KR101408217B1 - 질량분석패턴을 이용한 원발성간내담도암 및 전이성간암의 감별법 - Google Patents

질량분석패턴을 이용한 원발성간내담도암 및 전이성간암의 감별법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MALDI 질량분석(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)을 이용하여 원발성간내담도암(intrahepatic cholangiocarinoma)과 전이성 간암(metastatic adenocarcinoma)을 감별하는 방법 및 이에 사용되는 표지에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 MALDI 질량분석의 피크 강도 값을 측정하여 결정한 원발성간내담도암 및 전이성간암 감별진단용 표지(m/z)를 사용하여 암 조직에 대하여 실험을 수행한 결과 상당히 높은 정확도로 원발암과 간전이암을 감별할 수 있었다. 따라서 본 발명의 감별용 표지를 이용한 감별 방법은 간 종괴에 대해 원발성간내담도암과 전이성간암을 감별하는 효과적인 방법으로 사용될 수 있다.

Description

질량분석패턴을 이용한 원발성간내담도암 및 전이성간암의 감별법{Differential diagnosis of intrahepatic cholangiocarcinoma using lipid and protein profiles}
본 발명은 MALDI 질량분석(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)을 이용하여 원발성간내담도암(intrahepatic cholangiocarinoma)과 전이성 간암(metastatic adenocarcinoma)을 감별하는 방법 및 이에 사용되는 표지에 관한 것이다.
MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)는 질량분석(mass spectrometry)에 사용되는 이온화 기술로서 ESI (electrospray ionization) 기술과 마찬가지로 기체 상(gas phase)에서 큰 이온을 생성시키며, DNA, 단백질, 펩티드, 당 등과 같은 생체분자 및 유기 분자들의 분석에 사용될 수 있다. MALDI 질량분석은 크게 UV 레이저 빔에 의해 유발되는 탈착(desorption) 단계와 분석 물질이 이온화되는 단계에 의해 이루어진다.
한편, 조직-직접적 말디 질량분석 이미징(histology-directed matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) mass spectrometry imaging) 기술은 말디 이온화법을 이용한 질량분석 방법으로 Richard M. Caprioli에 의해서 개발되었다(Lancet 2003; 362(9382):433). 이는 분석하고자 하는 조직 표면에 매트릭스(matrix)를 도포하여 말디 이온화법을 적용하여, 조직으로부터 직접 질량 분석 데이터를 얻는 방법이다. 조직-직접적 말디 질량분석법은 조직에서 이온화된 단백질, 펩타이드, 지질, 또는 소형 분자(small molecules)의 분포에 대한 질량분석 정보를 표지 물질을 사용하지 않고(label-free) 조직으로부터 직접 획득하는 방법이다. 본 발명자는 이 방법을 이용하여 위암 등을 정상 조직과 구분할 수 있는 단백질 프로파일을 얻어 보고한 바 있다(J Proteome Res 2010; 9: 4123-4130).
또한, 본 발명자들은 대한민국 공개특허공보 제2012-0126194호를 통해 말디 질량분석 패턴으로 원발부위 불명 선암의 조직기원을 예측하는 방법을 개시한 바 있다. 그러나 상기 문헌에 기재된 발명은 단백질에 대한 분석패턴을 이용하여 간세포암과 간세포암 이외의 선암을 감별하거나, 유방암과 그 외의 선암을 감별하는 등의 방법에 관한 것이었다.
간내담도암은 선암(adenocarcinoma)으로서, 조직학적으로 전이성 선암과의 감별이 어려우며, 현재 간내담도암에 대한 조직특이적 면역염색화학 마커가 부재한 상황이다. 예를 들어 cytokeratin (CK) 의 경우 CK 7-positive/CK 20-negative 는 간내담도암에서 9/12 (75.0%), 대장암에서는 0% 이고, CK 7-negative/CK 20-positive 는 간내담도암에서 1/12 (8.3%), 대장암에서 2/25 (80.0%) 로서 어느 정도 양자를 구분하므로 CK 의 감별력은 완전치 못하다(Dig Liver Dis 2008;40(9):749-54). CDX2 의 경우 대장암에서 99% 양성이나 간내담도암에서 21% 까지 발현이 보고되었다(Am J Surg Pathol 2005;29(3):359-67). 따라서 간내담도암에 대한 감별진단의 정확도를 높일 수 있는 진단법의 개발이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 MALDI 질량분석을 이용한 간단한 방법으로 원발성간내담도암 및 전이성간암을 감별하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 다른 목적은 상기 감별에 사용될 수 있는 표지를 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MALDI 질량분석(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)을 이용하여 원발성간내담도암 및 전이성간암을 감별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 감별 방법은 m/z 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p524.5, p693.6, p706.6, p732.7, p734.7, p741.6, p750.6, p754.6, p756.7, p780.7, p798.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n794.6, n796.6, n812.6, n890.8, n894.8, n906.8, n908.8 및 n924.8 (여기에서, p는 양이온 모드; n은 음이온 모드) 로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 m/z 값에 대한 질량분석을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 상기 m/z 값 중 p524.5, p693.6, p706.6, p732.7, p734.7, p741.6, p750.6, p754.6, p756.7, p780.7, p798.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n794.6, n796.6, n812.6, n890.8, n894.8, n906.8, n908.8 및 n924.8은 그 분석 시료가 지질(lipid)에 해당한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감별 방법은, a) 원발성간내담도암 및 전이성간암 환자의 생물학적 시료를 각각 대상으로 하여 상기 m/z 값에 대한 피크 강도를 측정하는 단계; b) 감별 대상 시료로부터 상기 m/z 값에 대한 피크 강도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 측정한 대상 시료의 피크 강도를 상기 a)단계에서 측정한 피크 강도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c)단계는, 1) 상기 각각의 m/z 값에 대하여 측정된 전이성간암 시료의 피크에 대한 원발성간내담도암 시료의 피크의 비율을 계산하는 단계; 2) 상기 비율이 1을 초과하는 경우의 m/z 값을 원발성간내담도암에 대한 표지로 가중치를 주고, 상기 비율이 1 미만인 m/z 값을 전이성간암에 대한 표지로 가중치를 주어 측정한 대상 시료의 피크를 분석함으로써 원발성간내담도암 및 전이성간암 중 어느 쪽의 가능성이 높은지 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비율이 1을 초과하는 경우의 m/z 는 m/z 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, p524.5, p706.6, p732.7, p734.7, p754.6, p756.7, p780.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n812.6, n890.8 및 n894.8로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비율이 1 미만인 m/z 는 m/z 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p693.6, p741.6, p750.6, p798.7, n794.6, n796.6, n906.8, n908.8 및 n924.8로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c)단계는 1-nearest neighbor, 3-nearest neighbor, 및 nearest centroid 알고리즘을 이용하여 상기 피크를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 감별 방법에 사용될 수 있는 원발성간내담도암 및 전이성간암 감별용 표지를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지는 MALDI 질량분석에 있어서, m/z 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p524.5, p693.6, p706.6, p732.7, p734.7, p741.6, p750.6, p754.6, p756.7, p780.7, p798.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n794.6, n796.6, n812.6, n890.8, n894.8, n906.8, n908.8 및 n924.8 (여기에서, p는 양이온 모드; n은 음이온 모드) 로 이루어진 그룹에서 선택되는 m/z 값의 피크일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피크들 중 전이성간암 시료의 피크에 대한 원발성간내담도암 시료의 피크의 비율이 1을 초과하는 경우의 피크 또는 해당 m/z 값은 원발성간내담도암에 대한 표지로 가중치를 줄 수 있고, 상기 비율이 1 미만인 피크 또는 해당 m/z 값은 전이성간암에 대한 표지로 가중치를 줄 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비율이 1을 초과하는 표지는 상기 m/z 값들 중 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, p524.5, p706.6, p732.7, p734.7, p754.6, p756.7, p780.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n812.6, n890.8, 및 n894.8 로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비율이 1 미만인 표지는 상기 m/z 값들 중 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p693.6, p741.6, p750.6, p798.7, n794.6, n796.6, n906.8, n908.8 및 n924.8 로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 MALDI 질량분석의 피크 강도 값을 측정하여 결정한 원발성간내담도암 및 전이성간암 감별진단용 표지(m/z)를 사용하여 암 조직에 대하여 실험을 수행한 결과 상당히 높은 정확도로 원발암과 간전이암을 감별할 수 있었다. 따라서 본 발명의 감별용 표지를 이용한 감별 방법은 간 종괴에 대해 원발성간내담도암과 전이성간암을 감별하는 효과적인 방법으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 원발성간내담도암 및 전이성간암 감별진단용 표지(m/z) 전체에 대한 질량패턴을 이용하여 34개의 검체에 대해 주요 성분 분석(principal component analysis)을 수행한 결과이다. 서로의 거리가 가깝게 보일수록 전체 질량패턴이 유사한 검체이다. 간내담도암(cholangiocarcinoma; n=9), 전이암 (metastasis; n=25).
본 발명은 MALDI 질량분석을 이용하여 원발성간내담도암과 전이성 간암을 감별하는 방법에 관한 것으로서 다음 단계에 따라 수행될 수 있다.
1) 악성종양이 의심되는 원발암(간내담도암)과 간전이암에서 각각 조직을 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리한 원발암(간내담도암)과 간전이암 조직에서 MALDI 질량분석을 수행하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 피크 강도 값을 분석하여 원발암(간내담도암)과 간전이암을 감별할 수 있는 표지(m/z 값)를 설정하는 단계;
4) 감별 대상 검체의 시료에 대하여 위와 동일한 방법으로 MALDI 질량분석을 수행하는 단계; 및
5) 상기 3)단계의 표지에 대한 상기 4)단계의 질량분석 결과를 분석하여 원발암(간내담도암) 또는 간전이암을 감별하는 단계.
상기 1)단계에서 상기 조직은 생검 조직의 동결절편을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 2)단계의 MALDI 질량분석은 공지의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예컨대, MALDI 질량분석을 위해서는 먼저, 빛의 투과성이 높고, 전도성 표면을 갖는 Indium-tin-oxide (ITO) 글라스 슬라이드(glass slide) 또는 금으로 코팅된 스테인레스 스틸 등의 플레이트 위에 분석하고자 하는 동결 절편(tissue section)을 올린 후 기질(Matrix)과 혼합한다. 그 후 말디-토프(MALDI-time of flight) 장비를 이용하여 원하는 m/z 범위에 대해 질량분석결과를 얻어 이를 데이터베이스화한다. MALDI 분석용 데이터 프로세싱 과정은 통상적인 MALDI 데이터 프로세싱 방법을 사용할 수 있다.
상기 3)단계와 관련하여 본 발명의 질량분석 정보는 하기 표 1에 기재되어 있다. 본 발명자들은 국립암센터에서 수술적으로 절제된 전이성 간암과 원발성 간담도암의 동결 수술 조직에 대한 말디 질량분석을 이용하여 본 발명의 표지(m/z 값)을 도출하였다. 원발암(간내담도암)과 간전이암 간에 p<0.05 수준에서 유의한 차이를 보이는 질량 피크(peak)로 감별하며, 여기에 사용되는 질량패턴(46 peak)은 표 1과 같다.
m/z (protein) Assignment p Cholangiocarcinoma Metastasis Ratio
2749.5 0.0088 19.7 14.4 1.4
3325.1 0.0044 28.1 19.2 1.5
3367.5 0.0005 186.2 60.4 3.1
3393.2 0.0004 38.3 18.3 2.1
3438.8 0.0010 251.9 80.8 3.1
3481.7 0.0007 129.1 48.2 2.7
3663.2 0.0062 27.1 19.6 1.4
3705.6 0.0008 29.9 20.8 1.4
4132 0.0023 27.1 19.6 1.4
4935.8 0.0009 84.5 45.6 1.9
4961.9 0.0177 98.9 49.5 2.0
6118.4 0.0439 29.6 34.5 0.9
7006.6 0.0254 147.7 186.8 0.8
7881.7 0.0429 58.2 70.4 0.8
9420.2 0.0232 29.2 40.3 0.7
9517.9 0.0060 23.5 34.0 0.7
11824.5 0.0108 40.0 52.1 0.8
12282.3 0.0018 41.0 60.4 0.7
14010.1 0.0453 324.2 511.8 0.6
m/z ( lipid ) Assignment p Cholangiocarcinoma Metastasis Ratio
p524.5 LPS (18:1) [M+H]+ 0.0035 1.2 1.0 1.2
p693.6 0.0084 6.4 9.0 0.7
p706.6 PC {30:0} [M+H]+ 0.0008 2.1 1.4 1.5
p732.7 PC {32:1} [M+H]+ 0.0029 3.4 2.4 1.4
p734.7 PC {32:0} [M+H]+ 0.0100 7.6 5.7 1.4
p741.6 SM {34:1} [M+K]+ 0.0029 5.1 7.3 0.7
p750.6 PC {34:6} [M+H]+ 0.0032 8.4 12.7 0.7
p754.6 0.0081 2.1 1.6 1.3
p756.7 PC {32:0} [M+Na]+ 0.0017 4.0 2.5 1.6
p780.7 0.0110 3.9 3.3 1.2
p798.7 PC {34:1} [M+K]+ 0.0015 10.5 15.6 0.7
p806.7 0.0044 2.8 2.2 1.3
p808.7 　 0.0069 3.5 2.6 1.4
p810.7 　 0.0120 3.7 2.6 1.4
n506.2 　 0.0041 2.8 1.5 1.9
n606.2 　 0.0074 3.2 1.8 1.8
n616.6 　 0.0001 3.5 1.7 2.1
n642.6 　 0.0024 4.8 2.3 2.0
n687.7 　 0.0000 4.4 1.7 2.6
n794.6 　 0.0036 2.7 6.1 0.4
n796.6 　 0.0116 2.1 3.6 0.6
n812.6 　 0.0018 2.1 1.3 1.6
n890.8 　 0.0017 3.7 1.9 2.0
n894.8 　 0.0471 2.1 1.6 1.4
n906.8 ST-OH {42:1} [M-H]- 0.0046 4.9 11.6 0.4
n908.8 　 0.0006 3.0 6.8 0.4
n924.8 　 0.0402 2.3 4.6 0.5
m/z, mass over charge; Ratio, average peak ratio of cholangiocarcinoma to metastasis; p, positive ion mode; n, negative ion mode; LPS, lysophosphatidylserine; SM, sphingomyelin; PC, phosphatidylcholine; ST, sulfatide.
상기 46개의 질량 피크들의 패턴을 분석하여 상기 5)단계의 감별이 가능하게 된다. 따라서 상기 46개의 m/z 값은 원발성간내담도암 및 전이성간암을 감별하는 표지가 될 수 있다. 상기 m/z값 중 2749.5부터 14010.1까지는 단백질 시료에 대한 값이고, p524.5부터 n924.8까지는 지질 시료에 대한 값이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 m/z 값들 중 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, p524.5, p706.6, p732.7, p734.7, p754.6, p756.7, p780.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n812.6, n890.8, 및 n894.8 은 전이성간암의 평균 피크에 대한 원발성간내담도암의 평균 피크의 비율이 1보다 높은 경우의 m/z값이다. 따라서 검체 시료에서 이들 값에 대한 피크가 높을 경우 원발성간내담도암으로 감별될 확률이 높아진다.
반면에, 상기 m/z 값들 중 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p693.6, p741.6, p750.6, p798.7, n794.6, n796.6, n906.8, n908.8 및 n924.8 은 전이성간암의 평균 피크에 대한 원발성간내담도암의 평균 피크의 비율이 1 미만인 경우의 m/z값이다. 따라서 검체 시료에서 이들 값에 대한 피크가 높을 경우 전이성간암으로 감별될 확률이 높아진다고 볼 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
본 발명의 감별용 표지 설정
<1-1> MALDI 분석 준비
악성종양이 의심되는 간 종괴에서 조직을 분리한 후 10 μm 두께로 동결절편을 만들었다. 그 중 하나의 동결절편에 대해 hematoxylin/eosin (H&E) 염색을 수행하여 상피세포 부위를 표시해 두었고, 나머지 동결절편들은 indium tin oxide (ITO) 슬라이드에 녹이면서 붙이고(thaw-mount), 이후 진공건조기에서 건조하였다.
<1-2> 지질 질량패턴 동정
암세포 부위에 해당하는 곳에 Chip-1000 instrument (Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하여 7 mg 씩의 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)/-cyano-4- hydroxycinnamic acid (CHCA) (in 1 ml of 70% methanol, 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)/1% piperidine) 의 matrix를 100 pL 도포, 건조된 ITO 슬라이드를 UltrafleXtreme MALDI time-of-light mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 사용하여 스캔(positive- 와 negative-ion mode 각각 수행)하였다. 이때 m/z range 는 500 - 1,100으로 하고, FlexImaging software (version 2.1, Bruker Daltonics)를 사용하여 다시 한번 상피세포 유래 질량분석 데이터를 추출하되 이때 H&E slide를 참조하였다.
암세포에 해당하는 위치(spot)로부터 분석된 질량패턴만 ClinProTools (version 2.2, Bruker Daltonics)에서 분석처리; ClinProTools를 사용할 경우의 parameter; Resolution, 800; Top Hat baseline with 10% minimal baseline width as baseline subtraction; Recalibratation with a maximal peak shift of 2,000 ppm between reference and peak masses; % Match to Calibrant Peaks, 10%; Signal-to-noise ratio cutoff, 5; peak area for the peak calculation with zero level integration 로 측정하였다.
<1-3> 단백질 질량패턴 동정
ITO 슬라이드에 올려진 다른 동결절편을 graded ethanol(70%, 90%, 95% 각 30 초)로 세척한 후 20 mg/ml 의 sinapinic acid matrix (in 50:50 acetonitrile: 0.1% TFA)를 100 pL 도포, 건조된 ITO 슬라이드를 UltrafleXtreme MALDI time-of-light mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 사용하여 스캔하고 이때 m/z range 는 2,000-20,000 으로 하고, 3,000 consecutive laser shots (frequency, 1,000 Hz)을 주고 스캔을 수행하였다.
FlexImaging software (version 2.1, Bruker Daltonics)를 사용하여 다시 한번 상피세포 유래 질량분석 데이터를 추출하되 이때 H&E slide를 참조하고. 암세포에 해당하는 위치(spot)에서의 질량패턴만 ClinProTools (version 2.2, Bruker Daltonics)에서 분석처리하였다. ClinProTools를 사용할 경우의 parameter; Resolution, 300; Top Hat baseline with 10% minimal baseline width as baseline subtraction; Recalibratation with a maximal peak shift of 2,000 ppm between reference and peak masses; % Match to Calibrant Peaks, 20%; Signal-to-noise ratio cutoff, 5; peak area for the peak calculation with zero level integration.
< 실시예 2>
본 발명의 감별 방법 검증
국립암센터에서 절제술을 시행 받은 환자 34명으로부터 조직을 채취, 동결하였다. 34명 중 원발성 간내담도암은 9 명, 전이암이 25명 (대장직장암 23 명, 난소암 2명)이었다. 전이암의 원발부위는 난소암이 2명, 대장직장암이 23 명이었다.
동결조직으로부터 10 μm 두께로 동결절편을 얻어 크리오섹션(cryosection)하였다. 말디(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 질량분석(mass spectrometry, MS)을 시행하기 위한 준비 단계로, 동결절편 중 하나는 H&E(hematoxylin/eosin) 염색을 수행하여, 상피 세포에 해당하는 부위(spot)만 선택하도록 표시하였다.
나머지 동결절편은 크리오섹션 ITO(indium tin oxide) 슬라이드로 준비하기 위하여, 상피세포 부위에 해당하는 곳에 Chip-1000 instrument (Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하여 7 mg 씩의 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)/α-cyano-4- hydroxycinnamic acid (CHCA) (in 1 ml of 70% methanol, 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)/1% piperidine) 의 matrix를 100 pL 도포, 건조된 ITO slide를 UltrafleXtreme MALDI time-of-light mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 사용하여 scan (positive- 와 negative-ion mode 각각 수행)하였다. 이때 m/z range 는 500 - 1,100으로 하고, FlexImaging software (version 2.1, Bruker Daltonics)를 사용하여 다시 한번 상피세포 유래 질량분석 데이터를 추출하되 이때 H&E slide를 참조하였다. 암세포에 해당하는 spot 에서의 질량패턴만 ClinProTools (version 2.2, Bruker Daltonics)에서 분석처리; ClinProTools를 사용할 경우의 parameter; Resolution, 800; Top Hat baseline with 10% minimal baseline width as baseline subtraction; Recalibratation with a maximal peak shift of 2,000 ppm between reference and peak masses; % Match to Calibrant Peaks, 10%; Signal-to-noise ratio cutoff, 5; peak area for the peak calculation with zero level integration 로 측정하였다.
한편, ITO 슬라이드에 올려진 다른 동결절편을 graded ethanol (70%, 90%, 95% 각 30 초) wash 후 20 mg/ml 의 sinapinic acid matrix (in 50:50 acetonitrile: 0.1% TFA)를 100 pL 도포, 건조된 ITO slide를 UltrafleXtreme MALDI time-of-light mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 사용하여 scan 하고 이때 m/z range 는 2,000-20,000 으로 하고, 3,000 consecutive laser shots (frequency, 1,000 Hz)을 주고 scan 수행, FlexImaging software (version 2.1, Bruker Daltonics)를 사용하여 다시 한번 상피세포 유래 질량분석 데이터를 추출하되 이때 H&E slide를 참조하고. 암세포에 해당하는 spot 에서의 질량패턴만 ClinProTools (version 2.2, Bruker Daltonics)에서 분석처리; ClinProTools를 사용할 경우의 parameter; Resolution, 300; Top Hat baseline with 10% minimal baseline width as baseline subtraction; Recalibratation with a maximal peak shift of 2,000 ppm between reference and peak masses; % Match to Calibrant Peaks, 20%; Signal-to-noise ratio cutoff, 5; peak area for the peak calculation with zero level integration 로 측정하는 단계로 분석을 수행하였다.
이렇게 얻은 질량 패턴을 average normalization 수행한 후 하나의 데이터로 통합하였다. 그 결과는 도 1의 주요 성분 분석(principal component analysis) 결과와 같이 9명의 간내담도암 환자의 간조직검체의 질량 패턴이 25 명의 전이암 환자에서 수술로 얻은 간조직검체의 질량패턴과 뚜렷이 구분되는 양상이었다. 이에 간내담도암과 전이암 간의 차이가 있는 질량패턴을 동정하였고, 전체 검체를 1:1 로 나누어 절반의 검체를 training set으로 하여 거기에서 얻어진 질량패턴을 이용하여 나머지 절반에 적용하여 class label을 예측하는 class prediction analysis (1-nearest neighbor, 3-nearest neighbor, nearest centroid) 를 수행하였다. nQuery를 사용하여 생성한 100개의 random dataset에서 이를 반복하였다. 그 결과 100번의 random dataset 에서의 median accuracy 는 1-nearest neighbor, 3-nearest neighbor 및 nearest centroid 알고리즘 모두에서 94% (16/17) 이었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p524.5, p693.6, p706.6, p732.7, p734.7, p741.6, p750.6, p754.6, p756.7, p780.7, p798.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n794.6, n796.6, n812.6, n890.8, n894.8, n906.8, n908.8 및 n924.8 (여기에서, p는 양이온 모드; n은 음이온 모드) 로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 m/z 값에 대한 질량분석을 수행하는 단계를 포함하는 MALDI 질량분석(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)을 이용한 원발성간내담도암과 전이성간암의 감별 방법으로서,
    a) 원발성간내담도암 및 전이성간암 환자의 생물학적 시료를 각각 대상으로 하여 상기 m/z 값에 대한 피크 강도를 측정하는 단계;
    b) 감별 대상 시료로부터 상기 m/z 값에 대한 피크 강도를 측정하는 단계; 및
    c) 상기 b)단계에서 측정한 대상 시료의 피크 강도를 상기 a)단계에서 측정한 피크 강도와 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 c)단계는,
    1) 상기 각각의 m/z 값에 대하여 측정된 전이성간암 시료의 피크에 대한 원발성간내담도암 시료의 피크의 비율을 계산하는 단계;
    2) 상기 비율이 1을 초과하는 경우의 m/z 값을 원발성간내담도암에 대한 표지로 가중치를 주고, 상기 비율이 1 미만인 m/z 값을 전이성간암에 대한 표지로 가중치를 주어 측정한 대상 시료의 피크를 분석함으로써 원발성간내담도암 및 전이성간암 중 어느 쪽의 가능성이 높은지 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 m/z 값 중 p524.5, p693.6, p706.6, p732.7, p734.7, p741.6, p750.6, p754.6, p756.7, p780.7, p798.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n794.6, n796.6, n812.6, n890.8, n894.8, n906.8, n908.8 및 n924.8은 그 분석 시료가 지질인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 비율이 1을 초과하는 경우의 m/z 는 m/z 2749.5, 3325.1, 3367.5, 3393.2, 3438.8, 3481.7, 3663.2, 3705.6, 4132, 4935.8, 4961.9, p524.5, p706.6, p732.7, p734.7, p754.6, p756.7, p780.7, p806.7, p808.7, p810.7, n506.2, n606.2, n616.6, n642.6, n687.7, n812.6, n890.8 및 n894.8로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비율이 1 미만인 m/z 는 m/z 6118.4, 7006.6, 7881.7, 9420.2, 9517.9, 11824.5, 12282.3, 14010.1, p693.6, p741.6, p750.6, p798.7, n794.6, n796.6, n906.8, n908.8 및 n924.8로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 c)단계는 1-니어리스트네이버 (1-nearest neighbor), 3-니어리스트네이버(3-nearest neighbor), 및 니어리스트 센트로이드 (nearest centroid) 알고리즘을 이용하여 상기 피크를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102200233B1 (ko) * 2019-08-21 2021-01-08 충남대학교산학협력단 엑소좀 검출 및 간질환 진단을 위한 분석 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011099858A (ja) * 2009-11-06 2011-05-19 Chiba Univ 胆道がんの新規バイオマーカー
WO2012153964A2 (ko) * 2011-05-09 2012-11-15 국립암센터 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법
KR20120126194A (ko) * 2011-05-11 2012-11-21 국립암센터 말디 질량분석 패턴으로 원발부위 불명 선암의 조직기원을 예측하는 방법
US20130109592A1 (en) * 2010-06-23 2013-05-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods for detecting cancer

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011099858A (ja) * 2009-11-06 2011-05-19 Chiba Univ 胆道がんの新規バイオマーカー
US20130109592A1 (en) * 2010-06-23 2013-05-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods for detecting cancer
WO2012153964A2 (ko) * 2011-05-09 2012-11-15 국립암센터 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법
KR20120126194A (ko) * 2011-05-11 2012-11-21 국립암센터 말디 질량분석 패턴으로 원발부위 불명 선암의 조직기원을 예측하는 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102200233B1 (ko) * 2019-08-21 2021-01-08 충남대학교산학협력단 엑소좀 검출 및 간질환 진단을 위한 분석 방법

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