ES2885691T3

ES2885691T3 - Método de caracterización de una muestra mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas

Info

Publication number: ES2885691T3
Application number: ES15759917T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Stauber; David Bonnel; Fabien Pamelard; De Muller Gaël Picard
Original assignee: Imabiotech
Current assignee: Imabiotech
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2015-08-24
Publication date: 2021-12-15
Anticipated expiration: 2035-08-24
Also published as: EP3195345A1; CN106796197A; FR3025317A1; EP3195345B1; KR20170047337A; FR3025317B1; US20170221687A1; AU2015308264A1; DK3195345T3; US10141168B2; JP2017529527A; JP6860475B2; WO2016030621A1; CA2959111C; CA2959111A1

Abstract

Procedimiento de identificación mediante la obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) de una molécula de interés en una muestra de interés escogida entre un tejido biológico y un líquido biológico, según el cual: i) se analiza una disposición espacial de una pluralidad de iones en la muestra de interés a partir de datos de MSI de dichos iones en dicha muestra para determinar características morfométricas que definen formas geométricas y dimensiones matemáticas asociadas a esas formas geométricas y/o características de textura que definen una disposición de las formas geométricas entre ellas asociadas a dichos iones en dicha muestra; ii) se comparan las características morfométricas y/o de textura asociadas a la pluralidad de iones en dicha muestra de interés con datos morfométricos y/o de textura asociados a una pluralidad de iones en una muestra de referencia; iii) se identifica al menos un ion característico de la muestra, que presenta características morfométricas y/o de texturas diferentes respecto de las que hay en la muestra de referencia; iv) se identifica la molécula correspondiente a dicho ion identificado en la etapa iii).

Description

DESCRIPCIÓN

Método de caracterización de una muestra mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas

Campo técnico

La invención se refiere a un método de caracterización de una muestra utilizando imágenes por espectrometría de masas. Más particularmente, la invención propone utilizar datos de imágenes obtenidas por espectrometría de masas para extraer y medir datos morfométricos y/o de textura asociados a la distribución de uno o varios iones en una muestra. Asimismo, la invención propone utilizar tales datos morfométricos y/o de textura para identificar y/o seleccionar una o varias moléculas de interés en una muestra.

De manera general, la invención encuentra aplicaciones en cualquier campo en el que la caracterización de una muestra o de un compuesto en una muestra es útil o necesaria. Por ejemplo, la invención encuentra aplicaciones en el campo farmacéutico para identificar marcadores moleculares en diferentes tejidos biológicos, o en el campo del diagnóstico médico, para identificar un tipo de tejido y/o de célula en una muestra.

Estado de la técnica

La espectrometría de masas es una técnica ampliamente conocida y utilizada en análisis químico y en bioquímica para detectar e identificar moléculas de interés en una muestra. Desde hace algunos años, se ha desarrollado la obtención de imágenes moleculares mediante espectrometría de masas permitiendo visualizar la distribución de moléculas de interés directamente en una muestra. La técnica de imágenes por espectrometría de masas (MSI por sus siglas en inglés) agrupa todas las tecnologías de formación de imágenes que utilizan una fuente de ionización que permite localizar iones moleculares a partir de una muestra. Se pueden citar múltiples fuentes de ionización, como el láser, iones, gases, líquidos, disolventes, plasmas (fuentes solas o combinadas), microondas, electrones, que se pueden utilizar en la formación de imágenes, tales como DESI (por las siglas en inglés de “Desorption Electrospray Ionization”, ionización por electropulverización por desorción), LAESI (por las siglas en inglés de “Laser Ablation Electrospray Ionization”, ionización por electropulverización por ablación láser), MALDI (por las siglas en inglés de “Matrix Assisted Laser Desorption Ionization”, desorción e ionización láser asistida mediante matriz), SIMS (por las siglas en inglés de “Secondary ion Mass Spectrometry”, espectrometría de masas de ion secundario), MALDESI (por las siglas en inglés de “Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization”, ionización por electropulverización por desorción láser asistida mediante matriz) y LESA (por las siglas en inglés de “Liquid Extraction Surface Analysis”, análisis de superficie por extracción líquida) e ICP-MSI (por las siglas en inglés de “Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Imaging, obtención de imágenes mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente).

La técnica de obtención de imágenes mediante espectrometría de masas se utiliza actualmente principalmente para el análisis de tejidos biológicos. En efecto, es posible gracias a la MSI estudiar directamente la composición molecular de un tejido, o de un corte de éste, sin marcado mediante fluorescencia y sin radioactividad. Además, debido a su especificidad, la MSI permite discriminar e identificar iones detectados directamente en la muestra. De este modo, es actualmente corriente utilizar la MSI para el estudio o la investigación de marcadores moleculares endógenos en muestras biológicas de interés. Más precisamente, es posible analizar directamente la distribución de una molécula conocida concentrándose en un ion o en su relación de masa a carga (m/z). También es posible utilizar herramientas estadísticas, y en especial ACP (análisis de componentes principales), PLSA, T-test, ANOVA, u otra, para comparar al menos dos regiones de interés e identificar así una o varias moléculas específicas en una u otra de esas dos regiones (J. Stauber et al., J. Proteome Res., 2008, 7(3), páginas 969-978; D. Bonnel et al., Anal. Bioanal Chem, 2011). También se sabe utilizar métodos de segmentación durante el análisis de los espectros de una imagen de una muestra, con el fin de clasificar los espectros en función de la intensidad de los iones de dicha muestra. Así, se sabe caracterizar un tejido biológico en función del perfil de intensidad molecular de las zonas histológicas detectadas (T. Alexandrov et al., J. Cancer Res Clin Oncol, 2012, 139(1), páginas 85-95; T. Alexandrov et al., J. Proteomics, 2011, 75(1), páginas 237-245). Es entonces posible clasificar los tejidos en función de sus perfiles moleculares completos y no solamente en función del perfil espectral de algunos marcadores.

Sin embargo, todos los métodos de análisis de datos de MSI se basan actualmente en el estudio de los valores de intensidad asociados a las relaciones m/z. Más precisamente, durante la adquisición de una imagen de la muestra mediante MSI, se analiza dicha muestra con un haz de la fuente de ionización con el fin de registrar en cada punto de la muestra una media del espectro correspondiente a los iones detectados. El conjunto de datos registrados se presenta en forma de una matriz, con un espectro para cada coordenada de registro que contiene en una columna las diferentes relaciones m/z y en una segunda columna las correspondientes intensidades. A continuación, para un ion particular (es decir, para una relación m/z dada) que corresponde a un compuesto particular, la medida de la intensidad de este ion (o la integral del área del pico) permite obtener mediante programas de reconstrucción de imágenes el reparto de este ion (y, por lo tanto, del compuesto correspondiente) teniendo en cuenta la intensidad del pico con las coordenadas de registro y asignando a cada punto un píxel de color y/o de intensidad de color definida. De forma alternativa, se sabe también desfocalizar la fuente de ionización de forma que se analice toda o parte de la muestra en un solo disparo. Luego, se obtiene la localización gracias a un detector de posición (Luxembourg y col., Anal Chem 2004),

Sin embargo, no es posible discriminar dos muestras biológicas que tienen los mismos perfiles o firmas espectrales incluso cuando presentan organizaciones de tejidos y/o celulares diferentes. Se necesita entonces combinar el análisis por MSI con otro método de análisis de la muestra, tal como una coloración (inmunohistoquímica, historadiografía, etc), con el fin por ejemplo de identificar diferencias en la organización tisular de las dos muestras.

El artículo de Reichenbach et al. : “ Interactive spatio-spectral analysis of three-dimensional mass-spectral (3DxMS) chemical images” (“Análisis espacio-espectral interactivo de imágenes químicas tridimensionales de espectrometría de masas (3DxMS)”), Surface and Interface Analysis, vol. 43, páginas 529-534, DOI: 10.1002/sia.3553, describe una herramienta informática para la visualización interactiva de datos espacio-espectrales 3DxMS, que permite delimitar características espaciales tales como células o regiones en el seno de una célula.

El artículo de Casadonte et al. “ Imaging mass spectrometry to discriminate breast from pancreatic cancer metastasis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues” (“Obtención de imágenes por espectrometría de masas para distinguir metástasis de cáncer pancreático de cáncer de pecho en tejidos incorporados en parafina fijados con formalina”), Proteomics, vol. 14, páginas 956-964, DOI: 10.1002/pmic.201300430, describe la utilización de la obtención de imágenes mediante espectrometría de masas para clasificar el origen de metástasis cancerosas.

Resumen de la invención

Se propone utilizar datos de imágenes de una muestra (es decir, posiciones, valores de relaciones m/z, intensidades), obtenidos de forma clásica mediante espectrometría de masas, no solamente teniendo en cuenta los valores de intensidad asociados a los iones de dicha muestra, sino teniendo en cuenta además la disposición espacial de dichos iones en la muestra, y medidas que caracterizan dicha disposición espacial.

Se caracteriza una muestra en función de la morfología de la distribución y de las medidas asociadas (datos morfométricos) y/o de la textura de uno o varios iones en la muestra. Las formas y la distribución de las formas asociadas a la presencia de dichos iones en una muestra permiten obtener informaciones adicionales (superficie, forma, volumen, motivo o patrón, repetición, cantidad, dispersión, y los valores que se derivan de estas informaciones, tales como su relación, etc) respecto de las informaciones que se derivan de las intensidades espectrales. Es entonces posible caracterizar una muestra en función de las formas de al menos un ion en dicha muestra y/o de las dimensiones de estas formas y/o de su disposición en la muestra.

De este modo, es posible diferenciar dos muestras que presentan perfiles moleculares similares o idénticos. Asimismo, es posible identificar una muestra sobre la base de sus datos morfométricos y/o de textura, identificar moléculas de interés en una muestra centrándose por ejemplo en formas y/o texturas específicas, etc. Más generalmente, se propone caracterizar la morfometría y/o la textura de la distribución de uno o varios iones en una muestra y utilizar estos datos morfométricos y de textura como complemento o en sustitución de los datos espectrales de formación de imágenes.

Esta caracterización se puede combinar con los métodos actuales de tratamiento de los datos de las imágenes actuales que tienen en cuenta las intensidades, por ejemplo, y, más generalmente, con cualquier método de caracterización de una muestra, incluyendo tratamientos ópticos, físicos, mediante coloración, etc.

Se describe un método de caracterización de una muestra mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) según el cual se caracteriza una disposición espacial de al menos un ion en dicha muestra a partir de los datos de imágenes asociados a dicho ion, en términos de morfometría o de textura.

Dicho de otro modo, se mide y/o cuantifica la disposición espacial de al menos un ion en dicha muestra a partir de datos de MSI, con el fin de identificar formas, disposiciones de formas, medidas particulares y caracterizar, en consecuencia, la distribución de dicho ion en la muestra mediante estas características morfométricas y/o de textura.

De esta forma, la invención tiene por objeto un método de caracterización de una muestra escogida entre un tejido biológico y un líquido biológico mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI), que comprende las etapas según las cuales:

a) se adquieren datos mediante MSI, para al menos un ion en la muestra; luego

b) se mide y/o se cuantifica una disposición espacial de dicho al menos un ion en la muestra a partir de datos relativos a las posiciones de dicho al menos un ion en dicha muestra con el fin de identificar características morfométricas que definen formas geométricas y dimensiones matemáticas asociadas a esas formas geométricas y/o características de textura que definen una disposición de formas geométricas entre ellas, y caracterizar en consecuencia la distribución de dicho al menos un ion en la muestra por estas características morfométricas y/o de textura.

La invención tiene también por objeto un procedimiento de identificación mediante la obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) de una molécula de interés en una muestra de interés escogida entre un tejido biológico y un líquido biológico, según el cual:

i) se analiza una disposición espacial de una pluralidad de iones en la muestra de interés a partir de datos de MSI de dichos iones en dicha muestra para determinar características morfométricas que definen formas geométricas y dimensiones matemáticas asociadas a esas formas geométricas y/o características de textura que definen una disposición de las formas geométricas entre ellas asociadas a dichos iones en dicha muestra;

ii) se comparan las características morfométricas y/o de textura asociadas a la pluralidad de iones en dicha muestra de interés con datos morfométricos y/o de textura asociados a una pluralidad de iones en una muestra de referencia;

iii) se identifica al menos un ion característico de la muestra, que presenta características morfométricas y/o de texturas diferentes respecto de las que hay en la muestra de referencia;

iv) se identifica la molécula correspondiente a dicho ion identificado en la etapa iii).

Según un ejemplo útil para la comprensión de la invención, se describe también un procedimiento de identificación de una muestra mediante imágenes por espectrometría de masas en el cual:

i) se establece una base de datos, o un modelo, con datos morfométricos y/o de textura asociados a una pluralidad de iones de referencia, obtenidos a partir de varias muestras de referencia, siendo dichos datos morfométricos y/o de textura representativos de la disposición espacial de dichos iones de referencia en dichas muestras de referencia;

ii) se registran datos morfométricos que definen formas geométricas y dimensiones matemáticas asociadas a esas formas geométricas y/o datos de textura que definen una disposición de las formas geométricas entre ellas asociadas a al menos un ion en la muestra a identificar;

iii) se comparan datos morfométricos y/o de texturas asociados a los iones de la muestra a identificar con los datos morfométricos y/o de texturas asociados a los iones de referencia contenidos en la base de datos o el modelo.

Otro objeto de la invención consiste en un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por el ordenador y adaptadas para permitir a un sistema informático ejecutar el método de caracterización de una muestra y/o el procedimiento de identificación de una molécula de interés en una muestra según la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Ejemplo de representación de juegos de datos adquiridos mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas para dos muestras (1A y 1B), donde el blanco vale 0 y el negro un valor máximo.

Figura 2: Ejemplo de caracterización morfológica de datos de imágenes obtenidas por espectrometría de masas de muestras de tejidos pulmonares según la invención, que conduce a la identificación de tejido pulmonar patológico (vías respiratorias fibrosadas) por comparación con un tejido sano (vía respiratoria sana).

Figura 3: Ejemplo de recuento de las vías aéreas por morfometría mediante la puesta en práctica del procedimiento según la invención a juegos de datos de imágenes obtenidas por espectrometría de masas de dos muestras de vías aéreas de dos tejidos fibrosados.

Figura 4: Análisis y determinación de la superficie de las vías aéreas de pulmones de ratas por extrapolación de datos morfológicos obtenidos mediante el procedimiento según la invención a partir de los datos de imágenes se dichas muestras.

Figura 5: Representación de la distribución de dos iones en una muestra de piel mediante imágenes obtenidas por espectrometría de masas y caracterización de su disposición espacial en la muestra para la identificación de tejidos (por ejemplo, epidermis y estrato córneo).

Figura 6: representación esquemática de motivos y texturas obtenidos a partir de los juegos de datos de imágenes obtenidas por espectrometría de masas de un corte de tejido biológico en caja de Petri, mediante el procedimiento según la invención aplicado al recuento y caracterización de las células en dicho corte de tejido biológico.

Figura 7: Representación esquemática de diferentes criterios morfométricos para un ion objetivo que se pueden utilizar para discriminar dos regiones de interés en muestras A y B que presentan promedios de intensidades idénticos para dicho ion objetivo, que no permiten (ellos solos) diferenciarlas. Para un mismo promedio de intensidad para un ion dado la distribución puede así variar en cuanto al número de objetos, superficie del objeto, dispersión en la región de interés, forma, variabilidad de las superficies de un objeto a otro, etc.

Figura 8: representación esquemática de ciertas etapas del procedimiento de caracterización y/o de identificación según la invención que conduce a la extracción de criterios morfométricos para el ion que tiene un m/z de 91,5895 en una muestra: la imagen molecular se somete a una segmentación para obtener una imagen binaria que se trata de forma que se caracterice la distribución de dicho ion en número de objetos y superficie de dichos objetos.

Figura 9: Comparación para un tejido de referencia (tejido control) y un tejido de interés (tejido tratado) de la distribución del m/z 718,505 a nivel de la imagen molecular que muestra la intensidad de la distribución y la imagen binaria que pone de relieve la diferencia de superficie de la distribución de dicho m/z.

Exposición de la invención

En consecuencia, la invención tiene por objeto un método de caracterización de una muestra mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI), según la cual se caracteriza una disposición espacial de al menos un ion en dicha muestra a partir de los datos de imágenes asociadas a dicho ion, en términos de morfometría y/o de textura. Según la invención, la distribución del ion en la muestra no se caracteriza solamente en función de la intensidad, sino también en función de las formas y objetos que dibuja esta distribución y de las medidas asociadas (superficie, volumen, etc) y/o de la disposición de estas formas y objetos entre ellos. Entonces, es posible discriminar fácilmente dos muestras que, si bien presentan una intensidad promedio idéntica para un ion dado, presentan características morfométricas y/o de textura diferentes asociadas a dicho ion.

El método según la invención se puede aplicar a cualquier tipo de muestra que se puede analizar mediante un espectrómetro de masas bajo vacío (MALDI) o en atmósfera ambiente (LAESI, DESI), ya sea orgánico o inorgánico, líquido o sólido. Por ejemplo, el método según la invención se adapta particularmente a la caracterización de tejidos biológicos, de origen animal o vegetal.

Por “tejido” se entiende, de manera general, un conjunto de células del mismo origen y agrupadas en un conjunto funcional para contribuir a una misma función. En ciertos casos, se puede entender que un tejido es un órgano, un fragmento de órgano o una región específica de un órgano, que agrupa eventualmente varios conjuntos de células. Por ejemplo, el tejido puede ser un tumor localizado en el seno de un órgano.

En un ejemplo de aplicación, la muestra puede consistir en un corte histológico de tejido(s), cuyas regiones de interés se han caracterizado previamente mediante coloración y/o mediante sus firmas moleculares. Más generalmente, el método según la invención se puede utilizar para caracterizar más todas o parte de las regiones de interés de una muestra previamente identificadas mediante cualquier método del estado actual de la técnica.

Asimismo, el método según la invención se puede utilizar para caracterizar líquidos biológicos, como sangre, plasma, suero, saliva, líquido cefalo-raquídeo, orina, etc.

En el caso de una muestra líquida es posible secarla sobre una superficie con el fin de realizar la imagen de espectrometría de masas de la muestra secada, y luego caracterizar esta muestra mediante el método descrito. También es posible, en especial con un sistema de MSI de presión atmosférica, analizar la superficie de un líquido o de un disolvente.

El método según la invención puede utilizarse también para caracterizar muestras de vegetales.

Se entiende por “caracterizar una muestra” asociar propiedades distintivas y propias a dicha muestra, permitiendo dichas propiedades en especial discriminarla e identificarla entre otras muestras.

Según la invención se utilizan datos de imágenes y, más particularmente de los espectros, para determinar para un ion dado la disposición espacial que adopta en dicha muestra. De manera ventajosa, se utilizan más particularmente los datos asociados a una relación m/z, característica de un ion dado. En el contexto de la invención, la expresión “relación m/z”, o “relación masa a carga” designa una cantidad física característica de un ion, donde m representa la masa y z la valencia de dicho ion. En imágenes obtenidas por espectrometría de masas, un ion dado puede corresponder a varias relaciones m/z.

La “disposición espacial” o “distribución” de un ion o de una relación m/z se entiende de la o de las formas que dibuja o perfila la presencia de dicho ion o relación m/z en la muestra.

Según la invención, se determina la disposición espacial del o de los iones estudiados de forma que se les asocie una o varias formas, dimensiones, etc. Los datos de imágenes asociados a la presencia de al menos un ion en la muestra se utilizan para definir datos morfométricos y/o de textura representativos de la distribución de dicho ion en la muestra, independientemente de la variación de las intensidades asociadas a dicho ion en dicha muestra.

De manera ventajosa, la etapa de caracterización de la disposición espacial de al menos un ion en la muestra utiliza un procedimiento de reconocimiento de forma y/o de análisis de textura para segmentar los datos de imágenes de dicho ion en regiones de interés distintas y/o dibujar los contornos de motivos o patrones. Por ejemplo, se utiliza una técnica de morfología matemática, tal como la técnica de divisoria de aguas, la transformada de Hough, en especial en su forma generalizada, matrices de dependencias espaciales de los tonos de gris, etc.

Por “datos morfométricos” o “características morfométricas” se entienden datos y características relativos a la o a las formas geométricas, o patrones, formados por la presencia del ion considerado en la muestra (o de la relación m/z asociada a dicho ion), y a sus dimensiones matemáticas, tales como una superficie, un volumen, un diámetro, un radio, una longitud, una anchura, un espesor, etc. En ciertos casos, los patrones pueden consistir en elementos de escritura, como cifras, letras, palabras, etc.

Por “datos de textura” o “características de textura” se entienden datos y características relativos a una disposición de los patrones entre sí en la muestra, tales como el número de patrones repetidos, una distancia, una dispersión entre dichos patrones, etc.

Por “muestra de referencia” se entiende una muestra de la misma naturaleza y/u origen que la muestra de interés. Por ejemplo, cuando se estudia un tejido biológico de un sujeto de interés, la muestra de referencia consiste en un tejido biológico de la misma naturaleza que proviene de un sujeto testigo.

Según la invención, es posible caracterizar la disposición espacial de uno o varios iones o relaciones m/z de dicha muestra, tomados en conjunto o por separado. Así, un patrón dado puede estar asociado a la presencia y distribución de varias relaciones m/z tomadas simultáneamente en consideración. De forma alternativa, es posible caracterizar patrones diferentes para diferentes relaciones m/z en una misma muestra, simultánea o secuencialmente. Según la invención estas diferentes relaciones m/z pueden ser representativas de un mismo ion o de iones diferentes.

En un modo de realización, el método según la invención comprende una etapa previa de adquisición de datos de imágenes a partir de los cuales se determinan las características morfométricas y/o de textura de al menos una relación m/z.

El método según la invención se puede aplicar con cualquier técnica conocida de obtención de imágenes por espectrometría de masas y, en especial, mediante las técnicas de imágenes MALDI, LDI, DESI, LESA, LAESI (por las siglas en inglés de “Laser Ablation Electrospray Ionization”, ionización por electropulverización por ablación láser), DART (por las siglas en ingles de “Direct Analysis in Real Time”, análisis directo en tiempo real), LAMMA (por las siglas en inglés de “Laser Microprobe Mass Analysis”, análisis de masas con microsonda láser), SMALDI (por las siglas en inglés de “Scanning Microprobe Matrix Assisted Laser Desorption Ionization”, desorción e ionización láser asistida mediante matriz con microsonda de barrido), en combinación con diferentes tipos de analizadores, tales como el TOF (por las siglas en inglés de “tiempo de vuelo”), Orbitrap, FTICR (“resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier”), Cuadrupolo (“simple o triple”), ICP MS (espectrometría de masas por plasma acoplado inductivamente), etc.

En un ejemplo de aplicación particular de la invención, es posible visualizar las características morfométricas y/o de textura asociadas a al menos un ion directamente en una imagen iónica de la muestra, utilizando por ejemplo la obtención de imágenes MALDI. Más precisamente, las características morfométricas y/o de textura asociadas a los iones analizados se pueden generar en forma de imágenes que reproducen la muestra, de tal forma que se pueden visualizar en ellas sus disposiciones espaciales. Naturalmente, es posible superponer diferentes imágenes de la muestra, con el fin, por ejemplo, de visualizar simultáneamente datos de varios iones, e incluso datos histológicos u otros obtenidos mediante otros métodos de análisis tales como la microscopía óptica, la coloración histológica, etc.

En un modo de realización, el método de caracterización de una muestra según la invención comprende las etapas según las cuales:

a) se adquieren datos mediante MSI, para al menos un ion en la muestra; luego

b) se mide y/o cuantifica una disposición espacial de dicho al menos un ion en la muestra a partir de datos relativos a las posiciones de dicho al menos un ion en dicha muestra, con el fin de identificar características morfométricas que definen formas geométricas y dimensiones matemáticas asociadas a esas formas geométricas y/o características de textura que definen una disposición de las formas geométricas entre sí, y caracterizar en consecuencia la distribución de dicho al menos un ion en la muestra por esas características morfométricas y/o de textura.

A partir de la disposición espacial de un ion en una muestra de interés, se caracteriza dicho ion por sus características morfométricas y de textura, específicas de dicha muestra. Un mismo ion en otra muestra podrá presentar características morfométricas y de textura diferentes, aun cuando los perfiles moleculares de las dos muestras fueran idénticos.

De este modo, el procedimiento según la invención permite adquirir otro grado de informaciones para un ion en una muestra, que se pueden tener en cuenta solas o en combinación con cualquier otro dato o característica de la muestra y/o del ion considerado. Por ejemplo, es posible analizar simultánea o secuencialmente no solo las características morfométricas y de textura de un ion de interés, sino también todas o parte de sus características espectrales (intensidades de los picos de los espectros de masa, relación señal/ruido (S/N), área de los picos, etc.

De manera ventajosa, el procedimiento según la invención permite visualizar simultáneamente el conjunto de estos datos y características directamente en una misma imagen iónica de la muestra.

En otro modo de realización, el método de caracterización de una muestra comprende las etapas que consisten en:

c) segmentar datos de imagen de la muestra en regiones de interés representativas de perfiles de intensidad moleculares de la muestra; y

d) caracterizar una disposición espacial de los iones del perfil molecular de una región de interés según características morfométricas y/o de textura.

La etapa c) consiste en una segmentación de la muestra en función de los perfiles moleculares en el seno de dicha muestra. Cada región de interés corresponde a un perfil molecular obtenido a partir de los espectros de masas de la muestra. De forma clásica, se pueden utilizar diferentes características espectrales para obtener los perfiles moleculares de dicha muestra, y, en especial, la intensidad de los picos de los espectros de masas, la relación señal/ruido (S/N), el área de los picos etc.

Una vez identificadas la o las regiones de interés, se tratan los datos de las imágenes asociados a la región de interés seleccionada para caracterizar la disposición espacial del conjunto de los iones de dicha región de interés seleccionada. Son los datos del conjunto de iones en la región de interés los que se tienen en cuenta y se analizan para identificar los patrones y texturas característicos de dicha región de interés. Una vez más, según la invención, es posible reconstruir una imagen numérica de la muestra a partir de esos datos, de forma que se visualizan los resultados directamente sobre una imagen de la muestra.

Las etapas c) y d) se pueden realizar de manera independiente de las etapas a) y b), es decir, sin que se apliquen las etapas a) y b). En otro modo de realización particular, es posible aplicar sucesivamente las etapas a) y b), y luego las etapas c) y d), o, inversamente, de forma que se obtengan diferentes grados de informaciones en términos de morfometría y de textura del o de los iones considerados en la muestra considerada. Asimismo, es posible aplicar la etapa d) a varias o a todas las regiones de interés identificadas en la etapa c).

En otro modo de aplicación, el método de caracterización comprende la etapa que consiste en:

e) realizar una base de datos (BDD) que comprende datos morfométricos y/o de textura de una pluralidad de iones en dicha muestra.

De manera alternativa, el método de caracterización comprende la etapa que consiste en:

f) crear un modelo que comprende datos morfométricos y/o de textura de una pluralidad de iones en dicha muestra.

En el contexto de la invención, “una pluralidad” significa dos o más.

Se entiende que un “modelo” es un conjunto de datos, en el caso presente de características obtenidas de la muestra, en especial datos de intensidad, datos morfométricos y/o de textura, etc, que se han modelizado en especial para definir dependencias y/o relaciones entre dichos datos, y que es representativo de la muestra considerada. Una “base de datos” se refiere a una base en la cual se almacena un conjunto de datos brutos. Así, es posible obtener un conjunto de juegos de datos, es decir, de patrones, dimensiones, disposiciones, etc, propio de una muestra o tipo de muestra, o un modelo. Según la invención, esta base de datos (BDD) o este modelo se puede implementar (etapa g) con los datos espectrales de MSI de al menos un ion en dicha muestra, y/o con los datos fisicoquímicos, fisiológicos y/o biológicos propios de dicha muestra. Por ejemplo, la base de datos (BDD), o el modelo, se implementa con datos obtenidos mediante un estudio histológico, químico o de otro tipo de la muestra, o de una muestra idéntica, con el fin de definir diferentes zonas de interés.

Una base de datos (BDD) tal, o modelo, puede ser particularmente útil para identificar rápidamente y de manera automatizada un tejido, una región de un tejido, un tipo celular, un estado fisiológico de un tejido, por ejemplo, sano o patológico, etc. De la misma forma, la base de datos, o el modelo, se puede utilizar para la identificación o el recuento celular en una muestra biológica.

Según un ejemplo útil para la comprensión de la invención, se describe también un procedimiento de identificación de una muestra mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas en el cual:

i) se establece una base de datos, o se crea un modelo, con datos morfométricos y/o de textura asociados a al menos un ion de referencia, obtenidos a partir de varias muestras de referencia, siendo representativos dichos datos morfométricos y/o de textura de la disposición espacial de dicho al menos un ion de referencia en dichas muestras de referencia;

ii) se registran datos morfométricos y/o de textura (superficie, volumen, forma, patrón, repetición, etc) asociados a al menos un ion en la muestra a identificar;

iii) se comparan los datos morfométricos y/o de texturas de la etapa ii) con los datos morfométricos y/o de texturas contenidos en la base de datos, o el modelo, de la etapa i).

En la etapa ii) se analiza un ion correspondiente a un ion de la base de datos, o del modelo. De manera ventajosa, la base de datos, o el modelo, comprende datos morfométricos y/o de textura asociados o no a una pluralidad de iones de referencia. El conjunto de definiciones y características descritas previamente en relación con el método de caracterización de una muestra se aplica mutatis mutandis a dicho proceso de identificación. Ventajosamente, para cada muestra de referencia, se establece un juego de datos morfológicos y de texturas para varios iones de modo que se caracterice de la manera más fiable posible cada una de las muestras de referencia.

Se procede en la etapa iii) a un análisis de las similitudes y/o de las diferencias entre los diferentes juegos de datos de referencia y los juegos de datos de la muestra a identificar, de forma que se seleccionen la o las muestras de referencia que presentan características morfométricas similares o idénticas, y, por ende, a identificar la muestra.

El procedimiento según la invención puede, por ejemplo, permitir identificar la naturaleza y/o el origen de un tejido biológico, un tipo celular, el estado de la evolución de una enfermedad etc.

La invención tiene también por objeto un procedimiento de identificación de una molécula de interés en una muestra, según el cual:

i) se analiza una disposición espacial de una pluralidad de iones en la muestra de interés a partir de datos de MSI de dichos iones en dicha muestra para determinar características morfométricas que definen formas geométricas y dimensiones matemáticas asociadas a esas formas geométricas y/o características de textura que definen una disposición de las formas geométricas entre si asociadas a dichos iones en dicha muestra;

ii) se comparan los datos morfométricos y/o de textura asociados a la pluralidad de iones en dicha muestra con los datos morfométricos y/o de textura asociados a una pluralidad de iones en una muestra de referencia;

iii) se identifica al menos un ion característico de la muestra, que presenta características morfométricas y/o de textura diferentes respecto de las que hay en la muestra de referencia;

iv) se identifica la molécula correspondiente a dicho ion identificado en la etapa precedente.

Tal procedimiento permite descubrir e identificar una nueva molécula en una muestra de interés.

El procedimiento de identificación de una nueva molécula de interés en una muestra de interés comprende al menos previamente una etapa i) de adquisición de datos de MSI propios de dicha muestra y de caracterización de la distribución de uno o varios iones mediante características morfométricas y/o de textura.

El conjunto de características y definiciones descritas previamente en relación con el método de caracterización de una muestra se aplica mutatis mutandis al presente procedimiento de identificación de una molécula.

Según este modo de realización de la invención, se conoce la naturaleza de la muestra y se desea identificar uno o varios marcadores propios de la muestra, es decir que no están presentes en la muestra de referencia, o bien que presenta(n) características morfométricas y/o de textura diferentes respecto de las que hay en la muestra de referencia (figura 7). Las características morfométricas que se tienen en cuenta para un ion dado pueden ser, por ejemplo, el número de objetos, la media de superficie de los objetos, la dispersión, la forma, la variabilidad de las superficies, etc. Por lo tanto, se utiliza preferiblemente una muestra de referencia de la misma naturaleza y/o del mismo tipo que la muestra de interés.

De manera ventajosa, la etapa ii) se puede aplicar preguntando a una base de datos (BDD) que compila una pluralidad de juegos de datos de referencia de la muestra de referencia, o comparando los datos de la muestra con un modelo que compila una pluralidad de juegos de datos de referencia de la muestra de referencia.

Una vez que el o los datos morfométricos y/o de texturas distintivos de la muestra de interés se han identificado, se les asocia el o los iones correspondientes con el fin de remontar a la molécula asociada a cada uno de los iones.

Este procedimiento es particularmente útil en el campo farmacéutico o médico, en especial para identificar nuevos biomarcadores.

La invención tiene también por objeto un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por el ordenador y adaptadas para permitir a un sistema informático ejecutar el método de caracterización de una muestra según la invención y/o el procedimiento de identificación de una molécula de interés en una muestra según la invención.

De este modo, la invención propone un programa de ordenador que comprende instrucciones de código de programa para la ejecución de todas o de parte de las etapas expuestas previamente, cuando dicho programa se ejecuta en un ordenador.

De manera ventajosa, el programa de ordenador comprende instrucciones de código de programa para ejecutar al menos la etapa de caracterización de la disposición espacial de uno o varios iones en una muestra de interés.

De manera ventajosa, el soporte de datos legible por ordenador, o programa, según la invención, incorpora una base de datos, o un modelo, que comprende datos morfométricos y/o de textura de al menos un ion en al menos una muestra, y, preferiblemente, de una pluralidad de iones para una pluralidad de muestras.

Investigación de marcadores

El procedimiento según la invención se puede utilizar para la identificación de marcadores y, en especial de biomarcadores. En efecto, en el caso de muestras biológicas, es posible identificar variaciones de morfología presentes entre dos condiciones (por ejemplo, enfermo frente a sano, tratado frente a vehículo, expuesto frente a no expuesto, etc). En especial, según la invención, es posible estudiar más particularmente iones específicamente presentes en una región de interés, previamente identificada mediante un estudio macroscópico o microscópico de la estructura de la muestra, por ejemplo.

Una vez obtenidas las características morfométricas y/o de textura, y si después de un estudio estadístico se consideran significativamente diferentes las formas asociadas a los iones estudiados, basta remontar, de forma clásica, a la(s) masa(s) molecular(es) de interés asociadas. Tras la interrogación de las bases de datos especializadas, se pueden identificar la o las moléculas correspondientes. Para ello, se pueden utilizar diferentes tests estadísticos diferenciales, con el fin de basarse en la morfología de los elementos de distribución moleculares y no solamente en la intensidad. En especial se puede utilizar el test de Fischer, el test z, el test de Student, el test de Welch, el test de Student de muestras emparejadas, el ANOVA, el test de Dunett, el test de Tukey, el test de Kruskal-Wallis, el test de Wilcoxon-Mann-Whitney, el test de los rangos con signo de Wilcoxon, el MANOVA, etc.

Filtrado y clasificación molecular

El procedimiento según la invención se puede utilizar con fines de filtrado molecular.

Por ejemplo, es posible seleccionar, de manera arbitraria o no, una morfometría particular (por ejemplo, una forma en estrella de X mm2 de superficie mínima) para efectuar un filtro molecular en una muestra. Así, solo los iones que entren en el o los criterios definidos se seleccionan. Entonces es posible identificar moléculas que tienen el mismo impacto de forma que el buscado.

Un filtrado tal puede permitir también clasificar muestras. De este modo, mediante el procedimiento de la invención, es posible dar una puntuación de semejanza o parecido basándose en las informaciones de intensidades y de formas. Es posible reconocer automáticamente en una muestra, tal como un tejido biológico, la presencia de una forma dada que es por ejemplo característica de un estado fisiológico. Se hace entonces posible establecer clasificaciones a base de puntuaciones más precisas y fiables que las basadas únicamente en el criterio de la intensidad, que puede variar según la preparación de la muestra (depósito de la matriz, tiempo de desecación, congelación, tipo de tejido, etc.) contrariamente a las características morfométricas y de textura que se conservan cualquiera que sea el protocolo escogido.

Según la invención, es posible, de manera ventajosa, constituir una base de datos (BDD), o un modelo, compilando las especificaciones de varias muestras de una misma población, tales como varias muestras de un mismo tejido biológico o de tejidos biológicos del mismo origen o naturaleza. A partir de tal base de datos, o de tal modelo, es fácil identificar una misma muestra de una misma población o identificar con certeza una muestra en una población.

Por ejemplo, es posible caracterizar una muestra de tejido pulmonar como fibrosada por comparación con una muestra de tejido pulmonar sano. La figura 2 muestra más en particular los resultados obtenidos a partir de la caracterización morfométrica de los juegos de datos de imágenes obtenidas para la muestra de tejido pulmonar sano y la muestra de tejido pulmonar fibrosado. Según el procedimiento de la invención, se identifican dos morfometrías en forma de elipse de las cuales una presenta una relación entre el eje pequeño y el eje grande que tiende hacia uno (tejido fibrosado). La utilización de estas firmas morfométricas permite caracterizar dos formas de vías respiratorias, respectivamente sana (óvalo tipo 1) y fibrosada (óvalo tipo 2).

De forma similar, es posible caracterizar muestras inorgánicas, tales como componentes electrónicos, piezas de automóviles u otras, en especial con el fin de realizar un control de calidad.

Conteo celular y recuento morfométrico

El procedimiento según la invención puede utilizarse también en el campo del conteo o recuento celular o bacteriano, en especial en el marco de una evaluación medioambiental o de salud. A tal efecto, es posible seleccionar en la obtención de imágenes por espectrometría de masas moléculas específicas de la pared celular (lípidos, por ejemplo), con el fin de poner de manifiesto los objetos a contar.

Con el procedimiento según la invención, se aíslan las formas con un factor molecular, mientras que hasta el presente esto se realiza mediante señales ópticas, y en especial mediante microscopía óptica o citometría de flujo. La invención permite ir más allá de los límites de sensibilidad de detección obtenidos por las señales ópticas, pero también de la velocidad de trabajo, de la precisión (menos falsos positivos) y aumentar el número de parámetros analizados simultáneamente. Según la invención las células pueden ser contabilizadas y reconocidas tomando como base su morfología, indicando al mismo tiempo el perfil molecular y la actividad metabólica de la célula identificada. Por lo tanto, es posible recontar múltiples tipos celulares, biológicos o histológicos y su actividad fisiológica.

La figura 3 describe el recuento normalizado por morfometría sobre juegos de datos de imágenes obtenidos para muestras de vías aéreas de dos tejidos fibrosados. La detección automatizada de las formas ovales permite identificar y recontar las estructuras histológicas de interés (en este caso, las vías respiratorias) sin correlación con las coloraciones histológicas adyacentes.

Estudio cinético de las morfometrías

El procedimiento según la invención se puede utilizar también en el estudio cinético de formas, en especial para seguir la evolución en el tiempo de la morfometría (forma, superficie, volumen,...) de elementos de interés (moléculas, iones, m/z) en la muestra. En especial, es posible poner de manifiesto un cambio de morfometría, por ejemplo, el aumento o reducción de una región de interés con el tiempo.

También es posible considerar las etapas o fases de la evolución de las formas en una muestra biológica, de acuerdo con otros estudios de las fases de la muestra biológica. Por ejemplo, es posible mediante el procedimiento de la invención proporcionar curvas de superficie en función de una o varias masas diana con el tiempo. Si se identifican niveles o fases específicos (variaciones de morfometría, escalones, oscilación de fo rm as,.), se pueden correlacionar potencialmente con etapas conocidas de la muestra biológica (por ejemplo, cambio de grado de un tejido canceroso).

La figura 4 ilustra la aplicación del procedimiento según la invención al estudio de la evolución de la constricción de las vías aéreas en un tejido fibrosado. Como se representa, es posible con el procedimiento de la invención determinar la superficie de las vías aéreas con el paso del tiempo y, por lo tanto, seguir el impacto de la fibrosis sobre la constricción de las vías aéreas

Caracterización celular o tisular

El procedimiento según la invención se puede utilizar para identificar tipos celulares o subestructuras tisulares en una muestra biológica vegetal o animal. Este tipado o caracterización celular resulta posible gracias a las morfometrías de cada célula, que son específicas para cada una de ellas. Así, en función de las morfometrías celulares obtenidas, es posible determinar el o los tipos celulares contenidos en el seno de una o varias muestras.

Recientemente, determinados desarrollos instrumentales han permitido aumentar la resolución espacial de la obtención de imágenes por MALDI hasta por debajo de los 10 pm. Por su parte, la tecnología SIMS permite obtener una resolución inferior a 1 pm de manera rutinaria. Considerando que el tamaño medio de una célula es de 10-15 pm, se puede considerar que la obtención de imágenes por espectrometría de masas alcanza una resolución celular que permite discriminarlas en los juegos de datos moleculares.

La figura 5 ilustra la aplicación del procedimiento de la invención en el marco del tipado tisular en un corte de tejido de piel y sin correlación histológica. Las zonas del tejido (stratum corneum y epidermis) se identifican gracias a sus morfometrías específicas obtenidas tras adquisición con MSI.

Del mismo modo, la figura 6 ilustra de manera esquemática la aplicación del procedimiento de la invención en el marco del recuento y tipado celular directamente sobre / en una muestra biológica y sin correlación histológica. Las células de la muestra (tejido, disolución o cultivo celular) se caracterizan gracias a sus morfometrías específicas obtenidas tras adquisición con MSI.

Ejemplos

A continuación, se va a describir la invención con más detalle con ayuda de ejemplos precisos. Estos ejemplos se dan a título ilustrativo y de ninguna manera limitadores de la invención.

Ejemplo 1: Procedimiento para caracterizar una muestra o una región de interés combinando informaciones espectrales y espaciales

El presente ejemplo tiene por objetivo poner de manifiesto las diferencias de información que se pueden derivar de un mismo juego de datos de imágenes obtenidas para una muestra, según que se tomen en cuenta solo los datos relacionados con las intensidades para una relación m/z dada en dicha muestra o las características morfométricas y de textura asociadas a esa relación m/z.

Una vez obtenidos los datos de imágenes por espectrometría de masas (posiciones, relaciones m/z, intensidades) de una muestra, por cualquier método conocido, se procede, por ejemplo, según las etapas siguientes:

1 / cargar las imágenes obtenidas a partir de los datos de las imágenes obtenidas;

2 / determinar un umbral para binarizar las imágenes, utilizando, por ejemplo, el método de Otsu;

3 / etiquetar y contar objetos mediante un algoritmo no optimizado;

4 / recuperación del número de posiciones no nulas en una variable;

5 / recuperación del número de píxeles del objeto o de la imagen en una variable;

6 / cálculo de la intensidad media en una variable;

7 / pruebas para determinar si un objeto posee al menos ciertas propiedades de forma.

De manera simplificada, la etapa 3 se puede aplicar mediante el algoritmo siguiente:

“En la medida en que no se ha recorrido la imagen completa:

Recorrer la imagen línea por línea.

Si se encuentra un píxel no nulo (se pertenece a un objeto), recorrido de su entorno y de los alrededores de su entorno en 8 conexidades para poner a 0 los píxeles del objeto.

Incremento del contador de objetos.

Fin del recorrido del entorno o alrededores.

Fin del píxel no nulo.

Fin del recorrido de línea.

Fin del algoritmo”.

La etapa 7 de prueba puede realizarse por ejemplo haciendo una “abertura” (erosión £, seguida de una dilatación 5) por un elemento estructurante (EE) que presenta una o varias propiedades a probar. Si la adición de píxel de la abertura por el EE es no nula, entonces la imagen o la región posee la propiedad:

Abertura: A ° B = (A Q B) © B

Erosión: A Q B = {z E E| B~ e A}, B~ = {b z\b E B}, Vz E E

Resultados

Las etapas descritas previamente se han aplicado a datos de imágenes obtenidas de forma clásica para 2 segmentos (figura 1) que presentan cada uno de ellos una longitud de 6 píxeles, en continuo (figura 1A) o en fragmentado (figura 1B) y una intensidad media idéntica en esos 6 píxeles.

Mientras que tener en cuenta solamente las intensidades no permite diferenciar los dos segmentos, la caracterización morfológica y de textura obtenida mediante el procedimiento según la invención permite poner en evidencia las diferencias entre los dos segmentos (tabla 1)

Tabla 1: Características que se derivan de los datos de imágenes

Ejemplo 2: procedimiento para la identificación de picos de interés y de biomarcadores asociados a partir de datos morfométricos

Material y método

Los animales:

Para este estudio se han utilizado cinco pulmones de ratas. Tres provienen de ratas que han sufrido un tratamiento con bleomicina (Apollo Scientific, Reino Unido) por las vías aéreas (ruta de aspiración orofaríngea) a una dosis de 1 mg/kg durante siete días y dos provienen de animales que han recibido una disolución salina de manera similar durante el mismo tiempo. Todas las ratas eran machos Sprague Dawley, Crl:CD(SD). Se han sacrificado los dos grupos veintidós días después del inicio de la experiencia. Los pulmones se han inflado con agarosa, se han fijado en formol con 10 % de disolución tampón neutra y se han congelado a -80 °C. Las experiencias con animales eran conformes a la Animals (Scientific Procedures) Act de 1986.

Preparación para adquisición de imágenes por espectrometría de masas (SM):

Para la adquisición de las imágenes se han comprado láminas ITO a Delta Technologies (Loveland, Estados Unidos de América) y se han recubierto con 9-aminoacridina (9AA). Se han obtenido secciones de tejido fresco con un espesor de 12 pm utilizando un criostato Microm HM560 (Thermo Scientific, Alemania) a -35 °C y se han montado sobre láminas ITO. Además, se han depositado secciones de homogeneizado de riñones de rata drogados con fármaco con un espesor de 10 pm sobre las mismas láminas con el fin de servir de control de calidad para la evaluación de la reproductibilidad y de la variabilidad. Después de una hora se han retirado las láminas del criostato y luego se han desecado durante 20 minutos antes de ser finalmente conservadas a -80 °C hasta su uso.

La matriz utilizada era una disolución de 9AA a 5 mg/ml en un disolvente MeOH / H²O (4:1 vol:vol); se ha depositado en diez capas sucesivas con un aparato de depósito automatizado Suncollect (SunChrom GmBH, Friedrichsdorf, Alemania). La primera capa se ha aplicado a un caudal de 10 pl/min, la segunda capa a un caudal de 20 pl/min y las siguientes a un caudal de 30 pl/min.

Obtención de las imágenes de espectrometría de masas:

Se ha utilizado un espectrómetro de masas MALDI-FTICR (7T Solaris, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania), equipado con un láser SmartBeam II utilizado a una energía de salida de 80 % y una tasa de repetición de 1000 Hz, para obtener los filtros de masas en modo “fu11 scan” para los valores de m/z comprendidos entre 100 y 1000 con una resolución espacial de 30 pm y en modo negativo. Cada espectro de masas corresponde a la acumulación de 500 disparos láser consecutivos en el mismo lugar. Se ha realizado una calibración interna utilizando la matriz de 9AA así como los fosfolípidos comprendidos entre los valores de m/z 200 y 900. El espectrómetro de masas se controlaba mediante la utilización de los programas informáticos FTMS Control 2.0 y FlexImaging 4.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Las regiones escogidas para la adquisición de datos eran las vías aéreas pulmonares ya que la bleomicina debería inducir allí cambios.

La detección de los picos:

Se consideran picos los máximos del espectro promedio transformado de una condición que sobrepasan un umbral. La transformación utilizada ha sido la sustracción de la mediana de la señal sin los valores nulos dividida por la desviación absoluta en la mediana de la señal sin los valores nulos multiplicada por 1,4826. Esto da una aproximación de la relación señal a ruido en cada punto. Siendo la idea que el ruido sigue una distribución aproximadamente normal y que la verdadera señal está presente en menos de la mitad de las medidas globales o agregadas en el espectro medio, se ha realizado la eliminación de los valores nulos ya que la señal parece haber sufrido una compresión por una pequeña señal destructiva por FTMS Control 2.0. Se han probado otras maneras de aproximar el ruido (por ejemplo, la misma medida, pero hecha localmente o la distancia de un pico a una gaussiana que se supone que lo representa), pero no han dado resultados mejores para los umbrales bajos. El umbral retenido para este estudio es de 1 para tener el menor número de falsos negativos que sea posible, pero excluyendo la mayor parte de ruido posible. Las imágenes exportadas:

Para cada pico detectado, que corresponde a un biomarcador potencial, y para cada región de la que se obtienen imágenes, la imagen de la intensidad máxima en la ventana del pico se estira en una paleta de niveles de gris que tiene 8 bits de profundidad y luego se exporta a formato JPEG sin compresión. La elección de utilizar solo un canal se ha hecho para facilitar la inspección visual de los resultados. Se han obtenido aproximadamente 2000 iones de los que obtener imágenes en 12 regiones (6 en la condición 1 y 6 en la condición 2).

Caracterízación morfológica:

Para cada imagen:

Para tratar de optimizar las imágenes, se ha hecho una abertura en la imagen en niveles de gris utilizando un elemento estructurante de tamaño 2 x 2, seguida por un cierre que utiliza el mismo elemento estructurante: I = (((0 © B¹) © B¹) © B²) © B², siendo O la imagen original en niveles de gris, en nuestro caso B¹= B2 = B el elemento estructurante, una máscara booleana de varios valores centrada en el rincón inferior derecho; los valores que faltan se han obtenido por duplicación de la línea o columna más próxima.

A continuación, se binariza la imagen por aplicación del método de Otsu (en nuestro caso con un umbral único): la maximización de

con

o f = éDo ú í íO í - f i o ) 2

y

= 14=1(t - pT) * Vi

con

" 0 = l i = lPh

GUI =1 - tOo,

Po = £ f = i iPi/ COn

Pl = l l = k+l V i /

W1,

Vi = _N

Pi > Q>Z^í=ⁱP^í= 1

para una imagen que contiene N píxeles, L niveles de gris y siendo ni el número de píxeles que toman el valor de nivel de gris i.

Antes o después de ello, se calcula la superficie de la imagen en píxeles.

Luego, se cuenta el número de objetos en la imagen binarizada utilizando el cardinal del conjunto de etiquetas utilizadas para crear la imagen etiquetada tal como se describe en Rosenfeld et Pfaltz (1996) en conexidad 4.

Finalmente, se establece la superficie media de los objetos por unidad de superficie.

Comparación:

Se han realizado dos tests t de Welch entre las dos condiciones, uno basado sobre el número de objetos por unidad de superficie y el otro basado en la superficie media de los objetos por unidad de superficie. Se ha escogido el test t de Welch ya que se aplica bien a muestras de pequeño tamaño no emparejadas y que no es cierto que las varianzas de las dos poblaciones sean iguales. También se podría haber utilizado en su lugar un test de Mann-Whitney-Wilcoxon. Se han identificado 200 biomarcadores como significativamente diferentes entre la condición de control y la condición tratada sobre la base de utilización de criterios morfométricos, entre los cuales algunos biomarcadores no se identifican más que usando criterios morfométricos.

Como se representa en la figura 9, se ha podido identificar un componente de la membrana implicado en la apoptosis (m/z 718.505) que no era detectable teniendo en cuenta solo las intensidades (NS: no significativo; *: diferencia significativa).

Modelización:

Se ha realizado un modelo matemático sobre la base de los biomarcadores potenciales identificados de la condición tratada. Este modelo se ha utilizado con fines exploratorios para clasificar las muestras de ensayos tomando como base los caracteres morfométricos extraídos.

El presente estudio se podría continuar con las acciones siguientes:

- normalizar los datos;

- identificar los picos con el fin de asociar una molécula a un pico;

- realizar identificación biológica;

- realizar clasificación / aprendizaje automático (“machine learning”) utilizando por ejemplo plataformas en la nube (“cloud”).

Ejemplo 3: otras aplicaciones

Se pueden imaginar numerosas aplicaciones y, en especial, se pueden aplicar utilizando las etapas descritas en el ejemplo 1 o en el ejemplo 2. Por ejemplo, como se ha expuesto previamente en este texto, la invención se puede utilizar en el campo médico y farmacéutico, para identificar nuevos biomarcadores, para el filtrado y la clasificación molecular, el recuento celular y morfológico, el estudio de la evolución en el tiempo de una enfermedad o de un tratamiento, el tipado o caracterización celular o tisular, etc. Según la invención, también es posible, a partir de las superficies y/o de los volúmenes de distribución de un ion en una muestra, cuantificar de manera relativa o absoluta dicho ion en dicha muestra. Por supuesto, la invención encuentra aplicaciones en otros campos, tales como el control de calidad, el arte, el análisis comparado y automatizado de objetos, el estudio de la composición de materiales, etc.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de identificación mediante la obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI) de una molécula de interés en una muestra de interés escogida entre un tejido biológico y un líquido biológico, según el cual:

2. Procedimiento de identificación de una molécula en una muestra según la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional según la cual se visualizan las características morfométricas y/o de textura asociadas a al menos un ion directamente sobre una imagen de la muestra.

3. Procedimiento de identificación de una molécula en una muestra según una de las reivindicaciones precedentes, según el cual la etapa de análisis de la disposición espacial de dicho al menos un ion se realiza por aplicación de un procedimiento de reconocimiento de forma y/o de análisis de textura.

4. Procedimiento de identificación de una molécula en una muestra según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende la etapa previa según la cual se adquieren datos por MSI, para una pluralidad de iones en la muestra.

5. Procedimiento de identificación de una molécula en una muestra según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende la etapa según la cual se realiza una base de datos (BDD) o un modelo que comprende las características morfométricas y/o de textura de una pluralidad de iones en dicha muestra de interés, y, opcionalmente, la etapa adicional según la cual se implementa la base de datos (BDD) o el modelo con los datos espectrales de MSI de al menos un ion en dicha muestra de interés, y/o de los datos fisicoquímicos, fisiológicos y/o biológicos propios de dicha muestra de interés.

6. Método de caracterización de una muestra escogida entre un tejido biológico y un líquido biológico mediante obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI), que comprende las etapas según las cuales:

a) se adquieren datos mediante MSI, para al menos un ion en la muestra; luego

7. Método de caracterización de una muestra por MSI según la reivindicación 6, que comprende las etapas según las cuales:

c) se segmentan datos de imagen de la muestra en regiones de interés representativas de perfiles de intensidades moleculares de la muestra; y

d) se mide y/o cuantifica una disposición espacial de los iones del perfil molecular de una región de interés según características morfométricas y/o de textura de dicho perfil molecular.

8. Método de caracterización de una muestra por MSI según las reivindicaciones 6 o 7, que comprende la etapa según la cual:

e) se realiza una base de datos (BDD) o un modelo que comprende características morfométricas y/o de textura de una pluralidad de iones en dicha muestra y, opcionalmente,

f) se implementa la base de datos (BDD) o el modelo con los datos espectrales de MSI de al menos un ion en dicha muestra, y/o datos fisicoquímicos, fisiológicos y/o biológicos propios de dicha muestra.

9. Utilización de una base de datos o de un modelo obtenido según el método de caracterización de la reivindicación 8, para la identificación de un tejido, de una región de un tejido, de un tipo celular, de un estado fisiológico (sano o patológico) de un tejido o el recuento celular en una muestra biológica.

10. Método de caracterización de una muestra por MSI según la reivindicación 6, que comprende las etapas adicionales según las cuales:

i) se registran las características morfométricas y/o de textura obtenidas en la etapa a);

ii) se comparan las características morfométricas y/o de texturas asociadas a dicho al menos un ion de la muestra a identificar con los datos morfométricos y/o de texturas asociados a un ion de referencia.

11. Método de caracterización de una muestra por MSI según la reivindicación 10, que comprende la etapa adicional según la cual se establece una base de datos o un modelo con datos morfométricos y/o de textura asociados a al menos un ion de referencia, obtenidos a partir de varias muestras de referencia, siendo dichos datos morfométricos y/o de textura representativos de la disposición espacial de dicho al menos un ion de referencia en dichas muestras de referencia, siendo aplicada la etapa iii) comparando las características morfométricas y/o de texturas asociadas a dicho al menos un ion de la muestra a identificar con los datos de la base de datos o del modelo.

12. Soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por un ordenador, adaptadas para permitir a un sistema informático ejecutar el procedimiento de identificación de una molécula de interés en una muestra según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y/o el método de caracterización de una muestra según las reivindicaciones 6 a 8, y/o según la reivindicación 10 u 11.

13. Soporte de datos legible por ordenador según la reivindicación 12, caracterizado por que incluye una base de datos que comprende datos morfológicos y/o de textura de al menos un ion en al menos una muestra.