TWI706135B - 使用G72蛋白質與SLC7A11 mRNA作為生物標記來診斷與治療阿茲海默氏症的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於診斷阿茲海默氏症的方法，其包含下列步驟：偵測一取自於一被懷疑具有阿茲海默氏症的人類個體的血液樣品中的生物標記位準，該生物標記位準是選自於由下列所構成的群組：G72蛋白質位準、SLC7A11 mRNA表現位準以及它們的組合；以及令該血液樣品中所偵測到的生物標記位準與一預設標準相比較，其中若該血液樣品中所偵測到的生物標記位準高於該預設標準，該人類個體被認定為具有阿茲海默氏症。

Description

使用G72蛋白質與SLC7A11mRNA作為生物標記來診斷與治療阿茲海默氏症的方法
本發明是有關於一種用於診斷阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)的方法。特別地，本發明是有關於一種使用兩種生物標記(biomarker)(G72蛋白質以及SLC7A11 mRNA)來診斷阿茲海默氏症的方法。
失智症(dementia)的盛行率在老年人族群中正逐漸增加，而阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是一種神經退化性疾病(neurodegenerative disease)，它是最常見的失智症起因。阿茲海默氏症的早期檢測對於該疾病的後續治療效果而言是非常重要的。阿茲海默氏症通常是基於個人病史(person’s medical history)、家族病史(family medical history)以及行為觀察(behavioral observation)而被診斷。此外，典型的神經(neurological)與神經心理(neuropsychological)特徵以及互斥性病況(alternative condition)的存在與否亦被作為診斷的依據。另一方面，利用電腦斷層攝影(computed tomography, CT)或磁振造影(magnetic resonance imaging, MRI)以及利用單光子發射電腦斷層攝影(single-photon emission computed tomography, SPECT)或正電子發射斷層攝影(positron emission tomography, PET)所得到的先進醫學成像則可被用來幫助排除其他的大腦病變或失智症的亞型(subtype)。
醫療機構針對執業醫師已建立了診斷規範(diagnostic criteria)，俾以簡化以及標準化診斷方法(diagnostic process)。例如，國家神經與溝通疾病以及中風研究所(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke, NINCDS)以及阿茲海默氏症暨相關疾病協會(Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association, ADRDA)[現在被稱為阿茲海默氏症協會(Alzheimer’s Association)]建立了最常被使用之有關阿茲海默氏症診斷的NINCDS-ADRDA規範(McKhann G.et al. (1984),Neurology , 34:939-944)。
然而，上述的診斷方法是相當耗費時間的(time-consuming)並且須仰賴醫師的經驗。因此，對於阿茲海默氏症疾病診斷與治療領域中的醫學界人士而言，仍然存在有一需要去尋找能夠導致快速、可靠以及準確的診斷阿茲海默氏症之生物標記。
現今，大多數阿茲海默氏症生物標記的研究主要係著重於與該疾病有關聯的已知病理基質(pathological substrates)，諸如，澱粉樣蛋白斑(amyloid plaques)以及神經纖維纏結(neurofibrillary tangles)，它們分別是由異常聚集的乙型類澱粉蛋白(amyloid-β, Aβ)胜肽以及過度磷酸化的滔(hyperphosphorylated Tau, pTau)所組成。許多研究已經顯示：乙型類澱粉蛋白胜肽的主要種類[亦即，一種42-胺基酸胜肽(Aβ1-42)]在帶有阿茲海默氏症之病患的腦脊髓液(cerebrospinal fluid, CSF)中是顯著降低的，而pTau在帶有阿茲海默氏症之病患的CSF中則是增加的。雖然探討利用這2種生物標記來診斷疾病之相關研究已經被執行，但這些研究結果並沒有產生一有用、明確的診斷方法。
氮-甲基天門冬胺酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)是在神經細胞中被發現的一種麩胺酸受體(glutamate receptor)以及離子通道蛋白質(ion channel protein)。當麩胺酸鹽(glutamate)以及甘胺酸(glycine)[或D-絲胺酸(D-serine)]與NMDAR結合時會使其被活化。該經活化的NMDAR允許正電離子流過神經細胞的細胞膜。NMDAR對於突觸可塑性(synaptic plasticity)、記憶(memory)以及認知功能(cognitive function)而言是重要的。NMDAR媒介的神經傳導(NMDAR-mediated neurotransmission)的衰減會造成老化大腦中神經可塑性(neuronal plasticity)的缺乏以及認知不足(cognitive deficits)，進而導致臨床劣變(deterioration)以及大腦萎縮(brain atrophy)。
目前已有許多方式可用來促進NMDAR活化，其中之一是透過抑制D-胺基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)的活性，DAAO是一種負責降解D-絲胺酸與D-丙胺酸(D-alanine)的過氧化體黃素酶(peroxisomal flavoenzyme)。藉由抑制DAAO活性可提高D-胺基酸(D-amino acids)的位準，D-胺基酸是作用於NMDAR共促效劑位址(coagonist site)的神經傳導物質(neurotransmitters)。編碼D-胺基酸氧化酶活化劑(D-amino acid oxidase activator, DAOA)(亦被稱為G72)的基因具有靈長類特異性(primate specific)並且位於染色體13q32-q34上。G72蛋白質在NMDA信號的調節上可能扮演一個重要的角色。在一個先前研究中，C.H. Lin等人發現在帶有精神分裂症(schizophrenia)的病患中末梢G72蛋白質表現(peripheral G72 protein expression)是顯著高於健康個體所具者，這表示G72蛋白質的末梢表現具有潛力可供作為一種用於診斷精神分裂症的生物標記(C.H. Linet al . (2014), Molecular Psychiatry, 19:1-2)。
胱胺酸/麩胺酸反向運輸蛋白系統xc - (cystine/glutamate antiporter system xc - )是一種鈉-非依賴性酸性胺基酸運輸蛋白(sodium-independent acidic amino acid transporter)，它會調節以一為1:1比率的方式將胱胺酸攝取進入細胞中並交換麩胺酸離開細胞。系統xc - 是由一個重鏈次單元(heavy chain subunit)(4F2hc,SLC3A2 )以及一個輕鏈次單元(light chain subunit)(xCT,SLC7A11 )所組成。當胱胺酸經由系統xc - 被攝入後會在細胞內被還原成半胱胺酸(cysteine)，而半胱胺酸是一種用於合成抗氧化麩胱甘肽(glutathione, GSH)(它是大腦中最重要的抗氧化劑之一)的速率限制受質(rate-limiting substrate)。因此，系統xc - 在麩胺酸(它是哺乳動物大腦中最大量的胺基酸神經傳導物質)的釋放中亦扮演一個關鍵的角色。
就申請人所知，無論是G72蛋白質或系統xc - 中的任一者與阿茲海默氏症的相關性皆尚屬未知。為了開發出一種用於診斷阿茲海默氏症之新穎的生物標記，申請人已進行實驗與統計學分析，俾以判斷G72蛋白質和/或SLC7A11 mRNA在阿茲海默氏症檢測上的診斷準確性(diagnostic accuracy)。申請人經由研究分析結果而意外地發現到，G72蛋白質或SLC7A11 mRNA各自單獨可供應用作為一種用於偵測阿茲海默氏症的潛在生物標記，而G72蛋白質以及SLC7A11 mRNA的組合則可以更可靠且有效地診斷阿茲海默氏症。
發明概要
於是，本發明提供一種用於診斷阿茲海默氏症的方法，其包含下列步驟：偵測一取自於一被懷疑具有阿茲海默氏症的人類個體的血液樣品中的生物標記位準，該生物標記位準是選自於由下列所構成的群組：G72蛋白質位準、SLC7A11 mRNA表現位準以及它們的組合；以及令該血液樣品中所偵測到的生物標記位準與一預設標準相比較，其中若該血液樣品中所偵測到的生物標記位準高於該預設標準，該人類個體被認定為具有阿茲海默氏症。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
如本文中所用的，術語“阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)”意指從中年晚期開始表現記憶喪失(memory loss)、混淆(confusion)以及定向力障礙(disorientation)並且典型地在5到10年間導致死亡的一種進行性精神劣變(progressive mental deterioration)。在病理學上，阿茲海默氏症的特徵是在於細胞內神經原纖維(intracellular neurofibrils)、神經纖維纏結(neurofibrillary tangles)以及老年斑(senile plaques)[它們是由具有類澱粉核心(amyloid core)的粒狀或絲狀咾銀團塊(granular or filamentous argentophilic masses)所組成]的增厚(thickening)、黏合(conglutination)以及變形(distortion)。
如本文中所用的，術語“診斷(diagnose)”、“診斷(diagnosis)”或“診斷(diagnosing)”意指區別或鑑定一疾病(disease)、症狀(syndrome)或病況(condition)，或區別或鑑定一具有一特殊的疾病、症狀或病況的人。在本發明的一個例示性具體例中，測定與演算法(algorithms)是基於針對一樣品的分析而被用來診斷一個體中的阿茲海默氏症。
為了尋找可供用於偵測阿茲海默氏症的新穎生物標記，申請人比較健康個體與被鑑定為具有阿茲海默氏症的病患個體之間，在血液樣品的G72蛋白質位準和/或SLC7A11 mRNA表現位準上的差異性。申請人的研究結果顯示，G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準這兩者在AD組與對照組個體之間呈現出顯著差異性，這表示G72蛋白質或SLC7A11 mRNA可以作為一種用於偵測阿茲海默氏症的生物標記。申請人進一步經由受試者操作特徵(receiver operating characteristics, ROC)曲線分析而意外地發現到，無論是單獨使用G72蛋白質或SLC7A11 mRNA作為生物標記皆可展現良好的診斷靈敏度(sensitivity)及專一性(specificity)，而若使用G72蛋白質以及SLC7A11 mRNA的組合來進行檢測，則能夠展現更為優異的診斷力來鑑別AD組與對照組的個體，進而達至更為可靠的阿茲海默氏症診斷效用。
於是，本發明提供一種用於診斷阿茲海默氏症的方法，其包含下列步驟： 偵測一取自於一被懷疑具有阿茲海默氏症的人類個體的血液樣品中的生物標記位準，該生物標記位準是選自於由下列所構成的群組：G72蛋白質位準、SLC7A11 mRNA表現位準以及它們的組合；以及 令該血液樣品中所偵測到的生物標記位準與一預設標準相比較， 其中若該血液樣品中所偵測到的生物標記位準高於該預設標準，該人類個體被認定為具有阿茲海默氏症。
在本發明的一個較佳具體例中，該生物標記位準是G72蛋白質位準。
在本發明的另一個較佳具體例中，該生物標記位準是SLC7A11 mRNA表現位準。
在本發明的又另一個較佳具體例中，該生物標記位準是G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準的組合。
依據本發明，該血液樣品可以在任何時間下取自於該人類個體，並且可以是一禁食(fasting)或非禁食(non-fasting)的血液樣品。在本發明的一個具體例中，該血液樣品是在上午被獲得。在本發明的另一個具體例中，該血液樣品是在上午7時至9時之間而被獲得的一禁食的血液樣品。
依據本發明，該血液樣品被拿來進行偵測之前有先經過血液分離處理。在本發明的一個較佳具體例中，該血液樣品被進行血液分離處理以從該血液樣品中分離出血漿(plasma)或血清(serum)來供偵測G72蛋白質位準之用。在本發明的又另一個較佳具體例中，該血液樣品被進行血液分離處理以從該血液樣品中分離出白血球(white blood cells)來供偵測SLC7A11 mRNA表現位準之用。
依據本發明，該G72蛋白質位準與該SLC7A11 mRNA表現位準可藉由那些熟習此技藝者所詳知的方法而被測定。
在某些具體例中，該G72蛋白質位準可藉由免疫分析法(immunoassay)而被偵測。示範性的免疫分析法可以包括西方墨點免疫分析法(western blot immunoassay)、多重免疫分析法(multiplex immunoassay)、酵素結合免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)、免疫放射量測定分析法(immunoradiometric assay, IRMA)、螢光免疫分析法(fluorescent immunoassay, FIA)、化學發光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay)以及免疫濁度測定法(immunonephelometry)。
該G72蛋白質位準可使用一會專一性地結合至G72蛋白質之以抗體為基礎的結合部分而被偵測。在本發明的一個具體例中，該以抗體為基礎的結合部分是一抗體。
“以抗體為基礎的結合部分(Antibody-based binding moiety)”或“抗體(antibody)”包括免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecules)以及免疫球蛋白分子的免疫活性決定位(immunologically active determinants)[例如，含有一個會專一性地結合至G72蛋白質的抗原-結合位址(antigen-binding site)的分子]。術語“以抗體為基礎的結合部分”是意欲要包括任何同型(isotype)(例如，IgG、IgA、IgM、IgE等等)的完整抗體以及它們的亦會與G72蛋白質專一性地反應的片段。
在本發明中，該以抗體為基礎的結合部分可包括多株的(polyclonal)、單株的(monoclonal)抗體以及重組型抗體，或其他經純化的抗體以及重組型抗體之製品，並且進一步是意欲要包括人類化抗體(humanized antibodies)、雙-專一性抗體(bi-specific antibodies)以及具有至少一個衍生自一抗體分子的抗原-結合決定位的嵌合分子(chimeric molecules)。
在本發明中，“以抗體為基礎的結合部分”或“抗體”可包括一捕捉抗體(capture antibody)以及一偵測抗體(detection antibody)。
如此處所用的，術語“捕捉抗體”意指一抗體[不論是單株的抗體、多株的抗體，或是該抗體的一免疫反應片段(immunoreactive fragment)]，它能夠結合至一感興趣的抗原(antigen)，並且藉此而容許隨後被施用的抗體能夠辨識該抗原。該捕捉抗體可被用於一異質性(固相)或均質性(液相)分析法[heterogeneous (solid phase) or homogeneous (solution phase) assay]中。該捕捉抗體可被固定於一固相之上。
如此處所用的，術語“偵測抗體”意指一具有一可偵測標記的抗體，該可偵測標記對於存在一樣品中之一或更多感興趣的待測物(analytes)具有專一性[亦即，結合或被結合至待測物，或與該待測物形成一複合物]。該術語亦涵蓋一對於一或更多感興趣的待測物具有專一性的抗體，其中該抗體可被結合以另一個包含有一可偵測標記的物種。可偵測標記的實例包括，但不限於：一放射性標記(radioactive label)、一半抗原標記(hapten label)、一螢光標記(fluorescent label)、一化學發光標記(chemiluminescent label)、一酵素標記(enzymatic label)、一核苷酸[例如，寡核苷酸(oligonucleotide)]標記、一抗原決定位標籤(epitope tag)以及它們的組合。
半抗原標記的實例可包括生物素/鏈黴抗生物素蛋白(biotin/streptavidin)以及地高辛(digoxigenin)。
抗原決定位標籤的實例可包括T7、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5以及HIS。
抗體可使用傳統技術而被片段化(fragmented)。術語“抗體的片段”意指一抗體分子之經蛋白質水解切斷的節段(segments)或被重組地製備的部分(proteolytically-cleaved or recombinantly-prepared portions)，它們能夠選擇性地與一特定蛋白質相反應。
該等蛋白質水解切斷的節段和/或被重組地製備的部分之非限制性實例包括Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、dabs以及含有一藉由一個肽連接子(peptide linker)而被接合的VL與VH領域的單鏈變異性抗體(scFv)。該等scFv’s可被共價地或非共價地連結，俾以形成具有兩個或更多結合位址的抗體。
依據本發明，該G72蛋白質位準與從該可偵測標記的抗體所放射出的信號強度係呈正相關性。
在本發明的一個示範性具體例中，該以抗體為基礎的結合部分是藉由將抗體連結至一酵素而被可偵測地標記。依次地，當該酵素被曝露至它的基質時，該酵素會以一種能夠產生一化學部分(chemical moiety)的方式來與該基質相反應，該化學部分可藉由例如分光光度計的方式(spectrophotometric mean)、螢光標定的方式(fluorometric mean)或視覺的方式(visual mean)而被偵測到。
依據本發明，可被用來與抗體的可偵測標記相反應的酵素包括，但不限於：蘋果酸去氫酶(malate dehydrogenase)、葡萄球菌核酸酶(staphylococcal nuclease)、δ-V-類固醇異構酶(delta-V-steroid isomerase)、酵母乙醇去氫酶(yeast alcohol dehydrogenase)、α-甘油磷酸去氫酶(alpha-glycerophosphate dehydrogenase)、丙糖磷酸異構酶(triose phosphate isomerase)、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、天冬醯胺酸酶(asparaginase)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、β-半乳糖酶(β-galactosidase)、核醣核酸酶(ribonuclease)、尿素酶(urease)、觸酶(catalase)、葡萄糖-VI-磷酸去氫酶(glucose-VI-phosphate dehydrogenase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)以及乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase)。
在某些具體例中，該抗體亦可被標記以一螢光化合物(fluorescent compound)。當經螢光標記的抗體被曝露在具有適當波長的光下時，它的存在可因著螢光而被偵測到。適用於本發明之螢光化合物包括，但不限於：CYE染料(CYE dyes)、螢光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate, FITC)、玫瑰紅(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、柯里膦-O (coriphosphine-O, CPO)、藻藍蛋白(phycocyanin, PE)、別藻藍蛋白(allophycocyanin, APC)、鄰苯二甲醛(o-phthaldehyde)、螢胺(fluorescamine)以及雙聯染料(tandem dyes)。
該雙聯染料的實例包括PE-Cy5 (PC5)、PE-Cy7 (PC7)以及PE-德州紅(PE-Texas Red)。
在某些具體例中，該抗體可藉由螢光放射金屬(fluorescence emitting metals)[諸如152 Eu或其他的鑭系元素(lanthanide series)金屬]而被偵測。這些金屬可藉由一金屬-螯合基團(metal-chelating groups)[諸如二乙三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA)或乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)]而被附接至該抗體上。
在某些具體例中，該抗體可藉由偶合至一化學發光化合物(chemiluminescent compound)而被偵測。該化學發光-抗體的存在接著藉由偵測在一化學反應的過程當中所產生的發光而被測定。化學發光化合物的實例包括，但不限於：發光胺(luminol)、蟲螢光素(luciferin)、異發光胺(isoluminol)、theromatic吖錠酯(theromatic acridinium ester)、咪唑(imidazole)、吖錠鹽(acridinium salt)以及草酸酯(oxalate ester)。
另擇地，亦可使用其他各種免疫分析法中的任一者來進行偵測。例如，若是放射性地標記一抗體，可藉由使用放射免疫分析法來偵測該抗體。偵測放射性同位素的方法包括，但不限於：伽瑪計數器(gamma counter)、閃爍計數器(scintillation counter)以及自動放射顯影術(autoradiography)。該抗體可藉由放射性同位素而被偵測。放射性同位素的實例包括，但不限於：3 H、31 P、35 S、14 C以及125 I。
依據本發明，該SLC7A11 mRNA表現位準可使用下列方法學中的至少一者而被偵測到：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、即時聚合酶鏈反應(real time PCR)[又被稱為定量聚合酶鏈反應(quantitative PCR, q-PCR)]、反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR, RT-PCR)、定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative RT-PCR, RT-qPCR)、雜交(hybridization)、探針雜交(probe hybridization)以及基因表現陣列(gene expression array)。在本發明的一個具體例中，該SLC7A11 mRNA表現位準是使用定量反轉錄聚合酶鏈反應而被偵測。
依據本發明，術語“預設標準(predetermined standard)”可意指針對一健康個體的一血液樣品中的G72蛋白質位準或SLC7A11 mRNA表現位準的一範圍、一數值或一截斷值(cutoff value)，它是藉由一選定的方法而被測定。在健康個體的族群與具有阿茲海默氏症的個體之間的截斷值可以藉由那些熟習此技藝者而被測定。
術語“健康個體(healthy individual)”意指一不具有與阿茲海默氏症有關聯的任何症狀或者不處於發展出阿茲海默氏症之風險中的個體，亦即，該個體在經過一專業的執業醫師進行評估之後被認為是健康的。
為了評估阿茲海默氏症的進展或者針對阿茲海默氏症的治療的有效性，如在先前檢查中所偵測到的一G72蛋白質位準與一SLC7A11 mRNA表現位準亦可被用來作為針對該人類個體的參考資料。
在本發明的一個具體例中，有關於被懷疑具有阿茲海默氏症的人類個體中的G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準的預設標準是分別藉由西方墨點免疫分析法以及RT-qPCR來作測定，並產生一為2.3285 ng/mL的標準值以及一為12.185的標準ΔCT值(藉由將SLC7A11 的CT值減去選定的內控基因的平均CT值而被計算出)來分別作為針對一G72蛋白質位準以及一SLC7A11 mRNA表現位準的截斷值。
依據本發明，阿茲海默氏症的存在亦可以基於所偵測到的G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準的一合併截斷值而被測定。在某些具體例中，該合併截斷值可以藉由一使用統計學分析所公式化的方程式而被計算出來[諸如，判別函數分析(discriminant function analysis)、邏輯式迴歸分析(logistic regression analysis)、受試者操作特徵曲線分析(receiver operating characteristic curve analysis)以及脊迴歸分析(ridge regression analysis)]。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 實驗個體：
下面的實驗是使用由研究倫理審查會(Institutional Review Board, IRB)所認可的操作程序並依據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)的現行修訂版之規範來進行。在向參與者進行完整的實驗說明之後，有取得符合IRB規範之書面經告知的同意(informed consent)。
本實驗共計有239位人類個體參加，每位參與者沒有重大的腦血管病史且哈欽斯基缺血分數(Hachinski Ischemic Score)不大於4，同時除了阿茲海默氏症之外沒有主要的神經性(neurological)、精神性(psychiatric)或醫學(medical)的病況。再者，每位參與者沒有物質(包括酒精)上的濫用或成癮，沒有妄想(delusion)、幻覺(hallucination)或譫妄(delirium)的症狀，同時亦沒有嚴重的視覺或聽力損失，並且能夠遵循該操作程序。此外，為了排除潛在的干擾作用(confounding effect)，每位參與者已被確定為非吸菸者(non-smoker)並且依據診斷與統計手冊第4版(Diagnostic and Statistical Manual-IV, DSM-IV)的標準而被判斷為沒有物質(包括酒精)上的濫用。
在所有239位參與者之中，有130位人類個體被鑑定為健康自願者，並且在下文中被稱為“對照組(control group)”。這些個體的年齡為≥18歲、沒有任何第I軸向或第II軸向之精神異常(psychiatric disorder)以及身體與神經皆為健康的，並且具有落在正常範圍內的實驗室評鑑(laboratory assessment)[包括尿液/血液常規檢查(urine/blood routine)、生化試驗(biochemical test)以及心電圖學(electrocardiography)]結果。剩餘的109位人類個體被鑑定為帶有阿茲海默氏症的病患，並且在下文中被稱為“AD組(AD group)”。這些帶有阿茲海默氏症的病患符合下列條件：(1)滿足經由國家神經與溝通疾病以及中風研究所以及阿茲海默氏症暨相關疾病協會(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association, NINCDS-ADRDA)所提出之有關很有可能為阿茲海默氏症(probable AD)的規範並且具有一為1或更高的臨床失智量表(Clinical Dementia Rating, CDR)分數，以及(2)身體健康並且具有落在正常範圍內的實驗室評鑑(包括尿液/血液常規檢查、生化試驗以及心電圖學)結果。
在130位對照組個體與109位AD組個體當中，來自對照組的40位個體以及來自AD組的70位病患是依據年齡而被挑選與配對以供用於進一步分析。表1顯示所有個體[“年齡-不相配的(age-unmatched)”]以及年齡相配之個體的子集合[“年齡-相配的(age-matched)”]的臨床特徵(亦即，性別、年齡以及CDR分數)。 表1. 人口統計學特徵(demographic characteristics)
Figure 106116948-A0304-0001
 a 表示平均值±標準偏差(standard deviation)。實施例 1. G72 蛋白質位準以及 SLC7A11 mRNA 表現位準的分析以供用於阿茲海默氏症的診斷 實驗方法 ： A. 血漿中的 G72 蛋白質位準的偵測 ：
所有個體在經歷至少8小時的禁食之後，在上午7時至9時的期間內，對所有個體進行血液取樣。
血液取樣方式是藉由使用靜脈切開術(phlebotomy)而分別從對照組以及AD組的每一位個體中收集10 mL周邊靜脈血液(peripheral venous blood)並放入至一含有EDTA的血液收集管中。該收集管在4℃下以1500 xg予以離心歷時10分鐘。由此所得到的血漿被快速地移至另一個收集管中並且被立即地保存於-80℃下直到進一步分析。
血漿中的G72蛋白質位準是使用西方墨點分析來偵測，並依據下面的操作步驟來進行。首先，將上述收集到的血漿樣品進行解凍，繼而各取100 µL的血漿樣品並以ProteoPrep® Blue Albumin以及IgG Depletion Kit (Sigma)予以處理，俾以去除血漿中的高豐富蛋白質(high-abundant protein)。然後，收集低豐富蛋白質(low-abundance protein)的分離部分。接著，對分離部分各取10 µL並混合以一為4倍體積的樣品緩衝液(sample buffer)[含有500 mM Tris-HCl (pH 6.8)、16% SDS、80%甘油、400 mM DTT以及0.08%溴酚藍(bromophenol blue)]，藉此而得到蛋白質樣品。之後，取適量的蛋白質樣品並使用12% SDS-PAGE分離凝膠來進行電泳，繼而將凝膠片上被分離的蛋白質轉印至孔徑為0.45 μm的聚二氟乙烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane]。接著，將轉印後的PVDF膜取出並在室溫下以5%脫脂乳粉(nonfat dry milk){配於TBST [含有20 mM Tris-HCl (pH 7.6)、500 mM NaCl以及0.1% Tween 20]中}進行封阻處理(blocking)歷時1小時。之後，加入山羊抗-G72抗體(goat anti-G72 antibody)(Cat. No. sc-46118, Santa Cruz Biotechnology)作為一次抗體(primary antibody)(以TBST予以稀釋1000倍)，並置於4℃下反應隔夜後，以TBST予以洗滌3次，每次15分鐘。接著，加入HRP-結合抗-山羊IgG抗體(HRP-linked anti-goat IgG antibody)(Cat. No. sc-2030, Santa Cruz Biotechnology)作為二次抗體(以TBST予以稀釋5000倍)，於室溫下作用歷時2小時後，以TBST予以洗滌3次。之後，使用ECL高級西方墨點分析偵測套組(ECL Advance Western Blotting Detection Kit)(RPN2135, GE Healthcare)來進行化學發光染色(chemiluminescence staining)，並使用一ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare)來進行拍照。所得到的影像是使用ImageQuant™ TL 7.0軟體(GE Healthcare)來進行分析，藉由測量每一色帶的相對強度(relative intensity)並且利用G72重組蛋白質(20或50 ng，由中國醫藥大學附設醫院的張顥騰教授友情捐贈，台中，台灣)予以標準化而被定量。該西方墨點分析被重複進行2次。B. 白血球中的 SLC7A11 mRNA 表現位準 的偵測 ：
血液取樣方式是藉由使用靜脈切開術而分別從對照組以及AD組的每一位個體中收集10 mL周邊靜脈血液並放入至一含有EDTA的血液收集管中。該收集管在4℃下以1500 xg予以離心歷時10分鐘，移除血漿，繼而將1X RBC溶解緩衝液(RBC lysis buffer)(Genepure Technology Co.)加入至該收集管而使得紅血球(red blood cells,RBC)被溶解，接著以1500 xg予以離心歷時10分鐘，藉此而得到白血球(white blood cells,WBC)。
為了研究系統xc - 的輕鏈次單元在白血球中的基因表現，使用定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative RT-PCR, RT-qPCR)來分析白血球中的SLC7A11 mRNA表現位準。有關RT-qPCR是依據下面所述方式來進行：首先，總RNAs是使用TRI試劑(Molecular Research Center, Inc.)依據製造商的操作指南從白血球中被分離。由此所得到的RNA被混合以DNase I，俾以避免DNA汙染。RNA濃度是藉由使用一ND-1000 UV-Vis分光光度計(ND-1000 UV-Vis spectrophotometer)(Thermo Fisher Scientific Inc.)來測定260 nm的吸光值。由此所得到的總RNAs分別被拿來進行下面的反轉錄反應(reverse transcription reaction)以合成第一股cDNA (first-strand cDNA)。
有關第一股cDNA的合成是依據下面所述步驟來進行。簡言之，將一經分離的RNA的等分試樣(2.5 μg)加入0.5 μg的隨機六員與寡-dT的引子(random hexamer and oligo-dT primers)，並於70℃下作用歷時5分鐘，俾以使RNA二級結構短暫地變性，繼而轉移至冰上快速冷卻，俾以促進引子與RNA之間的黏合(annealing)過程。之後，加入1500 μM dNTP、20U RNase抑制劑(RNase inhibitor)、200U MMLV反轉錄酶(MMLV reverse transcriptase)(Promega)以及反轉錄酶緩衝液(reverse transcription buffer)並予以混合均勻(最終體積為20 μL)。接著，將所形成的混合物置於37℃下作用歷時90分鐘以進行延伸反應(extension)，繼而轉移至70℃下作用歷時10分鐘以終止酵素反應，藉此而得到第一股cDNA。
即時PCR偵測系統(Real-Time PCR Detection System)是使用SYBR Green Master Mix來測量SLC7A11 mRNA表現。特別地，PCR的總反應體積為20 μL，其中含有2 μL的第一股cDNA (250 ng)、10 μL Master mix (Roche)以及各個濃度為600 nM的引子(被用於擴增SLC7A11 的引子對被列示於表2中)。PCR的操作條件是先在95℃下進行預-培育歷時10分鐘，俾以活化熱啟動DNA聚合酶(hot-start DNA polymerase)，接而進行45個循環如下：在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時15秒、在58℃下進行引子黏合(primer annealing)以及延伸反應(extension)歷時45秒。為了監測RT-qPCR反應的專一性，PCR產物是藉由熔點曲線分析(melting curve analysis)而被分析。該RT-qPCR反應被執行2次。另外，作為負對照組(negative controls)的實驗被進行，俾以確認沒有交叉-汙染(cross-contamination)。
另外，3個內控基因(housekeeping genes)被用來作為內生性對照組(endogenous controls)，包括甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(2對引子對被使用)、乙二型微球蛋白(beta-2-microglobulin, B2M)以及次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase, HPRT)的基因。這些被用於RT-qPCR的內控基因的引子對被列示於表2中。而有關這些內控基因的平均CT值是用來計算出白血球中的SLC7A11 的相對mRNA表現位準(ΔCT = CT, 標的 –CT, 內控 )。 表2. 用於RT-qPCR的引子對
Figure 106116948-A0304-0002
 C. G72 蛋白質位準以及 SLC7A11 mRNA 表現位準的統計學分析：
有關AD組與對照組的基線特徵(baseline characteristics)被計算。數值資料(numeric data)是以平均值±標準偏差(Standard Deviation, S.D.)來表示。在AD組與對照組之間的p -數值是藉由t-試驗(t-test)而被計算出，並且一小於0.05的機率值(probability value)表示有統計學顯著性(statistical significance)(p ＜0.05)。
有關G72蛋白質、SLC7A11 mRNA以及它們的組合的受試者操作特徵(receiver operating characteristics, ROC)曲線是藉由將真陽性率(true positive rate)[亦即，靈敏度(sensitivity)]與偽陽性率(false positive rate)[亦即，1-專一性(specificity)]作圖而被獲得。
下面的公式(I)是用來計算G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準的組合的加權值(weighted value)，其是藉由邏輯式迴歸模型(logistic regression model)並且以G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準作為共變量(covariate)而被訂定： A＝-13.246+B×3.197+C×2.273 (I) A＝加權值 B＝G72蛋白質位準(ng/μL) C＝ΔCT值
針對各個生物標記在ROC曲線之下的區域[亦即ROC曲線下面積(area under the ROC curve, AUC)]亦被計算出來並且被使用作為一種用於測定何種生物標記具有一較佳的診斷力的指數(index)，俾以自健康個體中區別病患(參照Zweig M.H. (1993),Clin. Chem ., 39:561-577)。AUC數值的解釋包括：傑出的(AUC＞0.9)、優良的(AUC=0.8~0.9)、可接受的(AUC=0.7~0.8)、差的(AUC=0.6~0.7)以及無法鑑別的(AUC=0.5)。 結果：
申請人發現到年齡相配的個體與年齡不相配的個體所測得的實驗結果是相似的，因此以下僅就年齡相配的個體所獲得的數據來進行討論，而相關實驗數據被顯示在下面表3與表4中。 表3. 對照組與AD組的血漿G72蛋白質以及WBCSLC7A11 mRNA的表現位準
Figure 106116948-A0304-0003
 † 表示SLC7A11 的mRNA表現的ΔCT值 § 表示藉由公式(I)而被計算出的加權值 表4. 對照組與AD組的血漿G72蛋白質和/或WBCSLC7A11 mRNA位準的ROC曲線分析
Figure 106116948-A0304-0004
 † 表示SLC7A11 mRNA表現的ΔCT值 § 表示藉由公式(I)而被計算出的加權值A. G72 蛋白質作為一種用於診斷阿茲海默氏症的生物標記：
從表3可見，AD組以及對照組的G72蛋白質表現位準分別為2.63±1.20 ng/μL以及1.72±0.71 ng/μL，且AD組的血漿中的G72蛋白質表現位準是顯著高於對照組所具者(p ＜0.001)。這個實驗結果顯示，血漿中的G72蛋白質可作為一種用於偵測阿茲海默氏症的生物標記。
再從表4的ROC曲線分析來看，G72蛋白質表現位準的最佳截斷值(optimal cutoff value)是2.3285 ng/μL，這表示當一人類個體的血漿中的G72蛋白質位準³ 2.3285 ng/μL時，該人類個體可能帶有阿茲海默氏症。而若以這個G72蛋白質表現位準的截斷值來進行檢測，診斷的靈敏度以及專一性可分別地達到54.3%以及90%。此外，血漿中的G72蛋白質位準的AUC為0.726，這表示G72蛋白質具有一良好的診斷力，而可以用來區別AD組與對照組的個體。
綜合上述實驗結果可知：當使用血漿中的G72蛋白質作為針對阿茲海默氏症的唯一生物標記時，在區別AD組與對照組的個體上可提供有效的診斷力。B. SLC7A11 mRNA 作為一種用於診斷阿茲海默氏症的生物標記：
從表3可見，AD組以及對照組的象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值分別為13.82±1.29以及12.44±1.37，且AD組的白血球中象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值是顯著高於對照組所具者(p ＜0.001)。這個實驗結果顯示，白血球中的SLC7A11 mRNA可作為一種用於偵測阿茲海默氏症的生物標記。
再從表4的ROC曲線分析來看，SLC7A11 mRNA表現位準的最佳截斷值是12.185，這表示當一人類個體的白血球中象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值³ 12.185時，該人類個體可能帶有阿茲海默氏症。而若以這個SLC7A11 mRNA表現位準的截斷值來進行檢測，診斷的靈敏度以及專一性可分別地達到92.9%以及45%。此外，白血球中象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的AUC為0.764，這表示SLC7A11 mRNA具有一良好的診斷力，而可以用來區別AD組與對照組的個體。
綜合上述實驗結果可知：當使用白血球中的SLC7A11 mRNA作為針對阿茲海默氏症的唯一生物標記時，在區別AD組與對照組的個體上可提供有效的診斷力。C. 血漿中的 G72 蛋白質位準以及白血球中的 SLC7A11 mRNA 表現位準的組合用於診斷阿茲海默氏症：
從表3可見，AD組以及對照組的G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的組合的加權值分別為26.59±4.83以及20.54±4.03，且AD組的G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的組合的加權值是顯著高於對照組所具者(p ＜0.001)。這個實驗結果顯示，血漿中的G72蛋白質以及白血球中的SLC7A11 mRNA的組合可作為一種用於偵測阿茲海默氏症的生物標記組合。
再從表4的ROC曲線分析來看，G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的組合的最佳截斷值是21.723，這表示當一人類個體的G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的組合的加權值³ 21.723時，該人類個體可能帶有阿茲海默氏症。而若以這個組合的截斷值來進行檢測，診斷的靈敏度以及專一性可分別地達到85.7%以及67.5%。
此外，G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的組合的靈敏度是高於G72蛋白質位準所具者，而G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值的組合的專一性是高於象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值所具者。特別地，G72蛋白質位準以及象徵SLC7A11 mR NA表現位準的ΔCT值的組合的AUC數值是高於G72蛋白質位準或象徵SLC7A11 mRNA表現位準的ΔCT值各自所具者。
這些實驗結果顯示：G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA 表現位準的組合相較於G72蛋白質位準或SLC7A11 mRNA表現位準具有一更佳的診斷力，而可以區別AD組與對照組的個體。因此，該2種生物標記的組合使用在區別帶有與不帶有阿茲海默氏症的個體上具有一協同效應(synergic effect)。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
＜110＞ 林, 潔欣 藍, 先元 ＜120＞ 使用G72蛋白質與SLC7A11 mRNA作為生物標記來診斷與治療阿茲海默氏症的方法 ＜130＞ PE-54434-AM ＜160＞ 10 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的SLC7A11 的F1引子 ＜400＞ 1 ccatgaacgg tggtgtgtt 19 ＜210＞ 2 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的SLC7A11 的R1引子 ＜400＞ 2 gaccctctcg agacgcaac 19 ＜210＞ 3 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的GAPDH 的F2引子 ＜400＞ 3 ccactcctcc acctttgac 19 ＜210＞ 4 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的GAPDH 的R2引子 ＜400＞ 4 accctgttgc tgtagcca 18 ＜210＞ 5 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的GAPDH 的F3引子 ＜400＞ 5 agccacatcg ctcagacac 19 ＜210＞ 6 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的GAPDH 的R3引子 ＜400＞ 6 gcccaatacg accaaatcc 19 ＜210＞ 7 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的B2M 的F4引子 ＜400＞ 7 ttctggcctg gaggctatc 19 ＜210＞ 8 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的B2M 的R4引子 ＜400＞ 8 tcaggaaatt tgactttcca ttc 23 ＜210＞ 9 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的HPRT 的F5引子 ＜400＞ 9 acgtcttgct cgagatgtga 20 ＜210＞ 10 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工的序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於RT-qPCR的HPRT 的R5引子 ＜400＞ 10 taatccagca ggtcagcaaa 20

Claims (8)

  1. 一種用於診斷阿茲海默氏症的方法，其包含下列步驟：偵測一取自於一被懷疑具有阿茲海默氏症的人類個體的血液樣品中的生物標記位準，該生物標記位準是G72蛋白質位準以及SLC7A11 mRNA表現位準的組合；以及令該血液樣品中所偵測到的生物標記位準與一得自於健康個體之預設標準相比較，其中若該血液樣品中所偵測到的生物標記位準高於該預設標準，該人類個體被認定為具有阿茲海默氏症。
  2. 如請求項1的方法，其中該血液樣品被拿來進行偵測之前有先經過血液分離處理，俾以分離出血漿來供偵測G72蛋白質位準之用。
  3. 如請求項1的方法，其中該血液樣品被拿來進行偵測之前有先經過血液分離處理，俾以分離出血清來供偵測G72蛋白質位準之用。
  4. 如請求項1的方法，其中該G72蛋白質位準是使用一會專一性地結合G72之以抗體為基礎的結合部分而被偵測。
  5. 如請求項4的方法，其中該G72蛋白質位準是使用下列方法學之任一者而被偵測到：西方墨點免疫分析法、多重免疫分析法、酵素結合免疫吸附分析法、放射免疫分析法、免疫放射量測定分析法、螢光免疫分析法、化學發光免疫分析法以及免疫濁度測定法。
  6. 如請求項4的方法，其中該以抗體為基礎的結合部分是使用一選自於下列所構成的群組之可偵測標記而被標記：一 放射性標記、一半抗原標記、一螢光標記、一化學發光標記、一酵素標記以及一抗原決定位標籤。
  7. 如請求項1的方法，其中該血液樣品被拿來進行偵測之前有先經過血液分離處理，俾以分離出白血球來供偵測SLC7A11 mRNA表現位準之用。
  8. 如請求項1的方法，其中該SLC7A11 mRNA表現位準是使用下列方法學之任一者而被偵測到：聚合酶鏈反應、即時聚合酶鏈反應、反轉錄聚合酶鏈反應、定量反轉錄聚合酶鏈反應、雜交、探針雜交以及基因表現陣列。
TW106116948A 2017-02-09 2017-05-23 使用G72蛋白質與SLC7A11 mRNA作為生物標記來診斷與治療阿茲海默氏症的方法 TWI706135B (zh)

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