRNA以及它们的组合的受试者操作特征(receiveroperating characteristics,ROC)曲线通过将真阳性率(true positive rate)[也就是灵敏度(sensitivity)]与伪阳性率(false positive rate)[也就是1-特异性(specificity)]作图而被获得。
下面的公式(I)用来计算G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的组合的加权值(weighted value)，其通过逻辑式回归模型(logistic regression model)并且以G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平作为共变量(covariate)而被订定：
A＝-13.246+B×3.197+C×2.273 (I)
A＝加权值
B＝G72蛋白质水平(ng/μL)
C＝ΔCT值
针对各个生物标记在ROC曲线之下的区域[也就是ROC曲线下面积(area underthe ROC curve,AUC)]也被计算出来并且被使用作为一种用于测定何种生物标记具有较佳的诊断力的指数(index)，以自健康个体中区别病患(参照Zweig M.H.(1993),Clin.Chem.,39:561-577)。AUC数值的解释包括：杰出的(AUC>0.9)、优良的(AUC＝0.8～0.9)、可接受的(AUC＝0.7～0.8)、差的(AUC＝0.6～0.7)以及无法鉴别的(AUC＝0.5)。
结果：
申请人发现到年龄相配的个体与年龄不相配的个体所测得的实验结果是相似的，因此以下仅就年龄相配的个体所获得的数据来进行讨论，而相关实验数据被显示在下面表3与表4中。
表3.对照组与AD组的血浆G72蛋白质以及WBC SLC7A11 mRNA的表达水平
Figure BDA0001380025060000221
Figure BDA0001380025060000231
表示SLC7A11的mRNA表达的ΔCT值
§表示通过公式(I)而被计算出的加权值
表4.对照组与AD组的血浆G72蛋白质和/或WBC SLC7A11 mRNA水平的ROC曲线分析
Figure BDA0001380025060000232
Figure BDA0001380025060000233
表示SLC7A11 mRNA表达的ΔCT值
§表示通过公式(I)而被计算出的加权值
A.G72蛋白质作为一种用于诊断阿兹海默氏症的生物标记：
从表3可见，AD组以及对照组的G72蛋白质表达水平分别为2.63±1.20ng/μL以及1.72±0.71ng/μL，且AD组的血浆中的G72蛋白质表达水平显著高于对照组所具者(p<0.001)。这个实验结果显示，血浆中的G72蛋白质可作为一种用于检测阿兹海默氏症的生物标记。
再从表4的ROC曲线分析来看，G72蛋白质表达水平的最佳截断值(optimal cutoffvalue)是2.3285ng/μL，这表示当人类个体的血浆中的G72蛋白质水平≥2.3285ng/μL时，所述人类个体可能带有阿兹海默氏症。而若以这个G72蛋白质表达水平的截断值来进行检测，诊断的灵敏度以及特异性可分别地达到54.3％以及90％。此外，血浆中的G72蛋白质水平的AUC为0.726，这表示G72蛋白质具有良好的诊断力，而可以用来区别AD组与对照组的个体。
综合上述实验结果可知：当使用血浆中的G72蛋白质作为针对阿兹海默氏症的唯一生物标记时，在区别AD组与对照组的个体上可提供有效的诊断力。
B.SLC7A11 mRNA作为一种用于诊断阿兹海默氏症的生物标记：
从表3可见，AD组以及对照组的象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值分别为13.82±1.29以及12.44±1.37，且AD组的白血球中象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值显著高于对照组所具者(p<0.001)。这个实验结果显示，白血球中的SLC7A11 mRNA可作为一种用于检测阿兹海默氏症的生物标记。
再从表4的ROC曲线分析来看，SLC7A11 mRNA表达水平的最佳截断值是12.185，这表示当人类个体的白血球中象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值≥12.185时，所述人类个体可能带有阿兹海默氏症。而若以这个SLC7A11 mRNA表达水平的截断值来进行检测，诊断的灵敏度以及特异性可分别地达到92.9％以及45％。此外，白血球中象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的AUC为0.764，这表示SLC7A11 mRNA具有良好的诊断力，而可以用来区别AD组与对照组的个体。
综合上述实验结果可知：当使用白血球中的SLC7A11 mRNA作为针对阿兹海默氏症的唯一生物标记时，在区别AD组与对照组的个体上可提供有效的诊断力。
C.血浆中的G72蛋白质水平以及白血球中的SLC7A11 mRNA表达水平的组合用于诊断阿兹海默氏症：
从表3可见，AD组以及对照组的G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的加权值分别为26.59±4.83以及20.54±4.03，且AD组的G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的加权值显著高于对照组所具者(p<0.001)。这个实验结果显示，血浆中的G72蛋白质以及白血球中的SLC7A11 mRNA的组合可作为一种用于检测阿兹海默氏症的生物标记组合。
再从表4的ROC曲线分析来看，G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的最佳截断值是21.723，这表示当人类个体的G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的加权值≥21.723时，所述人类个体可能带有阿兹海默氏症。而若以这个组合的截断值来进行检测，诊断的灵敏度以及特异性可分别地达到85.7％以及67.5％。
此外，G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的灵敏度高于G72蛋白质水平所具者，而G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的特异性高于象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值所具者。特别地，G72蛋白质水平以及象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值的组合的AUC数值高于G72蛋白质水平或象征SLC7A11 mRNA表达水平的ΔCT值各自所具者。
这些实验结果显示：G72蛋白质水平以及SLC7A11 mRNA表达水平的组合相较于G72蛋白质水平或SLC7A11 mRNA表达水平具有更佳的诊断力，而可以区别AD组与对照组的个体。因此，所述2种生物标记的组合使用在区别带有与不带有阿兹海默氏症的个体上具有协同效应(synergic effect)。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考数据。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神之下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如权利要求所示者的限制。
序列表
<110> 长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院
<120> 用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法
<130> G72蛋白质与SLC7A11 mRNA
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的SLC7A11的F1引物
<400> 1
ccatgaacgg tggtgtgtt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的SLC7A11的R1引物
<400> 2
gaccctctcg agacgcaac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的GAPDH的F2引物
<400> 3
ccactcctcc acctttgac 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的GAPDH的R2引物
<400> 4
accctgttgc tgtagcca 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的GAPDH的F3引物
<400> 5
agccacatcg ctcagacac 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的GAPDH的R3引物
<400> 6
gcccaatacg accaaatcc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的B2M的F4引物
<400> 7
ttctggcctg gaggctatc 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的B2M的R4引物
<400> 8
tcaggaaatt tgactttcca ttc 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的HPRT的F5引物
<400> 9
acgtcttgct cgagatgtga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-qPCR的HPRT的R5引物
<400> 10
taatccagca ggtcagcaaa 20

Claims (9)

1.用于检测生物标记水平的试剂供应用于制备用来诊断阿兹海默氏症的试剂盒的用途，其特征在于：所述生物标记水平包含G72蛋白质水平，以及使用所述试剂盒来诊断阿兹海默氏症的步骤包括：
自被怀疑具有阿兹海默氏症的人类个体获得血液样品；
检测所述血液样品中的所述生物标记水平；以及
令所述血液样品中所检测到的生物标记水平与预设标准相比较，
其中若所述血液样品中所检测到的生物标记水平高于所述预设标准，所述人类个体被认定为具有阿兹海默氏症。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物标记水平还进一步包含有SLC7A11 mRNA表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述血液样品被拿来进行检测之前先经过血液分离处理，以分离出血浆来供检测G72蛋白质水平之用。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述血液样品被拿来进行检测之前先经过血液分离处理，以分离出血清来供检测G72蛋白质水平之用。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂包含会特异性地结合G72的以抗体为基础的结合部分。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂通过下列方法学的任一者而被用来检测G72蛋白质水平：西方墨点免疫分析法、多重免疫分析法、酶结合免疫吸附分析法、放射免疫分析法、免疫放射量测定分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法以及免疫浊度测定法。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述以抗体为基础的结合部分使用选自于下列所构成的群组的可检测的标记而被标记：放射性标记、半抗原标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记以及抗原决定簇标签。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述血液样品被拿来进行检测之前先经过血液分离处理，以分离出白血球来供检测SLC7A 11mRNA表达水平之用。
9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂通过下列方法学的任一者而被用来检测SLC7A 11mRNA表达水平：聚合酶链反应、杂交以及基因表达阵列。
CN201710699674.9A 2017-02-09 2017-08-16 用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法 Active CN108414765B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/428,893 US10473672B2 (en) 2017-02-09 2017-02-09 Methods for diagnosing and treating Alzheimers disease using G72 protein and SLC7A11 mRNA as biomarkers
US15/428,893 2017-02-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108414765A CN108414765A (zh) 2018-08-17
CN108414765B true CN108414765B (zh) 2020-09-01

Family

ID=59974267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710699674.9A Active CN108414765B (zh) 2017-02-09 2017-08-16 用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10473672B2 (zh)
EP (1) EP3361257B1 (zh)
CN (1) CN108414765B (zh)
TW (1) TWI706135B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102349630B1 (ko) * 2020-05-28 2022-01-10 재단법인대구경북과학기술원 알츠하이머 질환의 진단을 위한 Ｅｅｆ１ａ１의 용도

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981194A (en) * 1992-07-10 1999-11-09 University Of British Columbia Use of p97 and iron binding proteins as diagnostic and therapeutic agents
CN1078616C (zh) * 1998-12-16 2002-01-30 中国科学院上海生命科学研究中心 一种检测样品中是否存在老年痴呆病基因的方法和试剂盒
US20140171413A1 (en) * 2012-12-13 2014-06-19 China Medical University Compositions and methods for diagnosis of schizophrenia
JP6328146B2 (ja) * 2013-02-01 2018-05-23 グリアロジクス・インコーポレイテッドＧｌｉａｌｏｇｉｘ， Ｉｎｃ． 神経変性およびその他の疾患の治療用組成物および方法
CA2920474C (en) * 2013-07-11 2021-05-04 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Blood-based screen for detecting neurological diseases in primary care settings
CN105353135A (zh) * 2015-11-23 2016-02-24 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 阿尔茨海默病标志物的用途

Also Published As

Publication number Publication date
US20180224468A1 (en) 2018-08-09
US10473672B2 (en) 2019-11-12
CN108414765A (zh) 2018-08-17
EP3361257B1 (en) 2020-05-06
TW201830016A (zh) 2018-08-16
EP3361257A1 (en) 2018-08-15
TWI706135B (zh) 2020-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016269481B2 (en) Micro-rna, autoantibody and protein markers for diagnosis of neuronal injury
TWI788704B (zh) 分析個體樣品之方法
US20120178637A1 (en) Biomarkers and methods for detecting alzheimer&#39;s disease
WO2018221212A1 (ja) アルツハイマー病バイオマーカー
JP2022180442A (ja) 神経変性疾患を発症するリスクがある個体を検出する方法
CN109073661B (zh) 用于神经学疾病的诊断的测定法
CN108414765B (zh) 用G72蛋白质与SLC7A11mRNA作为生物标记来诊断与治疗阿兹海默氏症的方法
CN115461474A (zh) 用于评估阿尔茨海默病的蛋白标志物
JP2014527175A (ja) 精神発達、神経または神経精神障害の処置における臨床的有用性を予測するための方法
EP2855425A2 (en) Novel phenyl glyoxal probes
WO2015129324A1 (ja) 精神疾患マーカーおよびその用途
KR20220112204A (ko) 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법
EP2924437B1 (en) Method for detecting neurological disease accompanied by inflammation and/or demyelination
WO2023150707A2 (en) Methods for assessing likelihood of post-operative delirium in patients undergoing surgery
WO2021245413A1 (en) Methods of determining cancer
WO2023220276A1 (en) METHODS TO DETECT Aβ PROTEOFORMS AND USE THEREOF
WO2023164414A2 (en) Methods and compositions for evaluating biomarkers in salivary exosomes and evaluating cognitive fatigue
Naranjo et al. Methods for the prognosus and suagnosis of neurodegenerative diseases
WO2017178826A1 (en) Diagnosing acute bacterial meningitis
WANG et al. Patent 2774173 Summary
WO2014154670A1 (en) Methods for the prognosis and diagnosis of neurodegenerative diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181114

Address after: 123 Dakai Road, Bird Pine District, Kaohsiung City, Taiwan, China

Applicant after: KAOHSIUNG CHANG GUNG MEMORIAL HOSPITAL

Applicant after: China Medical University

Address before: 123 Dakai Road, Bird Pine District, Kaohsiung City, Taiwan, China

Applicant before: KAOHSIUNG CHANG GUNG MEMORIAL HOSPITAL

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant