ES2975228T3 - Derivados de GFAP para el diagnóstico de accidente cerebrovascular - Google Patents
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Abstract
Se describen métodos y kits para diagnosticar accidentes cerebrovasculares utilizando derivados de GFAP. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Derivados de GFAP para el diagnóstico de accidente cerebrovascular
Antecedentes
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte en todo el mundo y puede definirse como la pérdida de la(s) función/funciones cerebral(es) que se desarrolla rápidamente debido a la interrupción del riego sanguíneo al cerebro. Según la Organización Mundial de la Salud, 15 millones de personas al año padecen accidentes cerebrovasculares en todo el mundo, de las cuales 5 millones mueren y otros 5 millones quedan permanentemente incapacitadas. Un accidente cerebrovascular isquémico (IS) da como resultado una disminución del riego sanguíneo al cerebro, dando como resultado daño cerebral, y se produce cuando se bloquea un vaso sanguíneo, habitualmente a través de un coágulo sanguíneo. Este coágulo puede formarse localmente en una placa aterosclerótica (accidente cerebrovascular trombótico) o puede producirse alternativamente debido a una partícula o residuo que se desplaza que se ha originado en otro punto del torrente sanguíneo (accidente cerebrovascular embólico). El ataque isquémico transitorio (TIA) se produce cuando el riego sanguíneo al cerebro disminuye temporalmente. Se diagnostica un TIA si los síntomas se resuelven rápidamente (en el plazo de 24 horas) y la persona recupera su salud normal. El accidente cerebrovascular hemorrágico (HS) es la acumulación de sangre dentro de la bóveda del cráneo y puede dividirse en dos subtipos principales: hemorragia intracerebral (ICH), en la que la sangre se filtra hacia el tejido cerebral, y hemorragia subaracnoidea (SAH), en la que la sangre se escapa al espacio subaracnoideo. Un accidente cerebrovascular hemorrágico se produce cuando un vaso sanguíneo debilitado se rompe. La afección relacionada con accidente cerebrovascular en la que un individuo que presenta IS se transforma en un momento posterior en HS, se denomina “transformación hemorrágica” (HT). El accidente cerebrovascular isquémico representa aproximadamente el 85 por ciento de todos los casos de accidente cerebrovascular y el accidente cerebrovascular hemorrágico, el 15 por ciento. La tasa de mortalidad a 30 días para el IS es del 8-12 % y para el HS es del 37-38 %. Para minimizar el daño neurológico y la muerte después de un accidente cerebrovascular, es fundamental que los pacientes con accidente cerebrovascular se diagnostiquen con rapidez y precisión para poder administrarles el tratamiento adecuado. Por ejemplo, para descomponer los coágulos puede administrarse una terapia antitrombolítica como el activador tisular del plasminógeno (tPA). Sin embargo, una terapia de este tipo sólo está justificada en el IS y es perjudicial en el HS; la naturaleza del TIA no requiere tal terapia y en tales casos se prescriben anticoagulantes tales como warfarina y aspirina. La HT puede producirse como parte de la evolución natural del IS o como resultado de una terapia anticoagulante o trombolítica en la fase aguda del IS. Esto plantea un problema grave tanto para el individuo afectado por un accidente cerebrovascular como para el médico con respecto a las decisiones sobre el uso de terapia antitrombolítica y anticoagulante. Por tanto, los pacientes ingresados en una clínica con síntomas similares a los de un accidente cerebrovascular presentan al médico una tarea de diagnóstico diferencial muy compleja. Un médico que, al enfrentarse a un paciente, sospecha un accidente cerebrovascular, debe delimitar las diversas afecciones similares al accidente cerebrovascular: seudoaccidentes cerebrovasculares (hipoglucemia, sobredosis de drogas, migraña, convulsiones, hiponatremia, pérdida del conocimiento, tumores intracraneales, hematoma subdural, encefalopatía hipertensiva, encefalitis/meningitis), TIA, IS y accidentes cerebrovasculares que se transforman en accidente cerebrovascular hemorrágico, y un diagnóstico erróneo podría tener consecuencias mortales. En la actualidad, si se sospecha accidente cerebrovascular, se evalúan los síntomas físicos y habitualmente se realiza una TC. Una TC tiene buena sensibilidad para identificar pacientes con HS (aproximadamente el 90 % de sensibilidad), pero tiene poca sensibilidad para la detección de IS. La detección de biomoléculas (biomarcadores) relacionadas con el accidente cerebrovascular en fluidos biológicos es un posible medio de apoyo para el diagnóstico de accidente cerebrovascular. Los biomarcadores tienen el potencial de acelerar y aumentar la precisión del diagnóstico de accidente cerebrovascular y se han propuesto diversos biomarcadores candidatos para el diagnóstico de accidente cerebrovascular. La velocidad del diagnóstico de accidente cerebrovascular es especialmente crítica para garantizar el mejor desenlace posible para el paciente, ya que permite un tratamiento temprano. La medición de biomarcadores usando una muestra biológica del paciente es más rápida que implementar una gammagrafía cerebral, además de ser técnicamente más simplista y económica. La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) es una proteína estructural de ~50 kDa (kDa = kilodaltons) que se encuentra predominantemente en el cerebro. Básicamente no se detecta en el suero sistémico de pacientes sanos, pero se libera en cantidades crecientes durante el HS (documento EP1668370B1 - accidente cerebrovascular intracerebral, documento WO2005/05029088). La utilidad de GFAP como biomarcador de HS es cada vez más reconocida, pero siempre existe la necesidad de biomarcadores de accidente cerebrovascular adicionales, especialmente los que proporcionen mayor sensibilidad y mayor precisión en el diagnóstico y la predicción de HS y que respalden mejoras en el diagnóstico diferencial de accidente cerebrovascular.
Changhonget al.,(2016, Scientific Reports) se refieren a la evaluación de UCH-L1 y GFAP en suero en pacientes con accidente cerebrovascular agudo. Wunderlichetal. (2006, European Journal of Neurology) se refieren a que la liberación de GFAP que está relacionada con el estado neurovascular en el accidente cerebrovascular isquémico agudo. Mayeret al.,(2013, PLOS One) se refieren a los niveles en sangre de GFAP en pacientes con enfermedades neurológicas. Chenet al.,(2013, ASN Neuro) se refieren a la escisión por caspasas de GFAP que produce un fragmento proteolítico de ensamblaje comprometido que promueve la agregación de filamentos. Papaet al.,(2012, Annals of Emergency Medicine) se refieren a niveles elevados de productos de degradación de GFAP en suero en lesiones cerebrales traumáticas leves y moderadas que se asocian con lesiones intracraneales e intervención neuroquirúrgica. Kimikazuet al.,(1998, Brain Research) se refiere a un aumento de GFAP en la médula espinal de un ratón mutante con degeneración de motoneuronas. Suzukiet al.,(2005, Neurological Research) se refiere a la identificación de proteínas nitradas en el cerebro normal de rata usando un enfoque de proteómica.
Sumario de la invención
Se describen métodos de apoyo del diagnóstico de acontecimientos de accidente cerebrovascular en pacientes usando derivados de GFAP. Se ha descubierto inesperadamente que los derivados de GFAP constituyen una proporción sustancial de la proteína GFAP total en muestras tomadas de individuos que padecen un accidente cerebrovascular, y su detección y medición permite ensayos mejorados para el diagnóstico y pronóstico del accidente cerebrovascular. Los derivados de GFAP son fragmentos o especies de GFAP, con o sin modificación postraduccional (PTM), derivados de GFAP nativa (GFAP original). Mediante la detección y medición de la GFAP total, los derivados de la GFAP más la GFAP nativa, se obtienen resultados de ensayo más sensibles. La invención describe además métodos de detección basados en anticuerpos que, mediante la selección epitópica de secuencias de aminoácidos comunes y/o únicas para las diversas especies de GFAP, permiten ensayos para mejorar la predicción y el diagnóstico de accidentes cerebrovasculares. Estos métodos pueden usarse independientemente o pueden combinarse con gammagrafía cerebral en pacientes que presentan síntomas de accidente cerebrovascular para predecir, diagnosticar y discriminar accidente cerebrovascular isquémico mortal (IS mortal), transformación hemorrágica (HT) y accidente cerebrovascular hemorrágico (HS), permitiendo así diagnósticos oportunos y precisos, priorización del tratamiento de los pacientes y manejo más eficiente de los mismos. También se describen anticuerpos que se dirigen a zonas de las diversas especies de GFAP, dominios peptídicos de derivados de GFAP o GFAP nativa que incorporan los epítopos unidos por los anticuerpos de la invención que permiten los métodos de la invención.
Figuras
Figura 1. Gráficos de la concentración de GFAP en accidentes cerebrovasculares perniciosos y no perniciosos para el kit 1 y el kit 2 tal como se describe en la sección de ejemplos de métodos y resultados.
Figura 2. Gráfico de la media (desviación estándar entre paréntesis) de las concentraciones de GFAP en sujetos con seudoaccidentes cerebrovasculares, TIA, IS, IS mortal (IS mortal), HS y HT.
Figura 3. Curva ROC de accidente cerebrovascular pernicioso frente a accidente cerebrovascular no pernicioso usando el kit 2.
Figura 4. Secuencias de las tres principales isoformas de GFAP (tomadas de la base de datos Uniprot -www.uniprot.org, www.uniprot.org/uniprot/?query=gfap&sort=score).
Figura 5. Fragmentos peptídicos de GFAP, GFAP nativa y control de biochip (FITC-isotiocianato de fluoresceína) usados en el mapeo de epítopos de los anticuerpos GF9, GF10, 4A1 1 y GA-5 (o “GA5”). Los fragmentos se localizaron mediante mancha en regiones de prueba diferenciadas (DTR) de un biochip.
Figura 6. La configuración de localización mediante mancha del biochip correspondiente a la figura 5 se usa para derivar las características de unión de los anticuerpos GF9, GF10, 4A1 1 y GA-5.
Figura 7. Imágenes del biochip después de la adición de anticuerpos a las configuraciones de localización mediante mancha del biochip descritas en la figura 6. Las flechas indican la unión única del anticuerpo GF9 a DTR 4 que incorpora la secuencia peptídica de GFAP ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) y del anticuerpo GF10 a DTR 2 que incorpora la secuencia peptídica de GFAP ERKIESLEEEIR (SEQ ID NO: 2).
Figura 8. Fragmentos peptídicos de GFAP, GFAP nativa y control de biochip (FITC-isotiocianato de fluoresceína) usados en el mapeo de epítopos de los anticuerpos 4A11 y GA-5. Los fragmentos se localizaron mediante mancha en regiones de prueba diferenciadas (DTR) de un biochip.
Figura 9. La configuración de localización mediante mancha del biochip correspondiente a la figura 8 se usa para derivar las características de unión de los anticuerpos 4A11 y GA-5 (arriba). Imágenes del biochip después de la adición de anticuerpos a las configuraciones de localización mediante mancha del biochip (abajo). Estas muestran la unión única del anticuerpo 4A11 a la DTR 26 que incorpora la secuencia peptídica de GFAP NLRLEAENNLAA (SEQ ID NO: 3) y el anticuerpo GA-5 a la DTR 37 que incorpora la secuencia peptídica de GFAP VQTFSNLQIR (SEQ ID NO: 4).
Figura 10. Imágenes de inmunotransferencia de tipo Western (véase Ejemplos de métodos y resultados para metodologías experimentales) usando los cuatro anticuerpos de los kits 1 y 2 que se exponen a muestras de líquido cefalorraquídeo tomadas de pacientes que han sufrido hemorragia subaracnoidea. El carril del extremo izquierdo es estándar (marcador de tamaño molecular), el carril A es GFAP (n.° de catálogo de Calbiochem 344596), el carril B es lisado de tejido cerebral humano (ProSci), los carriles C a F representan muestras de CSF de pacientes con hemorragia subaracnoidea. Tal como puede observarse a partir de las imágenes, el anticuerpo GF9 se une a derivados únicos de GFAP de peso molecular mayor y menor que la GFAP nativa (indicado por flechas a la derecha de la imagen superior).
Figura 11. Imágenes de inmunotransferencia de tipo Western (véase Ejemplos de métodos y resultados para metodologías experimentales) del anticuerpo GF9 expuesto a muestras de suero tomadas de pacientes con accidente cerebrovascular hemorrágico. El carril A es GFAP nativa (Calbiochem), el carril B es lisado de tejido cerebral humano (ProSci), los carriles C a F representan muestras de suero de pacientes con accidente cerebrovascular hemorrágico. Tal como puede observarse a partir de la imagen, el anticuerpo GF9 se une a un derivado de GFAP de peso molecular menor que la GFAP nativa. Este derivado de GFAP también está presente en el lisado de tejido cerebral humano.
Figura 12. Valores de unidades de luz relativas (RLU) para generar una curva patrón derivada de un ensayo de tipo sándwich para GFAP nativa usando el anticuerpo de captura GF9 con anticuerpos detectores 4A11, GF10 y GA-5 unidos a HRP.
Figura 13. Concentración de especies de GFAP (derivados de GFAP de PM menor que GFAP nativa según inmunotransferencia de tipo Western) en muestras derivadas de pacientes con accidente cerebrovascular. Las muestras de los pacientes fueron líquido cefalorraquídeo (CSF), suero y plasma. Los valores de concentración se derivaron usando un anticuerpo de captura GF9 y un anticuerpo detector 4A11 unido a HRP. El ensayo de tipo sándwich se realizó usando el sistema Evidence Investigator™ de Randox Laboratories.
Figura 14. Concentración de especies de GFAP (derivados de GFAP de PM menor que GFAP nativa según inmunotransferencia de tipo Western) en muestras de CSF y suero derivadas de pacientes con accidente cerebrovascular derivadas usando el anticuerpo de captura GF9 y los anticuerpos detectores 4A11 y GA5.
Descripción detallada de la invención
Durante un estudio clínico de rutina que evaluaba la utilidad de GFAP nativa como biomarcador para el accidente cerebrovascular hemorrágico, se descubrió sorprendentemente que los derivados de GFAP de peso molecular menor que la GFAP nativa sin PTM representan un componente importante de la GFAP total presente en las muestras de pacientes con accidente cerebrovascular. La cantidad de estos derivados de GFAP es mayor en pacientes con HS, pacientes con HT y pacientes con IS mortal en comparación con los valores de control. También se encontró que otros derivados de GFAP, concretamente GFAP nativa con modificaciones postraduccionales y/o derivados de GFAP con un peso molecular mayor que el de GFAP nativa sin PTM, también estaban presentes en el líquido cefalorraquídeo (CSF) de pacientes con accidente cerebrovascular. Esto permite el uso de derivados de GFAP en un entorno clínico o en un lugar de atención como biomarcadores de diversas afecciones de accidente cerebrovascular para informar y apoyar el proceso de toma de decisiones clínicas. Estas diversas afecciones de accidente cerebrovascular incluyen HS (hemorragia intracerebral y/o hemorragia subaracnoidea), HT e IS mortal. El uso de estas especies de GFAP permite un ensayo de mayor poder de diagnóstico. El ensayo es más preciso ya que evita clasificar muestras como carentes de GFAP cuando GFAP está presente (véase la figura 1). A lo largo de esta memoria descriptiva se usan las siguientes definiciones:
“GFAP nativa” significa, a menos que se indique lo contrario, una o más de las tres isoformas caracterizadas de longitud completa de GFAP enumeradas en la base de datos Uniprot, isoforma 1 de GFAP de número de Uniprot P14136-1 sinónimo GFAP alfa, isoforma 2 de GFAP de número de Uniprot P14136-2 sinónimo GFAP delta, isoforma 3 de GFAP de número de Uniprot P14136-3 sinónimo GFAP épsilon, cada uno con o sin PTM. La isoforma 1 de GFAP tiene una masa de 49.880 Da, la isoforma 2 de GFAp tiene una masa de 50.289 Da, la isoforma 3 de GFAP tiene una masa de 49.508 Da. En el presente documento, un compuesto puede denominarse i. número de Uniprot ii. estructura química iii. nombre químico; en caso de conflicto, el orden de prioridad para la identificación del compuesto es i. > ii > iii.
“Derivado(s) de GFAP” significa una o más especies de GFAP individuales con o sin PTM de peso molecular menor que la GFAP nativa sin PTM, es decir, una o más especies de GFAP de un peso molecular de menos de aproximadamente 49 kDa (véase la definición de “GFAP nativa” para las tres especies nativas de GFAP de referencia y sus pesos moleculares), por ejemplo, un fragmento de GFAP derivado de GFAP nativa que se ha digerido enzimáticamente, y/o una o más especies de GFAP individuales con modificación postraduccional de peso molecular mayor que la GFAP nativa sin PTM, es decir, de un peso molecular mayor de aproximadamente 51 kDa, por ejemplo, un fragmento de GFAP hiperglicosilado de un peso molecular que supera aproximadamente 51 kDa; la definición de “derivado(s) de GFAP” excluye la GFAP nativa con PTM.
“GFAP total” significa GFAP nativa y derivados de GFAP.
“Especie de GFAP” significa cualquier proteína basada en GFAP, incluyendo todas las isoformas nativas de GFAP con y sin PTM y otras isoformas de GFAP tales como GFAP beta, GFAP kappa, GFAP gamma, GFAPAEx6, GFAPA135, GFAPA164 y GFAPAEx7 (véase Moetonet al2016), multímeros de GFAP (dímeros, tetrámeros, etc. basados en cualquiera de las diversas isoformas) y sus fragmentos con o sin PTM, y derivados de GFAP con o sin PTM.
“IS mortal” significa individuos diagnosticados con accidente cerebrovascular isquémico que posteriormente mueren.
“Accidente cerebrovascular pernicioso” significa un tipo de accidente cerebrovascular en el que el individuo ha padecido o está sufriendo un acontecimiento de accidente cerebrovascular potencialmente mortal. El accidente cerebrovascular pernicioso puede ser HS, HT o IS mortal.
“Accidente cerebrovascular hemorrágico” incluye tanto accidente cerebrovascular intracerebral como accidente cerebrovascular subaracnoideo, a menos que se indique lo contrario.
La invención describe un método de diagnóstico, o de apoyo del diagnóstico, de accidente cerebrovascular en un sujeto que comprende medir la cantidad de derivado de GFAP que comprende la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) presente en una muestra que se ha tomado del sujeto, incorporando el método un anticuerpo que se une a un epítopo del derivado de GFAP dentro de la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1), en el que una cantidad de derivado de GFAP en la muestra a la que se une el anticuerpo que es mayor que la cantidad de la GFAP en un sujeto de control es indicativa de accidente cerebrovascular. Los derivados de GFAP pueden ser de peso molecular menor que GFAP nativa sin PTM. La referencia a derivados de GFAP incluye casos en los que en una muestra existen: i) solo derivados de GFAP con PTM, ii) solo derivados de GFAP sin PTM y iii) una mezcla de derivados de GFAP, algunos con y algunos sin PTM. En una realización preferida, el derivado o derivados de GFAP de peso molecular menor que GFAP nativa sin PTM tiene o tienen un peso molecular de aproximadamente 35 - 49 kDa, 35 - 42 kDa, -49 kDa o 35 - 39 kDa. Preferiblemente, el accidente cerebrovascular identificado es uno o más de accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica y accidente cerebrovascular isquémico mortal. En una realización preferida, el método comprende: < 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas, medir la cantidad de derivados de GFAP, en el que los derivados de GFAP tienen un peso molecular menor que GFAP nativa sin PTM, en una muestra biológica tomada del paciente y someter al paciente a una gammagrafía cerebral y, si el valor de los derivados de GFAP es normal y la gammagrafía cerebral es negativa para accidente cerebrovascular hemorrágico, a > 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas, tomar una muestra adicional del paciente y medir la cantidad de los derivados de GFAP, en el que i) un nivel alto de proteínas de derivados de GFAP y una gammagrafía cerebral positiva para accidente cerebrovascular hemorrágico < 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas indica accidente cerebrovascular hemorrágico, ii) un nivel alto de proteínas de derivados de GFAP y una gammagrafía cerebral negativa para accidente cerebrovascular hemorrágico < 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas indica accidente cerebrovascular isquémico mortal, iii) un nivel medio de proteínas de derivados de GFAP y gammagrafía cerebral negativa para accidente cerebrovascular hemorrágico en el ingreso y un nivel alto de proteínas de GFAP total o derivados de GFAP > 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas indica transformación hemorrágica. Preferiblemente, las muestras se toman de un sujeto < 6 horas desde el ingreso del sujeto o la aparición de los síntomas. Preferiblemente, la segunda medición de proteína ácida fibrilar glial se toma a las 24 - 96 horas desde el ingreso o desde la aparición de los síntomas. Otros posibles puntos de tiempo para tomar una muestra del sujeto son a < 12 horas, < 8 horas o < 4 horas desde el ingreso del sujeto o la aparición de los síntomas. La referencia a una “cantidad” de una o más especies de GFAP puede reemplazarse por otros términos de cuantificación adecuados tales como “concentración”, “nivel”, etc. En todos los métodos de la invención es preferible que el momento de aparición de los síntomas sea el punto de referencia definitorio. Sin embargo, es posible que las circunstancias no permitan esto debido al estado del sujeto o a la falta de verificación por un tercero, en cuyo caso se usa el momento del ingreso (que también puede incluir la llegada del método al lugar). La muestra que va a analizarse en los métodos de la invención puede ser cualquier muestra biológica tal como sangre, suero, plasma, orina, tejido, saliva; la muestra biológica es preferiblemente una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma. La GFAP nativa también puede medirse conjuntamente con derivados de GFAP. En variaciones del método descrito de la invención y en realizaciones adicionales del método descrito de la invención de diagnóstico o de apoyo del diagnóstico de accidente cerebrovascular en un sujeto, i) se miden la GFAP nativa y los derivados de GFAP de peso molecular menor que la GFAP nativa sin PTM presentes en la muestra, en el que una cantidad medida que es mayor que la cantidad de un control de GFAP es indicativa de accidente cerebrovascular, ii) se miden los derivados de GFAP de peso molecular menor que la GFAP nativa sin PTM y los derivados de GFAP de peso molecular mayor que la GFAP nativa sin PTM presentes en la muestra, en el que una cantidad medida que es mayor que la cantidad de un control de GFAP es indicativa de accidente cerebrovascular, iii) se miden los derivados de GFAP de peso molecular mayor que la GFAP nativa sin PTM presentes en la muestra, en el que una cantidad medida que es mayor que la cantidad de un control de GFAP es indicativa de accidente cerebrovascular, iv) se miden la GFAP nativa y los derivados de GFAP de peso molecular mayor que GFAP nativa sin PTM presentes en la muestra, en el que una cantidad medida que es mayor que la cantidad de un control de GFAP es indicativa de accidente cerebrovascular, v) se miden la GFAP nativa y todos los derivados de GFAP presentes en la muestra (es decir, la GFAP total), en el que una cantidad medida que es mayor que la cantidad de un control de GFAP es indicativa de accidente cerebrovascular. Preferiblemente, el accidente cerebrovascular identificado es uno o más de accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica y accidente cerebrovascular isquémico mortal. Una técnica basada en inmunología (es decir, basada en anticuerpos) es la técnica analítica preferida y puede ser, por ejemplo, un formato de inmunoensayo competitivo o de tipo sándwich basado en tecnología de matriz de biochip (BAT) o un formato de punto de atención (POC) de flujo lateral. Para el formato de inmunoensayo de tipo sándwich preferido, pueden usarse dos o más anticuerpos de diferente especificidad como anticuerpos de captura para la GFAP nativa y los derivados de GFAP de peso molecular menor o mayor que la GFAP nativa sin PTM, junto con o bien un único anticuerpo detector que detecta un único epítopo común a todas las especies de GFAP, o bien con dos o más anticuerpos detectores de diferente especificidad de epítopo. Sin embargo, en un formato preferido, se usa un único anticuerpo de captura específico para un epítopo común a las diversas especies de GFAP y un único anticuerpo detector específico para un epítopo diferente común a las diversas especies de GFA<p>, por ejemplo los anticuerpos del kit 2.
Preferiblemente, el método comprende: < 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas, medir la cantidad de GFAP total en una muestra biológica tomada del paciente y someter al paciente a una gammagrafía cerebral y, si el valor de GFAP total es normal y la gammagrafía cerebral es negativa para accidente cerebrovascular hemorrágico, > 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas tomar una muestra adicional del paciente y medir la cantidad de GFAP total, en el que i) un nivel alto de proteína GFAP total y una gammagrafía cerebral positiva para accidente cerebrovascular hemorrágico < 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas indica accidente cerebrovascular hemorrágico, ii) un nivel alto de proteína GFAP total y una gammagrafía cerebral negativa para accidente cerebrovascular hemorrágico < 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas indica accidente cerebrovascular isquémico mortal, iii) un nivel normal de proteína GFAP total y gammagrafía cerebral negativa para accidente cerebrovascular hemorrágico en el ingreso y un nivel alto de proteína GFAP total > 24 horas desde el ingreso o la aparición de los síntomas indica transformación hemorrágica.
Preferiblemente, las muestras se toman de un sujeto < 6 horas desde el ingreso del sujeto o la aparición de los síntomas. Otros posibles puntos de tiempo para tomar una muestra del sujeto son a < 12 horas, < 8 horas o < 4 horas desde el ingreso del sujeto o la aparición de los síntomas. Preferiblemente, la segunda medición de proteína ácida fibrilar glial se toma a las 24 - 96 horas desde el ingreso o desde la aparición de los síntomas. En cada uno de los métodos anteriores, un valor medido de concentración de GFAP mayor que un valor de control de GFAP es indicativo de accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica o accidente cerebrovascular isquémico mortal; preferiblemente, el nivel de GFAP en el estado de accidente cerebrovascular es > 1,1 veces, > 1,2 veces, > 1,5 veces = > 2 veces, = > 3 veces o > 4 veces que el valor de control. Estos valores reflejan el hecho de que GFAP se encuentra a niveles muy bajos o indetectables en las muestras de control (“normales”). Por tanto, los métodos de la invención que incorporan la medición de derivados de GFAP pueden usarse en el diagnóstico de HS, HT y IS mortal. Los métodos de la invención pueden incorporar cualquier anticuerpo adecuado, pero es preferible que se incorpore a los métodos un anticuerpo que se una a un epítopo de una especie de G<f>A<p>dentro de la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1). Preferiblemente, el epítopo comprende al menos un aminoácido de la secuencia SERA (SEQ ID NO: 5) dentro de ETRASERAEMME (s Eq ID NO: 1). Cuando el método inmunoanalítico es un inmunoensayo de tipo sándwich convencional, el anticuerpo de unión a ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) puede ser el anticuerpo detector o de captura. Preferiblemente, es el anticuerpo de captura. El anticuerpo de captura del inmunoensayo puede estar en disolución, en disolución unido a un dispositivo de estado sólido tal como una perla, micropartícula o partícula magnética o adsorbido o unido químicamente a un sustrato tal como un biochip. Un biochip es un sustrato plano que puede ser, por ejemplo, a base de mineral o polímero, por ejemplo vidrio o plástico, pero preferentemente es de material cerámico. Los dispositivos de estado sólido usados se adaptan opcionalmente al estar cubiertos parcial o completamente con un material que promueva un ensayo mejorado, por ejemplo, una composición hidrófoba. El sustrato preferido es un biochip cerámico opcionalmente cubierto total o parcialmente con una composición hidrófoba. Las composiciones hidrófobas, bien conocidas en la técnica, pueden ayudar a minimizar o prevenir la unión no específica, optimizar las características de las gotitas que contienen anticuerpos cuando se añaden al dispositivo de estado sólido, mitigar la pérdida de señal mejorando así la detección y cuantificación. El método inmunoanalítico puede incorporar un anticuerpo adicional. Por ejemplo, el formato de tipo sándwich preferido incluye un anticuerpo adicional que se une a un epítopo que es o bien común a los derivados de GFAP o bien común a las especies de GFAP total, diferenciándose el epítopo al que se une el anticuerpo adicional del epítopo al que se une el primer anticuerpo. La especificidad de epítopo de cada uno de los dos anticuerpos del inmunoensayo es suficientemente diferente como para que un anticuerpo no impida o interfiera con la unión del otro anticuerpo a su epítopo y viceversa, y como para que no se vea comprometida la integridad del inmunoensayo en la detección y cuantificación de derivados de GFAP y/o GFAP total. Se prefiere que para todos los métodos inmunoanalíticos usados para el diagnóstico de accidente cerebrovascular el anticuerpo adicional se una a un epítopo de una especie de GFAP incorporado en la secuencia ERKIESLEEEIR (SEQ ID NO:2). El nivel de control de GFAP tal como se usa en los métodos descritos de la invención es uno que se ha medido en un paciente sano o en una población sana de pacientes, o se ha derivado de una población de pacientes clasificados como con uno o más de TIA, seudoaccidente cerebrovascular o accidente cerebrovascular isquémico. Un “control”, a menos que se califique de otro modo, puede ser GFAP nativa, un derivado de GFAP o cualquier otra especie de GFAP, incluyendo otras isoformas de GFAP y sus derivados, y dímeros y oligómeros de GFAP y sus derivados, o una mezcla de dos o más especies de GFAP, que se ha medido en un paciente sano o una población sana de pacientes o se ha derivado de una población de pacientes clasificados como uno o más de TIA, seudoaccidente cerebrovascular o accidente cerebrovascular isquémico (la población de control); los datos de pacientes con accidente cerebrovascular isquémico pueden usarse como control si, tal como lo muestra el estudio actual, los niveles de GFAP no aumentan en tales pacientes. La invención describe además el uso de derivados de GFAP que comprende la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) como marcadores de accidente cerebrovascular, en el que la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) es la diana de un anticuerpo en un ensayo de diagnóstico. Los derivados de GFAP pueden ser derivados de GFAP de peso molecular menor que GFAP nativa sin PTM y derivados de GFAP de peso molecular mayor que GFAP nativa sin PTM (es decir fragmentos de GFAP con PTM sustancial). Preferiblemente, se usan derivados de GFAP de peso molecular menor que GFAP nativa con o sin PTM.
Los derivados de GFAP se usan para apoyar el diagnóstico de o para diagnosticar el accidente cerebrovascular hemorrágico, la transformación hemorrágica y el accidente cerebrovascular isquémico mortal. En una realización adicional, el uso se realiza en combinación con una gammagrafía cerebral. La gammagrafía cerebral incluye tomografía computerizada (TC), rayos X, obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM), ultrasonido o cualquier otra exploración basada en una máquina (dispositivo médico) en la que la interacción del cerebro con la salida de ondas o partículas de un dispositivo médico permite destacar un acontecimiento cerebral anómalo, siendo un acontecimiento cerebral anómalo aquel que potencialmente es perjudicial para el cerebro. Los usos descritos son aplicables a derivados de GFAP que incorporan la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1). La invención también describe un anticuerpo que se une a un epítopo de una especie de GFAP incorporado en la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1). El epítopo al que se une el anticuerpo puede ser dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más residuos de aminoácidos contiguos. Los datos experimentales muestran que las dos secuencias peptídicas que se superponen a la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1), concretamente las secuencias GALNAGFKETRA (SEQ ID NO: 6) y EMMELNDRFASY (SEQ ID NO: 7), no se unen al anticuerpo, lo que sugiere que uno o más de los residuos centrales que no se superponen de ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1), concretamente SERA (SEQ ID NO: 5), probablemente comprendan el epítopo. Por tanto, en una realización adicional, la invención describe un anticuerpo en el que el epítopo comprende al menos un aminoácido de la secuencia SERA (SEQ ID NO: 5) de ETRASERAEMME (SEQ ID No : 1). La especie de GFAP a la que se une el anticuerpo es preferiblemente un derivado de GFAP de peso molecular menor que la GFAP nativa con o sin PTM y/o la GFAP nativa con PTM. El anticuerpo puede unirse a un derivado de GFAP correspondiente a la especie de GFAP de menor peso molecular en el patrón de Calbiochem, lo que implica que los anticuerpos GF9 y GF10 se unen a un derivado de GFAP de peso molecular de aproximadamente 44 kDa. (Véanse las figuras 10 y 11 y la hoja de datos de Calbiochem que describe que el patrón de GFAP tiene un peso molecular de 43 a 49 kDa); el anticuerpo GF9 puede unirse a otros derivados de GFAP de peso molecular menor o mayor de aproximadamente 43 kDa pero menor de aproximadamente 49 KDa, así como a especies de GFAP de peso molecular mayor de aproximadamente 49 kDa (véanse los dos geles superiores más a la derecha de la figura 10). La utilidad del anticuerpo y los métodos de la invención se reconocerán para otras especies de GFAP, incluyendo las isoformas de GFAP, GFAP beta, GFAP kappa, GFAP gamma, GFAPAEx6, GFAPA135, GFAPA164 y GFAPAEx7 (Moetonet al2016). El anticuerpo puede unirse (unir químicamente, por ejemplo, mediante unión covalente) a, o adsorberse sobre, la superficie de un dispositivo de estado sólido, tal como una perla, micropartícula, placa de microtitulación o biochip. Para unirse químicamente, la superficie del dispositivo de estado sólido habitualmente se activa o modifica químicamente para hacer que la superficie sea susceptible de unión de anticuerpos. Asimismo, el anticuerpo también puede activarse o modificarse químicamente para hacerlo propenso a unirse al dispositivo de estado sólido. El anticuerpo de la invención, en todas sus realizaciones, se usa en el diagnóstico de accidente cerebrovascular, siendo el accidente cerebrovascular preferentemente HS, HT o IS mortal. El anticuerpo de la invención, en todas sus realizaciones, puede incorporarse a un kit. La invención describe además un anticuerpo que se une a un epítopo de una especie de GFAP incorporada en la secuencia ERKIESLEEEIR (SEQ ID NO: 2); este anticuerpo puede ser o bien el anticuerpo detector o bien el de captura y puede unirse (unirse químicamente, por ejemplo, mediante unión covalente) a o adsorberse sobre la superficie de un dispositivo de estado sólido, tal como una perla, placa de microtitulación o biochip. Para unirse químicamente, la superficie del dispositivo de estado sólido habitualmente se activa o modifica químicamente para hacer que la superficie sea propensa a la unión de anticuerpos. Asimismo, el anticuerpo también puede activarse o modificarse químicamente para hacerlo propenso a unirse al dispositivo de estado sólido. El kit mencionado anteriormente también puede incorporar un anticuerpo que se une a un epítopo de una especie de GFAP incorporado en la secuencia (SEQ ID NO: 2). La invención describe además un anticuerpo de captura y un anticuerpo detector que se unen cada uno a un epítopo diferenciado de residuos de aminoácido no superpuestos comprendidos dentro de la secuencia 60 a 383 de GFAP correspondiente a los números de Uniprot de GFAP, P14136-1, P14136-2 y P14136-3 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11) para su uso en el diagnóstico o apoyo del diagnóstico de accidente cerebrovascular; los anticuerpos pueden ser GF9 y GF10, así como los anticuerpos disponibles comercialmente 4A11, SMI-21, SMI-23, SMI-24, SMI-25, 6F2 y 2.2B10 (véase Lin 2017, PloS One, Characterisation of a panel os monoclonal antibodies recognising specific epitopes on GFAP) en combinaciones de anticuerpo de captura-detector en los que en epítopo de la especie de GFAP al que se une el anticuerpo de captura es diferenciado de y no interfiere con (es decir, no socaba la unión de) el epítopo al que se une anticuerpo detector. Las combinaciones de anticuerpos de captura-detector preferidas para su uso en los métodos de la invención son GF9 y GF10, y GF9 y 4A11, en las que para ambos pares, cada uno de los dos anticuerpos dentro de un par puede ser el anticuerpo de captura o el anticuerpo detector, pero es preferible que GF9 sea el anticuerpo de captura para cada par. Una combinación de anticuerpo de captura-detector preferida para su uso en un método de inmunoensayo o kit para unirse a especie de GFAP es 4A11 y GF9, especialmente cuando el anticuerpo GF9 es el anticuerpo de captura. Al dirigirse a los residuos 60 a 383 comunes a las isoformas de GFAP correspondientes a los números de Uniprot P14136-1, P14136-2 y P14136-3 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11), usando un formato de inmunoensayo de tipo sándwich, puede lograrse un ensayo de sensibilidad mejorada. Los residuos 60 y 383 corresponden a aminoácidos terminales después de la exposición de GFAP nativa a la enzima calpaína. La escisión de uno o ambos de estos residuos dentro de GFAP nativa da lugar a los siguientes derivados de GFAP en los que el intervalo numérico dado corresponde al intervalo de residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (número de Uniprot de GFAP P14136-1) y pM es el peso molecular aproximado (entre paréntesis está el peso molecular exacto basado en GFAP sin PTM): GFAP 1-59 PM= ~ 6.000 Da (6.339 Da), GFAP 384-432 PM= ~ 6.000 Da (5.670 Da), GFAP 60-383 PM= ~ 38.000 Da (37.906 Da) , GFAP 1383 PM= -44.000 Da (44.228 Da), GFAP 60-432 PM= -44.000 Da (43.559 Da). Puede usarse un enfoque comparable con los números de Uniprot de GFAP P14136-2 y P14136-3 (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11). Uno o más de estos derivados de GFAP podrían usarse como biomarcadores de accidente cerebrovascular o apoyar el diagnóstico de accidente cerebrovascular y usarse en los métodos y productos de la invención descritos en el presente documento.
La invención describe el uso de derivados de GFAP como marcadores de accidente cerebrovascular, especialmente accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica o accidente cerebrovascular isquémico mortal; el derivado de GFAP puede tener cualquier peso molecular menor que la GFAP nativa sin PTM y puede tener aproximadamente 35 kDa, 36 kDa, 37 kDa, 38 kDa, 39 kDa, 40 kDa, 41 kDa, 42 kDa, 43 kDa, 44 kDa. 45 kDa, 46 kDa, 47 kDa, 48 kDa y 49 kDa. Los geles de proteínas son una técnica convencional usada en la separación de proteínas y la asignación de pesos moleculares aproximados y el término “aproximadamente” refleja esto. El número de producto de Calbiochem 344596 es un patrón de GFAP purificado a partir de cerebro humano que tiene un peso molecular de entre 43 y 49 kDa (hoja de datos). La referencia al patrón de Calbiochem (carril A) de los geles de las figuras 10 y 11 y a las características de unión epitópica del anticuerpo GF9 implica que un derivado de GFAP de PM = 43.000 - 44.000 Da aumenta en las muestras de pacientes con accidente cerebrovascular. Esto podría corresponder a la secuencia de aminoácidos 60-432 o 1 383 de número de Uniprot de GFAP P14136-1 (SEQ ID NO: 9) generada por digestión con calpaína; dada la proximidad del epítopo de GF9 al punto de digestión de calpaína 59-60, el derivado 60-432 de GFAP es una posibilidad. Los geles de la figura 10 destacan otros derivados de GFAP de PM = 43-49 kDa y de PM > 49 kDa a aproximadamente 55 kDA que se producen en muestras de pacientes con accidente cerebrovascular y que también pueden usarse para diagnosticar o apoyar el diagnóstico de accidente cerebrovascular.
Preferiblemente el derivado o derivados de GFAP se unen a un anticuerpo, uniéndose el anticuerpo a un epítopo dentro de la secuencia ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) del/de los derivado(s) de GFAP, preferiblemente al menos a un aminoácido dentro de la secuencia SERA (SEQ ID NO: 5) del derivado de GFAP. El anticuerpo es preferiblemente GF9. Tal como se usa en el presente documento, el término “accidente cerebrovascular isquémico (IS)” se refiere al tipo de accidente cerebrovascular que se produce cuando disminuye el riego sanguíneo al cerebro, dando como resultado daño cerebral. Un accidente cerebrovascular isquémico se produce cuando un vaso sanguíneo se bloquea, habitualmente a través de un coágulo de sangre. Este coágulo puede formarse localmente en una placa aterosclerótica (accidente cerebrovascular trombótico) o, alternativamente, puede producirse debido a una partícula o residuo que se desplaza y se originó en otro punto del torrente sanguíneo (accidente cerebrovascular embólico). El término “ataque isquémico transitorio (TIA)” se refiere a un “mini accidente cerebrovascular” que se produce cuando el riego sanguíneo al cerebro disminuye temporalmente. Se diagnostica un TIA si los síntomas se resuelven rápidamente (en el plazo de 24 horas, recuperando el individuo su salud normal). El término “seudoaccidente cerebrovascular” se aplica a afecciones distintas del accidente cerebrovascular que producen uno o más síntomas asociados con el accidente cerebrovascular y que conducen a que la afección del individuo se clasifique inicialmente como posible accidente cerebrovascular. El término “accidente cerebrovascular hemorrágico (HS)” se produce cuando la sangre se acumula dentro de la bóveda del cráneo, generalmente cuando se rompe un vaso sanguíneo debilitado. El accidente cerebrovascular hemorrágico puede clasificarse en dos subtipos principales: intracerebral (dentro del tejido cerebral); y subaracnoideo (alrededor de la superficie del cerebro y debajo de su capa protectora). La transformación hemorrágica (HT) o un transformador hemorrágico describe a un individuo inicialmente diagnosticado con un accidente cerebrovascular isquémico que en un momento posterior desarrolla un accidente cerebrovascular hemorrágico (véase Jickling 2014 para una revisión de la HT). Las referencias en el presente documento a “un paciente que ha sufrido o está sufriendo un accidente cerebrovascular” incluyen un paciente al que se le ha diagnosticado que actualmente sufre un accidente cerebrovascular o que se le ha diagnosticado o se le ha diagnosticado que ha tenido un accidente cerebrovascular previamente. El accidente cerebrovascular puede haber sido un acontecimiento reciente, habiendo iniciado tal acontecimiento el procedimiento de búsqueda de ayuda clínica del individuo. Los términos “sujeto” y “paciente” pueden usarse indistintamente en el presente documento y se refieren a un mamífero que incluye un no primate (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, perro, gato, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un mono y un ser humano). Preferiblemente, el sujeto o paciente es un ser humano. Tal como se usa en el presente documento, el término “biomarcador” se refiere a una molécula presente en una muestra biológica obtenida de un paciente, cuya concentración en dicha muestra puede ser indicativa de un estado patológico. Los derivados de GFAP y la GFAP total pueden usarse como biomarcadores complementarios a otros biomarcadores de accidente cerebrovascular para aumentar el poder de diagnóstico de un ensayo de accidente cerebrovascular. Tal como se usa en el presente documento, el término “biomarcador complementario” se refiere a un biomarcador que puede usarse junto con otros biomarcadores de accidente cerebrovascular para apoyar el diagnóstico; por tanto, se contemplan los derivados de GFAP y de GFAP original con uno o más biomarcadores de accidente cerebrovascular para su uso en el diagnóstico de accidente cerebrovascular. Se entiende bien en la técnica que las concentraciones normales o “de fondo” de los biomarcadores pueden presentar una ligera variación debido, por ejemplo, a la edad, el sexo o los genotipos étnicos/geográficos. Como resultado, el valor de corte usado en los métodos de la invención también puede variar ligeramente debido a la optimización dependiendo del paciente/población objetivo. La muestra biológica obtenida de un paciente es preferentemente una muestra de sangre, suero o plasma. Tal como se usa en el presente documento, el término “ex vivo” tiene su significado habitual en la técnica y se refiere a una muestra que se ha extraído del cuerpo de un paciente. Cuando se toma una muestra de sangre del paciente para su análisis, se analiza sangre completa, suero o plasma. El análisis de la muestra de sangre puede realizarse mediante varias metodologías analíticas, tal como espectrometría de masas, asociadas a una etapa de separación previa, tal como la cromatografía. La metodología preferida se basa en la inmunodetección. La tecnología de inmunodetección también se incorpora fácilmente a dispositivos que pueden transportarse o portátiles para su uso fuera del entorno clínico. Puede usarse un inmunoensayo cuantitativo, tal como una inmunotransferencia de tipo Western o ELISA, para detectar la cantidad de proteína. Un método de análisis preferido comprende el uso de un biochip de múltiples analitos que permite detectar y cuantificar varias proteínas simultáneamente. La electroforesis en gel 2D también es una técnica que puede usarse para el análisis de múltiples analitos. Aunque los anticuerpos policlonales o monoclonales son los agentes de unión preferidos usados en la invención, pueden usarse fragmentos de anticuerpos de cadena corta, fragmentos de cadena sencilla y otras sondas basadas en anticuerpos. Preferiblemente, el dispositivo de estado sólido usado en los métodos de la presente invención es una placa de microtitulación, preferiblemente el sistema de tecnología de matriz de biochip (BAT) (disponible de Randox Laboratories Limited). Más preferentemente, puede usarse el aparto Evidence Evolution, Evidence Investigator y Evidence Multistat (disponible en Randox Laboratories) para determinar los niveles de biomarcadores en la muestra.
Proteína ácida fibrilar glial
GFAP es una proteína de clase III de los filamentos intermedios (FI) localizada en los astrocitos del SNC, las células de Schwann gastrointestinales, las células gliales entéricas y las células de Muller de la retina.
Se han identificado aproximadamente diez isoformas de GFAP; sin embargo, la mayor parte de la investigación clínica sigue centrándose en la isoforma 1, que es la GFAP predominante expresada en los astrocitos del SNC. Es cada vez más evidente que GFAP está sujeta a patrones complejos de PTM que definen su función fisiológica y su papel en la progresión patológica. Un parámetro fisiológico fundamental, la fosforilación, constituye un acontecimiento clave de PTM que define la transición entre GFAP monoméricos fosforilados y diméricos no fosforilados que se integran con otras proteínas para generar una estructura citoesquelética celular estable. Por el contrario, la hiperfosforilación de GFAP se ha implicado en la progresión de la enfermedad provocando una pérdida de integridad celular. Un parámetro definitorio de la fisiopatología cerebral aguda da como resultado un aumento del secuestro de calcio intracelular y un cambio en el equilibrio iónico que es excitotóxico, activando varias cascadas intracelulares dañinas, incluyendo la peroxidación lipídica y la generación de radicales libres. Dado que la citrulinación o desaminación es una transformación dependiente de calcio de residuos de arginina realizada por miembros de la familia de las peptidil-arginina deiminasas, se ha propuesto que desempeña un papel causal en múltiples trastornos neurodegenerativos. Además, la citrulinación de proteínas está bien documentada como parámetro definitorio en enfermedades autoinmunes y los autoanticuerpos frente a GFAP son característicos en la circulación sistémica de pacientes con accidente cerebrovascular y TBI. La GFAP citrulinada también se ha observado en patologías neurodegenerativas tal como el tejido cerebral de Alzheimer, mientras que se ha detectado un perfil complejo de GFAP citrulinada en el cerebro de pacientes con esclerosis múltiple. También se ha detectado un aumento de la citrulinación en las retinas y las copas ópticas de la degeneración macular relacionada con la edad y en nervios ópticos glaucomatosos. La carbonilación de proteínas es una modificación indicativa de estrés oxidativo que se caracteriza por la adición de grupos carbonilo a aminoácidos unidos a proteínas. La carbonilación de proteínas puede producirse mediante oxidación directa de aminoácidos diana por especies reactivas de oxígeno o mediante interacción con especies reactivas de carbonilo que son producto de la peroxidación lipídica. Por cualquiera de los mecanismos, las modificaciones de carbonilo resultantes pueden alterar la función de las proteínas y contribuir a la patología. Como consecuencia, la carbonilación es una métrica del estrés oxidativo que es característico de diversas patologías neurodegenerativas, incluyendo la esclerosis múltiple y la enfermedad de Alzheimer. La GFAP de ha identificado como una proteína diana sometida a carbonilación selectiva. La glicosilación es uno de los acontecimientos de PTM más comunes y complejos. El análisis de los tejidos de la enfermedad de Alzheimer identificó 46 especies de GFAP solubles. Se ha observado un aumento del 60 % en la cantidad de especies de GFAP más ácidas en la AD, siendo las variantes tanto fosforiladas como N-glicosiladas; las especies más básicas estaban O-glicosiladas y no mostraron diferencias cuantitativas entre los cerebros cadavéricos de AD y los de control. Estos datos proporcionan evidencia clínica de que la caracterización de niveles de proteínas específicos de cada especie en condiciones fisiopatológicas puede mejorar el diagnóstico clínico.
Formato Analítico para detección/cuantificación de GFAP
Cada uno de los métodos descritos de la invención puede llevarse a cabo usando cualquier técnica analítica adecuada, pero las especies de GFAP son especialmente susceptibles de detección y cuantificación usando espectrometría de masas (preferiblemente junto con un método de separación cromatográfico o basado en gel adecuado, o similar) y metodologías basadas en inmunología; se prefieren particularmente los métodos inmunoanalíticos. Los métodos, tal como se indicó anteriormente, se basan preferiblemente en el formato de inmunoensayo de tipo sándwich que implica un anticuerpo de captura y un anticuerpo detector, uniéndose cada anticuerpo a un epítopo diferente en la especie de GFAP diana. El anticuerpo de captura preferiblemente está ubicado en o unido químicamente a la superficie de un dispositivo de estado sólido. Normalmente, un inmunoensayo de tipo sándwich se realiza primero mediante la adición de la muestra que va a analizarse, seguido por la adición del anticuerpo detector después de la unión del anticuerpo de captura-analito (especie GFAP). El anticuerpo detector se conjuga con un marcador detectable que promueve o proporciona una señal detectable y medible que permite detectar o cuantificar el analito. La señal puede ser cualquier radiación electromagnética adecuada basada, por ejemplo, en fosforescencia, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc. Preferiblemente, se usa fluorescencia o quimioluminiscencia. Un marcador detectable particularmente preferido es la peroxidasa de rábano picante. En un formato de inmunoensayo preferido, un anticuerpo de captura de la invención se adsorbe o se une químicamente a un dispositivo de estado sólido, y después de la adición de la muestra, se añade un anticuerpo detector que se une a las especies de GFAP capturadas.
Análisis estadístico
Las concentraciones o valores de corte habitualmente se derivan usando técnicas estadísticas convencionales. Un método común de análisis estadístico de biomarcadores es usar métodos univariados para comparar los niveles de biomarcadores en diversos grupos y resaltar aquellos biomarcadores cuyas concentraciones difieren significativamente entre grupos particulares. Esto va seguido por el análisis de la característica operativa del receptor (ROC). La curva ROC es un método preferido para evaluar la precisión de una prueba de diagnóstico; aborda tanto la sensibilidad, el número de verdaderos positivos, como la especificidad, el número de falsos positivos, de la prueba. Si van a usarse dos o más biomarcadores en el método de diagnóstico de IS, es decir GFAP y uno o más biomarcadores incluyendo ADN, ARN y marcadores basados en proteínas, puede derivarse un modelo matemático adecuado, tal como una ecuación de regresión logística. La ecuación de regresión logística podría incluir otras variables como la edad y el sexo del paciente. La curva ROC puede usarse para evaluar la precisión del modelo de regresión logística. La ecuación de regresión logística puede usarse independientemente o en un algoritmo para ayudar en la toma de decisiones clínicas. El experto conocerá numerosos métodos adecuados para desarrollar algoritmos estadísticos, y todos ellos están dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos de algoritmos de clasificación adecuados incluyen regresión logística multinominal, red neuronal perceptrón multicapa (MLP), redes neuronales artificiales, máquinas de vectores de soporte y clasificadores de bosque aleatorio. Para adquirir una sensibilidad y especificidad definidas, las dos condiciones de accidente cerebrovascular no pernicioso y accidente cerebrovascular pernicioso deben demarcarse usando una métrica adecuada y esto requiere que se adquiera un valor de referencia para la “condición normal” (derivada de la población de control), en este caso la cohorte no perniciosa. La condición normal también podría ser una cohorte sana. El valor de referencia podría ser un valor de corte predefinido que logre los valores óptimos de sensibilidad y especificidad para la condición objetivo, una mediana de valor, un valor medio, un valor cuartil, etc. La metodología y el analizador usados para medir un biomarcador en una muestra biológica inevitablemente dan como resultado que el valor de concentración de un biomarcador en particular varíe. Por tanto, aunque el valor de corte, el valor medio, etc. usados para determinar el riesgo de una afección perniciosa o no perniciosa en un paciente con sospecha de accidente cerebrovascular probablemente variará ligeramente de una plataforma a otra, por ejemplo para un inmunoensayo con ligera variación debido, por ejemplo, al anticuerpo (monoclonal, policlonal, etc.) o al sustrato (perla, placa de Elisa, biochip, etc.), el enfoque que usa el nivel de concentración de GFAP como biomarcador para este fin es válido e independiente de la plataforma y la metodología utilizadas en el procedimiento analítico.
Los hallazgos actuales también permiten un método para predecir un accidente cerebrovascular pernicioso (figura 1) en un paciente con sospecha de accidente cerebrovascular mediante la medición de derivados de GFAP y/o GFAP nativa utilizando los métodos y anticuerpos descritos anteriormente y en las reivindicaciones.
Métodos, ejemplos y resultados
Grupo de pacientes. El estudio consistió en 39 pacientes que presentaban síntomas de accidente cerebrovascular ingresados en el servicio de urgencias del Hospital General KAT de Atenas, Grecia. Los pacientes se clasificaron al ingreso usando análisis clínico que incorporaba la escala escandinava de accidentes cerebrovasculares y mediante TC. Se tomaron muestras de sangre en el momento del ingreso, a las 24 horas después del ingreso y cada 24 horas posteriormente hasta el día seis, excepto en los pacientes diagnosticados como TIA e seudoaccidentes cerebrovasculares que se sometieron a una única extracción de muestra de sangre en el momento del ingreso. El tiempo desde el inicio de los síntomas del accidente cerebrovascular y el ingreso hospitalario fue < 6 horas. Los criterios de exclusión incluyeron pacientes que ingresaron en el hospital > 6 horas desde el momento del inicio de los síntomas del accidente cerebrovascular, pacientes con patologías hepáticas o renales y pacientes que habían sufrido previamente un accidente cerebrovascular. También se obtuvieron y analizaron muestras del CSF de individuos que habían sufrido una hemorragia subaracnoidea usando electroforesis en gel 1 D e inmunotransferencia de tipo Western.
Análisis de muestras.Se analizaron muestras de sangre en plasma con EDTA obtenidas de los pacientes del grupo de estudio para detectar GFAP. Las proteínas se detectaron y cuantificaron usando biochips que incorporaban anticuerpos específicos para GFAP (anticuerpo de captura 4A11 y anticuerpo detector GA-5 - Kit 1) y el sistema Evidence Investigator (Randox Laboratories Ltd, Crumlin, RU). El kit 2 comprendía anticuerpos monoclonales (propiedades descritas en la Descripción) localizados mediante mancha en un biochip cerámico (el biochip cerámico usado para el kit 1 y tal como se describe en el documento EP0874242). Se analizaron muestras de CSF de individuos que habían sufrido hemorragia subaracnoidea usando electroforesis en gel 1 D e inmunotransferencia de tipo Western.
Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS e inmunotransferencia de tipo Western
En general se aplicaron condiciones convencionales. Se usó gel de poliacrilamida (14%). Las muestras se agitaron en vórtex y se incubaron en un baño seco durante 10-15 minutos a 95 °C durante aproximadamente 10 15 minutos, seguido por agitación en vórtex adicional. Se añadieron las muestras y el marcador de MW (Thermo Scientific n.° de cat. 26616) a los carriles apropiados y el gel corrió a aproximadamente 120-200 V hasta que el frente de colorante alcanzó la parte superior del gel. El casete tipo sándwich Western estaba hecho de esponja blanca, filtro de membrana, filtro de gel, esponja negra. El Western se hizo funcionar a aproximadamente 120 V durante una hora con una bolsa de hielo dentro del sistema mini-Protean y se dejó en agitación. Luego se bloqueó la transferencia en leche en polvo al 5% (20 ml) durante al menos 30 minutos. Se añadieron anticuerpos a las transferencias apropiadas y se lavaron con TBST (x3) durante 10 minutos. En caso necesario, se añadió HRP anti-especie a las transferencias seguido por lavados con TBST (x4) adicionales. La membrana se reveló usando una película de rayos X, un kit de inmunotransferencia de tipo Western de quimioluminiscencia BM, revelador y fijador. El uso de datos de gel (véanse las figuras 10 y 11) respalda la caracterización de las diversas especies de GFAP presentes en las muestras de pacientes.
Producción de anticuerpos.Se implementaron técnicas convencionales para la producción de anticuerpos monoclonales para el kit 2. Se inmunizaron ovejas con proteína ácida fibrilar glial procedente de cerebro humano. Se recogieron linfocitos y se fusionaron con células de heteromieloma. Los sobrenadantes del hibridoma resultante se examinaron para detectar la presencia de anticuerpos específicos usando ensayos basados en ELISA. Se clonaron los hibridomas positivos para producir hibridomas monoclonales estables. Los anticuerpos se purificaron y evaluaron mediante ELISA de unión directa para determinar su especificidad por GFAP del cerebro humano. Se llevó a cabo un trabajo molecular adicional usando ELISA y SDS de caracterización de anticuerpos convencional y técnicas Western. Se identificaron dos anticuerpos para pruebas adicionales, los anticuerpos GF9 y GF10 (Randox Laboratories, Crumlin, Irlanda del Norte).
Caracterización de anticuerpos.Se efectuó la caracterización de la unión de anticuerpos. Se generaron péptidos conjugados con BSA que abarcan residuos de aminoácidos de GFAP. Se inmovilizaron péptidos conjugados con BSA individuales en regiones de prueba diferenciadas (DTR) en un biochip, así como sustancias de control. Los dos anticuerpos de captura y los dos detectores de los kits 1 y 2 se conjugaron con peroxidasa de rábano picante (HRP) y cada anticuerpo conjugado individual se incubó en un biochip individual y se obtuvieron imágenes. Los fragmentos de la sustancia de prueba se localizaron mediante mancha tal como se describe en las figuras 5 y 8 y su posición en el biochip (cuadrícula de 7 x 7) se muestra en las figuras 6 y 9 (arriba). Las imágenes de las Figuras 7 y 9 (abajo) son los cuatro anticuerpos analizados; las DTR muestran una imagen gris/blanca que confirma la unión del anticuerpo a una especie de GFAP localizada mediante mancha o a una sustancia de control, por ejemplo, los cuatro anticuerpos se unen a la GFAP nativa localizada mediante mancha en las posiciones 37 (Merck), 39 (Hytest) y 41 (Randox).
Tabla 1. Anticuerpos usados en análisis de muestras y estudios de caracterización
t
Resultados
Se compararon cohortes de accidentes cerebrovasculares perniciosos y no perniciosos usando análisis de curva ROC. Los resultados se muestran en la tabla 2 y la figura 1.
Tabla 2. Medidas estadísticas de los niveles de GFAP usando dos kits de inmunoensayo diferentes
Los kits de GFAP 1 y 2 usan diferentes anticuerpos y difieren en sus sensibilidades (figura 1 y tabla 2): al detectar derivados de GFAP, la sensibilidad de la prueba aumenta, tal como se muestran por el valor de p y el valor de AUC. El kit 1 proporciona una sensibilidad del 44 % y una especificidad del 96 % con una concentración de corte de GFAP de 0,160 ng/ml. El kit 2 proporciona una sensibilidad del 75 % y una especificidad del 100 % con una concentración de corte de GFAP de 0,185 ng/ml. La figura 1 muestra que usando los anticuerpos que detectan GFAP nativa únicamente, más de la mitad de los individuos con accidente cerebrovascular no pernicioso tienen niveles indetectables (gráfico superior de la figura 1), a diferencia de la detección de GFAP total (gráfico inferior de la figura 1). El hallazgo de que están presentes derivados de GFAP en la sangre de pacientes que han sufrido HS, HT o IS mortal en cantidades que permiten un ensayo más sensible en comparación con la detección de GFAP nativa sola fue inesperado y permite un ensayo mucho más sensible para el diagnóstico de accidente cerebrovascular. La caracterización de los anticuerpos mostró que el anticuerpo de captura anti-GFAP del kit 2 (GF9) se unía al fragmento peptídico localizado mediante mancha en la posición 4 de DTR del biochip. Esto corresponde al péptido localizado mediante mancha ETRASERAEMME (SEQ ID NO: 1) (flecha de la figura 7, imagen superior izquierda). Ni el anticuerpo del kit 1 ni el anticuerpo detector GF10 del kit 2 se unieron a esta secuencia. El anticuerpo detector del kit 1 (G<a>-5) se unió a la secuencia TIPVQTFSNLQIRE (SEQ ID NO: 8). Los resultados mostraron que el par de anticuerpos más sensible para su uso en un método de inmunoensayo era la combinación de anticuerpos GF9 y 4A11 (véase la figura 13). Este ensayo tuvo una sensibilidad superior que cuando se usó un anticuerpo de captura GF9 con un anticuerpo detector GA-5, lo que puede sugerir que los productos de digestión con calpaína de GFAP no estaban detectándose o no se detectaron tan eficientemente cuando se usó el anticuerpo detector GA-5 (véase la figura 14). Por tanto, aunque puede lograrse un método mejorado basado en inmunoensayo para su uso en el diagnóstico del accidente cerebrovascular mediante la detección de GFAP nativa y derivados de GFAP usando diversas combinaciones de anticuerpo de capturadetector, puede obtenerse un inmunoensayo de mayor sensibilidad usando una combinación de anticuerpo de captura-detector en la que cada anticuerpo se une a secuencias de aminoácidos diferenciadas dentro de la GFAP nativa (isoformas 1,2 ó 3) que residen dentro del intervalo de 60-390 aminoácidos.
Bibliografía
Jickling GCet al(2014). Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 34: 185-199.
Moeton M.et al(2016). Cellular and Molecular Life Sciences, 73: 4101-4120.
Claims (15)
- REIVINDICACIONESi. Método inmunoanalítico de diagnóstico, o de apoyo del diagnóstico, de accidente cerebrovascular en un sujeto que comprende medir la cantidad de un derivado de GFAP que comprende la secuencia ETRASERAEMME presente en una muestra que se ha tomado del sujeto, incorporando el método un anticuerpo que se une a un epítopo del derivado de GFAP dentro de la secuencia ETRASERAEMME, en el que una cantidad de derivado de GFAP en la muestra a la que se une el anticuerpo que es mayor que la cantidad de la GFAP en un sujeto de control es indicativa de accidente cerebrovascular.
- 2. Método según la reivindicación 1, en el que el accidente cerebrovascular es accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica o accidente cerebrovascular isquémico mortal.
- 3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de control de GFAP es uno que se ha medido en un paciente sano o una población sana de pacientes, o se ha derivado de una población de pacientes clasificados como con uno o más de TIA, seudoaccidente cerebrovascular o accidente cerebrovascular isquémico.
- 4. Uso de un derivado de GFAP que comprende la secuencia ETRASERAEMME como marcador de accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica o accidente cerebrovascular isquémico mortal en un ensayo de diagnósticoin vitro,en el que la secuencia ETRASERAEMME es la diana de un anticuerpo en el ensayo de diagnóstico.
- 5. Uso según la reivindicación 4, en el que el derivado de GFAP tiene un peso molecular de aproximadamente 44 kDa y preferiblemente en el que el epítopo dentro de la secuencia ETRASERAEMME comprende al menos un aminoácido dentro de la secuencia SERA del derivado de GFAP.
- 6. Anticuerpo que se une a un epítopo de GFAP y el epítopo está incorporado en la secuencia ETRASERAEMME.
- 7. Anticuerpo según la reivindicación 6, en el que el epítopo al que se une el anticuerpo está dentro de la secuencia ETRASERAEMME y comprende al menos un aminoácido de la secuencia SERA.
- 8. Anticuerpo según las reivindicaciones 6 y 7, en el que GFAP es un derivado de GFAP de peso molecular menor que GFAP nativa sin modificación postraducional y tiene un peso molecular de aproximadamente 44 kDa.
- 9. Anticuerpo según las reivindicaciones 6 a 8, que se une a o se adsorbe sobre la superficie de un dispositivo de estado sólido, preferiblemente en el que el dispositivo de estado sólido es un biochip.
- 10. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para el diagnósticoin vitrode accidente cerebrovascular.
- 11. Uso según la reivindicación 12, en el que el accidente cerebrovascular es accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica o accidente cerebrovascular isquémico mortal.
- 12. Kit que incorpora un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, preferiblemente en el que el kit incorpora un anticuerpo adicional que se une a un epítopo de una especie de GFAP con la condición de que no se una a un aminoácido dentro de la secuencia ETRASERAEMME.
- 13. Uso de un anticuerpo de captura y detector cada uno de los cuales se une a un epítopo diferenciado de residuos de aminoácido no superpuestos comprendidos dentro de la secuencia de aminoácidos 60 a 383, en el que la secuencia de aminoácidos 60-383 es un fragmento de una cualquiera de SEQ ID NO: 9 a 11 en un método de inmunoensayo para diagnosticar o apoyar el diagnóstico de accidente cerebrovascular, en el que uno de los anticuerpos de captura y detector se une a un epítopo de GFAP dentro de la secuencia ETRASERAEMME.
- 14. Uso según la reivindicación 13, en el que una de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 se une mediante el anticuerpo de captura (GF9) y la otra se une mediante el anticuerpo detector (4A11).
- 15. Uso según las reivindicaciones 13 y 14, en el diagnóstico o el apoyo del diagnóstico de accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica o accidente cerebrovascular isquémico mortal.
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