ES2898371T3 - Método para diagnosticar accidentes cerebrovasculares usando una combinación de biomarcadores - Google Patents

Abstract

Un método para ayudar en el diagnóstico de accidente cerebrovascular en un paciente que se sospecha que ha sufrido o sufre actualmente un accidente cerebrovascular, en donde dicho método comprende; i) Determinar la concentración de la proteína de la enfermedad de Parkinson 7 (PARK7) y Dímero D en una muestra ex vivo de sangre, suero o plasma obtenida del paciente; ii) Establecer la significación estadística de la concentración de los biomarcadores por comparación con un valor control, en donde cada uno de los valores de concentración de los biomarcadores se introduce en uno o más algoritmos estadísticos para producir un valor resultante que se correlaciona con el diagnóstico de accidente cerebrovascular.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para diagnosticar accidentes cerebrovasculares usando una combinación de biomarcadores

Antecedentes de la invención

El accidente cerebrovascular es la tercera causa principal de muerte en todo el mundo y se puede definir como la pérdida de una o más funciones cerebrales que se desarrolla rápidamente debido a la interrupción en el suministro de sangre al cerebro. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, 15 millones de personas por año sufren de accidentes cerebrovasculares en todo el mundo, en donde 5 millones mueren y otros 5 millones quedan permanentemente incapacitados. Se estima que la hipertensión arterial es un factor contribuyente en 12,7 millones de estos 15 millones de casos de accidente cerebrovascular. En el Reino Unido, aproximadamente 150.000 personas experimentan un accidente cerebrovascular cada año, y el accidente cerebrovascular es responsable de aproximadamente 53.000 muertes por año. Los accidentes cerebrovasculares le cuestan a la economía aproximadamente £8.000 millones por año en Inglaterra, y los pacientes con accidentes cerebrovasculares ocupan aproximadamente el 20% de todas las camas agudas de hospitales y el 25% de las camas a largo plazo.

El accidente cerebrovascular se puede clasificar en tres subtipos:

i) El accidente isquémico (IS) ocurre cuando el suministro de sangre al cerebro disminuye, provocando daño cerebral. Un accidente isquémico ocurre cuando un vaso sanguíneo se bloquea, usualmente mediante un coágulo de sangre. Este coágulo puede formar localmente una placa aterosclerótica (accidente trombótico) o alternativamente puede ocurre debido al desplazamiento de un partícula o desecho que se ha originado en otra parte en el torrente circulatorio (accidente embólico);

ii) El accidente isquémico transitorio (TIA) es un 'mini accidente cerebrovascular' que ocurre cuando el suministro de sangre al cerebro disminuye temporalmente. Se diagnostica un TIA si los síntomas se resuelven rápidamente (dentro de 24 horas y el individuo recupera su salud normal); y

iii) El accidente hemorrágico (HS) ocurre cuando se acumula sangre dentro de la bóveda craneal, usualmente cuando se rompe un vaso sanguíneo debilitado. El accidente hemorrágico se puede clasificar en dos subtipos principales, a saber intracerebral (dentro del tejido cerebral) y subaracnoideo (alrededor de la superficie del cerebro y debajo de su capa protectora).

IS y TIA representan aproximadamente el 85% de todos los casos de accidente cerebrovascular, y HS representa el 15%. Con el fin de minimizar el daño neurológico que sigue a un accidente cerebrovascular es crucial que los pacientes con accidentes cerebrovasculares sean diagnosticados rápidamente y en forma precisa para poder recibir tratamiento adecuado. Por ejemplo, para disolver coágulos, se puede administrar una terapia trombolítica tal como el activador tisular del plasminógeno (TPA). No obstante, dicha terapia está solamente garantizada en IS y es perjudicial en HS. La naturaleza del TIA no requiere dicha terapia y en dichos casos se recetan anticoagulantes tales como warfarina y aspirina.

En la actualidad, si se sospecha un accidente cerebrovascular, se evalúan los síntomas físicos y por lo general se realiza una tomografía computada (TC). La TC tiene buena sensibilidad para identificar a pacientes con HS (aproximadamente 90% de sensibilidad) pero poca sensibilidad para identificar a pacientes con IS y TIA (aproximadamente 20% de sensibilidad). En la práctica, ocurre poco o ningún daño al tejido en TIA debido a su naturaleza transitoria, por lo tanto la TC es ineficaz como técnica diagnóstica. La resonancia magnética nuclear (RMN) ha mejorado la sensibilidad para el diagnóstico de IS (hasta aproximadamente 80%) pero los requisitos de mayor tiempo, accesibilidad del equipo y altos costes han limitado su uso para el diagnóstico de accidentes cerebrovasculares. La poca sensibilidad de la TC para la detección de IS y TIA indica que las pruebas con biomarcadores diagnósticos basados en fluidos biológicos para detectar IS y TIA serían una herramienta indispensable para ayudar a los profesionales en el diagnóstico de los subtipos de accidente cerebrovascular. Los biomarcadores basados en fluidos biológicos tienen el potencial de acelerar y aumentar la precisión del diagnóstico de accidente cerebrovascular. Se han propuesto varios biomarcadores candidatos para el diagnóstico de accidente cerebrovascular y la delimitación de los subtipos de accidente cerebrovascular, y existen varias descripciones de discriminación de IS/TIA frente a HS en la técnica anterior, por ejemplo, los documentos EP1238284, WO2010/086697, WO 2010/012834 y WO 2002/012892. EP1419388 describen datos que distinguen IS de HS, y todos los tipos de accidentes cerebrovasculares de controles sin accidentes cerebrovasculares. El documento US2015126385 describe información para ayudar en el diagnóstico del accidente cerebrovascular, que se basa en determinar la concentración de la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1) y uno o más biomarcadores adicionales seleccionados entre proteína de unión a ácido graso de tipo cardíaco (h-FABP), interleucina 6 (IL-6) y proteína C reactiva (CRP). Sin embargo, ninguno ha encontrado hasta el momento utilidad en la práctica clínica, y existe una necesidad clínica real de biomarcadores de los tres subtipos de accidentes cerebrovasculares que tengan gran sensibilidad y especificidad para permitir un diagnóstico exacto. El diagnóstico diferencial entre los tres subtipos distintos de accidentes cerebrovasculares que emplea un análisis de sangre facilitaría una decisión clínica más informada, tornaría potencialmente innecesarios los costosos y menos expeditivos diagnósticos por neuroimágenes, y podría mejorar el desenlace clínico del paciente.

Compendio de la invención

1. Un método para ayudar a diagnosticar un accidente cerebrovascular en un paciente que se sospecha que ha sufrido o sufre actualmente un accidente cerebrovascular, en donde dicho método comprende;

i) Determinar la concentración de la proteína de la enfermedad de Parkinson 7 (PARK7) y el dímero D en una muestra ex vivo de sangre, suero o plasma obtenida del paciente;

ii) Establecer la significación estadística de la concentración de los biomarcadores por comparación con un valor control, en donde cada uno de los valores de concentración de biomarcadores se introduce en uno o más algoritmos estadísticos para producir un valor resultante que se correlacione con el diagnóstico de accidente cerebrovascular.

2. El método según la reivindicación 1, en donde también se determina la concentración de uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de la lista que consiste en proteína de unión a ácido graso 3 (FABP3), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), glutatión S-transferasa P (GSTP), interleucina 6 (IL-6), nucleósido difosfato cinasa A (NDKA) y receptor del factor de necrosis tumoral soluble 1 (sTNFr1).

3. El método según la reivindicación 2, en donde se determina cualquiera de las siguientes concentraciones i) PARK7, dímero D y FABP3

ii) PARK7, dímero D e IL-6

iii) PARK7, dímero D y sTNFr1

iv) PARK7, dímero D y GFAP

v) PARK7, dímero D, FABP3 y sTNFr1

vi) PARK7, dímero D, FABP3 e IL-6

vii) PARK7, dímero D, FABP3, sTNFr1 e IL-6

viii) Dímero D, FABP3, GFAP y PARK7

ix) Dímero D, FABP3, GFAP, IL-6, PARK7 y sTNFr1

4. El método según las reivindicaciones 1-3 para el diagnóstico de accidente cerebrovascular isquémico.

Descripción detallada

A menos que se indique algo distinto, los términos técnicos establecidos se usan de conformidad con el uso convencional conocido por los expertos en la técnica.

La presente invención se refiere a métodos y biochips basados en biomarcadores que se pueden utilizar para ayudar en el diagnóstico de accidentes cerebrovasculares y en la discriminación entre accidente cerebrovascular hemorrágico (HS), accidente cerebrovascular isquémico (IS), accidente isquémico transitorio (TIA) y análogos a accidentes cerebrovasculares.

A menos que se indique algo distinto, todas las referencias en este documento a la expresión 'accidente cerebrovascular' abarcan las tres formas de accidente cerebrovascular; accidente hemorrágico (HS), accidente isquémico (IS) y accidente isquémico transitorio (TIA). Tal como se emplea en este documento, la expresión 'accidente isquémico (IS)' se refiere al tipo de accidente cerebrovascular que ocurre cuando el suministro de sangre al cerebro disminuye, provocando daño cerebral. Un accidente isquémico ocurre cuando un vaso sanguíneo experimenta un bloqueo, usualmente mediante un coágulo de sangre. Este coágulo puede formar localmente una placa aterosclerótica (accidente cerebrovascular trombótico) o alternativamente puede ocurrir debido al desplazamiento de una partícula o desecho que se originó en otra parte del torrente circulatorio (accidente cerebrovascular embólico). La expresión 'accidente isquémico transitorio (TIA)' se refiere a un 'mini accidente cerebrovascular' que ocurre cuando el suministro de sangre al cerebro disminuye temporalmente. Se diagnostica un TIA si los síntomas se resuelven rápidamente (dentro de las 24 horas en las que el individuo recupera la salud normal). Un 'accidente hemorrágico (HS)' ocurre cuando se acumula sangre dentro de la bóveda craneal, por lo general cuando se rompe un vaso sanguíneo debilitado. El accidente hemorrágico se puede clasificar en dos subtipos principales: intracerebral (dentro del tejido cerebral); y subaracnoideo (alrededor de la superficie del cerebro y debajo de su capa protectora). La expresión 'análogos a accidentes cerebrovasculares', tal como se emplea en este documento, se refiere a cualquier enfermedad no vascular que se presente con síntomas de tipo accidente cerebrovascular, incluidos, aunque sin limitarse a ello, hipoglucemia, hiperglucemia, epilepsia, esclerosis múltiple, migraña hemipléjica y tumores o infecciones intracraneales, como meningitis, encefalitis y abscesos.

La presente invención da a conocer un método para ayudar a diagnosticar un accidente cerebrovascular en un paciente que se sospecha que ha sufrido o sufre un accidente cerebrovascular, que comprende: Determinar la concentración de PARK7 y dímero D en una muestra ex vivo obtenida del paciente; y establecer la significación de la concentración de los biomarcadores. En otra realización, también se determina la concentración de uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de la lista que consiste en FABP3, GFAP, GSTP, IL-6, NDKA y sTNFr1. Las combinaciones preferidas de marcadores para el diagnóstico de accidentes cerebrovasculares incluyen PARK7, dímero D y Fa BP3, PARK7, dímero D y I L-6, PARK7, dímero D y sTNFr1, PARK7, dímero D y GFAP, PARK7, dímero D, FABP3 y sTNFr1, PARK7, dímero D, FABP3 y IL-6, PARK7, dímero D, FABP3, sTNFr1 y IL-6, dímero D, FABP3, GFAP y PARK7 y dímero D, FABP3, GFAP, IL-6, PARK7 y sTNFr1.

La expresión "dímero D", tal como se emplea en este documento, se refiere al producto de degradación de fibrina. El término "sTNFR1", tal como se emplea en este documento, se refiere al receptor del factor de necrosis tumoral 1 (UniProt P19438). El término "IL-6", tal como se emplea en este documento, se refiere a interleucina 6 (UniProt P05231). El término "PARK7", tal como se emplea en este documento, se refiere a la proteína de la enfermedad de Parkinson 7, también conocida como DJ-1 (UniProt Q99497). El término "FABP3", tal como se emplea en este documento, se refiere a la proteína de unión a ácido graso 3 (UniProt P05413). El término "GFAP", tal como se emplea en este documento, se refiere a la proteína ácida fibrilar glial (UniProt P14136). El término "GSTP", tal como se emplea en este documento, se refiere a glutatión S-transferasa P (UniProt P09211). El término "NDKA", tal como se emplea en este documento, se refiere a nucleósido difosfato cinasa A (Uniprot P15531).

Es posible que los niveles de algunos biomarcadores específicos no cerebrales se vean alterados en los análogos de accidentes cererbrovasculares, por lo tanto estos marcadores, cuando se usan aislados, pueden producir resultados falso positivos en el diagnóstico de accidente cerebrovascular cuando estos niveles se comparan con grupos control/de referencia sanos. En esos casos, la combinación con un marcador específico cerebral cuyos niveles no se alteren en análogos de accidente cerebrovascular puede mejorar la precisión clínica del método diagnóstico. Los niveles del biomarcador específico cerebral se pueden comparar con los niveles en grupos control sanos o grupos control de análogos de accidente cerebrovascular para ayudar en la diferenciación de dichos cuadros. El grupo de referencia puede también consistir tanto en controles sanos como en análogos de accidente cerebrovascular agrupados juntos. En la presente invención, se descubrió que añadir el marcador específico del cerebro PARK7 a ensayos del dímero D mejoró el desempeño diagnóstico. La Tabla 1 muestra la localización y la función patofisiológica de los cuatro biomarcadores específicos del cerebro, PARK7, GSTP, NDKA y GFAP, y cuatro biomarcadores específicos no cerebrales, dímero D, FABP3, IL-6 y sTNFr1, de la presente invención.

Por lo tanto, las concentraciones de uno o más biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en dímero D, FABP3, IL-6 y sTNFr1 se comparan con los niveles en un grupo control sano. Incluso en otra realización, las concentraciones de uno o más biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en PARK7, GSTP, NDKA y GFAP se comparan con los niveles en un grupo control análogo a accidente cerebrovascular.

Tabla 1 Biomarcadores preferidos de la presente invención junto con su localización dentro del cuerpo humano y su función patofisiológica

Las referencias citadas en este documento a 'un paciente que se sospecha que ha sufrido o sufre actualmente un accidente cerebrovascular' incluyen a un paciente que ha sido diagnosticado con un accidente cerebrovascular actual o que ha sido diagnosticado con un accidente cerebrovascular previo, y a cualquier paciente que presente síntomas de tipo accidente cerebrovascular. El accidente cerebrovascular puede haber sido un evento reciente, como un evento que haya ocasionado que el individuo buscara ayuda clínica.

Los términos "sujeto" y "paciente" se pueden usar de manera intercambiable en este documento y se refieren a un mamífero, incluidos un mamífero no primate (p. ej., vaca, cerdo, caballo, perro, gato, rata y ratón) y un primate (p. ej., mono o ser humano). Preferiblemente, el sujeto o paciente es un ser humano.

Tal como se emplea en este documento, el término 'biomarcador' se refiere a una molécula presente en una muestra biológica obtenida de un paciente, cuya concentración en dicha muestra puede ser indicativa de un estado patológico. Los presentes inventores han descubierto que varios biomarcadores son útiles para diferenciar entre distintos subtipos de accidentes cerebrovasculares, o bien solos o combinados con otros métodos diagnósticos, o como biomarcadores complementarios combinados con otros biomarcadores, como se describe en la presente invención. Tal como se emplea en este documento, la expresión 'biomarcador complementario' se refiere a un biomarcador que se puede utilizar junto con otros biomarcadores de accidentes cerebrovasculares para dar soporte al diagnóstico.

Se entiende bien en la técnica que un biomarcador normal o concentraciones de 'fondo' pueden exhibir variación ligera debido a, por ejemplo, edad, género o genotipos étnicos/geográficos. Como consecuencia, el valor de corte utilizado en los métodos de la invención puede variar ligeramente debido a la optimización, dependiendo de la población/paciente diana.

La muestra biológica obtenida de un paciente es preferiblemente una muestra de sangre, suero o plasma. Tal como se emplea en este documento, la expresión 'ex vivo' tiene su significado usual y se refiere a una muestra que ha sido extraída del cuerpo de un paciente. Cuando se toma una muestra de sangre del paciente para análisis, se analiza sangre completa, suero o plasma. El análisis de la muestra de plasma se puede efectuar mediante diversas metodologías analíticas tales como espectrometría de masas ligada a una etapa de separación tal como cromatografía. La metodología preferida se basa en la inmunodetección. La tecnología de inmunodetección ya está fácilmente incorporada a dispositivos manuales transportables para usar fuera del entorno clínico. Se puede usar un inmunoensayo cuantitativo Un inmunoensayo cuantitativo, tal como Western blot o ELISA, se puede usar para detectar la cantidad de proteína. Un método de análisis preferido comprende usar un biochip de múltiples analitos que permite que varias proteínas sean detectadas y cuantificadas simultáneamente. La electroforesis en gel 2D es también una técnica que se puede utilizar para análisis de múltiples analitos.

La persona experimentada estará al tanto de los numerosos métodos adecuados para desarrollar algoritmos estadísticos. Los ejemplos de algoritmos de clasificación adecuados incluyen regresión logística multinomial, red neuronal perceptrón multicapa (MLP), redes neuronales artificiales, máquinas vectoriales de soporte, clasificadores Naive Bayes y random forest. Los presentes inventores han descubierto que tanto la regresión logística multinominal como MPL logran un desempeño similar en el contexto de la presente invención, sugiriendo la importancia de los analitos (es decir, biomarcadores) utilizados en los métodos de la invención, en lugar del método utilizado para generar el modelo algorítmico. No obstante, en una realización preferida, el algoritmo estadístico incluye una ecuación de regresión logística. La precisión de los métodos estadísticos utilizados de acuerdo con la presente invención se puede describir de la mejor manera mediante las características operativas del receptor (ROC). La curva ROC aborda tanto la sensibilidad, el número de verdaderos positivos, como la especificidad, el número de verdaderos negativos, de la prueba. Por consiguiente, los valores de sensibilidad y especificidad para una combinación determinada de biomarcadores son indicativos de la precisión del ensayo. Por ejemplo, si una combinación de biomarcadores tiene valores de sensibilidad y especificidad de 80%, de 100 pacientes que experimentan accidentes cerebrovasculares, 80 serán correctamente identificados a partir de la determinación de la presencia de la combinación particular de biomarcadores como positivos para accidente cerebrovascular, mientras que de 100 pacientes que no han experimentado un accidente cerebrovascular, 80 obtendrán un resultado negativo preciso para la enfermedad. Si se han de utilizar dos o más biomarcadores en el método diagnóstico, se puede derivar un modelo matemático adecuado. La ecuación de regresión logística podría incluir otras variables tales como la edad y el género del paciente. La curva ROC se puede utilizar para evaluar la precisión del modelo de regresión logística. La ecuación de regresión logística se puede usar en forma independiente o en un algoritmo para ayudar en la toma de decisiones clínicas. Si bien una ecuación de regresión logística es un procedimiento matemático/estadístico común utilizado en dichos casos y se prefiere en el contexto de la presente invención, se pueden usar también otros procedimientos matemáticos/estadísticos. A modo de ejemplo, una ecuación de regresión logística aplicable

En un ámbito clínico, una etapa inicial de diagnosticar al paciente por sufrir o haber sufrido un accidente hemorrágico se puede llevar a cabo usando cualquier método o técnica diagnóstica adecuada conocida en el campo, incluidas técnicas de exploración tales como TC y RMN, o ensayando una muestra del paciente para biomarcadores de accidente cerebrovascular. El accidente hemorrágico se puede diagnosticar usando una TC en combinación con niveles de GFAP. Una vez que se ha descartado el accidente hemorrágico, se podría determinar la concentración de por lo menos dímero D y PARK7 en una muestra ex vivo obtenida del paciente y establecer la significación de la concentración de los marcadores comparando el valor de concentración para cada biomarcador con un valor control correspondiente a fin de ayudar en el diagnóstico.

En los métodos preferidos para diagnosticar el accidente cerebrovascular descritos anteriormente, los valores control pueden derivar de la concentración de los correspondientes biomarcadores en una muestra biológica obtenida de uno o más individuos que no han experimentado un accidente cerebrovascular. Dichos grupos control o grupos de referencia consisten en individuos que no han experimentado un accidente cerebrovascular y pueden ser, por ejemplo, individuos sanos, individuos que sufren enfermedades distintas de accidentes cerebrovasculares, p. ej., análogos de accidentes cerebrovasculares. El grupo control que se selecciona puede depender del biomarcador individual que se ha de medir. Por ejemplo, para biomarcadores no específicos del cerebro, puede ser útil usar un grupo control análogo a accidente cerebrovascular, mientras que para biomarcadores específicos del cerebro puede ser útil usar un grupo control sano o un grupo análogo a accidente cerebrovascular. En el caso en que se ha de diagnosticar o diferenciar un accidente isquémico, el grupo control puede consistir en análogos a accidente cerebrovascular por sí mismos o en combinación con pacientes de TIA. En otros casos, los controles sanos se pueden agrupar con análogos a accidente cerebrovascular para formar un grupo de referencia. Alternativamente, los valores control pueden corresponder a la concentración de cada uno del biomarcador en una muestra obtenida del paciente antes del evento del accidente cerebrovascular. En una realización preferida, cada uno de los valores de los biomarcadores del paciente y/o el control se introduce en uno o más algoritmos estadísticos para producir un valor resultante que indica si ha ocurrido un accidente cerebrovascular. Las concentraciones o valores de corte se derivan usando una técnica estadística; están disponibles diversos métodos distintos para desarrollar algoritmos estadísticos, y se conocen en la técnica. Un método estándar de análisis estadístico de biomarcadores consiste en usar métodos de una variable para comparar niveles de biomarcadores en diversos grupos y resaltar aquellos biomarcadores cuyas concentraciones difieran significativamente entre grupos particulares.

Las concentraciones o 'niveles' de biomarcadores se pueden determinar poniendo en contacto la muestra con un sustrato que tiene sondas específicas de cada uno de los biomarcadores incluidos en la combinación de biomarcadores. Las interacciones entre un biomarcador y su respectiva sonda se pueden monitorear y cuantificar utilizando diversas técnicas conocidas en el campo. Las concentraciones de biomarcadores preferiblemente se miden en ng/ml. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención da a conocer un sustrato que comprende sondas específicas para dímero D y sondas específicas para PARK7, opcionalmente el sustrato podría además comprender sondas específicas para cualquiera de FABP3, GFAP, GSTP, IL-6, NDKA y sTNFr1. Dicho sustrato se puede utilizar de acuerdo con cualquiera de los métodos de la presente invención para auxiliar en el diagnóstico de accidentes cerebrovasculares.

El 'nivel' de un biomarcador se refiere a la cantidad, nivel de expresión o concentración del biomarcador dentro de la muestra. Este nivel puede ser un nivel relativo en comparación con otro biomarcador o una muestra previa. Los niveles de los biomarcadores se pueden expresar como relaciones.

Tal como se emplea en este documento, el término 'específica', con referencia a una sonda, significa que la sonda se une solamente a un biomarcador, con unión insignificante a otros biomarcadores o a otros analitos en la muestra biológica que se esté analizando. Esto asegura que la integridad del ensayo diagnóstico y su resultado no se vean comprometidos por eventos de unión adicionales. Las sondas se pueden inmovilizar en la superficie del sustrato, por ejemplo se pueden inmovilizar en forma covalente. El sustrato puede ser cualquier sustancia capaz de soportar una o más sondas, por ejemplo un dispositivo en estado sólido, tal como un biochip. Un biochip es un sustrato plano que se puede basar, por ejemplo, en un mineral o polímero, pero es preferiblemente cerámico. La sonda podría ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, otras sondas tales como aptámeros, polímeros de impresión molecular, fagos, fragmentos de cadena corta y otras sondas basadas en anticuerpo.

Métodos

Grupos de pacientes

El estudio consistió en 113 pacientes que presentaban síntomas de tipo accidente cerebrovascular ingresados en el servicio de urgencias del hospital general KAT, Atenas, Grecia. Se incluyeron solamente pacientes que presentaban accidente cerebrovascular por primera vez. Se excluyeron pacientes con tumores malignos, antecedentes recientes de lesión cerebral traumática, enfermedad hepática y renal crónica o terminal. Se tomaron muestras de sangre (suero y plasma EDTA) al momento del ingreso y 24, 48, 72, 96 horas y 7 días después del ingreso. El suero y el plasma se dividieron en alícuotas y se conservaron a -80 °C hasta el ensayo. Todos los pacientes se sometieron a una TC tras ingresar y 72 horas después del inicio del accidente cerebrovascular. Se incluyeron en el estudio solamente pacientes ingresados en el servicio de urgencias dentro de las 6 horas del inicio de los síntomas neurológicos. El tiempo medio desde el inicio de los síntomas de accidente cerebrovascular hasta el ingreso en el hospital fue de 3,2 horas. En cada paciente, se registró la presencia de hipertensión arterial, diabetes mellitus, antecedentes de tabaquismo, dislipidemia y cardiopatía isquémica. Se midió la intensidad del accidente cerebrovascular al momento del ingreso con la Escala de Accidente Cerebrovascular de los Institutos Nacionales de Salud (National Institute of Health Stroke Scale o NIHSS). Se midió el resultado funcional con la escala de Rankin (mRS) el día 7, y los pacientes con accidente cerebrovascular agudo se categorizaron en tres grupos según la intensidad (leve, moderada y grave) de acuerdo con la puntuación de mRS: leve (puntuación mRS: 0-2), moderada (puntuación mRS: 3-4) y grave (puntuación mRS: 5-6). La evaluación clínica (usando los criterios señalados en la sección de antecedentes anterior) y las técnicas de neuroimágenes identificaron 10 accidentes hemorrágicos (HS), 53 accidentes isquémicos (IS), 13 accidentes isquémicos transitorios (TIA) y 37 análogos a accidente cerebrovascular (M); 79 sujetos sanos se usaron como controles (C).

Análisis de muestras

Se ensayaron las siguientes proteínas contra muestras de plasma EDTA de sangre obtenida en el ingreso de los pacientes del grupo de estudio: PARK7, dímero D, FABP3, GFAP, GSTP, IL-6, NDKA y STNFr1. Las proteínas se detectaron y cuantificaron usando biochips multiplexados que incorporan anticuerpos específicos de biomarcadores y Evidence Investigator (Randox Laboratories Ltd, Crumlin, Reino Unido). Se realizaron inmuoensayos sándwich quimioluminiscentes simultáneos de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se ensayaron una curva de calibración de nueve puntos y tres controles de referencia para cada biomarcador a fin de permitir la validación de resultados.

Análisis estadístico

Se sometieron biomarcadores individuales al análisis de curva ROC para evaluar la sensibilidad y la especificidad. Los valores AUC para combinaciones de biomarcadores se derivaron usando un clasificador Naive Bayes.

Resultados

Los datos que se exponen en las tablas 2 y 3 muestran ejemplos comparativos de combinaciones de biomarcadores para diagnosticar accidente cerebrovascular y diferenciar entre accidente hemorrágico (HS), accidente isquémico (IS), accidente isquémico transitorio (TIA), análogos a accidente cerebrovascular (M) y controles sanos (C);

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4 Análisis estadístico de cohorte control sana (HC) frente a cohorte de análogos a accidente cerebrovascular (análogo) y cohorte de accidente isquémico frente a HC, análogo y TIA análogo.

Tabla 5 Mediana de biomarcadores (unidades en la primera columna) de las cohortes HC, análogo y análogo TIA y % de incremento (inc.) de HC frente a análogo y HC frente a análogo TIA. La columna 4 exhibe los valores de corte utilizados para derivar las sensibilidades y especificidades resaltadas en la Tabla 4.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un método para ayudar en el diagnóstico de accidente cerebrovascular en un paciente que se sospecha que ha sufrido o sufre actualmente un accidente cerebrovascular, en donde dicho método comprende;

i) Determinar la concentración de la proteína de la enfermedad de Parkinson 7 (PARK7) y Dímero D en una muestra ex vivo de sangre, suero o plasma obtenida del paciente;

ii) Establecer la significación estadística de la concentración de los biomarcadores por comparación con un valor control, en donde cada uno de los valores de concentración de los biomarcadores se introduce en uno o más algoritmos estadísticos para producir un valor resultante que se correlaciona con el diagnóstico de accidente cerebrovascular.

2. El método según la reivindicación 1, en donde también se determina la concentración de uno o más biomarcadores adicionales seleccionados de la lista que consiste en proteína de unión a ácido graso 3 (FABP3), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), glutatión S-transferasa P (GSTP), interleucina 6 (IL-6), nucleósido difosfato cinasa A (NDKA) y receptor del factor de necrosis tumoral soluble 1 (sTNFr1).

3. El método según la reivindicación 2, en donde se determina cualquiera de las siguientes concentraciones i) PARK7, Dímero D y FABP3

ii) PARK7, Dímero D e IL-6

iii) PARK7, Dímero D y sTNFr1

iv) PARK7, Dímero D y GFAP

v) PARK7, Dímero D, FABP3 y sTNFr1

vi) PARK7, Dímero D, FABP3 e IL-6

vii) PARK7, Dímero D, FABP3, sTNFr1 e IL-6

viii) Dímero D, FABP3, GFAP y PARK7

ix) Dímero D, FABP3, GFAP, IL-6, PARK7 y sTNFr1

4. El método según las reivindicaciones 1-3 para el diagnóstico de accidente isquémico.