KR102200233B1 - 엑소좀 검출 및 간질환 진단을 위한 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질량 분석에 의하여 빠르고 간편하게 엑소좀을 검출하고, 간질환을 감별진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있는 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 새로운 엑소좀 마커 및 간질환 진단용 마커를 이용하여 질량분석에 의해 엑소좀을 검출하고, 간질환을 감별진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있는 분석 방법에 관한 것이다.

Description

엑소좀 검출 및 간질환 진단을 위한 분석 방법{Analytical Method for Detecting Exosome Fraction and Diagnosing Liver Disease}

본 발명은 질량 분석에 의하여 빠르고 간편하게 엑소좀을 검출하고, 간질환을 감별진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있는 분석 방법에 관한 것이다.

살아있는 거의 모든 세포는 단백질, 핵산 및 지질을 함유하는 구형의 이중 인지질막 형태의 소포체를 분비하며, 이를 세포외 소포(EVs, extracellular vesicles)라 한다. 건강한 세포와 사멸 세포 모두는 직경 30~10,000 nm 범위의 세포외 소포를 방출한다. 세포외 소포는 엑소좀, 미세소포 또는 세포 사멸체(apoptotic body)의 형태로 체액(biological fluids) 내에 존재하며, 최근 세포내 의사소통과 세포간/세포내 주요한 생리학적 및 병리학적 과정에 관여한다는 것이 알려지고 있다.

엑소좀은 엔도좀의 성숙과정 중의 소포인 다중소포체(MVBs, multivesicular bodies)가 플라즈마 멤브레인과 융합하며 세포외 환경으로 배출된 평균 입경 30~100 nm의 작은 세포외 소포이다. 엑소좀에는 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 방출된 엑소좀은 다른 세포에 융합할 수 있기 때문에, 한 세포에서 다른 세포로 생체 분자들을 수송할 수 있으며, 수송된 생체 분자를 통하여 세포와 세포 사이의 통신을 매개할 수 있다. 예를 들어, 저산소 상태에 놓은 종양세포는 혈관의 형성과 암의 전이를 촉진시킬 수 있는 생체분자를 포함한 엑소좀을 방출하는 것이 보고되었다. 혈류에서 엑소좀의 모폴로지 및/또는 농도의 변화는 특정 질환의 단계와 관련지을 수 있으며, 암의 단계와 화학방사선 요법과 같은 임상 치료에 대한 반응을 추정하는 데 사용할 수 있다. 이에 액체생검을 통한 엑소좀의 분석에 의해 질병을 진단, 치료, 예후 확인하려는 다양한 임상 연구가 시도되고 있다. 조직생검은 외과수술을 필요로 하기 때문에 환자에게 부담이 크며, 환자의 상태, 조직의 위치에 따라 시행이 어려운 경우도 있다. 그러나 액체생검은 기본적으로 혈액을 대상으로 하기 때문에 빠르고 간편하다는 장점이 있으며, 위양성 판명 가능성도 낮은 편이다.

엑소좀의 효과적인 분리나 농축 방법은 엑소좀을 이용한 질병의 진단, 치료에 대한 연구에 필수적으로, 최근 생물 시료에서 엑소좀이 풍부한 분획을 제조하는 다양한 방법들이 개발되었다. 이들은 기본적으로 원심분리(원심분리, 초원심분리 또는 차등원심분리), 초미세여과, 크기-배제 크로마토그라피 또는 면역활성-기반 방법 등에 초점이 맞춰져 있다(Kim 등 2015, Kang 등 2017, Li 등 2017, An 등 2018). ExoQuant(Biovision, Mountain View, CA, USA), Total Exosome Isolation Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 Exosome Isolation and Analysis Kit(Abcam, Cambridge, UK)와 같이 우수한 선택성과 감도로 엑소좀을 빠르게 풍부화하기 위한 상품들도 개발되었다.

엑소좀 풍부 분획의 분리 후 엑소좀의 존재는 주로 엑소좀 마커 단백질인 CD81, CD9, LGALS3BP 또는 HSPA8을 면역화학반응에 기반한 면역검출 방법을 사용하거나 전자 현미경으로 관찰하여 확인한다. 면역검출 방법에서 항체에 결합한 단백질은 컨쥬게이션된 이차 항체를 사용하여 가시화한다. 웨스턴블랏이나 ELISA와 같은 면역검출 방법은 선택성과 감도가 탁월하지만, 반응 조건이 엄격하고 시간이 많이 소요되는 다단계 공정을 필요로 한다. 전자 현미경은 엑소좀의 특징적인 모양을 관측하는 것으로 간편하기는 하지만 단순히 물리적인 특성만을 관측할 수 있어 정보가 제한적이다.

지방간은 간내 과도한 지방이 축적되어 발생하며, 일반적으로 간 무게의 5% 이상의 지방이 쌓이면 지방간으로 진단한다. 지방간은 과음으로 인한 알콜성 지방간과 술과 관계없이 비만, 당뇨, 고지혈증과 연관되어 발생하는 비알콜성 지방간으로 나눌 수 있다. 일반적으로 알콜성 지방간은 술을 끊으면 거의 대부분 정상으로 회복되나, 지방간에서 음주를 계속하는 경우 약 20% 내외가 간염을 거쳐 간경변증으로 발전한다. 비알콜성 지방간은 가벼운 지방간에서부터 지방간염, 간경변증에 이르는 다양한 병을 포함한다. 지방간염은 간에 지방이 축적될 뿐 아니라 괴사되는 염증 징후가 동반되는 것으로, 원인은 지방간과 비슷한 것으로 생각되나 어떤 경우에 지방간이 되고, 어떤 경우에 지방간염이 진행되는 지는 잘 밝혀져 있지 않다. 또한 단순 지방간은 심각한 간질환으로 진행되지 않는 경우가 대부분이지만, 지방간염은 장기간 관찰 시 10~20%가 간경변증으로 진행하는 것으로 알려져 지방간과 지방간염의 구별이 중요하다.

지방간의 진단은 혈액검사, 초음파, CT, MRI와 같은 영상의학적 검사나 조직검사에 의해 이루어진다. 혈액검사는 혈액을 통해 간기능을 검사하는 것으로, 가장 간단한 방법이지만 다른 간질환이 배제될 경우에만 지방간으로 진단이 가능하다. 혈액검사에 의하면 알콜성 지방간과 비알콜성 지방간을 구분할 수 있지만, 지방간과 지방간염은 구별이 불가능하다. 초음파는 CT나 MRI에 비해 간단하고 효과적인 영상의학적 검사방법으로, 구조물의 밝기로 지방간을 진단하고 경도, 중등도, 중증으로 나눌 수 있으나, 초음파 검사만으로 지방의 양이나 지방간염 혹은 간경변증으로의 진행을 판단할 수 없다. 간 조직검사는 간내 지방의 침착정도를 정확히 알 수 있으며, 동반된 염증이나 섬유화를 통해 장기 예후를 판단할 수 있다. 그러나 출혈, 감염, 장기 손상과 같은 합병증의 위험이 있다. 따라서 간질환, 특히 지방간의 정확한 진단을 위한 간단한 방법이 요구된다.

한편, FTICR-MS(Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry)는 가장 강력한 질량 분석 기법이다. 간략하게는 고자기장 내에서 여기된 이온의 질량 차이가 사인파(sine waves)의 중첩으로 이루어진 시그날의 패킷들로 이루어지며, 이는 퓨리의 변환에 의해 정확한 질량 데이터로 판독될 수 있다. FTICR-MS는 비파괴적인 방법으로, 데이터 수집 횟수를 증가시키거나 더 강한 자기장을 적용할수록 분해능이 더욱 향상된다. 세계에서 가장 고자장 자석은 21 Tesla까지 자기장을 발생시킬 수 있으며, m/z 400에서 2,7000,000(FWHM, full width half maximum)을 제공하여 높은 질량 정확도(parts-per billion)로 몰 질량을 측정할 수 있다. FTICR-MS와 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization)나 전자분무 이온화와 같은 소프트 이온화 기술(soft ionization technique)을 접목하면 거의 정확한 분자량과 분자구조에 대한 신뢰성 있는 정보를 얻을 수 있다. 더 광범위하게 사용되는 이중 질량 분석법(MS/MS)에 비해 FTICR-MS의 주요한 장점은 분석물을 온전하게 보전하면서 작업 질량 범위가 더 넓어 시료의 제작과 데이터 분석이 단순하다는 것이다.

Kim, J.; Tan, Z.; Lubman, D. M. Exosome Enrichment of Human Serum Using Multiple Cycles of Centrifugation. Electrophoresis 2015, 36 (17), 2017-2026. Kang, H.; Kim, J.; Park, J. Methods to Isolate Extracellular Vesicles for Diagnosis. Micro Nano Syst. Lett. 2017, 5 (1), 15. Li, P.; Kaslan, M.; Lee, S. H.; Yao, J.; Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics 2017, 7 (3), 789-804. An, M.; Wu, J.; Zhu, J.; Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. J. Proteome Res. 2018, 17 (10), 3599-3605.

본 발명은 새로운 엑소좀 바이오마커를 이용한 질량분석에 의해 탁월한 감도로 빠르고 간편하게 엑소좀을 검출할 수 있도록 하는 엑소좀 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 질량분석을 이용하여 간질환을 진단 및 감별할 수 있는 바이오마커를 제공하고, 이에 의해 간질환을 진단 및 감별할 수 있는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 시료로부터 엑소좀의 농축을 위하여, 시료 분획의 질량분석에 의해 PLF4(Platelet factor 4) 단백질을 마커로 하여 엑소좀을 검출하는 것을 특징으로 하는 엑소좀 검출 방법에 관한 것이다.

단백질과 같은 고분자는 구조가 복잡하고 열에 약하기 때문에 이온화를 위해 에너지를 가하면 이온화되기 전에 이미 변성이 되어 본래의 화학적 구조를 알 수 없다. 이에 이온화 시 고분자 원래시료의 성질을 잃지 않은 상태에서 시료의 이온화가 가능한 소프트 이온화 기술인 MALDI 또는 전자분무 이온화 방법에 의한 것이 바람직하다. 또한 실시예에서 확인할 수 있듯이, 상기 이온화 방법에 FTICR을 접목하는 경우 더욱 신뢰성 있는 정보를 얻을 수 있다.

실시예에서 확인할 수 있듯이, 엑소좀 분획에서는 PLF4 단백질에 기인한 m/z(+1), m/z(+2) 피크가 각각 7,765 및 3,883에서 주피크로 관측되었으며, PLF4의 Na 및 K 부가체에 기인한 피크 역시 관측되었다. 또한 동위원소 피크 패턴에 의해서도 해당 피크가 PLF4 단백질에 기인한 것임을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 PLF4 단백질 및 그 동위원소와 부가체의 피크들이 모두 확인될 수 있도록 본 발명의 엑소좀 검출을 위한 질량 분석은 m/z 3,000~10,000 범위의 질량을 포함하여 분석하는 것이 바람직하다. 상기 범위에서 PLF4 단백질은 분자량 및 동위원소 피크 패턴에 의해 확인이 가능하다.

본 발명은 또한 잠재적인 간질환자의 혈청 시료의 질량분석에 의해 m/z 7,920, 8,127, 8,932, 9,190 및 9,436의 피크를 검출하는 것을 특징으로 하는 간질환의 진단을 위해 필요한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 혈청시료 그 자체를 시료로 사용할 수도 있지만, 혈청 시료 내 존재하는 여러 가지 다른 성분으로 인한 피크들로 인한 혼동을 줄이기 위해서 간질환 혈청 시료로부터 분리된 엑소좀 풍부 분획을 시료로 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 엑소좀 풍부 분획을 제조하는 방법은 종래 기술에 다양한 방법이 알려져 있으며, 본 발명에서는 엑소좀 풍부 분획의 제조방법이 아닌 풍부 분획을 사용한 응용에 관한 것이므로 그 제조방법에 대한 언급은 생략한다.

질량 분석에서 상기 다섯 개의 피크들은 정상인에게서는 검출되지 않았으나, 간질환자들의 시료에서는 공통적으로 검출되었다. 따라서 간질환 여부를 판정할 때의 바이오마커로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 바이오마커들에 의하면 단순히 간질환의 유무를 진단할 수 있을 뿐 아니라, 간질환의 종류를 감별할 수 있다. 예를 들면, 알콜성 간염과 약물 유발성 간질환, 비특이적 간염은 m/z 7,766 피크에 대한 m/z 8,932, 9,190 및 9,436 피크의 상대 강도가 낮아 이를 정량에서 측정하는 것에 의해 지방간과 지방간염으로부터 감별이 가능하였다. 상기 값을 이용하면 알콜성 간염 역시 약물 유발성 간질환과 비특이적 간염으로부터 감별이 가능하였다. 실시예에서는 상기 각 피크의 상대강도를 5를 기준으로 하였으며, 알콜성 간염의 감별을 위해서는 추가적으로 m/z 8,932의 피크에 대한 상대 강도 값을 사용하였으나 임계 값은 추가적인 데이터의 수집에 의해 더욱 정교화할 수 있을 것으로 기대된다.

마찬가지로 m/z 8,127에 대한 m/z 7,920 및 8,932 피크의 상대 강도 값을 사용하면 지방간과 지방간염을 감별할 수 있었다. 예를 들어, 8,932/8127이 0.7 이하이면서, 7,920/8,127가 0.9 이하라면 단순 지방간으로, 나머지 경우는 지방간염으로 판정할 수 있다. 이 경우 지방간염은 모두 지방간염으로 판단하면서도 단순 지방간을 지방간염으로 판단한 것은 14%에 불과하였다. 그러나 단순 지방간 환자와 지방간염 환자를 대상으로 한 많은 데이터가 누적된다면, 더욱 정교한 기준치의 설정이 가능하고 그에 따라 위양성 또는 위음성으로 판단하는 오류를 더욱 낮출 수 있을 것이다.

이상과 같이 본 발명의 엑소좀 바이오마커에 의하면, 질량분석에 의해 빠르고 간편하며 높은 감도로 엑소좀을 검출할 수 있어 엑소좀의 분리 및 풍부 분획을 제조하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 예에 의한 간질환 바이오마커는 단순히 간질환 여부를 진단하는 것에 그치지 않고, 환자의 부담없이 간단한 방법에 의해 높은 확률로 감별하는 것이 가능하여 간질환의 감별 진단에 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1은 엑소좀 분획의 웨스턴 블랏 및 FM-SEM 이미지.
도 2는 정상인의 엑소좀 분획의 MALDI-FTICR 질량 스펙트럼.
도 3은 PLF4 단백질의 동위원소 분석 결과 및 시뮬레이션 결과를 보여주는 질량 스펙트럼.
도 4는 혈청 및 엑소좀 농축 단계별 시료의 MALDI-FTICR 질량 스펙트럼.
도 5는 정상인의 엑소좀 분획의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼.
도 6은 간질환별 마커 피크의 상대 강도를 보여주는 그래프.
도 7은 지방간 및 지방간염에서 마커 피크의 상대 강도를 보여주는 그래프.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

[실시예]

실시예 1 : 혈청으로부터 엑소좀 풍부 분획의 분리

정상인의 혈청 시료는 Innovative Research(Novi, MI, USA)로부터 입수하였다. 종래 보고된 KIM 등(2015)의 방법에 의해 혈청으로부터 엑소좀 풍부 분획을 분리하였다. 간략하게, 혈청 시료(1, 2 또는 4 mL)를 PBS 완충액으로 2배 희석하였다. 희석된 시료는 2,000×g, 12,000×g로 원심분리하고, 0.2㎛ 멤브레인으로 여과하고, 40,000×g에서 120분과 75분씩 4번 총 5번 다시 원심분리하였다. 각각의 원심분리 후에는 상등액을 제거하고 PBS 완충액을 추가하였다. 5번째 원심분리 후 100 ㎕ PBS 완충액을 엑소좀 펠렛에 첨가하였으며 추가적인 분석 전에 -20℃에서 저장하며 시료로 사용하였다.

실시예 2 : 단백질 정량 및 엑소좀의 웨스턴블랏 및 전자현미경 분석

상등액과 엑소좀 펠렛에 포함된 단백질의 양을 BCA assay test kit(Thermo fisher Scientific)를 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 검출하였다. BCA 에세이에 의해 결정된 엑소좀 단백질은 1 mL 혈청 당 2.4 ㎍이었다. 다섯번의 원심분리 공정에서 얻어진 상등액에 포함된 단백질의 농도는 각각 9,800, 210, 6.1, 1.8 및 0.7 ㎍/mL로 빠르게 감소하였다. 따라서 비-엑소좀(non-exosome) 단백질은 엑소좀 시료로부터 처음 세 번의 원심분리 시에 대부분 제거되었음을 확인할 수 있었다.

펠렛 중 엑소좀의 존재는 엑소좀 단백질 마커인 CD63 항체의 존재를 확인하는 웨스턴 블랏에 의해 확인하였다. 강한 면역분석 시그널을 얻을 수 있도록 2 mL 또는 4 mL의 혈청 시료로부터 제조한 상대적으로 높은 엑소좀 수준을 포함하는 펠렛을 분석에 사용하였다. 도 1의 (a)는 웨스턴 블랏 결과를 보여주는 전기영동 이미지로 (1)은 4mL 혈청 시료, (2)는 2mL 혈청 시료의 결과이며, (3)은 0.25 pg 표준 CD63 단백질의 전기영동 이미지로 펠렛 중 엑소좀 마커인 CD63이 존재함을 확인할 수 있다.

엑소좀 풍부 분획을 추가적으로 확인하기 위하여 FE-SEM(S4800, Hitachi, Tokyo, Japan) 분석을 실시하였다. FE-SEM 분석을 위하여 1 mL 혈청을 사용하여 제조한 엑소좀 풍부 분획을 10 배 희석한 시료 1 ㎕를 실리콘 웨이퍼에 로딩하고 건조하였다. 표면 전하 효과를 줄이기 위하여, FE-SEM 측정 전에 DC 플라즈마 208HR sputter coater(Cressington Scientific Instruments, Watford, UK; 20 mA, 30 s)를 사용하여 금을 코팅하였다. 도 1의 (b)는 엑소좀 분획의 FE-SEM 이미지로 엑소좀의 직경이 30~100 nm 범위에 있음을 확인할 수 있다.

실시예 3 : 질량분석에서 엑소좀 마커의 확인

각 원심분리 단계에서 얻은 상등액과 엑소좀 풍부 분획(펠렛) 및 전혈장 시료에 함유된 단백질의 특성을 MALDI-FTICR-MS로 분석하였다. 각 시료 10㎕를 진공 하에서 동결건조하고, 70% FA(formic acid) 용액 5㎕를 첨가하였다. 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합한 후에, 추가로 5㎕ 아세토니트릴(ACN)을 첨가하고 13,000 rpm(15,000×g)에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 상등액 시료를 다음과 같은 수정된 layer-by-layer 시료 준비 공정에 따라 표준 MALDI stainless stell plate 상에 로딩하였다: 먼저 1.5 ㎕ 시료를 플레이트에 로딩하고 상압에서 건조한 후, 1.5 ㎕ CHCA(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) 매트릭스 용액(10 mg/mL CHCA/ACN:물 [1:1] + 2.5% TFA)을 시료 위에 가하였다. m/z 1,000~20,000 범위의 질량을 정확하게 측정할 수 있도록, 사이토크롬 c(100 ㎍/mL)와 미오글로빈(500 ㎍/mL) 혼합물을 함유하는 보정제(calibrant)를 동일한 방법으로 별도의 스팟에 로딩하였다.

FTICR-MS 스퍽트럼은 Nd:YAG 레이저(355nm)가 장착된 Bruker 15-T SolariX (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) 장비로 각 스펙트럼에 대해 40회의 고에너지 레이저를 가하여 MALDI 양이온 모드에서 측정하였다. 질량 정확도를 향상시키고 고 S/N 비를 유지하기 위하여, 고정된 스팟에서 20개의 스펙트럼을 평균하였다. 15-T FTICR-MS 시스템은 해상도가 매우 높아(m/z 4,000에서 >160,000 [FWHM], m/z 8,000에서 >80,000 [FWHM]), MALDI-FTICR 질량 분석에서 단백질 피크를 결정하는 데 충분한 해상도를 제공한다.

MALDI-FTICR-MS는 Bruker Daltonics DataAnalysis 소프트웨어를 사용하여 보정 및 가시화하였다. 질량 스펙트럼은 사이트크롬 c(m/z(+1) : 12,359.3423; m/z(+2) : 6,180.1748)와 미오글로빈(m/z(+1) : 16,951.9997; m/z(+2) : 8,476.5035)의 혼합물을 함유하는 용액의 가장 풍부한 동위원소 피크들을 사용하여 보정하였다. 선형 보정을 적용하였으며, 그 결과 m/z 1,000~20,000에서의 평균 질량 오차는 2.0 ppm이하였다.

도 2는 실시예 1에서 정상인 혈청시료 1 mL 시료로부터 분리한 엑소좀 풍부 펠렛의 MALDI-FTICR 질량 스펙트럼이다. +1 및 +2 전하에 대해 가장 강도가 높은 동위원소 피크는 각각 m/z 7,765.191과 3,883.097이었다. 본 스펙트럼의 디컨볼루션 결과는 하나의 단백질이 우세하게 존재함을 나타낸다. 해당 단백질의 Na 및 K 부가체의 +1 상태 역시 원래 단백질 피크에 대해 m/z+22 및 +38 위치에서 각각 관측되었다. 이러한 부가체는 레이저 조사동안 매트릭스로부터 염의 분해에 의해 생성된다.

검출된 단백질 피크의 동정은 TagIdent tool(SIB Swiss Institute of Bioinformatics)을 사용한 데이터 검색에 의해 수행하였다. 실험 단백질 클러스터(m/z 7765.2)의 m/z 값을 질량 허용 오차 0.1 %(7,757.4348-7,772.9652 Da)인 인간의 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에서 가능한 모든 태그 순열에 대해 검색하고, 번역 후 수식(post-translational modification, PTMs) 또는 실험 오차로 인한 이동에 의해 야기된 편차를 허용하도록 하였다. TagIdent 검색 결과 세 개의 잠재적인 단백질이 도출되었으며, 이를 표 1에 기재하였다.

표 1에 기재된 각각의 단백질에 대한 동위원소 피크 패턴을 시뮬레이션하고 이를 실험 데이터와 비교하여, 엑소좀 풍부 분획에 함유된 단백질을 PLF4(Platelet factor 4, C₃₄₁H₅₇₇N₉₆O₁₀₁S₄)로 동정하였다. 동의원소 패턴에 대한 시뮬레이션은 Bruker MALDI-MS DataAnalysis package에 포함된 IsotopePattern program을 사용하여 수행하였으며, 질량 스펙트럼과 시뮬레이션 결과는 Origin software를 사용하여 재생성하였다. 도 3은 PLF4 단백질의 시뮬레이션 피크와 엑소좀 풍부 분획에 대한 실험 데이터를 비교하여 도시한 결과로 패턴이 정확하게 일치하는 것을 확인할 수 있다. 대표적인 동위원소 피크의 상대적인 강도는 표 2에 나타내었다.

MALDI-MS를 이용한 엑소좀 분석에서 엑소좀 마커로 PLF4에 해당하는 피크를 이용할 수 있는 지 확인하기 위하여, 엑소좀 풍부 분획의 MALDI-FTICR 질량 스펙트럼을 전체 혈장 및 각 원심분리 단계의 상등액의 질량 스펙트럼과 비교하였다. 도 4는 각 시료의 질량 스펙트럼으로, m/z 1,000~20,000 범위의 질량을 분석하였다. 엑소좀 풍부 분획은 m/z 7,766 부근의 하나의 주된 피크 클러스터를 보여주며, 이는 PLF4에 해당한다. 전혈장에서는 PLF4의 피크 클러스터와 강하거나, 비슷한 강도의 피크 클러스터가 다수 관찰되었다. 1차 상등액에서는 PLF4 피크가 약하게 관찰되었으나, 2차 상등액과 3차 상등액에서는 PLF4가 거의 검출되지 않았다. 도시하지는 않았으나 4차 및 5차 상등액에서는 독특한 피크 클러스터가 관측되지 않아 5차의 원심분리에 의해 비-엑소좀성 단백질이 모두 제거되었음을 확인할 수 있었다. 또한 엑소좀 분획은 m/z 1,000~20,000 범위에서는 PLF4의 m/z(+1) 7,765.16Da 및 m/z(+2) 3,389.09가 거의 유일한 주된 피크로, PLF4가 엑소좀 마커로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

추가적으로 엑소좀 풍부 분획에서 PLF4를 통상의 MALDI-TOF MS 장비를 사용하여 검출할 수 있는 지 확인하였다. 시료는 MALDI-FTICR-MS 분석과 동일한 방법에 의해 제작하였으며, Nd-YLF laser(349 nm)가 장착된 ASTA IDSys MALDI-TOF MS 장비를 사용하여 양이온 반사 모드에서 측정하였다. 도 5는 그 결과 얻어진 질량 스펙트럼으로 PLF4 단백질에 기인한 피크가 주 피크로 m/z 7,766 및 3,882에서 관측되었다.

실시예 4 : 간질환의 진단

생검에 의해 알콜성 간염(5명), 비알콜성 지방간(NAFLD)(15명 - 단순 지방간 6명; 비알콜성 지방간염(NASH) 9명), 약물 유발성 간질환(6명) 및 비특이적 간염(2명)으로 확인한 28명의 간질환자로부터 혈액 시료를 제공받았다. 모든 환자들로부터 혈청을 실험에 사용하고 그 결과를 공개할 것이라는 동의서를 받았으며, 시료 수집과 시험은 고려대학교 구로병원의 임상시험위원회의 승인을 받았다(KUGHI6089-001). 제공된 전혈시료로부터 원심분리에 의해 혈청을 분리하고 -20℃에 보관하며 사용하였다.

실시예 1과 동일한 방법에 의해 혈청으로부터 엔도좀 풍부 분획을 분리하고, 이를 MALDI-TOF MS로 분석하였다. 각 군의 엑소좀 풍부 분획의 MALDI-TOF 질량 분석 스펙트럼에서는 정상인으로부터 얻은 엔도좀 풍부 분획과는 달리 PLF4에 해당하는 m/z 7,766 피크 이외에도 m/z 7,920, 8,127, 8,932, 9,190 및 9,436 피크들이 관측되었다. 이 중 m/z 7,920과 8,127 피크는 도 4의 (b)의 정상인의 전혈장 시료에서는 관측되었으나, 엔도좀 풍부 분획에서는 관측되지 않았었으며, m/z 8,932, 9,190 및 9,436 피크는 전혈청이나 엔도좀 풍부 분획 모두에서 관측되지 않았다.

m/z 7,766 피크에 대한 상기 5개의 특징적인 피크에 대해 상대적인 피크 강도를 도 6에 평균값 및 표준오차로 도시하였다. 도 6에서, 지방간 관련 질환(단순 지방간 및 지방간염)은 5개의 피크가 모두 상당 강도로 관측된 것에 반해, 이 외 질환은 m/z 8,932, 9,190 및 9,436 피크의 강도가 현저하게 낮아 지방간 관련 질환을 다른 간질환으로부터 명확하게 구분되는 것을 볼 수 있다. 실제로 약물 유발성 간질환이나 비특이적 간염 환자 모두는 상기 세 개의 피크 모두 m/z 7,766 피크에 대한 상대 강도가 5보다 작았으며, 알콜성 간염은 약물 유발성 간질환이나 비특이적 간염에 비해서는 세 개의 피크 강도가 약간 높아 상대적 피크 강도가 5 이상인 피크가 포함되었지만 모두 10보다는 작았으며, 상대 강도가 5보다 작은 피크에 대해 m/z 8,932인 피크에 대한 상대 강도가 5보다 큰 것을 특징으로 하였다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, 단순 지방간과 지방간염에 대해서는 7,920/8,127 및 8,932/8,127의 피크 비율을 사용하여 감별이 가능하였다. 예를 들어, 7,920/8,127이 평균값인 0.9보다 큰 경우 지방간염이라고 판정하고, 7,920/8,127이 0.9 이하인 경우에는 추가로 8,932/8127의 값을 추가로 확인하여 평균값인 0.7보다 크다면 지방간염일 것으로 진단하는 경우 모든 지방간염 환자들을 양성으로 판정할 수 있었다. 이 경우 단순 지방간 환자들은 50%가 지방간염에 대해 위양성으로 판단되었다. 반대로 8,932/8127이 0.7보다 크다면 지방간염으로 판정하고, 0.7 이하인 경우에는 추가로 7,920/8,127 값을 확인하여 평균값인 0.9보다 크다면 지방간염으로 판정하는 경우 역시 모든 지방간염 환자들을 양성으로 판단할 수 있었다. 이 경우 단순 지방간 환자를 지방간염으로 판단한 것은 14%에 불과하여 더욱 높은 정확도로 판정이 가능하였다.

만일 더 많은 수의 환자에 대해 데이터가 축적된다면 더욱 정확한 기준점의 설정이 가능할 것이며, 따라서 더욱 높은 정확도로 질병의 감별이 가능할 것이다.

Claims (8)

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5. 잠재적인 간질환자의 혈청 시료의 질량분석에 의해 m/z 7,920, 8,127, 8,932, 9,190 및 9,436의 피크 중 하나 이상의 피크를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
   알콜성 간염, 비알콜성 지방간, 약물유발성 간질환 또는 비특이적 간염인 간질환의 진단을 위해 필요한 정보의 제공 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   혈청 시료로부터 분리된 엑소좀 풍부 분획을 질량분석하는 것을 특징으로 하는 정보의 제공 방법.
   
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
   지방간과 지방간염으로부터 알콜성 간염과 약물 유발성 간질환, 비특이적 간염을 감별하기 위하여,
   PLF4 단백질의 분자량 피크에 대한 m/z 8,932, 9,190 및 9,436 피크의 상대 강도를 정량 측정하는 것을 특징으로 하는 정보의 제공 방법.
   
8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
   지방간과 지방간염의 감별을 위하여 m/z 8,127에 대한 m/z 7,920 및 8,932 피크의 상대 강도를 정량 측정하는 것을 특징으로 하는 정보의 제공 방법.

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