KR100559374B1 - 종양 진단 마커로서의 헤모글로빈 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤모글로빈으로 이루어진 종양 진단 마커, 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양 진단 마커의 검출을 위한 조성물 및 진단 키트, 및 헤모글로빈에 특이적인 항체를 사용하여 종양 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 특히 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암 또는 유방암의 진단에 유용하다.

헤모글로빈, 헤모글로빈-알파, 헤모글로빈-베타, 종양 진단 마커, SELDI-TOF-MS, ELISA

Description

종양 진단 마커로서의 헤모글로빈{Hemoglobin as tumor diagnostic marker}

도 1은 WCX 단백질 칩을 이용하여 정상인과 난소암 환자의 혈청 내 단백질 발현 양상을 조사하여 비교한 SELDI-TOF-MS(Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight-mass spectrometry) 스펙트럼이며, 작은 분자량 크기 부분을 표시하였다.

도 2는 WCX 단백질 칩을 이용하여 정상인과 난소암 환자의 혈청 내 단백질 발현 양상을 조사하여 비교한 SELDI-TOF-MS 스펙트럼이며, 중간 분자량 크기 부분을 표시하였다.

도 3은 난소암 환자의 혈청에서 과발현된 15.1 및 15.8kDa 단백질을 16% SDS-PAGE에서 분리한 겔 사진이며, SELDI-TOF-MS로 15.1 및15.8kDa 단백질이 CM-세파로오스 컬럼에서 분리됨을 확인하였다.

도 4는 효소결합 면역흡착 검사(ELISA)를 이용한 난소암과 자궁경부암 환자 및 정상 사람의 혈청 헤모글로빈 흡광도 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 ELISA를 이용한 간암, 위암, 폐암, 유방암 환자 및 정상 사람의 혈청 헤모글로빈 흡광도 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 종양 진단에 관한 것으로서, 구체적으로는 헤모글로빈으로 이루어진 종양 진단 마커, 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양 진단 마커의 검출을 위한 조성물 및 진단 키트, 및 헤모글로빈에 특이적인 항체를 사용하여 종양 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

현재까지 다수의 종양 진단 바이오마커들이 밝혀져 있으며, 이들은 종양의 진단에 응용되고 있다.

이러한 종양 진단 마커들의 예로는, 유방암 진단에 유용한 CA27 및 CA29, 직장결장암 진단에 유용한 CEA, 췌장암 및 담즙관암에 유용한 CA19-9, 간세포암 및 비정상피종성 생식세포종 진단에 유용한 AFP, 비정상피종성 생식세포종 및 임신성융모성 질환의 진단에 유용한 b-HCG, 난소암 진단에 유용한 CA125, 및 전립선암 진단에 유용한 PSA 등이 알려져 있다.

난소암은 부인 암 중 사망률이 가장 높은 암이나 조기 진단시 5년 이상 생존율이 90% 이상으로서, 조기 진단이 대단히 중요한 암 중 하나이다. 현재 사용 중인 난소암 진단 바이오마커인 난소암 항원 125 (ovarian cancer antigen 125, CA125)의 농도를 측정하여 난소암을 조기 진단하는 경우에는, 비교적 낮은 50 내지 60% 정도의 정확도만을 나타내고 있다 [Katherrine, R.K. et al., PNAS 21:12343- 12348 (2003)]. 또한, CA125는 자궁 섬유종, 신장 이상 혹은 월경 등에 의한 위 양성 반응이 자주 발견되는 단점을 갖고 있다 [Menon, U. and Jacobs, I., Curr.opin Obstet. Gynecol. 12:39-42 (2000); Cohen, L.S. et al., Gyneco Oncol 82:40-48 (2001)]. 따라서, CA125를 대체 또는 보완할 수 있는 난소암 진단 바이오마커 또는 표지 물질의 개발이 필요하다.

본 발명자는 암을 진단할 수 있는 종양 진단 마커를 동정하고, 이러한 종양 진단 마커를 암 진단 방법 또는 암 진단 보조 방법에 적용하고자 하였다.

이러한 종양 진단 마커들은 정상 사람에 비해 암 환자에서 증가된 수준 또는 감소된 수준으로 존재하거나 암 환자에서만 특이하게 검출될 수 있다. 따라서, 정상 사람에 비해 암 환자의 시료 중에 상이한 수준으로 존재하는 마커나 암 환자의 시료에만 존재하는 하나 이상의 검출 마커를 확인하는 것은 시험된 개체의 암 진단에 있어 매우 유용한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명자들은 난소암 환자에서 정상 사람에 비해 혈청 내 특정 단백질의 발현이 유의하게 변화한다는 것을 확인하고 이를 사용하여 난소암 환자를 진단하는 방법에서 난소암 진단 마커로서의 사용 가능성을 검증하였으며, 또한 이러한 진단 마커가 난소암 뿐 만 아니라 자궁경부암, 폐암, 유방암 및 간암의 진단에서도 유용한 수단이 될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

하나의 관점으로서, 본 발명은 헤모글로빈으로 이루어진 종양 진단 마커에 관한 것이다.

다른 하나의 관점으로서, 본 발명은 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양 진단 마커를 검출하기 위한 조성물에 관한 것이다.

다른 하나의 관점으로서, 본 발명은 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양진단 마커를 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 헤모글로빈에 특이적인 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계, 및 상기한 항원-항체 복합체의 형성량을 대조군의 형성량과 비교하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 내의 종양 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 SELDI-TOF MS 방법을 통해 난소암 환자들의 혈청과 정상인의 혈청내 단백질의 발현 양상을 비교한 결과, 난소암 환자는 6.44, 6.64, 13.7, 13.9 및 14.1 kDa 단백질의 발현양이 정상인에 비해 낮고 15.1, 15.8 및 15.9 kDa 단백질의 발현양은 정상인에 비해 높다는 것을 확인하였으며, 또한 상기 확인된 단백질중 15.1 kDa 및 15.8 kDa의 단백질의 아미노산 서열 분석 결과, 15.1 kDa의 단백질이 헤모글로빈-알파에 해당하고 15.8 kDa의 단백질이 헤모글로빈-베타에 해당한다는 것을 확인하였다.

이와 같이 유의하게 발현 수준의 차이를 보이는 혈청 단백질들이 종양 진단 바이오마커로서 유용한지를 확인하기 위해서, 상기 확인된 헤모글로빈 단백질에 대한 항체를 사용하여 난소암 환자의 혈청 샘플에 대한 ELISA 분석을 수행하여 난소암 환자를 높은 민감도로 선별할 수 있었다. 또한, 난소암 뿐만 아니라 자궁경부암, 간암, 폐암 및 유방암에서도 고도의 민감도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 정상 사람의 혈청 내 헤모글로빈 최고 농도 0.098를 컷오프 값으로 사용하여, 난소암, 자궁경부암, 간암, 위암, 폐암 및 유방암 환자에 대해 민감도를 시험한 결과, 다양한 암 환자에 대한 판별 민감도가 77%, 79%, 59%, 27%, 60%, 60%로 확인되었다.

상기한 발견에 근거하여, SELDI-TOF-MS에 의해 분석된 6.44, 6.64, 13.7, 13.9, 14.1, 15.1, 15.8 및 15.9 kDa 단백질은 종양 진단 마커로서 종양을 진단하는데 사용할 수 있다. 이러한 종양 진단 마커는, 현재 사용되고 있는 여러 암 진단 표지 물질과 함께 또는 독립적으로 사용하여 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암 및 유방암, 특히 난소암 및 자궁경부암을 조기 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명은 6.44, 6.64, 13.7, 13.9, 14.1, 15.1, 15.8 및 15.9 kDa 단백질의 종양 진단 마커로서의 사용에 관한 것이다.

본 발명에서는 종양 진단 마커를 확인하기 위해 표면-증강된 레이저 탈착/이온화-비행시간 질량 분광분석법(Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight mass spectrometry, SELDI-TOF MS)을 이용하였다.

SELDI는, 일종의 친화도 기초한 질량 분광분석법으로 단백질이 화학적으로 개질된 표면에 선택적으로 흡착되며 불순물은 완충액을 사용한 세척에 의해서 제거되는 방법으로서, 단백질 칩을 이용하여 수집 및 분석을 동시에 수행한다. 이온 교환 혹은 소수성 칩의 경우 단백질 정제에 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 사용하는 것과 유사한 작용기를 직경 2 mm의 알루미늄 표면에 균일하게 붙이고 결합 완충액의 사용 하에 단백질을 친화성 포획시킨다. 결합 완충액의 종류, pH, 이온 농도 등을 조절하여 단백질 분획을 칩 표면에 조성한다. 주어진 조건에서 약하게 표면과 결합된 단백질을 세척 과정을 통하여 제거한 후, 에너지 흡수 분자 (또는 매트릭스)를 첨가하여 단백질을 결정화 한 후 단백질칩 판독기로 판독한다. 본 발명에서는 제조원(Ciphergen Biosystems, US)의 단백질칩 어레이(ProteinChip^R array)를 사용하였으며, 단백질 바이오칩은 WCX-2를 사용하였다. 분석하고자 하는 물질의 분자량에 따라 alpha-시아노-4-하이드록시 신남산 (CHCA MW 189.2, <15kDa 에 주로 사용), 에너지 흡수 분자 1 (EAM1 MW 231.21 10-50 kDa에 주로 사용), 시나핀산 (SPA MW 224.2, >15kDa에 주로 사용)을 사용한다. 질량 분광분석법에 의해 생성된 데이터는 컴퓨터 소프트웨어에 의해서 분석된다. 소프트웨어는 질량 분광분석기로부터의 시그날을 컴퓨터 판독가능한 형태로 전환시키는 코드를 포함하며, 본 발명에서는 단백질칩 데이터 분석 소프트웨어 (ProteinChip Data Analysis Software version 3.1, 제조원: Ciphergen Biosystems)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

본 발명에서 사용된 제조원(Ciphergen Biosystems, US)의 단백질칩 시스템(ProteinChip System)의 검출 방식을 간단히 언급하면 다음과 같다. 단백질칩 상에 난소암 환자 및 정상 사람의 혈청 샘플을 결정상으로 부착시키고 이러한 단백질칩을 단백질칩 판독기(ProteinChip Reader)에 장착한 후, 레이저 빔을 주사하여 단백질칩 상의 샘플 내 표적 단백질을 이온화시키며, 이러한 이온화된 단백질들은 진공 튜브를 통해 이온 검출기를 향해 날라가게 된다. 이때, 단백질의 크기가 작을수록 검출기에 도달하는 속도가 더 빠르게 되어 이러한 비행시간(Time of Flight)에 근거하여 정확한 분자량을 확인할 수 있다. 이러한 방식으로 분석된 질량 피크의 선택 및 스펙트럼의 비교는 제조원(Ciphergen Biosystems, US)의 바이오마커 위저드(Biomarker Wizard)를 사용하였으며 0.3% 범위내의 질량 차이는 동일한 피크로 처리하였다.

상기와 같은 방법을 이용함으로써 하나 이상의 종양 진단 마커들을 검출할 수 있다. 다수의 바이오마커들의 존재를 검출하는 것은 단일 바이오마커를 검출하는 것이 비해, 진단을 위한 보다 많은 정보를 제공하는 장점을 갖는다. 하나의 샘플 내에서 다수의 바이오마커들을 검출하는 것은 위 포지티브 또는 위 네가티브 진단의 확률을 감소시키고 진정 포지티브와 진정 네가티브 진단 확률을 높이는데 기여할 수 있을 것이다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 헤모글로빈으로 이루어진 종양 진단 마커를 제공한다.

헤모글로빈은 알파 및 베타 서브유닛의 다량체이며, 이들 서브유닛은 함께 또는 개별적으로 종양 진단 마커로서 작용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 헤모글로빈은 헤모글로빈-알파, 헤모글로빈-베타 또는 이들의 다량체이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양 진단 마커를 검출하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체를 포함한다. 또한, 완전한 분자뿐만 아니라 에피토프 결정소와 결합할 수 있는 단편, 예를 들면 Fab, F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다.

다클론 항체는 헤모글로빈을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler, G. et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor, D. et al., J. Immunol. Methods 81:31-42, 1985; Cote, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030, 1983; 및 Cole, S. P. et al., Mol. Cell Biol. 62:109-120, 1984).

헤모글로빈에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 또한 제조될 수 있 다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작제하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse, W. D. et al., Science 254: 1275-1281, 1989).

바람직하게는, 단클론 항체를 사용하여 종양 진단 마커로서의 헤모글로빈을 검출한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양진단 마커를 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 심장질환 진단키트에는 헤모글로빈을 선별적으로 인지하는 항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 헤모글로빈에 특이적인 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계, 및 상기한 항원-항체 복합체의 형성량을 대조군의 형성량과 비교하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 내의 종양 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으며, 반드시 이들로만 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 검출할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

헤모글로빈은 혈청 내에 존재하는 단백질로서, 상기한 바와 같은 항원-항체 복합체의 형성량을 정상인의 혈청에 의한 항원-항체 복합체의 형성량과 비교하여 일정 수준 이상 형성량의 나타내는 대상을 종양 환자로 특징지을 수 있다.

본 발명에서는 하기와 같은 정의를 갖는 용어들이 사용된다.

본 발명에서 사용된 용어 "질량 분광분석기(mass spectrometer)"는 가스 상 이온의 질량 대 전하 비(mass to charge ratio)로 해석될 수 있는 변수(parameter)를 측정하는 가스 상 이온 분광분석기를 의미한다. 질량 분광분석기는 통상적으로 이온 공급원 및 질량 분석기를 포함한다. 질량 분광분석기의 예로는 비행시간(time of flight), 자기 섹터(magnetic sector), 4중극 필터(quadrupole filter), 이온 트랩(ion trap), 이온 사이클로트론 공명(ion cyclotron resonance), 정전기 섹터 분석기(electrostatic sector analyzer) 및 이의 혼합을 들 수 있다. "질량 분광분석법"은 가스 상 이온을 검출하기 위한 질량 분광분석기의 사용을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "레이저 탈착 질량 분광분석기(laser desorption mass spectrometer)"는 분석물을 탈착, 휘발 및 이온화시키기 위한 수단으로서 레이저 에너지를 사용하는 질량 분광분석기를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "질량 분석기(mass analyzer)"는 가스 상 이온의 질량 대 전하 비로 해석될 수 있는 변수를 측정하기 위한 수단을 포함하는 질량 분광분석기의 구성부를 의미한다. 비행시간 질량 분광분석기(time of flight mass spectrometer)에서, 질량 분석기는 이온 광학부(ion optic assembly), 비행 튜브(flight tube) 및 이온 검출기(ion detector)를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "이온 공급원"은 탈착/이온화 과정을 통해 가스 상 이온을 공급하는 가스 상 이온 분광분석기의 구성부이며, 본 발명에 있어서 고체 상으로부터 분석물을 탈착/이온화시키는 이온화 에너지는 레이저 에너지이다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브(Probe)"는 가스 상 이온 분광분석기의 프로브 계면을 연동시켜 분석물을 이온화를 위한 이온화 에너지에 제시하고 가스 상 이온 분광분석기로 도입시키기 위해 채택된 장치를 의미한다. 이러한 프로브는 일반적으로 분석물이 이온화 에너지 공급원에 제시되게 하는 샘플 제시 표면을 포함하는 고체 기판을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 언급된 고체 기판은 단백질 바이오칩이다.

본 발명에서 사용된 용어 "표면-증강된 레이저 탈착/이온화(Surface-enhanced laser desorption/ionization, SELDI)"는 분석물(analyte)이 가스 상 이온 분광분석기의 프로브 계면을 연동시키는 SELDI 프로브의 표면 상에 포착되는 탈착/이온화 가스 상 이온 분광분석법을 의미한다.

프로브는 또한 흡착제 표면(adsorbent surface)을 포함할 수 있으며, 흡착제 표면은 흡착제(포착제(capture reagent) 또는 친화제(affinity reagent))가 결합된 표면을 의미한다. 흡착은 흡착제 또는 포착제에 대한 분석물의 검출가능한 비공유 결합을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "바이오칩(biochip)"은 흡착제가 부착되는 평편한 표면을 갖는 고체 기판이다. 일반적으로, 바이오칩 표면은 다수의 지정가능한 위치(addressable location)를 포함하며, 각각의 위치에는 이에 결합된 흡착제를 갖는다.

본 발명에서 사용된 용어 "단백질 바이오칩(protein biochip)"은 폴리펩타이드의 포착을 위해 채택된 바이오칩을 의미한다. 다수의 단백질 바이오칩이 당해 분야에 공지되어져 있다. 이러한 단백질 바이오칩은 예를 들면, 제조원들(Ciphergen Biosystems, CA; Packard BioScience Company, CT; Zyomyx, CA; 및 Phylos, MA)로부터 제조된 것이 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된 제조원(Ciphergen Biosystmes, US(OK))의 단백질 바이오칩은 지정가능한 위치에서 이에 부착된 크로마토그래피적 또는 생체특이적 흡착제(biospecific adsorbent)를 갖는 표면을 포함한다. 본 발명에서 사용된 Ciphergen ProteinChip _^R 어레이(Ciphergen Biosystems, Freemont CA USA)는 NP20, H4, H50, SAX-2, WCX-2, CM-10, IMAC-3, IMAC-30, LSAX-30, LWCX-30, IMAC-40, PS-10, PS-20 및 PG-20 등을 포함한다. 이들 단백질칩들은 스트립 형태로 알루미늄 기판을 포함한다. 이러한 스트립의 표면에서는 이산화규소가 피복되어져 있다. 또한, H4, H50, SAX-2, WCX-2, CM-10, IMAC-3, IMAC-30, PS-10 및 PS-20 바이오칩은 추가로 바이오칩 표면에 물리적으로 부착된 하이드로겔 형태의 기능성 교차 결합되거나 바이오칩 표면에 실란을 통해 공유 결합된 중합체를 포함한다. 또한, WCX-2 및 CM-10 바이오칩은 양 이온에 대한 카복실레이트 기능기를 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서는 WCX-2 바이오칩을 사용하지만, 이로써 제한되지는 않는다.

바이오칩 같은 기판 상에 포착된 후, 분석물은 다양한 검출 방법 예를 들면, 가스 상 이온 분광분석법, 광학적 분석법, 전기화학적 분석법 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 본 발명의 경우에는 SELDI-TOF 질량 분광분석법을 사용한다. 또한, 다양한 형태의 면역분석법, 예를 들면 ELISA는 고체 상에 포착된 분석물을 검출하는 가장 보편적인 방법이다. 본 발명에서는 예시를 위해서 SELDI-TOF 질량 분광분석법 및 ELISA 면역분석법을 사용하였으나, 본 발명의 목적 상 사용될 수 있는 방법은 이로서 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "종양 진단 마커"는 정상 사람으로부터의 샘플과 비교하여 사람 암 환자로부터의 샘플에서 상이하게 나타나는 폴리펩타이드를 의미 한다.

본 발명에서 사용된 용어 "상이하게 나타나는"이란 정상 사람과 비교하여 암 환자로부터의 샘플에서 나타난 마커의 양 및 빈도가 상이함을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리학적 상태의 존재 또는 특성을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 이의 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)에서 상이하다. 진단 분석법의 민감도는 포지티브로 시험된 질병에 걸린 개체의 백분율로서 표시된다. 질병에 걸린 개체가 상기 분석법에 의해 검출되지 않는 경우에는 "위 네가티브(false negative)"라고 한다. 질병에 걸리지 않고 분석법에서도 네가티브로 시험된 개체는 "진정 네가티브(true negative)"라고 한다. 진단 분석법의 특이도는 "1 - 위 포지티브율"로서 표시된다. 특정 진단 방법이 환자 상태에 대한 정확한 진단을 제공하지 못하다고 하더라도, 이러한 방법이 진단을 보조하는 긍정적인 지표를 제공하는 경우에는 이로써 진단 방법으로서의 가치가 충분하다.

본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 암호화된 폴리펩타이드 리간드를 의미한다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다제에 의한 절단으로 생성된 당해 분야에 매우 잘 공지된 다수의 단편으로서 존재할 수 있다. 이러한 단편들은 항체 분야의 숙련자에게는 자명할 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"은 인체로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장 등을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 혈청 내의 헤모글로빈의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 헤모글로빈과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

항원-항체의 결합물은 검출 표지체(detection label)를 통해 그의 형성이 확인되며, 이러한 검출 표지체는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 방사선동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 국한되는 것은 아니다.

검출 표지체로 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스라디쉬(horseradish) 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사선동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bolton) 및 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이로써 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 구체적인 실시예가 제공되지만, 이는 예시적이며 제한적이지 않은 것으로 이해해야 한다.

실시예

실시예 1: 샘플 혈청 선택

정상사람 대조군은 건강검진 결과 정상인 남녀 (각 10명)의 혈청을 사용하였고, 난소암 (35명 중 Ia 3명, Ib 1명, Ic 1명, IIa 1명, IIc 5명, IIIa 3명, IIIb 2명, IIIc 15명, IV 4명), 자궁경부암 (38명 중 Ia 1명, Ib 11명, IIa 5명, IIb 17명, IIIa 1명, IIIb 2명, IV 1명,), 간암 (22명), 위암 (15명), 폐암(15명), 유방암(15명) 환자의 혈청을 사용하였다.

실시예 2: 단백질칩 제조 및 SELDI-TOF MS 분석

종양 진단 바이오마커를 발굴하기 위하여, 정상 사람 및 난소암 환자(난소암 환자 III 기) 각각의 혈청 2 ul를 3 ul의 U8 완충액 (8M 우레아/1% CHAPS/137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄ 농도의 포스페이트 완충된 염수(PBS), pH 7.4)으로 희석하였다. 이 후, 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 50 mM Na-아세테이트 완충용액(아세테이트 완충용액, pH 4.0)으로 10 배 희석하여 5㎕를 약 양이온-교환 칩(weak cation-exchange, WCX2 chip; 제조원: Ciphergen Biosystmes) 표면에 집적하였다. 상기 칩을 습기가 주어진 상태에서 30분 동안 반응시킨 후 아세테이트 완충액으로 2 회, 3차 증류수로 1 회 세척 후 공기 중에서 완전히 건조시켰다. 건조된 칩의 표면에 1㎕의 포화 에너지 흡수 물질(energy absorbing material, 3,5-디메톡시-4-하이드록시신남산 (sinapinic acid))을 처리한 후 건조하여 시페젠 단백질칩 판독기(Ciphergen PreteinChip reader; 제조원: Ciphergen Biosystems)로 읽고 단백질칩 데이터 분석 소프트웨어(Proteinchip data analysis software version 3.1, 제조원: Ciphergen Biosystems)로 분석하였다.

질량 피크의 선택 및 스펙트럼의 비교는 바이오마커 위저드(Biomarker Wizard, 제조원: Ciphergen Biosystem)를 이용하였고 이때 0.3%범위내의 질량 차이는 동일한 피크로 인식하였다. 이 과정을 통하여 난소암 환자와 정상 사람의 혈청에서 유의하게 발현의 차이(p<0.05)를 보이는 6.44, 6.64, 13.7, 13.9, 14.1, 15.1, 15.8, 및 15.9 kDa의 단백질을 확인하였다. 이중 15.1, 15.8, 15.9 kDa 단백질은 난소암 환자 혈청에서 발현량이 증가된 반면 나머지 5개의 단백질은 난소암 환자의 혈청에서 정상 사람 보다 적게 발현되었다 (도 1 및 도 2 참조).

이중 15.1 kDa과 15.8 kDa의 단백질을 CM-세파로오스 컬럼과 16% SDS-PAGE를 통하여 분리한 후 (도 3), PVDF 막에 옮긴 후 아미노 말단 아미노산 서열을 기초과학지원연구소 서울분소에 의뢰하여 결정하였다(분석일 2002.10.10). 그 결과, 15.1 kDa의 아미노산 서열은 아미노 말단-발린-루이신-세린-프롤린-알라닌-아스파르트산-라이신-트레오닌-아스파라긴산-발린 (VLSPADKTNV)으로 밝혀졌고 이러한 서열을 NCBI를 통해 서열 검색해 본 결과 헤모글로빈-알파(pI 8.73, MW: 15126 달톤)임이 확인되었다. 또한, 15.8 kDa의 아미노산 서열은 아미노 말단-발린-히스티딘-루이신-트레오닌-프롤린-글루타민산-글루타민산-라이신-세린-알라닌(VHLTPEEKSA)으로 밝혀졌고 이를 NCBI를 통해 서열 검색해 본 결과 헤모글로빈-베타(pI 6.81, MW: 15867 달톤)임이 확인되었다. 이와 같은 SELDI 결과를 확인하고 헤모글로빈-알파 및 -베타의 조기 종양 진단 바이오마커로의 활용 가능성을 조사하기 위하여 헤모글로빈 항체를 이용한 효소 결합 면역 흡착 검사를 시도하였다.

실시예 3: 난소암 진단

정상 사람 및 환자 혈청 2 ul를 0.1% 트윈 20 이 포함된 PBS로 1:100으로 희석하여 50㎕를 ELISA 플레이트에 실온에서 1시간 동안 흡착시킨 후, 0.1% 트윈 20을 포함하는 1X PBS로 3회 세척하였다. 이후, 100㎕의 10% FBS(0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS 용액)로 실온에서 1시간 동안 블록킹(blocking)한 다음, 래비트에서 제조한 항-인간 헤모글로빈 항체 [Abcam (MA. USA)에서 인간 헤모글로빈으로 제조한 래비트 다항체, ab2798] 50㎕(1/5000 희석)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후 서양고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase)가 결합된 항 토끼 IgG를 1시간 반응시키고, 0.1% 트윈 20을 포함하는 PBS 용액으로 5회 세척하였다. 이후, 서양고추냉이 퍼옥시다제의 반응 기질로 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)을 첨가하고 30분 동안 반응시킨 후 2M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시켰다.

이를 450nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 시험군의 헤모글로빈 양을 비교 정량하였다. 35명의 난소암 환자 혈청은 평균 0.168 ± 0.166의 농도를 보인 반면, 8명의 정상인 혈청은 0.074 ± 0.005의 흡광도를 보였다. 이때, 정상 사람의 혈청 내 헤모글로빈 최고 농도인 0.089를 컷오프 값(cutoff value)으로 하였을 때 35명의 환자 혈청 중 27명의 혈청은 질병 군으로 분류할 수 있었고 8명은 정상 사람으로 분류되었다(민감도 77%)(도 4 및 표 1 참조).

실시예 4: 자궁경부암 진단

본 발명에 따라 확인된 종양 진단 바이오마커의 활용 가능성을 조사하기 위해서, 실시예 3에 따른 방법을 사용하여 동일한 조건하에서 38명의 자궁경부암 환자를 조사하였다.

그 결과, 혈청 중 헤모글로빈의 평균 농도는 0.188 ± 0.166이었으며, 38명 중 30명을 자궁경부암 환자로 분류하였다(민감도 79%)(참조 도 4 및 표 1).

실시예 5: 간암, 폐암, 유방암 진단

본 발명에 따른 종양 진단 바이오마커로서의 헤모글로빈의 특이성을 조사하기 위해서, 간암 환자(22명), 위암 환자(15명), 폐암 환자(15명), 유방암 환자(15명)의 혈청 내 헤모글로빈에 대한 흡광도를 정상 사람의 혈청 내 헤모글로빈에 대한 흡광도와 비교하여 조사하였다. 본 실시예에서 사용된 ELISA 방법은 실시예 3의 방법과 동일하며, 난소암 이외의 다른 암 환자의 혈청 샘플을 사용한 점에서만 상이하다.

ELISA 분석을 수행한 결과, 간암에서의 헤모글로빈 단백질의 평균 발현량은 0.097 ± 0.021이고, 위암에서의 평균 발현량은 0.086 ± 0.01이고, 폐암에서의 평 균 발현량은 0.101 ± 0.02이며 유방암에서의 평균 발현량은 0.11 ± 0.044이었으며, 이들 모두는 정상치 보다 높은 평균 발현량을 보였다. 컷오프 값으로 정상 사람의 최고치인 0.089를 적용하였을 때, 민감도는 간암의 경우 59%, 위암의 경우 27%, 폐암의 경우 60%, 유방암의 경우 60%를 나타냈으며 이는 혈청 내 헤모글로빈의 양은 암세포의 종류 및 발현 조직에 따라 상이함을 보여주었다(도 5 및 표 1 참조).

암 환자 혈청의 ELISA 검사 결과

	난소암	자궁경부암	간암	위암	폐암	유방암	정상인
평균1)	0.168	0.188	0.097	0.086	0.101	0.11	0.074
표준편차	0.166	0.116	0.021	0.01	0.02	0.044	0.005
암 판정(명)	27	30	13	4	9	9	0
정상 판정(명)	8	8	9	11	6	6	15
합계(명)	35	38	22	15	15	15	15
민감도(%)	77	79	59	27	60	60	100
기준치 (cutoff value)	0.089
1) 평균치는 ELISA 검사의 흡광도(450nm)의 평균 값을 표시하였다

상기 실시예 3, 4 및 5를 통해 확인된 바와 같이, 헤모글로빈에 대해 특이적인 항체를 사용한 검정 결과, 난소암 및 자궁경부암 뿐만 아니라, 간암, 폐암 및 유방암에서도 헤모글로빈의 증가를 확인함으로써, 헤모글로빈은 종양 진단 바이오마커, 특히 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암 및 유방암 진단 바이오마커로서 유용하며 이를 사용한 진단 방법을 확립할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 헤모글로빈의 혈청 내 농도를 결정함으로써 암의 존재 유무를 판정하는데 사용할 수 있다. 현재 사용되고 있는 여러 암 진단 표지 물질과 함께 또는 독립적으로 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암 및 유방암, 특히 난소암 및 자궁경부암의 조기 진단을 위함 민감도 및 특이도를 획기적으로 증가시킬 수 있다.

Claims (17)

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4. 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양 진단 마커를 검출하기 위한 조성물.
5. 제4항에 있어서, 헤모글로빈에 특이적인 항체가 헤모글로빈-알파 또는 헤모글로빈-베타에 특이적인 항체인 조성물.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 항체가 단클론 항체인 조성물.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 종양이 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암 또는 유방암인 조성물.
8. 제7항에 있어서, 종양이 남소암 또는 자궁경부암인 조성물.
9. 헤모글로빈에 특이적인 항체를 포함하는 종양진단 마커를 검출하기 위한 진단 키트.
10. 제9항에 있어서, 헤모글로빈에 특이적인 항체가 헤모글로빈-알파 또는 헤모글로빈-베타에 특이적인 항체인 진단 키트.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 종양이 난소암, 자궁경부암, 간암, 폐암 또는 유방암인 진단 키트.
12. 제11항에 있어서, 종양이 남소암 또는 자궁경부암인 진단 키트.
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