JP2017529527A - 質量分析イメージングによってサンプルを特徴づける方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析イメージングを使用することによってサンプルを特徴づける方法に関する。より詳細には、本発明は、サンプル中の1つ又はいくつかのイオンの分布と関連した形態計測データ及び/又はテクスチャデータを抽出及び測定するための質量分析によって得られたイメージングデータの使用を提案する。本発明はまた、サンプル中の1つ又はいくつかの対象の分子を同定及び/又は選択するためのこの種の形態計測データ及び/又はテクスチャデータの使用を提案する。
質量分析は、サンプル中の対象の分子を検出及び同定するために化学及び生化学分析において使用される周知の技術である。近年、質量分析による分子イメージングが開発され、対象の分子の分布をサンプル中に直接視認することが可能となった。質量分析イメージング(MSI)は、サンプルから分子イオンを局在化することを可能にするイオン化源を使用したすべてのイメージング技術を統括する。レーザー、イオン、気体、液体、溶媒、プラズマ(単独又は組み合わせられた源)、マイクロ波、電子などの、複数のイオン化源が挙げられ、DESI(「Desorption Electrospray Ionization」)、LAESI(「Laser Ablation Electrospray Ionization」)、MALDI(「Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization」)、SIMS(「Secondary Ion Mass Spectrometry」)、MALDESI(「Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization」)、及びLESA(「Liquid Extraction Surface Analysis」)(ICP−MSI(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Imaging)などの、イメージングモードにおいて使用され得る。
本発明は、サンプルのイオンと関連した強度値を考慮するだけでなく、サンプル中の前記イオンの空間配列及び前記空間配列を特徴づける測定値を考慮することによって、質量分析によるイメージングによって従来得られる前記サンプルのイメージングデータ(すなわち、位置、m/z比、強度)を使用することを提案する。
i)前記サンプル中の複数のイオンと関連した複数の形態計測及び/又はテクスチャを、参照サンプル中の複数のイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータと比較する;
ii)サンプルの少なくとも1つの特徴的イオンを同定する;
iii)工程ii)において同定された前記イオンに対応する分子を同定する。
i)データベース又はモデルが、いくつかの参照サンプルから得られた、複数の参照イオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータによって確立され、前記形態計測及び/又はテクスチャデータが、前記参照サンプル中の前記参照イオンの空間配列を表し;
ii)同定されるサンプル中の少なくとも1つのイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータが、記録され;
iii)同定されるサンプルのイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータが、データベース又はモデルに含まれる参照イオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータと比較される、
プロセスを提案する。
したがって、本発明は、形態計測及び/又はテクスチャに関して、サンプル中の少なくとも1つのイオンの空間配列を前記イオンと関連したイメージングデータから特徴づける、質量分析イメージング(MSI)によって前記サンプルを特徴づける方法を目的とする。本発明によれば、サンプル中のイオンの分布は、もはや強度によってだけではなく、この分布により描画された形状/オブジェクト及び関連した測定値(表面積、容積など)によって、並びに/又はこれらの形状/オブジェクト間の配列によって特徴づけられる。それ故、所与のイオンに対して同一の平均強度を有するが、前記イオンと関連した異なる形態計測及び/又はテクスチャ特性を有する2つのサンプルを判別することが容易に可能となる。
a)サンプル中の少なくとも1つのイオンのために、MSIによりデータを取得する工程;
次いで、
b)形態計測及び/又はテクスチャ特性に従って、前記少なくとも1つのイオンの位置と関連するデータからサンプル中の前記少なくとも1つのイオンの空間配列を特徴づける工程。
c)サンプルのイメージングデータをサンプルの分子強度プロファイルを表す対象の領域にセグメント化する工程;及び
d)形態計測及び/又はテクスチャ特性に従って対象の領域の分子プロファイルのイオンの空間配列を特徴づける工程。
e)前記サンプル中の複数のイオンから形態計測及び/又はテクスチャデータを含むデータベース(DB)を作成する工程。
代替的に、特徴づけ方法は、以下の工程を含む:
f)前記サンプル中の複数のイオンの形態計測及び/又はテクスチャデータを含むモデルを生成する工程。
i)いくつかの参照サンプルから得られた、少なくとも1つの参照イオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータによって、データベースが確立又はモデルが生成され、前記形態計測及び/又はテクスチャデータが、前記参照サンプル中の前記少なくとも1つの参照イオンの空間配列を表し;
ii)同定されるサンプル中の少なくとも1つのイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータ(表面積、体積、形状、パターン、繰り返しなど)が、記録され;
iii)工程ii)の形態計測及び/又はテクスチャデータが、工程i)の、データベース又はモデルに含まれる形態計測及び/又はテクスチャデータと比較される、
プロセスを目的とする。
i)前記サンプル中の複数のイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータが、参照サンプル中の複数のイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータと比較される;
ii)有利には参照サンプル中に存在しない、サンプルの少なくとも1つのイオンの特徴が、同定される;
iii)前工程において同定された前記イオンに対応する分子が同定される、
プロセスを目的とする。
本発明によるプロセスは、マーカ、特にバイオマーカを同定するために使用され得る。実際、生物学的サンプルの場合に、2つの状態(例えば、病気対健康、処置済対保菌、露出対非露出など)間に存在する形態変動を同定することが可能である。特に、本発明によれば、例えばサンプルの構造の巨視的及び/又は微視的研究によって前もって同定された、対象の領域に具体的に存在するイオンをより詳細に研究することが可能である。
本発明によるプロセスは、分子フィルタリングのために使用され得る。
本発明によるプロセスはまた、特に環境又は健康診断の一環としての、細胞又は細菌カウントの分野で使用され得る。この目的のために、カウントされるオブジェクトを強調するように、質量分析イメージングにおいて、細胞壁の特異的な分子(例えば脂質)を選択することが可能である。
本発明によるプロセスはまた、特にサンプル中の対象の要素(分子、イオン、m/z)の形態計測(形状、表面積、体積など)の経時変化を追跡するために、形状の動力学的研究において使用され得る。特に、経時的に対象の領域の形態計測の変化、例えば増大又は減少、を示すことが可能である。
本発明によるプロセスは、植物又は動物の生物学的サンプル中の細胞タイプ又は組織サブ構造を同定するために使用され得る。この細胞タイピングは、各々の細胞の特異的な形態計測によって可能となる。したがって、得られた細胞の形態計測に応じて、1つ又はいくつかのサンプル中に含まれる細胞タイプ(単数又は複数)を決定することが可能である。
本実施例の意図は、サンプル中で得られたm/z比に対する強度に関するデータだけを考慮するか、又はこのm/z比と関連した形態計測及びテクスチャ特性を考慮するかに応じて、前記サンプルについて取得された同じイメージングデータセットから生じる情報の違いを示すことである。
1/イメージングデータから得られた画像をロードする。
2/例えばOtsu法を使用することによって画像を2値化するための閾値を決定する。
3/非最適化アルゴリズムを介してオブジェクトをラベリング及びカウントする。
4/変数中の非ゼロ位置の数を回収する。
5/変数中のオブジェクト又は画像のピクセル数を回収する。
6/変数中の平均強度を算出する。
7/オブジェクトが少なくとも一定の形状性を有するかどうかを決定する試験をする。
「画像全体を走査しないのならば:
行別に画像行を走査し、
非ゼロピクセルに遭遇した(オブジェクトに属する)場合には、
オブジェクトのピクセルを0にセットするためにその近隣及び8連結で隣接する近隣を 走査し、
オブジェクトカウンタをインクリメントし、
近隣走査を終了し、
非ゼロピクセルを終了し、
行走査を終了し、
アルゴリズムを終了する」
上で説明された工程を、連続して(図1A)又は断片化して(図1B)6ピクセルの長さを各々有し及びこれらの6ピクセル上に同一の平均強度を各々有する2つのセグメント(図1)のために従来取得されるイメージングデータに適用した。
材料及び方法
動物:
5つのラット肺を、この研究のために使用した。3つは、7日間1mg/kgの用量で気道(口咽頭吸引ルート)によりブレオマイシン(Apollo Scientific, UK)の処置を受けていたラットのもので、2つは、同期間同様に食塩水を受けていた動物のものである。すべてのラットは、Sprague Dawley, Crl:CD (SD)雄ラットであった。両方の群を、実験開始の22日後に屠殺した。肺を、アガロースで膨張し、10%の中性緩衝液を含んだホルマリン中で固定し、−80度に冷凍した。動物実験は、1986年のAnimals (Scientific Procedures) Actに準拠した。
画像を取得するために、ITOスライドを、Delta Technologies (Loveland, USA)から購入し、9−アミノアクリジン(9AA)で覆った。
30μmの空間分解能を有した100〜1,000に含まれるm/zのための「フルスキャン」モード及びネガティブモードで質量フィルタを取得するために80%の出力エネルギー及び1000Hzの反復率で使用されるSmartBeam IIレーザーを備えた質量分析計MALDI-FTICR(7T Solarix, Bruker Daltonics, Breme, Germany)を使用した。各々の質量スペクトルは、同じ場所への500連続のレーザーショットの蓄積に対応する。内部較正を、9AAマトリックス及び200m/z〜900m/zに含まれるリン脂質を使用して、実行した。質量分析計を、FTMS Control 2.0及びFlexImaging 4.0ソフトウェアパッケージ(Bruker Daltonics, Breme, Germany)を使用して、制御した。
閾値を超えた状態から変換された平均スペクトルの最大を、ピークと見做す。使用した変換は、ゼロ値のない信号の中央値で減算してから、ゼロ値のない信号の中央絶対偏差に1.4826を乗じた数で除算するものであった。これは、各々のポイントにおける信号対雑音比の近似値をもたらす。ノイズはおおよそ正規分布に従いそして実信号は平均スペクトル中に集中した測定値の半分未満に存在するという着想により、信号がFTMS Control 2による破壊的ウェーブレットによって圧縮されたようであるのでゼロ値のサプレッションは達成された。他のノイズの近似方法(例えば、局所的に発生した同じ測定値、又は1つのピークからガウス分布までの距離がノイズを表す)を試験したが、低い閾値に対して良好な結果をもたらさなかった。可能な限り検出漏れを少なくし、可能な限りのノイズを除去するために、この研究のために維持した閾値は1である。
潜在的バイオマーカに対応した検出ピークごとに、及び撮像された領域ごとに、ピークのウインドウ中の最大強度の画像を、8ビットの深度を有したグレースケールのパレットで描画し、次いで圧縮せずにJPEG形式でエクスポートした。結果の目視検査を容易にするために、単一のチャンネルしか使用しないことにした。12の領域(状態1で6つ及び状態2で6つ)の約2,000の被撮像イオンを得た。
画像ごとに:
画像からノイズを取り除くために、オープニングを、サイズ2×2の構造要素を使用してグレースケールの画像に実行し、クロージングを、同じ構造要素を使用して実行した:
式中、Oは、グレースケールの原画像であり、我々の場合には、B1=B2=B構造要素であり、値のブーリアンは、右下隅に中心を置いて変化し、欠測値を、最も近い行又は列を複製することによって得た。
次いで、画像を、Otsu法(我々の場合には単一の閾値による)を適用することによって、2値化する:Nピクセル、L階調、及びni階調値iをとるピクセルの数を含む画像のための
の最大化;
この前か後に、ピクセル画像の表面積を算出する;
次いで、2値化された画像のオブジェクトの数を、4連結でRosenfeldとPfaltz(1996)に説明されるようにラベルをつけられた画像を生成するために利用されたラベルの集合の基数を使用して、カウントする;
最後に、単位面積当たりのオブジェクトの平均表面積を確定する。
2つのウェルチのt検定を、一方は単位面積当たりのオブジェクトの数に基づいて、もう一方は単位面積当たりのオブジェクトの平均表面積に基づいて、両方の状態で実行した。ウェルチのt検定は小さなサイズの対になっていないサンプルにうまく適用され、かつ両方の母集団の分散が等しいことが確実ではないので、ウェルチのt検定を選択した。これ以外では、Mann-Whitney-Wilcoxon 検定を使用することが可能であろう。
数学モデルを、処置済の状態で同定された潜在的なバイオマーカを基礎として作成した。このモデルを、抽出された形態計測特性に基づいて試験サンプルを分類するために、探査目的のために使用した。
−データを標準化する;
−ピークに分子を関連づけるためにピークの同定を実行する;
−生物学的解釈を実行する;
−例えばクラウドプラットフォームを使用して、分類/機械学習を実行する。
非常に多くの用途が実現可能であり、特に実施例1又は実施例2に説明された工程を使用することによって実施することが可能である。例えば、上で述べられたように、本発明は、医療及び製薬分野では、新しいバイオマーカを同定するために、分子フィルタリング及び分類、細胞及び形態カウント、疾患又は処置の経時的な評価の研究、細胞又は組織タイピングなどのために使用することができる。また、本発明によれば、サンプル中のイオン分布の表面積及び/又は体積から、前記サンプル中の前記イオンの相対的又は絶対的な定量化までが可能である。当然、本発明は、品質制御、芸術、比較及び自動オブジェクト分析、材料の組成の研究などの、他の分野においても用途が見いだされる。
Claims (19)
- 質量分析イメージング(MSI)によって対象のサンプル中の対象の分子を同定するプロセスであって、
i)対象のサンプル中の複数のイオンの空間配列を、前記サンプル中の前記イオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャ特性を決定するために前記サンプル中の前記イオンのMSIデータから分析する工程と;
ii)前記対象のサンプル中の複数のイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャ特性を、参照サンプル中の複数のイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータと比較する工程と;
iii)サンプルの少なくとも1つの特徴的イオンを同定する工程と;
iv)工程iii)において同定された前記イオンに対応する分子を同定する工程と、
を含むプロセス。 - 形態計測特性が、パターン(単数又は複数)及び前記パターンと関連した寸法を定める、請求項1に記載のサンプル中の分子を同定するプロセス。
- テクスチャ特性が、前記サンプル中のパターンの配列を定める、請求項1又は2に記載の分子を同定するプロセス。
- サンプルの画像上で直接少なくとも1つのイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャ特性が視認される追加的な工程を含む、請求項1〜3のうちのいずれか1項に記載のサンプル中の分子を同定するプロセス。
- 前記少なくとも1つのイオンの空間配列を分析する工程が、形状の認識及び/又はテクスチャの分析プロセスを適用することによって達成される、請求項1〜4のうちのいずれか1項に記載のサンプル中の分子を同定するプロセス。
- データが、サンプル中の複数のイオンに対する、MSIによって取得される予備工程を含む、請求項1〜5のうちのいずれか1項に記載のサンプル中の分子を同定するプロセス。
- データベース(DB)又はモデルに、前記対象のサンプル中の複数のイオンの形態計測及び/又はテクスチャ特性を含ませる工程を含む、請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載のサンプル中の分子を同定するプロセス。
- データベース(DB)又はモデルが、前記対象のサンプル中の少なくとも1つのイオンのスペクトルMSIデータ並びに/又は前記対象のサンプルに特異的な物理化学的、生理的、及び/若しくは生物学的データによって実施される追加的な工程を含む、請求項7に記載のサンプル中の分子を同定するプロセス。
- サンプル中のイオンの空間配列によって前記サンプルを特徴づけるように前記イオンの形態計測特性及び/又はテクスチャ特性を決定するための前記サンプル中の少なくとも1つの前記イオンの質量分析イメージング(MSI)データの使用。
- 形態計測及び/又はテクスチャ特性に関して、サンプル中の少なくとも1つのイオンの空間配列を前記イオンと関連したイメージングデータから特徴づける、質量分析イメージング(MSI)によってサンプルを特徴づける方法。
- a)データが、サンプル中の少なくとも1つのイオンのために、MSIにより取得される工程と;
b)サンプル中の前記少なくとも1つのイオンの空間配列が、形態計測及び/又はテクスチャ特性により前記サンプル中の前記少なくとも1つのイオンの位置と関連するデータから特徴づけられる工程と、
を含む、請求項10に記載のMSIによってサンプルを特徴づける方法。 - c)サンプルのイメージングデータが、サンプルの分子強度プロファイルを表す対象の領域にセグメント化される工程と;
d)対象の領域の分子プロファイルのイオンの空間配列が、前記分子プロファイルの形態計測及び/又はテクスチャ特性によって特徴づけられる工程と、
を含む、請求項10又は11に記載のMSIによってサンプルを特徴づける方法。 - e)前記サンプル中の複数のイオンの形態計測及び/又はテクスチャデータを含むデータベース(DB)又はモデルが作成される工程を含む、請求項10〜12のうちのいずれか1項に記載のMSIによってサンプルを特徴づける方法。
- f)データベース(DB)又はモデルが、前記サンプル中の少なくとも1つのイオンのスペクトルMSIデータ並びに/又は前記サンプルに特異的な物理化学的、生理的、及び/若しくは生物学的データによって実施される追加的な工程を含む、請求項13に記載のMSIによってサンプルを特徴づける方法。
- 組織、組織の領域、細胞タイプ、組織の(健康若しくは病気の)生理的状態などの同定、又は生物学的サンプル中の細胞カウントのための、請求項13又は14に記載の特徴づけ方法によって得られたデータベース又はモデルの使用。
- 質量分析イメージングによってサンプルを同定するプロセスであって、
i)同定されるサンプル中の少なくとも1つのイオンの空間配列が、同定される前記サンプル中の前記イオンの形態特性及び/又はテクスチャ特性を同定するために、前記サンプル中の前記イオンのMSIデータから特徴づけられ;
ii)工程i)において得られた形態計測及び/又はテクスチャ特性が、記録され;
iii)同定されるサンプルの前記少なくとも1つのイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャ特性が、参照イオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータと比較される、
プロセス。 - データベース又はモデルが、いくつかの参照サンプルから得られた、少なくとも1つの参照イオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャデータによって確立され、前記形態計測及び/又はテクスチャデータが、前記参照サンプル中の前記少なくとも1つの参照イオンの空間配列を表し、工程iii)が、同定されるサンプルの前記少なくとも1つのイオンと関連した形態計測及び/又はテクスチャ特性をデータベース又はモデルのデータと比較することによって適用される、追加的な工程を含む、請求項16に記載のMSIによってサンプルを同定するプロセス。
- コンピュータによって実行可能な命令であり、コンピュータシステムが、請求項1〜8のうちのいずれか1項に記載のサンプル中の対象の分子を同定するプロセスの少なくとも1つの工程を、及び/又は請求項10〜14のうちのいずれか1項に記載のサンプルを特徴づける方法の少なくとも1つの工程を、及び/又は請求項16又は17に記載のサンプルを同定するプロセスの少なくとも1つの工程を実行することを可能にするために適合された命令を含む、コンピュータ可読データ媒体。
- 少なくとも1つのサンプル中の少なくとも1つのイオンの形態及び/又はテクスチャデータを含んだデータベースを含むことを特徴とする、請求項18に記載のコンピュータ可読データ媒体。
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