WO2012153964A2 - 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents

지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for providing information for histological classification of lung cancer by analyzing a sample. More specifically, the present invention provides information for histological classification of non-small cell lung cancer by obtaining a lipid profile of a sample through mass spectrometry. It's about how to do it.
  • Lung cancer can be largely divided into non small cell carcinoma and small cell carcinoma.
  • Non-small cell lung cancer can be divided into squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.
  • treatment for squamous cell carcinoma and adenocarcinoma has similar basic principles and indications.
  • chemotherapy for chemotherapy for adenocarcinoma and squamous cell carcinoma is different.
  • drugs such as EGFR inhibitors or bevacizumab may or may not be available depending on histological type. In other words, accurate histologic differentiation is very important because the applicable anticancer agent is determined according to the histological type.
  • Histological differentiation between adenocarcinoma and squamous cell carcinomas is very difficult in biopsy using only a small amount of tissue. About 25% of such biopsies for differentiation have been reported to be impossible with current pathological methods.
  • immunostaining chemistry is generally performed to distinguish histologically from adenocarcinoma or squamous cell carcinoma.
  • the antibodies used at this time are p63, TTF1, cytokeratins 5/6/7, Napsin A and the like. In this method, sensitivity and specificity are not sufficient, and thus the accuracy is not reported to be relatively high (Am J Surg Pathol 34; 12 (2010): 1805-1811, J Thorac Oncol 5 (2010): 442-447).
  • Mass-assisted laser desorption and ionization (MALDI) mass spectormetry (MS) is a very sensitive test that has recently been used directly in human tissues, but it is very recent that frozen sinus tissues have been made using sinapinic acid as a matrix. It has been reported that analysis of frozen tissue can provide useful information for the diagnosis and pathological classification of cancer (Lancet 2003; 362 (9382): 433-449, Cancer Res 2005; 65 (17): 7674-7681, Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1975-1983).
  • Method for providing information for the histological classification of non-small cell lung cancer using a lipid profile to achieve the technical problem (a) preparing a sample by mixing the matrix (matrix) and human tissue; (b) performing mass spectrometry on the prepared sample; (c) selecting first lipid profile data which is information on a lipid profile from the data obtained by the mass spectrometry; And (d) comparing the first lipid profile data with second lipid profile data, which is information on at least one lipid profile selected from adenocarcinoma tissue and squamous cell carcinoma tissue. It includes; providing information that corresponds to any one of (adenocarcinoma) and squamous cell carcinoma (squamous cell carcinoma).
  • the substrate may comprise components used for mass spectrometry on lipid molecules.
  • the substrate may include at least one of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA).
  • DLB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • CHCA a-cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • the mass spectrometry may be matrix-assisted laser desorption and ionization (MALDI) mass spectrometry.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption and ionization
  • the mass spectrometry is MALDI-TOF MS, MALDI-FTICR-MSn, MALDI-Q-TOF, MALDI-QIT-TOF, MALDI-QIT-FTICR-MS, Field Desoption (FD), 252Cf-Plasma desoprtion (PD) , desoprtion chemical ionization (DCI), secondary ion mass spectrometry (SIMS), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), and tandem mass spectrometry.
  • FD 252Cf-Plasma desoprtion
  • DCI desoprtion chemical ionization
  • SIMS secondary ion mass spectrometry
  • FAB fast atom bombardment
  • ESI electrospray ionization
  • step (b) may be a step of performing mass spectrometry on the sample in a positive mode and a negative mode, respectively.
  • the first and second lipid profile data are 713.5 (m / z) in positive mode, 898.77 (m / z) in negative mode, 652.49 (m / z) in positive mode, and 906.89 (m / z in negative mode). ), 524.28 (m / z) in positive mode, 610.39 (m / z) in positive mode, 593.4 (m / z) in positive mode, 708.67 (m / z) in positive mode, 756.68 (m / z in positive mode) ), Data on the amount or proportion of lipid molecules having at least one molecular weight selected from 530.04 (m / z) in negative mode and 544.06 (m / z) in negative mode.
  • first and second lipid profile data may include data on the amount or proportion of lipid molecules having a molecular weight of 906.89 (m / z) in negative mode and 756.68 (m / z) in positive mode. Can be.
  • the first and second lipid profile data can be obtained by comparing the amount or ratio of ST-OH ⁇ 42: 1 ⁇ [MH]-in negative mode and PC ⁇ 32: 0 ⁇ [M + Na] + in positive mode. It can include data about.
  • the histological type of non-small cell lung cancer can be easily classified more accurately and at low cost with only a small amount of tissue samples.
  • FIG. 1 is a graph showing the mean spectrum of a sample of 21 patients.
  • 1 (A) shows the experimental results in the positive mode
  • FIG. 1 (B) shows the experimental results in the negative mode.
  • FIG. 2 is a graph comparing lipid profiles of lung cancer tissues and normal tissues by PCA analysis.
  • 2 (A) is a PCA plot of 21 pairs of lung cancer tissues and normal tissues.
  • Figure 2 (B) is the intensity profile for lung cancer tissue and normal tissue.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of the experiment using the validation set to verify the discrimination of the method according to the present invention.
  • 3 (A) shows a PCA (principal component analysis) result of 51 surgical samples as a validation set.
  • 3 (B) and (C) show experimental results using five biopsy tissues as a validation set. In FIG. 3 (B), red indicates that the specific gravity is high, and green indicates that the specific gravity is low.
  • 3 (C) is a mass spectrometry image of the validation set.
  • Samples to be used as training sets were prepared as follows. Lung cancer tissues and normal tissues were collected from 21 non-small cell carcinoma patients. Tissue samples were obtained from multiple (average 3) spots from each patient. The collected tissue samples were wrapped in aluminum foil and slowly frozen in nitrogen for 30-60 seconds and stored at -80 ° C until MALDI analysis.
  • frozen tissues were cryosectioned (10 ⁇ m), placed on an indium tinc oxide electroconductive glass slide, and vacuum dried.
  • Matrix by dissolving 7 mg of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and 7 mg of a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) in 1 mL of a mixture of 70% methanol, 0.1% TFA and 1% piperidine matrix was prepared. These substrates are fat-soluble to perform mass spectrometry on the lipids of tissue samples. Substrates of other components that are well mixed with lipids or are suitable for mass spectrometry of lipid molecules can also be used. In this embodiment, both 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) were used, but only DHB may be used.
  • DHB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • CHCA a-cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • Table 1 is a table summarizing the characteristics of the tissue sample used in the embodiment of the present invention.
  • a surgical sample and a biopsy sample were used.
  • the surgical sample included 21 tissue samples from a training set and 51 tissue samples from a validation set.
  • 21 patients consisted of 10 squamous cell carcinoma patients and 11 adenocarcinoma patients.
  • 51 tissue samples consisted of 26 squamous cell carcinoma tissue samples and 25 adenocarcinoma tissue samples.
  • Five tissue samples as biopsy samples consisted of three squamous cell carcinoma tissue samples and two adenocarcinoma tissue samples.
  • MALDI-TOF MS was used for mass spectrometry.
  • other assays capable of mass spectrometry of biomolecules namely MALDI-FTICR-MSn, MALDI-Q-TOF, MALDI-QIT-TOF, MALDI-QIT-FTICR-MS, Field Desoption (FD), 252Cf-Plasma Desoprtion (PD), desoprtion chemical ionization (DCI), secondary ion mass spectrometry (SIMS), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), tandem mass spectrometry can also be used.
  • the prepared substrates were supplied to the cancer-rich area using micropipette twice at 250 nl. It is also possible to coat the matrix using depositers such as ImagePrep (Bruker) or Chip1000 (Shimazu).
  • MALDI analysis was performed using MALDI equipment such as Autoflex III, Ultraflex or UltrafleXtreme (Bruker) equipped with smart-beam laser (Nd: YAG, 355 nm).
  • MALDI equipment such as Autoflex III, Ultraflex or UltrafleXtreme (Bruker) equipped with smart-beam laser (Nd: YAG, 355 nm).
  • MALDI analysis was performed under optimized linear mode from 500 to 1,200 Da, with a laser frequency of 200 Hz (3,000 consecutive laser shots) and a delay time of 0 ns. The data were obtained in positive ion mode and negative ion mode, respectively.
  • Baseline subtraction, spectral recalibration, spectral area calculation, and data reduction were performed as preprocessing for the acquired data.
  • Clinprotool version 2.2, Bruker Daltonics
  • the resolution was set to 300.
  • the data reduction was set to 4, and the spectra recalibration was performed with the maximum peak shift of 2000 ppm.
  • the "% Match to Calibrant Peaks" value was set to 20%.
  • the signal-to-noise ratio was set to greater than three (signal-to-noise ratios> 3). Peak area was used for peak calculation with zero level integration. This process can be done with software other than ClinProTool.
  • FIG. 1 is a graph showing the mean spectrum of a sample of 21 patients.
  • 1 (A) shows the experimental results in the positive mode
  • FIG. 1 (B) shows the experimental results in the negative mode.
  • Average spectrum as shown in Figure 1 shows the lipid expression pattern of the sample (lipid).
  • Normalization was performed on the data obtained in the positive mode and the data obtained in the negative mode. This is to standardize experimental differences between tissue samples. In other words, the average peak is normalized so that the data of different patients can be compared with each other.
  • the normalized positive mode dataset and the negative mode dataset are combined into one dataset.
  • Non-lipid peak (m / z 616.2 ⁇ 2.5 in the positive ion mode, m / z 540.2 ⁇ 2.5 in the negative ion mode) data were excluded.
  • Statistical analysis was performed on the combined dataset using BRB-ArrayTools (Biometrics Branch, NCI). The important thing is that both positive and negative mode datasets are used to perform statistical analysis, so there are many ways to reflect the results of both datasets.
  • FIG. 2 is a graph comparing lipid profiles of lung cancer tissues and normal tissues by PCA analysis.
  • 2 (A) is a PCA plot of 21 pairs of lung cancer tissues and normal tissues.
  • Figure 2 (B) is the intensity profile for lung cancer tissue and normal tissue.
  • lipid profiles of lung cancer tissues and normal tissues were clearly distinguished from each other in unsupervised analysis.
  • the permutation P value was less than 0.001.
  • the average prediction accuracy for the test set was 85.7% (6/7) (at feature selection P ⁇ 0.01). Significant differences were found between the 10 squamous cell carcinoma spectra and the 11 adenocarcinoma spectra.
  • Table 2 (Discriminatory peak-m / z and assignments) describes data for 11 peaks for adenocarcinoma tissue and squamous cell carcinoma tissue at feature selection of P ⁇ 0.01. At this time, the mass peak can consider tolerance up to ⁇ 2000 ppm.
  • Nine peaks out of 11 (p713.5, n898.77, p652.49, n906.89, p524.28, p610.39, p593.4, p708.67, p756.68) were found in adenocarcinoma tissues.
  • the larger two peaks (n530.04, n544.06) were larger in squamous cell carcinoma tissue.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of the experiment using the validation set to verify the discrimination of the method according to the present invention.
  • 3 (A) shows a PCA (principal component analysis) result of 51 surgical samples as a validation set.
  • 51 tissue samples are surgical samples. As a result, 51 tissue samples could be significantly differentiated according to histological type. As a result of reviewing feature selection of P ⁇ 0.01 using a support vector machine, 41 (80.4%) histological types of 51 tissue samples were correctly classified. In adenocarcinoma, the histological type was correctly classified in 21 out of 25 cases, and in histological cell carcinoma, the histological type was correctly classified in 20 out of 26 cases. In feature selection of P ⁇ 0.02 and P ⁇ 0.05, the accuracy increased to 84.3%.
  • 3 (B) and (C) show experimental results using five biopsy tissues as a validation set.
  • red indicates that the specific gravity is high
  • green indicates that the specific gravity is low.
  • 3 (C) is a mass spectrometry image of the validation set.
  • a bronchoscopy specimen was used for the vaildation set because it is ultimately applied to the biopsy tissue, not the surgical tissue, for clinical application of the predictive model. Because adenocarcinoma is difficult to obtain by bronchoscopic biopsy due to peripheral distribution, two adenocarcinoma and three squamous cell carcinoma were composed as validation set. MALDI signals were also applied using ImagePrep (Bruker) instead of manual matrix deposition.
  • the process of providing predictive information as to whether the unknown tissue is adenocarcinoma tissue or squamous cell carcinoma tissue is as follows.
  • a sample is prepared by mixing human tissue and a predetermined substrate requiring histological differentiation (S01).
  • MALDI analysis is performed on the prepared sample (S02).
  • MALDI-TOF MS was used for histological differentiation, but other analytical methods for analyzing peak data may be used.
  • the first lipid profile data which is information on the lipid profile is selected from the data obtained by mass spectrometry (S03). That is, the filtering step is performed to leave only data (first lipid profile data) of 11 peaks in the acquired data.
  • the supervised learning algorithm prediction is performed using the filtered data.
  • a support vector machine is used as a supervised learning algorithm, but other algorithms such as k-nearest neighbor, compound covariate predictor, linear discriminant analysis, nearest centroid, and the like may be used. You can also use BRB-ArrayTools (NCI) for analysis, but you can use any other software.
  • the sample may be adenocarcinoma (Providing information corresponding to any one of adenocarcinoma) and squamous cell carcinoma may be performed (S04).
  • the present invention has nine peaks among the eleven peaks (p713.5, n898.77, p652.49, n906.89, p524.28, p610.39, p593.4). , p708.67, and p756.68) provide predictive information that the unknown tissue sample is likely to be adenocarcinoma. If the remaining two peaks (n530.04, n544.06) are large, The tissue may include providing prediction information that the tissue is likely to be squamous cell carcinoma.
  • the present invention may include providing prediction information using an arbitrary peak value selected from eleven peaks. For example, using only two peaks out of 11 peaks, n906.89 (ST-OH ⁇ 42: 1 ⁇ [MH]-) and p756.68 (PC ⁇ 32: 0 ⁇ [M + Na] +). It may also provide information for histological differentiation. In other words, if two peak values are large, prediction information that an unknown tissue is likely to be adenocarcinoma is secured.

Abstract

본 발명은 작은 양의 조직샘플만으로도 비소세포성 폐암의 조직학적 유형을 보다 정확하고도 저비용으로 용이하게 분류하는 것을 목적으로 한다. 이러한 목적을 달성하기 본 발명은 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 것으로서, (a) 기질(matrix)과 인체 조직을 혼합하여 시료(sample)를 준비하는 단계와, (b) 준비된 시료에 대하여 질량분석을 수행하는 단계와, (c) 질량분석에 의하여 확보된 데이터에서 지질 프로파일에 대한 정보인 제1 지질 프로파일 데이터를 선별하는 단계 및 (d) 선암(adenocarcinoma) 조직 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 지질 프로파일에 대한 정보인 제2 지질 프로파일 데이터와 제1 지질 프로파일 데이터를 비교함으로써 시료가 선암(adenocarcinoma) 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 중의 어느 하나에 해당한다는 정보를 제공하는 단계를 포함한다.

Description

지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법
본 발명은 시료를 분석하여 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 것으로서, 보다 자세하게는 질량분석을 통하여 시료의 지질 프로파일을 얻음으로써 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 것이다.
폐암은 크게 비소세포폐암(Non small cell carcinoma)과 소세포암(Small cell carcinoma)으로 나뉠 수 있다. 비소세포폐암은 다시 편평상피세포암(Squamous cell carcinoma)과 선암(Adenocarcinoma)으로 나뉠 수 있다. 일반적으로 편평상피세포암과 선암을 위한 치료는 기본적인 원칙이나 적응증이 유사하다. 그러나 항암화학요법의 경우 선암과 편평상피세포암의 치료를 위한 항암화학요법은 서로 상이하다. 최근에 EGFR 저해제(EGFR inhibitor)나 bevacizumab 같은 약제는 조직학적 유형에 따라 사용이 가능하거나 불가능하기도 하다. 즉, 조직학적 유형에 따라 적용가능한 항암제가 결정되기 때문에 정확한 조직학적 감별(histologic differentiation)이 매우 중요하다.
선암(Adenocarcinoma)과 편평상피세포암(squamous cell carcinomas)의 조직학적 감별은 적은 양의 조직만을 이용하는 생검(biopsy)에서는 매우 어렵다. 그러한 감별을 위한 생검의 약 25%는 현행 병리학적인 방법으로는 불가능한 것으로 보고되고 있다.
현재는 H & E 염색으로 진단되지 않는 경우, 조직학적으로 선암(adenocarcinoma)인지 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma)인지 감별하기 위해서 면역염색화학법을 시행하는 것이 일반적이다. 이때 이용하는 항체가 p63, TTF1, cytokeratins 5/6/7, Napsin A 등이다. 이러한 방법으로는 sensitivity와 specificity가 충분치 않아서 정확도가 비교적 높지 않은 것으로 보고되고 있다(Am J Surg Pathol 34;12(2010):1805-1811, J Thorac Oncol 5 (2010) :442-447).
말디질량분석(matrix-assisted laser desorption and ionization(MALDI) mass spectormetry(MS))은 매우 예민한 검사법으로 인체조직에 직접 이용되기 시작한 것은 극히 최근의 일이지만, sinapinic acid를 기질(matrix)로 하여 동결조직(frozen tissue)을 분석하는 경우에 암의 진단과 병리학적 분류에 유용한 정보를 제공할 수 있다는 것이 보고되고 있다(Lancet 2003; 362(9382): 433-449, Cancer Res 2005; 65(17): 7674-7681, Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1975-1983).
최근에 개발되는 약제는 비소세포성 폐암의 조직학적 타입에 따라 사용 가능 여부가 결정되기 때문에 조직학적 감별이 중요해지고 있다. 현재의 면역염색화학법은 비교적 많은 양의 조직이 필요하며 비용이 많이 소요된다는 문제점이 있다. 또한, 면역염색화학법의 정확도(85-90%)보다 더 높은 정확도를 가지는 감별 방법이 요구된다.
본 발명의 목적은 적은 양의 조직샘플만으로도 비소세포성 폐암의 조직학적 유형을 보다 정확하고도 저비용으로 용이하게 분류하는 것을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위한 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법은, (a) 기질(matrix)과 인체 조직을 혼합하여 시료(sample)를 준비하는 단계; (b) 준비된 시료에 대하여 질량분석을 수행하는 단계; (c) 상기 질량분석에 의하여 확보된 데이터에서 지질 프로파일에 대한 정보인 제1 지질 프로파일 데이터를 선별하는 단계; 및 (d) 선암(adenocarcinoma) 조직 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 지질 프로파일에 대한 정보인 제2 지질 프로파일 데이터와 상기 제1 지질 프로파일 데이터를 비교함으로써 상기 시료가 선암(adenocarcinoma) 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 중의 어느 하나에 해당한다는 정보를 제공하는 단계;를 포함한다.
또한, 상기 기질은 지질 분자에 대한 질량분석을 하는 데 사용되는 성분을 포함할 수 있다.
또한, 상기 기질은 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) 와 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 질량분석은 MALDI(matrix-assisted laser desorption and ionization) 질량분석일 수 있다.
또한, 상기 질량분석은 MALDI-TOF MS, MALDI-FTICR-MSn, MALDI-Q-TOF, MALDI-QIT-TOF, MALDI-QIT-FTICR-MS, Field Desoption (FD), 252Cf-Plasma desoprtion (PD), desoprtion chemical ionization (DCI), secondary ion mass spectrometry (SIMS), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), Tandem Mass Spectrometry 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 (b)단계는 상기 시료에 대하여 포지티브 모드(positive mode)와 네거티브 모드(negative mode)에서 각각 질량분석을 수행하는 단계일 수 있다.
또한, 상기 제1 및 제2 지질 프로파일 데이터는 포지티브 모드에서 713.5(m/z), 네거티브 모드에서 898.77(m/z), 포지티브 모드에서 652.49(m/z), 네거티브 모드에서 906.89(m/z), 포지티브 모드에서 524.28(m/z), 포지티브 모드에서 610.39(m/z), 포지티브 모드에서 593.4(m/z), 포지티브 모드에서 708.67(m/z), 포지티브 모드에서 756.68(m/z), 네거티브 모드에서 530.04(m/z), 네거티브 모드에서 544.06(m/z) 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 분자량을 가지는 지질 분자의 양(abundance) 또는 비율에 대한 데이터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 및 제2 지질 프로파일 데이터는 네거티브 모드에서 906.89(m/z) 및 포지티브 모드에서 756.68(m/z)의 분자량을 가지는 지질 분자의 양(abundance) 또는 비율에 대한 데이터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 및 제2 지질 프로파일 데이터는 네거티브 모드에서 ST-OH{42:1}[M-H]- 및 포지티브 모드에서 PC{32:0}[M+Na]+의 양(abundance) 또는 비율에 대한 데이터를 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면 적은 양의 조직샘플만으로도 비소세포성 폐암의 조직학적 유형을 보다 정확하고도 저비용으로 용이하게 분류할 수 있다.
도 1은 21명 환자의 시료의 평균 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 도 1(A)는 포지티브 모드에서의 실험결과이며, 도 1(B)는 네거티브 모드에서의 실험결과이다.
도 2는 PCA 분석에 의하여 폐암 조직과 정상 조직의 lipid profile을 비교한 그래프이다. 도 2(A)는 폐암 조직과 정상 조직의 21쌍에 대한 PCA plot이다. 도 2(B)는 폐암 조직과 정상 조직에 대한 Intensity profile 이다.
도 3은 본 발명에 의한 방법의 변별력을 검증하기 위하여 validation set을 이용한 실험결과를 나타낸 그림이다. 도 3(A)는 validation set으로서 51개의 surgical sample에 대한 PCA(principal component analysis) 결과이다. 도 3(B) 및 (C)는 validation set으로서 5개의 생검조직을 이용한 실험결과이다. 도 3(B)에서 적색은 비중이 높다는 것을, 녹색은 비중이 낮다는 것을 나타낸다. 도 3(C)는 validation set의 Mass spectrometry image 이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 순서도이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 실시예는 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 도면에서의 요소의 형상 등은 보다 명확한 설명을 위하여 과장되게 표현된 부분이 있을 수 있으며, 도면상에서 동일 부호로 표시된 요소는 동일 요소를 의미한다.
1. 시료의 준비
training set으로 사용할 시료는 다음과 같이 준비되었다. 21명의 비소세포성 폐암(Non small cell carcinoma) 환자로부터 폐암 조직과 정상 조직을 각각 채취하였다. 각각의 환자로부터 복수개(평균 3개)의 spot에서 조직샘플을 확보하였다. 채취된 조직 샘플을 알루미늄 호일에 싸서 질소에 30~60 초간 서서히 동결시키고, MALDI 분석을 할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
MALDI 분석을 위하여 동결 조직(frozen tissue)을 cryosection (10 μm)한 후에 indium tinc oxide electroconductive glass slide에 위치시킨 후 진공 건조하였다.
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) 7 mg 와 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 7 mg 를 1 mL 의 70 % methanol 와 0.1 % TFA 및 1 % piperidine matrix의 혼합물에 녹임으로서 기질(matrix)을 준비하였다. 이러한 기질은 조직샘플의 지질(lipid)에 대한 질량분석을 하기 위하여 지용성의 성질을 가진다. 지질과 잘 섞이거나, 또는 지질 분자의 질량분석에 적합한 다른 성분의 기질을 사용할 수도 있다. 본 실시예에서는 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)와 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)를 모두 사용하였으나 DHB 만을 사용할 수도 있다.
표 1은 본 발명의 실시예에 사용된 조직샘플의 특징을 정리한 표이다. 표 1에서 보듯이, 본 발명의 실시예에서는 surgical sample과 biopsy sample이 사용되었다. surgical sample은 training set으로서 환자 21명의 조직샘플과 validation set으로서 51개의 조직샘플을 포함한다. training set으로서 21명의 환자는 10명의 편평상피세포암 환자와 11명의 선암 환자로 구성되었다. validation set으로서 51개의 조직샘플은 26개의 편평상피세포암 조직샘플과 25개의 선암 조직샘플로 구성되었다. biopsy sample로서의 5개의 조직샘플은 3개의 편평상피세포암 조직샘플과 2개의 선암 조직샘플로 구성되었다.
[규칙 제26조에 의한 보정 09.07.2012]
표1　
Figure WO-DOC-FIGURE-29
2. 질량 분석
다음으로, 준비된 시료에 대하여 질량분석을 수행하였다. 본 실시예에서는 질량분석을 위하여 MALDI-TOF MS 를 이용하였다. 그러나, 생체분자의 질량분석을 할 수 있는 다른 분석법, 즉 MALDI-FTICR-MSn, MALDI-Q-TOF, MALDI-QIT-TOF, MALDI-QIT-FTICR-MS, Field Desoption (FD), 252Cf-Plasma desoprtion (PD), desoprtion chemical ionization (DCI), secondary ion mass spectrometry (SIMS), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), Tandem Mass Spectrometry 등을 이용할 수도 있다.
준비된 기질을 250 nl 씩 두 번 micropipette을 이용하여 cancer-rich area에 공급하였다. ImagePrep (Bruker) 이나 Chip1000 (Shimazu) 같은 depositer 를 사용하여 기질(matrix)에 코팅하는 것도 가능하다.
다음으로, smart-beam laser (Nd:YAG, 355 nm)가 장착된 Autoflex III 나 Ultraflex 혹은 UltrafleXtreme(Bruker) 등의 MALDI 장비를 이용하여 MALDI 분석을 시행하였다.
MALDI 분석은 500 ~ 1,200 Da 에서 optimized 된 linear mode 하에서 수행되었으며, laser frequency 는 200 Hz (3,000 consecutive laser shots), delay time 은 0 ns에 맞추었다. 그리고, 데이터는 positive ion mode 와 negative ion mode에서 각각 확보하였다.
데이터를 얻기 전에 lipid-mixed calibration standards with m/z ranges of 674-834 Da (positive ion mode) and 564-906 Da (negative ion mode)로 교정(calibration)을 수행한다.
3. 데이터의 처리
확보된 데이터에 대하여 preprocessing으로서 baseline subtraction, spectral recalibration, spectral area calculation, data reduction 을 시행하였다. Clinprotool(version 2.2, Bruker Daltonics)을 사용하는 경우에, resolution은 300으로 설정하였다. 그리고, 10%의 minimal baseline width 로 Top Hat baseline subtraction 을 수행하였다. data reduction은 4로 설정하였고, Maximal peak shift 는 2000 ppm 으로 하여 spectra recalibration 을 수행하였다. "％ Match to Calibrant Peaks"값은 20%로 설정되었다. 신호 대 노이즈 비는 3보다 크도록(signal-to-noise ratios > 3) 설정되었다. 피크 영역은 zero level integration으로 피크 계산에 사용되었다(peark area was used for peak calculation with zero level integration). 이 같은 과정은 ClinProTool 외의 다른 software 로 수행할 수도 있다.
도 1은 21명 환자의 시료의 평균 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 도 1(A)는 포지티브 모드에서의 실험결과이며, 도 1(B)는 네거티브 모드에서의 실험결과이다.
도 1과 같은 평균 스펙트럼은 시료의 지질(lipid) 발현 양상을 보여준다. 데이터 처리의 결과, 총 144 개의 feature (positive ion mode 78개, negative ion mode 66 개)가 확보되었다.
포지티브 모드에서 확보된 데이터(positive mode dataset) 및 네거니브 모드에서 확보된 데이터(negative mode dataset)에 대하여 각각 노멀라이제이션(정규화)(normalization)을 수행하였다. 이는 조직샘플별 실험적 차이를 표준화하기 위함이다. 즉, 서로 다른 환자의 데이터를 서로 비교가능하도록 평균 피크를 정규화하는 것이다.
그리고, 정규화된 포지티브 모드 데이터셋과 네거티브 모드 데이터셋을 하나의 데이터셋으로 결합하였다. 한편, non-lipid peak (m/z 616.2 ± 2.5 in the positive ion mode, m/z 540.2 ± 2.5 in the negative ion mode) 데이터는 제외하였다. 결합된 데이터셋에 대하여 BRB-ArrayTools(Biometrics Branch, NCI)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 중요한 것은 통계분석을 수행함에 있어서 포지티브 모드 데이터셋과 네거티브 모드 데이터셋을 모두 사용한다는 것이기 때문에 두 데이터셋의 결과를 모두 반영하는 방식에는 여러 가지가 있을 수 있다.
4. 통계분석
BRB-ArrayTools(Biometrics Branch, NCI)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. BRB-ArrayTools의 다차원 스케일링 분석(multi-dimensional scaling analysis)을 사용하여 PCA 플롯(principal component analysis plot)이 생성되었다. 클래스 비교와 클래스 예측 분석도 BRB-ArrayTools을 이용하여 수행되었다.
퍼뮤테이션 P 값(permutation P value)이 0.05 보다 작은 경우에는 상기 클래스의 지질 프로파일은 서로 상이하다고 판단할 수 있다. 클래스 예측 분석은 training set 샘플(n=21)을 2 대 1의 비율로 2 개의 subset 으로 random하게 나눔으로서 수행될 수 있다. training set(n=14)에 대하여 가장 정확한 예측결과를 제공하는 classifier를 test set(n=7)에 대한 classifier로 사용하였다.
도 2는 PCA 분석에 의하여 폐암 조직과 정상 조직의 lipid profile을 비교한 그래프이다. 도 2(A)는 폐암 조직과 정상 조직의 21쌍에 대한 PCA plot이다. 도 2(B)는 폐암 조직과 정상 조직에 대한 Intensity profile 이다.
도 2(A)와 도 2(B)에서 보듯이, unsupervised analysis 에 있어서 폐암 조직과 정상 조직의 lipid profile 은 서로 명확하게 구분되었다. 또한, BRB-ArrayTool을 이용한 class comparison analysis에 있어서, 퍼뮤테이션 P 값(permutation P value)은 0.001 보다 작았다.
한편, 11개의 선암(adenocarcinoma) 시료와 10개의 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 시료에 대하여 class comparison을 수행하였다. 그 결과, P < 0.01 의 feature selection에서 11개의 피크가 두 가지 시료 사이에서 서로 유의하게(significantly) 구분되었다. 피크의 값은 해당 분자의 양(abundance) 또는 비율일 수 있다. 두 가지 시료 사이에 차이가 없다면 우연히 적어도 11개의 피크가 선택될 확률은 0.007 이었다. 21개 시료에 대한 0.632+ bootstrap cross validation analysis한 결과, 퍼뮤테이션 P 값(permutation P value)은 테스트가 수행된 모든 classifier 에 대한 관계에서 0.05 보다 작았다. 이러한 결과는 선암(adenocarcinoma) 조직과 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직은 서로 다른 lipid profile 을 가진다는 것을 의미한다. 21개의 조직샘플을 이용한 100번의 random training-to-test partition에 대하여 test set에 대한 평균 예측 정확도는 85.7%(6/7)이었다(at feature selection P < 0.01). 즉, 10 개의 편평상피세포암 spectra 와 11 개의 선암 spectra를 비교할 때 서로간에 유의한(significant) 차이가 발견되었다.
표 2
Figure PCTKR2012003571-appb-T000002
표 2(Discriminatory peak - m/z and assignments)에는 P < 0.01의 feature selection 에서 선암(adenocarcinoma) 조직과 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직에 대한 11개의 peak에 대한 data가 기재되어 있다. 이때 mass peak 은 ± 2000 ppm 까지의 tolerance 를 고려할 수 있다. 11개 중에서 9개의 peak ( p713.5, n898.77, p652.49, n906.89, p524.28, p610.39, p593.4, p708.67, p756.68 )가 선암 (adenocarcinoma) 조직에서 더 크게 나타났으며, 나머지 2개의 peak ( n530.04, n544.06 )가 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직에서 더 크게 나타났다. MS/MS analysis 결과, 선암 (adenocarcinoma) 조직에서 더 높게 나타난 2 개의 peak 는 각각 ST-OH{42:1}[M-H]－ (m/z 906.89)와 PC{32:0}[M+Na]+ (m/z 756.68)인 것으로 확인되었다.
이러한 결과가 non-bioloigic factor 로 인해 우연히 발생했는지 여부를 검증하기 위하여 검체의 종류 (surgical vs biopsy), matrix deposition method (manual vs ImagePrep), profile acquisition mode (profiling vs imaging) 를 모두 바꾸어 보았다.
도 3은 본 발명에 의한 방법의 변별력을 검증하기 위하여 validation set을 이용한 실험결과를 나타낸 그림이다. 도 3(A)는 validation set으로서 51개의 surgical sample에 대한 PCA(principal component analysis) 결과이다.
우리는 보다 큰 validation set을 이용하여 상기 결과를 검증하기로 하였다. validation set으로서 51개의 조직샘플(표 1 참조)은 surgical sample이다. 실험 결과, 51개의 조직샘플은 조직학적 타입에 따라 유의하게 감별될 수 있었다. support vector machine를 이용하여 P＜0.01의 feature selection에서 검토한 결과, 51개 중에서 41개(80.4%)의 조직샘플의 조직학적 타입이 정확하게 분류(classified)되었다. 선암(adenocarcinoma)의 경우에는 25개 중에서 21개에 대하여 조직학적 타입이 정확하게 분류되었으며, 편평세포상피암(squamous cell carcinoma)의 경우에는 26개 중에서 20개에 대하여 조직학적 타입이 정확하게 분류되었다. P＜0.02 및 P＜0.05의 feature selection에서는 정확도가 84.3%까지 증가하였다.
도 3(B) 및 (C)는 validation set으로서 5개의 생검조직을 이용한 실험결과이다. 도 3(B)에서 적색은 비중이 높다는 것을, 녹색은 비중이 낮다는 것을 나타낸다. 도 3(C)는 validation set의 Mass spectrometry image 이다.
도 3(B) 및 (C)와 관련하여, 예측모델의 임상적 활용을 위해서는 궁극적으로 수술조직이 아닌 생검조직에 적용해야 하기에, vaildation set 은 기관지 내시경 검체를 사용하였다. adenocarcinoma 는 peripheral distribution 으로 인하여 bronchoscopic biopsy로 얻기 힘들기 때문에 adenocarcinoma 2 례와 squamous cell carcinoma 3 례를 validation set 으로 구성하였다. MALDI signal 도 manual matrix deposition 대신 ImagePrep (Bruker)을 사용하여 도포하였다.
그리하여 검체의 종류 (surgical vs biopsy), matrix deposition method (manual vs ImagePrep), profile acquisition mode (profiling vs imaging)를 모두 바꾸면서 discriminatory peak 이 non-bioloigic factor 로 인해 우연히 발견되었을 가능성을 확인하려 하였다. 결론적으로 실험 조건을 다양하게 바꾸더라도 상기 11 개의 discriminatory peak 의 변별력은 유지되었다.
5 개의 validation set 검체는 원래 수술조직에서 발견한 discriminatory peak 으로 hierarchical clustering을 시행할 때 adenocarcinoma 끼리 squamous cell carcinoma 끼리 clustering 이 되었다. 실험결과, 예측 정확도는 90.2%에 달하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 surgical sample에서 보였던 pattern 과 동일한 양상으로 coordinated expression pattern을 보여주고 있었다.
결론적으로 실험 조건을 다양하게 바꾸더라도 상기 11 개의 peak 에 의한 변별력은 유지되었다. 따라서, 이러한 11 개의 peak 또는 그 중에서 선택된 일부 peak 를 이용하여 새로운 미지의 조직 샘플의 조직학적 감별이 가능하다는 것이 확인되었다.
5. 조직학적 감별을 위한 예측 프로세스
미지의 조직이 선암 (adenocarcinoma) 조직인지 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직인지에 대한 예측 정보를 제공하는 프로세스는 다음과 같다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 순서도이다.
먼저, 조직학적 감별을 필요로 하는 인체조직과 소정의 기질을 혼합하여 시료를 준비한다(S01).
다음으로, 준비된 시료에 대하여 MALDI분석을 수행한다(S02). 본 실시예에서는 조직학적 감별을 위하여 MALDI-TOF MS 를 이용하였으나, peak data를 분석할 수 있는 다른 분석법을 이용할 수도 있다.
다음으로, 질량분석에 의하여 확보된 데이터에서 지질 프로파일에 대한 정보인 제1 지질 프로파일 데이터를 선별한다(S03). 즉, 확보된 데이터에서 11 개의 peak에 대한 데이터(제1 지질 프로파일 데이터)만을 남기는 필터링 단계를 수행한다. 필터링된 데이터를 이용하여 supervised learning algorithm prediction 을 수행한다. 본 실시예에서는 supervised learning algorithm 으로서 support vector machine 을 사용하였으나, k-nearest neighbor, compound covariate predictor, linear discriminant analysis, nearest centroid 등의 다른 algorithm 을 사용할 수도 있다. 또한, 분석을 위해 BRB-ArrayTools (NCI) 를 사용하나, 기타 다른 software 를 사용할 수도 있다.
다음으로, 선암(adenocarcinoma) 조직 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 지질 프로파일에 대한 정보인 제2 지질 프로파일 데이터와 상기 제1 지질 프로파일 데이터를 비교함으로써 상기 시료가 선암(adenocarcinoma) 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 중의 어느 하나에 해당한다는 정보를 제공하는 단계가 수행될 수 있다(S04).
이러한 S04 단계와 관련하여 제1실시예로서, 본 발명은 11 개의 peak 중에서 9개의 peak ( p713.5, n898.77, p652.49, n906.89, p524.28, p610.39, p593.4, p708.67, p756.68 )의 값이 크다면 미지의 조직샘플은 adenocarcinoma 일 가능성이 크다는 예측 정보를 제공하며, 나머지 2개의 peak ( n530.04, n544.06 )의 값이 크다면 미지의 조직은 squamous cell carcinoma 일 가능성이 크다는 예측 정보를 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 S04 단계와 관련하여 제2실시예로서, 본 발명은 11 개의 peak 중에서 선택된 임의의 peak 값을 이용하여 예측 정보를 제공하는 단계를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 11 개의 peak 중에서 2개의 peak, 즉 n906.89(ST-OH {42:1}[M-H]-) 및 p756.68(PC{32:0}[M+Na]+) 만을 이용하여 조직학적 감별을 위한 정보를 제공할 수도 있다. 즉, 2개의 peak값이 크다면 미지의 조직은 adenocarcinoma 일 가능성이 크다는 예측 정보가 확보된다.
앞에서 설명되고, 도면에 도시된 본 발명의 일 실시예는, 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.

Claims (9)

  1. (a) 기질(matrix)과 인체 조직을 혼합하여 시료(sample)를 준비하는 단계;
    (b) 준비된 시료에 대하여 질량분석을 수행하는 단계;
    (c) 상기 질량분석에 의하여 확보된 데이터에서 지질 프로파일에 대한 정보인 제1 지질 프로파일 데이터를 선별하는 단계; 및
    (d) 선암(adenocarcinoma) 조직 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 조직 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 지질 프로파일에 대한 정보인 제2 지질 프로파일 데이터와 상기 제1 지질 프로파일 데이터를 비교함으로써 상기 시료가 선암(adenocarcinoma) 및 편평세포상피암 (squamous cell carcinoma) 중의 어느 하나에 해당한다는 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기질은 지질 분자에 대한 질량분석을 하는 데 사용되는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 기질은 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) 와 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 중에서 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 질량분석은 MALDI(matrix-assisted laser desorption and ionization) 질량분석인 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 질량분석은 MALDI-TOF MS, MALDI-FTICR-MSn, MALDI-Q-TOF, MALDI-QIT-TOF, MALDI-QIT-FTICR-MS, Field Desoption (FD), 252Cf-Plasma desoprtion (PD), desoprtion chemical ionization (DCI), secondary ion mass spectrometry (SIMS), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), Tandem Mass Spectrometry 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (b)단계는 상기 시료에 대하여 포지티브 모드(positive mode)와 네거티브 모드(negative mode)에서 각각 질량분석을 수행하는 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 지질 프로파일 데이터는 포지티브 모드에서 713.5(m/z), 네거티브 모드에서 898.77(m/z), 포지티브 모드에서 652.49(m/z), 네거티브 모드에서 906.89(m/z), 포지티브 모드에서 524.28(m/z), 포지티브 모드에서 610.39(m/z), 포지티브 모드에서 593.4(m/z), 포지티브 모드에서 708.67(m/z), 포지티브 모드에서 756.68(m/z), 네거티브 모드에서 530.04(m/z), 네거티브 모드에서 544.06(m/z) 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 분자량을 가지는 지질 분자의 양(abundance) 또는 비율에 대한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 지질 프로파일 데이터는 네거티브 모드에서 906.89(m/z) 및 포지티브 모드에서 756.68(m/z)의 분자량을 가지는 지질 분자의 양(abundance) 또는 비율에 대한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 지질 프로파일 데이터는 네거티브 모드에서 ST-OH{42:1}[M-H]- 및 포지티브 모드에서 PC{32:0}[M+Na]+의 양(abundance) 또는 비율에 대한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 프로파일을 이용한 비소세포성 폐암의 조직학적 분류를 위한 정보를 제공하는 방법.
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