JP4921302B2 - 質量分析システム - Google Patents

Description

本発明は、試料分離手段と質量分析手段とを備えた質量分析システムに関し、定量測定の信頼性向上に関するものである。

一般的な質量分析法では、測定対象の試料をイオン化した後、生成された各種イオンを質量分析装置に送り込み、イオンの質量数と電荷の比である質量対電荷比（ｍ／ｚ）の値ごとに、イオンの測定強度を決定する。この結果得られるマススペクトルデータは、各質量対電荷比に対する測定されたイオンの測定強度のピークを含んでいる。

また、生体試料のように多数の成分が混合した複雑な試料の分析においては、質量分析装置のみでは同一もしくは非常に近い質量対電荷比を有する成分を分離することが困難である。

このため、試料中の成分の分離を目的として液体クロマトグラブ（ＬＣ）などの試料分離手段と、質量分析手段（ＭＳ）が一体となった、液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）のような質量分析システムが多用されている。

さらに、近年質量分析システムにより複数の生体試料の網羅的解析を行い、その差異を検出する、ディファレンシャル解析が病理マーカ探索や創薬ターゲット分子探索の有用な技術として注目されている。

例えば、正常細胞と悪性腫瘍細胞のタンパク質発現量の比較において、顕著な差異を示すタンパク質は悪性腫瘍のマーカとなり得る。このディファレンシャル解析の分野においては、微量成分のピークまで検出・同定可能な高い定性能力と、正確な発現量を比較するための高い定量能力が重要である。

特許文献１においては、マススペクトルデータの全ピークから算出したＺスコアを判定基準として、有効ピークを選別することでノイズを軽減させ、ディファレンシャル解析による差異の検出を明確化させる技術が開示されている。

特許文献２においては、安定同位体を組み込んだ質量の異なる複数の標識試薬を用いることで、複数試料中に含まれる同成分を質量差で区別し、各成分の相対比を求める技術が開示されている。

特開２００５−２５７４８３号公報 特表２００２−５２３０５８号公報

特に生体試料のように非常に多数の成分を含む複雑な試料においては、試料の分離手段により試料中の成分を分離してもなお、同一保持時間において多数の成分が溶出してしまう。

このため、同一物質であっても、共存する他の成分の量や種類に依存してイオン化効率が変化することや、質量分離部や検出部が大量のイオンにより飽和することで定量結果に影響を及ぼす。すなわち、マススペクトルデータにおけるイオンの測定強度が減少してしまうことがある。（以下、イオンサプレッションと呼ぶ）。

特許文献１に開示された方法では、Ｚスコアを用いることで微小ピークとベースノイズの判別を可能としている。しかし、Ｚスコアが負となる場合（イオンの測定強度が平均以下、すなわち、イオンサプレッションがおきている可能性がある場合）には、誤った定量値を算出してしまう。

特許文献２に開示された方法では、２種類以上の混合試料中における各成分の定量値を算出し、その相対比を利用してディファレンシャル解析を行うことが可能となる。しかし、イオンサプレッションの影響下においては、前記各成分の定量値・相対比そのものに狂いが生じることがあり、この場合ディファレンシャル解析において誤判定を生じてしまう。

本発明は上記の課題に鑑み、その目的とするところは、マススペクトルデータにおいて特にイオンサプレッションの影響により定量結果の信頼性（以下、定量信頼性と呼ぶ）が低下しているマススペクトルデータを判別することで、定量信頼性を向上させることにある。

本発明は、成分のスペクトルが時間の経過順に並ぶように試料を分離する分離手段と、
ススペクトルが質量対電荷比（Ｍ／Ｚ）の順に並ぶように前記各スペクトルの成分を分析する質量分析手段を含む質量分析システムにおいて、前記スペクトルの全部に及ぶ全マススペクトルの分析データより前記各スペクトルに存在する一定の質量対電荷比のピークを選択する機能と、前記全マススペクトルの分析データから前記各スペクトルの分析データにおける前記ピークの統計的指標を算出する機能と、前記統計的指標を判定基準として、前記各スペクトルの分析データの定量信頼性を判定する機能を有することを特徴とする。

更に、本発明は前記ピークを２つ以上選択し得る機能を有すること、前記統計的指標がＺスコアまたは平均値であること、前記ピークを前記分離手段からの溶出時間に応じて変更可能な変更機能を有すること、前記統計的指標を算出する際に、前記ピークに対し前記分離手段からの溶出時間に応じて係数補正を実施し前記統計的指標を算出する係数補正機能を有することを特徴とする。

更にまた、本発明は前記各マススペクトルデータの定量信頼性の判定結果をユーザに提示する機能を有すること、前記試料としてタンパク質、代謝産物が分析可能であること、前記ピークを生成する内部標準マーカを前記試料に添加することを特徴とする。

本発明によれば、イオンサプレッションの影響を受けたマススペクトルデータ、すなわち定量信頼性が低いマススペクトルを特定できるようになった。その結果、定量信頼性が低いデータと、定量信頼性の正常なデータの判定ができるので信頼性が向上した。

以下、添付図面を参照しながら、本発明の質量分析システムを実施するための最良の形態を詳細に説明する。図１〜図７は、本発明の実施形態を例示する図であり、これらの図において、同一の符号を付した部分は同一物を表わし、基本的な構成及び動作は同様であるものとする。

図１は本発明の実施形態が適用される定量分析システムに用いるマススペクトルデータを取得するための質量分析システムの例である。

図１において、質量分析システムは、測定する試料が導入され、その特性に応じて分離する試料分離装置１０１と、送られて来る分離された成分をイオン化するイオン化部１０２を有する。

更に、質量分析システムは、イオン化部１０２でイオン化された試料の成分を各質量数成分に分離する質量分析部１０３と、各質量数成分に分離され分離イオンを検出する検出器１０４を有する。検出器１０４にて得られ、送られた検出信号をデータ処理するデータ処理部１０５、データ処理された後、マススペクトルデータとして表示する表示部１０６を有する。

更にまた、質量分析システムは、一連の質量分析システム（イオン化部、質量分析部、データ処理部）を制御する制御部１０７を有する。

制御部１０７、処理部１０５、表示部１０６は、スペクトルの全部に及ぶ全マススペクトルの分析データより各スペクトルに存在する一定の質量対電荷比のピークを選択する機能と、全マススペクトルの分析データから前記各スペクトルの分析データにおける前記ピークの統計的指標を算出する機能と、統計的指標を判定基準として、各スペクトルの分析データの定量信頼性を判定する機能を有する。

更に、制御部１０７、処理部１０５、表示部１０６は、前述したピークを２つ以上選択し得る機能と、ピークを分離手段からの溶出時間に応じて変更可能な変更機能と、統計的指標を算出する際に、ピークに対し分離手段からの溶出時間に応じて係数補正を実施し統計的指標を算出する係数補正機能と、各マススペクトルデータの定量信頼性の判定結果をユーザに提示する機能を有する。

ここで、試料分離装置１０１には、例えば、液体クロマトグラフ（「ＬＣ」）、ガスクロマトグラフ（「ＧＣ」）、電気泳動装置（「Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」）などの試料分離装置を含むことが好ましい。

また、イオン化部１０２には、例えば、エレクトロスプレー（「ＥＳＩ」）イオンソース、常圧化学電離（「ＡＰＣＩ」）イオンソース、常圧光電離（「ＡＰＰＩ」）イオンソース、レーザ脱着電離（「ＬＤＩ」）イオンソース、誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオンソース、電子衝撃（「ＥＩ」）イオンソース、化学電離（「ＣＩ」）イオンソース、電界電離（「ＦＩ」）イオンソース、高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオンソース、液体二次イオン質量分析法（「ＬＳＩＭＳ」）イオンソース、常圧電離（「ＡＰＩ」）イオンソース、電界脱着（「ＦＤ」）イオンソース、マトリックスアシスト（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ）レーザ脱着電離（「ＭＡＬＤＩ」）イオンソース、および、シリコン上脱着／電離（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ）（「ＤＩＯＳ」）イオンソースなどのイオンソースを含むことが好ましい。さらに、イオンソースは連続イオンソースもしくはパルスイオンソースであり得る。

さらに、質量分析部１０３には、例えば、フライト時間（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析装置、四重極質量分析装置、ペニングまたはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（「ＦＴＩＣＲ」）質量分析装置、二次元または線形四重極イオントラップ、ポールまたは三次元四重極イオントラップ、および、オービトラップなどの質量分析装置を含むことが好ましい。

また質量分析部１０３は単独の質量分析装置で構成されても、複数の質量分析装置を組み合わせて構成されても構わない。

さらに、衝突解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）法、電子捕獲解離（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）法などの解離法により、イオン化した試料を多段階解離可能な装置構成をとることも可能である。

図７は、本発明の特徴を模式的に示した模式図で、この図を引用して本発明の特徴点を述べる。

横軸Ｘの時間は、試料分離装置１０１（分離手段）が成分を分離する分離時間である。縦軸ＹのＩは、分離された成分の出力強度と、分離分析されたＭ／Ｚの出力強度を示す。前方軸ＺのＭ／Ｚは、質量分析部１０３（質量分析手段）が各質量数成分を分離分析したイオンの質量数と電荷の比である質量対電荷比（ｍ／ｚ）を示す。

時間の経過順に並ぶ波形７０は分離手段で分離された成分の出力強度を示す成分のスペクトルである。

質量対電荷比（Ｍ／Ｚ）の順に並ぶに連立するピークの線列８１〜８４は、質量分析部１０３（質量分析手段）で分離分析された各質量数成分の出力強度を示すススペクトルである。

ススペクトルの線列８１〜８４は、波形７０の各スペクトルの山にタイミングを合わせて出力されるので、各スペクトル毎の質量数成分の内訳になる。ススペクトルの線列８１に含まれる点線で示すピーク８１２、線列８２中のピーク８２２、線列８３中のピーク８３２、線列８４中のピーク８４２は、分離分析する試料に予め含めて置いた内部標準試料の出力である。

この内部標準試料による一定のピークは、どのスペクトルの山に現れ、質量対電荷比（ｍ／ｚ）の出力が幾らになるか予め把握されている。図７では線列８２中のピーク８２２は、他のピークに比べて出力が低い。

本来なら、他のピークと同じ出力の値になるのである。ピーク８２２が低いのは、前述したイオンサプレッション等の影響が生じていることが予想される。このイオンサプレッションの影響が生じているスペクトルの山はスペクトルの分析データの定量信頼性が乏しく、このスペクトルの山を分析データから除くことで、相対的・全体的に定量信頼性を向上させることができる。

なお、一定のピークを出力する内部標準試料は、溶媒であったり、溶媒に添加する標準試料でもよい。

このように、一定の質量対電荷比のピークを選び、各スペクトルに亘る全マススペクトルの分析データから各スペクトルの分析データにおける上記ピークの統計的指標を算出し、この統計的指標を判定基準として各スペクトルの分析データの定量信頼性を判定することで定量信頼性を高めることが実現できる。

次に図２に示す実施例１について説明する。

図２は質量分析システムの分析手順を示している。

まず、質量分析データに含まれる一定の質量対電荷比を持つピークを選択する（選択したピークを以下、選択ピークと呼ぶ）。ここで、上記選択ピークは、一定の質量対電荷比範囲内に存在するピークとすることが好ましい、さらにはピーク以外にも一定範囲の質量対電荷比を用いることも可能である。

また、質量対電荷比ではなくイオンを検出する時間や、イオンの質量そのものなど上記の情報に順ずるものを利用することも可能である。

次に選択ピークの測定強度の面積値（以下、ピーク面積と呼ぶ）を各溶出時間におけるマススペクトルの分析データごとに算出する（ステップ２００）。ここで算出するものは、ピーク面積以外にも、ピーク時の測定強度の絶対値、ピークの各測定点における測定強度の和など上記の情報に順ずるものを利用することも可能である。

次に全マススペクトルの分析データのピーク面積より、各マススペクトルの分析データのピーク面積の統計的指標を算出する（ステップ２０１）。ここで、算出するものはＺスコアまたは平均値であることが好ましいがこれに限定されるわけではない。

なお、以下本発明の実施例は、統計的指標としてＺスコアを用いた場合を例として説明する。

ここで、Ｚスコアとは一般的に統計的解析指標の一つであるＺスコアを言う。二つの単語の共起関係（相互の結び付き）の強さを表わす指標の１つで、値が大きいほど結びつきが強いことを示す。Ｚスコアの計算式は例えば以下のように表わされる。

Ｚスコア ＝ （観測データの平均−期待値の平均）／（√分散）
Ｚスコアを算出する際の前記期待値の平均は全マススペクトルの分析データより算出することが好ましいが、一定保持時間範囲内のマススペクトルの分析データや、一定間隔のマススペクトルの分析データなどから算出しても構わない。

こうして決定されたＺスコアが一定以上の負値（ステップ２０２）であるスペクトルをイオンサプレッションのおきているマススペクトルの分析データ、すなわち定量信頼性が低いマススペクトルの分析データであると判定する（ステップ２０３）。逆にＺスコアが一定以上の負値でないマススペクトルの分析データを定量信頼性が高いと判定する（ステップ２０４）。

本発明は、特にタンパク質や代謝産物の網羅的解析を目的とするプロテオーム解析やメタボローム解析など、生体由来試料のように質量分析の前段階に試料分離を実行しても、なお同一保持時間に多量の成分が含まれるような試料を測定する際のイオンサプレッションの検出に適用することが好ましい。

図３に示す実施例２について説明する。

本実施例では、Ｚスコアを算出するピークを複数選択し、定量信頼性を判定する。

図３に示すように、まず、２つ以上の選択ピークの面積値を算出する（ステップ３００）。各選択ピークの各マススペクトルの分析データにおけるＺスコアを算出する（ステップ３０１）。各選択ピークの定量信頼性を判定する（ステップ３０２）。

各選択ピークの定量信頼性が低いか判定する（ステップ３０３）。Ｚスコアが一定以上の負値である場合、該当選択ピークにおいて、該当マスペクトルの分析データの定量信頼性が低いと判定する。これを全選択ピーク・全マススペクトルに対して実施する（ステップ３０４）。

逆に各マススペクトルの分析データにおいて、全てあるいは一定数以上の前記判定結果において信頼性が高いと判定された場合、該当マススペクトルの分析データの定量信頼性が高いと判定する（ステップ３０５）。

図４に示す実施例３について説明する。

本実施例では、Ｚスコアを算出する選択ピークを、試料の分離手段からの溶出時間あるいは、質量分析システムの測定条件に応じて変更可能とする。

図４に示すように、測定時間Ｔ１−Ｔ２間はピーク４０１の、Ｔ２−Ｔ３間はピーク４０２のＺスコアを用いて、各マススペクトルデータの定量信頼性を判定する。

この場合、Ｚスコアを算出する際に用いる期待値の平均は、ピーク４０１はＴ１−Ｔ２間、ピーク４０２はＴ２−Ｔ３間からそれぞれ算出することが好ましい。

図５の（図５Ａ、図５Ｂ）に示す実施例４について説明する。

本実施例では、Ｚスコアを算出する際に、選択ピークの測定強度に対し保持時間に応じた補正を実施する。

例えば、図５Ａに示すように、保持時間と共に選択ピークの測定強度が一次関数的に変化すると予測される場合、保持時間に応じた予想増分値を差し引いた、図５Ｂに示すような選択ピークの測定強度の補正値をもとにＺスコアを算出する。さらにはこの補正係数はユーザが任意に指定できるよう定量分析システムを構成することが好ましい。

図６の（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）に示す実施例５について説明する。

本実施例では、定量信頼性に応じて、ユーザに対し定量分析結果の提示方法を変更する。

例えば、図６Ａに示すように、定量信頼性の高低をユーザに提示する、あるいは図６Ｂに示すように、定量信頼性の高い結果と低い結果を別に提示するようにするものである。さらには、定量信頼性の低い結果はユーザに提示しない、あるいは直接提示はせず別ファイルに保存するようにしても良い。さらには、図６Ｃに示すように上記各提示方法をユーザが任意に選択できるよう定量分析システムを構成することが好ましい。

以上、本発明の定量分析システムについて、具体的な実施の形態示して説明したが、本発明がこれらに限定されるわけではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、上記各実施形態、他の実施形態にかかる発明の構成及び機能に様々な変更・改良を加えることが可能である。

本発明の実施例に係るもので、質量分析システムの全体概略構成図である。 本発明に係る定量分析システムの実施例１の手順を説明する図である。 本発明に係る定量分析システムの実施例２の手順を説明する図である。 本発明に係る定量分析システムの実施例３について説明する図である。 本発明に係る定量分析システムの実施例４について説明する図である。 本発明に係る定量分析システムの実施例５について説明する図である。 本発明の実施例に係るもので、本発明の特徴を模式的に示した模式図である。

符号の説明

１０１…試料分離装置、１０２…イオン化部、１０３…質量分析部、１０４…検出器、１０５…データ処理部、１０６…制御部、Ｘ…横軸の時間、Ｙ…縦軸、Ｉ…出力強度、７０…時間の経過順に並ぶ波形、８１〜８４…質量対電荷比（Ｍ／Ｚ）の順に並ぶに連立するススペクトルの線列、８１２、８２２、８３２、８４２…ピーク。

Claims (7)

1. 成分のスペクトルが時間の経過順に並ぶように試料を分離する分離手段と、
   マススペクトルが質量対電荷比（Ｍ／Ｚ）の順に並ぶように前記各スペクトルの成分を分析する質量分析手段を含む質量分析システムにおいて、
   前記スペクトルの全部に及ぶ全マススペクトルの分析データより前記各スペクトルに存在する予め設定した所定の質量対電荷比のピークを選択する機能と、
   前記全マススペクトルの分析データから前記各スペクトルの分析データにおける前記ピークのＺスコアを算出する機能と、
   前記Ｚスコアを判定基準として、前記各スペクトルの分析データの定量信頼性を判定する機能を有することを特徴とする質量分析システム。
2. 請求項１記載の質量分析システムにおいて、
   前記ピークを２つ以上選択し得る機能を有することを特徴とする質量分析システム。
3. 請求項１記載の質量分析システムにおいて、
   前記ピークを前記分離手段からの溶出時間に応じて変更可能な変更機能を有することを特徴とする質量分析システム。
4. 請求項１記載の質量分析システムにおいて、
   前記統計的指標を算出する際に、前記ピークに対し前記分離手段からの溶出時間に応じて係数補正を実施し前記統計的指標を算出する係数補正機能を有することを特徴とする質量分析システム。
5. 請求項１記載の質量分析システムにおいて、
   前記各マススペクトルの分析データの定量信頼性の判定結果をユーザに提示する機能を有することを特徴とする質量分析システム。
6. 請求項１記載の質量分析システムにおいて、
   前記成分としてタンパク質、代謝産物が分析可能であることを特徴とする質量分析システム。
7. 請求項１記載の質量分析システムにおいて、
   前記ピークを生成する内部標準試料が前記試料に含まれることを特徴とする質量分析システム。

Images