WO2012152970A1 - Método de diagnóstico del ictus isquémico - Google Patents

Método de diagnóstico del ictus isquémico Download PDF

Info

Publication number
WO2012152970A1
WO2012152970A1 PCT/ES2012/070312 ES2012070312W WO2012152970A1 WO 2012152970 A1 WO2012152970 A1 WO 2012152970A1 ES 2012070312 W ES2012070312 W ES 2012070312W WO 2012152970 A1 WO2012152970 A1 WO 2012152970A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hsc70
stroke
amount
ischemic stroke
ischemic
Prior art date
Application number
PCT/ES2012/070312
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Teresa GASULL DALMAU
Antonio DÁVALOS ERRANDO
Jovita PONCE TORRENT
Natalia PEREZ DE LA OSSA HERRERO
Original Assignee
Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol filed Critical Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol
Publication of WO2012152970A1 publication Critical patent/WO2012152970A1/es

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Definitions

  • the present invention is related to the field of medicine, and particularly to the field of strokes.
  • ischemic stroke refers to a method of early diagnosis of ischemic stroke.
  • STATE OF THE TECHNIQUE Stroke (also called stroke, stroke or stroke) is the loss of brain functions as a result of
  • Cerebral stroke causes a series of variable symptoms depending on the affected brain area. In the milder cases, the consequences may go unnoticed and be little limiting for the patient due to the nondescript symptomatology: paraesthesia, mild weakness of a muscle group, small disorientation, etc. However, the stroke often causes permanent neuronal damage or results in the death of the patient. This disease is the third cause of mortality, and the first cause of permanent disability in adults, in most developed countries.
  • the stroke can be ischemic or hemorrhagic.
  • An ischemic stroke occurs when the brain loses blood supply due to sudden and immediate interruption of blood flow, which
  • hemorrhagic stroke is triggered by the rupture of a brain blood vessel due to a hypertensive peak, a congenital aneurysm, or other less frequent causes.
  • tissue plasminogen activator tissue plasminogen activator
  • the tPA produces its effect by disintegration of the clot that causes the lack of blood flow in the brain area at risk.
  • this treatment has only proven effective when administered to patients during the first hours after clot formation, having demonstrated its effectiveness during first 4.5 hours from the onset of symptoms (Hacke W, Kaste M, Bluhmki E, Brozman M, Davalos A, Guidetti D, Larrue V, Lees KR, Medeghri Z, Machnig T, Schneider D, von Kummer R, Wahlgren N, Toni D.
  • Thrombolysis with Alteplase 3 to 4.5 Hours after Acute Ischemic Stroke N Engl J Med, 2008, vol. 359, p. 1317.
  • the treatment has also shown effectiveness a few hours beyond 4.5 hours in those cases where there is still salvageable tissue.
  • tPA treatment is contraindicated in patients suffering from a stroke of hemorrhagic etiology.
  • the administration of tPA-based therapy to a patient suffering from a hemorrhagic stroke can be fatal for that patient.
  • Contraindications according to the etiology of the stroke show the importance of a rapid diagnosis.
  • it is not only important to quickly determine that the patient suffers a stroke, but also to determine the etiology of the stroke, that is, if it is an ischemic or hemorrhagic stroke.
  • diagnostic tests capable of providing this information (nuclear magnetic resonance imaging (MRI) and computerized axial tomography (CT)) must be performed in a hospital, and in most cases, due to the time required for transfer to the hopital and that required to perform the diagnostic tests by MRI / CT scan, takes longer than the period of time in which it is effective to administer the treatment based on a tPA.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • CT computerized axial tomography
  • ApoC-lll demonstrated a sensitivity of 94% and a
  • the invention provides an in vitro method for the diagnosis of ischemic stroke in a patient comprising determining the amount of HSC70.
  • HSC70 protein is released into the bloodstream shortly after the onset of the ischemic episode and is maintained at elevated levels during the first six hours after the onset of symptoms.
  • the foregoing is very advantageous for clinical practice because it allows an early diagnosis of ischemic stroke to be carried out, which, in turn, makes it possible to administer the treatment in a period of time in which said treatment is more likely to be effective. .
  • the diagnostic method provided by the invention allows the medical professional to decide about the administration of the treatment many minutes or even hours in advance regarding the usual administration times in the current clinical practice, a practice that involves hospitalizing the patient and diagnosing the stroke by diagnostic imaging methods. This means improving the therapeutic effect of said treatment and reducing the percentage of neurons that claudique the ischemic event, as well as the resulting neurological deficit.
  • the high sensitivity of the method of the invention in the diagnosis of ischemic stroke in a patient suspected of having a stroke makes it possible to rule out that the patient diagnosed with a stroke of a hemorrhagic nature. This is a great advantage, since this prevents thrombolytic treatment, which is suitable for stroke
  • ischemic administered by mistake to a patient suffering from a stroke of hemorrhagic etiology, for which the thrombolytic treatment is
  • the invention provides, in a second aspect, a method for deciding or recommending the administration of a suitable pharmacological treatment for ischemic stroke comprising the steps of: a) determining in vitro the amount of HSC70 in a patient suspected of suffer an ischemic stroke; and b) compare the amount of HSC70 determined according to section a) with a reference value, which ensures that the stroke is of the ischemic type, where if the amount of HSC70 is greater than the reference value, the initiation of treatment indicated for ischemic stroke is recommended and if the amount of HSC70 is equal to or less than the reference value, the start of treatment is not recommended.
  • the method of the invention can be carried out from a sample obtained from the patient, which greatly facilitates and speeds up said diagnosis.
  • the invention provides the use of the HSC70 protein as a diagnostic marker for ischemic stroke.
  • the invention provides the use of HSC70 as a therapeutic marker.
  • the invention provides the use of suitable means to determine the amount and / or concentration of HSC70 in the methods of the invention.
  • the present invention not only makes it possible to quickly and easily diagnose ischemic stroke in a patient, but also to administer the appropriate treatment to ischemic stroke without the risk of mistakenly administering it to a patient with hemorrhagic stroke.
  • FIG. one Concentration (ng / ml) of serum HSC70 obtained from healthy individuals (A) and from patients with ischemic stroke (B and C). The concentration of HSC70 in patients with ischemic stroke was determined within 6 hours from the onset of symptoms of ischemic stroke (B) and 24 hours after the onset of symptoms of ischemic stroke (C).
  • FIG. 2 Concentration (ng / ml) of serum HSC70 obtained from patients with ischemic stroke (1) and from patients with hemorrhagic stroke (2) within 6 hours from the onset of cerebral stroke symptoms.
  • FIG. 3 ROC curve for the diagnostic value of the method based on the determination of serum HSC70. The ordinate axis represents the sensitivity values in and the abscissa axis represents the complement of the specificity (1 -specificity).
  • FIG. 4 Sensitivity and specificity values for some cut-off points of the ROC curve of FIG 3.
  • the HSC70 protein is a cytosolic member of heat shock proteins. This protein is essential for cell viability and its participation in several functions in prevention or reversal of protein aggregation has been described. The best known of these activities is its function in the disassembly of the trellis that surrounds clathrin-coated endocytosis vesicles. So far, the release of HSC70 during stroke and its role in hypoxia situations is not established. Two isoforms of HSC70, isoform I, of 646 have been described
  • the invention contemplates using any of the isoforms, or other vahants, of HSC70 as a marker.
  • tissue plasminogen activator in English: Tissue Plasminogen
  • Activator or tPA is a proteolytic protein involved in the dissolution of blood clots. Specifically, it is a serine protease found in endothelial cells, the cells that line the inside of blood vessels. As an enzyme, it catalyzes the conversion of plasminogen to plasmin, which is the main enzyme for the dissolution of blood clots.
  • human tPA of recombinant origin is used as a drug for the treatment of ischemic stroke and other conditions caused by blood clots.
  • the recombinant tPA used most frequently in the treatment of ischemic stroke is known as alteplase.
  • the prior art comprises other variants of recombinant tPA that could be used for the treatment, for example, reteplase, techneplase and demoteplase.
  • sample refers to a body fluid or a patient's tissue obtained for the purpose of carrying out the in vitro diagnosis of ischemic stroke or deciding on the treatment to be applied to the patient.
  • therapeutic marker refers to the HSC70 protein used for the examination of samples obtained from a patient suspected of suffering from a disease and determining whether the patient meets the necessary conditions for the indicated therapeutic treatment to be effective.
  • Reference value means a value with which the amount of HSC70 determined according to the invention is compared for the diagnosis of ischemic stroke. It is a marker value that allows a patient with ischemic stroke to be distinguished from the rest of individuals who do not suffer an ischemic stroke, including among these individuals those who pace a stroke of a hemorrhagic nature.
  • the reference value is a value that allows discarding with a high sensitivity that the patient
  • the reference value will depend on several factors, among which the type of sample in which the marker is determined, the time period in which said determination is carried out and, to a lesser extent, the determination technique used are highlighted. This is because the levels of the marker can vary in the different fluids or tissues of the patient, depending on the time elapsed since the triggering of the ischemic episode, and depending on the determination technique used.
  • level refers to the amount or concentration of HSC70 in a sample obtained from a patient.
  • “Semiquantitative determination” means a determination that it allows to discriminate whether the concentration of an analyte in a sample, in the case of the present invention, a diagnostic marker, is dependent on a selected reference value.
  • binding group is meant a molecule or molecule segment capable of specifically binding to a target protein (in this case the target protein is HSC70).
  • Biosensor means an instrument for measuring biological or chemical parameters.
  • the parameter to be measured is the HSC70 protein.
  • antibody refers to a complete antibody, including without limitation a chimeric, recombinant, transgenic, humanized, grafted and single chain antibody, and the like, as well as any fusion protein, its conjugates, its fragments, or its derivatives containing one or more domains that selectively bind to the target protein or peptide.
  • monoclonal antibodies are preferred.
  • Single chain oligonucleotides with sizes between 70 and 100 nucleotides capable of recognizing in specific ways and with high affinity to various types of target molecules by means of a three-dimensional folding of their chain are understood. They are generally obtained by selecting them from combinatohal oligonucleotide libraries, using the SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enhchment), which will allow to select that oligonucleotide from the library used that binds with more affinity to the molecule Diana. These molecules are capable of adopting globular structures allowing them to exhibit complex and sophisticated
  • molecular recognition properties being able to bind in a stable and very specific way to their targets.
  • Said molecular targets can be small molecules such as ATP, proteins, nucleic acids and complex multi-male structures.
  • immunoassay an immunochemical technique where immune complexes are used, that is, those resulting from the conjugation of antibodies and antigens, as quantification references of a given analyte, which may be the antibody or the antigen, using a molecule as a marker that is part of the reaction with the immune complex for measurement.
  • FIG. 1 shows the results of the determination of serum HSC70 obtained from healthy individuals and patients with ischemic stroke.
  • p ⁇ 0.05 there is a significant difference (p ⁇ 0.05) in HSC70 levels, which are much higher in patients with ischemic stroke than in healthy individuals.
  • the inventors have found that there is also a significant difference (p ⁇ 0.05) in the serum HSC70 concentration of patients with stroke of ischemic nature compared to patients with stroke of nature.
  • the present invention provides in its first aspect an in vitro method for the diagnosis of ischemic stroke in a patient based on the determination of the HSC70 protein.
  • the method further comprises comparing the amount of HSC70 determined with a reference value, where an amount of HSC70 greater than the reference value indicates that the patient suffers an ischemic stroke.
  • the inventors have verified that marker levels remain significantly elevated during the hours following the ischemic episode, returning to their baseline level.
  • the sample in which the marker is determined to carry out the diagnosis of ischemic stroke is obtained in a period of time less than
  • a time period of less than 24 hours may be: 20 hours, 18 hours, 16 hours, 14 hours, 12 hours, 10 hours, 8 hours, or less.
  • the method of the invention also allows the diagnosis of ischemic stroke before 6 hours after the onset of symptoms, even before four and a half hours. This fact is very useful in clinical practice because it allows quick decisions about the patient's treatment. In current clinical practice, the most effective treatments for ischemic stroke are based on the administration of a thrombolytic drug, and the effectiveness of these drugs is closely related to the speed with which they are administered to the patient.
  • the method of the invention is carried out in a period of time less than 6 hours from the onset of cerebral stroke symptoms.
  • the time period may be between 20 minutes and 4 hours 30 minutes from the onset of symptoms.
  • the period is between 1 hour and 3 hours from the onset of symptoms.
  • the recommended treatment comprises the administration of a thrombolytic agent, which is the appropriate treatment for ischemic stroke.
  • thrombolytic agents are urokinase and tPA.
  • the recommended treatment comprises the administration of tPA.
  • the present invention contemplates the administration of any vacancy of tPA, although,
  • the administered tPA is human recombinant tPA, for example, alteplase, indicated for the treatment of ischemic stroke.
  • ischemic stroke patients provide by the prior art.
  • a complementary or alternative treatment to thrombolytic agents is the elimination of the thrombus caused by ischemic stroke by neurointerventional surgery.
  • the sample in which the level of the marker is determined according to the method of the invention is preferably a blood sample or any blood-derived fluid, such as plasma or serum.
  • the marker can also be found in other body fluids or tissues, such as cerebrospinal fluid, lymph, urine, saliva and neuronal tissue, so all of them can be used as a sample to determine the marker of the invention.
  • the determination of the label is carried out in a serum sample.
  • the reference value with which the marker level is compared according to the method of the invention is selected such that the diagnostic method has a high sensitivity.
  • the method of the invention allows to diagnose with certainty if the patient suffers an ischemic stroke, ruling out that the stroke is hemorrhagic, and administer the appropriate treatment.
  • ROC acronym for the English Receiver Operating Characteristic, or Receiver Operating Characteristic
  • the discrimination threshold is equivalent to the reference value of the method of the invention.
  • FIG 3 and FIG 4 show, respectively, the ROC curve and its cut-off points for the method of diagnosis of ischemic stroke under the conditions indicated in the examples of the embodiments, that is, in serum and a term less than 6 hours after the onset of symptoms.
  • Each cut-off point of the ROC curve is a possible reference value for the conditions in which the method is carried out and a sensitivity and specificity value is associated.
  • a cut-off point (or reference value) of 3.42 ng / ml is associated with a sensitivity of 90%.
  • the concentration of HSC70 in the patient's serum is greater than 3.42 ng / ml, said patient has a 90% chance of suffering an ischemic stroke.
  • Serum HSC70 concentration higher than the reference value of 4,353 ng / ml has a 100% chance of suffering an ischemic stroke.
  • the cut-off points greater than 4,353 also have sensitivity values of 100%.
  • the specificity of the method is too low. When the specificity is low it means that the diagnostic method can result in a false negative, that is, there is a risk of issuing a diagnosis Ischemic stroke negative for a patient who does suffer from an ischemic stroke.
  • the reference value is preferably selected in such a way that it provides the method of the invention with a sensitivity in the range of 90% to 100%, plus
  • the reference value with which the level of the marker is compared according to the method of the invention will depend on several factors, including the type of sample in which the marker is determined, the term of time in which said determination is carried out and the determination technique used. For example, the reference values indicated above are applicable when the
  • a suitable reference value may be between 3.4 ng / ml and 4.6 ng / ml. The person skilled in the art will know how to select the appropriate reference value according to the conditions in which the method of the invention is carried out.
  • the determination of the amount of HSC70 in the sample can be quantitative or semi-quantitative.
  • the field of analytics provides various methods for the quantitative and semi-quantitative determination of proteins in a sample, as well as a wide variety of instruments (biosensors) to carry out these methods. Any type of biosensor can be used in the method of the invention.
  • protein determination methods make use of specific binding groups for the protein to be determined, such as antibodies or aptamers.
  • suitable binding groups are proteins that interact specifically with the HSC70 protein.
  • a protein that interacts specifically with HSC70 is the protein known as CHIP (acronym for C-terminus of HSC70 interacting protein).
  • HSC70 can be carried out advantageously by an immunoassay.
  • Any immunoassay can be used in the method of the present invention, for example, the assay by
  • Enzyme-linked immunoabsorption (ELISA), radioimmunoassay, immunoblot and immunochromatography Another suitable method for determining HSC70 is surface plasmon resonance. All these methods are well known in the field of protein analysis and constitute non-limiting examples of suitable methods for carrying out the determination of the marker of the invention. Some of these methods have the advantage that they can be carried out in small and easy-to-use biosensors that do not need to be located in a laboratory, nor do they require personnel specialized in analytical chemistry. Thus, the procedure of the invention could be carried out quickly at the point of assistance, for example, it can be carried out by health workers in the same ambulance that transferred the patient to the hospital.
  • Non-limiting examples of rapid detection biosensors suitable for carrying out the method of the invention are an immunochromatographic strip (also known as "dipstick”) or a lab-on-a-chip card with microfluidic circuit and immunodetection or detection of the interaction with a second molecule.
  • an immunochromatographic strip also known as "dipstick”
  • a lab-on-a-chip card with microfluidic circuit and immunodetection or detection of the interaction with a second molecule.
  • the method of the invention comprises
  • Non-limiting examples of stroke diagnostic markers that can be determined together with the marker of the invention are: APO-Cl, APO 111 (Allard L et al, supra), NR2a and NR2b autoantibodies (Dambinova S et al, supra), metalloproteinase 9, type B natriuretic peptide (BNP), S100 protein and D-dimer (Laskowitz D, Kasner S, Saver J, Remmel K, Jauch E. "Clinical Usefulness of a Biomarker-Based Diagnostic Test for Acute Stroke.
  • the HSC70 marker and the additional marker (s) can be determined all at once or each separately.
  • the present invention also provides a kit for the diagnosis of ischemic stroke. Said kit comprises suitable means for determining the amount of HSC70 protein. The appropriate means will depend
  • suitable means may be, among others, the support for carrying out the immunoassay, conjugated antibody, detection antibody, sample buffer and developing solution.
  • the kit may also contain controls for correct interpretation of the result, additional reagents, such as reagents for calibration of the method and reagents for pre-treatment of the sample, as well as instructions for carrying out the method of diagnosis of ischemic stroke. according to the invention.
  • the kit may additionally contain suitable means to determine another stroke marker.
  • the HSC70 marker and, optionally, other markers are incorporated into a strip
  • the kit provided by the present invention can be used in routine clinical practice to quickly identify patients suffering from an ischemic stroke even in pre-hospital conditions.
  • medical personnel can apply the appropriate treatment to the patient quickly and safely, thereby increasing the chances of recovery.
  • the concentration of HSC70 (ng / ml) in serum obtained from 10 healthy patients and 10 patients with ischemic stroke was determined in vitro within 6 h from the onset of symptoms.
  • the determination of HSC70 in patients' serum was recalculated in serum samples obtained 24 hours after the onset of symptoms.
  • Classification within the ischemic stroke subtype was performed by imaging criteria using nuclear magnetic resonance imaging (NMR) or computerized axial tomography (CAT).
  • NMR nuclear magnetic resonance imaging
  • CAT computerized axial tomography
  • the determination of HSC70 in the samples was carried out using the kit "ELISA Kit for Heat Shock 70kDa Protein 8 (HSPA8)" (USCN Life Science) following the supplier's instructions.
  • FIG 1 shows that patients diagnosed as patients with ischemic stroke have significantly higher serum levels of HSC70 (p ⁇ 0.05) than healthy controls during the first hours of the onset of symptoms (6 h from the onset of symptoms ). The results shown in this figure also indicate that serum HSC70 levels decrease after 24 hours from the beginning of the episode.
  • HSC70 concentration of HSC70 (ng / ml) in serum samples obtained from 10 patients with ischemic stroke and 10 patients with hemorrhagic stroke was determined in vitro, always within 6 hours from the onset of symptoms. Classification within the ischemic or hemorrhagic stroke subtype was performed by imaging criteria using nuclear magnetic resonance imaging (NMR). The determination of HSC70 in the samples was carried out by ELISA using the "ELISA Kit for Heat Shock 70kDa Protein 8 (HSPA8)" of USCN Life Science, following the supplier's instructions.
  • NMR nuclear magnetic resonance imaging
  • results are shown in FIG 2 and indicate that patients diagnosed as patients with ischemic stroke had significantly higher serum levels (p ⁇ 0.05) than patients with hemorrhagic stroke within the first 6 hours after the onset of symptoms.
  • Example 3 To estimate the diagnostic capacity of the method of the invention, an ROC curve was constructed (FIG 3). This curve represents the sensitivity values in the ordinate axis and the complement of the
  • cut-off points of the ROC curve are specified in FIG 4, which give an idea of the sensitivity and specificity in the diagnosis of ischemic stroke for each serum HSC70 concentration value.
  • said cut-off points of the ROC curve are possible reference values for the diagnostic method of the invention. Selecting a reference value or another assumes that the diagnostic method provides better or worse sensitivity in the given conditions. For example, as can be seen, if a reference value of 4,353 ng / ml is selected, patients with serum levels greater than 4,353 ng / ml would be diagnosed with ischemic stroke with a sensitivity of 100% and 80% of specificity This implies that 100% of patients with serum values of
  • HSC70 higher than a reference value of 4,353 suffer an ischemic stroke and that all of them can be given a thrombolytic treatment.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona un método in vitro para el diagnóstico de ictus isquémico en un paciente que comprende determinar la cantidad de proteína cognitiva de choque térmico 70 ("HSC70"). Adicionalmente la invención proporciona un método para decidir o recomendar la administración de un tratamiento farmacológico adecuado para el ictus isquémico que comprende: a) determinar in vitro la cantidad de HSC70 en un paciente sospechoso de sufrir un ictus isquémico; y b) comparar la cantidad de HSC70 determinada según el apartado a) con un valor de referencia, donde si la cantidad de HSC70 es superior al valor de referencia se recomienda el inicio del tratamiento y si la cantidad de HSC70 es igual o inferior al valor de referencia no se recomienda el inicio del tratamiento. Finalmente, la invención proporciona el uso de la proteína HSC70 en el diagnóstico del ictus de etiología isquémica

Description

Método de diagnóstico del ictus isquémico
La presente invención está relacionada con el campo de la medicina, y particularmente con el campo de los accidentes cerebrovasculares.
Específicamente se refiere a un método de diagnóstico temprano del ictus isquémico.
ESTADO DE LA TÉCNICA El ictus cerebral (también llamado ictus, accidente cerebrovascular o apoplejía) es la pérdida de las funciones cerebrales producto de la
interrupción del flujo sanguíneo al cerebro. El ictus cerebral origina una serie de síntomas variables en función del área cerebral afectada. En los casos más leves, las consecuencias pueden pasar inadvertidas y ser poco limitantes para el paciente por lo anodino de la sintomatología: parestesias, debilidad leve de un grupo muscular, pequeña desorientación, etc. Sin embargo, con frecuencia el ictus cerebral provoca daños neuronales permanentes o resulta en la muerte del paciente. Esta enfermedad es la tercera causa de mortalidad, y la primera causa de discapacidad permanente en adultos, en la mayoría de los países desarrollados.
Según su etiología, el ictus cerebral puede ser isquémico o hemorrágico. Un ictus isquémico se presenta cuando el cerebro pierde la irrigación sanguínea por la interrupción súbita e inmediata del flujo sanguíneo, lo que
frecuentemente ocurre debido a la oclusión de alguna de las arterias que irrigan la masa encefálica a causa de un coágulo sanguíneo. Por el contrario, el ictus hemorrágico se desencadena por la ruptura de un vaso sanguíneo encefálico debido a un pico hipertensivo, un aneurisma congénito, u otras causas menos frecuentes.
Hasta el momento, el tratamiento que ha demostrado mayor eficacia en pacientes con ictus del tipo isquémico ha sido la administración de-activador del plasminógeno tisular (tPA). El tPA produce su efecto por disgregación del coágulo que origina la falta el riego sanguíneo en la zona cerebral en riesgo. Pero este tratamiento solamente ha demostrado ser eficaz cuando se administra a los pacientes durante las primeras horas después de la formación del coágulo, habiendo demostrado su efectivad durante las primeras 4,5 primeras horas desde el inicio de los síntomas (Hacke W, Kaste M, Bluhmki E, Brozman M, Dávalos A, Guidetti D, Larrue V, Lees KR, Medeghri Z, Machnig T, Schneider D, von Kummer R, Wahlgren N, Toni D. "Thrombolysis with Alteplase 3 to 4.5 Hours after Acute Ischemic Stroke". N Engl J Med, 2008, vol. 359, p.1317). El tratamiento también ha mostrado efectividad unas horas más allá de las 4,5 h en aquellos casos en que todavía existe tejido salvable. Por otro lado, al tratarse de un fármaco con efecto trombolítico, el tratamiento con tPA está contraindicado en pacientes que padecen un ictus de etiología hemorrágica. La administración de la terapia a base de tPA a un paciente que sufre un ictus hemorrágico puede ser fatal para dicho paciente.
La limitación temporal para administrar el tratamiento y sus
contraindicaciones según la etiología del ictus ponen de manifiesto la importancia de un diagnóstico rápido. Así, para poder administrar un tratamiento adecuado, no sólo es importante determinar con rapidez que el paciente sufre un ictus, sino también determinar la etiología del ictus, es decir, si se trata de un ictus isquémico o hemorrágico. Lamentablemente, las pruebas diagnósticas capaces de proporcionar esta información (resonancia magnética nuclear (RMN) y tomografía axial computerizada (TAC)) deben ser realizadas en un hospital, y en la mayoría de los casos, debido al tiempo requerido para el traslado al hopital y el requerido para la realización de las pruebas diagnósticas por RMN/TAC, se demoran más allá del plazo de tiempo en el cual resulta efectivo administrar el tratamiento a base de un tPA. A nivel mundial sólo un 3 al 5 % de los pacientes reciben este tratamiento. Para el porcentaje restante de pacientes el tiempo transcurrido entre el accidente isquémico y la hospitalización es superior al indicado para poder iniciar el tratamiento.
Con el objeto de llevar a cabo un diagnóstico rápido del ictus isquémico, varios autores describen el uso de diferentes biomarcadores. Entre ellos, Dambinova et al (Dambinova S, Khounteev G, Izykenova G, Zavolokov I, llyukhina I, Skoromets A. "Blood Test Detecting Autoantibodies to N-Methyl- D-aspartate Neuroreceptors for Evaluation of Patients with Transient
Ischemic Attack and Stroke". Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, p.1752-1762) describen cómo los autoanticuerpos contra la proteína NR2 presentan valores significativamente superiores en el suero de pacientes con ictus isquémico en comparación con pacientes con ictus hemorrágico. En otro estudio, Allard et al describen dos marcadores séricos, ApoC-l y ApoC-lll para predecir ictus de etiología isquémica a diferencia del ictus hemorrágico dentro de las 6 horas desde el comienzo de los síntomas (Allard L, Lescuyer P, Burgess J, Leung K, Ward M, Walter N, Burkhard P, Corthals G,
Hochstrasser D, Sánchez J. "ApoC-l and ApoC-lll as potential plasmatic markers to distinguish between ischemic and hemorrhagic stroke".
Proteomics, 2004, vol. 4, p. 2242-2251 ). Según estos autores, ApoC-l diagnostica ictus isquémico frente al hemorrágico con una sensibilidad del 94% y una especificidad del 73%, es decir, 1 falso negativo de 16 pacientes con ictus isquémico y 4 falsos positivos de 15 pacientes con ictus
hemorrágico. El ApoC-lll demostró una sensibilidad del 94% y una
especificidad del 87% (1 falso negativo de 16 pacientes con ictus isquémico y 2 falsos positivos de 15 pacientes con ictus hemorrágico).
Si bien estos marcadores poseen una buena sensibilidad en el diagnóstico del ictus isquémico, ninguno de ellos permite descartar el ictus de etiología hemorrágica con un 100% de sensibilidad dentro de un plazo de tiempo suficientemente reducido.
Por lo tanto, es deseable disponer de métodos alternativos para el diagnóstico temprano del ictus de etiología isquémica que descarten la posibilidad de un evento hemorrágico, de tal modo que se pueda administrar un tratamiento adecuado al ictus isquémico con segundad.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado que los niveles de la proteína cognitiva de choque térmico 70 ("HSC70", en función de su acrónimo en inglés: heat shock cognate protein 70 kDa, también denominada proteína cognitiva de choque térmico 71 "HSC71 ", o "HSPA8" que es el acrónimo del inglés heat shock 70 kDa protein 8) en suero de pacientes que han sufrido un ictus isquémico es significativamente superior a los niveles de la misma proteína en el suero de individuos sanos y de pacientes que han sufrido un ictus de etiología hemorrágica. Esta sorprendente diferencia en los niveles de HSC70 permite llevar a cabo el diagnóstico del ictus isquémico. Así, en un primer aspecto, la invención proporciona un método in vitro para el diagnóstico de ictus isquémico en un paciente que comprende determinar la cantidad de HSC70.
Se ha observado que proteína HSC70 se libera al torrente sanguíneo poco después del comienzo del episodio isquémico y se mantiene en niveles elevados durante las seis primeras horas transcurridas desde el comienzo de los síntomas. Lo anterior es muy ventajoso para la práctica clínica porque permite llevar a cabo un diagnóstico temprano del ictus isquémico, lo cual, a su vez, hace posible la administración del tratamiento en un plazo de tiempo en el cual dicho tratamiento tiene más posibilidades de ser efectivo.
El método de diagnóstico proporcionado por la invención permite al profesional médico decidir acerca de la administración del tratamiento con muchos minutos o incluso horas de antelación respecto a los tiempos de administración habituales en la práctica clínica actual, práctica que implica hospitalizar al paciente y diagnosticar el ictus mediante métodos de diagnóstico por imagen. Esto supone mejorar el efecto terapéutico de dicho tratamiento y reducir el porcentaje de neuronas que claudiquen ante al evento isquémico, así como el déficit neurológico resultante.
Adicionalmente, la elevada sensibilidad del método de la invención en el diagnóstico de ictus isquémico en un paciente sospechoso de padecer de ictus permite descartar que el paciente diagnosticado padece un ictus de naturaleza hemorrágica. Esto supone una gran ventaja, ya que con ello se evita que el tratamiento trombolítico, que es adecuado para el ictus
isquémico, se administre por error a un paciente que padece un ictus de etiología hemorrágica, para el cual el tratamiento trombolítico está
contraindicado.
Por lo tanto, la invención proporciona, en un segundo aspecto, un método para decidir o recomendar la administración de un tratamiento farmacológico adecuado para el ictus isquémico que comprende los pasos de: a) determinar in vitro la cantidad de HSC70 en un paciente sospechoso de sufrir un ictus isquémico; y b) comparar la cantidad de HSC70 determinada según el apartado a) con un valor de referencia, que permite asegurar que el ictus es del tipo isquémico, donde si la cantidad de HSC70 es superior al valor de referencia se recomienda el inicio del tratamiento indicado para el ictus isquémico y si la cantidad de HSC70 es igual o inferior al valor de referencia no se recomienda el inicio del tratamiento.
Ventajosamente el método de la invención puede ser llevado a cabo a partir de una muestra obtenida del paciente, lo que facilita y agiliza en gran medida dicho diagnóstico. En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de la proteína HSC70 como marcador diagnóstico de ictus isquémico.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de HSC70 como marcador terapéutico.
Por último, la invención proporciona el uso de medios de adecuados para determinar la cantidad y/o concentración de HSC70 en los métodos de la invención. En definitiva, la presente invención no sólo permite diagnosticar de manera rápida y sencilla el ictus isquémico en un paciente, sino que permite administrar el tratamiento adecuado al ictus isquémico sin riesgo de administrárselo erróneamente a un paciente con ictus hemorrágico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 . Concentración (ng/ml) de HSC70 en suero obtenido de individuos sanos (A) y de pacientes con ictus isquémico (B y C). La concentración de HSC70 en pacientes con ictus isquémico fue determinada dentro de las 6 horas desde el comienzo de los síntomas de ictus isquémico (B) y a las 24 horas del comienzo de los síntomas de ictus isquémico (C).
FIG. 2: Concentración (ng/ml) de HSC70 en suero obtenido de pacientes con ictus isquémico (1 ) y de pacientes con ictus hemorrágico (2) dentro de las 6 horas desde el comienzo de los síntomas de ictus cerebral. FIG. 3: Curva ROC para el valor diagnóstico del método basado en la determinación de HSC70 en suero. El eje de de ordenadas representa los valores de sensibilidad en y el eje de abscisas representa el complementario de la especificidad (1 -especificidad).
FIG. 4: Valores de sensibilidad y especificidad para algunos puntos de corte de la curva ROC de la FIG 3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La proteína HSC70 es un miembro citosólico de las proteínas de choque térmico. Esta proteína es esencial para la viabilidad celular y se ha descrito su participación en varias funciones en prevención o reversión de agregación de proteínas. La más conocida de estas actividades es su función en el desensamblaje del enrejado de que envuelve las vesículas de endocitosis recubiertas de clatrina. Hasta el momento, la liberación de HSC70 durante el ictus y su papel en situaciones de hipoxia no está establecido. Se han descrito dos isoformas de la HSC70, la isoforma I, de 646
aminoácidos, que parece ser la proteína completa y la isoforma II, de 493 aminoácidos de longitud, que parece ser la forma madura. La invención contempla usar como marcador cualquiera de las isoformas, u otras vahantes, de la HSC70.
El término "diagnóstico" es bien conocido en el estado de la técnica y se refiere al procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad. El "activador del plasminogeno tisular" (en inglés: Tissue Plasminogen
Activator o tPA) es una proteína proteolítica implicada en la disolución de coágulos de sangre. Específicamente, es una serina proteasa que se encuentra en las células endoteliales, las células que recubren el interior de los vasos sanguíneos. Como enzima, cataliza la conversión de plasminogeno a plasmina, que es la enzima principal para la disolución de coágulos de sangre. En medicina se emplea tPA humano de origen recombinante como fármaco para el tratamiento de ictus isquémico y otras condiciones causadas por coágulos sanguíneos. El tPA recombinante empleado con más frecuencia en el tratamiento del ictus isquémico se conoce como alteplasa. Sin embargo, el estado de la técnica comprende otras variantes de tPA recombinante que podrían usarse para el tratamiento, por ejemplo, reteplasa, tecneplasa y desmoteplasa.
El término "muestra" se refiere a un fluido corporal o un tejido del paciente obtenido con el propósito de llevar a cabo el diagnóstico in vitro del ictus isquémico o decidir acerca del tratamiento que se ha de aplicar al paciente.
En la presente invención, "marcador terapéutico" se refiere a la proteína HSC70 utilizada para el esudio de muestras obtenidas de un paciente sospechoso de sufrir una enfermedad y determinar si el paciente reúne las condiciones necesarias para que el tratamiento terapéutico indicado sea efectivo.
Se entiende por "valor de referencia" un valor con el cual se compara la cantidad de HSC70 determinada según la invención para el diagnóstico del ictus isquémico. Se trata de un valor del marcador que permite distinguir un paciente con ictus isquémico del resto de individuos que no sufren un ictus isquémico, incluyendo entre estos individuos los que paceden un ictus de naturaleza hemorrágica. Preferentemente, el valor de referencia es un valor que permite descartar con una elevada sensibilidad que el paciente
diagnosticado sufre un ictus hemorrágico.
El valor de referencia dependerá de varios factores, entre los que destacan el tipo de muestra en la que se determine el marcador, el plazo de tiempo en el cual se lleve a cabo dicha determinación y, en menor medida, la técnica de determinación empleada. Esto es debido a que los niveles del marcador pueden variar en los diferentes fluidos o tejidos del paciente, en función del tiempo trascurrido desde el desencadenamiento del episodio isquémico, y en función de la técnica de determinación empleada.
El término "nivel" o "niveles" se refiere a la cantidad o concentración de HSC70 en una muestra obtenida de un paciente.
Se entiende por "determinación semicuantitativa" una determinación que permite discriminar si la concentración de un analito en una muestra, en el caso de la presente invención, un marcador de diagnóstico, es supenor a un valor de referencia seleccionado. Por "grupo de unión" se entiende una molécula o segmento de molécula capaz de unirse específicamente a una proteína diana (en el presente caso la proteína diana es la HSC70).
Se entiende por "biosensor" un instrumento para la medición de parámetros biológicos o químicos. En la presente invención el parámetro a medir es la proteína HSC70.
Según la invención, "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo completo, incluyendo sin limitación un anticuerpo quimérico, recombinante, transgénico, humanizado, injertado y de una única cadena, y similares, así como cualquier proteína de fusión, sus conjugados, sus fragmentos, o sus derivados que contengan uno o más dominios que se unen selectivamente a la proteína diana o péptido. Cuando se utilizan anticuerpos completos para la presente invención, se prefieren anticuerpos monoclonales.
Se entiende por "aptámeros" oligonucleótidos de cadena sencilla con tamaños entre 70 y 100 nucleótidos capaces de reconocer de forma específica y con alta afinidad a vahos tipos de moléculas diana mediante un plegamiento tridimensional de su cadena. Generalmente son obtenidos mediante su selección desde librerías de oligonucleótidos combinatohales, mediante el método SELEX (de sus siglas en inglés: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enhchment), que permitirá seleccionar aquel oligonucleótido de la librería utilizada que se une con más afinidad a la molécula diana. Estas moléculas son capaces de adoptar estructuras globulares lo que les permite exhibir unas complejas y sofisticadas
propiedades de reconocimiento molecular siendo capaces de unirse de una manera estable y muy específica a sus dianas. Dichas dianas moleculares pueden ser pequeñas moléculas como ATP, proteínas, ácidos nucleicos y complejas estructuras multiméhcas.
Por "inmunoensayo" se entiende una técnica inmunoquímica donde se emplean complejos inmunes, es decir, los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito determinado, que puede ser el anticuerpo o el antígeno, usando para la medición una molécula como marcador que forma parte de la reacción con el complejo inmune.
La FIG. 1 muestra los resultados de la determinación de HSC70 en suero obtenido de individuos sanos y de pacientes con ictus isquémico. Como se puede observar, existe una diferencia significativa (p < 0,05) en los niveles de HSC70, los cuales son mucho más elevados en pacientes con ictus isquémico que en individuos sanos. Adicionalmente, los inventores han encontrado que también existe una diferencia significativa (p < 0,05) en la concentración de HSC70 en suero de pacientes con ictus de naturaleza isquémica en comparación con pacientes con ictus de naturaleza
hemorrágica (ver FIG. 2).
Con base en los resultados obtenidos, la presente invención proporciona en su primer aspecto un método in vitro para el diagnóstico de ictus isquémico en un paciente basado en la determinación de la proteína HSC70. En una realización particular del primer aspecto de la invención, el método comprende, adicionalmente, comparar la cantidad de HSC70 determinada con un valor de referencia, donde una cantidad de HSC70 superior al valor de referencia indica que el paciente sufre un ictus isquémico. En el curso de sus experimentos, los inventores han comprobado que los niveles del marcador se mantienen significativamente elevados durante las horas siguientes al episodio isquémico, volviendo a su nivel basal
aproximadamente a las 24 horas desde el comienzo de los síntomas. Por lo tanto, la muestra en la cual se determina el marcador para llevar a cabo el diagnóstico de ictus isquémico se obtiene en un plazo de tiempo inferior a las
24 horas desde el comienzo de los síntomas de ictus cerebral. Un plazo de tiempo inferior a 24 horas puede ser: 20 horas, 18 horas, 16 horas, 14 horas, 12 horas, 10 horas, 8 horas, o inferior. El método de la invención también permite diagnosticar el ictus isquémico antes del transcurso de 6 horas desde el comienzo de los síntomas, incluso antes del transcurso de cuatro horas y media. Este hecho es de gran utilidad en la práctica clínica porque permite tomar decisiones rápidas acerca del tratamiento del paciente. En la práctica clínica actual los tratamientos más efectivos para el ictus isquémico se basan en la administración de un fármaco trombolítico, y la efectividad de estos fármacos está íntimamente relacionada con la rapidez con la que se administran al paciente.
Así, en una realización particular, el método de la invención se lleva a cabo en un plazo de tiempo inferior a las 6 horas desde el comienzo de los síntomas de ictus cerebral. En una realización preferida, el plazo de tiempo puede estar comprendido entre 20 minutos y 4 horas 30 min desde el comienzo de los síntomas. En otra realización preferida, el plazo está comprendido entre 1 hora y 3 horas desde el comienzo de los síntomas.
Preferentemente, el tratamiento recomendado comprende la administración de un agente trombolítico, que es el tratamiento adecuado para el ictus isquémico. Ejemplos no limitativos de agentes trombolíticos conocidos son uroquinasa y tPA. En una realización preferida de la invención, el tratamiento recomendado comprende la administración de tPA. La presente invención contempla la administración de cualquier vanante de tPA, si bien,
preferentement el tPA administrado es tPA recombinante humano, por ejemplo, alteplasa, indicado para el tratamiento del ictus isquémico.
Otros tratamientos para los pacientes de ictus isquémico proporcionados por el estado de la técnica también forman parte de la presente invención. Por ejemplo, un tratamiento complementario o alternativo a los agentes trombolíticos es la eliminación del trombo que ha causado el ictus isquémico mediante cirugía neurointervencionista.
La muestra en la cual se determina el nivel del marcador según el método de la invención es, preferentemente, una muestra de sangre o cualquier fluido derivado de la sangre, como por ejemplo, plasma o suero. El marcador también se puede encontrar en otros fluidos o tejidos corporales, como por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, linfa, orina, saliva y tejido neuronal, por lo que todos ellos pueden utilizarse como muestra para determinar el marcador de la invención. En una realización preferida, la determinación del marcador se lleva a cabo en una muestra de suero. Preferentemente, el valor de referencia con el cual se compara el nivel del marcador según el método de la invención se selecciona de tal manera que el método de diagnóstico posee una sensibilidad elevada. De este modo, el método de la invención permite diagnosticar con segundad si el paciente sufre un ictus isquémico, descartando que el ictus sea hemorrágico, y administrar el tratamiento adecuado.
Una posible forma de establecer el valor de referencia para el método de la invención en unas condiciones dadas es a partir de los puntos de corte de la curva ROC para el marcador en esas condiciones. Una curva ROC (acrónimo del inglés Receiver Operating Characteristic, o Característica Operativa del Receptor) es una representación gráfica de la sensibilidad frente a (1 - especificidad) para un sistema clasificador binario según se varía el umbral de discriminación. El umbral de discriminación equivale al valor de referencia del método de la invención.
En la FIG 3 y la FIG 4 se muestran, respectivamente, la curva ROC y sus puntos de corte para el método de diagnóstico de ictus isquémico en las condiciones indicadas en los ejemplos de los modos de realización, es decir, en suero y un plazo de tiempo inferior a las 6 horas desde el comienzo de los síntomas. Cada punto de corte de la curva ROC es un posible valor de referencia para las condiciones en las cuales se lleva a cabo el método y lleva asociado un valor de sensibilidad y especificidad. Por ejemplo, un punto de corte (o valor de referencia) de 3,42 ng/ml lleva asociada una sensibilidad del 90%. Esto quiere decir que, según el método de la invención, cuando la concentración de HSC70 en el suero del paciente es superior a 3,42 ng/ml, dicho paciente tiene un 90% de posibilidades de sufrir un ictus isquémico. Otro ejemplo: para un punto de corte de 4,353 ng/ml, la sensibilidad del método es del 100%. Por lo tanto, los pacientes que tienen una
concentración de HSC70 en suero superior al valor de referencia de 4,353 ng/ml tienen un 100% de posibilidades de sufrir un ictus isquémico.
En la FIG 4 se puede apreciar que los puntos de corte superiores a 4,353 también presentan valores de sensibilidad del 100%. Sin embargo, a partir de cierto punto, la especificidad del método es demasiado baja. Cuando la especificidad es baja significa que el método de diagnóstico puede resultar en un falso negativo, es decir, se corre el riesgo de emitir un diagnóstico negativo de ictus isquémico para un paciente que sí pacede un ictus isquémico.
Como consecuencia de todo lo anterior, el valor de referencia se selecciona, preferentemente, de tal manera que proporciona al método de la invención una sensibilidad comprendida en un rango del 90 % al 100%, más
preferentemente cercana al 100%, y una especificidad elevada.
Es evidente para el experto en la materia que el valor de referencia con el cual se compara el nivel del marcador según el método de la invención dependerá de varios factores, entre ellos, el tipo de muestra en la que se determine el marcador, el plazo de tiempo en el cual se lleve a cabo dicha determinación y la técnica de determinación empleada. Por ejemplo, los valores de referencia arriba indicados son aplicables cuando la
determinación de la concentración de la proteína HSC70 se realiza en las condiciones indicadas en los ejemplos. Así, para dichas condiciones, un valor de referencia adecuado puede estar comprendido entre 3,4 ng/ml y 4,6 ng/ml. El experto en la materia sabrá seleccionar el valor de referencia adecuado en función de las condiciones en las que se lleve a cabo el método de la invención.
La determinación de la cantidad de HSC70 en la muestra puede ser cuantitativa o sem ¡cuantitativa. El campo de la analítica proporciona diversos métodos para la determinación cuantitativa y sem ¡cuantitativa de proteínas en una muestra, así como una gran diversidad de instrumentos (biosensores) para llevar a cabo estos métodos. Cualquier tipo de biosensor puede ser utilizado en el método de la invención.
Con frecuencia los métodos de determinación de proteínas hacen uso de grupos de unión específicos para la proteína a determinar, tales como anticuerpos o aptámeros. Otros grupos de unión adecuados son proteínas que interaccionan de manera específica con la proteína HSC70. Como ejemplo no limitativo de proteína que interacciona de manera específica con HSC70 se encuentra la proteína conocida como CHIP (acrónimo del inglés C- terminus of HSC70 interacting protein).
La determinación de HSC70 se puede llevar a cabo ventajosamente mediante un inmunoensayo. Cualquier inmunoensayo puede utilizarse en el método de la presente invención, por ejemplo, el ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo, inmunoblot e inmunocromatografía. Otro método adecuado para determinar HSC70 es la resonancia de plasmón de superficie. Todos estos métodos son bien conocidos en el campo del análisis de proteínas y constituyen ejemplos no limitativos de métodos adecuados para llevar a cabo la determinación del marcador de la invención. Agunos de estos métodos tienen la ventaja de que pueden llevarse a cabo en biosensores de pequeño tamaño y fácil uso que no necesitan estar ubicados en un laboratorio, ni requieren de personal especializado en química analítica. Así, el procedimiento de la invención podría ser llevado a cabo de forma rápida en el punto de asistencia, por ejemplo, se puede llevar a cabo por los asistentes sanitarios en la misma ambulancia que translada al paciente al hospital.
Ejemplos no limitativos de biosensores de detección rápida adecuados para llevar a cabo el método de la invención son una tira inmunocromatográfica (también conocido por "dipstick") o una tarjeta lab-on-a-chip con circuito de microfluídica e immunodetección o detección de la interacción con una segunda molécula.
En una realización particular, el método de la invención comprende
determinar, además de la proteína HSC70, al menos otro marcador de diagnóstico del ictus. La determinación de uno o más marcadores puede reforzar la información facilitada por la HSC70, proporcionar información complementaria, o ambas cosas. Ejemplos no limitativos de marcadores de diagnóstico del ictus que pueden determinarse junto con el marcador de la invención son: APO- Cl, APO 111 (Allard L et al, supra), autoanticuerpos NR2a y NR2b (Dambinova S et al, supra), metaloproteinasa 9, péptido natriurético tipo B (BNP), proteína S100 y dímero-D (Laskowitz D, Kasner S, Saver J, Remmel K, Jauch E. "Clinical Usefulness of a Biomarker-Based Diagnostic Test for Acute Stroke. The Biomarker Rapid Assessment in Ischemic Injury (BRAIN) Study". 2009. Stroke, vol. 40, p. 77-85). El marcador HSC70 y el/los marcadores adicionales pueden determinarse todos a la vez o cada uno por separado. La presente invención también proporciona un kit para el diagnóstico del ictus isquémico. Dicho kit comprende medios adecuados para determinar la cantidad de proteína HSC70. Los medios adecuados dependerán
principalmente de la técnica empleada para determinar la cantidad de
HSC70. Por ejemplo, si la técnica empleada es un inmunoensayo, los medios adecuados pueden ser, entre otros, el soporte para llevar a cabo el inmunoensayo, anticuerpo conjugado, anticuerpo de detección, tampón de muestra y solución de revelado. El kit también puede contener controles para una correcta interpretación del resultado, reactivos adicionales, tales como, reactivos para la calibración del método y reactivos para el pre-tratamiento de la muestra, así como instrucciones para llevar a cabo el método de diagnóstico del ictus isquémico según la invención. El kit puede contener, adicionalmente, medios adecuados para determinar otro marcador del ictus. En una realización particular, el marcador HSC70 y, opcionalmente, otros marcadores, están incorporados a una tira
inmunocromatográfica o "dipstick", de modo que se determinan todos al mismo tiempo de forma rápida y sin necesidad de disponer de un laboratorio ni personal especializado.
Se puede utilizar el kit proporcionado por la presente invención en la práctica clínica rutinaria para identificar con rapidez los pacientes que padecen un ictus isquémico incluso en condiciones pre-hospitalarias. Mediante el uso del kit de la invención, el personal médico puede aplicar el tratamiento adecuado al paciente de forma rápida y segura, incrementando así las posibilidades de recuperación del mismo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas. EJEMPLOS Ejemplo 1 .
Se determinó in vitro la concentración de HSC70 (ng/ml) en suero obtenido de 10 pacientes sanos y de 10 pacientes con ictus isquémico dentro de las 6 h desde el comienzo de los síntomas. La determinación de HSC70 en el suero de los pacientes se volvió a calcular en muestras suero obtenidas transcurridas 24 horas desde el comienzo de los síntomas. La clasificación dentro del subtipo ictus isquémico se realizó por criterios de imagen utilizando resonancia magnética nuclear (RMN) o Tomografía axial computerizada (TAC). La determinación de HSC70 en las muestras se llevó a cabo utilizando el kit "ELISA Kit for Heat Shock 70kDa Protein 8 (HSPA8)" (USCN Life Science) siguiendo las instrucciones de proveedor.
La FIG 1 muestra que los pacientes diagnosticados como pacientes con ictus isquémico presentan niveles séricos de HSC70 significativamente (p < 0,05) más altos que los controles sanos durante las primeras horas del comienzo de los síntomas (6 h desde el comienzo del los síntomas). Los resultados mostrados en esta figura también indican que los niveles séricos de HSC70 disminuyen transcurridas 24 horas desde el comienzo del episodio
isquémico.
Ejemplo 2.
Se determinó in vitro la concentración de HSC70 (ng/ml) en muestras de suero obtenidas de 10 pacientes con ictus isquémico y de 10 pacientes con ictus hemorrágico, siempre dentro de las 6 horas desde el comienzo de los síntomas. La clasificación dentro del subtipo ictus isquémico o hemorrágico se realizó por criterios de imagen utilizando resonancia magnética nuclear (RMN). La determinación de HSC70 en las muestras se llevó a cabo mediante ELISA utilizando el "ELISA Kit for Heat Shock 70kDa Protein 8 (HSPA8)" de USCN Life Science, siguiendo las instrucciones del proveedor.
Los resultados se muestran en la FIG 2 e indican que los pacientes diagnosticados como pacientes con ictus isquémico presentaron niveles séricos significativamente (p < 0,05) más altos que los pacientes con ictus hemorrágico dentro de las 6 primeras horas desde el comienzo de los síntomas.
Los elevados niveles séricos de HSC70 en las primeras horas transcurridas desde el comienzo de los síntomas en pacientes con ictus de etiología isquémica no se observó en los ictus de etiología hemorrágica, lo cual sirve de base para una prueba diagnóstica que, utilizando la determinación in vitro de niveles de HSC70, discrimina los enfermos que presenten el subtipo ictus isquémico.
Ejemplo 3. Para estimar la capacidad diagnóstica del procedimiento de la invención se construyó una curva ROC (FIG 3). Esta curva representa los valores de sensibilidad en el eje de de ordenadas y del complementario de la
especificidad (1 -especificidad) en el eje de abscisas. En la FIG 4 se especifican los puntos de corte de la curva ROC, los cuales dan una ¡dea de la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de ictus isquémico para cada valor de concentración de HSC70 en suero. Así, dichos puntos de corte de la curva ROC son posibles valores de referencia para el método de diagnóstico de la invención. Seleccionar un valor de referencia u otro supone que el método de diagnóstico proporcione una sensibilidad mejor o peor en las condiciones dadas. Por ejemplo, tal y como se puede observar, si se selecciona un valor de referencia de 4,353 ng/ml, los pacientes con niveles séricos mayores de 4,353 ng/ml serían diagnosticados con ictus isquémico con una sensibilidad del 100% y un 80% de especificidad. Esto implica que el 100% de los pacientes que presentan valores séricos de
HSC70 superiores a un valor de referncia de 4,353 sufren un ictus isquémico y que a todos ellos se les puede administrar un tratamiento trombolítico.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método in vitro para el diagnóstico de ictus isquémico en un paciente que comprende determinar la cantidad y/o concentración de proteína cognitiva de choque térmico 70 ("HSC70").
2. Método según la reivindicación 1 , que adicionalmente comprende comparar la cantidad y/o concentración de HSC70 con un valor de referencia, donde una cantidad de HSC70 en el paciente superior al valor de referencia es indicativo de ictus isquémico.
3. Método para decidir o recomendar la administración de un tratamiento farmacológico adecuado para el ictus isquémico que comprende los pasos de: a) determinar in vitro la cantidad y/o concentración de HSC70 en un paciente sospechoso de sufrir un ictus isquémico ; y
b) comparar la cantidad y/o concentración de HSC70 determinada según el apartado a) con un valor de referencia que permite asegurar que el ictus es del tipo isquémico. donde si la cantidad de HSC70 es superior al valor de referencia se recomienda el inicio del tratamiento indicado para el ictus isquémico y si la cantidad y/o concentración de HSC70 es igual o inferior al valor de referencia no se recomienda el inicio del tratamiento.
4. Método según la reivindicación 3, donde el tratamiento recomendado comprende la administración de un agente trombolítico.
5. Método según la reivindicación 4, donde el agente trombolítico es un activador del plasminógeno tisular humano recombinante.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, que se lleva a cabo en un plazo de tiempo inferior a 24 horas desde el comienzo de los síntomas de ictus cerebral.
7. Método según la reivindicación 6, donde el plazo de tiempo es inferior a 6 horas desde el comienzo de los síntomas de ictus cerebral.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde el plazo de tiempo está comprendido entre 20 minutos y cuatro horas y media desde el comienzo de los síntomas de ictus cerebral.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, donde la
determinación de la cantidad y/o concentración de HSC70 se lleva a cabo en una muestra de un fluido del paciente.
10. Método según la reivindicación 9, donde el fluido es sangre, plasma o suero.
1 1 . Método según la reivindicación 10, donde el fluido es suero.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , donde la determinación de HSC70 se lleva a cabo usando un grupo de unión específico para HSC70.
13. Método según la reivindicación 12, donde el grupo de unión específico para HSC70 es un anticuerpo.
14. Método según la reivindicación 13, donde la determinación de HSC70 se lleva acabo mediante un inmunoensayo.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, donde
adicionalmente se determina la cantidad y/o concentración de al menos otro marcador de diagnóstico del ictus.
16. Kit para llevar a cabo el método definido por la reivindicación 15 que comprende medios adecuados para determinar la cantidad de HSC70 y medios adecuados para determinar la cantidad de al menos otro marcador de diagnóstico de ictus.
17. Uso de HSC70 como marcador diagnóstico de ictus isquémico.
PCT/ES2012/070312 2011-05-06 2012-05-04 Método de diagnóstico del ictus isquémico WO2012152970A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201130729 2011-05-06
ESP201130729 2011-05-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012152970A1 true WO2012152970A1 (es) 2012-11-15

Family

ID=47138824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2012/070312 WO2012152970A1 (es) 2011-05-06 2012-05-04 Método de diagnóstico del ictus isquémico

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2012152970A1 (es)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007007129A2 (en) * 2005-07-14 2007-01-18 Universite De Geneve Diagnostic method for brain damage-related disorders

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007007129A2 (en) * 2005-07-14 2007-01-18 Universite De Geneve Diagnostic method for brain damage-related disorders

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AOKI, M. ET AL.: "Temporal profile of the induction of heat shock protein 70 and heat shock cognate protein 70 mRNAs after transient ischemia in gerbil brain", BRAIN RESEARCH., 22 January 1993 (1993-01-22), pages 185 - 192 *
KAWAGOE, J. ET AL.: "Distributions of heat shock protein (HSP) 70 and heat shock cognate protein (HSC) 70 mRNAs after transient focal ischemia in rat brain", BRAIN RESEARCH., vol. 587, no. 2, 8 July 1992 (1992-07-08), pages 195 - 202 *
THE NATIONAL INSTITUTE OF NEUROLOGICAL DISORDERS AND STROKE RT-PA STROKE STUDY GROUP.: "Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke", THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE., vol. 333, no. 24, 14 December 1995 (1995-12-14), pages 1581 - 1587 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2538504T3 (es) Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga
ES2232424T3 (es) Metodo para diagnosticar y distinguir un ictus.
ES2415375T3 (es) Un procedimiento para diagnosticar placas ateroescleróticas midiendo CD36
ES2666350T3 (es) Método y dispositivo para la detección combinada de infecciones virales y bacterianas
ES2533086T3 (es) Método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa
ES2373048T3 (es) Análisis para el diagnóstico de la enfermedad de alzheimer basado en la determinación de la proporción de productos de escisión ab de secretasa.
ES2718731T3 (es) Métodos, dispositivos y kits para detectar o monitorizar la lesión renal aguda
ES2564290T3 (es) Inmunoensayo de flujo lateral para la activación de complemento y métodos de uso para evaluación del sitio de atención de trastornos asociados a complemento
ES2282780T3 (es) Metodo para el diagnostico de la fibrosis hepatica.
ES2386574T3 (es) Procedimiento de detección de afección en paciente con alteración de la consciencia
ES2911270T3 (es) Composición para diagnosticar enfermedades infecciosas o complicaciones infecciosas mediante el uso de triptofanil-arnt sintetasa y método para detectar el marcador de diagnóstico
WO2020124013A1 (en) Combinatorial temporal biomarkers and precision medicines with detection and treatment methods for use in neuro injury, neuro disease, and neuro repair
ES2549460T3 (es) NT-pro ANP y sFlt-1 para la diferenciación entre los eventos isquémicos y circulatorios
ES2557558T3 (es) Composiciones y métodos para caracterizar una miopatía
ES2656082T3 (es) NT-proANP y NT-proBNP para el diagnóstico del accidente cerebrovascular
ES2400255T3 (es) Procedimiento in vitro para la diagnosis y la diagnosis precoz de enfermedades neurodegenerativas
CN101268370A (zh) 基于nr2肽诊断和治疗脑血管事件的方法
JP2018523092A (ja) 星状細胞トラウマトーム（ｔｒａｕｍａｔｏｍｅ）および神経外傷のバイオマーカー
ES2306080T3 (es) Procedimiento para el diagnostico de septicemina mediante determinacion selectiva de la concentracion de superoxidodismutasa cu/zn (sod cu/zn) en muestras de pacientes.
WO2012152970A1 (es) Método de diagnóstico del ictus isquémico
ES2898371T3 (es) Método para diagnosticar accidentes cerebrovasculares usando una combinación de biomarcadores
EP3117356B1 (en) Diagnostic marker for treatment of cerebral ischemia
US7659091B2 (en) Diagnostic marker
ES2774014T3 (es) Dispositivo médico, procedimiento de inmunoensayo y ensayo para la detección de la retinopatía diabética proliferativa
US10036746B2 (en) Method for the diagnosis of neuromyelitis optica

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12782080

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12782080

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1