KR20160110865A - 자가항체를 이용한 제1형 당뇨병 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 키트 및 제1형 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 이용하면, 제1형 당뇨병의 발병여부를 특이적으로 진단할 수 있으므로, 보다 효과적인 당뇨병의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

자가항체를 이용한 제1형 당뇨병 진단방법{Diagnostic method for type 1 diabetes using autoantibodies}

본 발명은 자가항체를 이용한 제1형 당뇨병 진단방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 키트 및 제1형 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 가장 흔한 질병중 하나이며, 혈중 포도당 농도가 상승함에 따라 대사 장애가 증가함을 특징으로 한다. 당뇨병은 고혈당 상태로 나타나지만, 개인별 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)과 관련된 미세혈관 또는 대혈관 합병증을 유발할 수도 있다.

이들 합병증은 삶의 질을 저하시키고 생명을 위협하는 위험한 요소들이다. 당뇨병에서 가장 높은 빈도를 차지하는 것은 제2형 당뇨병(T2DM)으로, 고혈압, 이상지질혈증, 복부 비만과 같은 대사 질환과 흔히 동반된다. 제2형 당뇨병의 발병에는 인슐린에 대한 적절한 신호 전달이 이뤄지지 못하는 인슐린저항성이 중요하다. 이에 반해 제1형 당뇨병(T1DM)은 제2형 당뇨병에 비해 드물지만, 인슐린의 절대적인 부족이 동반되므로, 제1형 당뇨병 환자의 치료를 위해서는 인슐린이 필수적이다. 제1형 당뇨병의 발병은 비이상적인 자가면역 반응에 의한 췌장 베타세포의 선택적 파괴가 원인으로, 결국 체내의 인슐린이 절대적으로 부족하게 된다. 췌장의 베타세포에서 생성되는 인슐린은 혈당 조절에 필수적일 뿐만 아니라, 에너지 대사의 중추적인 역할을 담당하기 때문에 생명의 유지에도 없어서 안 되는 호르몬이다. 즉, 당뇨병으로 진단한 환자가 제1형 당뇨병인 경우에는 인슐린 투여는 혈당 조절에 필수적일 뿐만 아니라, 생명의 유지에도 매우 필수적이어서, 당뇨병 진단 당시 제2형 당뇨병과 감별하여 진단하는 것이 필요하다.

이와 같이, 당뇨병 발병으로 인한 공통적인 결과는 혈당수준이 증가하는 것이지만, 발병원인에 따른 치료가 각각 상이하기 때문에, 정확한 진단이 매우 중요하다. 제1형 당뇨병의 진단에 자가항체의 측정이 중요한데, 현재까지 임상적으로 사용되는 자가항체는 GAD-항체 [glutamic acid decarboxylase (GAD65) auto-antibodies, GADA], IA-2 항체(protein tyrosine phosphatase auto-antibodies, IA-2A), ZnT8 항체(zinc transporter auto-antibodies, ZnT8A) 등이 있고, 제2형 당뇨병의 진단에도 사용될 수 있으나(이를 들어, 한국공개특허 제2011-0066059호), 제2형 당뇨병의 진단용 마커로서의 자가항체에 대한 연구는 미미한 실정이다.

또한, 제1형 당뇨병과 관련된 자가항체의 한계는 성인 제1형 당뇨병이나 아시아에서 중요한 T1DM의 아형인 전격성(fulminant) T1DM 환자에서 양성률이 낮아 진단이 어렵다는 점이다. 더구나 아시아 T1DM환자에서는 ZnT8 항체의 경우 서구인에 비해 자가항체의 비율이 낮다. 따라서 T1DM의 진단 효용을 증대할 수 있는 자가항체의 발굴이 필요하다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 제1형 당뇨병을 특이적으로 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정함으로써, 제1형 당뇨병을 특이적으로 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제1형 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 제1형 당뇨병을 특이적으로 진단하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 자가항체에 주목하게 되었다. 생체내 성분과 특이적으로 반응하는 항체인 자가항체는 정상적인 체내환경에서는 생성되지 않으나, 특정 질환이 발병되어 특정 단백질이 비정상적으로 증가하게 되면, 이를 제거하기 위하여 생성되는 것으로 알려져 있으므로, 제1형 당뇨병의 발병 시에 이에 특이적인 자가항체가 생성될 것으로 가정하고, 이를 발굴하고자 하였다. 그 결과, 제1형 당뇨병의 발병 시에 인슐린을 생성하는 췌장 내 췌도세포의 β세포에서 특이적으로 발현되는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체가 혈액 내에 높은 수준으로 증가함을 확인하고, 상기 자가항체를 검출함으로써 제1형 당뇨병을 특이적으로 진단하는 방법을 개발하였다. 본 발명의 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 이용하여 제1형 당뇨병의 발병여부를 특이적으로 진단하는 방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "EEF1A1(eukaryote translation elongation factor 1α1)" 및 "UBE2L3(ubiquitin-conjugating enzyme 2L3)"는 각각 서열번호1(EEF1A1) 및 서열번호2(UBE2L3)로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. EEF1A1은 NCBI Accession No. NP_001393 (GenBank Accession NM_001402)에 기재된 서열, UBE2L3는 NCBI Accession No. CAG30492 (GenBank Accession NM_003347)에 기재된 서열일 수 있다. 또한, EEF1A1, UBE2L3는 각각 이들의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80%이상, 보다 바람직하게는 90%이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "자가항체(autoantibodies, AAb)"란, 체내에서 발현되어 생체내 성분과 특이적으로 반응하는 항체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 자가항체는 제1형 당뇨병의 발병 시에 생성되는 EEF1A1에 대한 자가항체 또는 UBE2L3에 대한 자가항체가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "제1형 당뇨병(type 1 diabetes, T1DM)" 이란, 췌장의 베타 세포가 자가 면역반응에 의해 파괴되어 발생하는데, 유전적인 요인과 환경적인 요인이 복합적으로 병인에 기여한다. 췌장 베타세포 파괴에 의한 인슐린 부족으로, 체내 혈당수준이 비정상적으로 증가하는 대사 질환으로 발현된다.

본 발명에 있어서, 상기 제1형 당뇨병은 환자의 혈액내에서 본 발명에서 제공하는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출함에 의하여 그의 발병여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 제1형 당뇨병의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "항체의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질에 대한 항체의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항원, 항체 또는 앱타머가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "항원"이란, 항체와 항원항체 결합을 수행할 수 있는 단백질성 면역원을 의미하는데, 이러한 항원은 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용된 항원은 상술한 EEF1A1 또는 UBE2L3가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH₂로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 될 수 있고, 바람직하게는 상기 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머가 될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 제1형 당뇨병 진단용 조성물을 포함하는 제1형 당뇨병 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 제1형 당뇨병이 발병된 개체에서 유래된 시료로부터 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하여 제1형 당뇨병의 발병여부를 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 단백질의 수준을 측정하기 위한 항원, 항체, 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.

본 발명의 용어 "시료"란, 제1형 당뇨병이 발병된 개체에서 분리되어 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 바람직하게는 제1형 당뇨병이 발병된 환자의 혈액, 혈청, 혈장, 조직시료 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란 제1형 당뇨병이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명의 키트는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위한 ELISA 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.

다른 일례로서, 본 발명의 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 제1형 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출하는 방법은 (a) 검사대상 개체의 생물학적 시료로부터 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 단백질의 수준을 정상 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 생물학적 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 혈액, 혈청, 혈장, 조직시료 등이 될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 측정된 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준이 정상 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 수준과 비교하여 유의하게 증가하는 경우에는 상기 검사대상 개체에서 제1형 당뇨병이 발병하였다고 판정할 수 있고, 유의하게 증가하지 않은 경우에는 상기 개체에서 제1형 당뇨병이 발병하지 않았다고 판정할 수 있다. 이때, 상기 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.

본 발명에서 제공하는 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 이용하면, 제1형 당뇨병의 발병여부를 특이적으로 진단할 수 있으므로, 보다 효과적인 당뇨병의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 당뇨병 환자의 혈청에 포함된 자가항체를 발굴하는 방법의 순서를 나타내는 개략도이다.
도 2a는 T1DM 환자, T2DM 환자 및 정상인에서 공통적으로 발현되는 자가항체의 분포를 나타내는 벤다이어그램이다.
도 2b는 위계적 군집분석방법에 따라 T1DM 환자, T2DM 환자 및 정상인 시료에 포함된 자가항체의 발현수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 히트맵으로서, 노란색은 발현양이 증가된 것을 나타내고, 청색은 발현양이 감소된 것을 나타낸다.
도 3a는 T2DM 환자 및 정상인으로부터 T1DM 환자를 구별하기 위하여, 자가항체를 이용하여 PLS-DA를 수행한 결과를 나타내는 2차원 PLS-DA 플롯으로서, 점선은 T2DM 환자 및 정상인과 T1DM 환자를 구별하는 판단함수를 나타낸다.
도 3b는 PLS-DA에 의해 결정된 각 자가항체의 VIP(variable importance in projection) 값을 나타내는 그래프로서, 점선은 VIP 하한선인 1.59를 나타낸다.
도 3c는 T1DM 환자, T2DM 환자 및 정상인 시료에서 발현된 각각의 자가항체(EEF1A1-AAb, UBE2L3-AAb 및 c7orf53-AAb)의 발현수준을 나타낸 히트맵이다.
도 4는 췌장조직을 대상으로 항-EEF1A1 항체, 항-UBE2L3 항체 또는 항-c7orf53 항체를 이용한 면역형광염색 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 항-EEF1A1 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내고; B, G 및 L은 항-인슐린 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내며; C, H 및 M은 항-글루카곤 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내고; D, I 및 N은 DAPI 염색된 핵을 나타내며; F는 항-UBE2L3 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내고; K는 항-c7orf53 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내며; E는 A 내지 D를 합성한 사진이고; J는 F 내지 I를 합성한 사진이며, O는 K 내지 N을 합성한 사진이다.
도 5a는 T1DM 환자, 정상인, T2DM 환자 및 그레이브스병 환자의 혈청에 포함된 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프로서, 점선 위에 표시된 시료를 양성으로 간주하였다.
도 5b는 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb에 대한 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)을 나타내는 그래프이다.
도 5c는 T1DM 어린이 환자 및 정상 어린이의 혈청에 포함된 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 T1DM 환자가 보유한 각 자가항체(GADA, EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb)의 분포를 나타내는 벤다이어그램이다.
도 6b는 T1DM의 발병 연령에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 T1DM의 발병 연령 및 유병기간에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 T1DM의 발병 연령 및 유병기간에 따른 혈청 내 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6e는 공복 시 C-펩타이드 수준에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6f는 일반 T1DM 환자, 전격성(fulminant) T1DM 환자 또는 성인 지연형자가면역성당뇨병(latent autoimmune diabetes of adults, LADA) 환자를 대상으로 혈청 내 EEF1A1-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6g는 일반 T1DM 환자, 전격성 T1DM 환자 또는 LADA 환자를 대상으로 혈청 내 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 당뇨병 환자의 혈청에 포함된 자가항체 발굴

도 1에 개시된 방법에 따라 당뇨병 환자의 혈청에 포함된 자가항체를 발굴하였다. 도 1은 당뇨병 환자의 혈청에 포함된 자가항체를 발굴하는 방법의 순서를 나타내는 개략도이다.

먼저, 16명의 제1형 당뇨병(T1DM) 환자, 16명의 제2형 당뇨병(T2DM) 환자 및 17명의 정상인(NGT: normal glucose tolerance)으로 구성된 1차 시험군으로부터 각각의 혈청을 수득하였다. 이때, T1DM 환자의 평균연령은 42±16세이고, T2DM 환자는 최소 5년 동안 경구용 당뇨치료제를 투여한 환자이며, 정상인은 당뇨병이 발병되지 않은 일반인을 대상으로 하였다.

상기 수득한 각 혈청에 PBS를 가하여 1:500으로 희석시킨 시료를 수득하고, 상기 시료를 단백질 마이크로어레이 플랫폼 버전 5.0(ProtoArray; Invitrogen)에 가한 다음, 90분 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, Alexa Fluor 647이 결합된 항-인간 IgG를 가한 다음, GenePix 4000B 형광스캐너(Molecular Devices)로 스캔하여 상기 마이크로어레이에 결합된 3,060개의 자가항체(Autoantibodies, AAb)를 검출하였다.

상기 검출된 자가항체 중 T1DM 환자에서 강하게 나타나는 자가항체를 선별하였다. T1DM 환자군에서 정상군, T2DM 환자군과 각각 비교하여 높게 측정되는 자가항체 103개, 27개를 선별한 후, 이들 자가항체 중 [정상군+T2DM 군]에 비해 T1DM 환자군에서 유의하게 높게 측정되는 자가항체를 선택하여, 최종 29개의 자가항체가 선택되었다(도 2a).

상기 확인된 자가항체를 대상으로, 위계적 군집분석방법을 수행하였다. 먼저, 상기 마이크로어레이에서 검출된 신호의 강도를 컴퓨터 소프트웨어인 ProtoArray Prospector에 적용하여 정규화된 값을 산출하고, 이를 Gene Expression Omnibus 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gds) 및 M-statistic test에 적용하여 z 값을 산출하였는데, 상기 z 값이 >1.64인 경우에 자가항체가 존재하는 것으로 간주하였다. 상기 결과는 히트맵으로 표시하였다(도 2b).

도 2b는 위계적 군집분석방법에 따라 T1DM 환자, T2DM 환자 및 정상인 시료에 포함된 자가항체의 발현수준의 변화를 분석한 결과를 나타내는 히트맵으로서, 노란색은 발현양이 증가된 것을 나타내고, 청색은 발현양이 감소된 것을 나타낸다. 따라서, T1DM 환자에서 T2DM 환자나 정상인에 비해, 선택된 자가항체의 강도가 강함을 알 수 있었다.

상기 분석된 자가항체를 대상으로 T1DM 환자를 특징적으로 구별할 수 있는 자가항체를 선별하기 위하여, 이들의 상대적인 기여도를 평가하였다. 구체적으로, 상기 69개의 자가항체의 발현양을 이용하여 실증적 PLS-DA를 수행함으로써, T1DM 환자, T2DM 환자 및 정상인 시료에서 분리된 각 자가항체의 상대적 집단기여도를 나타내는 VIP(variable importance in projection) 값을 산출하였다. 이때, 귀무가설을 위한 VIP의 실증적 분포를 추정한 결과, 실증적 VIP 분포의 90%에 해당하는 1.59의 VIP 하한선을 결정하였고, 이에 따라 VIP>1.59의 자가항체는 T1DM, T2DM 및 정상인 시료에서 분리된 유의한 분포를 갖는다고 간주하였다(도 3a 및 3b).

도 3a는 T2DM 환자 및 정상인으로부터 T1DM 환자를 구별하기 위하여, 자가항체를 이용하여 PLS-DA를 수행한 결과를 나타내는 2차원 PLS-DA 플롯으로서, 점선은 T2DM 환자 및 정상인과 T1DM 환자를 구별하는 판단함수를 나타내고, 도 3b는 PLS-DA에 의해 결정된 각 자가항체의 VIP(variable importance in projection) 값을 나타내는 그래프로서, 점선은 VIP 하한선인 1.59를 나타낸다. 상기 도 3b에서 보듯이, VIP 하한선보다 높은 VIP 값을 나타내는 자가항체는 50개인 것으로 확인되었다.

상기 확인된 50개의 자가항체 중에서 정상인에서는 발현되지 않은 자가항체를 검색한 결과, 3개의 항원인 EEF1A1(eukaryote translation elongation factor 1α1), UBE2L3(ubiquitin-conjugating enzyme 2L3) 또는 c7orf53(chromosome 7 open reading frame 53)에 대한 각각의 자가항체(EEF1A1-AAb, UBE2L3-AAb 및 c7orf53-AAb)를 선발하였다(도 3c).

도 3c는 T1DM 환자, T2DM 환자 및 정상인 시료에서 발현된 각각의 자가항체(EEF1A1-AAb, UBE2L3-AAb 및 c7orf53-AAb)의 발현수준을 나타낸 히트맵이다. 도 3c에서 보듯이, 상기 선발된 각각의 자가항체는 T2DM 환자 및 정상인 시료보다는 T1DM 환자에서 발현량이 증가됨을 확인하였다.

실시예 2: 면역형광염색 분석

상기 실시예 1에서 선발된 3종의 자가항체(EEF1A1-AAb, UBE2L3-AAb 및 c7orf53-AAb)가 T1DM에 직접적으로 영향을 미치는 인슐린 분비기관인 췌장의 어느 부위에서 발현되는지를 확인하기 위하여, 면역형광염색 분석을 수행하였다.

구체적으로, 장액성 선종으로 인한 부분적인 췌장절제를 수행한 환자로부터 얻어진 췌장조직에 항-EEF1A1 항체, 항-UBE2L3 항체 또는 항-c7orf53 항체를 가하여 반응시키고, Alexa Fluor 488이 결합된 이차 항체를 가하여 추가로 반응시켰다. 또한, 대조군으로서 항-인슐린 항체를 가하여 반응시키고, Alexa Fluor 647이 결합된 이차 항체를 가하여 추가로 반응시켰으며, 항-글루카곤 항체를 가하여 반응시키고, Alexa Fluor 594이 결합된 이차 항체를 가하여 추가로 반응시켰다. 상기 면역형광염색을 수행한 다음, 공초점 현미경(Olympus FluoView FV1000 confocal laser scanning microscope)을 사용하여 그 결과를 확인하였다(도 4).

도 4는 췌장조직을 대상으로 항-EEF1A1 항체, 항-UBE2L3 항체 또는 항-c7orf53 항체를 이용한 면역형광염색 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 항-EEF1A1 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내고; B, G 및 L은 항-인슐린 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내며; C, H 및 M은 항-글루카곤 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내고; D, I 및 N은 DAPI 염색된 핵을 나타내며; F는 항-UBE2L3 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내고; K는 항-c7orf53 항체를 사용한 면역형광염색 결과를 나타내며; E는 A 내지 D를 합성한 사진이고; J는 F 내지 I를 합성한 사진이며, O는 K 내지 N을 합성한 사진이다. 도 4에서 보듯이, EEF1A1 및 UBE2L3는 췌장조직에 포함된 췌도세포의 β세포에 대량으로 존재한 반면, c7orf53은 예외적으로 α세포에서 발견되었다.

따라서, 췌장에서 인슐린 분비를 담당하는 췌도세포의 β세포에 대량으로 존재하는 항원과 결합하는 자가항체인 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb를 최종 선발하였다.

실시예 3: 자가항체의 효과검증

실시예 3-1: 자가항체의 함량 비교

상기 실시예 2에서 최종 선발된 자가항체를 검증하기 위하여, 95명의 T1DM 환자, 49명의 T2DM 환자, 11명의 LADA(latent autoimmune diabetes in adults) 환자, 20명의 그레이브스병(Graves) 환자 및 66명의 정상인(NGT)을 포함하는 2차 시험군에서 수득한 혈청시료를 사용하였다. 상기 혈청시료를 대상으로 ELISA를 수행하여, 각 혈청시료에 포함된 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양을 측정하였다(도 5a). 이때, 상기 ELISA는 EEF1A1 또는 UBE2L3로 코팅된 플레이트에 PBS로 희석된(1:1,000-1:10,000) 혈청시료를 가하여 반응시킨 후, 염소유래 항-사람 IgG-HRP 항체를 사용하여 검출하는 방식으로 수행하였다.

도 5a는 T1DM 환자, 정상인, T2DM 환자 및 그레이브스병 환자의 혈청에 포함된 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프로서, 점선 위에 표시된 시료를 양성으로 간주하였다. 도 5a에서 보듯이, EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb는 정상인 및 T2DM 환자의 시료에서 보다도 T1DM 환자의 시료에서 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였다(^** P<0.01). 특히, 자가면역질환의 대조군으로 사용된 그레이브스병 환자에 비하여도, T1DM 환자의 시료에서 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인하였다(^** P<0.01).

실시예 3-2: 자가항체를 유발하는 항원의 양성율 비교

상기 2차 시험군을 대상으로 EEF1A1 및 UBE2L3의 양성율을 측정하였다(표 1).

EEF1A1 및 UBE2L3의 양성율

		EEF1A1	UBE2L3
양성율	T1DM(n = 95) T2DM(n = 49) LADA(n = 11) Graves disease(n = 20) NGT(n = 66)	28(29.5) 1(2.0) 0 2(10.0) 1(1.5)	34(35.8) 1(2.0) 0 4(20.0) 1(1.5)
P 값	T1DM vs.NGT T1DM vs.T2DM T1DM vs.LADA T1DM vs.Graves disease	<0.001 <0.001 0.035 0.094	<0.001 <0.001 0.015 0.201

표 1에서 보듯이, T1DM 환자에서 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양성율은 각각 29.5% 및 35.8%를 나타내었으나, T2DM 환자에서는 2%를 나타내었고, 정상인에서는 1.5%를 나타내었다.

실시예 3-3: ROC 곡선 분석

T1DM 예측 정확도를 정량적으로 평가하기 위하여, 자가항체용 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)을 생성하고, 이로부터 AUC(areas under the curve)를 산출하였다(도 5b).

도 5b는 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb에 대한 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)을 나타내는 그래프이다. 도 5b에서 보듯이, EEF1A1-AAb에 대하여 ROC 곡선으로부터 산출된 AUC 값은 0.73이고, UBE2L3-AAb에 대하여 ROC 곡선으로부터 산출된 AUC 값은 0.78임을 확인하였으므로, 상기 각 자가항체는 T1DM를 예측함에 있어 높은 수준의 정확도를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3-4: 어린이 환자에 대한 자가항체의 효과검증

상기 2종의 자가항체를 이용하여 T1DM을 예측하는 방법이 성인이 아닌 어린이에게도 적용될 수 있는 지를 확인하고자, 33명의 어린이 T1DM 환자 및 34명의 정상인 어린이를 포함하는 3차 시험군을 사용하였다. 상기 3차 시험군으로부터 혈청시료를 수득하고, 상기 혈청시료를 대상으로 ELISA를 수행하여, 각 혈청시료에 포함된 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양을 측정하였다(도 5c).

도 5c는 T1DM 어린이 환자 및 정상 어린이의 혈청에 포함된 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5c에서 보듯이, 정상 어린이의 혈청보다는 T1DM 어린이 환자의 혈청에서 유의하게 높은 수준으로 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb가 검출됨을 확인하였다(^* P<0.05, ^** P<0.01).

상기 실시예 3-1 내지 3-4의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 자가항체인 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb는 성인 뿐만 아니라 어린이 T1DM 환자의 혈청에서 특이적으로 검출되므로, T1DM의 발병여부를 진단하는 마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 자가항체의 임상특성 분석

T1DM 환자 중 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb 양성인 사람의 임상적 특징을, T1DM 환자의 대표적인 기존의 자가항체인 GADA(GAD65에 대한 자가항체)의 경우와 비교하였다(표 2). 이때 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb 양성 여부는, 본 발명에서 제공하는 진단용 키트로 측정하였다.

GADA, EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb를 갖는 T1DM 환자의 임상적 특성

	GADA		EEF1A1-AAb		UBE2L3-AAb
	양성 (n=71)	음성 (n=22)	양성 (n=28)	음성 (n=67)	양성 (n=34)	음성 (n=61)
연령(세)	29 (17-69)	32 (19-58)	25 (17-33)	34 (17-69)	23 (17-37)	34 (17-69)
시작연령(세)	25 (13-66)	29 (10-58)	21 (13-33)	30 (10-66)	19 (14-36)	32 (10-66)
유병기간(년)	3.5± 3.0	2.6± 3.2	3.3± 2.7	3.2± 3.7	2.9± 2.7	3.4± 3.7
DKA 이력(명)	20 (28.2)	16 (72.7)	11 (35.3)	27 (40.3)	14 (41.2)	24 (39.3)
공복시 C-펩타이드 수준(ng/mL)	0.33±0.32	0.22±0.24	0.22±0.23	0.33±0.33	0.25±0.26	0.33±0.33
전격성 T1DM (명)	0	11 (50.0%)	3 (10.7%)	8 (11.9%)	2 (5.9%)	9 (14.8%)
다른 자가면역질환 동반(명)	15 (21.4%)	3 (14.3%)	5 (18.5%)	14 (21.2%)	7 (21.1%)	12 (20.0%)
GADA 양성(명)	-	-	21 (75.0%)	50 (76.9%)	27 (79.4%)	44 (74.6%)
항-UBE2L3 항체 양성(명)	27 (38.0%)	7 (31.8%)	26 (92.9%)	8 (11.9%)	-	-
항-EEF1A1 항체 양성(명)	21 (29.6%)	7 (31.8%)	-	-	26 (76.5%)	2 (3.3%)

첫째, T1DM 환자가 보유한 각 자가항체의 분포를 분석하였다(도 6a).

도 6a는 T1DM 환자가 보유한 각 자가항체(GADA, EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb)의 분포를 나타내는 벤다이어그램이다. 도 6a에서 보듯이, T1DM 환자의 총 38.7%(36/93)의 환자가 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb에 양성이었다. GADA 음성의 T1DM 환자 22명에서, EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb 둘 중 하나의 자가항체에 양성인 환자 비율은 총 40.9% (9/22)으로, 전체 T1DM 환자 중 GADA, EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb 세 자가 항체 중 어느 하나라도 양성인 환자는 86% (80/93)였다.

종래에 공지된 GADA를 사용하면 약 76%의 T1DM 환자를 진단할 수 있었으나, 상기 GADA에 EEF1A1-AAb 및 UBE2L3-AAb를 추가로 사용하여 T1DM 환자 진단율을 약 86%까지 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

둘째, T1DM 발병 연령에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량을 분석하였다(도 6b).

도 6b는 T1DM의 발병 연령에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6b에서 보듯이, T1DM의 발병 연령이 젊을수록 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량이 증가하였으나, GADA는 이러한 특성을 나타내지 않음을 확인하였다.

셋째, T1DM의 유병기간에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량을 분석하였다(도 6c 및 6d).

도 6c는 T1DM의 발병 연령 및 유병기간에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6d는 T1DM의 발병 연령 및 유병기간에 따른 혈청 내 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6c 및 6d에서 보듯이, T1DM의 유병기간과 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량은 특별한 상관관계를 찾지 못하였으나, 유병기간과 상관없이 T1DM 발병 연령에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량 변화의 경향은 그대로 유지됨을 알 수 있었다.

넷째, 공복 시 C-펩타이드 수준에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량을 분석하였다(도 6e).

도 6e는 공복 시 C-펩타이드 수준에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6e에서 보듯이, 공복 시 C-펩타이드 수준이 감소할수록 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량이 증가함을 확인하였다.

다섯째, T1DM의 아형에 따른 혈청 내 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb의 함량을 분석하였다(도 6f 및 6g).

도 6f는 일반 T1DM 환자, 전격성 T1DM 환자 또는 LADA 환자를 대상으로 혈청 내 EEF1A1-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6g는 일반 T1DM 환자, 전격성 T1DM 환자 또는 LADA 환자를 대상으로 혈청 내 UBE2L3-AAb의 함량 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6f 및 6g에서 보듯이, 대조군인 LADA 환자의 혈청에서는 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb가 전혀 검출되지 않았고, 전격성 T1DM 환자의 혈청에서는 소량의 EEF1A1-AAb 또는 UBE2L3-AAb가 검출됨을 확인하였다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION KNU-Industry Cooperation Foundation Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Diagnostic method for type 1 diabetes using autoantibodies <130> KPA141379-KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant EEF1A1 <400> 1 Met Gly Lys Glu Lys Thr His Ile Asn Ile Val Val Ile Gly His Val 1 5 10 15 Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Cys Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Lys Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ser Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80 Glu Thr Ser Lys Tyr Tyr Val Thr Ile Ile Asp Ala Pro Gly His Arg 85 90 95 Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Cys Ala 100 105 110 Val Leu Ile Val Ala Ala Gly Val Gly Glu Phe Glu Ala Gly Ile Ser 115 120 125 Lys Asn Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Gly 130 135 140 Val Lys Gln Leu Ile Val Gly Val Asn Lys Met Asp Ser Thr Glu Pro 145 150 155 160 Pro Tyr Ser Gln Lys Arg Tyr Glu Glu Ile Val Lys Glu Val Ser Thr 165 170 175 Tyr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asn Pro Asp Thr Val Ala Phe Val Pro 180 185 190 Ile Ser Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Leu Glu Pro Ser Ala Asn Met 195 200 205 Pro Trp Phe Lys Gly Trp Lys Val Thr Arg Lys Asp Gly Asn Ala Ser 210 215 220 Gly Thr Thr Leu Leu Glu Ala Leu Asp Cys Ile Leu Pro Pro Thr Arg 225 230 235 240 Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys Ile 245 250 255 Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val Glu Thr Gly Val Leu 260 265 270 Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Val Asn Val Thr Thr Glu 275 280 285 Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Pro 290 295 300 Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val Lys Asn Val Ser Val Lys Asp Val 305 310 315 320 Arg Arg Gly Asn Val Ala Gly Asp Ser Lys Asn Asp Pro Pro Met Glu 325 330 335 Ala Ala Gly Phe Thr Ala Gln Val Ile Ile Leu Asn His Pro Gly Gln 340 345 350 Ile Ser Ala Gly Tyr Ala Pro Val Leu Asp Cys His Thr Ala His Ile 355 360 365 Ala Cys Lys Phe Ala Glu Leu Lys Glu Lys Ile Asp Arg Arg Ser Gly 370 375 380 Lys Lys Leu Glu Asp Gly Pro Lys Phe Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ala 385 390 395 400 Ile Val Asp Met Val Pro Gly Lys Pro Met Cys Val Glu Ser Phe Ser 405 410 415 Asp Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr 420 425 430 Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ala Val Asp Lys Lys Ala Ala Gly Ala 435 440 445 Gly Lys Val Thr Lys Ser Ala Gln Lys Ala Gln Lys Ala Lys 450 455 460 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant UBE2L3 <400> 2 Met Ala Ala Ser Arg Arg Leu Met Lys Glu Leu Glu Glu Ile Arg Lys 1 5 10 15 Cys Gly Met Lys Asn Phe Arg Asn Ile Gln Val Asp Glu Ala Asn Leu 20 25 30 Leu Thr Trp Gln Gly Leu Ile Val Pro Asp Asn Pro Pro Tyr Asp Lys 35 40 45 Gly Ala Phe Arg Ile Glu Ile Asn Phe Pro Ala Glu Tyr Pro Phe Lys 50 55 60 Pro Pro Lys Ile Thr Phe Lys Thr Lys Ile Tyr His Pro Asn Ile Asp 65 70 75 80 Glu Lys Gly Gln Val Cys Leu Pro Val Ile Ser Ala Glu Asn Trp Lys 85 90 95 Pro Ala Thr Lys Thr Asp Gln Val Ile Gln Ser Leu Ile Ala Leu Val 100 105 110 Asn Asp Pro Gln Pro Glu His Pro Leu Arg Ala Asp Leu Ala Glu Glu 115 120 125 Tyr Ser Lys Asp Arg Lys Lys Phe Cys Lys Asn Ala Glu Glu Phe Thr 130 135 140 Lys Lys Tyr Gly Glu Lys Arg Pro Val Asp 145 150

Claims (8)

1. EEF1A1(eukaryote translation elongation factor 1α1) 또는 UBE2L3(ubiquitin-conjugating enzyme 2L3)에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 제1형 당뇨병 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 EEF1A1는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 UBE2L3는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 자가항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원, 이의 단편, 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 제1형 당뇨병 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 키트는 ELISA 키트인 것인 키트.
   
7. (a) 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 측정된 단백질 수준을 정상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는,
   제1형 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 EEF1A1 또는 UBE2L3에 대한 자가항체를 검출하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직시료인 것인 방법.

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