ES2557558T3 - Composiciones y métodos para caracterizar una miopatía - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para diagnosticar una miopatía necrotizante auto-inmunomediada en un sujeto mamífero, determinando la presencia de auto-anticuerpos específicos para la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGCR) o un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a auto-anticuerpos anti-HMGCR en el sujeto, que comprende las etapas de: a) realizar un inmunoensayo poniendo en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con una proteína HMGCR o un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a auto-anticuerpos anti-HMGCR, b) detectar la presencia de auto-anticuerpos en la muestra que específicamente unen la proteína HMGCR o el fragmento de la misma que tiene actividad de unión a auto-anticuerpos anti-HMGCR, en donde la presencia de auto-anticuerpos que específicamente unen la proteína HMGCR o el fragmento de la misma que tiene actividad de unión a auto-anticuerpos anti-HMGCR es indicativa que el sujeto padece miopatía.

Description

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La descripción proporciona un cierto número de objetivos que son útiles para el desarrollo de fármacos altamente específicos para tratar un trastorno caracterizado por los métodos delineados en esta memoria. Además, los métodos descritos proporcionan medios fáciles para identificar las terapias que son seguras para su uso en sujetos. Además, los métodos de la invención proporcionan una vía para analizar virtualmente cualquier número de compuestos para los efectos sobre una enfermedad descrita en esta memoria con un rendimiento de alto volumen, alta sensibilidad y baja complejidad.

Se entiende que los intervalos proporcionados en esta memoria son una abreviatura para todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números, o sub-intervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50.

Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "tratar", “tratando", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o aliviar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo. Se apreciará que, aunque no se excluya, el tratamiento de un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con el mismo se eliminen por completo.

A menos que se indique específicamente o resulte obvio a partir del contexto, tal como se utiliza en esta memoria, el término "o" se entiende que es inclusivo. A menos que se especifique o sea obvio a partir del contexto, tal como se utiliza en esta memoria, los términos "un", "una" y "el", “la” se entienden que pueden ser en singular o plural.

A menos que se indique específicamente o resulte obvio a partir del contexto, tal como se utiliza en esta memoria, el término "aproximadamente" se entiende que está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de 2 desviaciones estándares de la media. Aproximadamente puede entenderse como dentro del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del valor establecido. A menos que se desprenda del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en esta memoria están modificados por el término aproximadamente.

La relación de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en esta memoria incluye definiciones de esa variable como cualquier grupo individual o combinación de grupos mencionados. La relación de una realización para una variable o aspecto en esta memoria incluye esa realización como cualquier realización individual o en combinación con cualquier otra realización o partes de la misma.

Cualesquiera composiciones o métodos proporcionados en esta memoria se pueden combinar con una o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en esta memoria.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención presenta métodos para diagnosticar una miopatía necrotizante inmunomediada en un sujeto.

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que en determinados pacientes el uso de estatinas se asocia con una miopatía necrotizante autoinmuno-mediada con auto-anticuerpos que reconocen proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGCR).

Tal como se informó en detalle a continuación, se realizó el descubrimiento de nuevos auto-anticuerpos en pacientes con miopatía necrotizante al caracterizar pacientes que tienen necrosis miofibrilar sin inflamación prominente, un hallazgo inespecífico en pacientes con distrofias y miopatías tóxicas o inmunomediadas. Dado que la etiología de una miopatía necrotizante es a menudo oscura, la cuestión de cómo tratar a estos pacientes, es decir, si se beneficiarían de la inmunosupresión, quedó sin respuesta. Para desarrollar un método para el diagnóstico y tratamiento de estos pacientes con miopatía necrotizante, se analizaron las muestras de biopsia muscular y muestras de suero de 225 pacientes con miopatía. Las especificidades de anticuerpos se determinaron mediante la realización de inmunoprecipitaciones de lisados de células HeLa marcados con 35S-metionina. Las muestras de biopsia seleccionadas se tiñeron para el complejo de ataque a la membrana, complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y el marcador de células endoteliales CD31. Muestras de biopsia muscular de treinta y ocho de los 225 pacientes mostraron predominantemente necrosis miofibrilar. Doce de estos pacientes tenían una asociación de auto-anticuerpos conocida con u otra etiología para su miopatía. Dieciséis de los restantes veintiséis sueros inmunoprecipitaron proteínas de 200-kD y 100-kD; esta especificidad se observó en sólo uno de los 187 pacientes sin miopatía necrotizante. Los pacientes con el auto-anticuerpo anti-200/100-kD (10.333 UI/litro) y una miopatía irritable en electromiografía (88%). Sesenta y tres por ciento de estos pacientes habían estado expuestos a las estatinas antes de la aparición de debilidad. Todos los pacientes respondieron a la terapia inmunosupresora, y

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sujeto debe continuar la terapia con estatinas. Para llegar a esta determinación, el médico puede considerar si el sujeto tiene auto-anticuerpos que reconocen la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR). Tales anticuerpos pueden desarrollarse en semanas, meses o incluso años después de que se inició el tratamiento con estatinas. Si se desea, un sujeto sometido a terapia con estatinas se somete a ensayo de dichos auto-anticuerpos, independientemente de si está o no está mostrando síntomas de miopatía.

En una realización, el kit incluye una composición que contiene al menos un agente que se une un autoanticuerpo que se une específicamente a la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR). En determinadas realizaciones, el agente que se une al auto-anticuerpo es un fragmento de la proteína HMGCR, por ejemplo, un fragmento C-terminal. En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente estéril que contiene el agente de unión; tales recipientes pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, bolsitas, envases blíster u otras formas de envase apropiadas conocidas en la técnica. Tales recipientes pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, película de metal, u otros materiales adecuados para contener medicamentos.

Si se desea, el kit se proporciona junto con instrucciones para utilizar el kit para diagnosticar la enfermedad autoinmune, miopatía asociada con una respuesta autoinmune asociada con la terapia con estatinas y/o miopatía necrotizante. Las instrucciones incluirán generalmente información sobre el uso de la composición para el diagnóstico de un sujeto que tiene miopatía o que tiene miopatía necrotizante. En otras realizaciones, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del agente de unión; advertencias; indicaciones; contra-indicaciones; datos del estudio de los animales; datos del estudio clínico; y/o referencias. Las instrucciones se pueden imprimir directamente en el envase (cuando está presente), o como una etiqueta aplicada al recipiente, o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta separada suministrada en o con el recipiente.

Tipos de Muestras Biológicas

El nivel de auto-anticuerpos que reconocen una proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR) se mide en diferentes tipos de muestras biológicas. En una realización, el nivel de un auto-anticuerpo se mide en diferentes tipos de muestras biológicas. En otra realización, el nivel de auto-anticuerpos se mide en diferentes tipos de muestras biológicas. En una realización, la muestra biológica es una muestra de tejido que incluye las células musculares (p. ej., células musculares obtenidas en una biopsia muscular). En otra realización, la muestra biológica es una muestra de fluido biológico. Muestras de fluidos biológicos incluyen sangre, suero sanguíneo, plasma, saliva

o cualquier otro fluido biológico útil en los métodos de la invención.

Selección de un Método de Tratamiento y Vigilancia del Sujeto

Después de haber identificado que un sujeto padece una enfermedad autoinmune, miopatía asociada con una respuesta autoinmune asociada con la terapia con estatinas, y miopatía necrotizante, se selecciona un método de tratamiento. Está disponible un cierto número de regímenes de tratamiento estándares. El nivel o la presencia de auto-anticuerpos que reconocen la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR) es uno de los factores utilizados en la selección de un método de tratamiento. En una realización, la presencia de auto-anticuerpos que reconocen la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR) es indicativa de que la terapia inmunosupresora es apropiada. Otros factores relevantes que se pueden utilizar en unión con la presencia de dichos auto-anticuerpos son otros marcadores e indicadores clínicos útiles en la definición de una miopatía (por ejemplo, auto-anticuerpos antisintetasa, auto-anticuerpos de la partícula de reconocimiento anti-señal (SRP), niveles elevados de creatina quinasa (CK), infiltrados marcados de células inflamatorias en la biopsia muscular, vacuolas ribeteadas, atrofia perifascicular, MHC positivo de clase I, deposición del complejo de ataque a la membrana en pequeños vasos sanguíneos perimisiales y tinción de anticuerpos anti-NCAM de fibras musculares regenerantes).

El estado patológico o el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, miopatía asociada con una respuesta autoinmune asociada con una terapia con estatinas y miopatía necrotizante, o una propensión a desarrollar una afección de este tipo puede vigilarse utilizando los métodos y composiciones descritos.

En una realización, se vigila la expresión de marcadores presentes en un fluido corporal tal como sangre, suero sanguíneo y plasma. Esta vigilancia puede ser útil, por ejemplo, para evaluar la eficacia de un fármaco particular (p. ej., un fármaco inmunosupresor) en un sujeto que exhibe síntomas de miopatía. De manera deseable, el tratamiento con el fármaco inmunosupresor reduce los niveles de auto-anticuerpos que reconocen la proteína 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A (HMGCR). Si un tratamiento de este tipo no reduce los niveles de auto-anticuerpos, está indicada una terapia inmunosupresora diferente. Por ejemplo, si los niveles de auto-anticuerpos no se reducen en respuesta a la prednisona, está indicada una terapia de combinación inmunosupresora. Dicha terapia puede implicar a cualquiera de dos o más de los siguientes prednisona, rituximab, inmunoglobulina intravenosa, azatioprina y/o

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metotrexato, u otros agentes inmunomuduladores. Los agentes terapéuticos que disminuyen la expresión de un marcador utilizado en la invención (p. ej., auto-anticuerpos que reconocen la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR)) se consideran particularmente útiles.

Kits

Se describen kits para el diagnóstico de una enfermedad autoinmune, miopatía asociada con una respuesta autoinmune asociada con la terapia con estatinas y miopatía necrotizante, en particular una respuesta autoinmune asociada con la presencia de auto-anticuerpos que reconocen la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR). En una realización, el kit incluye un agente que une auto-anticuerpos que se unen específicamente a la proteína 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR). En una realización, este agente se fija a un sustrato.

El sustrato es un soporte sólido que puede estar en forma de una tira de papel, varilla de medición, membrana (p. ej., una membrana de nilón o un filtro de celulosa), una placa (p. ej., una placa de microtitulación, una placa de 96 pocillos) o partículas sólidas (p. ej., látex o perlas magnéticas). El soporte sólido puede estar hecho de cualquier material adecuado, que incluye, pero no se limita a un plástico (p. ej., polietileno, polipropileno, poliestireno, látex, poli(cloruro de vinilo), poliuretano, poliacrilamida, poli(alcohol vinílico), nilón, poli(acetato de vinilo) o cualquier copolímero adecuado de los mismos), celulosa (p. ej., diversos tipos de papel tal como papel de nitrocelulosa, y similares), un polímero de silicio (p. ej., siloxano), un polisacárido (p. ej., agarosa o dextrano), o una resina de intercambio de iones (p. ej., resinas de intercambio de aniones o cationes convencionales).

En otras realizaciones, el kit comprende el agente fijado a un sustrato y otros reactivos útiles en un ELISA. En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente estéril que contiene una composición celular terapéutica o profiláctica; recipientes de este tipo pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, bolsitas, envases blíster, u otras formas de recipientes apropiados conocidos en la técnica. Recipientes de este tipo pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, película de metal, u otros materiales adecuados para contener medicamentos.

Si se desea, el kit incluye instrucciones para utilizar el kit para detectar la unión del auto-anticuerpo a la proteína 3hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMGCR) o un fragmento de la misma. Las instrucciones incluirán generalmente información sobre el uso de la composición para el diagnóstico de una enfermedad autoinmune, miopatía asociada con una respuesta autoinmune asociada con la terapia con estatinas, y miopatía necrotizante. En otras realizaciones, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del agente de unión a HMGCR; precauciones; advertencias; indicaciones; contra-indicaciones; información de sobredosis; reacciones adversas; farmacología de los animales; estudios clínicos; y/o referencias. Las instrucciones se pueden imprimir directamente en el envase (cuando está presente), o como una etiqueta aplicada al recipiente, o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta separada suministrada en o con el recipiente.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro del ámbito de competencia del experto. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology "(Weir, 1996); "Gen Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller y Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos utilizados en la invención y, como tales, se pueden considerar en la fabricación y la práctica de la invención. Técnicas particularmente útiles para realizaciones particulares se comentarán en las secciones que siguen.

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos ordinarios en la técnica una exposición y descripción completas de cómo hacer y utilizar el ensayo, la detección y métodos terapéuticos descritos, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los autores de la invención consideran como su invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Un nuevo auto-anticuerpo anti-200/100-kD está presente en suero de pacientes con una miopatía necrotizante.

Muestras de biopsia muscular obtenidas de 225 pacientes que presentaban debilidad proximal del músculo, elevados niveles de creatina quinasa (CK) y/o evidencia de miopatía en la electromiografía (EMG) y/u otra evidencia

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de enfermedad muscular fueron revisadas con el fin de identificar a aquellos con una miopatía predominantemente necrotizante. No se consideró que pacientes con resultados de la biopsia notables para infiltrados marcados de células inflamatorias, vacuolas ribeteadas (características de miositis de cuerpos de inclusión), atrofia perifascicular (patognomónico de la dermatomiositis (DM), u otros rasgos característicos de un diagnóstico específico tuvieran una miopatía predominantemente necrotizante.

En total, treinta y ocho pacientes (17% del total) fueron identificados como que tenían una miopatía predominantemente necrotizante en la biopsia muscular. De ellos, una enfermedad muscular específica fue diagnosticada de forma definitiva en doce pacientes, utilizando métodos de ensayo existentes. Diez pacientes tenían miopatías autoinmunes tal como se define por la presencia de auto-anticuerpos antisintetasa (uno con anti-Jo-1, dos con anti-PL-12 y uno con anti-PL-7) o por la presencia de auto-anticuerpos anti-partícula de reconocimiento de señal (SRP) (seis pacientes); cada uno de estos pacientes también tenía una respuesta definida positiva a la terapia inmunosupresora. Además, un paciente tenía una miopatía necrotizante asociada con hipotiroidismo profundo y otro tenía distrofia muscular de cinturas de tipo 2B (es decir, disferlinopatía), que fue confirmada más tarde por pruebas genéticas. El resto de los veinte y seis pacientes (~ 10% de la cohorte original) tenía una miopatía predominantemente necrotizante de etiología poco clara.

Sueros recogidos de los veintiséis pacientes descritos anteriormente fueron rastreados en cuanto a la presencia de nuevos auto-anticuerpos. Sorprendentemente, se encontró que los sueros de dieciséis de estos pacientes (62%) habían inmunoprecipitado un par de proteínas a partir de extractos de células HeLa marcados radiactivamente con tamaños aproximados de 200 kd y 100 kd, respectivamente (Figura 1). Estas proteínas, con pesos moleculares que no corresponden a los de auto-antígenos específicos de miositis conocidos, siempre se inmunoprecipitaron como un par. Aunque fueron reproducibles inmunoprecipitaciones de auto-anticuerpos anti-200/100-kD, ningún suero detectó proteínas de 200-kD o 100-kD cuando se utilizaba para la inmunotransferencia de extractos de células HeLa.

Con el fin de evaluar la especificidad de estos anticuerpos para un fenotipo necrotizante, se sometió a ensayo la inmunorreactividad de auto-anticuerpos anti-200/100 para la cohorte restante. Entre los 187 pacientes que no padecían una miopatía necrotizante predominante, el suero de sólo 1 paciente (0,5%) inmunoprecipitó las proteínas de 200-kd y 100-kd, demostrando que este hallazgo es altamente específico para aquellos pacientes con una miopatía necrotizante (P < 10-15 mediante el ensayo exacto de Fisher). Ninguno de los sueros de los 12 pacientes con miopatías necrotizantes asociadas a afecciones previamente conocidas, incluyendo los 6 pacientes con anticuerpos anti-SRP, inmunoprecipitaba proteínas con pesos moleculares de 200 kd o 100 kd.

Varios de los sueros auto-anticuerpos anti-200/100-kD positivos immunoprecipitaron proteínas adicionales. Por ejemplo, el suero del paciente 8089 inmunoprecipitó una proteína de ~ 70 kD, así como las proteínas de 200-kD y 100-kD (Figura 1, pista 2). Es de señalar que cada una de las proteínas adicionales fue reconocida por no más de 1 de los 16 sueros de pacientes con positividad auto-anticuerpo anti-200/100. Además de ello, ninguna de las bandas adicionales reconocidas por cualquiera de los auto-anticuerpos anti-200/100-kD positivos correspondía en tamaño a auto-antígenos específicos de miositis previamente reconocidos, incluyendo proteínas con pesos moleculares de 72kD, 54-kD y/o 21-kD, como se ve en pacientes con miopatía de partículas de reconocimiento anti-señal.

Ejemplo 2: El uso de estatinas se correlaciona estadísticamente con positividad de auto-anticuerpos anti-200/100-kD

Se analizaron la información demográfica, los hallazgos de laboratorio, los patrones de debilidad, imágenes por resonancia magnética (MRI) del muslo y otras características clínicas de los dieciséis pacientes auto-anticuerpos anti-200/100-kD positivos con una miopatía necrotizante (Tabla 1). El único paciente que tenía especificidad de autoanticuerpos anti-200/100-kD con una miopatía predominantemente necrotizante se excluyó de este análisis (Tabla 1).

Tabla 1: Características clínicas de los pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kD

Demografía

Número de pacientes

16

Edad media en el brote de la enfermedad (años)

54

Sexo femenino

63%

Raza blanca

56%

Raza no blanca

44%

Fallecidos

0%

Rasgos clínicos

Debilidad muscular subjetiva

100%

Debilidad proximal tras el examen

100%

Uso de silla de ruedas

25%

Enfermedad pulmonar intersticial

0%

Tumores malignos

13%

Fenómeno de Raynaud

13%

Sarpullido

44%

Mialgias

75%

Artralgias

50%

Disfagia

63%

Uso de estatinas

63%

Hallazgos de laboratorio

Nivel inicial de creatina fosfoquinasa, media (UI/litro)

8.702

Nivel máximo de creatina quinasa, media (UI/litro)

10.333

Anticuerpo antinuclear positivo (> 1:160)

6%

Tasa de sedimentación de eritrocitos elevada

38%

Nivel de proteínas C-reactivas elevado

6%

Anti-Ro positivo

0%

Anti-La positivo

0%

Rasgos de MRI del muslo

Hallazgos normales tras MRI del muslo

0%

Edema muscular

100%

Atrofia

75%

Sustitución grasa

67%

Edema fascial

25%

Hallazgos por electromiografía (EMG)

Miopatía irritable

88%

Miopatía no irritable

13%

Normal

0%

* Excepto cuando se indique lo contrario, los valores son el porcentaje. CPK = creatina fosfoquinasa; CK = creatina quinasa; ANA = anticuerpo antinuclear; ESR = velocidad de sedimentación de eritrocitos; MRI = Formación de imágenes por resonancia magnética; EMG = electromiografía

Los hombres y las mujeres estaban representados en números casi iguales y tenían una edad media de 54 años en

5 el brote de la enfermedad. Todos los dieciséis pacientes informaron de resistencia previamente normal, con un brote agudo o subagudo de la debilidad muscular que se produce en edad adulta. En el momento de la evaluación inicial, todos los pacientes tenían debilidad muscular proximal, evidencia de edema muscular en la RMI muslo bilateral y niveles de creatina quinasa acusadamente elevados, con un valor medio de 10.333 UI/litro (intervalo 3.052-24.714). Cada una de las dieciséis electromiografías (EMGs) disponibles para su revisión reveló rasgos de miopatía. Catorce

10 de los dieciséis pacientes (88%) demostró una miopatía irritable, mientras que las dos miopatías restantes eran no irritables.

Otros rasgos clínicos destacados incluían mialgias en 12 (75%) de 16 pacientes, artralgias en 8 (50%) de 16 pacientes y disfagia en 10 (63%) de 16 pacientes. Sólo 2 (13%) de 16 pacientes tenían el fenómeno de Raynaud. Aunque 7 (44%) de 16 pacientes reseñó un sarpullido no específico, ningún paciente tuvo rasgos cutáneos

15 compatibles con DM en el examen o informe histórico. Ninguno de estos pacientes tenía anticuerpos contra antígenos nucleares extraíbles detectados por los laboratorios clínicos (incluyendo anti-Ro, anti-La, anti-RNP y antiScl-70) y ningún paciente cumplía los criterios para otra enfermedad del tejido conjuntivo. Dos pacientes tenían tumores malignos previas: 1 tenía cáncer de ovario no recurrente tratado 5 años antes del brote de la enfermedad muscular y el otro tenía cáncer de próstata que estaba en remisión clínica después del tratamiento.

20 Ninguno de los pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100 positivos tenía un historial familiar de enfermedad muscular. Además de ello, el aleteo de la escápula, una debilidad facial, una debilidad asimétrica, u otros rasgos distintivos sugestivos de enfermedad muscular hereditaria estaban ausentes en cada uno de estos pacientes.

De señalar, 10 (63%) de 16 pacientes habían estado expuestos a la terapia con estatinas antes de la aparición de debilidad. La media ± desviación estándar (SD) de duración del tratamiento con estatinas antes de la aparición de

25 los síntomas musculares fue de 31,3 ± 27,4 meses (intervalo 0 -84 meses). En cada caso, la interrupción de la medicación con estatinas no condujo a una clara mejoría clínica, y el período de tiempo medio ± SD entre la interrupción de estatinas y la biopsia muscular fue de 5,2 ± 4,6 meses (intervalo 1-14 meses). Una revisión de los registros de los pacientes no reveló otras exposiciones potenciales a miotoxina.

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Para determinar si la asociación con el uso de estatinas fue una coincidencia, se analizó/evaluó la frecuencia de uso de estatinas en otros grupos de pacientes con miositis (Tabla 2).

Tabla 2: Frecuencia de uso de estatinas en pacientes con diferentes formas de enfermedad muscular

Grupo

Frecuencia del uso de estatinas Edad media ± SD de los pacientes (años)

Todos los pacientes con anticuerpos anti-200/100-kD Pacientes de DM Pacientes de PM Pacientes de IBM

10 de 16 (62,5%) 5 de 33 (15,2%) 7 de 38 (15,2%) 11 de 31 (35,5%) 57,8 ± 14,8 51,0 ± 12,2 49,1 ± 14,1 67,7 ± 9,9

Todos los pacientes con anticuerpos anti-200/100-kD de ≥ 50 años de edad Pacientes de DM de ≥ 50 años de edad Pacientes de PM de ≥ 50 años de edad Pacientes de IBM de ≥ 50 años de edad

10 de 12 (83,3%) 4 de 16 (25%) 7 de 19 (36,8%) 10 de 30 (33,3%) 64,4 ± 9,2 61,0 ± 8,3 60,4 ± 7,6 68,4 ± 9,2

DM: dermatomiositis, MP: polimiositis e IBM: miositis de cuerpos de inclusión. P < 0,05 frente a pacientes que tienen anticuerpos anti-200/100-kD, mediante el test de chi-cuadrado.

imagen12P < 0,05 frente a pacientes de ≥ 50 años de edad que tienen anticuerpos anti-200/100-kD, mediante test t de Student.

5 (15,2%) de 33 pacientes con DM, 7 (18,4%) de 38 pacientes con PM y 11 (35,5%) de 31 pacientes con IBM habían sido tratados con estatinas antes de someterse a una biopsia muscular; la frecuencia de uso de estatinas se incrementó significativamente (P < 0,05) en el grupo de auto-anticuerpos anti-200/100 positivos en comparación con los dos grupos DM y PM. Sin embargo, en este análisis, no hubo diferencia significativa en el uso de estatinas entre el grupo de pacientes con positividad de auto-anticuerpos anti-200/100 y el grupo con IBM (P = 0,08). Dado que los pacientes de edad avanzada son más propensos a ser tratados con estatinas, se evaluaron las edades de los pacientes con diferentes formas de miositis. En comparación con todos los pacientes auto-anticuerpos anti-200/100 positivos, que tenían una edad media ± SD de 57,8 ± 14,8 años, el grupo total de pacientes con IBM era significativamente mayor, con una edad media ± SD de 67,7 ± 9,9 años. Cuando en el análisis sólo se incluyeron aquellos pacientes de 50 o más años de edad, 10 (83,3%) de 12 pacientes auto-anticuerpos anti-200/100 positivos, 4 (25%) de 16 pacientes con DM, 7 (36,8%) de 19 pacientes con PM y 10 (33,3%) de 30 pacientes con IBM habían estado expuestos a las estatinas (Tabla 2). En esta comparación de emparejamiento de edad, el tratamiento con estatinas era significativamente superior en la población de auto-anticuerpos anti-200/100 positivos en comparación con las poblaciones de DM (P = 0,002), PM (P = 0,011) e IBM (P = 0,003).

Hubo una variación notable en el fenotipo clínico, oscilando desde un paciente tetrapléjico, intubado crónicamente, a varios pacientes que tenían sólo una debilidad leve. Un rasgo único en la mayoría de los pacientes era su conservación relativa de resistencia a pesar de niveles acusadamente elevados de enzimas musculares. Sin embargo, los registros médicos de varios pacientes mostraron un nivel enzimático aparente muscular umbral (generalmente entre 3.000 y 7.000 UI/litro) por encima del cual se produjo debilidad.

Ejemplo 3: Las miopatías experimentadas por pacientes auto-anticuerpos anti-200/100-kD positivos responden a una terapia inmunosupresora

Los regímenes de medicación y las respuestas al tratamiento (basados en mejoras objetivas en la resistencia) eran variables. Están disponibles las características clínicas de los 16 pacientes auto-anticuerpos anti-200/100 positivos. De los 14 pacientes que fueron seguidos longitudinalmente, 9 (64%) tuvieron una respuesta completa o casi completa a la inmunosupresión y 5 (36%) tuvieron una respuesta parcial a la inmunosupresión. Estos 5 pacientes incluían 1 paciente cuya progresiva debilidad muscular se estabilizó, pero no mejoraron con la inmunosupresión. Seis (43%) de los 14 pacientes experimentó una recaída cuando se disminuyó gradualmente o se retiró la medicación inmunosupresora. Siete (60%) de los 14 pacientes están actualmente en fase de reducción de sus medicamentos inmunosupresores y no han experimentado una recaída hasta la fecha. Sólo 1 paciente tuvo una reducción completa de medicaciones inmunosupresoras sin experimentar una recaída de debilidad.

Tabla 3: Regímenes de medicación y respuestas al tratamiento de dieciséis pacientes con anti-auto-anticuerpos 200/100-kD

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P: prednisona; AZA: azatioprina; MTX: metotrexato; IVIG: inmunoglobulina intravenosa; MMF: micofenolato mofetil; CYC: ciclosporina; RTX: rituximab; FK506: tacrolimus, HCQ: hidroxicloroquina; y LTF: perdida durante el seguimiento.

La mayoría de los pacientes tuvieron una respuesta inicial muy modesta a la prednisona y requirieron terapia inmunosupresora de combinación. Rituximab e inmunoglobulina intravenosa eran adjuntos valiosos cuando se añadían a prednisona y azatioprina o metotrexato. La mayoría de los pacientes requirieron alguna dosis de prednisona durante la terapia de mantenimiento e informaron sobre debilidad con la reducción de esteroides, incluso si su respuesta inicial al tratamiento con prednisona era sólo modesta.

Ejemplo 4: La miopatía necrotizante asociada con positividad de auto-anticuerpos anti-200/100-kD tiene rasgos característicos de miopatías inmunomediadas.

Dieciséis (94%) de 17 pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100 tenían muestras de biopsias musculares que muestran una necrosis miofibral prominente; la muestra de biopsia restante del paciente era notable para extensos infiltrados inflamatorios, y un subsiguiente análisis no incluía los resultados de esta biopsia. A pesar de que un examen minucioso reveló colecciones endomisiales y/o perivasculares de células inflamatorias en 5 (31%) de las 16 muestras de biopsia muscular, el grado de inflamación era leve en comparación con el observado en las muestras de biopsia muscular típicas obtenidas de pacientes con PM o DM. Ninguna muestra de biopsia obtenida de un paciente con positividad de auto-anticuerpos anti-200/100 reveló evidencia de más de una denervación leve, y ninguna muestra de biopsia era positiva para la acumulación de glucógeno anormal o la deposición de amiloides.

De los 16 pacientes con miopatías necrotizantes que eran auto-anticuerpos anti-200/100 positivas, estaban disponibles muestras congeladas de tejido muscular obtenidas de 8 pacientes para su posterior análisis. Para evaluar la morfología de los vasos sanguíneos, las secciones se tiñeron con anticuerpos anti-CD31. Se observaron capilares endomisiales anormalmente agrandados con paredes engrosadas en 5 (63%) de 8 muestras de biopsia (flechas en la Figura 2B). Sin embargo, la densidad de capilares en el tejido muscular no estaba notablemente reducida en ninguna de las muestras de biopsia muscular.

La deposición del complemento fue evaluada por tinción de las muestras de biopsia muscular auto-anticuerpos anti200/100 positivas disponibles con anticuerpos que reconocen el complejo de ataque a la membrana. Aunque los capilares endomisiales no fueron reconocidos definitivamente por el anticuerpo (Figura 3D), en 6 (75%) de 8 muestras de biopsia muscular, se tiñeron pequeños vasos perimisiales (Figuras 3A y 3B). En contraposición, los vasos sanguíneos de muestras de biopsia muscular control no se teñían intensamente con anticuerpos del complejo de ataque a la membrana. Como era de esperar, la deposición del complejo de ataque a la membrana también estaba presente en miofibras necróticas y degenerativas; esto se consideró un hallazgo inespecífico. Sin embargo, en 4 (50%) de 8 de las muestras de biopsia muscular auto-anticuerpos anti-200/100 positivas, las superficies sarcolemales de fibras musculares no necróticas dispersadas, teñidas en positivo para el complejo de ataque a la membrana (Figuras 3C y D); tal como se muestra, algunas de estas células musculares eran relativamente pequeñas, lo que sugiere que podrían estar regenerando fibras.

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La tinción de muestras de biopsia muscular de auto-anticuerpos anti-200/100 positivas con anticuerpos que reconocen MHC clase I demostró que el sarcolema de 4 (50%) de 8 muestras era claramente MHC de clase I positivo (Figura 4). Varios otros tenían una tinción límite de MHC clase I, pero esto apareció considerablemente menos intenso que la observada en las muestras de biopsia muscular de pacientes Jo-1-positivos con PM que se incluyeron como controles positivos en el mismo experimento.

Las miopatías autoinmunes (a las que se alude colectivamente como miositis) son una familia de afecciones caracterizadas clínicamente por debilidad muscular simétrica proximal, niveles elevados de creatina quinasa sérica y hallazgos miopáticos en electromiografía (Dalakas MC, et al, Lancet 2003; 362: 971-82 y Mammen AL. Ann NY Acad Sci 2010; 1184:134-53). Aunque otras afecciones musculares pueden provocar síndromes clínicos similares, el diagnóstico de un trastorno autoinmune conlleva importantes implicaciones terapéuticas y de pronóstico, ya que sólo estos trastornos responden habitualmente a la terapia inmunosupresora.

Al igual que con otras enfermedades autoinmunes sistémicas, una fuerte asociación de auto-anticuerpos con fenotipos clínicos distintos se observa en pacientes con miopatía autoinmune. Por ejemplo, los auto-anticuerpos dirigidos contra aminoacil-ARN de transferencia (ARNt) sintetasas son los auto-anticuerpos específicos de miositis más frecuentes (MSAs) y se observan en ~ 20% de los pacientes con miositis (Targoff IN, et al., Rheum Dis Clin North Am 2002;28:859-90, viii). Estos y auto-anticuerpos que reconocen otras ARNt sintetasas se asocian con una constelación específica de rasgos clínicos que incluyen la enfermedad pulmonar intersticial, fenómeno de Raynaud, artritis y un hallazgo cutáneo característico conocido como manos de mecánico (Yoshida S, et al., Arthritis Rheum 1983;26:604-11; Marguerie C, et al., QJ Med 1990;77:1019-38). Pese a que el rastreo de auto-anticuerpos puede desempeñar un papel significativo en el diagnóstico de la enfermedad muscular inmunomediada, no siempre se observan anticuerpos de este tipo.

La presencia de infiltrados inflamatorios en muestras de biopsia muscular es otra característica bien reconocida de las miopatías autoinmunes (Dalakas MC, et al., 2003). Sin embargo, las muestras de biopsia muscular de algunos pacientes con miopatías autoinmunes contienen, en todo caso, pocos infiltrados de células inflamatorias. Por ejemplo, pacientes con auto-anticuerpos específicos de miositis (MSAs) dirigidos contra componentes de la SRP tienen muestras de biopsia que son notables para células musculares degenerantes, necróticas y regenerantes sin extensos infiltrados de células inflamatorias (Miller T, et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002;73:420-8; Kao AH, et al., Arthritis Rheum 2004; 50:209-15; Hengstman GJ, et al., Ann Rheum Dis 2006;65:1635-8; y Dimitri D, et al., Muscle Nerve 2007; 35:389-95). Por consiguiente, es probable que los pacientes con miopatías necrotizantes de lo contrario no diagnosticadas también puedan tener auto-anticuerpos únicos que podrían ser utilizados para el diagnóstico.

Entre un grupo de 225 pacientes con miopatías, treinta y ocho tenían muestras de biopsia muscular con miopatías predominantemente necrotizantes. Después de extensos ensayos de laboratorio, las condiciones específicas podrían ser diagnosticadas en doce de estos pacientes; éstos eran en su mayoría pacientes con anti-partícula de reconocimiento de señal (SRP) o miositis anti-sintetasa. Los sueros de los restantes veintiséis pacientes fueron rastreados en cuanto a la presencia de nuevos auto-anticuerpos y observó que dieciséis de estos sueros inmunoprecipitaron un par de proteínas con pesos moleculares aproximados de 200 kD y 100 kD, respectivamente. Además, entre los otros 187 pacientes, un paciente con una muestra de biopsia que muestra abundantes infiltrados de células inflamatorias compartió esta inmunoespecificidad. Los pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kD no tenían otros auto-anticuerpos conocidos, incluyendo anti-SRP. Por lo tanto, auto-anticuerpos anti-200/100-kD caracterizan un subconjunto único de pacientes con miopatías, representando dieciséis de los veinte y seis pacientes (62%) con miopatías idiopáticas necrotizantes.

En muchos aspectos, los rasgos clínicos de los pacientes con inmunoespecificidad de auto-anticuerpos anti200/100-kD son similares a los de los pacientes con otras formas de miopatía inmunomediada; ambos grupos experimentaron típicamente el brote sub-agudo de debilidad muscular proximal con elevados niveles de creatina quinasa, tenían resultados de miopatía irritable en electromiografía, evidencia de edema en MRI y, en la mayoría de los casos, una respuesta clara a la terapia inmunosupresora. Sin embargo, había varios rasgos únicos de los pacientes auto-anticuerpos anti-200/100-kD-positivos. En primer lugar, varios pacientes tenían niveles muy altos de creatina quinasa (en el intervalo de 3.000-8.000 UI/litro) pero sólo una debilidad muscular mínima. Esto indica que, o bien existe una capacidad inusual de estos pacientes para regenerar músculo con eficacia suficiente para mantener el ritmo de la destrucción muscular extensiva o que estos pacientes tienen una anomalía de la membrana muscular que permite la fuga de creatina quinasa sin provocar debilidad; una anomalía de este tipo podría ser consistente con el hallazgo de la deposición del complejo de ataque a la membrana tras el sarcolema de las fibras musculares no necróticas. En segundo lugar, en > 60% de estos pacientes, la exposición a la terapia con estatinas precedió al desarrollo de síntomas musculares, que persistieron mucho después de suspender el tratamiento con la miotoxina. De manera importante, esta asociación era más fuerte en pacientes de edad avanzada; más del 80% de pacientes

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auto-anticuerpos anti-200/100 kD-positivos con edades de 50 años o más habían estado expuestos a las estatinas. Esta tasa fue significativamente más alta que las tasas de tratamiento con estatinas en grupos emparejados en edad de pacientes con polimiositis, dermatomiositis o miositis por cuerpos de inclusión.

Aunque los pacientes auto-anticuerpos anti-200/100 kD-positivos comparten determinados rasgos con las poblaciones bien descritas de pacientes con anticuerpos anti-SRP, dos hallazgos claves distinguen a estos grupos como algo distinto. En primer lugar, los sueros de pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kD no reconocían ninguna de las subunidades de partícula de reconocimiento de señal, y sueros de pacientes con auto-anticuerpos anti-SRP no reconocían proteínas con pesos moleculares de ~ 200 kD o ~ 100 kD. Estas observaciones demuestran que pacientes con la especificidad de auto-anticuerpos anti-200/100-kD son inmunológicamente distintos de la población de pacientes con anticuerpos anti-SRP. En segundo lugar, varios pacientes auto-anticuerpos anti-200/100positivos que tenían niveles extremadamente altos de CK, tenían sólo una debilidad mínima. Esto fue inusual, debido a que los pacientes con anticuerpos anti-SRP con niveles elevados de CK son típicamente uniformemente muy débiles.

Para caracterizar adicionalmente la enfermedad muscular en pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100, muestras de biopsia muscular se tiñeron con anticuerpos contra complejo de ataque a la membrana, marcadores de células endoteliales y MHC de clase I. La deposición de complejos de ataque a la membrana representa la etapa final de la cascada del complemento y puede indicar que el tejido está destinado a la destrucción por el sistema inmune. La deposición del complejo de ataque a la membrana sobre capilares endomisiales ha sido demostrada en pacientes con dermatomiositis (Kissel JT et al., N Engl J Med 1986;314:329-34 y Emslie-Smith AM et al., Ann Neurol 1990; 27:343-56) y en tres de cuatro análisis de muestras de biopsia positivas para anti-SRP (Miller T, et al., 2002; Kao AH, et al., 2004; Hengstman GJ, et al., 2006; y Dimitri D, et al., 2007); esto no ocurre en las distrofias musculares (Spuler S et al., Neurology 1998; 50:41-6). Aunque la deposición de complejos de ataque a la membrana no se observó en capilares endomisiales en muestras de biopsia obtenidas de pacientes con auto-anticuerpos anti200/100-kD, en cinco de las ocho muestras, los capilares endomisiales estaban anormalmente engrosados y ampliados. Anomalías morfológicas similares se han descrito tanto en pacientes con anticuerpos anti-SRP como en un grupo de pacientes con "miopatía necrotizante con capilares pipestem". A pesar de que este último grupo comparte algunos rasgos patológicos con pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kD y anticuerpos anti-SRP, estos pacientes diferían por tener cualquiera otra enfermedad del tejido conjuntivo o cáncer activo (Emslie-Smith AM y Engel AG, Neurology 1991; 41:936-9).

A pesar de su ausencia en los capilares, la deposición del complejo de ataque a la membrana en los vasos sanguíneos pequeños perimisiales era evidente en seis (75%) de ocho muestras de biopsia obtenidas de pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kD. Sin estar ligados a la teoría, es razonable que la deposición del complemento en estos casos puede reflejar un nuevo objetivo vascular en esta población de pacientes. Además, el complejo de ataque a la membrana localizado en la superficie de las fibras no necróticas se observó en 4 (50%) de las 8 muestras de biopsia de pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100 que se analizaron. A pesar de que la presencia del complejo de ataque a la membrana de fibras no necróticas había sido previamente reseñado en miopatías inmunomediadas (Oxenhandler R, et al., Hum Pathol 1982; 13:745-57), esto no es una característica general de estos trastornos; en múltiples estudios de miopatía anti-SRP, un complejo de ataque a la membrana se observó en fibras no necróticas en sólo una de siete (Miller T, et al., J Neurol Neurosurg Psichiatry 2002; 73:420-8), ninguno de seis (Hengstman GJ, et al., 2006) y una de tres (Dimitri D, et al., Muscle Nerve 2007; 35:389-95) muestras de biopsia muscular. Cabe señalar que también se ha reseñado que la deposición del complejo de ataque a la membrana en miofibras no necróticas se produce en algunas distrofias (Spuler S, et al., Neurology 1998; 50:41-6), y que la deposición del complejo de ataque a la membrana en los vasos sanguíneos y las fibras musculares puede ser un daño secundario a la membrana en lugar de un evento patológico primario.

Finalmente, cuatro de las ocho muestras de biopsia disponibles incluían miofibras con tinción sarcolemal de MHC de clase I. Este es un rasgo característico de las miopatías inmunomediadas y es raro o está ausente en muestras de biopsia de pacientes con distrofias musculares y otros trastornos musculares y nerviosos (Van der Pas J, et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2004; 75:136-9 y Sundaram C, et al., Neurol India 2008; 56:363-7). En comparación, los resultados de los estudios de evaluación de la tinción de MHC de clase I en pacientes con anticuerpos contra SRP han sido mixtos; un estudio señaló fibras de MHC de clase I-positivas en dos de tres pacientes (Dimitri D, et al., 2007), un segundo estudio demostró estas fibras en tres de seis pacientes (Miller T, et al., J Neurol Neurosurg Psichiatry 2002; 73:420-8), y un tercer estudio demostró las fibras en ninguno de los seis pacientes (Hengstman et al., 2006).

Curiosamente, dos informes recientes describen pacientes en los que se desarrolló una miopatía necrotizante durante el tratamiento con estatinas y progresó a pesar de la suspensión de la medicación miotóxica (Needham, et al., Neuromuscul Disord 2007; 17:194-200 y Grable-Esposito et al., Muscle Nerve 2010; 41:185-90). En el mayor de

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los dos informes, Grable-Esposito et al., describían veinticinco pacientes que experimentaron el desarrollo de una miopatía necrotizante, aparentemente inmunomediada, asociada a estatinas, que comparte muchos de los rasgos clínicos observados en la cohorte de pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kD positivos. Por ejemplo, este grupo de pacientes tenía debilidad muscular proximal, incluidos hombres y mujeres en números casi iguales, tenía un nivel de creatina quinasa medio de 8.203 UI/litro, requería múltiples medicaciones inmunosupresoras para lograr una resistencia mejorada y experimentaba una recaída tras la reducción de las medicaciones inmunosupresoras. Las muestras de biopsia muscular de ocho pacientes similares fueron analizadas en detalle por Needham y colaboradores (Needham, et al., 2007). Considerando que todas las muestras de biopsia descritas en Needham, et al., había aumentado la expresión de MHC de clase I en la superficie de las fibras musculares no necróticas, sólo cuatro de los ocho pacientes auto-anticuerpos anti-200/100-kD positivos descritos en esta memoria eran positivos para la tinción de MHC de clase I.

En conclusión, los resultados reseñados arriba en esta memoria identifican un grupo de pacientes con una miopatía necrotizante y una nueva especificidad de auto-anticuerpos anti-200/100. Curiosamente, el desarrollo de este fenotipo se asocia con la exposición a las medicaciones de estatinas. Además de la presencia de auto-anticuerpos, todos los pacientes respondieron a la inmunosupresión, y muchos experimentaron un brote de debilidad cuando se redujo gradualmente este tratamiento. Estos hallazgos tienden a indicar la presencia de una miopatía inmunomediada en estos sujetos. La presencia de MHC de clase I en la superficie de fibras no necróticas también sustenta que este proceso está inmunomediado. De hecho, los pacientes con miopatías necrotizantes y autoanticuerpos anti-200/100 muy probablemente tienen una enfermedad autoinmune que debería ser tratada con la medicación inmunosupresora.

Ejemplo 5: Sobre-regulación de la expresión de auto-antígenos de 200 kd y 100 kd por las estatinas.

Tal como se reseñó arriba en esta memoria, los sueros de un grupo de pacientes con IMNM inmunoprecipitan proteínas de -200-y -100-kd de extractos HeLa radio-marcados.

Dada la fuerte asociación del uso de estatinas con el desarrollo de estos auto-anticuerpos anti-200/100-kd, células HeLa fueron marcadas con 35S-metionina/cisteína después del tratamiento previo durante 24 horas, ya sea con mevinolina 10 pM o vehículo (DMSO) solo. Para validar la equivalencia de proteínas de estos lisados, se realizaron inmunoprecipitaciones utilizando anticuerpos contra Mi-2 o PM-Scl. Como se anticipó, se detectaron cantidades iguales de Mi-2 y los 5 componentes de la proteína del complejo PM-Scl en cada uno de los tipos de lisado. En contraposición, niveles incrementados 3 veces tanto de la proteína de 200-kd como de la de 100-kd se inmunoprecipitaron a partir de las células tratadas con mevinolina, demostrando que los niveles de estos autoantígenos están sobre-regulados por las estatinas (Figura 5A).

Goldstein y Brown (Goldstein JL y Brown MS Nature 1990; 343:425-30) originalmente demostraron que la expresión de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (abreviada como HMG-CoA reductasa o como HMGCR) está sobre-regulada mediante el tratamiento con estatinas. Morikawa y colaboradores (Morikawa S et al., J Atheroscler Thromb 2005; 12:121-31) extendieron estos hallazgos a las células musculares. Utilizaron el análisis de micromatrices de ADN para demostrar que las estatinas inducen la expresión de diecinueve genes en una línea celular del músculo esquelético humano, la mayoría de los cuales están relacionados con la biosíntesis del colesterol. Entre éstas, HMG-CoA reductasa se seleccionó como un candidato para el auto-antígeno de 100-kD debido a su peso molecular de 97-kd.

HMGCR marcada con 35S-metionina se generó mediante (IVTT) y se utilizó en un ensayo de inmunoprecipitación con suero de 16 pacientes con auto-anticuerpos anti-200/100-kd, así como suero de 6 sujetos control negativos, que consisten en 3 pacientes de DM y 3 individuos normales sin exposición a estatinas. Las muestras de suero de pacientes anti-200/100-kd-positivos inmunoprecipitaron HMGCR, mientras que muestras de suero de los grupos control no lo hicieron (Figura 5B).

Ejemplo 6: Los auto-anticuerpos anti-200/100-kD reconocen un fragmento C-terminal de la HMG-CoA reductasa.

HMG-CoA reductasa es una proteína de la membrana con un pequeño dominio extracelular, siete dominios que abarcan a la membrana y un dominio catalítico intracelular. Para definir la o las regiones de la proteína reconocida por los sueros de pacientes con anticuerpos anti-HMGCR, se sintetizaron proteína HMGCR de longitud completa, marcada con 35S-metionina, un fragmento N-terminal que incluye los dominios extracelulares y que abarcan a la membrana (aa 1-377) y un fragmento C-terminal que incluye la porción intracelular de la molécula (aa 340-888). El suero de pacientes anti-HMGCR-positivos inmunoprecipitó consistentemente HMGCR de longitud completa y el fragmento C-terminal, pero no el fragmento N-terminal (Figura 6). Cuando sueros anti-HMGCR-positivos se

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