ES2955992T3 - Método para evaluar una sinucleinopatía - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para desarrollar productos farmacéuticos para el tratamiento de afecciones neurodegenerativas, tales como afecciones sinucleopáticas, afecciones amiloidopáticas, afecciones tauopáticas y enfermedad de Huntington. Los métodos implican el uso de un biomarcador para determinar el efecto de un fármaco candidato sobre la afección. El perfil de biomarcadores incluye medidas cuantitativas de cada una de una o una pluralidad de formas de proteínas neurodegenerativas, en las que las proteínas neurodegenerativas son, por ejemplo, alfa-sinucleína y beta amiloide, tau o Huntingtina. Los perfiles de biomarcadores incluyen una o más formas oligoméricas y, opcionalmente, una o más formas monoméricas de la proteína neurodegenerativa. Las proteínas neurodegenerativas se pueden cuantificar a partir de, por ejemplo, exosomas derivados del SNC de la sangre de un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para evaluar una sinucleinopatía

Antecedentes

Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por cambios degenerativos en el cerebro, incluida la pérdida de función y la muerte de las neuronas. Las enfermedades neurodegenerativas incluyen, sin limitación, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia por cuerpos de Lewy.

Muchas enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la acumulación aberrante de formas oligoméricas de proteínas. Se cree que estas formas oligoméricas contribuyen a la degeneración y muerte neuronal. El documento US 2015/0119278 A1 describe biomarcadores y métodos de diagnóstico y pronóstico para la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos. El documento WO 2015/200851 A1 describe un método para enriquecer exosomas derivados del SNC a partir de un fluido biológico y que los biomarcadores de los exosomas derivados del SNC se pueden medir para detectar una enfermedad neurológica, diferenciar entre diferentes enfermedades neurológicas, monitorear la progresión de la enfermedad o evaluar objetivamente tratamientos médicos existentes y futuros. El documento WO 2015/068075 A2 describe un método in vitro para cuantificar la proteína Tau en un individuo que comprende medir la cantidad de proteína Tau en una Fracción Enriquecida en Ectosoma de dicho individuo. El documento WO 2017/032871 A1 describe métodos de diagnóstico diferencial de demencia con cuerpos de Lewy y/o enfermedad de Parkinson que comprenden una etapa de aislamiento de exosomas de una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) y determinación del número de exosomas y/o cantidad de a-sinucleína en un volumen definido de muestra de LCR. "Extracellular vesicles in neurodegenerative disease - pathogenesis to biomarkers" Thompson et al., Nature Reviews Neurology, volumen 12, junio de 2016, pág. 346-357 describe la biología y función de las vesículas extracelulares, analiza la evidencia de su participación en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas y considera su potencial como biomarcadores de enfermedades. "a-Synuclein in Extracellular Vesicles: Functional Implications and Diagnostic Opportunities" Loov et al., Cell Mol. Neurobiol, 36, 2016, pág. 437-448, describe que la asinucleína puede transferirse entre células a través de vesículas extracelulares, la presencia de a-sinucleína asociada a vesículas extracelulares puede actuar como un biomarcador de diagnóstico para la enfermedad de Parkinson y otras a-sinucleinopatías, y métodos para detectar a-sinucleína en vesículas extracelulares. El documento WO 2013/138512 A1 describe métodos para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la enfermedad de Alzheimer que implican medir las cantidades de proteína Ap monomérica y oligomérica combinada y cantidades de proteína Ap monomérica en una muestra obtenida de un sujeto y determinar una proporción de modo que la proporción pueda usarse en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de la enfermedad de Alzheimer. El documento US 2008/0220449 A1 describe un método para el diagnóstico, estratificación y seguimiento de la progresión de la enfermedad de Alzheimer que se basa en la cuantificación de oligómeros de tau en LCR extracelular utilizando un ensayo ELISA modificado. "Circulating brainenriched microRNAs as novel biomarkers for detection and differentiation of neurodegenerative diseases" Sheinerman et al, Alzheimer's Research & Therapy, (2017), 9: 89, describe la posibilidad de desarrollar diagnósticos basados en microARN para la detección y diferenciación de enfermedades neurodegenerativas.

Resumen

La invención proporciona, como se especifica en las reivindicaciones, un método para inferir un riesgo de desarrollar, un diagnóstico, un estadio, un pronóstico, una progresión o un grado de respuesta a un supuesto agente neuroprotector para una sinucleinopatía. En el presente documento se divulgan, entre otras cosas, perfiles de biomarcadores para afecciones neurodegenerativas, tales como afecciones sinucleopáticas, afecciones amiloidopáticas, tauopatías y enfermedad de Huntington, y la neurodegeneración asociada con las mismas. El perfil de biomarcadores comprende medidas de una o una pluralidad de especies diferentes (también denominadas "formas") de alfa-sinucleína. El perfil de alfa-sinucleína puede comprender medidas cuantitativas de cada una de una o una pluralidad de formas de proteínas neurodegenerativas que se seleccionan entre: (I) al menos una forma oligomérica; (II) una pluralidad de formas oligoméricas; (III) al menos una forma oligomérica y al menos una forma monomérica; (IV) una pluralidad de formas oligoméricas y al menos una forma monomérica; (V) al menos una forma oligomérica y una pluralidad de formas monoméricas; y (VI) una pluralidad de formas oligoméricas y una pluralidad de formas monoméricas.

Las especies de proteínas se miden a partir de vesículas extracelulares derivadas del SNC, en lo sucesivo denominadas exosomas, aisladas de la sangre. Las especies examinadas pueden derivarse de un compartimento interno del exosoma, por ejemplo, de exosomas de los que se han eliminado las proteínas de la superficie. Los perfiles de biomarcadores medidos de esta manera representan un medio de medición relativamente sencillo y no invasivo.

Como tales, los métodos de esta divulgación para medir un perfil de biomarcadores para la neurodegeneración son útiles en el desarrollo de fármacos para probar la eficacia neuroprotectora de un fármaco candidato, a veces denominado en el presente documento un supuesto agente neuroprotector. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para comprender mejor los efectos posteriores y las bases moleculares de la oligomerización en afecciones neurodegenerativas, tales como las sinucleinopatías, y para acelerar el desarrollo de estrategias terapéuticas efectivas. Dichos métodos también son útiles para identificar sujetos para su inscripción en ensayos clínicos y para determinar un diagnóstico, pronóstico, progresión o riesgo de desarrollar una afección sinucleopática. En el presente documento se describen adicionalmente métodos novedosos para tratar a un sujeto que, mediante los métodos de esta divulgación, se determina que tiene o está en riesgo de desarrollar neurodegeneración asociada con afecciones sinucleopáticas, en particular, un tratamiento neuroprotector (no reivindicado).

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación, y los dibujos adjuntos en los que:

La FIG. 1 muestra un diagrama de flujo de un ejemplo de método que detecta formas monoméricas y oligoméricas de alfa-sinucleína.

La FIG. 2 muestra un diagrama de flujo de un ejemplo de protocolo para validar la eficacia del fármaco.

La FIG. 3 muestra un diagrama de flujo de un ejemplo de método que detecta formas monoméricas y oligoméricas de proteínas implicadas en afecciones neurodegenerativas.

La FIG. 4 muestra un diagrama de flujo de un ejemplo de método que detecta formas monoméricas y oligoméricas de una proteína neurodegenerativa.

La FIG. 5 muestra un ejemplo de diagrama de flujo de creación y validación de un modelo de diagnóstico para diagnosticar una afección neurodegenerativa.

La FIG. 6 muestra un ejemplo de diagrama de flujo para clasificar un sujeto de acuerdo con cualquiera de varios estados ejecutando un algoritmo o modelo de diagnóstico en un perfil de biomarcador.

La FIG. 7 muestra ejemplos de perfiles de biomarcadores que incluyen especies monoméricas y cinco oligoméricas de alfa-sinucleína en cinco estados diferentes. Estos perfiles se pueden utilizar para correlacionar con varios estados. Los perfiles pueden ser utilizados por modelos ejecutados por un operador humano o por un ordenador.

Descripción detallada

I. Condiciones neurodegenerativas y proteínas asociadas

Los métodos divulgados en el presente documento son útiles para el diagnóstico y el desarrollo de fármacos para una variedad de afecciones neurodegenerativas. Estos incluyen, sin limitación, sinucleinopatías (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica), amiloidopatías (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), tauopatías (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal) y enfermedad de Huntington. Estas enfermedades tienen en común la acumulación de especies de polipéptidos oligoméricos tóxicos y, en algunos casos, formas oligoméricas o monoméricas anormalmente fosforiladas, y la capacidad de detectar dichas formas en exosomas derivados del SNC.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína neurodegenerativa" se refiere a una proteína que, en forma oligomerizada, está asociada con la neurodegeneración. Las proteínas neurodegenerativas incluyen, sin limitación, alfa-sinucleína, tau, beta amiloide y Huntingtina.

Se cree que ciertas formas oligomerizadas o formas anormalmente fosforiladas de polipéptidos cerebrales subyacen a una variedad de afecciones neurodegenerativas. Esto incluye, por ejemplo, las funciones de la alfa-sinucleína en condiciones sinucleinopáticas, la beta amiloide en condiciones amiloidopáticas, la tau en condiciones tauopáticas y la Huntingtina en la enfermedad de Huntington. En particular, la evidencia actual sugiere que los oligómeros de asinucleína pueden actuar como especies tóxicas en la EP y otras sinucleinopatías. En determinadas realizaciones, la especie oligomérica detectada es una especie anormalmente fosforilada.

Perfiles que incluyen cantidades de cada una de una o una pluralidad de formas de proteínas neurodegenerativas (por ejemplo, formas de alfa-sinucleína, beta amiloide, tau o Huntingtina) seleccionadas de: (I) al menos una forma oligomérica; (II) una pluralidad de formas oligoméricas; (III) al menos una forma oligomérica y al menos una forma monomérica; (IV) una pluralidad de formas oligoméricas y al menos una forma monomérica; (V) al menos una forma oligomérica y una pluralidad de formas monoméricas; y (VI) se usa una pluralidad de formas oligoméricas en modelos para inferir, entre otras cosas, condiciones neurodegenerativas o progresión hacia condiciones neurodegenerativas, típicamente con una o más formas oligoméricas incluidas en un modelo que indica la presencia y actividad de la enfermedad o progresión hacia la enfermedad. Esto incluye cantidades relativas crecientes de formas oligoméricas de alfa-sinucleína que indican la presencia y actividad de una sinucleinopatía, o la progresión hacia una sinucleinopatía; cantidades relativas crecientes de beta amiloide oligomérica que indican la presencia y actividad de una amiloidopatía, o progresión hacia una amiloidopatía, cantidades relativas crecientes de tau oligomérica o anormalmente fosforilada que indican la presencia y actividad de una tauopatía, o progresión hacia una tauopatía, y cantidades relativas crecientes de Huntingtina oligomérica que indica la presencia y actividad de la enfermedad de Huntington, o la progresión hacia la enfermedad de Huntington. Por consiguiente, un perfil anormal de tales oligómeros indica un proceso de neurodegeneración.

Como se usa en el presente documento, el término "perfil de biomarcadores" se refiere a datos que indican medidas cuantitativas de cada una de una o una pluralidad de formas de proteínas neurodegenerativas que incluyen una o más formas oligoméricas y, opcionalmente, una o más formas monoméricas. Esto incluye cantidades de especies de alfasinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente hiperfosforilada y, opcionalmente, monomérica; y Huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Por ejemplo, un perfil de biomarcador puede incluir (I) al menos una forma oligomérica; (II) una pluralidad de formas oligoméricas; (III) al menos una forma oligomérica y al menos una forma monomérica; (IV) una pluralidad de formas oligoméricas y al menos una forma monomérica; (V) al menos una forma oligomérica y una pluralidad de formas monoméricas; y (VI) una pluralidad de formas oligoméricas y una pluralidad de formas monoméricas.

Las formas de proteínas pueden referirse a especies de proteínas individuales o colecciones de especies. Por ejemplo, un 6 mer de alfa-sinucleína es una forma de alfa-sinucleína de retroceso. Además, la colección de 6 a 18 mers de alfasinucleína, en conjunto, puede ser una forma de alfa-sinucleína.

Un perfil de biomarcador puede incluir una pluralidad de formas de una proteína. En una realización, un perfil de biomarcadores puede incluir medidas cuantitativas de cada una de una pluralidad de formas oligoméricas y formas monoméricas de la proteína neurodegenerativa. Así, por ejemplo, el perfil de biomarcador podría incluir medidas cuantitativas de cada una de un 6 mer, 7 mer, 8 mer, 9 mer, 10 mer, 11 mer, 12 mer, 13 mer, 14 mer, 15 mer y 16 mer, 9 mer.

Las medidas cuantitativas pueden ser medidas absolutas, medidas normalizadas (por ejemplo, frente a una medida de referencia) y medidas relativas. Por ejemplo, en una realización, un perfil de biomarcador comprende una cantidad relativa de una forma oligomérica de una proteína neurodegenerativa con respecto a una forma monomérica de la proteína neurodegenerativa.

El término "perfil de biomarcador" también puede usarse para referirse a un patrón particular en el perfil que un modelo infiere que está asociado con un diagnóstico, estadio, progresión, tasa, pronóstico, capacidad de respuesta al fármaco y riesgo de desarrollar una afección neurodegenerativa. Por consiguiente, "perfil de biomarcador de sinucleína" se refiere a un perfil que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica, el término "perfil de biomarcador de amiloide" se refiere a un perfil que comprende beta-amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, el término "perfil de biomarcador de tau" "se refiere a un perfil que comprende tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica, el término "perfil de biomarcador de huntingtina" se refiere a un perfil que comprende huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína/polipéptido monomérico" se refiere a una única molécula de proteína o polipéptido no agregada, incluyendo cualquier especie de la misma, tal como especies fosforiladas. Como se usa en el presente documento, el término "proteína/polipéptido oligomérico" se refiere a especies oligoméricas individuales o un agregado que comprende una pluralidad de especies oligoméricas, incluidas especies fosforiladas. Se entiende que la medición de una forma oligomérica de una proteína, como se usa en el presente documento, puede referirse a la medición de todas las formas oligoméricas (forma oligomérica total) o formas oligoméricas específicas. Las formas oligoméricas especificadas pueden incluir, por ejemplo, formas dentro de un rango de tamaño o condición física particular, tales como, por ejemplo, fibrillas solubles.

Los perfiles anormales (por ejemplo, cantidades relativas aumentadas de formas oligoméricas a monoméricas o aumentos o disminuciones de ciertas formas oligoméricas en relación con otras formas oligoméricas) indican actividad patológica y, por lo tanto, tiempo hasta el inicio clínico futuro y tasas posteriores de progresión clínica. Además, el retorno a la normalidad en los perfiles de biomarcadores (por ejemplo, reducciones en cantidades relativas de formas oligoméricas a formas monoméricas) refleja la eficacia de una intervención neuroprotectora candidata. En consecuencia, los perfiles de biomarcadores descritos en el presente documento son útiles para determinar la eficacia de candidatos a fármacos por su efecto neuroprotector.

En consecuencia, los perfiles de biomarcadores funcionan no sólo como diagnóstico de un estado patológico existente sino también como centinela de la patología antes del inicio clínico, por ejemplo, cuando un sujeto es presintomático o preclínico, por ejemplo, tiene signos o síntomas que son insuficientes para un diagnóstico de enfermedad. Esto es relevante ya que el éxito relativo de los tratamientos neuroprotectores a menudo parece estar relacionado con su administración lo antes posible. Además, se cree que estos perfiles de biomarcadores indican el estadio o el grado de una afección neurodegenerativa. Por consiguiente, determinar los perfiles de biomarcadores (por ejemplo, cantidades relativas de formas oligoméricas y monoméricas de la proteína seleccionada) es útil para determinar la eficacia de un tratamiento, por ejemplo, en ensayos clínicos y, para intervenciones terapéuticas que se consideran eficaces para tratar la neurodegeneración, incluidas, por ejemplo, la neurodegeneración, sinucleinopatía, amiloidopatía, tauopatía o enfermedad de Huntington en el individuo.

En cada una de estas condiciones, se cree que las formas oligomerizadas/agregadas de polipéptidos descritas en el presente documento son tóxicas para las neuronas porque los perfiles de biomarcadores que comprenden formas oligoméricas y, opcionalmente, formas monoméricas de estos polipéptidos funcionan en modelos para inferir actividad patológica. En particular, cantidades relativas aumentadas de formas oligoméricas en comparación con formas monoméricas indican patología. Las medidas de estos biomarcadores se pueden utilizar para rastrear las respuestas de los sujetos a terapias existentes o en desarrollo, así como para predecir el desarrollo de una enfermedad o el estado o progreso de una enfermedad existente.

A. Sinucleinopatías

1. Condiciones

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sinucleinopatía" y "afección sinucleopática" se refieren a una afección caracterizada por perfiles anormales de alfa-sinucleína oligomérica, que es una forma agregada anormal de alfa-sinucleína. En determinadas realizaciones, las sinucleinopatías se manifiestan como una enfermedad sinucleopática clínicamente evidente tal como, por ejemplo, EP, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica y algunas formas de enfermedad de Alzheimer, así como otros trastornos neurodegenerativos raros tales como diversas distrofias neuroaxonales. Los signos y, opcionalmente, síntomas suficientes para un diagnóstico clínico de una enfermedad sinucleinopática son aquellos generalmente suficientes para que una persona experta en la técnica de diagnosticar tales afecciones realice dicho diagnóstico clínico.

La enfermedad de Parkinson ("EP") es un trastorno progresivo del sistema nervioso central (SNC) con una prevalencia del 1 % al 2 % en la población adulta mayor de 60 años. La EP se caracteriza por síntomas motores, que incluyen temblor, rigidez, inestabilidad postural y lentitud de los movimientos voluntarios. La causa de la forma idiopática de la enfermedad, que constituye más del 90 % del total de los casos de EP, sigue siendo difícil de alcanzar, pero ahora se considera que implica factores tanto ambientales como genéticos. Los síntomas motores están claramente relacionados con una degeneración progresiva de las neuronas productoras de dopamina en la sustancia negra. Más recientemente, la EP ha pasado a ser reconocida como parte de un grupo de trastornos multisistémicos, que afectan principalmente a los ganglios basales (por ejemplo, EP), o a la corteza cerebral (por ejemplo, demencia con cuerpos de Lewy), o a los ganglios basales, el tronco encefálico y la médula espinal (por ejemplo, atrofia multisistémica) y que están todos vinculados por la presencia de depósitos intracelulares (cuerpos de Lewy) que consisten principalmente en una proteína cerebral llamada alfa-sinucleína. En consecuencia, estos trastornos, junto con el síndrome de Hallevorden-Spatz, la distrofia axonal neuronal y la lesión cerebral traumática, a menudo se han denominado "sinucleinopatías".

Los signos y síntomas de la EP pueden incluir, por ejemplo, temblores en reposo, rigidez, bradicinesia, inestabilidad postural y un síndrome parkinsoniano festinante. Un signo de EP es una respuesta positiva en estas disfunciones motoras a la carbidopa-levodopa.

Los estadios clínicamente reconocidos de la enfermedad de Parkinson incluyen los siguientes: Estadio 1: leve; Estadio 2: moderada; Estadio 3 - estadio intermedio; Estadio 4: grave; Estadio 5: avanzado.

En la actualidad, el diagnóstico de EP se basa principalmente en los resultados de un examen físico que a menudo se cuantifica mediante el uso de la escala de estadificación modificada de Hoehn y Yahr(Hoehn y Yahr, 1967, Neurology, 17:5, 427-442) y la Escala Unificada de Calificación de la Enfermedad de Parkinson (UPDRS). El diagnóstico diferencial de la EP frente a otras formas de parkinsonismo, por ejemplo, la parálisis supranuclear progresiva (PSP), puede resultar difícil y, por lo tanto, puede producirse un diagnóstico erróneo en hasta el 25 % de los pacientes. De hecho, la EP generalmente pasa desapercibida durante años antes de que se pueda realizar el diagnóstico clínico inicial. Cuando esto sucede, la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra ya supera el 50 % y puede acercarse al 70 %. Aún no se ha validado ningún análisis de sangre para detectar la EP o cualquier sinucleinopatía relacionada. Si bien los estudios de imágenes que utilizan tomografía por emisión de positrones (PET) o resonancia magnética se han utilizado en el diagnóstico de la EP al proporcionar información sobre la ubicación y extensión del proceso neurodegenerativo, confieren poca o ninguna información sobre la patogénesis de la degeneración observada y no guían la selección de una intervención específica sinucleopática particular.

La demencia con cuerpos de Lewy (DCL) afecta a alrededor de 1.3 millones de personas en Estados Unidos. Los síntomas incluyen, por ejemplo, demencia, fluctuaciones cognitivas, parkinsonismo, alteraciones del sueño y alucinaciones. Es la segunda forma más común de demencia después de la enfermedad de Alzheimer y suele aparecer después de los 50 años. Al igual que la enfermedad de Parkinson, la DCL se caracteriza por depósitos anormales de alfa-sinucleína en el cerebro.

La atrofia multisistémica (AMS) se clasifica en dos tipos, el tipo parkinsoniano y el tipo cerebeloso. El tipo parkinsoniano se caracteriza, por ejemplo, por síntomas parkinsonianos de la EP. El tipo cerebeloso se caracteriza, por ejemplo, por problemas de movimiento y coordinación, disartria, alteraciones visuales y disfagia. Los síntomas de ^a M^s reflejan pérdida celular y gliosis o proliferación de astrocitos en áreas dañadas del cerebro, especialmente la sustancia negra, el cuerpo estriado, el núcleo olivar inferior y el cerebelo. Son característicos los depósitos anormales de alfa-sinucleína.

Las tasas de error diagnóstico para la EP y otras sinucleinopatías pueden ser relativamente altas, especialmente en sus etapas iniciales, una situación que podría volverse importante con la introducción de terapias modificadoras de la enfermedad eficaces, tales como las terapias neuroprotectoras.

2. Alfa-sinucleína

La alfa-sinucleína es una proteína que se encuentra en el cerebro humano. La proteína alfa-sinucleína humana está formada por 140 aminoácidos y está codificada por el gen SNCA (también llamado PARK1). (Alpha-synuclein: Gene ID: 6622; Homo sapiens; Cytogenetic Location: 4q22.1).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alfa-sinucleína" incluye especies normales (no modificadas), así como especies modificadas. La alfa-sinucleína puede existir en formas monoméricas o agregadas. Los monómeros de alfa-sinucleína pueden agregarse de manera aberrante en oligómeros, y la alfa-sinucleína oligomérica puede agregarse en fibrillas. Las fibrillas pueden agregarse aún más para formar depósitos intracelulares llamados cuerpos de Lewy. Se cree que la alfa-sinucleína monomérica y sus diversos oligómeros existen en equilibrio. El procesamiento de alfa-sinucleína en el cerebro también puede producir otras especies supuestamente anormales, como la alfasinucleína fosforilada en la serina 129 ("alfa-sinucleína p129").

La alfa-sinucleína se expresa abundantemente en el sistema nervioso central (SNC) humano y, en menor medida, en varios otros órganos. En el cerebro, la alfa-sinucleína se encuentra principalmente en las terminales neuronales, especialmente en la corteza cerebral, el hipocampo, la sustancia negra y el cerebelo, donde contribuye a la regulación de la liberación de neurotransmisores. En circunstancias normales, esta proteína monomérica soluble tiende a formar un tetrámero plegado de forma estable que resiste la agregación. Pero, en ciertas condiciones patológicas, por razones desconocidas, la alfa-sinucleína beta se pliega anormalmente, se pliega mal, se oligomeriza y se agrega para eventualmente formar fibrillas, una vía metabólica capaz de producir intermediarios altamente citotóxicos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alfa-sinucleína monomérica" se refiere a una única molécula de alfa-sinucleína no agregada, incluyendo cualquiera de sus especies. Como se usa en el presente documento, el término "alfa-sinucleína oligomérica" se refiere a un agregado que comprende una pluralidad de moléculas de proteína alfa-sinucleína. Esto incluye alfa-sinucleína oligomérica total y formas o especies seleccionadas de la misma. La alfasinucleína oligomérica incluye formas que tienen al menos dos unidades monoméricas hasta formas de protofibrillas. Esto incluye formas oligoméricas que tienen, por ejemplo, entre 2 y aproximadamente 100 unidades monoméricas, por ejemplo, entre 4 y 16 unidades monoméricas o al menos 2, 3, 4 o 5 docenas de unidades monoméricas. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "oligómero de sinucleína de peso relativamente bajo" se refiere a oligómeros de sinucleína compuestos por hasta 30 unidades monoméricas (30 mer). En determinadas realizaciones, alfa-sinucleína se refiere a la forma o formas detectadas mediante el método de detección particular. Por ejemplo, las formas pueden ser aquellas detectables con anticuerpos generados contra formas monoméricas u oligoméricas particulares de alfa-sinucleína.

Ahora se cree que el potencial neurotóxico de la alfa-sinucleína procesada de manera aberrante en formas oligomerizadas contribuye a la aparición y posterior progresión de los síntomas de las afecciones patológicas antes mencionadas, en particular la EP, la demencia con cuerpos de Lewy, la atrofia multisistémica y varios otros trastornos. Generalmente se definen como un grupo de trastornos neurodegenerativos caracterizados en parte por la acumulación intracelular de agregados anormales de alfa-sinucleína, algunos de los cuales parecen tóxicos y pueden contribuir a la patogénesis de los trastornos antes mencionados. Aún no se sabe exactamente cómo ciertas formas oligomerizadas de alfa-sinucleína podrían causar neurodegeneración, aunque se ha sugerido el papel de factores como el estrés oxidativo, la lesión mitocondrial y la formación de poros. Sin embargo, muchos creen ahora que los procesos que conducen a la oligomerización y agregación de la alfa-sinucleína pueden ser fundamentales para la lesión y destrucción celular que se produce en estos trastornos.

Algunos estudios han demostrado que los oligómeros y protofibrillas de sinucleína prefibrilares son especialmente propensos a conferir neurotoxicidad. Loov et al., "a-Synuclein in Extracellular Vesicles: Functional Implications and Diagnostic Opportunities", M. Cell Mol Neurobiol. Abril de 2016; 36 (3): 437-48. doi: 10.1007/s10571-015-0317-0). Otros sugieren que las especies de sinucleína oligoméricas de orden inferior pueden ser las principales responsables, y aún no está claro con precisión qué especie de sinucleína, o qué conjunto de especies con diferentes disposiciones de láminas beta, actuando solas o en conjunto mediante uno o múltiples mecanismos patológicos, es más neurotóxico en la EP o en cualquier sinucleinopatía relacionada (Wong et al., "a-synuclein toxicity in neurodegeneration: mechanism and therapeutic strategies", Nat Med. 7 de febrero de 2017; 23 (2): 1-13. doi: 10.1038/n.4269).

Una porción de sinucleína intracelular, junto con algunos de sus productos metabólicos, se empaqueta dentro de vesículas exosomales y se libera en el fluido intracelular del cerebro, desde donde pasa al líquido cefalorraquídeo (LCR) y a la circulación sanguínea periférica. La alfa-sinucleína es una proteína que se encuentra en el cerebro humano. La proteína alfa-sinucleína humana está formada por 140 aminoácidos y está codificada por el gen SNCA (también llamado PARK1). (Alpha-synuclein: Gene ID: 6622; Homo sapiens; Cytogenetic Location: 4q22.1).

B. Amiloidopatías

1. Condiciones

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "amiloidopatía" se refiere a una afección caracterizada por la acumulación de polímeros amiloides en el cerebro. Las amiloidopatías incluyen, entre otras, la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, tales como la EP en etapa avanzada. La enfermedad de Alzheimer es la forma más frecuente de demencia. Se caracteriza a nivel anatómico por la acumulación de placas amiloides formadas por formas agregadas de beta-amiloide, así como ovillos neurofibrilares. Sintomáticamente se caracteriza por pérdida progresiva de memoria, deterioro cognitivo y cambios neuroconductuales. El Alzheimer es progresivo y actualmente no se conoce ninguna forma de detener o revertir la enfermedad.

2. Beta amiloide

La beta amiloide (también llamada p-amiloide, Ap, A-beta y beta-amiloide) es un fragmento peptídico de la proteína precursora de amiloide. La beta amiloide suele tener entre 36 y 43 aminoácidos. Los agregados de beta amiloide forman oligómeros solubles que pueden existir en varias formas. Se cree que los oligómeros de beta amiloide mal plegados pueden hacer que otras moléculas de beta amiloide asuman una forma oligomérica mal plegada. A-betai^-42 tiene la secuencia de aminoácidos: DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA [SEQ ID NO: 1].

En la enfermedad de Alzheimer, las proteínas p-amiloide y tau se oligomerizan y se acumulan en el tejido cerebral, donde parecen causar daño y pérdida neuronal; de hecho, algunos afirman que dichos intermediarios solubles de agregación, u oligómeros, son las especies clave que median la toxicidad y subyacen a la siembra y propagación de enfermedades (The Amyloid-p Oligomer Hypothesis: Beginning of the Third Decade. Cline EN, Bicca MA, Viola KL, Klein WL. J Alzheimer's Dis. 2018; 64(s1): S567-S610; "Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer's and Parkinson's diseases", Choi ML, Gandhi S. FEBS J. 20 de junio de 2018). Los oligómeros de pamiloide son cruciales para la aparición y progresión de la EA y representan un objetivo farmacológico popular, siendo presumiblemente el biomarcador más directo. La proteína tau también puede hiperfosforilarse anormalmente.

Los métodos que se utilizan actualmente para cuantificar las formas monoméricas y oligoméricas de A-beta incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), métodos para la detección de un solo oligómero y otros, que son principalmente métodos basados en biosensores ("Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloidp Oligomers in Cerebrospinal Fluid", Schuster J, Funke SA. J Enfermedad de Alzheimer. 7 de mayo de 2016; 53(1): 53-67).

El análisis de distribución de intensidad de fluorescencia basado en superficie (sFIDA) presenta una cuantificación de oligómeros altamente específica y sensible, así como una insensibilidad total hacia los monómeros ("Advancements of the sFIDA method for oligomer-based diagnostics of neurodegenerative diseases", Kulawik A. et al., FEBS Lett. Febrero de 2018; 592(4):516-534).

C. Tauopatías

1. Condiciones

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tauopatía" se refiere a una afección caracterizada por acumulación y agregación de en asociación con neurodegeneración. Las tauopatías incluyen, sin limitación, la enfermedad de Alzheimer ("EA"), la parálisis supranuclear progresiva, la degeneración corticobasal, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 y la enfermedad de Pick.

La EA también se caracteriza por una segunda característica patológica, el ovillo neurofibrilar (ONF). Los ONF están anatómicamente asociados con la pérdida neuronal, lo que vincula el proceso de formación de ONF con la lesión neuronal y la disfunción cerebral. El componente principal de los ONF es una forma hiperfosforilada de tau, una proteína asociada a microtúbulos. Durante la formación de ONF, tau forma una variedad de especies de agregación diferentes, incluidos los oligómeros de tau. Cada vez hay más pruebas que indican que la formación del oligómero tau precede a la aparición de ovillos neurofibrilares y contribuye de forma importante a la pérdida neuronal. (J Alzheimer's Dis. 2013; 37(3): 565-8 "Tauopathies and tau oligomers", Takashima A).

Los multímeros solubles y no fibrilares parecen ser más tóxicos que los ovillos neurofibrilares formados por tau filamentosa.

En la demencia del lóbulo frontotemporal, la proteína de unión al ADN de TAR ("TDP-43") de longitud completa forma oligómeros amiloides tóxicos que se acumulan en las regiones frontales del cerebro. Las proteinopatías TDP-43, que también incluyen la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), se caracterizan por cuerpos de inclusión formados por t DP-43 poliubiquitinada e hiperfosforilada de longitud completa y truncada. La TDP-43 humana recombinante de longitud completa forma oligómeros esféricos estructuralmente estables que comparten epítopos comunes con un anticuerpo específico del oligómero antiamiloide. Se ha descubierto que los oligómeros TDP-43 son neurotóxicos tanto in vitro como in vivo (Nat. Commun. 12 de septiembre de 2014; 5: 4824. La TDP-43 de longitud completa forma oligómeros amiloides tóxicos que están presentes en pacientes con demencia lobular frontotemporal (TDP). La determinación de la presencia y abundancia de oligómeros de TDP-43 se puede lograr utilizando un anticuerpo de oligómero amiloide TDP-43 específico llamado TDP-O entre los diferentes subtipos de FTLD-TDP ("Detection of TDP-43 oligomers in frontotemporal lobar degeneration-TDP", Kao PF, Ann Neurol. Agosto de 2015; 78(2): 211-21).

2. Tau

Tau es una fosfoproteína con 79 sitios potenciales de fosforilación de serina (Ser) y treonina (Thr) en la isoterma de tau más larga. Tau existe en seis isotermas, que se distinguen por el número de dominios de unión. Tres isotermas tienen tres dominios de unión y las otras tres tienen cuatro dominios de unión. Las isotermas resultan del corte y empalme alternativo en los exones 2, 3 y 10 del gen tau. Tau está codificada por el gen MAPT, que tiene 11 exones. El haplogrupo H1 parece estar asociado con una mayor probabilidad de sufrir ciertas demencias, como la enfermedad de Alzheimer.

Varias especies oligoméricas de tau, incluidas aquellas que van de 6 a 18 mer, han sido implicadas en el proceso neurotóxico asociado con trastornos cerebrales tauopáticos y se han medido mediante transferencia Western y otras técnicas, incluida la fluorescencia de una sola molécula (véase, por ejemplo, Kjaergaard M., et al., "Oligomer Diversity during the Aggregation of the Repeat Region of Tau" ACS Chem Neurosci. Jul 17 de 2018; Ghag G et al., "Soluble tau aggregates, not large fibrils, are the toxic species that display seeding and cross-seeding behavior", Protein Sci. Agosto 20 de 2018. doi: 10.1002/pro.3499; y Comerota MM et al., "Near Infrared Light Treatment Reduces Synaptic Levels of Toxic Tau Oligomers in Two Transgenic Mouse Models of Human Tauopathies", Mol Neurobiol. Agosto 17 de 2018).

Los métodos para medir especies de tau oligoméricas incluyen inmunoensayo. Tau se puede aislar mediante una expresión común seguida de cromatografía, tal como cromatografía de afinidad, exclusión por tamaño e intercambio aniónico. Esta forma se puede utilizar para inmunizar animales para generar anticuerpos. La agregación de tau se puede inducir utilizando ácido araquidónico. Los oligómeros se pueden purificar mediante centrifugación sobre un gradiente escalonado de sacarosa. También se pueden utilizar formas oligoméricas de tau para inmunizar animales y generar anticuerpos. Para detectar tau oligomérica se puede utilizar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima tipo sándwich que utiliza el anticuerpo TOC1 específico del oligómero de tau. El anticuerpo del complejo de oligómero tau 1 (TOC1) identifica específicamente especies de tau oligoméricas, en la fracción tris insoluble y soluble en sarcosilo (Shirafuji N., et al, "Homocysteine Increases Tau Phosphorylation, Truncation and Oligomerization", Int J Mol Sci. Marzo 17 de 2018; 19(3)) (véase, por ejemplo, Methods Cell Biol. 2017; 141: 45-64. doi: 10.1016/bs.mcb.2017.06.005. Epub julio 14 de 2017. Production of recombinant tau oligomers in vitro. Combs B1, Tiernan CT1, Hamel C1, Kanaan ⁿ M.)

D. Enfermedad de Huntington

1. Enfermedad de Huntington

La enfermedad de Huntington es una enfermedad hereditaria causada por una mutación autosómica dominante en el gen de la Huntingtina. La mutación se caracteriza por la duplicación de tripletes CAG. Se caracteriza por una neurodegeneración progresiva. Los síntomas incluyen trastornos del movimiento, tales como movimientos involuntarios, problemas para caminar y dificultad para tragar y hablar. También se caracteriza por un deterioro cognitivo progresivo.

2. Proteína de huntingtina

La proteína de Huntington está codificada por el gen Huntington, también llamado HTT o HD. La proteína de Huntington normal tiene alrededor de 3144 aminoácidos. La proteína normalmente es de unos 300 KdA.

En la enfermedad de Huntington (EH), la escisión de la proteína huntingtina (mhtt) mutante de longitud completa en fragmentos mhtt más pequeños y solubles propensos a la agregación parece ser un proceso clave en la fisiopatología de este trastorno. De hecho, la agregación y citotoxicidad de proteínas mutantes que contienen un número ampliado de repeticiones de poliglutamina (poliQ) es un sello distintivo de varias enfermedades, además de la EH. Dentro de las células, la Huntingtina mutante (mHtt) y otras proteínas mutantes de expansión de poliglutamina existen como monómeros, oligómeros solubles y cuerpos de inclusión insolubles (J. Huntington's Dis. 2012; 1(1): 119-32. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. Sontag EM, et al., Brain Sci. Marzo 3 de 2014; 4(1): 91-122. Monomeric, oligomeric and polymeric proteins in Huntington disease and other diseases of polyglutamine expansion. Hoffner G. et al.). En determinadas realizaciones, los oligómeros tienen una altura de 2 a 10 nm con una relación de aspecto (la distancia más larga a la distancia más corta) inferior a 2.5, lo que indica una estructura globular.

II. Detección y medición de monómeros y oligómeros.

A. Muestras biológicas

Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a una composición que comprende un analito. Una muestra puede ser una muestra cruda, en la que el analito se mezcla con otros materiales en su forma nativa (por ejemplo, un material de origen), una muestra fraccionada, en la que un analito está al menos parcialmente enriquecido, o una muestra purificada en la que el analito está al menos sustancialmente puro. Como se usa en el presente documento, el término "muestra biológica" se refiere a una muestra que comprende material biológico que incluye, por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos, polisacáridos, lípidos y niveles de orden superior de estos materiales tales como exosomas, células, tejidos u órganos.

Las formas oligoméricas y monoméricas de proteínas neurodegenerativas, como la alfa-sinucleína, la beta amiloide, la tau y la Huntingtina, se pueden detectar en exosomas a partir de muestras de fluidos corporales del sujeto. Más particularmente, los aislados de exosomas derivados del SNC son un subconjunto preferido de exosomas para la detección y análisis de afecciones sinucleopáticas. En particular, son útiles las proteínas de los compartimentos internos de un exosoma.

Los exosomas pueden aislarse de una variedad de muestras biológicas de un sujeto. La muestra biológica es un fluido corporal. Las fuentes de exosomas de fluidos corporales incluyen, por ejemplo, sangre (por ejemplo, sangre completa o una fracción de la misma tal como suero o plasma, por ejemplo, sangre venosa periférica), líquido cefalorraquídeo, saliva, leche y orina, o fracciones de los mismos. En la invención reivindicada, la muestra biológica es una muestra de sangre. El uso de sangre venosa como fuente de exosomas es una muestra preferida para una prueba de diagnóstico destinada a su uso tanto en adultos como en niños debido a la seguridad, aceptabilidad y conveniencia de la punción venosa de rutina en entornos médicos.

B. Métodos para determinar cantidades de oligoméricos y

Polipéptidos monoméricos

Las formas monoméricas y oligoméricas de proteínas pueden detectarse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluidos, entre otros, inmunoensayo (por ejemplo, ELISA), espectrometría de masas, cromatografía de exclusión por tamaño, transferencia Western y métodos basados en fluorescencia (por ejemplo, espectroscopia de fluorescencia o FRET) y ensayo de ligadura de proximidad.

1. Alfa-sinucleína

Las cantidades de alfa-sinucleína monomérica y alfa-sinucleína oligomérica se pueden determinar individualmente. Alternativamente, la alfa-sinucleína total en la muestra se puede medir con alfa-sinucleína monomérica o con alfasinucleína oligomérica y la cantidad de las otras especies se puede determinar basándose en la diferencia.

La alfa-sinucleína monomérica, oligomérica y total se puede detectar mediante, por ejemplo, inmunoensayo (por ejemplo, ELISA o transferencia Western), espectrometría de masas o cromatografía de exclusión por tamaño. Los anticuerpos contra la alfa-sinucleína están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Abcam (Cambridge, MA), ThermoFisher (Waltham, MA) y Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).

Las siguientes referencias describen métodos para medir el contenido total de alfa-sinucleína. Mollenhauer et al., (Movement Disorders, 32:8 p. 1117 (2017)) describe métodos para medir la alfa-sinucleína total de fluidos corporales. Loov et al. (Cell Mol. Neurobiol., 36:437-448 (2016)) describe el uso de anticuerpos para aislar exosomas positivos para L1 CAM del plasma. Abd-Elhadi et al., (Anal Bioanal Chem. (2016) noviembre; 408(27): 7669-72016) describe métodos para determinar los niveles totales de alfa-sinucleína en células sanguíneas humanas, LCR y saliva determinados mediante un ELISA de lípidos.

La alfa-sinucleína total se puede detectar en un ELISA utilizando, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-a-syn humano 211 (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.) para la captura y un anticuerpo policlonal anti-a-syn humano FL-140 (Santa Cruz Biotechnology , EE. Uu .) para la detección mediante un ensayo de quimioluminiscencia ligada a peroxidasa de rábano picante (HRP). Este enfoque evita la detección de a-sinucleína monomérica, pero no distingue entre las diferentes formas multiméricas.

Las formas monomérica y oligomérica de alfa-sinucleína pueden detectarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos que utilizan anticuerpos específicos para las formas. Véase, por ejemplo, Williams et al., ("Oligomeric alpha-synuclein and p-amyloid variants as potential biomarkers for Parkinson's and Alzheimer's diseases", Eur J Neurosci. (2016) Enero; 43(1): 3-16) y Majbour et al. ("Oligomeric and phosphorylated alpha-synuclein as potential CSF biomarkers for Parkinson's disease", Molecular Neurodegeneration (2016) 11: 7). El-Agnaf O. et al, (FASEB J. 2016; 20: 419-425) describieron la detección de formas oligoméricas de la proteína alfa-sinucleína en plasma humano como un biomarcador potencial para la EP

Se pueden producir anticuerpos contra monómeros y oligómeros de alfa-sinucleína inmunizando animales con monómeros u oligómeros de alfa-sinucleína. (Véase, por ejemplo, las publicaciones 2016/0199522 (Lannfelt et al.), 2012/0191652 (El-Agnaf). Los oligómeros de alfa-sinucleína se pueden preparar mediante el método de El Agnaf (US 2014/0241987), en el que una solución de a-sinucleína recién preparada se mezcló con dopamina en una proporción molar de 1:7 (a-sinucleína:dopamina) y se incubó a 37 °C. Los anticuerpos contra diferentes formas oligoméricas de alfa-sinucleína también se describen en Emadi et al., ("Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric a-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents a-Synuclein-induced Toxicity", J Mol Biol. 2007; 368: 1132-1144. [PubMed: 17391701]) (dímeros y tetrámeros) y Emadi et al. ("Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of a-Synuclein", J Biol Chem. 2009; 284: 11048-11058. [PubMed: 19141614]) (dímeros y tetrámeros) y Emadi et al. ("Detección de formas oligoméricas morfológicamente distintas de a-sinucleína", J Biol Chem. 2009; 284: 11048­ 11058. [PubMed: 19141614]) (trímeros y hexámeros). Los anticuerpos de unión a protofibrillas se describen, por ejemplo, en el documento u S 2013/0309251 (Nordstrom et al.).

La alfa-sinucleína monomérica se puede distinguir de la alfa-sinucleína polimérica mediante inmunoensayo utilizando anticuerpos que son reconocidos únicamente por las formas oligoméricas de sinucleína. Otro método implica la detección de diferencias de masa, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Se pueden utilizar métodos fluorescentes (véase, por ejemplo, Sangeeta Nath, et al., "Early Aggregation Steps in a-Synuclein as Measured by FCS and FRET Evidence for a Contagious Conformational Change" Biophys J. 7 de abril de 2010; 98(7): 1302-1311, doi: 10.1016/j.bpj.2009.12.4290; y Laura Tosatto et al., "Single-molecule FRET studies on alpha-synuclein oligomerization of Parkinson's disease genetically related mutants", Scientific Reports 5, Diciembre de 2015.) Otro método implica medir la alfa sinucleína total, seguida de la digestión con proteinasa K de la alfa sinucleína no patológica y la detección de la alfa sinucleína restante. Otro método implica un ensayo de ligadura por proximidad de alfa sinucleína. Las sondas de ensayo de ligadura de proteínas se generan a partir de anticuerpos generados contra la o las proteínas de interés, una para cada una de las proteínas implicadas en la supuesta interacción, que se conjugan con oligonucleótidos cortos. Si las sondas se unen a proteínas que interactúan, los oligonucleótidos están lo suficientemente cerca como para iniciar una reacción de amplificación, que puede detectarse mediante oligonucleótidos etiquetados y observarse como una señal punteada, donde cada punto representa una interacción. (Roberts RF et al., "Direct visualization of alpha-synuclein oligomers reveals previously undetected pathology in Parkinson's disease brain. Brain", 2015; 138: 1642-1657. doi: 10.1093/brain/awv040, y Nora Bengoa-Vergniory et al., "Alpha-synuclein oligomers: a new hope", Acta Neuropathol. 2017; 134(6): 819-838).

La cantidad relativa de forma oligomérica de alfa-sinucleína a monómeros se puede expresar como una relación.

La cantidad o valor se puede expresar como una señal emitida por un ensayo o como una cantidad absoluta después de la conversión, por ejemplo a partir de una curva estándar, por ejemplo, en términos de masa por volumen.

Las especies de alfa-sinucleína en las muestras se pueden estratificar aún más. Por ejemplo, las especies de oligómeros se pueden dividir en oligómeros de orden inferior, por ejemplo, de 2 a 24 unidades monoméricas, oligómeros de orden superior, por ejemplo, de 24 a 100 unidades monoméricas, o protofibrillas, etc.

2. Beta amiloide

Los oligómeros y los monómeros se pueden distinguir mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Este ensayo se parece a un ELISA tipo sándwich. El monómero Ap contiene un epítopo, mientras que los oligómeros contienen varios de estos epítopos. Por lo tanto, si se usaran anticuerpos superpuestos a epítopos hacia el epítopo único anterior para capturar y detectar anticuerpos, la unión a un epítopo específico y único generaría competencia entre estos dos anticuerpos. En otras palabras, el monómero estaría ocupado por el anticuerpo de captura o de detección pero no por ambos. ("Oligomeric forms of amyloid-p protein in plasma as a potential bloodbased biomarker for Alzheimer's disease", Wang MJ et al. Alzheimer's Res Ther. 15 de diciembre de 2017; 9(1): 98. "Potential fluid biomarkers for pathological brain changes in Alzheimer's disease: Implication for the screening of cognitive frailty", Ruan Q et al., Mol Med Rep. Octubre de 2016; 14(4): 3184-98. "Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloid-p Oligomers in Cerebrospinal Fluid," Schuster J, Funke SA. J Alzheimer's Dis. 7 de mayo de 2016; 53(1): 53-67).

Las formas oligoméricas de beta amiloide para detección incluyen, por ejemplo, 4-24 mer de beta amiloide.

3. Tau

Los oligómeros de tau en fluidos biológicos, por ejemplo, LCR, pueden medirse mediante ELISA y análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-oligómero de tau. (Sengupta U, et al., "Tau oligomers in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease", Ann Clin Transl Neurol. Abril de 2017; 4(4): 226-235.

Los oligómeros de tau para detección incluyen, por ejemplo, oligómeros de bajo peso molecular, por ejemplo, no más de 20 mer, por ejemplo, 3-18 mer. La presencia de oligómeros solubles en el líquido cefalorraquídeo se puede detectar con anticuerpos monoclonales anti-oligómero con transferencia Western y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas tipo sándwich (sELISA). David, MA et al., "Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients", Front Neurol. 2 de diciembre de 2014; 5: 251. Las formas oligoméricas de tau incluyen formas hiperfosforiladas de tau oligomérica.

4. Huntingtina

Estudios de cuantificación recientes han utilizado inmunoensayos basados en TR-FRET. Un método de detección que combina cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) permite la resolución y definición de la formación y agregación de especies mhtt nativas solubles y agregados insolubles en el cerebro. "Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients", Marcellin D. et al., PLoS One. 2012; 7(9): e44457.

Se han utilizado una variedad de técnicas publicadas para analizar especies oligoméricas de huntingtina, incluido, por ejemplo, análisis de electroforesis en gel de agarosa (AGE) (en condiciones nativas o ligeramente desnaturalizantes, SDS al 0.1 % o PAGE azul-nativo en condiciones nativas), que proporciona una serie de oligómeros inmunorreactivos; los anticuerpos anti-huntingtina reconocen diferencialmente oligómeros específicos de Huntingtina.

Se ha desarrollado un inmunoensayo de una sola etapa basado en TR-FRET para cuantificar mHtt soluble y agregado en homogeneizados de células y tejidos (el inmunoensayo dúplex basado en TR-FRET revela una correlación inversa de la Huntingtina mutante soluble y agregada en la enfermedad de Huntington. Baldo B, et al., Chem Biol. 24 de febrero de 2012; 19 (2): 264-75).

Los ensayos basados en transferencia de energía de Forster resuelta en el tiempo (TR-FRET) representan inmunoensayos sensibles, homogéneos y de alto rendimiento ampliamente utilizados para la cuantificación de proteínas de interés. TR-FRET es extremadamente sensible a distancias pequeñas y, por lo tanto, puede proporcionar información conformacional basada en la detección de la exposición y la posición relativa de los epítopos presentes en la proteína diana reconocida por anticuerpos selectivos. Anteriormente hemos informado ensayos TR-FRET para cuantificar proteínas HTT basadas en el uso de anticuerpos específicos para diferentes epítopos HTT del terminal amino (Fodale, V. et al., "Polyglutamine- and temperature-dependent conformational rigidity in mutant huntingtin revealed by immunoassays and circular dichroism spectroscopy", PLoS One. 2 de diciembre de 2014; 9(12): e112262. doi: 10.1371/diario.pone.0112262. eCollection 2014.

C. Aislamiento de exosomas

Los exosomas son vesículas extracelulares que se cree que se liberan de las células tras la fusión de un compartimento endocítico intermedio, el cuerpo multivesicular (MVB), con la membrana plasmática. Las vesículas liberadas en este proceso se denominan exosomas. Se cree que los exosomas contribuyen a la propagación de especies de sinucleína tóxicas entre las neuronas del SNC y hacia el LCR y otros fluidos corporales. Los exosomas suelen estar en el intervalo de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm.

En la técnica se conocen muchos métodos para aislar exosomas. Estos incluyen, por ejemplo, métodos de captura por inmunoafinidad, métodos de aislamiento basados en el tamaño, ultracentrifugación diferencial, precipitación de exosomas y técnicas de aislamiento basadas en microfluidos. Loov C. et al. Cell Neurobiol. 2016 (citado anteriormente).

Los métodos de captura por inmunoafinidad utilizan anticuerpos unidos a una fracción de extracción para unir exosomas y separarlos de otros materiales de la muestra. Un soporte sólido puede ser, por ejemplo, una micropartícula que se puede atraer magnéticamente. Se pueden utilizar inmunoperlas de látex.

En particular, este método es útil para aislar exosomas derivados del SNC usando biomarcadores específicos del cerebro (por ejemplo, marcadores neurales y gliales); uno de esos marcadores es L1CAM. Otro marcador es KCAM. Otras proteínas relativamente específicas del cerebro también pueden servir en esta capacidad. Los exosomas derivados del SNC se caracterizan por marcadores proteicos asociados con el cerebro, incluidos, por ejemplo, KCAM, L1CAM y NCAM (véase, por ejemplo, los documentos US 2017/0014450, US 2017/0102397, US 9,958,460). Los exosomas derivados del SNC se pueden aislar usando métodos de captura por afinidad. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, perlas paramagnéticas unidas a anticuerpos contra marcadores específicos tales como L1 CAM (véase, por ejemplo, Shi et al., "Plasma exosomal a-alphasynuclein is likely CNS-derived and increased in Parkinson's disease", Acta Neuropathol. Noviembre de 2014; 128(5): 639-650).

Qiagen describe su kit exoEasy Maxi como el uso de columnas de centrifugación por afinidad de membrana para aislar eficientemente exosomas y otras vesículas extracelulares del suero, plasma, sobrenadante de cultivos celulares y otros fluidos biológicos.

Los métodos de aislamiento basados en el tamaño incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño y ultrafiltración. En la cromatografía de exclusión por tamaño se utiliza una fase estacionaria porosa para separar los exosomas de acuerdo con su tamaño. En la ultrafiltración, se utiliza un filtro de membrana porosa para dos exosomas separados en función de su tamaño o peso.

La ultracentrifugación diferencial implica una serie de ciclos de centrifugación de diferente fuerza centrífuga y duración para aislar los exosomas en función de su densidad y diferencias de tamaño con respecto a otros componentes de una muestra. La fuerza centrífuga puede ser, por ejemplo, de ~100,000 a 120,000 * g. Se pueden utilizar inhibidores de proteasa para prevenir la degradación de proteínas. Se puede utilizar una etapa de limpieza previa para eliminar otros materiales grandes de la muestra.

Los exosomas se pueden aislar de soluciones de materiales biológicos alterando su solubilidad o dispersabilidad. Por ejemplo, se puede utilizar la adición de polímeros tales como polietilenglicol (PEG), por ejemplo, con un peso molecular de 8000 Da, para precipitar exosomas de la solución.

Se pueden utilizar métodos basados en microfluidos para aislar exosomas. Estos incluyen, por ejemplo, métodos acústicos, electroforéticos y electromagnéticos. Por ejemplo, un nanofiltro acústico utiliza ondas estacionarias de ultrasonido para separar los exosomas en una muestra de acuerdo con su tamaño y densidad.

Otros métodos para aislar exosomas derivados del SNC se describen, por ejemplo, en Kanninnen, KM et al., "Exosomes as new diagnostic tools in CNS diseases", Biochimica et Biophysica Acta, 1862 (2016) 403-410.

Muchas proteínas, como la alfa sinucleína, relacionada con la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas humanas, se generan fuera del SNC y dentro del cerebro y pueden unirse a la superficie externa de los exosomas que atraviesan la barrera hematoencefálica hacia la circulación periférica. Por consiguiente, en determinadas realizaciones de los métodos divulgados en el presente documento, se trata una fracción exosomal para eliminar las moléculas unidas a la superficie exosomal. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante procedimientos de lavado rigurosos, tal como con una solución tampón de fosfato (PBS). Después de dicho procesamiento, el contenido del exosoma puede procesarse para el ensayo.

III. Determinación del diagnóstico, estadio, progresión, pronóstico y riesgo de desarrollo de afecciones neurodegenerativas

Perfiles de biomarcadores que comprenden cantidades de formas oligoméricas y, opcionalmente, monoméricas de un biomarcador de proteína neurodegenerativa (por ejemplo, cantidades de especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta-amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, hiperfosforilada y, opcionalmente, monomérica; y Huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica) en una muestra biológica, y un cambio en los perfiles a lo largo del tiempo, indican la presencia, gravedad y dirección de afecciones neurogenerativas del tipo neurodegenerativo. En particular, las proporciones anormales, por ejemplo, cantidades elevadas, del biomarcador proteico descrito en el presente documento indican un proceso de neurodegeneración. Este proceso, si no se controla, puede provocar síntomas manifiestos en condiciones sinucleopáticas. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para determinar en un sujeto (por ejemplo, en individuos sintomáticos o asintomáticos) un diagnóstico, estadio, progresión, tasa, pronóstico, capacidad de respuesta al fármaco y riesgo de desarrollar una afección neurodegenerativa caracterizada por cantidades anormales de proteína agregada por ejemplo, alfa-sinucleína, beta amiloide, tau o Huntingtina (cada uno de ellos, denominado en el presente documento un "estado neuropático", por ejemplo, "estado sinucleinopático", "estado amiloidopático", "estado tauopático", "estado de Huntington").

Como se usa en el presente documento, el término "diagnóstico" se refiere a una clasificación de un individuo de acuerdo con que tenga o no una afección patógena particular, incluyendo, por ejemplo, el estadio de esa afección.

Como se utiliza en el presente documento, el término "clínicamente similar pero etiológicamente diferente" se refiere a afecciones que comparten signos y/o síntomas clínicos pero que surgen de diferentes causas biológicas.

Como se utiliza en el presente documento, el término "estadio" se refiere al grado relativo de gravedad de una afección, por ejemplo, enfermedad sospechada, una etapa temprana, una etapa intermedia o una etapa avanzada. La estadificación se puede utilizar para agrupar a los pacientes de acuerdo con su etiología, fisiopatología, gravedad, etc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "progresión" se refiere a un cambio, o la falta del mismo, en el estadio o la gravedad de una afección a lo largo del tiempo. Esto incluye un aumento, una disminución o una estasis en la gravedad de la afección. En determinadas realizaciones, se miden tasas de progresión, es decir, cambios a lo largo del tiempo.

Como se utiliza en el presente documento, el término "pronóstico" se refiere al curso previsto, por ejemplo, la probabilidad de progresión, de la afección. Por ejemplo, un pronóstico puede incluir una predicción de que es probable que la gravedad de la afección aumente, disminuya o permanezca igual en algún momento futuro. En el contexto de la presente divulgación, pronóstico puede referirse a la probabilidad de que un individuo: (1) desarrollará una afección neurodegenerativa, (2) progresará de una estadio a otro más avanzado, a otro estadio más avanzado de la afección, (3) exhibirá una disminución en la gravedad de la afección, (4) exhibirá un deterioro funcional a un cierta tasa, (5) sobrevivirá con una afección durante un cierto período de tiempo (por ejemplo, tasa de supervivencia) o (6) la afección recurrirá. La afección puede ser una afección sinucleopática (por ejemplo, EP, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica o alguna sinucleinopatía relacionada), una afección amiloidopática (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), una afección tauopática (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) y la enfermedad de Huntington. Estos términos no pretenden ser absolutos, como apreciará cualquier experto en el campo del diagnóstico médico.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "riesgo de desarrollar" se refiere a la probabilidad de que un individuo asintomático o preclínico desarrolle un diagnóstico definitivo de enfermedad. La determinación de la probabilidad incluye probabilidades tanto precisas como relativas, tal como "más probable que no", "muy probable", "improbable" o un porcentaje de probabilidad, por ejemplo, "90 %". El riesgo se puede comparar con la población general o con una población emparejada con el sujeto en función de cualquiera de los factores de riesgo ambiental, edad, sexo y riesgo genético. En tal caso, se puede determinar que un sujeto tiene un riesgo mayor o menor en comparación con otros miembros de la población.

En general, cantidades relativas crecientes de proteínas neurodegenerativas oligoméricas a monoméricas, como alfasinucleína, beta amiloide, tau y Huntingtina, se correlacionan con procesos neurodegenerativos, presencia de enfermedades, estadios más avanzados de la enfermedad, progresión a una etapa más grave, peor pronóstico, mayor riesgo de desarrollar una enfermedad o la ineficacia de una intervención terapéutica experimental. En determinadas realizaciones, se prefiere medir la alfa-sinucleína de exosomas derivados del SNC en sangre periférica. Por ejemplo, un aumento en las cantidades relativas de formas oligoméricas a monoméricas de al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 250 %, al menos un 500 % o al menos un 1000 % en comparación con lo normal indica una condición anormal, como la presencia de una enfermedad.

IV. Modelado de perfiles de especies de proteínas neurodegenerativas para inferir diagnóstico, estadio, progresión, pronóstico y riesgo de desarrollo de afecciones neurodegenerativas

La determinación del diagnóstico, estadio, progresión, pronóstico y riesgo de una afección neurodegenerativa son procesos de clasificación de un sujeto en diferentes afecciones o diferentes clases o afecciones dentro de un estado, tal como enfermedad/salud (diagnóstico), estadio I/estadio II/estadio III (estadio), con probabilidad de remisión/probable de progresar (pronóstico) o asignar una puntuación en un intervalo. Los métodos de clasificación que utilizan perfiles de biomarcadores pueden implicar identificar perfiles que son característicos de varios estados y correlacionar un perfil de un sujeto con una clase o estado. La identificación de dichos perfiles puede implicar el análisis de perfiles de biomarcadores de sujetos que pertenecen a diferentes estados y discernir patrones o diferencias entre los perfiles. El análisis se puede realizar mediante examen visual de los perfiles o mediante análisis estadístico.

A. Análisis estadístico

Normalmente, el análisis implica el análisis estadístico de un número suficientemente grande de muestras para proporcionar resultados estadísticamente significativos. Para este fin se puede utilizar cualquier método estadístico conocido en la técnica. Dichos métodos o herramientas incluyen, entre otros, correlacional, correlación de Pearson, correlación de Spearman, chi cuadrado, comparación de medias (por ejemplo, prueba T pareada, prueba T independiente, ANOVA), análisis de regresión (por ejemplo, regresión simple, regresión múltiple, regresión lineal, regresión no lineal, regresión logística, regresión polinómica, regresión por pasos, regresión de cresta, regresión de lazo, regresión de elasticnet) o análisis no paramétrico (por ejemplo, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, prueba de rangos de signos de Wilcoxon, prueba de signos). Estas herramientas se incluyen en paquetes estadísticos disponibles comercialmente, tales como MATLAB, JMP Statistical Software y SAS. Dichos métodos producen modelos o clasificadores que se pueden utilizar para clasificar un perfil de biomarcador particular en un estado particular.

El análisis estadístico puede ser implementado por el operador o mediante aprendizaje automático.

B. Aprendizaje automático

En determinadas realizaciones, el análisis estadístico se mejora mediante el uso de herramientas de aprendizaje automático. Estas herramientas emplean algoritmos de aprendizaje, en los que la variable o variables relevantes se miden en los diferentes estados posibles, y se determinan y utilizan patrones que diferencian los estados para clasificar un sujeto de prueba. En consecuencia, cualquier método de clasificación de esta divulgación puede desarrollarse comparando mediciones de una o más variables en sujetos que pertenecen a diversas afecciones dentro de un estado sinucleinopático particular. Esto incluye, por ejemplo, determinar un perfil de biomarcadores que comprende cantidades de una o más formas de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, alfa-sinucleína monomérica en sujetos con diversos diagnósticos o en diversas etapas en diversos momentos para permitir la predicción del diagnóstico, etapa, progresión, pronóstico, capacidad de respuesta al fármaco o riesgo. También se pueden incluir otras variables, como antecedentes familiares, estilo de vida, exposición a sustancias químicas, diversos rasgos fenotípicos, etc.

1. Conjunto de datos de entrenamiento

Un conjunto de datos de entrenamiento es un conjunto de datos que normalmente comprende un vector de valores para cada una de una pluralidad de características para cada uno de una pluralidad de sujetos (más generalmente denominados objetos). Una de las características puede ser una clasificación del sujeto, por ejemplo, un diagnóstico o una medida de un grado en una escala. Esto se puede utilizar en métodos de aprendizaje supervisado. Otras características pueden ser, por ejemplo, cantidades medidas de cada una de una pluralidad de formas diferentes de una proteína neurodegenerativa. Las diferentes formas incluirán una pluralidad de especies diferentes que incluyen, por ejemplo, una o una pluralidad de formas oligoméricas y, opcionalmente, una o una pluralidad de formas monoméricas. Normalmente, las características incluirán una pluralidad de formas oligoméricas diferentes y, opcionalmente, una o más formas monoméricas. Así, por ejemplo, un vector para un sujeto individual puede incluir un diagnóstico de una afección neurodegenerativa (por ejemplo, diagnosticado o no con enfermedad de Parkinson) y mediciones de una pluralidad de formas seleccionadas entre alfa sinucleína monomérica, alfa sinucleína dimérica, alfa sinucleína trimérica, alfa sinucleína tetramérica, ... alfa sinucleína de 28 mer, alfa sinucleína de 29 mery alfa sinucleína de 30 mer. En otras realizaciones, las formas son colecciones de especies, tales como especies de alfa-sinucleína de peso molecular relativamente bajo. En determinadas realizaciones, el conjunto de datos de entrenamiento utilizado para generar el clasificador comprende datos de al menos 100, al menos 200 o al menos 400 sujetos diferentes. La proporción de sujetos clasificados que tienen versus los que no tienen la afección puede ser al menos 2:1, al menos 1:1 o al menos 1:2. Alternativamente, los sujetos preclasificados como que padecen la afección no pueden comprender más del 66 %, no más del 50 %, no más del 33 % o no más del 20 % de los sujetos.

2. Algoritmos de aprendizaje

Los algoritmos de aprendizaje, también denominados algoritmos de aprendizaje automático, son algoritmos ejecutados por ordenador que automatizan la construcción de modelos analíticos, por ejemplo, para agolpamiento, clasificación o reconocimiento de perfiles. Los algoritmos de aprendizaje realizan análisis de los conjuntos de datos de entrenamiento proporcionados al algoritmo.

Los algoritmos de aprendizaje generan un modelo, también conocido como clasificador, algoritmo de clasificación o algoritmo de diagnóstico. Los modelos reciben, como entrada, datos de prueba y producen, como salida, una inferencia o una clasificación de los datos de entrada como pertenecientes a una u otra clase, grupo o posición en una escala, tal como diagnóstico, estadio, pronóstico, progresión de la enfermedad, capacidad de respuesta a un medicamento, etc.

Se puede utilizar una variedad de algoritmos de aprendizaje automático para inferir una condición o estado de un sujeto. Los algoritmos de aprendizaje automático pueden ser supervisados o no supervisados. Los algoritmos de aprendizaje incluyen, por ejemplo, redes neuronales artificiales (por ejemplo, redes de retropropagación), análisis discriminantes (por ejemplo, clasificador bayesiano o análisis de Fischer), máquinas de vectores de soporte, árboles de decisión (por ejemplo, procesos de partición recursivos como CART, árboles de clasificación y regresión), bosques aleatorios, clasificadores lineales (por ejemplo, regresión lineal múltiple (RLM), regresión de mínimos cuadrados parciales (MCP) y regresión de componentes principales (RCP)), agrupamiento jerárquico y análisis de conglomerados. El algoritmo de aprendizaje generará un modelo o clasificador que se puede utilizar para hacer una inferencia, por ejemplo, una inferencia sobre el estado de enfermedad de un sujeto.

3. Validación

Un modelo puede validarse posteriormente utilizando un conjunto de datos de validación. Los conjuntos de datos de validación suelen incluir datos sobre las mismas características que el conjunto de datos de entrenamiento. El modelo se ejecuta en el conjunto de datos de entrenamiento y se determina el número de verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos y falsos negativos, como medida del rendimiento del modelo.

Luego, el modelo se puede probar en un conjunto de datos de validación para determinar su utilidad. Normalmente, un algoritmo de aprendizaje generará una pluralidad de modelos. En determinadas realizaciones, los modelos pueden validarse basándose en la fidelidad a las medidas clínicas estándar utilizadas para diagnosticar la afección bajo consideración. Se pueden seleccionar uno o más de estos en función de sus características de rendimiento.

C. Ordenadores

La clasificación de la condición de un sujeto basada en cualquiera de los estados descritos en el presente documento se puede realizar mediante un ordenador digital programable. El ordenador puede incluir una memoria tangible que recibe y, opcionalmente, almacena al menos mediciones de una o una pluralidad de formas oligoméricas y, opcionalmente, formas monoméricas del biomarcador proteico (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; amiloide beta oligomérico y, opcionalmente monomérico, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y Huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica), en un sujeto y un procesador que procesa estos datos mediante la ejecución de un código que incorpora un algoritmo de clasificación. El algoritmo de clasificación puede ser el resultado de un análisis estadístico implementado por el operador o por el aprendizaje automático.

Un sistema comprende un primer ordenador como se describe en comunicación con una red de comunicaciones configurada para transmitir datos al ordenador y/o transmitir resultados de una prueba, tal como una clasificación como se describe en el presente documento a un ordenador remoto. La red de comunicaciones puede utilizar, por ejemplo, una red de transmisión de alta velocidad que incluye, entre otras, línea de abonado digital (LAD), módem por cable, fibra, tecnología inalámbrica, satélite y banda ancha a través de líneas eléctricas (BLE). El sistema puede comprender además un ordenador remoto conectado a través de la red de comunicaciones al primer ordenador.

D. Ejecución del modelo y realización de una inferencia

El modelo seleccionado puede ser el resultado de un análisis estadístico ejecutado por el operador o del aprendizaje automático. En cualquier caso, el modelo se puede utilizar para hacer inferencias (por ejemplo, predicciones) sobre un sujeto de prueba. Se puede generar un perfil de biomarcador, por ejemplo en forma de un conjunto de datos de prueba, por ejemplo, que comprende un vector, que contiene valores de características utilizadas por el modelo, a partir de una muestra tomada del sujeto de prueba. El conjunto de datos de prueba puede incluir las mismas funciones utilizadas en el conjunto de datos de entrenamiento o un subconjunto de estas características. Luego, el modelo se aplica o ejecuta en el conjunto de datos de prueba. Correlacionar un perfil de proteína neurodegenerativa con una afección, estado de enfermedad, pronóstico, riesgo de progresión, probabilidad de respuesta al fármaco, etc. es una forma de ejecutar un modelo. La correlación puede ser realizada por una persona o por una máquina. La elección puede depender de la complejidad de la operación de correlación. Esto produce una inferencia, por ejemplo, una clasificación de un sujeto como perteneciente a una clase o grupo (como un diagnóstico), o un lugar en una escala (como la probabilidad de responder a una intervención terapéutica).

En determinadas realizaciones, el clasificador incluirá una pluralidad de formas de proteínas oligoméricas y, normalmente, pero no necesariamente, una o más formas monoméricas de la proteína neurodegenerativa. El clasificador puede ser o no un modelo lineal, por ejemplo, de la forma AX BY CZ = N, en el que A, B y C son cantidades medidas de las formas X, Y y Z. El clasificador puede requerir, por ejemplo, análisis automático de vectores de soporte. Por ejemplo, el modelo de inferencia puede realizar un reconocimiento de patrones en el que un perfil de biomarcador se encuentra en una escala entre normal y anormal, con varios perfiles tendiendo más hacia lo normal o hacia lo anormal. Por lo tanto, el clasificador puede indicar un nivel de confianza de que el perfil es normal o anormal.

El clasificador o modelo puede generar, a partir de una o varias formas medidas, un único número de diagnóstico que funciona como modelo. Clasificar un estado neuropatológico, por ejemplo, estado sinucleopático (por ejemplo, diagnóstico, estadio, progresión, pronóstico y riesgo) puede implicar determinar si el número de diagnóstico está por encima o por debajo de un umbral ("nivel de diagnóstico"). Por ejemplo, el número de diagnóstico puede ser una cantidad relativa de proteína neurodegenerativa oligomérica (por ejemplo, alfa-sinucleína) con respecto a proteína neurodegenerativa monomérica (por ejemplo, alfa-sinucleína) (incluyendo la medición de especies específicas o formas fosforiladas de cada una). Ese umbral se puede determinar, por ejemplo, basándose en una cierta desviación del número de diagnóstico por encima de los individuos normales que están libres de cualquier signo de una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, sinucleopática. Se puede determinar una medida de tendencia central, como la media, la mediana o la moda, de los números de diagnóstico en un número estadísticamente significativo de individuos normales y anormales. Se puede seleccionar un límite por encima de cantidades normales como nivel de diagnóstico de una afección neurodegenerativa, por ejemplo, sinucleinopática. Ese número puede ser, por ejemplo, un cierto grado de desviación de la medida de tendencia central, como la varianza o la desviación estándar. En una realización, la medida de la desviación es una puntuación Z o número de desviaciones estándar del promedio normal. En determinadas realizaciones, una cantidad de alfa-sinucleína oligomérica con respecto a alfa-sinucleína monomérica superior a 1.5:1, 2:1, 5:1 o 10:1 indica la presencia o un mayor riesgo de manifestar una afección neurodegenerativa, por ejemplo, sinucleopática.

El modelo puede seleccionarse para proporcionar un nivel deseado de sensibilidad, especificidad o poder predictivo positivo. Por ejemplo, el nivel de diagnóstico puede proporcionar una sensibilidad de al menos cualquiera del 80 %, 90 %, 95 % o 98 % y/o una especificidad de al menos cualquiera del 80 %, 90 %, 95 % o 98 % y/o o un valor predictivo positivo de al menos cualquiera de 80 %, 90 %, 95 % o 98 %. La sensibilidad de una prueba es el porcentaje de positivos reales que dan positivo. La especificidad de una prueba es el porcentaje de negativos reales que dan negativo. El valor predictivo positivo de una prueba es la probabilidad de que un sujeto que da positivo sea realmente positivo.

V. Desarrollo de intervenciones terapéuticas para tratar afecciones neurodegenerativas

En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para permitir el desarrollo práctico de intervenciones terapéuticas para afecciones neurodegenerativas, por ejemplo, afecciones sinucleopáticas, afecciones amiloidopáticas, afecciones tauopáticas y enfermedad de Huntington. Los métodos implican, entre otras cosas, seleccionar sujetos para ensayos clínicos y determinar la eficacia de la intervención terapéutica en un conjunto de sujetos.

Los métodos que comprenden monitorear los perfiles de biomarcadores de proteínas neurodegenerativas (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta-amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica) son útiles para determinar si una intervención terapéutica experimental es eficaz para prevenir el inicio clínico o inhibir la progresión posterior de una sinucleinopatía, o si un sujeto debe participar en un ensayo clínico para probar la eficacia de un fármaco candidato para tratar dichas afecciones. Perfiles de biomarcadores o cambios en los perfiles de biomarcadores de la proteína neurodegenerativa (por ejemplo, cantidades relativas o tasas de cambio en cantidades relativas de formas oligoméricas y monoméricas del biomarcador proteico (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y monomérica; beta-amiloide oligomérica y monomérica, tau oligomérica y monomérica, y Huntingtina oligomérica y monomérica) permiten la determinación directa de los efectos del tratamiento sobre la afección, incluyendo, por ejemplo, el proceso básico de la enfermedad.

A. Inscripción de sujetos

Los ensayos clínicos implican la inscripción de sujetos para probar la eficacia y seguridad de una posible intervención terapéutica, tal como una farmacéutica. Normalmente, los sujetos se seleccionan para que tengan diferentes condiciones de un estado, por ejemplo, sujetos con o sin diagnóstico de enfermedad o en diferentes etapas de la enfermedad o diferentes subtipos de enfermedad o pronóstico diferente. Los sujetos de los ensayos clínicos se pueden estratificar en diferentes grupos para recibir el mismo tratamiento o un tratamiento diferente. La estratificación puede basarse en varios factores, incluido el estadio de la enfermedad. La estadificación de la enfermedad es un sistema de clasificación que utiliza hallazgos diagnósticos para producir grupos de pacientes en función de factores como la etiología, la fisiopatología y la gravedad. Puede servir como base para agrupar pacientes clínicamente homogéneos para evaluar la calidad de la atención, el análisis de los resultados clínicos, la utilización de recursos y la eficacia de tratamientos alternativos.

En un método, los posibles sujetos de ensayo clínico se estratifican al menos en parte en perfiles de biomarcadores de formas oligoméricas y, opcionalmente, monoméricas del biomarcador proteico (por ejemplo, especies de alfasinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta-amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica). Así, por ejemplo, los sujetos que tienen diferentes perfiles de biomarcadores (por ejemplo, cantidades relativas mayores y menores) pueden asignarse a diferentes grupos.

La población de sujetos en un ensayo clínico debería ser suficiente para mostrar si el fármaco produce una diferencia estadísticamente significativa en el resultado. Dependiendo de este nivel de potencia, el número de individuos en el ensayo puede ser de al menos 20, al menos 100 o al menos 500 sujetos. Entre estos, debe haber un número significativo de individuos que exhiban un perfil de biomarcadores consistente con tener la afección neurodegenerativa (por ejemplo, un nivel aumentado del biomarcador de sinucleína, es decir, nivel relativo de alfa-sinucleína oligomérica con respecto a monomérica). Por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 35 %, al menos el 50 % o al menos el 66 % de los sujetos pueden tener inicialmente dicho perfil de biomarcadores (que comprende, por ejemplo, diversas especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica); beta amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica). Además, un número significativo de sujetos se dividirán entre estados de clase. Por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 35 %, al menos el 50 %, al menos el 66 % o el 100 % de los sujetos pueden tener inicialmente un diagnóstico de una afección neurodegenerativa (por ejemplo, afección sinucleopática (por ejemplo, EP), afección amiloidopática, afección tauopática y enfermedad de Huntington).

B. Desarrollo de fármacos

Al comenzar el ensayo clínico, la eficacia de la intervención terapéutica en los diferentes grupos de estratificación se puede determinar rápidamente en función del efecto sobre el perfil de biomarcadores de la proteína neurodegenerativa (por ejemplo, perfiles de especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica); beta amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica). Más específicamente, un cambio en el perfil de biomarcadores de las formas oligoméricas y, opcionalmente, monoméricas de la proteína predice la eficacia clínica de la intervención terapéutica. Los métodos generalmente implican en primer lugar probar individuos para determinar el perfil de biomarcador que comprende formas oligoméricas y, opcionalmente, monoméricas del biomarcador proteico (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica). Después de las mediciones, la intervención terapéutica, por ejemplo, un fármaco experimental, se administra al menos a un subconjunto de los sujetos. Normalmente, al menos un subconjunto de sujetos recibe un placebo o ningún tratamiento. En algunos casos, los sujetos sirven como sus propios controles, recibiendo primero un placebo y luego la intervención experimental, o al revés, para comparar. En ciertos casos, esto se puede hacer junto con la administración de formas de tratamiento ya reconocidas. La población se puede dividir en términos de dosis, momento y velocidad de administración de la intervención terapéutica. Las consideraciones éticas pueden requerir detener un estudio cuando se observa una mejora estadísticamente significativa en los sujetos de prueba. Como se usan en el presente documento, "fármaco experimental" y "fármaco candidato" se refieren a un agente que tiene o se está probando para determinar un efecto terapéutico. Un "supuesto agente neuroprotector" se refiere a un agente que tiene o se está probando que tiene acción neuroprotectora.

Después de la administración de la intervención terapéutica, se determina nuevamente el perfil de biomarcadores.

La intervención terapéutica puede ser la administración de un fármaco candidato. Utilizando métodos estadísticos estándar, se puede determinar si la intervención terapéutica ha tenido un impacto significativo en el perfil del biomarcador que comprende formas oligoméricas y, opcionalmente, monoméricas del biomarcador proteico (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica). En general, un cambio estadísticamente significativo, especialmente un cambio hacia un perfil normal, en comparación con el perfil inicial de biomarcadores indica que la intervención terapéutica es neuroprotectora y, por lo tanto, retrasará el inicio clínico, o ralentizará o preferiblemente revertirá la progresión de la afección neurodegenerativa (por ejemplo, afección sinucleopática, afección amiloidopática, afección tauopática, enfermedad de Huntington.

Por consiguiente, los sujetos para quienes un perfil de biomarcador que comprende formas oligoméricas a monoméricas de la proteína (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; beta amiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica) (alternativamente, formas oligoméricas y totales de la proteína) que se pueden medir incluyen, por ejemplo: (1) Sujetos asintomáticos de una afección neurodegenerativa (por ejemplo, afección sinucleopática, afección amiloidopática, afección tauopática, enfermedad de Huntington); (2) sujetos que tienen síntomas mínimos de enfermedad neurodegenerativa y ningún signo que sugiera una afección neurodegenerativa (por ejemplo, a quienes se les puede diagnosticar una afección neurodegenerativa "sospechosa" o "preclínica", especialmente cuando se han identificado ciertos factores de riesgo genéticos y/o ambientales); (3) sujetos que tienen el diagnóstico de una afección neurodegenerativa "probable" y sujetos diagnosticados ("diagnóstico definitivo") con una afección neurodegenerativa. Estos incluyen, por ejemplo, (1) sujetos que son asintomáticos para una afección sinucleopática, (2) sujetos que tienen síntomas parkinsonianos mínimos y ningún signo que sugiera una afección sinucleinopática (por ejemplo, a quienes se les puede diagnosticar "sospechoso" o "preclínico" para EP o alguna sinucleinopatía relacionada, especialmente cuando se han identificado ciertos factores de riesgo genéticos y/o ambientales); (3) sujetos que tienen el diagnóstico de sinucleinopatía "probable" (por ejemplo, EP) y sujetos diagnosticados ("diagnóstico definitivo") con una afección sinucleinopática.

Los sujetos son típicamente humanos, pero también incluyen animales no humanos, por ejemplo, los utilizados como modelos para la Ep, como roedores (por ejemplo, ratones y ratas), gatos, perros, otros cuadrúpedos domesticados (como caballos, ovejas y cerdos) y primates no humanos (por ejemplo, monos). Los modelos animales incluyen tanto modelos genéticos como modelos basados en la administración de neurotoxinas. Las neurotoxinas utilizadas en tales modelos incluyen, por ejemplo, la administración de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y 1-metil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), y paraquat y rotenona. Los modelos genéticos incluyen mutaciones genéticas en SNCA (a-syn, PARK1 y 4), PRKN (proteína ubiquitina ligasa parkin RBR E3, PARK₂), PINK1 (quinasa 1 supuestamente inducida por PTEN, PARK6), DJ-1 (PARK7) y LRRK₂ (quinasa repetida 2 rica en leucina, PARK8).

Los ensayos clínicos de terapias neuroprotectoras para afecciones neurodegenerativas, como las sinucleinopatías, requieren medidas que indiquen rápidamente la eficacia de la terapia potencial. De lo contrario, la determinación de la eficacia de un fármaco basada en observaciones clínicas normalmente lleva muchos meses. Los perfiles de biomarcadores que comprenden oligómeros de proteínas neurodegenerativas y, opcionalmente, monómeros proporcionan dichas medidas, lo que permite la evaluación práctica de la eficacia de los fármacos modificadores de enfermedades en sujetos que padecen trastornos cerebrales mortales como la EP

VI. Métodos de tratamiento (no reivindicados)

Dependiendo del estadio o clase de afección neurodegenerativa (por ejemplo, afección sinucleopática, afección amiloidopática, afección tauopática, enfermedad de Huntington) en la que se clasifica un sujeto en función del perfil de biomarcadores como se describe en el presente documento, un sujeto puede necesitar una intervención terapéutica. Se proporcionan en el presente documento métodos para tratar a un sujeto determinado (no reivindicado), mediante los métodos divulgados en el presente documento, que presenta una afección neurodegenerativa (por ejemplo, una afección sinucleopática y una afección amiloidopática, una afección tauopática, enfermedad de Huntington) con una intervención terapéutica eficaz para tratar la afección. Intervenciones terapéuticas que cambian y especialmente aquellas que reducen la cantidad de la forma oligomérica del biomarcador proteico a la forma monomérica del biomarcador proteico (por ejemplo, alfa-sinucleína oligomérica y monomérica; beta amiloide oligomérica y monomérica, tau oligomérica y monomérica; y Huntingtina oligomérica y monomérica), reflejan un tratamiento eficaz, por ejemplo, una intervención terapéutica desarrollada mediante los métodos del presente documento y clínicamente validada.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "intervención terapéutica", "terapia" y "tratamiento" se refieren a una intervención que produce un efecto terapéutico (por ejemplo, es "terapéuticamente eficaz"). Las intervenciones terapéuticamente efectivas previenen, retardan la progresión, retrasan la aparición de los síntomas, mejoran la afección (por ejemplo, causan la remisión), mejoran los síntomas o curan una enfermedad, tal como una afección sinucleinopática. Una intervención terapéutica puede incluir, por ejemplo, la administración de un tratamiento, la administración de una sustancia farmacéutica o biológica o nutracéutica con intención terapéutica. La respuesta a una intervención terapéutica puede ser completa o parcial. En algunos aspectos, la gravedad de la enfermedad se reduce en al menos un 10 %, en comparación, por ejemplo, con el individuo antes de la administración o con un individuo de control que no está recibiendo tratamiento. En algunos aspectos, la gravedad de la enfermedad se reduce al menos en un 25 %, 50 %, 75 %, 80 % o 90 % o, en algunos casos, ya no es detectable utilizando técnicas de diagnóstico estándar. Reconociendo que ciertos subgrupos de sujetos pueden no responder a una terapia, una medida de efectividad terapéutica puede ser la efectividad para al menos el 90 % de los sujetos sometidos a la intervención sobre al menos 100 sujetos.

Como se usa en el presente documento, el término "eficaz" como modificación de una intervención terapéutica ("tratamiento eficaz" o "tratamiento eficaz para") o cantidad de un fármaco ("cantidad eficaz"), se refiere a ese tratamiento o cantidad para mejorar un trastorno, como se describió anteriormente. Por ejemplo, para el parámetro dado, una cantidad terapéuticamente eficaz mostrará un aumento o disminución en el parámetro de al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 % o al menos 100 %. La eficacia terapéutica también se puede expresar como "veces" que aumenta o disminuye. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener al menos un efecto de 1.2 veces, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces o más sobre un control. Actualmente, la eficacia clínica contra la gravedad de los síntomas motores en un sujeto parkinsoniano se puede medir utilizando escalas estandarizadas como la UPDRS y la escala de Hoehn y Yahr; para síntomas metálicos y cognitivos, las escalas ADAS-cog o MMPI. (Se reconoce que la utilidad de tales escalas no depende necesariamente del tipo o naturaleza de la enfermedad subyacente).

Por lo tanto, de acuerdo con algunos métodos, primero se analiza a un sujeto para determinar el perfil de biomarcadores que comprende formas oligoméricas y/o monoméricas de proteínas neurodegenerativas en una muestra biológica del sujeto. Se determina una clasificación en una afección o clase apropiada en función del perfil de biomarcadores. Basándose en la clasificación, se puede tomar una decisión con respecto al tipo, cantidad, vía y momento de administración de una intervención terapéutica óptimamente eficaz al sujeto.

A. Afección sinucleinopática

Una intervención terapéutica modificadora de los síntomas para la EP (es decir, un tratamiento sintomático o paliativo) puede comprender la administración de un fármaco seleccionado entre un agonista de la dopamina (por ejemplo, pramipexol (por ejemplo, Mirapex), ropinirol (por ejemplo, Requip), rotigotina (por ejemplo, Neupro) , apomorfina (por ejemplo, Apokyn)), levodopa, carbidopa-levodopa (por ejemplo, Rytary, Sinemet), un inhibidor de la MAO-B (por ejemplo, selegilina (por ejemplo, Eldepryl, Zelapar) o rasagilina (por ejemplo, Azilect)), un inhibidor de la catecol-O-metiltransferasa (COMT) (por ejemplo, entacapona (Comtan) o tolcapona (Tasmar)), un anticolinérgico (por ejemplo, benzotropina (por ejemplo, Cogentina) o trihexifenidilo), amantadina o un inhibidor de la colinesterasa (por ejemplo, rivastigmina (Exelon)) o algún agente o grupo de agentes similar (no reivindicados).

Una intervención terapéutica neuroprotectora o modificadora de la enfermedad para la EP puede comprender la administración de un fármaco supuestamente modificador de la enfermedad como se describe en cualquiera de las siguientes solicitudes de patente provisionales: número de serie 62/477,187, presentada el 27 de marzo de 2017; número de serie 62/483,555, presentada el 10 de abril de 2017; número de serie 62/485,082, presentada el 13 de abril de 2017; número de serie 62/511,424, presentada el 26 de mayo de 2017; número de serie 62/528,228, presentada el 3 de julio de 2017; número de serie 62/489,016, presentada el 24 de abril de 2017; número de serie 62/527,215, presentada el 30 de junio de 2017.

B. Afección amiloidopática

Una intervención terapéutica que modifica los síntomas para una afección amiloidopática (es decir, un tratamiento sintomático o paliativo) puede comprender la administración de un fármaco tal como Razadyne^® (galantamina), Exelon^® (rivastigmina) y Aricept^® (donepezilo) (no reivindicado).

C. Afección Tauopática

Una intervención terapéutica que modifica los síntomas para una afección tauopática (es decir, un tratamiento sintomático o paliativo) puede comprender la administración de un fármaco tal como Razadyne^® (galantamina), Exelon^® (rivastigmina) y Aricept^® (donepezilo) o los citados en el presente documento utilizados para el tratamiento sintomático de la EP (no reivindicados).

D. Enfermedad de Huntington

Una intervención terapéutica modificadora de síntomas para la enfermedad de Huntington (es decir, un tratamiento sintomático o paliativo) puede comprender la administración de un fármaco tal como tetrabenazina (Austedo^® (deutetrabenazina),IONIS-HTT^Rx, así como diversos neurolépticos y benzodiazepinas (no reivindicados).

VII. Métodos para evaluar la capacidad de respuesta a las intervenciones terapéuticas

En un sujeto que padece un trastorno neurodegenerativo (por ejemplo, una afección sinucleopática, una afección amiloidopática, una afección tauopática, enfermedad de Huntington) la eficacia de una intervención terapéutica o la capacidad de respuesta del sujeto a la intervención terapéutica se puede determinar evaluando el efecto de la intervención terapéutica sobre el perfil de biomarcadores. Esto incluye la eficacia en cualquier estado neurodegenerativo, por ejemplo, diagnóstico, estadio, progresión, pronóstico y riesgo. Un cambio en el perfil del biomarcador hacia un perfil más normal indica la eficacia de la intervención terapéutica.

El uso de perfiles de biomarcadores que comprenden formas oligoméricas y, opcionalmente, monoméricas de un biomarcador proteico (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica; betaamiloide oligomérica y, opcionalmente, monomérica, tau oligomérica y, opcionalmente, monomérica; y huntingtina oligomérica y, opcionalmente, monomérica), confiere ventajas sobre los medios convencionales (por ejemplo, cambios en la sintomatología, escalas funcionales o exploraciones radiológicas) para juzgar la eficacia del tratamiento en tales situaciones. Estos medios convencionales para juzgar la eficacia no sólo son insensibles, inexactos y semicuantitativos, sino que normalmente requieren largos períodos (por ejemplo, años) antes de alcanzar la magnitud suficiente para medir con precisión. En consecuencia, el número de tratamientos potencialmente útiles probados se reduce significativamente y el gasto de los ensayos clínicos y, por lo tanto, el coste final de los medicamentos útiles aumenta sustancialmente.

En determinadas realizaciones, el perfil de biomarcadores de las especies de biomarcadores proteicos (por ejemplo, alfa-sinucleína, beta amiloide, tau o Huntingtina) se miden una pluralidad de veces, normalmente, antes, durante y después de la administración de la intervención terapéutica o en una pluralidad de momentos posteriores a la intervención terapéutica.

VIII. Kits (no reivindicados)

En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento kits para detectar biomarcadores de proteínas oligoméricas y monoméricas (por ejemplo, especies de alfa-sinucleína oligomérica y monomérica; beta amiloide oligomérica y monomérica, tau oligomérica y monomérica; y huntingtina oligomérica y monomérica), e interpretar los resultados así obtenidos. Los kits pueden comprender recipientes para contener reactivos para aislar exosomas de un fluido corporal, reactivos para exosomas derivados del SNC preferentemente aislados de todos los exosomas, primeros reactivos suficientes para detectar formas oligoméricas del biomarcador proteico (por ejemplo, alfasinucleína, beta amiloide, tau o huntingtina) y segundos reactivos suficientes para detectar una forma monomérica del biomarcador proteico (por ejemplo, alfa-sinucleína, beta amiloide, tau o huntingtina), o reactivos para detectar especies de biomarcadores proteicos totales (por ejemplo, alfa-sinucleína, beta amiloide, tau o huntingtina).

Por ejemplo, los kits para usar en la detección y estadificación de un estado de enfermedad sinucleinopática en una muestra biológica pueden comprender reactivos, tampones, enzimas, anticuerpos y otras composiciones específicas para este fin. Los kits también suelen incluir instrucciones de uso, así como software para el análisis y la interpretación de datos. El kit puede comprender además muestras que sirven como estándares normativos. Cada solución o composición puede estar contenida en un vial o frasco y todos los viales pueden mantenerse confinados en una caja para venta comercial.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1: Los oligómeros de alfa-sinucleína están elevados en comparación con los monómeros de alfa-sinucleína en condiciones sinucleopáticas.

El tema de estudio es una cohorte de individuos que han sido diagnosticados con una afección sinucleopática y se les aplica una intervención terapéutica activa y luego otra diferente, posiblemente conocida por ser inactiva, o al revés. O una cohorte que comprende una pluralidad de sujetos que son asintomáticos para una afección sinucleopática en una pluralidad de sujetos a los que se les ha diagnosticado la afección sinucleopática son el tema de estudio. En cualquier caso, se toman muestras de sangre venosa de cada sujeto mediante venopunción en varios momentos, incluso en condiciones iniciales o de control (por ejemplo, tratamiento de intervención inactivo) y nuevamente durante la administración de un tratamiento potencialmente activo (por ejemplo, intervención experimental). Los exosomas derivados del SNC se aíslan de la sangre usando los métodos descritos en el presente documento. Se miden las cantidades de alfa-sinucleína monomérica y alfa-sinucleína oligomérica o especies específicas de las mismas que están contenidas dentro de los exosomas aislados. Se determina una proporción de especies de alfa-sinucleína oligomérica y de alfa-sinucleína monomérica. Los resultados muestran que en la cohorte de sujetos diagnosticados con la enfermedad sinucleopática, la proporción de alfa-sinucleína oligomérica a alfa-sinucleína monomérica aumenta en un grado estadísticamente significativo. Posteriormente se descubre que aquellos que tienen un cambio significativo en los resultados de este ensayo de biomarcadores tienen un cambio proporcional en el estado clínico.

Ejemplo 2: Estratificación de sujetos/ensayo clínico

Se analizan sujetos voluntarios sin EP y con EP para determinar cantidades relativas de alfa-sinucleína oligomérica y monomérica en exosomas derivados del SNC. Según las cantidades relativas determinadas y utilizando los límites determinados en el ejemplo anterior, los sujetos se agrupan en varios grupos de prueba. Ciertos grupos de prueba reciben un placebo. A otros grupos de prueba se les administran diferentes cantidades de un compuesto en un ensayo clínico. Durante y/o después de la administración, se repiten las pruebas. Se analizan las mediciones recopiladas. Se determina que la intervención terapéutica produce una disminución estadísticamente significativa en las cantidades relativas de alfa-sinucleína oligomérica a alfa-sinucleína monomérica.

Ejemplo 3: Ensayo clínico del fármaco candidato neuroprotector para las sinucleinopatías

El objetivo de un estudio de Fase II es evaluar la seguridad, tolerabilidad y eficacia inicial de pramipexol, administrado con Aprepitant y con o sin y, opcionalmente, lovastatina o fármacos igualmente eficaces, en pacientes con EP y trastornos relacionados. Se realiza un ensayo ambulatorio de tratamiento secuencial, de dosis creciente, cruzado, en hasta 30 pacientes con EP (EP), atrofia sistémica múltiple (AMS), demencia con cuerpos de Lewy (DCL) o trastorno sinucleopático relacionado. Ninguno de los participantes puede haber sido tratado con un agonista de la dopamina u otro fármaco de actividad central durante los 3 meses anteriores al ingreso al estudio, excepto levodopa-carbidopa (Sinemet), que se mantiene en una dosis estable durante todo el ensayo hasta cierto punto considerado médicamente aceptable. Después de las evaluaciones clínicas y de laboratorio de referencia, incluida la Escala de Clasificación Unificada de EP (ECUEP-Parte III) y las determinaciones de biomarcadores de sinucleína, los individuos que dan su consentimiento y cumplen con los criterios de adhesión cambian de su régimen de tratamiento de la EP previo al estudio a uno que incluya pramipexol ER y Aprepitant. La dosis de pramipexol ER se ajusta hasta la que se tolera óptimamente (o un máximo de 9 mg/día) y luego se mantiene estable durante un máximo de 12 a 16 semanas. El tratamiento conjunto con un fármaco adicional (por ejemplo, una estatina) administrado en su dosis máxima aprobada puede comenzar durante 3 meses adicionales según se considere clínicamente apropiado, momento en el cual todos los sujetos regresan a su régimen de tratamiento previo al ingreso. Durante el ensayo, se repitieron las medidas iniciales de eficacia y seguridad a intervalos regulares, incluida la determinación de los niveles de biomarcadores de sinucleína. La eficacia se determina en función del cambio estadísticamente significativo hacia la normalidad de un perfil de biomarcador que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, especies de alfa-sinucleína monomérica.

Ejemplo 4: Diagnóstico

Un sujeto presenta ciertos síntomas compatibles con la EP pero, a nivel preclínico, todavía carece de muchas de las características clínicas distintivas de esta enfermedad. La sangre se extrae del sujeto mediante punción venosa. Se miden las cantidades de alfa-sinucleína oligomérica y monomérica a partir de exosomas derivados del SNC en la sangre. Se determina un perfil de biomarcadores. Un algoritmo de diagnóstico clasifica el perfil para que sea consistente con un diagnóstico de EP. Al sujeto se le diagnostica EP y se le somete a un régimen terapéutico, ya sea uno paliativo para mitigar los síntomas o un tratamiento dirigido a la etiología de la enfermedad con fines de neuroprotección.

Ejemplo 5: Estadificación

Un sujeto presenta un diagnóstico de EP El médico ordena un análisis de sangre del sujeto para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Basándose en el perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monómeros, el médico determina que el sujeto se encuentra en una etapa temprana de la EP y, por lo tanto, responde mejor a una intervención terapéutica particular.

Ejemplo 6: Pronóstico/Progresión

Un sujeto presenta un diagnóstico de EP El médico ordena un primer y un segundo análisis de sangre del sujeto con varios meses de diferencia para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Con base en el perfil del biomarcador alfa-sinucleína oligomérica a monomérica, el médico determina que la enfermedad del sujeto progresa lentamente y que se espera que el sujeto tenga muchos años de vida útil, incluso sin una intervención terapéutica riesgosa.

Ejemplo 7: Evaluación de riesgos

Un sujeto se presenta para un examen físico sin síntomas de una enfermedad sinucleinopática. En este caso, este individuo es consciente de un factor de riesgo genético o ambiental. El médico ordena un análisis de sangre del sujeto para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Con base en el perfil de biomarcadores relativamente anormal de algunas o todas las especies mensurables de alfasinucleína oligomérica, en comparación con individuos de control sanos, el médico determina que el sujeto tiene una baja probabilidad de desarrollar EP

Ejemplo 8: Respuesta a la terapia

Un sujeto presenta un diagnóstico de EP El médico ordena análisis de sangre iniciales del sujeto para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica antes de comenzar el tratamiento. Después de una ronda de tratamiento, pero antes de que los síntomas clínicos hayan cambiado, el médico solicita un segundo análisis de sangre. En función de un cambio hacia la normalidad en a, el médico determina si el tratamiento es eficaz o si es necesario cambiar o repetir la dosis.

Ejemplo 9: Desarrollo de Diagnóstico

Se analizan sujetos voluntarios sin EP y con EP en diferentes etapas diagnosticadas para determinar un perfil de biomarcadores que comprende una pluralidad de alfa-sinucleína oligomérica y alfa-sinucleína monomérica. Según el perfil de biomarcadores determinado, los sujetos se clasifican de acuerdo con que muestren presencia o ausencia de enfermedad y, opcionalmente, estadio de la enfermedad. Los perfiles se determinan mediante un algoritmo de aprendizaje computarizado que, luego del análisis de los datos, genera un algoritmo de clasificación que infiere un diagnóstico. El modelo de inferencia se selecciona para producir una prueba con la sensibilidad y especificidad deseadas.

Ejemplo 10: Los perfiles de oligómeros de alfa-sinucleína cambian en condiciones sinucleopáticas

A una cohorte de individuos que son objeto de estudio se les ha diagnosticado una afección sinucleopática. A los sujetos se les aplica una intervención terapéutica activa y luego otra diferente, posiblemente conocida por ser inactiva. Alternativamente, las intervenciones se pueden realizar en orden inverso. O una cohorte que comprende una pluralidad de sujetos que son asintomáticos para una afección sinucleopática en una pluralidad de sujetos a los que se les ha diagnosticado la afección sinucleopática son el tema de estudio. En cualquier caso, se toman muestras de sangre venosa de cada sujeto mediante venopunción en varios momentos, incluso en condiciones iniciales o de control (por ejemplo, tratamiento de intervención inactivo) y nuevamente durante la administración de un tratamiento potencialmente activo (por ejemplo, intervención experimental). Los exosomas derivados del SNC se aíslan de la sangre usando los métodos descritos en el presente documento. Se miden las cantidades de una pluralidad de formas de alfa-sinucleína, incluyendo alfa-sinucleína monomérica y alfa-sinucleína oligomérica que están contenidas dentro de los exosomas aislados. Estos datos se combinan en un conjunto de datos. El conjunto de datos se analiza utilizando métodos estadísticos, en este caso, utilizados para entrenar un algoritmo de aprendizaje, por ejemplo, una máquina de vectores de soporte, para desarrollar un modelo que infiera si un sujeto debe clasificarse como si tiene o no la afección sinucleopática. Los resultados muestran que en la cohorte de sujetos diagnosticados con la enfermedad sinucleopática ciertas especies de alfa-sinucleína oligomérica aumentan en un grado estadísticamente significativo en relación con otras especies oligoméricas y, opcionalmente, especies monoméricas. Posteriormente se descubre que aquellos que tienen un cambio significativo en los resultados de este ensayo de biomarcadores tienen un cambio proporcional en el estado clínico.

Ejemplo 11: Estratificación de sujetos/ensayo clínico

Se analizan sujetos voluntarios sin EP y con EP para determinar un perfil de biomarcadores de alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica en exosomas derivados del SNC. Según el perfil de biomarcadores determinado y utilizando un clasificador determinado en el ejemplo anterior, los sujetos se agrupan en varios grupos de prueba. Ciertos grupos de prueba reciben un placebo. A otros grupos de prueba se les administran diferentes cantidades de un compuesto en un ensayo clínico. Durante y, opcionalmente después de la administración, se repiten las pruebas. Se analizan las mediciones recopiladas. Se determina que la intervención terapéutica produce un cambio estadísticamente significativo hacia la normalidad de los perfiles de biomarcadores que comprenden alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, alfa-sinucleína monomérica.

Ejemplo 12: Ensayo clínico de fármaco candidato neuroprotector para las sinucleinopatías

El objetivo de un estudio de Fase II es evaluar la seguridad, tolerabilidad y eficacia inicial de pramipexol, administrado con Aprepitant y con o sin y, opcionalmente, lovastatina o fármacos igualmente eficaces, en pacientes con EP y trastornos relacionados. Se realiza un ensayo ambulatorio de tratamiento secuencial, de dosis creciente, cruzado, en hasta 30 pacientes con EP (EP), atrofia sistémica múltiple (AMS), demencia con cuerpos de Lewy (DCL) o trastorno sinucleopático relacionado. Ninguno de los participantes puede haber sido tratado con un agonista de la dopamina u otro fármaco de actividad central durante los 3 meses anteriores al ingreso al estudio, excepto levodopa-carbidopa (Sinemet), que se mantiene en una dosis estable durante todo el ensayo hasta cierto punto considerado médicamente aceptable. Después de las evaluaciones clínicas y de laboratorio de referencia, incluida la Escala de Clasificación Unificada de EP (ECUEP-Parte III) y las determinaciones de biomarcadores de sinucleína, los individuos que dan su consentimiento y cumplen con los criterios de adhesión cambian de su régimen de tratamiento de la EP previo al estudio a uno que incluya pramipexol ER y Aprepitant. La dosis de pramipexol ER se ajusta hasta la que se tolera óptimamente (o un máximo de 9 mg/día) y luego se mantiene estable durante hasta aproximadamente 12 a 16 semanas. El tratamiento conjunto con un fármaco adicional (por ejemplo, una estatina) administrado a su dosis máxima aprobada puede comenzar durante 3 meses adicionales según se considere clínicamente apropiado, momento en el cual todos los sujetos regresan a su régimen de tratamiento previo al ingreso. Durante el ensayo, se repitieron las medidas iniciales de eficacia y seguridad a intervalos regulares, incluida la determinación de los niveles de biomarcadores de sinucleína. La eficacia se determina en función del cambio estadísticamente significativo hacia la normalidad de un perfil de biomarcador que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, especies de alfasinucleína monomérica.

Ejemplo 13: Diagnóstico

Un sujeto presenta ciertos síntomas compatibles con la EP pero, a nivel preclínico, todavía carece de muchas de las características clínicas distintivas de esta enfermedad. La sangre se extrae del sujeto mediante punción venosa. Se miden las cantidades de alfa-sinucleína oligomérica y monomérica a partir de exosomas derivados del SNC en la sangre. Se determina un perfil de biomarcadores. Un algoritmo de diagnóstico clasifica el perfil para que sea consistente con un diagnóstico de EP. Al sujeto se le diagnostica EP y se le somete a un régimen terapéutico, ya sea un paliativo para mitigar los síntomas o un tratamiento dirigido a la etiología de la enfermedad con fines de neuroprotección.

Ejemplo 14: Estadificación

Un sujeto presenta un diagnóstico de EP El médico ordena un análisis de sangre del sujeto para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Basándose en el perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monómeros, el médico determina que el sujeto se encuentra en una etapa temprana de la EP y, por lo tanto, responde mejor a una intervención terapéutica particular.

Ejemplo 15: Pronóstico/Progresión

Un sujeto presenta un diagnóstico de EP El médico ordena un primer y un segundo análisis de sangre del sujeto con varios meses de diferencia para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Con base en el perfil del biomarcador alfa-sinucleína oligomérico a monomérico, el médico determina que la enfermedad del sujeto progresa lentamente y que se espera que el sujeto tenga muchos años de vida útil, incluso sin una intervención terapéutica riesgosa.

Ejemplo 16: Evaluación de riesgos

Un sujeto se presenta para un examen físico sin síntomas de una enfermedad sinucleinopática. En este caso, este individuo es consciente de un factor de riesgo genético o ambiental. El médico ordena un análisis de sangre del sujeto para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica. Con base en el perfil de biomarcadores relativamente anormal de algunas o todas las especies mensurables de alfasinucleína oligomérica, en comparación con individuos de control sanos, el médico determina que el sujeto tiene una baja probabilidad de desarrollar EP

Ejemplo 17: Respuesta a la terapia

Un sujeto presenta un diagnóstico de EP El médico ordena análisis de sangre iniciales del sujeto para determinar un perfil de biomarcadores que comprende alfa-sinucleína oligomérica y, opcionalmente, monomérica antes de comenzar el tratamiento. Después de una ronda de tratamiento, pero antes de que los síntomas clínicos hayan cambiado, el médico solicita un segundo análisis de sangre. En función de un cambio hacia la normalidad en a, el médico determina si el tratamiento es eficaz o si es necesario cambiar o repetir la dosis.

Ejemplo 18: Ejemplo de perfiles de biomarcadores

La Fig. 7 muestra un ejemplo de perfiles de biomarcadores que incluyen especies monoméricas y cinco oligoméricas de alfa sinucleína en cinco estados diferentes. Los estados incluyen normal, enfermedad de Parkinson en estadio 1 (PD-1), enfermedad de Parkinson en estadio 2 (PD-2), tratamiento con el agente terapéutico 1 (Rx-1) y tratamiento con el agente terapéutico 2 (Rx-2). Las cantidades relativas de cada una de las especies oligoméricas se indican mediante la oscuridad de la línea. Como puede verse, el oligómero 4 está elevado tanto en la enfermedad de Parkinson en estadio 1 como en estadio 2. Por el contrario, los oligómeros 1,2 y 3 están elevados en el estadio 1 pero no en el estadio 2. El agente terapéutico 1 reduce las cantidades relativas de oligómero 4 y se considera que tiene actividad neuroprotectora. En comparación, el agente terapéutico 2 no reduce el oligómero 4 y, en este ejemplo, se considera que no es neuroprotector.

Ejemplo 19: Desarrollo de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer

Los sujetos voluntarios diagnosticados por un profesional médico con o sin enfermedad de Alzheimer proporcionan muestras de sangre para su análisis. Se aíslan los contenidos internos de los exosomas derivados del cerebro. Se determinan las cantidades de a-beta monomérica y cada una de una pluralidad de especies de a-beta oligomérica. La comparación de los resultados muestra que en los sujetos diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer, una forma oligomérica aumenta constantemente en comparación con la a-beta monomérica. Se determina además que una cantidad de esta forma por encima de un nivel umbral determinado proporciona un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer con una sensibilidad del 85 % y una especificidad del 98 %. Este nivel de umbral se utiliza para diagnosticar a otros sujetos con la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 19: Desarrollo de diagnóstico para la enfermedad de Huntington

Los sujetos voluntarios diagnosticados por un profesional médico con la enfermedad de Huntington o sin ella proporcionan muestras de sangre para su análisis. Se aíslan los contenidos internos de los exosomas derivados del cerebro. Se determinan las cantidades de cada una de una pluralidad de especies de proteína huntingtina oligomérica. Utilizando un análisis de regresión lineal, se descubre que cantidades de tres formas oligoméricas separadas en combinación pueden diagnosticar la enfermedad de Huntington en forma de un modelo matemático lineal.

Tal como se utiliza en este documento, se aplican los siguientes significados a menos que se especifique lo contrario. La palabra "puede" se usa en un sentido permisivo (es decir, que significa tener el potencial para), en lugar del sentido obligatorio (es decir, que significa debe). Las palabras "incluye", "que incluye" e "incluido" y similares significan que incluyen, pero no se limitan a. Las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural. Así, por ejemplo, la referencia a "un elemento" incluye una combinación de dos o más elementos, sin perjuicio del uso de otros términos y frases para uno o más elementos, tales como "uno o más". El término "o", a menos que se indique lo contrario, no es exclusivo, es decir, abarca tanto "y" como "o". El término "cualquiera de" entre un modificador y una secuencia significa que el modificador modifica cada miembro de la secuencia. Así, por ejemplo, la frase "al menos cualquiera de 1,2 o 3" significa "al menos 1, al menos 2 o al menos 3". La frase "al menos uno" incluye "una pluralidad".

Si bien en el presente documento se han mostrado y descrito ciertas realizaciones de la presente invención, será obvio para los expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo únicamente.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para inferir un riesgo de desarrollar, un diagnóstico, un estadio, un pronóstico, una progresión o un grado de respuesta a un supuesto agente neuroprotector para una sinucleinopatía, en el que el método comprende: a) determinar, a partir de una muestra de sangre de un sujeto que está enriquecida en partículas microsomales derivadas del ^s N^c , un perfil de alfa-sinucleína que comprende medidas cuantitativas de una o más formas oligoméricas de alfa-sinucleína y, opcionalmente, una forma monomérica de alfa-sinucleína para crear un conjunto de datos de prueba; y

b) ejecutar un modelo en el conjunto de datos de prueba para inferir un riesgo de desarrollar, un diagnóstico, un estadio, un pronóstico, una progresión de o un grado de respuesta a un supuesto agente neuroprotector para la sinucleinopatía, en el que el modelo es obtenido por:

(I) proporcionar un conjunto de datos de entrenamiento que comprende, para cada uno de una pluralidad de sujetos, valores que indican (1) el estado de una sinucleinopatía o la respuesta a un supuesto agente neuroprotector para una sinucleinopatía, y (2) medidas cuantitativas de cantidades de cada uno de uno o más formas oligoméricas de alfasinucleína y, opcionalmente, una forma monomérica de alfa-sinucleína en una muestra de sangre enriquecida en partículas microsomales derivadas del SNC; y

(II) realizar un análisis estadístico del conjunto de datos de entrenamiento para desarrollar un modelo que infiera el estado de la sinucleinopatía en un individuo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las formas de alfa-sinucleína para las cuales se determinan las medidas cuantitativas se seleccionan de:

(I) al menos una forma oligomérica;

(II) una pluralidad de formas oligoméricas;

(NI) al menos una forma oligomérica y al menos una forma monomérica;

(IV) una pluralidad de formas oligoméricas y al menos una forma monomérica;

(V) al menos una forma oligomérica y una pluralidad de formas monoméricas;

(VI) una pluralidad de formas oligoméricas y una pluralidad de formas monoméricas; y

(VII) al menos una gama de tamaños de formas oligoméricas.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una de las formas oligoméricas comprende un conjunto de especies de alfa-sinucleína.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modelo comprende: correlacional, correlación de Pearson, correlación de Spearman, chi cuadrado, comparación de medias (por ejemplo, prueba T pareada, prueba T independiente, análisis de regresión ANOVA (por ejemplo, regresión simple, regresión múltiple, regresión lineal, regresión no lineal, regresión logística, regresión polinómica, regresión por pasos, regresión de cresta, regresión de lazo, regresión de elasticnet) o análisis no paramétrico (por ejemplo, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, prueba de rangos de signos de Wilcoxon, prueba de signos).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modelo se ejecuta por ordenador.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sinucleinopatía se selecciona entre enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia multisistémica o un trastorno relacionado.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las formas oligoméricas incluyen uno o más oligómeros de sinucleína de peso molecular relativamente bajo.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las formas oligoméricas de sinucleína incluyen formas oligoméricas en un intervalo de tamaño de aproximadamente 6 mer a 18 mer.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de sangre comprende una muestra de sangre venosa.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas microsomales derivadas del SNC se lavan para eliminar las proteínas unidas a la membrana de la superficie.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modelo utiliza un patrón de cantidades relativas de una pluralidad de formas oligoméricas de alfa-sinucleína o una relación de formas de alfa-sinucleína oligomérica a alfa-sinucleína monomérica.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una o más formas oligoméricas de alfasinucleína y, opcionalmente, una forma monomérica de alfa-sinucleína se aíslan de un compartimento interno de las partículas microsomales.