JP5934183B2 - ミオパチーを特性化するための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本願は、以下の米国仮出願第61/324,857号(2010年4月16日出願)及び同第61/371,798号(2010年8月9日出願)の優先権を主張し、このそれぞれの全てが参照により本明細書に取り込まれている。
本研究は国立衛生研究所(National Institutes of Health)からの以下の助成金によって支援された。助成金番号:AR44684、R37DE12354、K23−AR−053197、及びK08−AR−245783。政府は本発明においてある特定の権利を有している。
一実施態様では、筋肉痛を有すると確認されている対象に自己免疫抗体が存在しないことは、自己免疫抗体の進展について対象を定期的に観察しながら、スタチン治療を続けることができることを示唆している。
別の実施態様では、筋肉痛及び筋力低下を有する対象における自己抗体の確認は、スタチン治療を中止して免疫抑制療法を開始すべきであることを示唆している。
一実施態様では、定期的試験をスタチン治療開始の3、6、9、12、24及び/又は36ヶ月後に行う。
別の実施態様では、方法は更に、スタチン治療に続いて筋肉痛又は筋力低下があるかについて対象を識別することを含んでいる。
一実施態様では、方法は更に、対象が筋肉痛又は筋力低下を有しているかを確認することを含んでいる。
別の実施態様では、生体試料が液体の生体試料又は組織試料である。
別の実施態様では、液体の生体試料が血液、血清、又は血漿である。
別の実施態様では、自己抗体を免疫測定法(例えば、ELISA、免疫沈降、蛍光免疫吸着測定、化学結合免疫吸着測定、放射免疫測定、免疫ブロット法、免疫測定法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、又は免疫組織化学)で検出する。
一実施態様では、HMGCRタンパク質又はその断片が基質に固定化されている。
別の実施態様では、基質が膜、ビーズ、又はマイクロチップである。
別の実施態様では、比色分析又は放射分析を用いて結合を検出する。
一実施態様では、キットは更に前期の何れかの態様の方法でキットを用いるための使用説明書を含有している。
一実施態様では、基質が膜、ビーズ、又はマイクロチップである。
別の実施態様では、比色分析を用いて結合を検出する。
別の実施態様では、HMGCR断片がaa340〜888を含むC−末端断片を含んでいる。
上記態様のある特定の実施態様では、タンパク質を免疫沈降法で検出する。
上記態様の別の実施態様では、100kD及び/又は200kDタンパク質に結合しているHMGCR抗体を比色分析又は放射分析で検出する。
更に別の実施態様では、ミオパチーはスタチン治療に関連している自己免疫介在性ミオパチー又は壊死性ミオパチーである。
更に別の実施態様では、方法は、近位筋力、両大腿部MRI上の筋浮腫、クレアチンキナーゼのレベル、及び/又は筋電図検査におけるミオパチー所見を特性化することを包含する。
更に別の実施態様では、方法は、抗シンセターゼ自己抗体、抗−シグナル認識粒子(SRP)自己抗体、上昇したクレアチンキナーゼ(CK)レベル、筋生検における炎症細胞の著しい浸潤、縁取りされている空胞、筋束周辺萎縮、クラスI MHC陽性、小筋周膜血管への細胞膜傷害複合体沈着、及び再生筋繊維の抗NCAM抗体染色よりなる群から選ばれるマーカーを検出することを包含する。
上記態様のある特定の実施態様では、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体レベルにおいて、基準レベルと比較して、標準偏差が約2〜5倍増大している検出は、スタチン関連自己免疫性ミオパチーを示す。
別の実施態様では、自己抗体のレベルにおいて、標準偏差が約3倍増大している検出は、スタチン関連自己免疫性ミオパチーを示す。
上記態様の更に別の実施態様では、方法は更に、患者が筋肉痛及び筋力低下を有していると確認することを含んでいる。
更に別の実施態様では、生体試料が液体の生体試料又は組織試料である。
別の実施態様では、液体の生体試料が血液、血清、又は血漿である。
別の実施態様では、自己抗体を免疫測定法(例えば、ELISA、免疫沈降、蛍光免疫吸着測定、化学結合免疫吸着測定、放射免疫測定、免疫ブロット法、免疫測定法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、又は免疫組織化学)で検出する。
上記態様のある特定の実施態様では、HMGCR断片はaa340〜888からなるC−末端断片を含有している。
「3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質」とは、HMGCR抗体結合活性を有しているNCBI Ref:NP_000850.1又はその断片と少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチド又はその断片を意味する。1つの好ましい断片は、分子(aa340〜888)の細胞内部分を含有しているC−末端断片であり、これは以下に太文字/下線内に示されている。
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MLSRLFRMHGLFVASHPWEVIVGTVTLTICMMSMNMFTGNNKICGWNYECPKFEEDVLSSDIIILTITRC
IAILYIYFQFQNLRQLGSKYILGIAGLFTIFSSFVFSTVVIHFLDKELTGLNEALPFFLLLIDLSRASTL
AKFALSSNSQDEVRENIARGMAILGPTFTLDALVECLVIGVGTMSGVRQLEIMCCFGCMSVLANYFVFMT
FFPACVSLVLELSRESREGRPIWQLSHFARVLEEEENKPNPVTQRVKMIMSLGLVLVHAHSRWIADPSPQ
NSTADTSKVSLGLDENVSKRIEPSVSLWQFYLSKMISMDIEQVITLSLALLLAVKYIFFEQTETESTLSL
KNPITSPVVTQKKVPDNCCRREPMLVRNNQKCDSVEEETGINRERKVEVIKPLVAETDTPNRATFVVGNS
SLLDTSSVLVTQEPEIELPREPRPNEECLQILGNAEKGAKFLSDAEIIQLVNAKHIPAYKLETLMETHER
GVSIRRQLLSKKLSEPSSLQYLPYRDYNYSLVMGACCENVIGYMPIPVGVAGPLCLDEKEFQVPMATTEG
CLVASTNRGCRAIGLGGGASSRVLADGMTRGPVVRLPRACDSAEVKAWLETSEGFAVIKEAFDSTSRFAR
LQKLHTSIAGRNLYIRFQSRSGDAMGMNMISKGTEKALSKLHEYFPEMQILAVSGNYCTDKKPAAINWIE
GRGKSVVCEAVIPAKVVREVLKTTTEAMIEVNINKNLVGSAMAGSIGGYNAHAANIVTAIYIACGQDAAQ
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IVCGTVMAGELSLMAALAAGHLVKSHMIHNRSKINLQDLQGACTKKTA
本発明は、対象におけるミオパチー(例えば、免疫介在性の壊死性ミオパチー)を治療する、診断する、観察する、及びその他に特性化するための組成物、方法、及びキットに有用である組成物及び方法を特徴としている。
このような壊死性ミオパチー患者を診断及び治療する方法を開発するために、ミオパチーを有する225人の患者由来の筋生検試料及び血清サンプルを分析した。35S−メチオニンで標識したヒーラ(HeLa)細胞溶解物から免疫沈降を行って抗体特異性を確認した。選択した生検試料を、細胞膜傷害複合体、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)、及び内皮細胞マーカーCD31で染色した。患者225人のうちの38人からの筋生検試料が主に筋線維壊死を示した。これらの患者のうち12人がそれらのミオパチー又はその他の病因に関連している公知の抗体を有していた。残りの26人のうちの16人の血清が200−kD及び100−kDタンパク質を免疫沈降した;この特異性は壊死性ミオパチーを有していない187人のうちたった1人で観察された。抗200/100−kD抗体(10,333IU/リットル)、及び筋電図検査で炎症性ミオパチーを有する患者(88%)。これらの患者の63%は衰弱の徴候前にスタチンに触れていた。全ての患者は免疫抑制療法に応答して、薬物治療を減らすと多くの患者が衰弱の再発を経験していた。
免疫組織化学的解析が、8人のうち6人の患者の小血管上にそして8人のうち4人の患者の非壊死性筋線維表面上に細胞膜傷害複合体を示した。8人のうち5人の患者が異常な毛細管形態を有し、8人のうち4人の患者が非壊死性筋線維表面上にクラスI MHCを発現した。これらのデータから、抗200/100−kD自己抗体特異性が、以前は自己抗体陰性であると考えられていた壊死性ミオパチーを有する患者のサブグループを特定することが明らかである。
壊死性ミオパチーを有する患者における新規な自己抗体の最初の発見に続いて、免疫介在性の壊死性ミオパチー(IMNM)の病気のメカニズムを解明してその診断を促進することを目指して、自己抗体が標的にする200−kD及び100−kD自己抗原を同定するために、以下に詳細に報告するように、更なる実験を実施した。
自己限定的ミオパチーを誘発することに加えて、スタチンの使用は、200−kD及び100−kD自己抗原を認識する自己抗体を有する、免疫介在性の壊死性ミオパチー(IMNM)に関係がある。これらの分子を同定するために、自己抗原発現に対するスタチン治療の効果を、患者由来血清を用いる免疫沈降法によって解明した。〜100−kD自己抗原の同定を、インビトロで転写/翻訳した(IVTT)3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCoA還元酵素又はHMGCR)タンパク質の免疫沈降によって確認した。筋肉におけるHMGCoA還元酵素の発現を免疫蛍光法で分析した。ミオパチー患者の群を抗HMGCoA還元酵素自己抗体に関して、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)及び自己限定スタチンミオパチーの予知因子である、rs419056C対立遺伝子に対する遺伝子型によってスクリーニングした。スタチン暴露は培養細胞中での〜200−kD/〜100−kD自己抗原の発現を誘発した。HMGCoA還元酵素を100−kD自己抗原として同定した。競合実験は〜200−kDタンパク質を認識する異なった自己抗体を明らかにしなかった。抗HMGCoA還元酵素自己抗体陽性の患者由来の筋生検組織において、HMGCoA還元酵素の発現が、筋肉再生のマーカーである、神経細胞接着分子(NCAM)を発現する細胞において上方調節された。抗HMGCoA還元酵素自己抗体が Johns Hopkins Myositis Center を受診している750人の患者のうち45人(6%)に見出された。年齢50歳以上の患者のうち、92.3%がスタチンを服用していた。rs419056C対立遺伝子の有病率は抗HMGCoA還元酵素自己抗体陽性患者において増大していなかった。スタチンは、スタチン関連IMNMにおいて自己抗体の主要な標的である、HMGCRの発現を上方調節した。再生筋細胞は、スタチン治療を中断した後でも免疫応答を持続できる、高レベルのHMGCRを発現する。これらの研究は持続した自己免疫の環境要因と進展の間の力学的な関連を明らかにしている。
スタチンは、コレステロール生合成経路における主要酵素である、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−コエンザイムA還元酵素(HMG CoA還元酵素、又はHMGCR)を特異的に阻害してコレステロールレベルを低下させる。これらの薬剤は心臓血管のエンドポイントを有意に低下させ、そして最も一般に処方される薬剤であり、2005年に米国でほぼ3000万人がスタチンを処方された(Stagnitti MN. Rockdale (MD): Agency for Healthcare Research and Quality; 2008 May. Statistical brief 205)。スタチンの例は、アトロバスタチン(Lipitor(登録商標)及び Torvast)、フルバスタチン(Lescol)、ロバスタチン(Mevacor(登録商標)、Altocor、Mevinolin、及び Altoprev(登録商標))、ピタバスタチン(Livalo(登録商標)、Pitava)、プラバスタチン(Pravachol、Selektine、及び Lipostat)、ロスバスタチン(Crestor(登録商標))及びシンバスタチン(Zocor(登録商標)及び Lipex(登録商標))を包含する。
本発明は、対象の生体サンプル中で3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体を検出する診断試験を特徴としている。一実施態様では、このような自己抗体のレベルを対象のサンプル中で測定して、そして自己免疫疾患、スタチン治療に関連している自己免疫応答に関係するミオパチー、及び壊死性ミオパチーを特性化するため、又はこのような疾患が進展する傾向を特性化するために用いられる。生体サンプル中の自己抗体のレベルを測定するために標準的な方法を用いることができる。生体サンプルは、組織サンプル(例えば、細胞サンプル、生検サンプル)並びに、これに限定されないが、血液、血清、及び血漿を包含する体液を包含する。ポリペプチドのレベルを測定する方法は、免疫測定法、ELISA、ウェスタンブロット及び放射免疫測定、或いは当該技術分野で公知のその他の方法を包含する。
単独又は1つ又はそれ以上の追加のマーカーと組合わせた自己抗体の上昇したレベルは、自己免疫疾患の陽性指標と考えられる。自己抗体の増大は、少なくとも約10%、25%、50%、75%又はそれ以上であってよい。
一実施態様では、本発明のマーカーの何れかの上昇は、自己免疫疾患、ミオパチー、又は壊死性ミオパチーを暗示している。
マーカー(例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド)の発現レベルは、PT−PCR、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、磁気及び/又は抗体コーティングビーズとの結合、in situ ハイブリダイゼーション、蛍光in situ ハイブリダイゼーション(FISH)、フローチャンバー接着アッセイ、ELISA、マイクロアレー分析、又は比色分析のような、当該技術分野で周知の方法によって比較する。方法は更に、エレクトロスプレイイオン化質量分析(ESI−MS)、ESI−MS/MS、ESI−MS/(MS)n、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI−TOF−MS)、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(SELDI−TOF−MS)、シリコン上のレーザー脱離イオン化(DIOS)、二次イオン質量分析法(SIMS)、四重極飛行時間型分析(Q−TOF)、大気圧化学イオン化質量分析(APCI−MS)、APCI−MS/MS、APCI(MS)n、大気圧光イオン化質量分析(APPI−MS)、APPI−MS/MS、及びAPPI−(MS)n、四重極質量分析、フーリエ変換型質量分析(FTMS)、並びにイオントラップ質量分析(ここで、nは0より大きい整数である)の1つ又はそれ以上を包含する。
一実施態様では、体液(例えば、血液、血清、血漿)の対象サンプルは、ミオパチーの発症前に、しかしスタチン治療の開始に続いて採取する。
ある実施態様では、その量を定量せずに、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体の存在のみを検出することが有用であって、ミオパチーの可能性の高い診断と相関付けることができる。自己抗体の測定は、マーカーの検出を自己免疫疾患、スタチン治療に関連する自己免疫応答に関連するミオパチー、及び壊死性ミオパチーの可能性の高い診断と相関付けるための自己抗体の定量も包含する。従って、検査している対象で検出されたマーカーの量がコントロールの量と比べて異なっている(すなわち、コントロールより高い)場合、検査対象は自己免疫疾患、スタチン治療に関連する自己免疫応答に関連するミオパチー、及び壊死性ミオパチーを有する高い可能性がある。
本発明は、自己免疫疾患、スタチン治療に関連する自己免疫応答に関連するミオパチー、及び壊死性ミオパチー、又はこのような疾患を発症する傾向を同定又は特性化するのに有用な多数の診断アッセイを提供する。一実施態様では、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体単独の、又はこれとミオパチーを特性化するために用いられる1つ又はそれ以上の他のマーカー(抗シンセターゼ自己抗体、抗シグナル認識粒子(SRP)自己抗体、上昇したクレアチンキナーゼ(CK)レベル、筋生検における顕著な炎症性細胞浸潤、筋束周辺萎縮、クラスIMHC陽性、微小筋周膜血管への細胞膜傷害複合体の沈着、及び再生筋繊維の抗−NCAM抗体染色)との組み合わせの存在を検出することによってミオパチーを特性化する。これらのマーカーのレベルを検出する具体的な方法を記載して実施例を以下に提供したが、当業者は、本発明がこのような方法に限定されないことを認識できる。自己抗体レベルは、標準的な方法の何れかによって定量することができ、そのような方法は、これに限定されないが、抗体結合を検出する免疫測定(例えば、ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降法、免疫蛍光法)のような方法を含む。このようなアッセイは膜、試験紙、バイオチップ、又は当該技術分野で公知のその他の何れかの基盤上で実施できる。
本発明は、自己免疫疾患、スタチン治療に関連する自己免疫応答に関連するミオパチー、及び壊死性ミオパチーを診断又は観察するための、或いはこれらの疾患又は3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体の存在と関連するその他の疾患に対する治療を選択するためのキットを提供する。一実施態様では、キットは、対象がスタチン治療を続けるべきか否かを確認するために用いられる。この確認に至る際に、医師は対象が3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体を有しているか否かを考慮することができる。このような抗体はスタチン治療開始の数週、数ヶ月或いは数年後にでさえ発生しうる。所望により、スタチン治療中の対象を、ミオパチーの症状を示しているかいないかに関わらずこのような自己抗体について検査する。
3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体のレベルを異なった種類の生体サンプル中で測定する。一実施態様では、1つの自己抗体のレベルを異なった種類の生体サンプル中で測定する。別の実施態様では、自己抗体のレベルを異なった種類の生体サンプル中で測定する。一実施態様では、生体サンプルは筋細胞を包含している組織サンプル(例えば、筋生検で得た筋細胞)である。別の実施態様では、生体サンプルは生体液サンプルである。生体液サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、又は本発明の方法で有用なその他の生体液を包含する。
対象が自己免疫疾患、スタチン治療に関連する自己免疫応答に関連するミオパチー、及び壊死性ミオパチーを発症していることが確認された後、治療方法を選択する。多くの標準的な治療計画を利用できる。3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体のレベル又は存在は、治療方法の選択に用いられる1つのファクターである。一実施態様では、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体の存在は、免疫抑制療法が適切であることを示唆している。このような自己抗体の存在と併用できるその他の関連するファクターは、ミオパチーの特定に有用なその他のマーカー及び臨床指標(例えば、抗シンセターゼ自己抗体、抗シグナル認識粒子(SRP)自己抗体、上昇したクレアチンキナーゼ(CK)レベル、筋生検における顕著な炎症性細胞浸潤、縁取りされている空胞、筋束周辺萎縮、クラスIMHC陽性、微小筋周膜血管への細胞膜傷害複合体の沈着、及び再生筋繊維の抗−NCAM抗体染色)である。
本発明は、自己免疫疾患、スタチン治療に関連する自己免疫応答に関連するミオパチー、及び壊死性ミオパチー、特に3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質を認識する自己抗体の存在に関連している自己免疫応答の診断用キットをを提供する。一実施態様では、キットは、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質に特異的に結合する自己抗体に結合する物質を包含している。一実施態様では、この物質が基質に固定されている。
近位筋力低下、上昇したクレアチンキナーゼ(CK)レベル、筋電図検査(EMG)におけるミオパチーの徴候、及び/又は筋疾患のその他の徴候を有する患者225人から得た筋生検試料を、優位に壊死性のミオパチーを有するものを同定するために精査した。顕著な炎症性細胞の浸潤、縁取りされている空胞(封入体筋炎の特性)、筋束周辺萎縮(皮膚筋炎(DM)に特徴的)、又は特異診断を特徴付けるその他の特性が注目される生検結果を有する患者は、優位な壊死性のミオパチーを発症していると考えなかった。
16人の壊死性ミオパチーを有する抗−200/100−kD自己抗体陽性患者の人口統計学的情報、検査所見、低下のパターン、大腿部核磁気共鳴画像(MRI)及びその他の臨床的特性を解析した(表1)。抗−200/100−kD自己抗体特異性、優位な壊死性のミオパチーを単独で有する患者をこの解析から除外した(表1)。
投薬計画及び治療応答(筋力の他覚的改善に基づく)は変動する。抗−200/100自己抗体陽性患者16人の臨床所見を入手できた。長期に渡って追跡した14人の患者のうち、9人(64%)は完全に或いはほぼ完全に免疫抑制に応答して、5人(36%)は免疫抑制に部分的に応答した。これら5人の患者は、筋力低下の進展が安定化した1人の患者を含んでいたが、免疫抑制では改善されなかった。14人の患者のうち6人(43%)は免疫抑制剤を徐々に減らすか断つと再発した。14人の患者のうち7人(60%)は現在免疫抑制剤を徐々に減らしているが今日まで再発が起きていない。1人の患者だけが筋力低下の再発なしで免疫抑制剤を完全に減らしていた。
抗−200/100自己抗体を有する患者17人のうち16人(94%)が、優位な筋繊維壊死を示す筋生検試料を有していて:残りの患者の生検試料は広範な炎症性浸潤が優位であったので、その後の分析にはこの生検の結果を含めなかった。精密な検査により筋生検試料16のうち5つ(31%)で炎症性細胞の筋内膜及び/又は血管周囲堆積が明らかにされたが、炎症の程度は、PM又はDM患者から得た典型的な筋生検試料に見られるものと比べて軽度であった。抗−200/100自己抗体陽性を有する患者から得た生体試料はどれも軽度を超える脱神経の兆候を明らかにせず、どの生体試料も異常なグリコーゲン蓄積又はアミロイド沈着に陽性ではなかった。
上で報告したように、IMNMを有する患者群から得た血清は、放射標識化ヒーラ抽出物から、−200−kD及び−100kDタンパク質を免疫沈降した。
HMG−CoA還元酵素は1つの小さい細胞外ドメイン、7つの膜貫通ドメイン、及び1つの細胞内触媒ドメインを有する膜タンパク質である。抗−HMGCR抗体を有する患者から得た血清が認識するタンパク質の領域を特定するために、35S−メチオニンで標識化した全長のHMGCRタンパク質、細胞外及び膜貫通ドメインを包含するN−末端断片(aa1〜377)、及び分子の細胞内部分を包含するC−末端断片(aa340〜888)を合成した。抗−HMGCR陽性患者から得た血清は全長のHMGCR及びC−末端断片を一貫して免疫沈降したが、N−末端断片を免疫沈降しなかった(図6)。35S−メチオニンで標識化した全長のHMGCRタンパク質の免疫沈降前に、抗−HMGCR陽性血清を非標識化C−末端HMGCRの濃度を増大させながら前培養すると、免疫沈降しなくなった(図7A)。総合すると、これらの知見は、抗−HMGCR自己抗体がこの酵素の細胞内C−末端部分を認識したことを明らかにしている。
抗HMGCR陽性患者から得た血清が200−kDタンパク質を認識する独特な自己抗体を含んでいるか否かを確認するために、35S−メチオニンで標識化し、メビノリン処理したヒーラ細胞抽出物から、再びこれを精製したC−末端HMGCRタンパク質と前培養して、免疫沈降を実施した(図7B)。この手法はHMGCR及び−200−kDタンパク質の両方の免疫沈降を阻害して、−200−kDタンパク質はHMGCRと共免疫沈降するか又はHMGCR二量体であるかの何れかであることを示唆している。
抗−HMGCR自己抗体について患者を迅速にスクリーニングするために、ELISAを開発した。相対吸光度値が3標準偏差であるか又はスタチンを服用したことのないコントロールの健常対象20人の平均値より高い場合は血清サンプルが抗−HMGCRに陽性であると特定した。この方法を用いて、先にヒーラ細胞抽出物から免疫沈降によって確認されている抗−200/100−kD陽性血清16の全てが抗−HMGCR陽性であることを見出した。これに対して、DM患者33人(以前にスタチンを服用していた5人を含む)及びIBM患者31人(以前にスタチンを服用していた11人を含む)は誰も抗−HMGCR陽性ではなかった。
HMG−CoA還元酵素(HMGCR)抗体 についての酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)における陽性結果のカットオフ値は0.215吸光度単位であり;この値はスタチンを投与されたことのない健常対象20人の平均より大きい3標準偏差に等しかった。
スタチンの使用は血清検査前の期間を示している。
クレアチンキナーゼ(CK)値はIU/リットルで表されている。
筋電図(EMG)所見は、正常、炎症性ミオパチー(IM)、又は非炎症性ミオパチー(NIM)として分類した。
筋生検所見は、壊死+炎症(N+I)、壊死性ミオパチー(NM)、又は壊死+縁取りされている空胞(N+RV)として分類した。
rs4149046に対する遺伝子型決定はDNAサンプルが入手可能な抗−HMG−CoA還元酵素抗体陽性患者17人について実施した。
n/a= 適用せず。
W=白人、B=黒人、A=アジア人
抗−HMGCR陽性患者45人のうち、30人(66.7%)が以前にスタチンを服用していた(表1)。50歳又はそれ以上で我々のクリニックを訪れた患者26人のうち、24人がスタチンを服用していた(92.3%)。従って、抗−HMGCR自己抗体を有する患者におけるスタチン使用の比率は、我々及び他の者が以前に報告している、DM(25%)、PM(36.8%)、及びIBM(33.3%)を含む、他のミオパチーを有する患者(年齢〜50歳)について年齢を対応させたものより有意に高い(Grable-Esposito et al., 2010 and Christopher-Stine et al.,2010)。
Study of the Effectiveness of Additional Reductions in Cholesterol and Homocysteine (SEARCH) Collective (N Engl J Med 2008;359: 789-99) で公表された最近の研究は、SLCO1B1遺伝子(すなわち、rs4149056C対立遺伝子)における特定多型の存在がスタチンミオパチーの発症と強い関連性があることを明らかにした。この遺伝子は、スタチンの肝摂取を調節する、有機アニオントランスポーターポリペプチドOATP−1B1をコードする。〜12,000人の参加者(殆どがヨーロッパ系)の集団におけるC対立遺伝子の保有率は0.15であったのに対して、シンバスタチンを80mg/日の用量で開始して1年以内にスタチンミオパチーを発症した人における保有率は0.54であった。
インビボにおけるHMG−CoA還元酵素発現を直接試験するために、筋生検切片を市販のポリクローナル抗−HMG−CoA還元酵素抗体(Millipore, Billerica, MA)で染色した。筋炎関連自己抗原は再生の特性を示して筋細胞において高レベルで発現されるので(Casciola-Rosen et al., J Exp Med 2005;201:591-601 及び Mammen et al, Arthritis Rheum 2009;60: 3784-93)、筋生検切片を抗−NCAM抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で共染色した。NCAM(神経細胞接着分子)は筋再生について確立されたマーカーである。正常な特性を示している筋生検切片において、HMGCR(図8E)及びNCAM(図8D)が比較的低いレベルで発現された(図8Fも参照されたい)。一方、抗−HMGCR−CoA還元酵素自己抗体陽性患者(数ヶ月〜数年スタチンを服用していなかった)から得た筋生検サンプル中で、NCAM陽性線維は優位だった(図8A)。興味深いことに、これらNCAM陽性線維の殆どが高レベルのHMGCR−CoA還元酵素も発現した(図8B〜C)。これらの知見は、抗−HMGCR−CoA還元酵素自己抗体陽性患者から得た再生筋線維が高レベルのHMGCRを発現することのインビボでの確認を提供する。
保存血清、評価のために入手可能な筋生検試料、並びに近位筋力低下、上昇したクレアチンキナーゼ(CK)レベル、ミオパチーの筋電図検査(EMG)所見、磁気共鳴画像上での筋浮腫、及び/又は筋生検上のミオパチーの特徴によって特定されたミオパチーを有する225人の患者をJohns Hopkins Institutional Review Boardで承認された、2007年3月から2008年12月までの、長期に渡る研究に登録した。病歴を提供すること及びJohns Hopkins Myositis Center で健康診断を受けることに加えて、これらの患者は以下の幾つか又は全てを含む総合評価を受けた:(1)筋電図検査及び神経伝導検査、(2)非対称両大腿部MRI、(3)肺機能検査、(4)胸部、腹部、及び骨盤のコンピュータ断層撮影を含む悪性腫瘍のスクリーニング、(5)CKレベル、抗核抗体(ANA)スクリーニング、赤血球沈降速度(ESR)、C−反応タンパク質(CRP)レベル、抗Ro/Laスクリーニング、及び筋炎特異的自己抗体(MSA)スクリーニングを含む、異なる民間試験所数ヶ所で実施される標準的な実験室評価、及び(6)臨床又は生検特徴によって疑わしいときは、肢帯筋ジストロフィー(肢帯筋ジストロフィー評価パネル(Athena Diagnostics, Worcester, MA)による)、酸性マルターゼ欠損症(グリコーゲン貯蔵ミオパチー「A」プロフィル(Athena Diagnostics)及び/又はαグルコシダーゼ活性についての乾燥血斑試験(Genzyme, Cambridge, MA)による)、及び/又は顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー(FSHD)DNA試験(Athena Diagnostics)による)を含む遺伝性筋疾患の検査。
筋生検試料を三角筋、二頭筋、又は大腿四頭筋群から得た。それぞれのケースにおいて、選択した筋肉が弱いことを試験医師が確認した。筋生検試料から得たスライドをJohns Hopkins Neuromuscular Pathology Laboratory で評価した。これらの検討はヘマトキシリン及びエオシン染色した組織、更に下記の染色剤の幾つか又は全てを包含した:改変ゴモリ・トリクローム、pH4.3、pH4.6、及びpH9.4におけるアデノシントリホスファターゼ、NADテトラゾリウム還元酵素、酸性ホスファターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、チトクロームオキシダーゼ、エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、過ヨウ素酸−シッフ(PAS)、PAS−ジアスターゼコントロール、及びコンゴレッド。凍結及びパラフィン包埋試料を、変性、再生、及び/又は壊死繊維、初期筋内膜炎症、血管周囲炎症、縁取りされている空胞、筋束周辺萎縮、及び線維症の存在について規定通りにスクリーニングした。優位に異常な組織学的特徴としての壊死性筋線維の存在に基づき;筋貪食を受けている壊死性筋線維を除外して、「壊死性ミオパチー」生検試料を同定した。炎症性細胞はあっても、少なかった。抗−200/100−kD自己抗体特異性を有する患者から得た筋生検試料を、CD31(内皮細胞マーカー)、C5b−9(すなわち、細胞膜傷害複合体)、及びクラスI主要組織適合複合体(MHC)を認識する抗体で染色した。
それぞれの患者から採取した血清サンプルを−80℃で保存した。標準的な手法を用いて培養したヒーラ細胞を100μCi/mlの35S−メチオニン及びシステイン(MP Biomedicals, Solon, OH)で、メチオニンを含まず、及びシステインを含まない培地中で、2時間放射標識した。細胞をその後、緩衝液A(50mMのトリスpH7.4、150mMのNaCl、5mMのEDTA、0.5%のノニデット(Nonidet)P40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及びプロテアーゼ阻害カクテル)中で溶解した。それぞれを10cmのシャーレで緩衝液A1mLに溶解して10の免疫沈降に用いた。1μlの患者血清を100μlの放射標識化溶解物に加えて、緩衝液B(1%のノニデットP40、20mMのトリス、pH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、及びプロテアーゼ阻害カクテル)で容量を1mlにし、そして混合物を4℃で1時間回転して免疫沈降を実施した。プロテインAアガロースビーズ(Pierce, Rockford, IL)を抗体−抗原複合体を沈殿させるために用い、次いで10%のSDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した
放射標識化免疫沈降物をX線蛍光撮影で可視化した。
2002年5月と2010年4月の間に、近位筋力低下、上昇したクレアチンキナーゼ(CK)レベル、筋電図(EMG)上でのミオパチー所見、核磁気共鳴画像(MRI)上での筋浮腫、及び/又は筋生検でのミオパチー特性によって定義して、ミオパチーが疑われる患者750人を長期に渡る研究に登録した。患者がBohanとPeterの基準(Bohan and Peter, N Engl J Med 1975;292:344-7 and 403-7)に従う推定又は確定疾患を有している場合に、患者を多発性筋炎(PM)又は皮膚筋炎(DM)を有していると定義し、彼らがGriggs et al.の基準(Griggs et al., Ann Neurol 1995;38:705-13)に見合っていたら、封入体筋炎(IBM)を有していると定義した。各対象から血清が入手でき、そして対象260人からDNAサンプルが入手できた。以前にスタチンに暴露していない健常なコントロール対象25人からも血清サンプルを得た。対象全てを、Johns Hopkins Institutional Review Board によって承認されたプロトコールに登録した。DNAサンプルが入手できた抗HMG−CoA還元酵素陽性患者17人全てに対して、適切に検証されたTaqMan(登録商標) Drug Metabolism Genotyping Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) を用いて、rs4159056C対立遺伝子の遺伝子型判定を実施した(詳細な臨床情報についての表4を参照されたい)。
ヒーラ細胞を10μMメビノリン(Sigma, St. Louis, MO)の存在下又は非存在下で22時間培養し、次いで100μCi/mlの35S−メチオニン/システイン(MP Biomedicals, Solon, OH)で放射標識化し、溶解して、患者血清で免疫沈降した(上記実施例1〜4を参照されたい)。免疫沈降物を還元し、煮沸し、電気泳動(10%ドデシル硫酸ントリウム−ポリアクリルアミドゲル)に付して、X線蛍光撮影で可視化した。
全長ヒトHMG−CoA還元酵素をコードするDNAをInvitrogen (Carlsbad, CA)から購入した。N−末端断片(アミノ酸(aa)1〜377)をコードするDNAをR377からストップコドンまで突然変異させて作成した。HMG−CoA還元酵素のC−末端(aa340〜888)をコードするDNAを、全長DNAを鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で作成した。構築物を配列決定し、検証して、IVTT反応(Promega, Madison, WI)で用い、35S−メチオニン標識化タンパク質を作成した。これらの産物を用いて免疫沈降を実施して、上記のように免疫沈降物を検出した。
それぞれの患者血清1マイクロリットルを、グルタチオンS−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現されたヒトHMG−CoA還元酵素の触媒ドメイン(aa426〜888)(以下「C−末端HMG−CoA還元酵素」と呼ぶ;Sigma)と共に前培養した(30分、4℃、50μl中)。続いて、前培養した抗体を、全長IVTT HMG−CoA還元酵素又はメビノリン処理したヒーラ細胞から作られた放射標識化溶解物との免疫沈降に用いた。
ELISAプレート(96ウェル)をリン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈した100ngのC−末端HMG−CoA還元酵素(Sigma)で1晩4℃でコーティングした。複製ウェルをPBSのみで培養した。プレートを洗浄した後、PBSに1:400で希釈したヒト血清サンプルを0.05%のTween20と共にウェルに37℃で1時間加えた。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒト抗体(1:10,000;Pierce, Rockford, IL)を、37℃で30分間各ウェルに加えた。SureBlue(登録商標)ペルオキシダーゼ試薬(KPL, Gaithersburg, MD)を用いて発色を行って、450nmの吸光度を確認した。各サンプルについて、PBSでコーティングしたウェルのバックグランド吸光度を対応するC−末端HMG−CoA還元酵素でコーティングしたウェルのそれから差し引いた。試験サンプルの吸光度をそれぞれのELISAに含まれている参照血清である、任意の陽性コントロールサンプル(サンプル9176)における吸光度との比で表した。
ヒト生検試料の採取及び使用はJohns Hopkins Institutional Review Boardで承認された。抗HMGCR抗体を有する患者6人及び正常コントロール対象3人から得た筋生検試料を検討した。全ての生体試料は3ヶ月以上にわたってスタチンを投薬されていなかった患者から得た。パラフィン切片の染色を先に記載(9)したように実施した。抗体培養は、ウサギ抗−HMGCR(Millipore)とマウス抗−神経細胞接着分子(抗−NCAM;Santa Cruz Biotechnology)一次抗体との混合物、続いてロバ抗−ウサギIgG Alexa Fluor594(HMGCRを検出するために)及びロバ抗−マウスIgG Alexa Fluor488(NCAMを検出するため)二次抗体(Invitrogen)との混合物を含んでいた。
前述の説明から、本明細書に記載されている本発明を、様々な使用及び条件に適用するために、改変及び修正できることは明らかであろう。このような実施態様もまた以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (19)
- 方法が、
a)対象から生体サンプルを得ること、
b)対象の生体サンプル中の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質又は自己抗体との結合活性を有するその断片を認識する自己抗体を検出することによって免疫測定を行うこと、及び
c)生体サンプル中のHMGCRタンパク質又はその断片に結合する自己抗体の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含んでなり、
自己抗体の存在が、対象が自己免疫疾患を有することを示す、
対象における自己免疫疾患を診断するために、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質又はその断片を認識する自己抗体を検出する方法。 - 自己免疫疾患が、免疫介在性ミオパチーである、請求項1に記載の方法。
- ミオパチーがスタチン治療に関連した自己免疫介在性ミオパチー又は壊死性ミオパチーである、請求項2に記載の方法。
- 検出が、対象サンプル中の自己抗体のレベルを参照レベルと比較することを含んでなる、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 自己抗体レベルの3標準偏差増大した検出が、スタチン関連自己免疫性ミオパチーを示す、請求項2〜4の何れか一項に記載の方法。
- 生体サンプルが液体生体サンプル又は組織サンプルである、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- 液体生体サンプルが、血液、血清、又は血漿である、請求項6に記載の方法。
- 免疫測定が、ELISA、免疫沈降、蛍光免疫吸着測定、化学結合免疫吸着測定、放射免疫測定、免疫ブロット法、免疫測定法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、及び免疫組織化学からなる群より選ばれる、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- HMGCRタンパク質又はその断片を基質に固定化する、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- 基質が膜、ビーズ、又はマイクロチップである、請求項9に記載の方法。
- 比色分析又は放射分析を用いて結合を検出する、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
- 自己抗体が、化学発光を含む光学的方法で検出される、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。
- HMGCR断片が、aa340〜888を含むC−末端断片を含んでなる、請求項1〜12の何れか一項に記載の方法。
- キットが、基質に固定化された3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質又は自己抗体との結合活性を有するその断片を含んでなり、HMGCR又はその断片への対象の自己抗体の特異的な結合を検出し、それによって対象のミオパチーを特性化する、対象のミオパチーを特性化するためのキット。
- 基質が膜、ビーズ、又はマイクロチップである、請求項14に記載のキット。
- 比色分析を用いて結合を検出する、請求項14に記載のキット。
- HMGCRの断片がaa340〜888を含むC−末端断片を含んでなる、請求項14に記載のキット。
- HMGCRタンパク質又はその断片を基質に固定化する、請求項14〜17の何れか一項に記載のキット。
- 免疫介在性の壊死性ミオパチーに関連し、200kD及び100kDタンパク質を認識する、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルコエンザイムA還元酵素(HMGCR)タンパク質に対する新規な自己抗体。
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