ES2336946T3 - Metodo de diagnostico para trastornos relacionados con daño cerebral. - Google Patents
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Abstract
Método para el diagnóstico de accidente cerebrovascular en un sujeto que se sospecha que padece el mismo, que comprende detectar glutatión-S-transferasa P (GSTP-1), o una variante, un mutante o una isoforma de la misma, en una muestra de sangre, plasma o suero extraída de un sujeto, en el que un nivel elevado de GSTP-1, en comparación con un control, es indicativo de accidente cerebrovascular.
Description
Método de diagnóstico para trastornos
relacionados con daño cerebral.
Esta invención se refiere a un método de
diagnóstico para accidente cerebrovascular.
No está disponible actualmente ningún marcador
biológico para el diagnóstico de rutina de trastornos relacionados
con daño cerebral incluyendo enfermedades cerebrovasculares,
demencia y enfermedades neurodegenerativas. Esta invención se
refiere al uso de líquido cefalorraquídeo de pacientes fallecidos
como un modelo para el descubrimiento de marcadores de trastornos
relacionados con daño cerebral, y al uso de tales marcadores en el
diagnóstico de trastornos relacionados con daño cerebral en seres
humanos y animales.
A lo largo de las últimas dos décadas, se han
estudiado varios marcadores biológicos (biomarcadores) en el
líquido cefalorraquídeo (LCR) y suero de pacientes con trastornos
relacionados con daño cerebral, incluyendo creatina
cinasa-BB [1], lactato deshidrogenasa [2], proteína
básica de la mielina [3], proteína S100 [4], enolasa específica de
neuronas (NSE) [5], proteína ácida fibrilar de la glía [6] y tau
[7]. La mayoría de ellas no han demostrado ser indicadores útiles
de la extensión del daño cerebral ni factores pronóstico precisos
del estado clínico y el desenlace funcional. De hecho, el valor de
diagnóstico de los biomarcadores para trastornos relacionados con
daño cerebral se ha visto dificultado por su aparición tardía y un
máximo retrasado tras el acontecimiento del daño, su escasa
sensibilidad y especificidad, y el entendimiento limitado de los
mecanismos que gobiernan la liberación de estas moléculas en el LCR
y, en última instancia, en la sangre. Como resultado de estas
limitaciones, el uso de biomarcadores de trastornos relacionados con
daño cerebral actualmente está limitado al entorno de investigación
y no se ha recomendado ninguno para la evaluación de rutina [8].
El documento WO 01/42793 se refiere a un ensayo
de diagnóstico para accidente cerebrovascular en el que la
concentración de proteína de unión a ácidos grasos cardiaca o
cerebral (H-FABP o B-FABP) se
determina en una muestra de líquido corporal.
De manera ideal, un biomarcador para el
diagnóstico, la monitorización y el pronóstico de trastornos
relacionados con daño cerebral debe incluir al menos las siguientes
características: (1) debe ser específico de cerebro; (2) debido a
las dificultades obvias de obtener muestras de LCR en pacientes, la
detección en líquidos corporales más fácilmente disponibles tales
como sangre, suero, plasma, orina, saliva o lágrimas es sumamente
deseable; (3) debe aparecer muy temprano; (4) su nivel máximo,
alternativamente el área bajo la curva de concentraciones
secuenciales, deben reflejar la extensión del daño cerebral;
finalmente (5) debe ser indicativo del desenlace funcional. Se
muestran en el presente documento nuevos biomarcadores de trastornos
relacionados con daño cerebral.
Se describe cómo se han identificado proteínas
como nuevos biomarcadores de diagnóstico para trastornos
relacionados con daño cerebral usando un análisis basado en
proteómica del LCR de pacientes fallecidos como un modelo de daño
cerebral masivo. Se han descrito ensayos de diagnóstico para
accidente cerebrovascular basados en tales marcadores que usan FABP
en el documento WO 01/42793 y se han descrito ensayos que usan
RNA-BP, UFD1 y NDKA en el documento WO2005/029088.
Se han descrito ensayos de diagnóstico para la enfermedad de
Huntington que usan clusterina en el documento WO 2006/061610. Se
han descrito ensayos de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer
que usan apolipoproteína A-IV, factor H del
complemento, factor 3a del complemento y
alfa-2-macroglobulina en el
documento WO 2006/035237. Se han descrito ensayos de diagnóstico
para la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (ECJ) y su
forma variante vECJ que usan FABP en el documento WO 01/67108, y se
han descrito ensayos similares basados en isoformas de hemoglobina
y cistatina C en el documento WO 2004/040316. Se ha descrito un
ensayo de diagnóstico adicional para ECJ y vECJ basado en
hemoglobina beta en el documento WO 2006/061609. Se dan a conocer
métodos y composiciones referentes a la enfermedad de Alzheimer en
el documento WO 2006/021810. El uso de los polipéptidos según la
presente invención puede validarse de una manera similar.
La presente invención proporciona lo
siguiente:
- 1.
- Un método para el diagnóstico de accidente cerebrovascular en un sujeto que se sospecha que padece el mismo, que comprende detectar glutatión-S-transferasa P (GSTP-1), o una variante, un mutante o una isoforma de la misma, en una muestra de sangre, plasma o suero extraída de un sujeto, en el que un nivel elevado de GSTP-1, en comparación con un control, es indicativo de accidente cerebrovascular.
- 2.
- Método de seguimiento de la progresión de un accidente cerebrovascular en un sujeto al que se le diagnosticó previamente que padecía el mismo, que comprende medir los niveles de GSTP-1, o una variante, un mutante o una isoforma de la misma, en múltiples muestras de sangre, plasma o suero extraídas de un sujeto en momentos diferentes y determinar el cambio en los niveles de la GSTP-1 en la muestra sometida a prueba más recientemente en comparación con los niveles en muestras sometidas a prueba previamente y correlacionar tal cambio con la progresión, regresión o estabilización de dicho accidente cerebrovascular.
- 3.
- Método según 1 ó 2, en el que se usa un anticuerpo frente a GSTP-1 en la detección o la determinación de la concentración.
- 4.
- Método según 1 ó 2, en el que la GSTP-1 se detecta mediante la determinación de al menos un autoanticuerpo frente a la misma.
- 5.
- Método según cualquiera de 1 a 3, en el que se usan dos o más marcadores seleccionados de anticuerpos frente a GSTP-1 en un pocillo individual de una placa de microtitulación de ELISA.
- 6.
- Método según cualquiera de 1 a 5, en el que GSTP-1 y al menos otro polipéptido se someten a ensayo por separado, y se usa un algoritmo de predicción para el diagnóstico, en el que dicho al menos otro polipéptido es uno para el cual el nivel está o bien aumentado o bien disminuido en el líquido cefalorraquídeo de pacientes fallecidos en comparación con el líquido cefalorraquídeo de donantes sanos.
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Los polipéptidos (también denominados proteínas)
útiles en la presente invención son aquéllos para los cuales se
encontró el nivel o bien aumentado o bien disminuido en el líquido
cefalorraquídeo de pacientes fallecidos en comparación con el
líquido cefalorraquídeo de donantes sanos. En este contexto, el
término "aumentado" significa que el polipéptido se produce
exclusivamente en LCR de paciente fallecido en oposición a LCR de
paciente sano, o que se produce en LCR de paciente fallecido a un
nivel superior que en LCR de paciente sano, tal como al menos 1,2
veces superior, preferiblemente al menos 1,5 veces superior, o
incluso al menos 8-10 veces superior. El término
"disminuido" significa que el polipéptido está ausente en LCR
de paciente fallecido en oposición a LCR de paciente sano, o que se
produce en LCR de paciente fallecido a un nivel inferior que en LCR
de paciente sano, tal como inferior en un factor de 0,8 o menos,
preferiblemente de 0,7 o menos.
Es una predicción razonable que todos estos
polipéptidos serán útiles como marcadores para trastornos
relacionados con daño cerebral. Esto se ha validado para ciertos
polipéptidos, tal como se describe en los ejemplos a continuación.
El uso de otros polipéptidos se ha validado mediante los datos en
los documentos WO 01/42793; WO 01/67108; WO2004/040316; WO
2005/029088; WO 2006/035237; WO 2006/061609 y WO 2006/061610; todos
los cuales se incorporan al presente documento como referencia.
Los polipéptidos (también denominados proteínas)
útiles en la presente invención no se limitan a las secuencias
correspondientes a los números de registro en las tablas 1, 2, 3 y
4, e incluyen variantes, mutantes e isoformas de las mismas. Una
variante se define como una variación que se produce de manera
natural en la secuencia de un polipéptido que tiene un alto grado
de homología con la secuencia dada, y que tiene sustancialmente las
mismas propiedades funcionales e inmunológicas. Un mutante se define
como una variante creada artificialmente. Un alto grado de
homología se define como una homología de al menos el 90%,
preferiblemente de al menos el 95% y lo más preferiblemente de al
menos el 99%. Las variantes pueden producirse dentro de una única
especie o entre especies diferentes. Una isoforma de un polipéptido
tiene la misma función que el polipéptido pero está codificada por
un gen diferente y puede tener pequeñas diferencias en su secuencia.
Las proteínas anteriores son de origen humano, pero la invención
engloba el uso de los correspondientes polipéptidos de otras
especies de mamíferos, por ejemplo animales bovinos.
Los trastornos relacionados con daño cerebral en
el contexto de la presente invención incluyen los siguientes:
traumatismo craneal, accidente cerebrovascular isquémico, accidente
cerebrovascular hemorrágico, hemorragia subaracnoidea, hemorragia
intracraneal, ataque isquémico transitorio, demencia vascular,
degeneración corticobasal ganglionar, encefalitis, epilepsia,
síndrome de Landau-Kleffner, hidrocefalia,
pseudotumor cerebral, enfermedades talámicas, meningitis, mielitis,
trastornos del movimiento, temblor esencial, enfermedades de la
médula espinal, siringomielia, enfermedad de Alzheimer (de
aparición temprana), enfermedad de Alzheimer (de aparición tardía),
demencia por infartos múltiples, enfermedad de Pick, enfermedad de
Huntington, Parkinson, síndromes parkinsonianos, demencia
frontotemporal, degeneración corticobasal, atrofia multisistémica,
parálisis supranuclear progresiva, enfermedad con cuerpos de Lewy,
esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, síndrome de
Dandy-Walker, ataxia de Friedreich, enfermedad de
Machado-Joseph, migraña, esquizofrenia, trastornos
del estado de ánimo y depresión. También están incluidos los
trastornos correspondientes en mamíferos no humanos, tales como
encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), por ejemplo
encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en el ganado o tembladera
en las ovejas. Por consiguiente, el término "paciente" engloba
tanto seres humanos como mamíferos no humanos.
En una realización, el trastorno relacionado con
daño cerebral es el accidente cerebrovascular y el polipéptido es un
homólogo de una de las proteínas enumeradas en la tabla 1, 2, 3 ó
4.
El término "diagnóstico", tal como se usa
en el presente documento, incluye determinar si está presente o
ausente un trastorno relacionado con daño cerebral, y también puede
incluir determinar el estado hasta el que ha progresado. El
diagnóstico puede servir como base de un pronóstico en cuanto al
futuro desenlace para el paciente y para monitorizar la eficacia del
tratamiento.
El término "control" se refiere a un sujeto
normal (ser humano o mamífero no humano), es decir uno que padece
un trastorno relacionado con daño cerebral (también denominado un
"donante sano"), y también a una muestra extraída del mismo
sujeto que proporcionó la muestra de diagnóstico, pero en un momento
anterior.
Las referencias a una concentración aumentada o
disminuida en comparación con una muestra de un control no implican
que se emprenda realmente un etapa de comparación, puesto que en
muchos casos será obvio para el médico experto que la concentración
es anómalamente alta o baja. Además, cuando están monitorizándose
progresivamente los estadios de un trastorno relacionado con daño
cerebral, la comparación realizada puede ser con la concentración
observada previamente en el mismo sujeto en una progresión anterior
del trastorno.
Las figuras 1-4 muestran partes
de mapas de 1-DE tras la electroforesis de
desplazamiento de gel (Off-gel) para LCR
ante y post mórtem, indicando las flechas las bandas
correspondientes a las proteínas enumeradas en la tabla 1. Se
cargaron 5-10 \mug de proteína en un gel plano de
SDS-PAGE (12,5% de T/2,6% de C). Se tiñó el gel con
plata.
Las figuras 5-7 muestran los
resultados de un ensayo para UFD1 para dos grupos de pacientes: un
grupo control y un grupo con accidente cerebrovascular agudo.
La figura 8 muestra inmunotransferencias de tipo
Western de cuatro proteínas que se identificaron únicamente en
fracciones de LCR post mórtem.
La figura 9 muestra los resultados de un ensayo
para GSTP-1 para grupos de pacientes con accidente
cerebrovascular y controles, tal como se describe en el ejemplo
5.
La figura 10 muestra la validación mediante
inmunotransferencia de tipo Western de apolipoproteína
A-IV en la enfermedad de Alzheimer, tal como se
describe en el ejemplo 6.
La figura 11 es un diagrama de dispersión de los
valores para el factor 3a del complemento en plasma de pacientes con
enfermedad de Alzheimer y controles, tal como se describe en el
ejemplo 8.
La figura 12 muestra una correlación de los
niveles del factor H del complemento determinados mediante
inmunotransferencia de tipo Western con la Escala Global de Demencia
en pacientes con presunta enfermedad de Alzheimer.
La figura 13 es una curva operativa del receptor
(ROC, Receiver Operating Curve) para el factor H del
complemento y la
alfa-2-macroglobulina como
biomarcadores plasmáticos candidatos de la enfermedad de
Alzheimer.
La invención presentada en el presente documento
se refiere a métodos para detectar niveles crecientes o decrecientes
de polipéptidos en líquidos corporales incluyendo los componentes
sanguíneos (por ejemplo plasma o suero) o el líquido
cefalorraquídeo de sujetos afectados por un trastorno relacionado
con daño cerebral incluyendo enfermedades cerebrovasculares,
demencia y enfermedades neurodegenerativas, en comparación con
sujetos control (no afectados). Para este fin, puede hacerse uso de
anticuerpos o de cualquier método específico de detección de
polipéptidos.
La invención también incluye realizaciones en
las que los polipéptidos, en particular los de la tabla 1, 2, 3 ó 4,
se determinan indirectamente. Por ejemplo, puede determinarse al
menos un autoanticuerpo frente a uno o más de los polipéptidos, en
particular los de la tabla 1, 2, 3 ó 4.
Los anticuerpos contra marcadores proteicos del
daño cerebral, en particular sus dominios de unión a proteína, son
adecuados como herramientas de detección. Pueden usarse métodos de
biología molecular y biotecnológicos para alterar y optimizar las
propiedades como anticuerpo de dichas moléculas de manera
específica. Además de esto, los anticuerpos pueden modificarse
químicamente, por ejemplo por medio de acetilación, carbamoilación,
formilación, biotinilación, acilación, o derivatización con
polietilenglicol o polímeros hidrófilos, con el fin de aumentar su
estabilidad.
Un marcador de polipéptido específico
seleccionado de cualquiera de las proteínas enumeradas en la tabla
1, 2, 3 ó 4 se determina en una muestra de líquido corporal, por
ejemplo usando un anticuerpo frente al mismo. El marcador puede
detectarse simplemente y/o puede medirse su concentración. El
marcador se mide preferiblemente mediante un inmunoensayo, usando
un anticuerpo específico frente al polipéptido y midiendo la
extensión de la interacción antígeno (polipéptido)/anticuerpo. El
anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
modificado por ingeniería genética (quimérico). Se conocen
anticuerpos frente a polipéptidos y están disponibles
comercialmente. También, puede usarse el método habitual de
Köhler-Milstein para producir anticuerpos. Menos
preferiblemente, el anticuerpo puede ser policlonal. En el contexto
de la presente invención, el término "anticuerpos" incluye
fragmentos de unión de anticuerpos, tales como fragmentos Fab o de
cadena sencilla.
Puede usarse cualquier método de inmunoensayo
conocido. En un ensayo de intercalación (sándwich), se une
un anticuerpo (por ejemplo policlonal) frente al polipéptido a la
fase sólida, tal como un pocillo de una placa de microtitulación de
plástico, y se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo
marcado específico frente al polipéptido que va a detectarse.
Alternativamente, puede usarse un ensayo de captura de anticuerpos
(también denominado "inmunoensayo indirecto"). En este caso, se
deja que la muestra de prueba se una a una fase sólida, y entonces
se añade el anticuerpo anti-polipéptido (policlonal
o monoclonal) y se deja que se una. Si se usa un anticuerpo
policlonal en este contexto, debe ser de manera deseable uno que
muestre una baja reactividad cruzada con otras formas del
polipéptido. Tras eliminar por lavado el material no unido, se
determina la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida usando un
segundo anticuerpo marcado, contra el primero.
Puede realizarse un ensayo directo usando un
anticuerpo anti-polipéptido marcado. Se deja que la
muestra de prueba se una a la fase sólida y se añade el anticuerpo
anti-polipéptido. Tras eliminar por lavado el
material no unido, se determina la cantidad de anticuerpo unido a
la fase sólida. El anticuerpo puede marcarse directamente en lugar
de a través de un segundo anticuerpo.
En otra realización, puede realizarse un ensayo
de competencia entre la muestra y un polipéptido marcado o un
péptido derivado del mismo, estando compitiendo estos dos antígenos
por una cantidad limitada de anticuerpo
anti-polipéptido unido a un soporte sólido. El
polipéptido o péptido marcado puede preincubarse con el anticuerpo
sobre la fase sólida, mediante lo cual el polipéptido en la muestra
desplaza parte del polipéptido o péptido del mismo unido al
anticuerpo.
Aún en otra realización, se permite que los dos
antígenos compitan en una única incubación conjunta con el
anticuerpo. Tras la eliminación del antígeno no unido del soporte
por lavado, se determina la cantidad de marcador unido al soporte y
se mide la cantidad de proteína en la muestra mediante referencia a
curvas de valoración patrón establecidas previamente.
De manera global, el marcador es preferiblemente
una enzima. El sustrato para la enzima puede dar lugar a la
formación de color, ser fluorescente, quimioluminiscente o
electroquímico, y puede ser soluble o precipitar. Alternativamente,
el marcador puede ser un radioisótopo o fluorescente, por ejemplo
usar fluoresceína conjugada.
La enzima puede ser, por ejemplo, fosfatasa
alcalina o peroxidasa del rábano y puede usarse convenientemente de
manera colorimétrica, por ejemplo usando fosfato de
p-nitrofenilo como sustrato con formación de color
amarillo con fosfatasa alcalina.
Para un ensayo quimioluminiscente, el anticuerpo
puede marcarse con un éster de acridinio o peroxidasa del rábano.
Esta última se usa en el ensayo de quimioluminiscencia potenciada
(ECL). En este caso, el anticuerpo, marcado con peroxidasa del
rábano, participa en una reacción quimioluminiscente con luminol, un
sustrato de peróxido y un compuesto, que potencia la intensidad y
la duración de la luz emitida, normalmente,
4-yodofenol o ácido
4-hidroxicinámico.
Puede usarse un inmunoensayo amplificado tal
como inmuno-PCR. En esta técnica, el anticuerpo se
une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende
cebadores de PCR, mediante lo cual se amplifica el ADN con el
anticuerpo unido al mismo mediante la reacción en cadena de la
polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids
Research 1995; 23, 522-529 (1995) o T. Sano et
al., en "Molecular Biology and Biotechnology" ed. Robert
A. Meyers, VCH Publishers, Inc. (1995), páginas 458 - 460. Se lee la
señal como anteriormente.
En un procedimiento, puede usarse un ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar el
polipéptido.
Es posible la automatización completa en un
analizador para química clínica usando ampliamente tal como el
sistema COBAS^{TM} MIRA Plus de Hoffmann-La Roche,
descrito por M. Robers et al. Clin Chem. julio de
1998;44(7):1564-7 o el sistema AxSYM^{TM}
de Abbott Laboratories, y puede aplicarse para el diagnóstico
clínico de rutina de trastornos relacionados con daño cerebral.
Pueden medirse las concentraciones de
polipéptido mediante otros medios distintos al inmunoensayo. Por
ejemplo, la muestra puede someterse a electroforesis en gel 2D y
estimarse la cantidad del polipéptido mediante barrido
densitométrico del gel o de una inmunotransferencia del mismo. Sin
embargo, es deseable llevar a cabo el ensayo de manera rápida, de
modo que pueda tratarse al paciente con prontitud.
En principio, puede usarse cualquier líquido
corporal para proporcionar una muestra para diagnóstico, pero
preferiblemente el líquido corporal es líquido cefalorraquídeo
(LCR), plasma, suero, sangre, orina, lágrimas o saliva.
Según la invención, puede realizarse un
diagnóstico de trastornos relacionados con daño cerebral a partir de
la determinación de un único polipéptido o cualquier combinación de
dos o más de los polipéptidos.
Uno o más de los polipéptidos especificados que
está contenido de manera diferencial en un líquido corporal de
sujetos afectados por daño cerebral y sujetos no afectados por daño
cerebral pueden usarse para aplicaciones de diagnóstico, pronóstico
y terapéuticas, incluyendo para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de un trastorno relacionado con daño cerebral.
Esto puede suponer la preparación y/o el uso de un material que
reconoce, se une a o tiene cierta afinidad por el polipéptido
mencionado anteriormente. Ejemplos de tales materiales son
anticuerpos y chips de anticuerpo. El término "anticuerpo" tal
como se usa en el presente documento incluye antisuero policlonal,
anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos tales como Fab y
anticuerpos modificados por ingeniería genética. Los anticuerpos
pueden ser quiméricos o de una única especie. La referencia
anterior a aplicaciones de "pronóstico" incluye realizar una
determinación del transcurso probable de un trastorno relacionado
con daño cerebral midiendo, por ejemplo, la cantidad del polipéptido
mencionado anteriormente en una muestra de líquido corporal. La
referencia anterior a aplicaciones de "seguimiento terapéutico"
incluye realizar una determinación del transcurso probable de un
trastorno relacionado con daño cerebral midiendo, por ejemplo, la
cantidad del polipéptido mencionado anteriormente en una muestra de
líquido corporal (y evaluando su nivel como una función del
tratamiento, la recuperación de la discapacidad o no, el tamaño de
las lesiones, etc.). La referencia anterior a aplicaciones
"terapéuticas" incluye, por ejemplo, preparar materiales que
reconocen, se unen a o tienen afinidad por los polipéptidos
mencionados anteriormente, y usar tales materiales en terapia. En
este caso, pueden modificarse los materiales, por ejemplo combinando
un anticuerpo con un fármaco, para de ese modo dirigir el fármaco
hasta una región específica del paciente. En otra realización, se
administra a un sujeto una vacuna dirigida contra un polipéptido, o
una variante o un mutante del mismo, seleccionado de la tabla 1, 2,
3 ó 4, o un determinante antigénico (epítopo) del mismo.
Debe entenderse que la referencia anterior a
"presencia" o "ausencia" de un polipéptido, y las
expresiones equivalentes "presente" y "no presente",
significan simplemente que existe una diferencia significativa en
la cantidad de un polipéptido que se detecta en la muestra de sujeto
afectado o no afectado (o control). Por tanto, la "ausencia"
de un polipéptido en una muestra de prueba puede incluir la
posibilidad de que el polipéptido esté realmente presente, pero en
una cantidad significativamente menor que en una muestra de prueba
comparativa. Según la invención, puede realizarse un diagnóstico
basándose en la presencia o ausencia de un polipéptido, y esto
incluye la presencia de un polipéptido en una cantidad
significativamente menor o significativamente mayor con referencia a
una muestra de prueba comparativa (o control).
Debe entenderse que las referencias anteriores a
"detectar" un polipéptido incluyen una referencia a
composiciones y métodos para detectar modificaciones
postraduccionales de los polipéptidos además de variaciones
cuantitativas. Por tanto, la invención engloba la detección de
modificaciones postraduccionales en general, y determinar si tales
modificaciones de un polipéptido concuerdan con un diagnóstico de un
trastorno relacionado con daño cerebral. Un ejemplo de una
modificación postraduccional de este tipo es la
N-glicosilación.
Pueden usarse kits y dispositivos de ensayo en
el diagnóstico de trastornos relacionados con daño cerebral. Estos
pueden incluir uno o más anticuerpos frente a un polipéptido
seleccionado de cualquiera de las proteínas enumeradas en la tabla
1, 2, 3 ó 4. Los anticuerpos se unirán a los polipéptidos adecuados
en una muestra de líquido extraída de un paciente. Los anticuerpos
pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido. Preferiblemente, se
coloca cada anticuerpo en una ubicación direccionable única, para
permitir de ese modo una lectura del ensayo separada para cada
polipéptido individual en la muestra, así como lecturas para
cualquier combinación seleccionada de polipéptidos. Tales kits y
dispositivos de ensayo también pueden incluir anticuerpos frente a
otros polipéptidos marcadores además de uno o más de los de la tabla
1, 2, 3 ó 4. Tales otros polipéptidos marcadores incluyen los
descritos en los documentos WO01/42793 y WO2005/029088. En una
realización particular, el otro polipéptido marcador es
glutatión-S-transferasa P.
Un dispositivo de ensayo puede comprender un
sustrato sólido que tiene una o más ubicaciones que contienen un
material que reconoce, se une a o tiene afinidad por un polipéptido,
o una variante o un mutante del mismo, tal como se definió
anteriormente, en particular seleccionado de la tabla 1, 2, 3 ó 4.
Polipéptidos preferidos que pueden detectarse mediante un
dispositivo de este tipo son proteínas de unión a ácidos grasos,
glutatión-S-transferasa P,
RNA-BP, UFD1, NDKA, clusterina, apolipoproteína
A-IV, factor H del complemento, factor 3a del
complemento, alfa-2-macroglobulina,
isoformas de la hemoglobina, cistatina C, hemoglobina beta,
apolipoproteína E,
glutatión-S-transferasa Mu 1,
cadena de tubulina beta-4, isozima L1 de hidrolasa
carboxi-terminal de ubiquitina, transgelina 3,
proteína neuronal Np25, inhibidor 1 de la disociación de Rab GDP,
dihidropirimidinasa de tipo 2 (DRP-2), aspartato
aminotransferasa citoplasmática, fructosa-bisfosfato
aldolasa C, y subunidad alfa de tipo 6 del proteasoma. El
dispositivo de ensayo puede incluir anticuerpos frente a dos o más
de estos polipéptidos, frente a tres o más, cuatro o más, cinco o
más, o en algunos casos diez o veinte o más.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
LCR: líquido cefalorraquídeo;
H-FABP: proteína de unión a ácidos grasos cardiaca;
NDKA: nucleósido difosfato cinasa A; ECJ: enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob; OGE: electroforesis de
desplazamiento de gel; UPD1: proteína de degradación por fusión de
ubiquitina 1; GST-P:
glutatión-S-transferasa P; SBP:
productos de descomposición de espectrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando técnicas de electroforesis en gel
unidimensional (1-DE), separación de proteínas de
líquido cefalorraquídeo (LCR) y espectrometría de masas, se
encontraron los 58 polipéptidos nombrados en la tabla 1 con niveles
elevados o disminuidos en el LCR de pacientes fallecidos, usado
como modelo de daño cerebral masivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron veinte muestras de LCR para el enfoque
basado en proteómica que tiene como objetivo descubrir marcadores
de trastornos relacionados con daño cerebral. Cinco de estas
muestras se obtuvieron en la autopsia de pacientes fallecidos 6
horas tras su fallecimiento sin patología del sistema nervioso
central. Otras quince se recogieron mediante punción lumbar de
pacientes vivos a los que se les realizó un examen neurológico para
determinar estados benignos no relacionados con daño cerebral
(cefalea atípica y parálisis nerviosa facial periférica
idiopática). Se centrifugaron las muestras de LCR inmediatamente
tras su recogida, se tomaron alícuotas, se congelaron a -80ºC y se
almacenaron hasta su análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la inmunodepleción de albúmina sérica
humana, transferrina, haptoglobina, IgG, IgA y antitripsina usando
un sistema Multiple Affinity Removal (Agilent Technologies,
Wilmington, EE.UU.). Se concentraron 3 ml de LCR hasta
aproximadamente 300 \mul usando ultrafiltración (MWCO de 10 kDa,
Vivascience). Se dividió el LCR en alícuotas de 200 \mul para la
inmunodepleción según las instrucciones del fabricante. Se
concentraron las fracciones combinadas tras la depleción usando
ultrafiltración. Se midieron concentraciones finales de proteínas
en LCR de entre 600 y 900 \mug/\mul usando un ensayo Bradford.
Todos los reactivos y aparatos para electroforesis de
desplazamiento de gel (OGE) se han descrito en detalle en otra parte
(Ros, A., et al., Protein purification by
Off-Gel electrophoresis. Proteomics, 2002.
2(2): págs. 151-6). Se cargaron 750 \mul
de las muestras de LCR sometidas a inmunodepleción sobre la tira
para OGE usando la carga de todos los pocillos (50 \mul por
pocillo). Se enfocaron las muestras para un total de 31,6 kVh (1 h a
100 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1000 V, 15 h a 2000 V). Se limitó la
corriente a 50 \muA y se controló la temperatura a 20ºC. Se
recogieron fracciones (20-100 \mul) de cada
pocillo y se almacenaron a -20ºC antes de la
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron las fracciones procedentes de la
OGE con una disolución concentrada 5X de tampón de Laemmli
(Tris-HCl 0,125 M, SDS al 4%, glicerol al 40%, azul
de bromofenol al 0,1%, pH 6,8) hasta 70 \mul y se calentaron a
95ºC durante 5 min. Se centrifugaron las muestras a 14000 g y se
cargó el sobrenadante sobre el gel de
SDS-poliacrilamida al 12,5%. Se realizó la
migración en un tampón
Tris-glicina-SDS pH 8,3. Entonces se
tiñó el gel usando tinción de plata compatible con EM procedente de
Blum [Blum, H., Beier, H. y Gross, H. J., Electrophoresis 1987, 8,
93-99]. En primer lugar se fijó el gel durante un
mínimo de 30 min. en metanol al 50% (v/v), ácido acético al 10%
(v/v) y luego 15 min. en metanol al 5% (v/v). Entonces se lavó el
gel 3 veces durante 5 min. con H_{2}O milli-Q y
se incubó durante 2 min. en tiosulfato de sodio
(Na_{2}S_{2}O_{3}, 5 H_{2}O) 0,2 g/l (p/v) recién
preparado. Se lavó adicionalmente el gel 3 veces durante 30 s con
H_{2}O milli-Q, y se incubó en la disolución de
tinción, es decir 25 min. en disolución de nitrato de plata
(AgNO_{3}) 2 g/l. Se lavó el gel 3 veces durante 1 min. con
H_{2}O milli-Q, y se incubó en la disolución de
revelado (carbonato de sodio Na_{2}CO_{3} 30g/L (p/v), 0,05% de
HCOH al 37% (v/v), 2% (v/v) de un tiosulfato de sodio
(Na_{2}S_{2}O_{3}, 5 H_{2}O) 0,2 g/l (p/v) recién
preparado) durante 10 min. como máximo. Se detuvo el revelado del
gel usando una disolución de Na_{2}-EDTA 14 g/l
(p/v) durante 10 min. antes de lavar con H_{2}O
milli-Q. Se determinaron las masas moleculares
aparentes haciendo correr 2 \mug de patrones de peso molecular de
amplio intervalo (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Se barrió el gel en un escáner Arcus II Agfa, con software Agfa
Fotolook versión 3.6. Se cortaron las bandas que iban a
identificarse, se pusieron en tubos Eppendorf y se eliminó la
tinción. Se incubó cada trozo de gel en 30 \mul de disolución de
eliminación de tinción (K_{3}FeCN_{6} 30 mM,
Na_{2}S_{2}O_{3} 100 mM) con agitación en vórtex ocasional
hasta que se eliminó por completo la tinción de los geles
(5-10 min.). Entonces se lavaron los trozos de gel
dos veces durante 10 min. con un mínimo de 100 \mul de H_{2}O
milli-Q durante 10 y luego se almacenaron a 4ºC en
etanol al 10% (v/v).
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron los trozos de gel con 200 \mul de
bicarbonato de amonio 50 mM, durante 10 min. Entonces se
deshidrataron los trozos de gel con 100 \mul de CH_{3}CN al
100% y se secaron en una centrífuga de vacío (HETO, Allerod,
Dinamarca). Se realizó la digestión con tripsina tal como se
describió previamente [Scherl, A., Coute, Y., Deon, C., Calle, A.,
Kindbeiter, K., et al., Mol Biol Cell 2002, 13,
4100-9]. Se realizó
NanoCL-ESI-EM/EM en una trampa
iónica LCQ DecaXP (Thermofinnigan, San Jose, CA) acoplada a un
inyector automático LC-PAL (CTC Analytics, Zwingen,
Suiza) y una microbomba de HPLC Rheos 2000 (Flux Instruments,
Basilea, Suiza). Para cada experimento, se inyectaron 5 \mul de
muestra en CH_{3}CN al 5%, ácido fórmico al 0,1%, en una columna
de fase inversa C18 (diámetro interno de 75 \mum) rellena de
manera interna con Zorbax 300Extend-C18 de 5 \mum
(Agilent Technologies, Wilmington, EE.UU.). Se eluyeron los péptidos
de la columna usando un gradiente de CH_{3}CN en presencia de
ácido fórmico al 0,1%. Para la elución de los péptidos, se aumentó
la concentración de acetonitrilo desde el 8 hasta el 47% en 15 min.
Se usó un divisor de flujo para reducir la velocidad de flujo desde
40 \mul/min. hasta aproximadamente 0,2 \mul/min. Se aplicó un
potencial de 1,8 kV sobre el capilar de nanoelectropulverización
(New Objective, Woburn, MA). Se usó helio como gas de colisión. Se
fijó la energía de colisión al 35% con respecto al máximo. Se
adquirieron los espectros de EM/EM mediante el cambio automático
entre el modo EM y EM/EM. Se eligieron los dos picos mayores de cada
barrido de EM para EM/EM. Se aplicó exclusión dinámica con un
recuento de repeticiones de 2 y una duración de repeticiones de 0,5
min. Tras estas dos adquisiciones de EMEM con el mismo precursor,
se excluyó el precursor del análisis mediante EMEM durante 1,0 min.
Se convirtieron los espectros en archivos DTA, se reagruparon usando
software interno y se realizó la búsqueda en la base de datos con
MASCOT 1.8 (http://www.matrixscience.co.uk/). Se eligió una
tolerancia de 2,0 Da para el precursor y de 1,0 Da para los
fragmentos. Se seleccionó ESI-TRAP como el
instrumento. Se realizó una búsqueda en la base de datos
Swiss-Prot de UniProt sin restricción de especies.
En estas condiciones, el umbral de significación vino dado por una
puntuación de 42 o superior mediante Mascot. También se hizo una
búsqueda de los datos frente a la base de datos
Swiss-Prot de UniProt usando el programa Phenyx
(http://www.phenyx-ms.com/). Se validaron
manualmente los resultados positivos para proteínas con menos de
tres péptidos por encima del umbral. Se hizo una búsqueda adicional
de los datos frente a la base de datos Trembl, lo que dio como
resultado la identificación de otras 22 proteínas. Los resultados se
muestran en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó una de las proteínas que se identificó
que estaba regulada por incremento en LCR de paciente fallecido
como posible biomarcador de la enfermedad cerebrovascular, un
ejemplo de un trastorno relacionado con daño cerebral. Se llevó a
cabo un estudio de pacientes con accidente cerebrovascular y los
resultados se muestran en las figuras 5 a 7. Se obtuvo una señal de
intensidad de ELISA para el homólogo de la proteína de degradación
por fusión de ubiquitina 1 (UFD1) en muestras de plasma de los
pacientes y de pacientes de control negativo. Se extrajeron
muestras de plasma de pacientes entre 0-24 horas y/o
tras 72 horas de su llegada al hospital de urgencias, y se hicieron
coincidir en edad/sexo con muestras de pacientes control.
Se realizó un ELISA usando placas negras
Reacti-Bind^{TM} recubiertas con
NeutrAvidin^{TM} de 96 pocillos (Pierce, Rockford, IL). En primer
lugar se aclararon las placas con solución salina tamponada con
borato, pH 8,4, (BBS) (H_{3}BO_{3} 100 mM,
Na_{2}B_{4}O_{7} 25 mM (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.), NaCl 75
mM (Merck, Darmastadt, Alemania)) en un lavador NOVAPATH^{TM}
(Bio-Rad, Hercules, CA). Luego, se añadieron 50
\mul de anticuerpo conjugado con biotina (2 \mug/ml) preparado
en el tampón de dilución A a pH 7 (DB, poli(alcohol
vinílico), hidrolizado al 80%, peso mol. 9000-10.000
(Aldrich, Milwaukee, WI, EE.UU.), MOPS (ácido
3-[N-morfolino]propanosulfónico) (Sigma),
NaCl, MgCl_{2} (Sigma), ZnCl_{2} (Aldrich), pH 6,90, disolución
de BSA al 30%, de calidad para fabricación (Serological Proteins
Inc., Kankakee, IL)), y se incubó durante una hora a 37ºC. Entonces
se lavaron las placas 3 veces con BBS en el lavador de placas.
Entonces se añadieron 50 \mul de antígeno y se incubó durante una
hora a 37ºC. Se diluyeron las proteínas recombinantes a 100, 50,
25, 12,5, 6,25 ng/ml con el tampón de dilución A para establecer una
curva de calibración. Se diluyeron las muestras de plasma hasta la
concentración apropiada con el tampón de dilución A. Tras la etapa
de lavado, se añadieron 50 \mul de anticuerpo conjugado con
fosfatasa alcalina a la dilución apropiada con tampón A y se incubó
durante una hora a 37ºC. Entonces se lavó la placa de 96 pocillos 3
veces con BBS en el lavador de placas y se añadieron 50 \mul de
sustrato fluorescente Attophos® AP (Promega, Madison, WI). Se
leyeron inmediatamente las placas en un lector de placas de
microtitulación del fluorímetro SpectraMax
GEMINI-XS, (Molecular Devices Corporation,
Sunnyvale, CA, EE.UU.) (\lambda_{excitación} = 444 nm y
\lambda_{emisión} = 555 nm). Se expresan los resultados en UFR
y pueden obtenerse en modo de punto final (sólo una lectura) o en
modo cinético durante 10 minutos. En modo cinético, se fijó el
lector de placas para el registro usando 6 destellos (por pocillo)
que luego se integraron en un promedio. De esta manera, se analizó
cada pocillo 6 veces usando un intervalo de tiempo mínimo entre
cada lectura. Esto se tradujo en un retardo de 2 minutos entre
lecturas. Se calculó la pendiente y se usó para determinar el valor
final para cada pocillo. Se determinó el mejor valor de corte para
discriminar entre los grupos control y con accidente cerebrovascular
(isquémico más hemorrágico o isquémico frente a hemorrágico) usando
curvas ROC generadas en el software GraphPad Prism 4.
Queda claro a partir de la figura 5 que UFD1 se
sobreexpresa en el plasma de pacientes con accidente cerebrovascular
en comparación con pacientes control. Se realizó un análisis
estadístico y se trazaron curvas ROC (software GraphPad Prism 4)
que indican la sensibilidad de la prueba como una función de la
especificidad (figuras 6). Se dedujeron los mejores valores de
corte para distinguir entre pacientes con accidente cerebrovascular
y control a partir de estas curvas ROC. Se obtuvieron una
sensibilidad y una especificidad del 94,4% y 77,8%,
respectivamente, usando los mejores valores de corte. Se realizó una
prueba de Mann-Whitney no paramétrica para comparar
los grupos con accidente cerebrovascular y control. Se obtuvieron
valores de p muy bajos (<0,0001), lo que indica que la diferencia
entre el accidente cerebrovascular y los controles fue sumamente
significativa.
Este resultado demuestra que el homólogo de la
proteína de degradación por fusión de ubiquitina 1 (UFD1) es un
marcador plasmático útil para el diagnóstico temprano del accidente
cerebrovascular, solo, o en combinación con otros biomarcadores.
Como UFD1 se ha hallado en LCR de paciente
fallecido, es una predicción razonable que otros polipéptidos y
proteínas expresados de manera diferencial en LCR de paciente
fallecido también serán útiles como marcadores para trastornos
relacionados con daño cerebral.
Este ejemplo proporciona datos adicionales que
muestran los niveles plasmáticos de UFDP1 en pacientes con accidente
cerebrovascular y control. Los datos adicionales se han obtenido a
partir de dos cohortes de pacientes y controles, la más pequeña de
Ginebra y un panel más exhaustivo de los EE.UU.
Se realizó un ELISA usando placas negras
Reacti-Bind^{TM} recubiertas con
NeutrAvidin^{TM} de 96 pocillos (Pierce, Rockford, IL). En primer
lugar se aclararon las placas en solución salina tamponada con
borato, pH 8,4, (BBS) (H_{3}BO_{3} 100 mM,
Na_{2}B_{4}O_{7} 25 mM (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.), NaCl 75
mM (Merck, Darmastadt, Alemania)) en un lavador NOVAPATH^{TM}
(Bio-Rad, Hercules, CA). Luego, se añadieron 50
\mul de anticuerpo conjugado con biotina específico frente al
marcador relevante (2 \mug/ml) preparado en el tampón de dilución
A a pH 7 y se incubó durante una hora a 37ºC. Entonces se lavaron
las placas 3 veces con BBS en el lavador de placas. Entonces se
añadieron 50 \mul de antígeno o plasma y se incubó durante una
hora a 37ºC. Se diluyeron los antígenos de proteínas recombinantes a
100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 ng/ml con tampón de dilución A
para generar una curva de calibración. Se diluyeron las muestras de
plasma hasta la concentración apropiada con tampón de dilución A.
Tras una etapa de lavado adicional, se añadieron 50 \mul de
anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina específicos frente al
biomarcador relevante a la concentración apropiada en tampón de
dilución A y se incubó durante una hora a 37ºC. Entonces se lavó la
placa de 96 pocillos 3 veces con BBS en el lavador de placas y se
añadieron 50 \mul de sustrato fluorescente Attophos® AP (Promega,
Madison, WI). Se leyeron inmediatamente las placas en un lector de
placas de microtitulación del fluorímetro SpectraMax
GEMINI-XS (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale,
CA, EE.UU.) (\lambda_{excitación} = 444 nm y
\lambda_{emisión} = 555 nm).
Se expresan los resultados en UFR y pueden
obtenerse en modo de punto final (sólo una lectura) o en modo
cinético durante 10 minutos. En modo cinético, para cada pocillo se
promediaron 6 destellos y se analizó cada pocillo 6 veces usando un
intervalo de tiempo mínimo entre cada lectura (2 minutos). Se
calculó la pendiente y se usó para determinar el valor final para
cada pocillo. Se determinó el mejor valor de corte para discriminar
entre los grupos control y con accidente cerebrovascular (isquémico
más hemorrágico o isquémico frente a hemorrágico) usando curvas ROC
generadas en el software GraphPad Prism 4.
Los resultados se muestran en la figura 7. Este
resultado demuestra además que el homólogo de la proteína de
degradación por fusión de ubiquitina 1 (UFD1) es un marcador útil
para el diagnóstico temprano del accidente cerebrovascular, solo, o
en combinación con otros biomarcadores.
Como UFD1 se ha hallado en LCR de paciente
fallecido, es una predicción razonable que otros polipéptidos y
proteínas que se expresan de manera diferencial en LCR de paciente
fallecido también serán útiles como marcadores para trastornos
relacionados con daño cerebral.
En el trabajo actual, se ha usado un método
alternativo a la 2-DE con el fin de caracterizar
adicionalmente el proteoma de LCR post mórtem humano. Se
analizó un conjunto de muestras de LCR post mórtem (n = 5)
usando un protocolo de cuatro etapas: (i) inmunodepleción de
proteínas abundantes en LCR (albúmina, IgG, IgA, transferrina,
antitripsina y haptoglobina), (ii) fraccionamiento de proteínas del
LCR según su pI usando electroforesis de desplazamiento de gel
(OGE) (24), (iii) análisis de las fracciones procedentes de la OGE
mediante SDS-PAGE, (iv) identificación de proteínas
mediante CL-EM/EM. Se validaron proteínas
seleccionadas que se identificaron en el LCR post mórtem
usando inmunotransferencias de tipo Western de muestras individuales
y LCR post mórtem y ante mórtem. Se tratará el
posible interés de las proteínas identificadas en LCR post
mórtem como biomarcadores de daño cerebral.
Todos los productos químicos, a menos que se
establezca lo contrario, se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis,
MI, EE.UU.) y eran de la mayor pureza disponible. El CH_{3}CN se
adquirió de Biosolve (Westford, MA, EE.UU.).
Se recogieron muestras de LCR post mórtem
de cinco pacientes diferentes mediante punción ventricular en la
autopsia, 6 horas tras el fallecimiento en promedio. Los pacientes
fallecidos no tenían ningún historial, síntomas ni signos de ningún
estado psiquiátrico o neurológico. La causa del fallecimiento no
estuvo relacionada con ninguna disfunción del sistema nervioso
central o periférico y los datos neuropatológicos del cerebro
concordaron con cambios relacionados con la edad sin patología
relevante. Se usaron muestras de LCR ante mórtem control
para la validación mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se
recogieron mediante punción lumbar de diagnóstico de cinco
pacientes vivos que tenían a los que se les realizó un examen
neurológico para determinar estados benignos no relacionados con
daño cerebral (cefalea atípica y parálisis nerviosa facial
periférica idiopática). Cada paciente o los familiares del paciente
dieron el consentimiento informado antes de su inclusión. Se
centrifugaron muestras de LCR atraumáticas inmediatamente tras la
recogida, se tomaron alícuotas, se congelaron a -80ºC y se
almacenaron hasta su análisis.
Se usaron muestras de plasma obtenidas del
Hospital Universitario de Ginebra para la evaluación del nivel de
GST-P1. La junta del comité ético institucional
local aprobó el protocolo clínico. Se incluyeron en este estudio
siete pacientes con accidente cerebrovascular y control consecutivos
ingresados en el servicio de urgencias del Hospital Universitario
de Ginebra. De los 7 pacientes consecutivos incluidos, a 3 se les
diagnosticó estados no neurológicos y se clasificaron como muestras
control (2 hombres y 1 mujer, con una edad promedio de 70,26 años)
y a 4 se les diagnosticó accidente cerebrovascular (3 hombres y 1
mujer, edad promedio de 71,81 años) incluyendo 2 accidentes
cerebrovasculares isquémicos y 1 hemorrágico intracerebral. El
diagnóstico de accidente cerebrovascular lo estableció un neurólogo
experimentado y se basó en la aparición repentina de un déficit
neurológico focal y el posterior reconocimiento de una lesión que
concuerda con los síntomas en las imágenes de cerebro obtenidas
mediante TAC o IRM. El grupo control incluía pacientes con cáncer (n
= 2) y uno con trastorno gastrointestinal (n = 1). Para cada
paciente, se recogió una muestra de sangre en el momento del
ingreso en tubos que contenían heparina seca en el plazo de un
intervalo de tres horas tras la aparición de los síntomas. Tras su
centrifugación a 1500 g durante 15 min. a 4ºC, se tomaron
alí-
cuotas de las muestras y se almacenaron a -80ºC hasta el análisis. Se realizaron análisis con las muestras congeladas.
cuotas de las muestras y se almacenaron a -80ºC hasta el análisis. Se realizaron análisis con las muestras congeladas.
Se concentraron muestras reunidas de LCR post
mórtem hasta 300 \mul usando dispositivos de ultrafiltración
de
MWCO de 10 kDa (Vivaspin UF 4, Vivascience, Alemania). La carga proteica fue de aproximadamente 1,6 mg. Entonces se diluyó la muestra 1:5 con tampón A de MARS (Agilent, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se hizo pasar a través de un filtro de 0,22 \mum. Se inyectaron alícuotas de 200 \mul en una columna MARS de 4,6 x 100 mm (Agilent). Se recogieron las fracciones no retenidas, se reunieron y se concentraron hasta aproximadamente 1 ml usando ultrafiltración. Se lavaron estas fracciones concentradas dos veces con NH_{4}HCO_{3} 10 mM. Se realizó un ensayo de concentración de proteínas usando el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
MWCO de 10 kDa (Vivaspin UF 4, Vivascience, Alemania). La carga proteica fue de aproximadamente 1,6 mg. Entonces se diluyó la muestra 1:5 con tampón A de MARS (Agilent, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se hizo pasar a través de un filtro de 0,22 \mum. Se inyectaron alícuotas de 200 \mul en una columna MARS de 4,6 x 100 mm (Agilent). Se recogieron las fracciones no retenidas, se reunieron y se concentraron hasta aproximadamente 1 ml usando ultrafiltración. Se lavaron estas fracciones concentradas dos veces con NH_{4}HCO_{3} 10 mM. Se realizó un ensayo de concentración de proteínas usando el método de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Se realizó el fraccionamiento mediante OGE como
en Heller, M., Michel, P.E., Morier, P., Crettaz, D., Wenz, C.,
Tissot, J.D., Reymond, F., y Rossier, J.S. (2005)
Two-stage Off-Gel isoelectric
focusing: protein followed by peptide fractionation and application
to proteome analysis of human plasma. Electrophoresis 26,
1174-1188. Se preparó el LCR sometido a depleción
para OGE añadiendo urea, tiourea y DTT hasta concentraciones finales
de 7 M, 2 M y 65 mM, respectivamente. Se rehidrataron tiras de IPG
(13 cm, pH 4,0-7,0) con una disolución que contenía
urea 7 M, tiourea 2 M, DTT 65 mM, anfolitos al 0,5% (v/v) (pH
4,0-7,0) y glicerol al 5%. Entonces se puso un
dispositivo de 15 pocillos en el IPG rehidratado y se cargaron 50
\mul de muestra en cada pocillo a lo largo de toda la tira. Se
usaron varios dispositivos multipocillo en paralelo para permitir el
fraccionamiento de la totalidad de la muestra en un único
experimento. Se inició el voltaje a 100 V (1 hora) luego se aumentó
hasta 500 V (durante 1 hora), 1000 V (durante 1 hora) y finalmente
hasta 2000 V en el que se mantuvo durante 15 horas. Se realizó el
enfoque a 20ºC con un límite de corriente de 50 mA. Se recuperaron
fracciones de cada uno de los pocillos.
Se separaron las proteínas de las fracciones de
OGE mediante SDS-PAGE en geles de
Tris-glicina al 12% de T preparados de manera
interna (8 x 5 x 0,15 cm). Se cargaron aproximadamente 60 \mul de
cada fracción en el gel. Tras la migración, se tiñeron los geles
con una tinción de plata compatible con EM (Blum, H., Beier, H., y
Gross, H.J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA
and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8,
93-99). Se eliminó la tinción de las bandas cortadas
de los geles teñidos con plata, con K_{3}Fe(CN_{6}) 15
mM, Na_{2}S_{2}O_{3} 50 mM, y se lavaron con agua MilliQ
(Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) (26). Entonces se deshidrataron
los trozos de gel en CH_{3}CN al 100% y se secaron en una
centrífuga de vacío. Se digirieron las proteínas en gel usando
protocolos habituales (Scherl, A., Coute, Y., Deon, C., Calle, A.,
Kindbeiter, K., Sanchez, J.C., Greco, A., Hochstrasser, D., y Diaz,
J.J. (2002) Functional proteomic analysis of human nucleolus. Mol.
Biol. Cell 13, 4100-4109). Se extrajeron los
péptidos con TFA al 1% seguido por CH_{3}CN al 50%, TFA al 1%. Se
concentraron los extractos combinados mediante centrifugación a
vacío.
Se disolvieron los péptidos extraídos tras la
digestión en gel, en 9 \mul de CH_{3}CN al 5%, ácido fórmico al
0,1% y se cargaron 5 \mul para el análisis mediante
CL-EM/EM. Se conectó una precolumna (diámetro
interno de 100 \mum, 2-3,5 cm de largo)
directamente a una columna analítica (diámetro interno de 75 \mum,
9-10 cm de largo). Se rellenaron ambas columnas de
manera interna con Zorbax Extend C-18 de 5 \mum,
3\ring{A} (Agilent). Se desarrolló un gradiente desde el 4 hasta
el 56% de disolvente B en disolvente A (disolvente A: CH_{3}CN al
5%, ácido fórmico al 0,1%, disolvente B: CH_{3}CN al 80%, ácido
fórmico al 0,1%) durante 15 minutos a una velocidad de flujo de
aproximadamente 300 nl/min. Se aumentó la concentración de
disolvente B hasta el 95% antes de volver a las condiciones
iniciales para la reequilibración de la columna. Se pulverizó
directamente el eluato en la fuente de nano-ESI de
un espectrómetro de masas con trampa iónica LCQ DecaXP (Thermo
Finnigan, San Jose, CA) con un voltaje de pulverización de 1,8 - 2,2
kV. Se usó la adquisición dependiente de datos para seleccionar
automáticamente 2 precursores para EM/EM de cada espectro de EM
(intervalo de m/z de 400-1600). Se adquirieron
espectros de EM/EM con una energía de colisión normalizada del 35%,
una activación Q de 0,25 y una anchura de aislamiento de 4 m/z. El
tiempo de activación fue de 30 milisegundos. Se aplicó exclusión
dinámica con un recuento de repeticiones de 2, un tiempo de
exclusión de 30 segundos y una anchura de pico de exclusión de
\pm 1,5 Da. También se aplicó activación de ancho de banda. Se
usaron tiempos de inyección máximos de 50 milisegundos y 200
milisegundos para las adquisiciones de EM y EM/EM, respectivamente,
y se fijaron los correspondientes objetivos de control automático de
ganancia en 10^{8}.
Se generaron listas de picos usando el software
Bioworks 3.1 (Thermo Finnigan, San Jose, CA). Se combinaron
automáticamente los archivos de datos resultantes de cada análisis
en un único archivo de texto. Se hizo una búsqueda de las listas de
picos resultantes frente a la base de datos
UniProt/Swiss-Prot sin restricción de especies
usando Mascot operando en un servidor local (versión 1.8, Matrix
Sciences, R.U.) y el escritorio virtual Phenyx (Gene Bio, Suiza).
Se usó Mascot con la masa promedio seleccionada, un error de la masa
del precursor de 2,0 Da y un error de la masa del péptido de 1,0
Da. Se seleccionó la tripsina como la enzima, con una sola posible
escisión que falte. Se seleccionó la trampa iónica de ESI como el
tipo de instrumento y metionina oxidada como modificación variable.
Para Phenyx, se seleccionó la trampa iónica para el tipo de
instrumento y LCQ para el algoritmo. Se usaron dos tandas de
búsqueda, ambas con tripsina seleccionada como la enzima y
metionina oxidada como modificación variable. En la primera tanda,
se permitió que faltara una escisión y se usó el modo de escisión
normal. Se seleccionó esta tanda en el modo de búsqueda
"turbo". En la segunda tanda, se permitió que faltaran 2
escisiones y se fijó el modo de escisión en semiescindido. La
longitud mínima de péptido permitida fue de 6 aminoácidos y la
tolerancia del ion original fue de 2,0 Da en ambas tandas de
búsqueda. Se redujeron ligeramente los criterios de aceptación en la
búsqueda de la segunda tanda (tanda 1: puntuación AC de 7,0,
puntuación Z del péptido de 7,0, valor de p del péptido de 1
E-6; tanda 2: puntuación AC de 7,0, puntuación Z
del péptido de 6,0, valor de p del péptido de 1
E-5). Se aceptó que las proteínas que se
identificaron como proteínas humanas con 3 o más péptidos de alta
puntuación tanto para Mascot como para Phenyx eran verdaderas
coincidencias. Los "péptidos de alta puntuación" correspondían
a péptidos que estaban por encima del umbral en las búsquedas con
Mascot (probabilidad del 5% de falsa coincidencia para cada péptido
por encima de esta puntuación) y por encima de una puntuación de
péptido de 8,5 para las búsquedas con Phenyx usando el algoritmo de
puntuación de LCQ. Se validaron manualmente las coincidencias con
menos de 3 péptidos. Sólo se incluyeron las coincidencias de un
único péptido si eran péptidos de alta puntuación en los resultados
de ambos programas y si se consideró que los datos coincidían bien
con la secuencia del péptido.
También se hizo una búsqueda de las listas de
picos frente a la base de datos Swiss-Prot y TrEMBL
combinadas de UniProt restringida a entradas humanas usando el
escritorio virtual Phenyx (Gene Bio, Suiza). Los criterios de
aceptación fueron más rigurosos que para la búsqueda de la base de
datos Swiss Prot sola (tanda 1: puntuación AC de 16,0, puntuación Z
del péptido de 8,0, valor de p del péptido de 1 E-7;
tanda 2: puntuación AC de 10,0, puntuación Z del péptido de 7,0,
valor de p del péptido de 1 E-6).
Se mezcló un volumen de 30 \mul de LCR en
bruto o sometido a depleción con 120 \mul de una disolución de
rehidratación. La disolución final contenía urea 8 M, CHAPS al 4%
(p/v), DTT 65 mM, Resolytes 3,5-10 al 2% (v/v) y
una cantidad traza de azul de bromofenol. Se usó la totalidad de la
muestra correspondiente a aproximadamente 6 \mug de proteínas
para la rehidratación de una tira de IPG de pH 3-10,
no lineal de 7 cm comercial (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se
llevó a cabo el IEF. Se realizó una separación bidimensional en
geles de SDS-PAGE fabricados de manera interna (9 x
8 x 0,15 cm, 12% de T, 2,6% de C). Se tiñeron los geles con plata
amoniacal.
Se cargaron muestras de LCR ante y
post mórtem (20 \mul) en gel de
Tris-glicina al 12% de T preparados de manera
interna (8 x 7 x 0,1 cm). Se usaron los siguientes controles
positivos: 100 ng de calcifosina recombinante (Scientific Proteins,
Suiza), 100 ng de proteína de degradación por fusión de ubiquitina 1
(UFD1) recombinante (Biosite, San Diego, CA, EE.UU.), 1 \mul de
extracto de línea celular U373 para la isoforma beta de la proteína
14-3-3, y 5 \mul de extracto de
línea celular HeLa para
glutatión-S-transferasa P
(GST-P). Se sometieron a electrotransferencia las
proteínas separadas mediante SDS-PAGE sobre una
membrana de PVDF tal como describen Towbin et al. (Towbin,
H., Staehelin, T. y Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of
proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:
procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,
4350-4354). Se tiñeron las membranas con negro de
amido, se eliminó la tinción con agua y se secaron. Se realizó la
inmunodetección usando anticuerpos específicos y el kit por
quimioluminiscencia de inmunotransferencia de tipo Western de BM
(Roche, Basilea, Suiza). Se usaron los siguientes anticuerpos:
anticuerpo policlonal de conejo anti-calcifosina
humana (Scientific Proteins, Witterswil, Suiza) diluido 1/1000,
anticuerpo Omniclonal® de ratón anti-UFD1 humana
(Biosite, San Diego, CA, EE.UU.) diluido 1/1000, anticuerpo
policlonal de conejo
anti-14-3-3 \beta
humana (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) diluido
1/500, anticuerpo monoclonal de ratón
anti-GST-P humana (Transduction
Laboratories, Lexington, KY, EE.UU.) diluido 1/1000.
Se cargaron cinco \mul de fracciones de OGE
obtenidas de conjuntos de LCR post mórtem y ante
mórtem sobre geles de Tris-glicina al 12% de T
preparados de manera interna (8 x 7 x 0,1 cm). Se usaron cinco
\mul de conjuntos de LCR en bruto post mórtem y ante
mórtem como controles positivos y negativos, respectivamente.
Se sometieron a electrotransferencia las proteínas separadas
mediante 1-DE sobre una membrana de PVDF tal como
describen Towbin et al. (30). Se tiñeron las membranas con
negro de amido, se eliminó la tinción con agua y se secaron. Se
realizó la inmunodetección usando anticuerpo policlonal de conejo
anti-14-3-3 humana
(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) diluido 1/500 y
el kit por quimioluminiscencia de inmunotransferencia de tipo
Western de BM (Roche, Basilea, Suiza).
Como no había disponible ningún kit comercial
para la detección de GST-P1, se desarrolló una
prueba de ELISA preparada de manera interna. Un técnico de
laboratorio experimentado llevó a cabo los ensayos (de manera ciega)
con un coeficiente de variación inferior al 15%. Se realizó un
ELISA tipo sándwich usando placas negras
Reacti-Bind^{TM} recubiertas con
NeutrAvidin^{TM} de 96 pocillos (Pierce, Rockford, IL). En primer
lugar se aclararon las placas con solución salina tamponada con
borato, pH 8,4, (BBS) (H_{3}BO_{3} 100 mM,
Na_{2}B_{4}O_{7} 25 mM (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) NaCl 75
mM (Merck, Darmastadt, Alemania)) en un lavador NOVAPATH^{TM}
(Bio-Rad, Hercules, CA). Luego, se añadieron 50
\mul de anticuerpo monoclonal frente a GST-P1
conjugado con biotina (2 \mug/ml) preparado en el tampón de
dilución A a pH 7 (DB, poli(alcohol vinílico), hidrolizado
al 80%, peso mol. 9000-10.000 (Aldrich, Milwaukee,
WI, EE.UU.), MOPS (Sigma), NaCl, MgCl_{2} (Sigma), ZnCl_{2}
(Aldrich), pH 6,90, disolución de BSA al 30%, de calidad para
fabricación (Serological Proteins Inc., Kankakee, IL)), y se incubó
durante una hora a 37ºC. Entonces se lavaron las placas 3 veces con
BBS en el lavador de placas. Se usaron cincuenta \mul de muestras
de LCR o sangre diluidas dos veces y se incubó durante una hora a
37ºC. Se sometió a ensayo cada muestra por duplicado y se
distribuyeron aleatoriamente sobre la placa. Se diluyó proteína
GST-P1 recombinante (Invitrogen) a 100 ng/ml con el
tampón de dilución A. Se obtuvo la curva de calibración en la misma
placa a concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 y 0
\mug/l. Tras la etapa de lavado, se añadieron 50 \mul de
anticuerpos monoclonales frente a GST-P1 conjugados
con fosfatasa alcalina a la dilución apropiada con el tampón de
dilución A y se incubó durante una hora a 37ºC. Entonces se lavó la
placa de 96 pocillos 3 veces con BBS en el lavador de placas y se
añadieron 50 \mul de sustrato fluorescente Attophos® AP para
fluorescencia (Promega, Madison, WI). Se leyeron inmediatamente las
placas en un lector de placas de microtitulación del fluorímetro
SpectraMax GEMINI-XS, (Molecular Devices
Corporation, Sunnyvale, CA, EE.UU.) usando unidades de fluorescencia
relativas (UFR) para el modo de punto final
(\lambda_{excitación} = 444 nm y \lambda_{emisión} = 555
nm). Se obtuvo una curva de calibración usando una regresión lineal
en el intervalo lineal de la curva. Inicialmente se expresaron los
niveles de proteína en unidades de fluorescencia relativas (UFR) y
se calcularon las concentraciones mediante la curva de
calibración.
El análisis de líquidos corporales, tales como
LCR, plantea un reto en cuanto al alto intervalo dinámico de
concentraciones de proteína. El predominio de proteínas
particulares, tales como albúmina e inmunoglobulinas, da como
resultado que muchas proteínas de menor abundancia quedan sin
detectar mediante técnicas convencionales, tales como
2-DE y espectrometría de masas. Por tanto, se
realizó la inmunodepleción de algunas de las proteínas más
abundantes en el LCR (albúmina, serotransferrina, IgG, IgA,
haptoglobina y -1-antitripsina) con el fin de
mejorar la cobertura de las proteínas de baja abundancia. Para
acceder a los resultados de la depleción de las proteínas
abundantes, se realizó 2-DE de las muestras de LCR
antes y después de la sustracción de inmunoafinidad. Los geles
muestran importantes similitudes antes y después de la depleción y
confirman que la retirada de algunas proteínas abundantes permitió
la detección de manchas de menor abundancia. Este resultado obtenido
para la muestra de LCR post mórtem reproduce perfectamente
los presentados por Maccarrone et al. (Maccarrone, G.,
Milfay, D., Birg, I., Rosenhagen, M., Holsboer, F., Grimm, R.,
Bailey, J., Zolotarjova, N., y Turck, C.W. (2004) Mining the human
cerebrospinal fluid proteome by inmunodepletion and shotgun mass
espectrometry. Electrophoresis 25, 2402-12) para LCR
ante mórtem con reproducibilidad de depleción similar de
serie en serie (datos no mostrados).
Tras la depleción de proteínas abundantes, se
fraccionó la muestra de LCR post mórtem mediante OGE según su
pI. Se realizó la OGE usando un gradiente de pH que oscilaba desde
4,0 hasta 7,0. Entonces se separaron las fracciones obtenidas de la
OGE mediante SDS-PAGE. La figura 2 muestra un gel de
SDS-PAGE teñido con plata de una muestra de LCR
post mórtem. Como resultado del fraccionamiento mediante OGE,
algunas bandas se representaron en múltiples fracciones y otras se
concentraron en una o dos fracciones. También se usaron
inmunotransferencias de tipo Western para verificar la calidad del
fraccionamiento mediante OGE. Se separó una muestra del LCR post
mórtem reunido, mediante SDS-PAGE junto con cada
una de las fracciones procedentes de la OGE de la muestra. Por
ejemplo, fue evidente la proteína
14-3-3 gamma en la muestra de LCR
post mórtem no fraccionada y en una única fracción tras la
OGE de la muestra de LCR post mórtem (fracción 3). Estos
resultados se correspondían con las identificaciones obtenidas
mediante EM y la búsqueda en bases de datos. Se identificó la
proteína 14-3-3 gamma en una banda
de la fracción 3 procedente del fraccionamiento de LCR post
mórtem (véase la tabla 2). La muestra de LCR ante mórtem
no mostró ninguna banda para la proteína
14-3-3 gamma.
Se identificaron las proteínas a partir de
bandas cortadas de los geles. Se cortaron bandas de regiones
equivalentes tanto de los geles de LCR post mórtem como de
los geles de LCR ante mórtem. Las únicas partes de los
carriles que no se escindieron fueron aquellas en las que no
mostraron bandas ni las muestras post mórtem ni
lasante mórtem. Se identificó un total de 316 proteínas en
este estudio y se enumeran estos resultados en las tablas 2 y 3, en
las que la tabla 2 contiene proteínas de la base de datos
UniProt/Swiss-Prot (se hizo la búsqueda con todas
las especies) y la tabla 3 contiene las proteínas identificadas a
partir de la base de datos TrEMBL de UniProt (se hizo la búsqueda
con la taxonomía restringida al ser humano) (véanse los datos
complementarios). De todas las proteínas identificadas, se
identificaron 294 de la base de datos Swiss Prot y otras 22 de las
búsquedas en TrEMBL sobre ser humano. De las 299 proteínas que se
identificaron a partir de las fracciones de LCR post mórtem,
201 se identificaron de manera única en LCR post mórtem. Se
identificó un total de 115 proteínas en las fracciones de LCR
ante mórtem y 17 de estas proteínas eran únicas para estas
fracciones. De todas las proteínas identificadas, 98 estaban
presentes tanto en fracciones de LCR post mórtem como ante
mórtem.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigaron adicionalmente proteínas de
interés específico, tales como las proteínas que sólo se
identificaron en fracciones de LCR post mórtem o las que se
sabe que están asociadas con trastornos cerebrales, usando
inmunotransferencias. La figura 8 muestra inmunotransferencias de
tipo Western de cuatro proteínas que se identificaron sólo en
fracciones post mórtem. Como se describe en la sección de
métodos, se separaron muestras de LCR no fraccionadas sobre un gel
de SDS-PAGE y luego se sometieron a
electrotransferencia sobre una membrana de PVDF. Entonces se sondó
la membrana para detectar proteínas de interés usando anticuerpos
específicos. Los resultados para la proteína
14-3-3 beta, calcifosina,
GST-P y UFD1 se muestran en la figura 8. Para las
tres primeras proteínas, la evidencia de su concentración aumentada
en LCR post mórtem en comparación con LCR ante mórtem
es clara a partir de la fuerte señal evidente en cada una de las
muestras de LCR post mórtem pero no en las muestras ante
mórtem. El resultado es menos claro para UFD1, pero todavía es
evidente una concentración aumentada de esta proteína en las
muestras de LCR post mórtem. También se sometieron a prueba
otras isoformas de la proteína
14-3-3 (épsilon, gamma, teta, zeta)
y proporcionaron resultados idénticos a los de la isoforma beta
(datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Las búsquedas bibliográficas de las proteínas
identificadas a partir de la base de datos
Swiss-Prot permitieron su clasificación mediante su
supuesta ubicación y función. Las proteínas circulantes (51%) y las
proteínas secretadas (9%) clásicas representaban juntas la mayoría
de las proteínas identificadas en las fracciones de LCR ante
mórtem. En contraposición, la mayoría de las proteínas
identificadas en la muestra de LCR post mórtem tenían una
supuesta ubicación intracelular (57,5%) y hubo una proporción menor
de proteínas circulantes (21%) y proteínas secretadas (3%)
clásicas. Considerando las proteínas identificadas únicamente en las
fracciones de LCR post mórtem, se encontró que más del 75%
tenían una supuesta ubicación intracelular. Estos datos sugieren
fuertemente que la mayoría de esas proteínas aparecen en LCR post
mórtem por escape tisular. También se observaron diferencias en
las funciones representadas por las proteínas identificadas en LCR
ante mórtem en comparación con LCR post mórtem. En
LCR ante mórtem, se encontró que numerosas proteínas estaban
implicadas en la unión y el transporte de proteínas, la
coagulación, la inmunidad o la inflamación. En LCR post
mórtem, la proporción de esas clases funcionales fue mucho
menor, mientras que la proporción de clases funcionales tales como
enzimas, proteínas estructurales y proteínas de transducción de
señales fue superior. La mayoría de las proteínas identificadas
únicamente en el conjunto de LCR post mórtem estaban
asociadas con funciones intracelulares incluyendo enzimas
metabólicas, proteínas estructurales y proteínas implicadas en las
rutas de transducción de señales y en el metabolismo de
proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un estudio de 2-DE anterior
identificó varias proteínas con niveles aumentados en LCR post
mórtem en comparación con LCR ante mórtem. Estudios de
validación adicionales mostraron el posible interés de algunas de
estas proteínas como marcadores bioquímicos de diversos trastornos
neurológicos. El objetivo del presente estudio fue caracterizar
adicionalmente el proteoma del LCR post mórtem con el fin de
identificar nuevos posibles marcadores de daño cerebral.
Se realizó un análisis paralelo de muestras de
LCR ante mórtem y post mórtem reunidas usando un
protocolo que combinaba varias etapas de fraccionamiento de
proteínas antes de la identificación de las proteínas mediante EM.
Se identificó un total de 115 proteínas en el conjunto ante
mórtem y de 299 en el conjunto post mórtem, dando como
resultado un total de 316 identificaciones de proteínas distintas.
La comparación entre las listas de proteínas ante mórtem y
post mórtem indicó que 201 proteínas se identificaron de
manera única en las fracciones de LCR post mórtem. Con el
fin de reducir el riesgo de introducir diferencias entre las
muestras debido a sesgo técnico, se controló cuidadosamente cada
etapa del análisis. Para la depleción de proteínas, se usó un
método sumamente específico basado en cromatografía de sustracción
por inmunoafinidad. Este sistema minimiza el riesgo de eliminación
de proteínas no específicas. Las proteínas del LCR proteínas se
fraccionaron adicionalmente según su pI usando OGE. Se ha
demostrado que la técnica de OGE separa de manera fiable proteínas
con una resolución de hasta 0,15 unidades de pH. La inmunodetección
de la isoforma gamma de la proteína
14-3-3 sólo en una única fracción
de las fracciones post mórtem seguido por OGE confirmó el
poder de resolución de la técnica. El análisis en gel de
2-DE y SDS-PAGE de fraccionamientos
por duplicado de muestras de LCR ante mórtem y post
mórtem también confirmó la alta reproducibilidad de OGE (datos
no mostrados). En el estudio actual, el fraccionamiento por OGE de
las muestras ante mórtem y post mórtem se realizó en
la misma serie usando un dispositivo de múltiples pocillos con el
fin de evitar las variaciones entre ensayos. Las fracciones
obtenidas de la OGE se separaron mediante SDS-PAGE.
Las fracciones de proteínas ante y post mórtem
correspondientes se cargaron siempre en el mismo gel. Tras la
tinción con plata, se cortaron los carriles de gel usando un patrón
idéntico para las fracciones ante y post mórtem
correspondientes. Se realizó la digestión de proteínas en gel y la
extracción de péptidos en paralelo para las fracciones ante
y post mórtem correspondientes. En la etapa final del
protocolo, se identificaron las proteínas mediante análisis por
CL-ESI-EM/EM usando un espectrómetro
de masas con trampa iónica. A menudo se considera que el análisis
por CL-ESI-EM/EM dependiente de los
datos es escasamente reproducible entre adquisiciones de datos por
duplicado. Éste es generalmente el caso para los estudios de
proteoma a gran escala que investigan muestras de proteínas muy
complejas. En el estudio presentado aquí, el análisis por
CL-ESI-EM/EM se realizó en péptidos
extraídos de pequeñas bandas de gel de SDS-PAGE.
Este enfoque redujo la complejidad de la mezcla de péptidos
analizada y disminuyó el riesgo de pérdida en las identificaciones
de proteínas. Se realizaron experimentos de inmunotransferencia con
el fin de comprobar que las diferencias entre las listas de
proteínas ante y post mórtem realmente correspondían
a diferencias en la concentración de proteínas. Los resultados
obtenidos tanto de las muestras de LCR no fraccionadas como de las
fracciones de OGE confirmaron los resultados del análisis por
CL-ESI-EM/EM.
El uso de LCR post mórtem como una fuente
de posibles marcadores proteicos de daño cerebral se basó en la
suposición de que la necrosis cerebral global tras el fallecimiento
da como resultado el escape de proteínas desde los tejidos dañados
hacia el LCR, imitando de ese modo acontecimientos asociados con
lesiones del tejido cerebral en diversos trastornos neurológicos.
Por consiguiente, el 75% de las 201 proteínas identificadas de
manera única en la muestra de LCR post mórtem tenía una
supuesta ubicación intracelular, debido lo más probablemente a su
escape de las células cerebrales dañadas. Además, se encontró que la
mayoría de las proteínas identificadas a partir de LCR post
mórtem estaban asociadas con funciones intracelulares (enzimas
metabólicas, proteínas estructurales, proteínas de transducción de
señales y proteínas implicadas en síntesis y degradación). Un
respaldo adicional para el argumento de que la mayoría de las
proteínas identificadas específicamente en el LCR post
mórtem aparecen por escape tisular procedió de la comparación de
estos resultados con estudios previos de LCR de sujetos sanos.
Aproximadamente el 70% de las proteínas identificadas en el conjunto
de LCR ante mórtem ya se ha descrito en al menos uno de
estos estudios. En contraposición, sólo se notificó el 15% de las
proteínas detectadas de manera única en el conjunto de LCR post
mórtem en estos estudios previos. Dado que las muestras
ante y post mórtem se analizaron en idénticas
condiciones, esta discrepancia sugiere que la mayoría de las
proteínas identificadas de manera única en la muestra post
mórtem o bien están ausentes en LCR ante mórtem sano o
bien están presentes a niveles muy bajos. Su detección se vio
facilitada presumiblemente en LCR post mórtem tras su
liberación de las células dañadas.
Las búsquedas bibliográficas de las 201
proteínas identificadas específicamente en LCR post mórtem
también reveló que varias de ellas se habían descrito previamente
como posibles marcadores de trastornos cerebrales. Por ejemplo,
H-FABP y DJ-1, que se identificaron
anteriormente en el estudio de 2-DE de LCR post
mórtem, se han validado como posibles marcadores plasmáticos
tempranos de accidente cerebrovascular. También se demostró que
H-FABP era un posible marcador de ECJ y otras
demencias neurodegenerativas. Se han descrito la proteína ácida
fibrilar de la glía y la creatina cinasa BB como posibles marcadores
de diversos trastornos relacionados con daño cerebral, aunque se ha
cuestionado su utilidad clínica. También se identificaron varias
isoformas de la proteína 14-3-3,
que es un marcador de ECJ en LCR conocido. Otro hallazgo interesante
fue la identificación en LCR post mórtem de un fragmento de
la cadena alfa de espectrina de cerebro. Los fragmentos de
espectrina, denominados productos de descomposición de espectrina
(SBP), se producen en una variedad de estados neurodegenerativos
mediante proteólisis mediada por caspasa 3 y calpaína. Son
particularmente estables y se propusieron como posibles marcadores
en LCR de lesión cerebral por traumatismo. El fragmento identificado
en este estudio tenía un peso molecular de aproximadamente 120 kDa,
correspondiente a un SBP específico producido por la proteólisis de
caspasa 3.
Muchas identificaciones de proteínas adicionales
a partir de este estudio son de interés como posibles marcadores de
trastornos cerebrales debido a sus niveles elevados en LCR post
mórtem en comparación con LCR ante mórtem. A partir de
la lista de 201 proteínas identificadas de manera única en LCR
post mórtem, se han destacado varias puesto que se ha
notificado que son específicas del cerebro, que tienen altos niveles
de expresión en el cerebro y/o que se han asociado con lesión o
patología del sistema nervioso. Se ha seleccionado un total de 22
proteínas usando estos criterios (tabla 4).
Estas proteínas tienen todas una supuesta
ubicación intracelular o en la membrana y, con la excepción de dos
proteínas, se identificaron a partir de bandas de gel de
SDS-PAGE con Mr correspondientes al PM teórico de
la proteína de longitud completa. Se detectaron las proteína fosfato
de tipo receptor F y Mu en bandas de gel con Mr de aproximadamente
120 kDa mientras que los PM teóricos de las proteínas de longitud
completa son de 210.282 kDa y 161.704 kDa, respectivamente. Varias
de las proteínas mostradas en la tabla 4 también se han detectado
en estudios anteriores de LCR ante mórtem (véase la tabla 2).
Esto no es sorprendente, puesto que los productos de escape tisular
también se liberan a bajos niveles desde tejidos sanos hacia
líquidos corporales (1). Dado que los métodos para la
identificación de proteínas a partir de mezclas complejas continúan
logrando menores límites de detección, se prevé que se encontrarán
productos de escape tisular adicionales en LCR ante mórtem.
En el estudio actual, sin embargo, estas proteínas se identificaron
de manera única en las fracciones post mórtem, lo que
sugiere que su concentración en LCR estaba aumentada en el modelo de
lesión cerebral masiva.
Tomados juntos, estos datos sugieren fuertemente
que las 22 proteínas seleccionadas representan posibles marcadores
de daño cerebral sumamente interesantes. Según este modelo, se
liberaron de células dañadas hacia el LCR tras la necrosis del
tejido cerebral.
Además, se ha notificado que son específicas del
cerebro o que tienen altos niveles de expresión en el cerebro,
aumentando de ese modo la posibilidad de ser marcadores específicos
de lesión cerebral. Además, se han encontrado niveles de expresión
alterados de varias de estas proteínas en trastornos neurológicos o
tras lesión del sistema nervioso. Estudios de validación usando
tanto muestras de suero como de LCR de pacientes determinarán la
utilidad de estas proteínas como marcadores de daño cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la validación mediante ELISA para
evaluar la concentración en sangre de la
glutatión-S-transferasa P
(GSTP-1) en dos cohortes independientes de pacientes
que englobaban pacientes con accidente cerebrovascular con
diferentes subtipos (isquemia, hemorragia y ataque isquémico
transitorio (AIT)) y pacientes control. Detalles de las cohortes son
los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de plasma correspondían a diez
controles y diez pacientes con accidente cerebrovascular con edad
(nacimiento desde 1911 hasta 1935) y sexo (7 mujeres y 3 hombres)
coincidentes, recogidas y sometidas a prueba en Ginebra. Los
pacientes con accidente cerebrovascular y control ingresaron en el
servicio de urgencias del Hospital Universitario de Ginebra y se
incluyeron en este estudio desde agosto de 1996 hasta enero de 1997.
Para cada paciente, se recogió una muestra de sangre en tubos que
contenían heparina seca en el momento del ingreso. Tras la
centrifugación a 1500 g durante 15 min. a 4ºC, se tomaron alícuotas
de las muestras de plasma y se almacenaron a -20ºC hasta su
análisis. El grupo control (7 mujeres y 3 hombres; edad media: 78,3
años; intervalo: 66-89 años) está compuesto por
pacientes que presentan diversos estados médicos o quirúrgicos,
incluyendo cáncer, trastornos gastrointestinales, patologías
ortopédicas y oftalmológicas. Ninguno de ellos tiene un historial
previo o reciente de acontecimiento cerebrovascular.
El grupo con accidente cerebrovascular está
compuesto por pacientes a los que se les diagnosticó accidente
cerebrovascular (7 mujeres y 3 hombres; edad media: 74,1 años;
intervalo: 62-85 años) incluyendo 9 accidentes
cerebrovasculares isquémicos y 1 hemorrágico. El intervalo de tiempo
entre el acontecimiento neurológico y la primera extracción de
sangre osciló desde inferior a 12 horas (n = 6) y hasta 2 días (n =
2 para 24 horas y n = 2 para 2 días). El diagnóstico de accidente
cerebrovascular lo estableció un neurólogo experimentado y se basó
en una aparición repentina de un déficit neurológico focal y el
posterior reconocimiento de una lesión que concuerda con los
síntomas de las imágenes de cerebro obtenidas mediante TAC o IRM. El
grupo con accidente cerebrovascular se separó según el tipo de
accidente cerebrovascular (isquemia o hemorragia), la ubicación de
la lesión (tronco encefálico o hemisferio) y la evolución clínica a
lo largo del tiempo (AIT cuando se producía recuperación completa
en el plazo de 24 horas o accidente cerebrovascular establecido
cuando el acontecimiento neurológico todavía estaba presente tras 24
horas).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incluyeron en este estudio veintinueve
pacientes control y 39 con accidente cerebrovascular (tabla 5). Las
pruebas se realizaron en muestras de sueros. El subgrupo con
accidente cerebrovascular incluyó 10 pacientes hemorrágicos y 29
isquémicos. La población isquémica se dividió en (i)
cardioembólicos, entre ellos infarto de circulación anterior
parcial (n = 5) y total (n = 4), (ii) aterotrombóticos, entre ellos
infarto de circulación anterior parcial (n = 5) y total (n = 5) y
(iii) infarto lacunar (n = 5) y AIT (n = 5). Los 39 pacientes con
accidente cerebrovascular se incluyeron en el plazo de 24 horas tras
la aparición de los síntomas, y se obtuvo el tiempo exacto para 18
pacientes. El intervalo de tiempo promedio entre el acontecimiento
neurológico y la primera extracción de sangre para estos pacientes
fue de 10,0 horas (intervalo de 30 min. a 6,25 días).
Los resultados se muestran en la figura 9. El
nivel de GSTP-1 fue significativamente superior en
la sangre de los pacientes con accidente cerebrovascular en las
cohortes suiza y española (p<0,0001, pruebas de
Mann-Whitney) con un 100% de sensibilidad y
especificidad en la cohorte suiza y con un 72% de sensibilidad y un
93% de especificidad en la cohorte española.
Este resultado demuestra que
GSTP-1 es un marcador útil para el diagnóstico
temprano del accidente cerebrovascular, solo, o en combinación con
otros biomarcadores.
Dado que GSTP-1 se ha encontrado
sobreexpresada en el LCR de paciente fallecido, es una predicción
razonable que otros polipéptidos y proteínas expresadas de manera
diferencial en el LCR de paciente fallecido también serán útiles
como marcadores para trastornos relacionados con daño cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
La apolipoproteína A-IV
(ApoA-IV) se identificó por primera vez en el
análisis proteómico del LCR descrito en el ejemplo 4 anterior. Para
evaluar su utilidad en el diagnóstico de trastornos relacionados con
daño cerebral, se estudió su presencia en el plasma de pacientes
con enfermedad de Alzheimer (EA) usando inmunotransferencia de tipo
Western.
Las muestras de plasma se diluyeron 1:10 con
agua doblemente destilada y se sometieron a ensayo usando un método
de unión a colorante de Bradford (las muestras diluidas permiten el
manejo de volúmenes de alícuotas de tamaño adecuado).
Se llevó a cabo SDS-PAGE usando
muestras de 20 \mug por carril (2 \mug si la muestra es un
anticuerpo primario o secundario desnaturalizado) en geles de
acrilamida al 16%, de 1,5 mm de espesor, en 10 pocillos (NOVEX)
durante 1 h a 80 V; 1,5 h a 125 V. A esto le siguió una
inmunotransferencia de tipo Western sobre membrana de nitrocelulosa
a 50 V durante 1,5 h. Las inmunotransferencias se sondaron con los
siguientes anticuerpos:
Anti-ApoA-IV
(específico del extremo N-terminal), Santa Cruz
Biotechnology, Inc.
Anti-ApoA-IV
(específico del extremo C-terminal), Santa Cruz
Biotechnology, Inc.
Ambos anticuerpos son anticuerpos policlonales
de cabra purificados por afinidad producidos frente a un mapeo de
péptidos cerca del extremo terminal amino
(N-terminal) o carboxilo
(C-terminal) de ApoA-IV de origen
humano. Se eligieron estos anticuerpos puesto que el sondaje para
determina los extremos N y C-terminal debe aumentar
la posibilidad de detección de la proteína y/o fragmentos de
ApoA-IV. Los resultados de este análisis se muestran
en la figura 10.
Se encontraron varias bandas que parecían ser
específicas para ApoA-IV y también discriminatorias
para la EA. Estas bandas no aparecen en la inmunotransferencia
control sólo con anticuerpos secundarios para las muestras control o
de EA.
Las bandas 3-6 que se observan
en la región de 10-16 kDa son discriminatorias para
la EA, pero también parecen alinearse con bandas en los carriles de
anticuerpo desnaturalizado
anti-ApoA-IV. También se ha
observado que las bandas 3-6 son mucho más intensas
en las inmunotransferencias en las que se han usado anticuerpos
anti-ApoA-IV específicos del extremo
N-terminal.
Se observaron otras dos bandas clave. La banda 1
se observó a aproximadamente 45 kDa y parece corresponder a la
proteína APO-AIV madura de longitud completa. La
banda 2 se observa a aproximadamente 28 kDa y parece ser un
fragmento N-terminal de APO-AIV.
\vskip1.000000\baselineskip
El factor H del complemento (FHC) se identificó
por primera vez en el análisis proteómico del LCR descrito en el
ejemplo 4 anterior. Para evaluar su utilidad en el diagnóstico de
trastornos relacionados con daño cerebral, se estudió su presencia
en el plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) usando
inmunotransferencia de tipo Western.
Se diluyeron muestras de plasma hasta 1 en 8 en
solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadió un volumen
igual de tampón de muestra Laemmli 2x y luego se llevó a ebullición
durante 10 min. hasta su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó electroforesis en gel de SDS usando
geles de 1,5 mm, de 36 pocillos Fisher Scientific (todas las
disoluciones se adquirieron de National Diagnostics). Se separaron
las muestras en un gel de resolución al 10% con un gel de
apilamiento al 4% (todas las disoluciones se adquirieron de National
Diagnostics). Se separaron las muestras (20 \mul) inicialmente
durante 30 min. a 110 V y después durante 60 min. a 150 V hasta que
el frente de colorante comenzó a entrar en el tampón de
desplazamiento.
El gel se transfirió a PVDF (Amersham
Biosciences) usando un dispositivo de transferencia semiseca
(Bio-Rad) durante 45 min. a 15 V. Entonces se
bloqueó la membrana en leche al 5% preparada en
PBS-Tween y se sondó con el anticuerpo primario
frente al factor H del complemento (Abcam, R.U.) durante la noche a
4ºC. Las bandas se detectaron con un kit de detección por
quimioluminiscencia de inmunotransferencia de tipo Western (ECL+,
Amersham Biosciences) y las membranas se barrieron usando un escáner
de fluorescencia Storm (Amersham Biosciences).
Se observó una banda inmunorreactiva a 139 kDa
(FHC) y se cuantificó la densidad óptica usando el software Image
Quant (Amersham Biosciences). El análisis se realizó mediante la
prueba de Mann-Whitney no paramétrica usando el
paquete SPSS.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de la inmunotransferencia de tipo
Western se adquirieron de plasma de 128 personas con EA probable
NINCDS-ADRDA y 78 controles ancianos sanos normales.
Los casos con EA tenían un aumento del 32% en FHC
(Mann-Whitney; tabla 6).
Hubo una diferencia en cuanto al sexo con un
valor de FHC relativamente alto en familiares globales femeninos con
respecto a masculinos (p=0,05). Sin embargo, el FHC fue más alto en
los casos con EA en relación con los controles incluso cuando se
consideraron los sexos por separado (p<0,01; tabla 7).
Un análisis de curva operativa del receptor
(ROC) mostró que el FHC tiene un rendimiento mejor que el azar como
prueba de diagnóstico.
Para evaluar adicionalmente el rendimiento del
FHC como marcador de diagnóstico en plasma para la EA, se
determinaron los niveles de FHC usando la misma metodología de
inmunotransferencia de tipo Western en varias demencias clínicamente
similares. Se mostró que los niveles de FHC sólo eran
significativamente elevados con respecto a los controles en la
cohorte de EA no en ninguna otra demencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio, fue posible mostrar para
muestras de plasma que la concentración del péptido C3a de
individuos con enfermedad de Alzheimer (EA) cambia.
\vskip1.000000\baselineskip
C3 es un glicoproteína de 180 kDa que actúa como
componente del sistema del complemento. Activa el sistema del
complemento, procesándose mediante la eliminación de cuatro residuos
de arginina para formar dos cadenas, \alpha y \beta, unidas
mediante un puente disulfuro. En un acontecimiento proteolítico, el
péptido C3a de 77 residuos de aminoácidos de largo (anafilatoxina)
de 4 kDa se libera posteriormente de la cadena \alpha. Se ha
demostrado que C3a es un mediador pro-inflamatorio y
anti-inflamatorio que se une a C3aR, un receptor
acoplado a proteínas G.
El objetivo de este estudio era la determinación
cuantitativa del péptido C3a en muestras de plasma humano de un
grupo control y uno del caso (EA).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se analizaron muestras de
plasma humano usando un ensayo de ELISA de C3a comercial (BD OptEIA
N.º de cat. 550499) de BD Biosciences (San Diego, CA 92121
(EE.UU.)). Las placas se lavaron en el instrumento
Powerwasher384 de Tecan GmbH (Crailsheim, Alemania) y,
posteriormente, se midieron en un lector de absorbancia
GeniosPro de Tecan GmbH (Crailsheim, Alemania) a 450/620 nm
con 10 lecturas por pocillo. Todos los procedimientos se llevaron a
cabo según las instrucciones de los fabricantes. Las muestras de
plasma humano se diluyeron 1:500 antes del análisis.
En este método, se añadieron en primer lugar
muestras de pacientes o patrones de C3a de o bien un grupo del caso
(EA) o bien un grupo control a pocillos que se habían recubierto
antes con anticuerpos monoclonales frente a
C3a-desArg. Tras lavar los pocillos, se añade una
mezcla de anticuerpo policlonal biotilinado anti-C3a
humano y estreptavidina-peroxidasa del rábano,
produciendo una intercalación
anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Se
cuantificó la actividad de la enzima presente en la superficie del
pocillo mediante la reacción con un sustrato adecuado (TMB) para
producir color. Como controles, el ensayo incluye disoluciones
patrón de C3a con un intervalo de concentraciones de desde 0 hasta 5
ng/ml.
Se realizaron dos experimentos: el experimento 1
con 20 muestras de pacientes por grupo y el experimento 2 con 30
muestras de pacientes por grupo (el experimento 2 fue una repetición
del experimento 1 con otras 10 muestras de pacientes por grupo). Se
analizó por duplicado cada muestra de paciente y control.
Con el fin de que los resultados del ensayo se
consideraran válidos, las concentraciones de los controles deben
cumplir ciertos criterios como los facilitados por el fabricante.
Para las curvas patrón del experimento 1 y el 2, se han determinado
coeficientes de determinación de 0,995 y 0,998, respectivamente.
Además, los valores de absorbancia medidos se analizaron
estadísticamente mediante una prueba de la t de dos colas
(paquete de programa statistiXL 1,5).
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los valores de absorbancia individuales,
se observó una variación biológica significativa tanto para el
grupo control como para el del caso (coeficiente de variación en el
experimento VL050802: 26 y 27%; coeficiente de variación en el
experimento VL051012: 37 y 30%). El diagrama de dispersión en la
figura 11 muestra los valores medidos durante los primeros
experimentos de ELISA. En ambos experimentos se encontró que la
diferencia entre los dos grupos era estadísticamente significativa,
tal como se indicaba por los valores de probabilidad de 0,005 y
0,003. Las razones calculadas (control/EA) para la abundancia de C3a
fueron de 0,77 y 0,76 en los dos experimentos de ELISA (véase la
tabla 8). Estas razones indican una débil modulación de la expresión
de C3a en muestras de plasma de pacientes con EA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este resultado demuestra que el factor 3a del
complemento es un marcador útil para la enfermedad de Alzheimer,
solo, o en combinación con otros biomarcadores.
Dado que el factor 3a del complemento se ha
encontrado sobreexpresado en el LCR de paciente fallecido, es una
predicción razonable que otros polipéptidos y proteínas expresadas
de manera diferencial en el LCR de paciente fallecido también serán
útiles como marcadores para trastornos relacionados con daño
cerebral.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suministró una lista de proteínas observadas
en LCR post mórtem basándose en los ejemplos 1 y 4
anteriores. La lista se examinó para encontrar aquellas proteínas,
que previamente se había observado que cambiaban en su expresión en
otros paradigmas experimentales tales como ratones transgénicos
estudiados en el contexto de la enfermedad de Alzheimer (proyecto
PRO-TAMAD).
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 9 indica el subconjunto de proteínas
observadas en LCR post mórtem humano que también muestra la
expresión diferencial en el material del hipocampo aislado de los
ratones transgénicos estudiados dentro del proyecto
PRO-TAMAD. A este respecto, se hace referencia al
documento WO 2006/021810.
\newpage
El conocimiento de las proteínas que circulan en
LCR como consecuencia de daño cerebral, en este caso post
mórtem, es un recurso extremadamente útil. La tarea de asociar
diversos subconjuntos de estas proteínas con otros estados
neurológicos puede emprenderse fácilmente y este ejemplo demuestra
cómo una simple revisión de los datos del legado puede proporcionar
evidencia adicional para respaldar las proteínas candidatas clave
como biomarcadores de una enfermedad particular.
Al considerar los datos históricos de
PRO-TAMAD, parece haber un solapamiento considerable
con las proteínas que se ha observado que cambian en el hipocampo y
en el tejido del resto del hemisferio (ROH) del modelo de ratones
transgénicos de la enfermedad de Alzheimer. Ahora se ha demostrado
que diez de las diecisiete proteínas originales notificadas en el
estudio PRO-TAMAD están presentes en el LCR post
mórtem humano y particularmente cinco de ellas nunca se habían
citado anteriormente en el LCR. Tomados juntos, estos hallazgos
sugieren la importancia adicional de estas proteínas en
enfermedades neurológicas, la enfermedad de Alzheimer
particularmente. No sólo se han mostrado cambios que están
correlacionados con la respuesta a la enfermedad dentro del tejido
cerebral, aunque es el caso en el ratón, sino que ahora también se
ha observado la aparición de estas proteínas en el LCR como
consecuencia del daño tisular.
La comparación de los cambios en las proteínas a
través de diferentes paradigmas experimentales es, por tanto, útil
y representa un ejercicio valioso que puede usarse para establecer
la utilidad de entidades de proteína particulares, como
biomarcadores que actúan como un puente entre especies, tejidos y
líquidos corporales. En consecuencia, un ejercicio de este tipo
debe ser una consideración de rutina cuando los experimentos de
descubrimiento de biomarcadores producen nuevos candidatos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un estudio de
caso-control usando análisis de electroforesis en
gel bidimensional de plasma seguido por espectrometría de masas
para identificar las proteínas que difieren entre un grupo con
enfermedad de Alzheimer y un grupo control. Éstas se validaron
entonces mediante inmunotransferencia de tipo Western. Para el
análisis de proteómica, se incluyeron 50 personas con EA a través
de servicios secundarios y 50 controles ancianos normales a través
de la atención primaria. Para los fines de validación, se examinó a
un total de 511 sujetos con EA y otra enfermedad neurodegenerativa y
controles ancianos normales.
El análisis mediante imágenes de la distribución
de las proteínas de los geles identifica sólo casos con EA con un
56% de sensibilidad y un 80% de especificidad. En análisis mediante
espectrometría de masas de los cambios observados en la
electroforesis bidimensional identificó varias proteínas implicadas
previamente en la patología de la EA, incluyendo el precursor del
factor H del complemento (FHC) y
\alpha-2-macroglobulina
(\alpha-_{2}M). La elevación del FHC y de
\alpha-_{2}M se validó mediante
inmunotransferencia de tipo Western y se demostró que el FHC era
específico para la EA y que estaba correlacionado con la gravedad de
la enfermedad.
Los resultados se muestran en las figuras 12 y
13. La figura 12 muestra una correlación de los niveles del factor
H del complemento determinados mediante inmunotransferencia de tipo
Western con la Escala Global de Demencia en pacientes con presunta
enfermedad de Alzheimer. La figura 13 es una curva operativa del
receptor (ROC) para el factor H del complemento y
alfa-2-macroglobulina como
biomarcadores plasmáticos candidatos de la enfermedad de
Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (6)
1. Método para el diagnóstico de accidente
cerebrovascular en un sujeto que se sospecha que padece el mismo,
que comprende detectar
glutatión-S-transferasa P
(GSTP-1), o una variante, un mutante o una isoforma
de la misma, en una muestra de sangre, plasma o suero extraída de un
sujeto, en el que un nivel elevado de GSTP-1, en
comparación con un control, es indicativo de accidente
cerebrovascular.
2. Método de seguimiento de la progresión de un
accidente cerebrovascular en un sujeto al que se le diagnosticó
previamente que padecía el mismo, que comprende medir los niveles de
GSTP-1, o una variante, un mutante o una isoforma de
la misma, en múltiples muestras de sangre, plasma o suero extraídas
de un sujeto en momentos diferentes y determinar el cambio en los
niveles de la GSTP-1 en la muestra sometida a prueba
más recientemente en comparación con los niveles en muestras
sometidas a prueba previamente y correlacionar tal cambio con la
progresión, regresión o estabilización de dicho accidente
cerebrovascular.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que se usa un anticuerpo frente a GSTP-1 en la
detección o la determinación de la concentración.
4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la GSTP-1 se detecta mediante la determinación
de al menos un autoanticuerpo frente a la misma.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se usan dos o más marcadores
seleccionados de anticuerpos frente a GSTP-1 en un
pocillo individual de una placa de microtitulación de ELISA.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que GSTP-1 y al menos
otro polipéptido se someten a ensayo por separado, y se usa un
algoritmo de predicción para el diagnóstico, en el que dicho al
menos otro polipéptido es uno para el cual el nivel está o bien
aumentado o bien disminuido en el líquido cefalorraquídeo de
pacientes fallecidos en comparación con el líquido cefalorraquídeo
de donantes sanos.
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