KR20120079299A

KR20120079299A - Ａｔｇ4Ｂ 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서

Info

Publication number: KR20120079299A
Application number: KR1020110000526A
Authority: KR
Inventors: 안형준; 권익찬; 최귀원
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-01-04
Filing date: 2011-01-04
Publication date: 2012-07-12
Also published as: KR101244837B1

Abstract

본 발명은 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서에 관한 것으로, 구체적으로 자가포식과 관련된 Atg4B 단백질 분해효소를 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서에 관한 것이다. 본 발명의 바이오 센서는 자가포식과 관련된 Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드를 포함하고 있어, Atg4B 단백질 분해효소를 효과적으로 검출할 수 있으며, 특히 상기 폴리펩타이드와 폴리머의 접합체로 형성된 나노파티클은 세포투과성 및 생체적합성이 매우 우수하므로 Atg4B 단백질 분해효소 보다 효과적으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 바이오 센서는 Atg4B 단백질 분해효소 반응용 조성물, 자기포식 영상화용 조성물, 자기포식 질환 진단용 조성물 및 Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

Ａｔｇ4Ｂ 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서{Biosensor for detecting Atg4B protease}

본 발명은 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서에 관한 것으로, 구체적으로 자가포식과 관련된 Atg4B 단백질 분해효소를 특이적으로 검출할 수 있는 바이오 센서에 관한 것이다.

자가포식(autophagy)은 세포내에서 리소좀의 분해과정을 이용하여 손상된 소포체나 오랜 수명으로 기능을 다한 단백질 등을 재활용하는 생명현상으로 영양분 결핍, 호르몬 불균형, 산화, 고온이상, 감염 등과 같은 외부자극, 혹은 세포내 리모델링, 단백질 침전 등과 같은 내부 필요성에 의하여 정확하게 조절된다 (Levine B. et al., Dev. Cell 2004, 6, 463-477.; Levine B. et al., Cell 2008, 132, 27-42.).

상기 자가포식은 수많은 항상성(homeostatic) 과정, 발달(developmental) 과정, 및 생리학적 과정에서 나타나며, 박테리아, 바이러스가 외부 침입한 세포를 제거하는 데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Levine B. et al., Nat. Rev. Immunol 2007, 7, 767-777.; Lee HK. et al., Curr. Opin. Immunol 2008, 20, 23 29.; Mizushima N. et al., Genes Dev 2007, 21, 2861-2873).

상기와 같이 자가포식 현상의 중요성에도 불구하고 포유 동물 세포에서 자가포식을 검출하는 방법은 자가포식 마커의 부족으로 인해 많은 한계가 있어 왔다. 구체적으로 현재 자가포식의 일반적 검출은 자가포식에 관여하는 LC3(microtuble-associated protein light chain 3) 단백질이 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE) 리피드와 연결된 후 자가포식소체(autophagosome)에 결합하는 것을 확인하는 방법으로 수행되어 왔으며, 보다 구체적으로 하기와 같은 세 가지 검출 방법이 주로 사용되어 왔다.

첫째로, 전자현미경을 사용하는 방법으로, 자가포식소체의 형태학적 분석을 통하여 수행하는 것이 있으나, 세포 전처리과정의 불편함, 살아있는 세포의 모니터링의 불가능, 일반 실험실에서의 접근 난이성 등의 문제로 인하여 널리 사용되지 못하고 있다.

둘째로, GFP-LC3 융합단백질을 세포에 트랜스펙션(trasnfection)에 의하여 인위적으로 발현시켜서 자가포식소체 형성시 나타나는 형광점 모양을 관찰하는 방법이 있으나, 이 방법은 자가포식이 발생한 세포외 정상세포에서도 상당부분의 점모양이 관찰되어서 자가포식 활성화된 세포와 정상세포를 구분하기에 난해하다는 단점이 있다. 또한 세포내에서 발현된 GFP-LC3 단백질의 과발현은 자가포식과는 무관하게 정상세포에서도 형광점을 발생시킨다는 단점이 있고 GFP-LC3 단백질 발현 자체가 자가포식을 유도한다는 문제점이 있다 (Mizushima N. et al., Cell 2010, 140, 313-326.). 또한 GFP-LC3 단백질은 리소좀과 융합된 후 생성되는 autolysosome에서는 표지력이 현저히 감소하는 문제점도 있다.

셋째로, 면역블로팅(immunoblotting)을 이용하여 LC3-I의 LC3-II로의 변환을 검출하는 방법이 있는데, LC3-II 자체가 자가포식에 의하여 분해되어 상대적인 양을 정량하기 어려운 문제점을 가지고 있으며 LC3-II 항체의 민감도가 LC3-I 보다 훨씬 높아서 둘 사이의 상대적인 양 비교가 불가능한 단점이 있다.

따라서, 종전 검출방법의 문제점을 개선하고 효과적으로 자기포식을 검출할 수 있는 방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다. 이를 통하여 자기포식 현상의 연구나 자가포식과 관련된 난치성 질환의 치료제 개발이 가능할 수 있다.

이에 본 발명자들은 자가포식 현상에서 활성화되는 Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드, 이와 폴리머를 연결하여 제조된 접합체 및 상기 접합체로 형성된 나노파티클을 개발함으로써 상기 Atg4B 단백질 분해효소를 효과적으로 검출할 수 있고 자가포식을 영상화 할 수 있음을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 일례는 하기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 Atg4B(Arabidopsis autophagy-related proteins 4b) 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서(Atg4B 단백질 분해효소 검출용 조성물)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

<화학식 1>

R1-R2-Gly

다른 예는 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)를 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 예는 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)로 형성된 나노파티클을 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 예는 상기 바이오 센서를 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 반응용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 예는 상기 바이오 센서를 함유하는 자기포식 영상화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 예는 상기 바이오 센서를 함유하는 자기포식 질환 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 예는 상기 바이오 센서를 함유하는, Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 Atg4B(Arabidopsis autophagy-related proteins 4b) 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공한다.

<화학식 1>

R1-R2-Gly

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)를 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)로 형성된 나노파티클을 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 바이오 센서를 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 반응용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 바이오 센서를 함유하는 자기포식 영상화용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 바이오 센서를 함유하는 자기포식 질환 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 바이오 센서를 함유하는, Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 'Atg4B'는 시스테인 단백질 분해효소의 일종으로, 자기포식이 발생하는 경우 활성화되는 단백질 분해효소이다 (Betin VM, Lane JD. Caspase cleavage of Atg4D stimulates GABARAP-L1 processing and triggers mitochondrial targeting and apoptosis. J Cell Sci 2009; 122: 2554-66). 상기 Atg4B 단백질 분해효소는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 인간을 포함한 포유류에서 유래된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간에서 유래된 것일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 NCBI 등재번호가 NP_037457인 단백질 분해효소일 수 있다.

본 발명에서 '바이오 센서'는 Atg4B 단백질 분해효소의 반응 여부를 검출할 수 있는 센서를 의미하며, Atg4B 단백질 분해효소가 본 발명의 폴리펩타이드를 인지하고 분해하는지 여부를 확인할 수 있는 센서를 의미한다. 본 발명에서 '센서'는 상기 폴리펩타이드의 Atg4B 단백질 분해효소 검출 용도를 표현하기 위하여 광의로 사용된 것으로, 유형적인 형태에 한정되지 않고, 폴리펩타이드가 효소 검출에 사용되는 다양한 적용 형태를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에서 '접합체'는 본 발명의 폴리펩타이드와 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 것으로, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드와 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 공유결합된 것을 의미한다.

본 발명에서 '나노파티클'은 상기 접합체에 포함된 폴리머의 자가 조립 성질에 의하여 형성된 것으로, 이에 한정되지 않지만 평균지름이 100 내지 800 nm, 바람직하게는 100 내지 500 nm일 수 있다.

본 발명의 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서는 하기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 한다.

<화학식 1>

R1-R2-Gly

상기 화학식 1에서 R1은 Thr 또는 Val이고, R2는 Phe 또는 Tyr다.

상기 폴리펩타이드는 Atg4B 단백질 분해효소가 인식하는 기질인 Atg8 단백질의 공통된 모티프를 추출함으로써 밝혀낸 것으로, Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 부위 (인식부위 또는 절단부위)이다. 구체적으로 Glycine 앞(R2)에는 방향족 고리(aromatic ring)를 측쇄로 갖는 페닐알라닌(Phe) 또는 티로신(Tyr)이 위치하며, 그 앞(R1)에는 트레오닌(Thr) 또는 발린(Val)이 위치한다.

상기 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 3개 이상 20개 이하의 아미노산 잔기로 구성된 것일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 폴리펩타이드의 한쪽 말단, 바람직하게는 아미노 말단에 위치하는 일차아민기에 형광물질이 결합할 수 있다. 이와 같은 형광물질 결합을 위하여, 상기 폴리펩타이드의 아미노 말단은 Ser일 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 화학식 1의 서열 (R1-R2-Gly)의 Gly (Atg4B의 인식부위)과 형광물질이 결합한 말단 (예컨대 아미노 말단)의 반대쪽 말단 (예컨대, 카르복시 말단) 사이에 위치하는 아미노산 중 하나 이상에 소광제가 결합하는 부위를 가질 수 있다. 상기 소광제가 결합하는 부위는 예컨대, Lys의 아민기 또는 Cys의 SH기일 수 있으며, 따라서, 상기 폴리펩타이드는 상기와 같은 형광물질이 결합한 말단 (예컨대 아미노 말단)의 반대쪽 말단 (예컨대, 카르복시 말단)과 화학식 1의 서열 (R1-R2-Gly)의 Gly과 카르복시 말단 사이에 Lys 및 Cys으로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 용해도 향상을 위하여 친수성 아미노산, 예를 들어 아르기닌(Arg)을 추가적으로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시된 것일 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 표지인자로 표지될 수 있으며, 상기 표지인자는 단백질에 공유 또는 비공유로 결합하여 특정 아미노산 서열의 존재여부를 표지할 수 있는 물질로써 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효소, 형광물질, 방사성 동위원소, 소광체 또는 화학물질일 수 있다.

상기 형광물질은 적색 또는 근적외선의 형광을 발광하는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사, 보디피 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 형광 염료인 FITC일 있다. 상기 형광물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 폴리펩타이드에 표지될 수 있으며 보다 바람직하게는 상기 폴리펩타이드에 함유된 Serine에 표지될 수 있다.

상기 소광체는 상기 형광물질에서 발하는 형광을 소광시킬 수 있는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 블랙홀 소광체(blackhole quencher), 블랙베리(blackberry quencher) 소광체 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있으며, 형광체의 종류에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 보다 바람직하게는 형광체를 FITC를 사용하는 경우 소광체로 블랙홀 소광체(blackhole quencher)를 사용할 수 있다. 상기 소광체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 폴리펩타이드에 표지될 수 있으며, 예를 들어 블랙홀 소광체(blackhole quencher)를 사용하는 경우 상기 폴리펩타이드를 구성하는 lysine (아민기) 또는 cysteine (티올기) 잔기에 표지될 수 있다.

상기와 같이 형광물질를 상기 펩타이드의 한쪽 말단에 표지하고 소광체를 상기 펩타이드의 반대쪽 말단에 표지함으로써, Atg4B 단백질 분해효소가 존재하지 않은 상태에서 본 발명의 융합 단백질이 소광 현상을 보이나 Atg4B 단백질 분해효소가 상기 펩타이드의 인식부위를 분해하는 경우 형광 현상을 보임으로써 Atg4B 단백질 분해효소를 용이하게 검출할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서는 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)를 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 폴리펩타이드와 결합하여 나노파티클을 형성하는 폴리머는 특정 폴리머에 한정되지 않지만, 바람직하게는 글라이콜 키토산, 예컨대 글라이콜 키토산의 당잔기에 5β-콜란산(cholanic acid)을 결합하여 소수성을 부여한 HGC(Hydrophobically Modified Chitosan) 폴리머가 바람직할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 HGC 폴리머는, 이에 한정되지 않지만, 글라이콜 키토산의 당잔기의 5β-콜란산의 결합 정도가 총 모노사카라이드 유닛의 10 mol% 내지 40mol%, 더욱 바람직하게는 약 15 mol% 내지 25 mol%, 가장 바람직하게는 약 19.1mol%일 수 있다.

상기 접합체는 상기 폴리펩타이드 및 상기 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 것으로, 상기 폴리머는 상기 폴리펩타이드를 표면에 노출시키는 나노파티클의 역할뿐만 아니라 소수성 리소좀 염료를 폴리머의 자가조립 성질을 이용하여 나노파티클의 내부에 봉입시키는 역할을 수행할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서는 상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)로 형성된 나노파티클을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 나노파티클은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 나노파티클의 내부에 리소좀 염색 염료가 봉입될 수 있으며, 상기 리소좀 염색 염료는 리소좀 내부의 산성조건하에서 형광 시그널을 발생시키는 염료를 의미하며 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 Lysolite Red일 수 있다. 상기 리소좀 염색 염료는 세포내에서 리소좀에 의한 폴리펩타이드 분해를 검출함으로써, Atg4B 단백질 분해효소에 의한 폴리펩타이드 분해를 구분하기 위한 것이다.

상기 나노파티클은 세포투과율이 현저히 우수하며, 세포 독성이 없어 생체 적합성도 매우 우수하다. 나아가, 상기 폴리펩타이드를 포함하고 있어 Atg4B 단백질 분해효소를 특이적으로 검출할 수 있다.

따라서 본 발명의 바이오 센서는 Atg4B 단백질 분해효소에 특이적으로 인식되는 폴리펩타이드를 포함하고 있어, Atg4B 단백질 분해효소의 존재여부나 발현 정도를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 예를 들면, 자가포식이 유도 혹은 발생한 세포에서 Atg4B 활동도를 분석함으로써 자가포식이 진행중임을 분석할 수 있다. 나아가 이를 통하여 살아있는 세포에서 자가포식 과정을 실시간으로 영상화할 수 있다.

따라서, 또 다른 측면에서 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 포함하는 Atg4B 단백질 분해효소 반응용 조성물이 제공된다.

또 다른 측면에서 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 포함하는 세포의 자가포식 영상화용 조성물이 제공된다.

또 다른 측면에서, 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 생물시료에 접촉시키는 단계; 및 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서 내의 Atg4B 단백질 인식 부위(화학식 1의 서열 중 Gly 다음 위치)의 절단 여부를 영상화하는 단계를 포함하는, 세포의 자가포식 영상화 방법이 제공된다. 상기 영상화 단계는 앞서 설명한 형광물질로부터 발생하는 형광 또는 형광 세기를 통상의 방법 (예컨대, 형광현미경, 형광분광기 등)으로 측정하여 수행될 수 있다. 상기 생물시료는 동물, 바람직하게는 포유류, 예컨대, 사람을 포함하는 영장류, 설치류 등으로부터 유래하는 것으로, 상기 동물의 생체 또는 생체로부터 분리된 조직 또는 세포일 수 있다.

또한 또 다른 측면에서 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 포함하는 자기포식 관련 질환의 진단용 조성물이 제공된다.

또 다른 측면에서, 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 생물시료에 투여하는 단계; 및 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서 내의 Atg4B 단백질 인식 부위(화학식 1의 서열 중 Gly 다음 위치)의 절단 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 자기포식 관련 질환의 진단에 정보를 제공하는 방법이 제공된다. 이 때, 상기 인식 부위의 절단 정도가 정상시료의 절단 정도와 비교하여 높은 경우 상기 생물시료는 자기포식 관련 질환을 앓고 있는 것으로 판단할 수 있다. 상기 인식 부위의 절단 정도의 측정 단계는 앞서 설명한 형광물질로부터 발생하는 형광 또는 형광 세기를 통상의 방법(예컨대, 형광현미경, 형광분광기 등)으로 측정하여 수행될 수 있다. 상기 생물시료는 동물, 바람직하게는 포유류 (예컨대, 사람을 포함하는 영장류, 설치류)로부터 유래하는 것으로, 상기 동물의 생체 또는 생체로부터 분리된 조직 또는 세포일 수 있다. 또한, 상기 정상시료는 자기포식 관련 질환을 앓고 있지 않은 동물, 바람직하게는 포유류(예컨대, 사람을 포함하는 영장류, 설치류), 또는 이로부터 분리된 조직 또는 세포를 의미한다.

상기 자기포식 관련 질환은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 픽병(Pick's Disease), 및 파킨슨-ALS(amyotrophic lateral sclerosis)-치매 복합증 등의 퇴행성 신경질환; 고형암 (폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 식도암, 전립선암, 뇌암 등), 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종 등 암; 심근증; 노화; PCD(type II programmed cell death), 및 박테리아 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다 (Nixon RA, Cataldo AM, Mathews PM. The endosomal-lysosomal system of neurons in Alzheimer's disease pathogenesis: a review. Neurochem Res 2000; 25: 1161-72; Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakaya H, Yoshimori T, et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature 2004; 432: 1032-36; 및 Tanida I, Minematsu-Ikeguchi N, Ueno T, Kominami E. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy. Autophagy 2005; 1: 84-91 참조).

상기 영상화용 또는 진단용 조성물 내의 유효성분으로서의 상기 바이오 센서의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 '고형분 중량'은 추출물 중 용매 성분을 제거하고 남은 성분의 중량을 말한다.

　상기 영상화용 또는 진단용 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한 또 다른 측면에서 본 발명은 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서를 포함하는 Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및 상기 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서 내의 Atg4B 단백질 인식 부위(화학식 1의 서열 중 Gly 다음 위치)의 절단 정도를 측정하는 단계를 포함하는, Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝 방법이 제공된다. 이 때, 후보 화합물을 접촉시킨 경우의 Atg4B 단백질 인식 부위 절단 정도가 후보 화합물을 접촉시키지 않은 경우와 비교하여 감소된 경우, 상기 후보 화합물을 Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물로서 판단할 수 있다. 상기 인식 부위의 절단 정도의 측정 단계는 앞서 설명한 형광물질로부터 발생하는 형광 또는 형광 세기를 통상의 방법(예컨대, 형광현미경, 형광분광기 등)으로 측정하여 수행될 수 있다. 상기 후보 화합물은 각종 화합물, 단백질, 핵산 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 바이오 센서는 자가포식과 관련된 Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드를 포함하고 있어, Atg4B 단백질 분해효소를 효과적으로 검출할 수 있으며, 특히 상기 폴리펩타이드와 폴리머의 접합체로 형성된 나노파티클은 세포투과성 및 생체적합성이 매우 우수하므로 Atg4B 단백질 분해효소 보다 효과적으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 바이오 센서는 Atg4B 단백질 분해효소 반응용 조성물, 자기포식 영상화용 조성물, 자기포식 질환 진단용 조성물 및 Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝 조성물로 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드및 HGC(Hydrophobically Modified 글라이콜 키토산) 폴리머가 결합된 접합체, 상기 접합체로 형성되고 리소좀 염색 염료가 내부에 봉입된 나노파티클 및 자가포식 현상에서 활성화된 Atg4B 단백질에 의하여 상기 폴리펩타이드가 분해됨으로써 형광이 발생하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는 Atg4B 단백질 분해효소에 인식되는 기질 단백질인 Atg8의 homolog인 ScAtg8, RnLC3, HsGATE16, HsGABARAP, 및 SpAtg8의 인식부위를 서열분석하여 Atg4B에 인식되는데 필요한 최소한의 서열 모티프를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 폴리펩타이드에 형광체와 소광체를 각각 결합시키고 HPLC를 사용하여 분리 정제하는 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 수용액상에서 Dynamic Light Scattering (DLS)를 이용하여 본 발명의 나노파티클의 평균 크기를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 나노파티클의 우수한 세포투과성을 보여주는 결과이다.
도 6는 본 발명의 나노파티클의 우수한 생체적합성을 나타낸 결과(A)와 자가포식 유도체인 rapamycin의 세포내 독성평가 결과(B)이다.
도 7은 자가포식 유도체인 rapamycin 1μM을 처리한 후 LC3 항체를 이용하여 자가포식이 유도되었음을 보여주는 결과이다.
도 8은 본 발명의 나노파티클 내부에 봉입된 Lysolite Red 염료에 의하여 나노파티클이 세포내 리소좀에 내부로 포획되었을 때 리소좀 내부의 산성에 의하여 염색이 가능하며 cytoplasm에서는 Lysolite Red 염료가 염색되지 않음을 보여주는 결과이다.
도 9는 본 발명의 나노파티클이 Atg4B 단백질 분해효소에 특이적으로 반응하는 것을 보여주는 결과이다.
도 10은 본 발명의 나노파티클이 Atg4B 단백질 분해효소에 특이적으로 반응하는지를 단백질 분해효소 저해제를 첨가하여 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 나노파티클이 자가포식이 유도된 세포에서 형광신호를 발생할 수 있으며, Atg4B 저해제를 사용할 경우 자가포식이 유도된 세포 추출물에서도 형광신호가 감소했음을 보여주는 결과이다.
도 12는 본 발명의 나노파티클을 사용하여 자가포식을 유도한 세포에서 시간에 따라 Atg4B의 활동도를 영상화한 세포영상(A), scramble 나노파티클을 처리하고 자가포식 유도 5 시간 후의 세포영상 결과(B), 본 발명의 나노파티클을 정상세포에 처리하고 5시간 후에 관찰한 세포영상(C) 결과이다.
도 13은 본 발명의 나노파티클과의 비교를 위하여 폴리펩타이드 서열이 바뀐 scramble 나노파티클이 자가포식이 유도된 세포에서 Atg4B의 활동도를 영상화할 수 없음을 보여주는 결과이다.
도 14는 본 발명의 나노파티클은 자가포식이 유도되지 않은 정상세포에서는 Atg4B의 활동도를 영상화하지 않음을 보여주는 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 아미노산 서열에 형광체와 소광체가 결합된 폴리펩타이드의 제조

<1-1> Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 아미노산 서열 디자인

자가포식에 관여하는 Atg4B에 인식되는 기질인 Atg8 단백질간에 공통적으로 존재하는 아미노산 서열 모티프를 추출해 내기 위하여 ScAtg8 (Saccharomyces cerevisiae, Genbank Accession No. CAA84899), RnLC3 (Rattus norvegicus, No. AAP42561), HsGATE16 (Homo sapiens, No. AAK20400.1), HsGABARAP (Homo sapiens, No. BAB21549), 및 SpAtg8 (Schizosaccharomyces Pombe, NCBI Accession No. NP_596531)의 아미노산 서열분석을 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 기재한 바와 같이, Atg4B에 분해되는 위치는 glycine 잔기 다음이며, glycine 잔기 앞에는 반드시 aromatic ring을 side chain으로 가지고 있는 phenyalanien 혹은 tyrosine 잔기가 위치해야 하며, 그 앞에는 아미노산 서열분석에서 높은 보전성을 보이는 threonine 잔기가 바람직하다.

상기 도 2의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 친수성 용해도를 향상시키기 위해 arginine 잔기를 도입하고, 소광체를 결합하기 위해 lysine 잔기를 도입함으로써, Atg4B 단백질 분해효소가 특이적으로 인식하는 아미노산 서열로 서열번호 1(S TFG FSGKRRRRRRRRR)의 아미노산 서열을 디자인하였다.

<1-2> 형광체와 소광체의 결합 및 분리 정제

상기 <실시예 1-1>에서 디자인된 폴리펩타이드에 세포영상화에 필요한 형광체와 소광체를 결합하였다.

구체적으로 형광체 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 서열번호 1의 아미노산 말단의 primary amine에 부착되어있는 형태로 폴리펩타이드(FITC-peptide)를 합성(Peptron Inc. Korea에 합성 의뢰함)하여 HPLC로 정제한 후, FITC-peptide 4 mg과 NHS ester 반응기가 달려있는 소광체 BHQ1(Black Hole Quencher)을 몰비율 1:2로 각각 DMSO(Dimethylsulfoxide)에 용해시켜서 0.5 M HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, pH 7.5) 버퍼용액을 같은 부피만큼 넣어줌으로써 pH를 조절하였다. 상기 반응은 12시간 동안 상온에서 이루어졌으며 반응하지 않은 소광체와 반응부산물은 HPLC 액체크로마토그래피(ZORBAX Eclipse XDB-C18, Agilent Technologies)를 이용하여 정제하였다 (도 3). 구체적으로 eluent A buffer (0.1 % TFA in distilled water)로 수세하였고 25 내지 95 % eluent B buffer (0.1 % TFA in acetonitrile)를 25분 동안 1mL/min의 속도로 흘려주었다. 수집된 FITC-peptide-BHQ1 정제물은 동결건조(lyophilize)하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 폴리펩타이드 및 HGC 폴리머가 결합된 접합체의 제조

먼저 HGC 폴리머를 제조하기 위하여, 글라이콜 키토산에 존재하는 아민 자리 중 23 mol%에 해당하는 아민 자리에 5β-cholanic acid을 결합시키기 위해 글라이콜 키토산 250 mg과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride) 64.5 mg을 증류수 30 mL에 녹이고, 별도의 플라스크에서는 5β-cholanic acid 80.8 mg과 NHS (N-hydroxysuccinimide) 38.7 mg을 메탄올 90 mL에 녹였다. 주사기를 이용하여 천천히 5β-cholanic acid과 NHS의 반응용액을 글라이콜 키토산과 EDC의 반응용액에 상온에서 하루 동안 천천히 첨가하였다. MWCO=12 kDa 투석막을 이용하여 증류수와 메탄올의 비율을 1:4에서 점점 증류수의 비율을 높여가면서 투석하였고 최종적으로는 순수한 증류수에서 투석한 후 동결건조(lyophilize)하였다. 상기와 같이 제조된 HGC 폴리머로 형성된 HGC 나노파티클은 DLS에 의한 분석에서 증류수에 용해된 경우 약 359 nm의 평균지름을 갖는 것으로 알려져 있다(Nam HY. et al., J Control Release 2009, 136, 259-267).

상기 <실시예 1-2>에서 정제된 폴리펩타이드를 상기 HGC 나노파티클에 결합시키기 위하여, 1.4 mg의 상기 폴리펩타이드를 DMSO에 녹인 후 같은 부피의 PBS (pH 6.0) 버퍼를 첨가하였다. 또한 EDC 1mg과 sulfo-NHS 1.2 mg을 PBS (pH 6.0) 버퍼에 녹이고 상기 준비된 펩파이드 용액에 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 14 mL PBS(pH 7.4)에 상기 합성된 HGC 폴리머를 녹인 용액을 첨가하여 12시간 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응물을 상기 HGC 폴리머 합성하는 경우와 마찬가지 방법으로 MWCO=12 kDa 투석막으로 투석한 후 동결건조(lyophilize)하여, FITC-peptide-BHQ1 및 HGC 폴리머가 결합된 접합체를 제조하였다.

< 실시예 3>

본 발명의 접합체로 형성된 나노파티클 및 이의 내부에 리소좀 염색 염료의 봉입

상기 <실시예 2>에서 본 발명의 폴리펩타이드에 형광체 및 소광체가 결합된FITC-peptide-BHQ1 및 HGC 폴리머가 결합된 접합체로 형성된 나노파티클에 리소좀 염색 염료인 Lysolite Red (AAT Bioquest, USA)를 봉입하기 위하여, 상기 나노파티클 0.1 mg을 20 μL DMSO에 녹인 후 DMSO에 녹아있는 Lysolite Red 10 μL를 첨가하고 70 μL PBS 버퍼를 첨가하였다. 상기 혼합물을 초음파를 이용하여 균일하게 만들어 주었으며, 이때 HGC 폴리머가 가지는 친수성과 소수성 성질에 의한 자가조립현상에 의하여 소수성인 Lysolite Red 염료가 나노파티클의 소수성 내부에 봉입되었다. 최종적으로 상기 나노파티클을 PBS 버퍼에 투석하고 DLS 측정 결과 평균지름이 약 322 nm임을 알 수 있었다 (도 4).

< 실험예 1>

본 발명의 나노파티클의 세포투과 활성

상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 나노파티클의 세포투과성을 확인하기 위하여 human breast cancer cell line인 MDA-MB231(Cassoni, P. et al. Journal of Cancer 1998, 72(2), 340-344.)에 대한 세포투과 실험을 수행하였다.

구체적으로 형광현미경에서의 형광관찰을 용이하게 하기 위하여, 먼저 상기 <실시예 1-2>에서 FITC-peptide-BHQ1 폴리펩타이드 합성시 소광체 BHQ1의 결합을 생략한 후 HGC 폴리머에 상기 폴리펩타이드를 결합시키고, 앞에서 기술한 것처럼 리소좀 염색 염료를 봉입하여 나노파티클을 제조하였다. MDA-MB231 cell (4x10⁵)에 상기 나노파티클 10 μg/mL을 처리한 후 10 분 간격으로 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 형광현미경으로 Achroplan IR40 x/0.80W lens, FITC용 a fluorescence filter(Omega optical), Axiocam black and white CCD camera(Carl Zeiss)가 부착된 Axioskop2 FS plus imaging microscope (ZEISS)을 사용하였으며, 이의 관찰결과를 도 5에 기재하였다.

상기 도 5에 기재한 바와 같이, 본 발명의 나노파티클을 처리한 후 10 분 경과부터 세포내 투과가 관찰되기 시작하였으며 약 30분 경과에서 최대의 세포투과성을 보여주었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 나노파티클은 세포투과성이 매우 우수함을 알 수 있다.

< 실험예 2>

본 발명의 나노파티클의 세포독성 조사 및 자가포식 유도체 세포독성 조사

본 발명의 나노파티클의 세포내 생체적합성을 조사하기 MTT assay를 수행하였다. 구체적으로 1x10⁴ cells/mL 밀도를 갖는 MDA-MB231 cell에 대하여 다양한 농도의 나노파티클을 처리하고 그 결과를 도 6a에 기재하였다.

상기 도 6a에 기재한 바와 같이, 본 발명의 나노파티클은 300 μg/mL까지 우수한 생체적합성을 보여주었으며 바람직하게는 본 발명의 나노파티클의 농도를 10 μg/mL로 결정할 수 있었다.

한편 대표적 자가포식 유도체인 rapamycin의 생체내 독성을 MTT assay를 통하여 상기와 동일한 방법으로 조사하고 그 결과를 도 6b에 기재하였다.

상기 도 6b에 기재한 바와 같이, 동일한 방식으로 독성 실험한 결과 rapamycin은 10 μM까지 우수한 생체적합성을 보여주었고 보다 바람직하게는 하기 실험에서 rapamycin으로 자가포식을 유도하는 경우 그 농도를 1 μM로 결정하였다.

< 참조예 1>

본 발명에서 이용한 자가포식 유도체 rapamycin 의 자가포식 유도 확인

mTOR(mammalian target of rapamycin) 저해를 통한 rapamycin의 세포내에서의 자가포식 유도 활성을 immunoblotting을 이용하여 확인하였다.

구체적으로 MDA-MB231 세포 (4x10⁵)에 1 μM rapamycin을 30분에서 5시간까지 처리한 후 세포를 PBS 버퍼에 수세하고 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% soduim deoxycholate, and 0.1% SDS)에서 초음파를 사용하여 용해하였다. 원심분리를 통해 상층액만을 분리한 후 15 % SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 하고 분획된 단백질들을 polyvinylidene difluoride membrane에 transfer하였다. 비특이적 결합을 막기 위해서 5% Skim milk로 membrane을 1시간 동안 상온에서 블로킹하고 0.15% Tween 20 (PBST)이 포함된 PBS 버퍼로 3번 수세하였다. anti-Atg8/LC3 antibody (diluted 1:1000, v/v, Sigma, St. Louis, Missouri, U.S.A)을 사용하여 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 난 후 다시 PBST(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% tween 20)를 이용하여 수세하였다. 희석된 peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (1:2000, v/v; Sigma, St. Louis, Missouri, U.S.A)을 상온에서 3시간 동안 반응시킨 후 결합된 항체는 Enhanced Chemiluminescence Reagent (Enhanced Chemiluminescence Western blotting system, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)을 사용하여 검출하고 그 결과를 도 7에 기재하였다. 이때 LC3-I과 LC3-II간의 상대적인 비율의 차이는 자가포식이 진행되고 있음을 의미한다.

상기 도 7에 기재한 바와 같이, rapamycin을 처리하는 경우 LC3-I에서 LC3-II로의 전이가 발생함을 알 수 있으며 이로부터 rapamycin이 자가포식을 유도할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 3>

본 발명의 나노파티클이 리소좀에서 보여주는 세포영상

본 발명의 나노파티클이 리소좀 내에서도 발견될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명의 나노파티클 내부에 리소좀 염색 염료를 봉입하였다. 이를 통해 본 발명의 나노파티클이 리소좀에 포획될 경우 형광시그널을 발생하는지 여부를 확인하였다. 즉 상기 리소좀 염색 염료는 리소좀의 산성조건하에서만 형광을 나타내므로 본 발명에서는 cytoplasm에 존재하는 나노파티클과 리소좀에 존재하는 나노파티클을 구분하기 위하여 나노파티클 내부에 Lysolite Red 리소좀 염색 염료를 봉입한 것이다.

구체적으로 FITC와 BHQ1을 결합시키지 않은 본 발명의 폴리펩타이드를 HGC 폴리머에 결합시켜서 peptide-HGC 접합체를 준비하였다. 이러한 접합체 0.1 mg을 DMSO(Dimethylsulfoxide) 20 μL에 녹이고 10 μL Lysolite Red 염료 원액과 혼합한 후 70 μL PBS 버퍼을 첨가하고 초음파로 처리하였다. 이러한 과정은 amphiphilic 성질을 갖는 HGC 폴리머가 자가조립성질에 의하여 나노파티클로 형성될 때 소수성 성질을 갖는 내부에 역시 마찬가지로 소수성인 Lysolite Red 염료가 봉입하도록 하여 최종적으로는 염료가 나노파티클의 내부에 봉입될 수 있었다. 포함된 DMSO를 제거하기 위하여 PBS 버퍼에 대하여 투석을 3회 실시하였다. 다음으로 상기 나노파티클 10 μg/Ml을 MDA-MB231 세포(4x10⁵)에 처리하고 시간별로 형광현미경을 이용하여 관찰하고 그 결과를 도 8에 기재하였다.

상기 도 8에 기재한 바와 같이, 세포투과된 나노파티클 중 리소좀에 포획된 소량은 1시간부터 빨간색의 형광을 보여주기 시작하였으며 이러한 결과는 본 발명의 나노파티클이 리소좀에 포획될 경우 FITC와는 다른 형광파장을 발생함으로써 충분히 Atg4B에 의한 시그널과 구분될 수 있음을 보여준다. 또한 시간에 따른 빨간 형광점의 증가는 관찰되지 않았다.

< 실험예 4>

본 발명의 나노파티클의 Atg4B 단백질 분해효소에 대한 반응 특이성

본 발명의 나노파티클에 결합되어있는 폴리펩타이드가 시스테인 유형 펩티드를 가수분해하는 것으로 알려진 Atg4B 단백질 분해효소에 대해서만 특이적으로 형광을 복원시키는 것을 확인하기 위해, 다른 시스테인 유형 단백질 분해효소와 비교하였다.

구체적으로 assay buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에서 caspase-7, caspase-8, papain, Atg4B 단백질 분해효소(NCIB NP_037457) 각각의 10 μg/mL 농도에 대하여 본 발명의 나노파티클 10 μg/mL을 30분간 37℃에서 반응시키고 발생하는 형광신호를 측정하여 그 결과를 도 9에 기재하였다.

상기 도 9에 기재한 바와 같이, 분해효소가 없는 대조구 실험에서 본 발명의 나노파티클은 background signal만을 나타내었고 caspase-7, caspase-8, papain 분해효소에 대해서는 매우 낮은 형광시그널을 발생한 반면, Atg4B 반응에서는 20배 이상의 형광복원력을 보여주었다 (도 9). 또한 Atg4B에 인식되지 않는 scramble 폴리펩타이드를 결합시킨 나노파티클에서는 형광신호가 거의 발생하지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명의 나노파티클이 Atg4B 단백질 분해효소에만 특이적으로 반응한다는 것을 알 수 있다. 상기 scramble 폴리펩타이드는 Atg4B에 인식되지 않는 random sequence를 의미하는 것으로, 본 실험예에서는 'STFWFSGKRRRRRRRRR'(서열번호 2)를 사용하였다.

또한 본 발명의 나노파티클의 Atg4B 단백질 분해효소에 대한 특이성을 좀더 확인하기 위하여, 시스테인 유형 단백질 분해효소의 대표적 저해제인 PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)와 Complete Protease Inhibitor Cocktail (a mixture of protease inhibitors that stop a multitude of proteases)을 첨가하고 형광신호를 측정하여 그 결과를 도 10에 기재하였다.

상기 도 10에 기재한 바와 같이, Atg4B 효소가 있는 경우 형광이 매우 강하게 발생한 반면, 상기 저해제가 있는 경우에서는 Atg4B 효소가 없는 경우와 마찬가지로 본 발명의 나노파티클은 형광을 발생하지 않았다. 상기 결과는 본 발명의 나노파티클, 보다 구체적으로 상기 나노파티클에 포함된 본 발명의 폴리펩타이드가 Atg4B 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 분해될 수 있으며, Atg4B 단백질 분해효소가 저해되었을 경우에는 분해되지 않음을 보여준다.

< 실험예 5>

본 발명의 나노파티클로 자가포식이 유도된 세포에서의 형광복원력 확인

본 발명의 나노파티클로 세포내에서의 Atg4B 단백질 분해효소의 활동성을 영상화할 수 있는지를 확인하기 위하여 세포에 대한 형광복원 실험을 수행하였다.

구체적으로 MDA-MB231 세포에 1 μM rapamycin을 처리한 후 1시간에서 5시간까지 세포배양을 한 후 세포를 수거해서 세포내용물을 초음파를 이용해 추출하였다. 이렇게 준비된 세포추출물에 본 발명의 나노파티클 10 μg/mL을 처리한 후 형광복원을 측정하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.

상기 도 11에 기재한 바와 같이, 정상세포 추출물을 사용한 샘플에서는 형광발생이 극히 미비하였으나 자가포식이 유도된 세포추출물에서는 시간이 증가할수록 형광시그널이 증가하였다. 특히 자가포식 유도 5시간째 세포추출물에서는 정상세포추출물과 비교할 때 약 5배 이상의 형광복원을 보여주었으나 정상세포추출물에서는 background signal과 비교할 때 약 1.5배정도의 형광발생에 그쳤다. 상기 결과로부터 자가포식 유도에 의해 활성화된 Atg4B 단백질 분해효소에 의해 본 발명의 나노파티클이 형광복원이 가능함을 알 수 있다.

< 실험예 6>

본 발명의 나노파티클을 이용한 자가포식 유도 세포에서의 Atg4B 활동도 영상화

본 발명의 나노파티클을 이용하여 세포내에서 자가포식 유도에 의해 활성화된 Atg4B 단백질 분해효소가 형광을 복원시키는 것을 영상화하였다.

구체적으로 MDA-MB231 세포에 나노파티클 10 μg/mL을 30분간 처리한 후 자가포식 유도체인 rapamycin을 1 μM 농도로 처리하였다. Confocal 현미경을 이용하여 관찰한 결과, rapamycin 처리 1시간 후에는 오직 노란 시그널만이 관찰되었는데 이는 FITC와 Lysolite Red 염료 파장의 co-localization에 의한 결과로서, 리소좀에 포획된 나노파티클이 리소좀에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되었음을 나타낸다(도 12A). 사용한 confocal 현미경은 Argon (488 nm)과 HeNe (543 nm) lasers가 설치된 Olympus FV1000 confocal laser scanning microscope (Olympus, Tokyo, Japan)이었다.

그러나 rapamycin 처리 2시간 경과한 후에는 cytoplasm에서의 FITC 형광발생이 관찰되었으며 리소좀에서 관찰되는 노란 형광과는 구분이 되었다. 이러한 FITC 형광발생은 cytoplasm에 존재하는 Atg4B 단백질 분해효소에 의해 나노파티클의 폴리펩타이드가 분해되었음을 나타낸다. 시간이 경과함에 따라 빨간 형광점 외부에 존재하는 FITC 형광 시그널이 점점 증가하였고 5 시간째에서 최대의 형광발생을 보여주었다.

상기 결과로부터 본 발명의 나노파티클이 세포내에서 Atg4B 분해효소의 활동도를 영상화함으로써 자가포식의 진행상태를 영상화할 수 있음을 알 수 있다.

또한 정상세포에서 본 발명의 나노파티클의 반응성을 조사하기 위하여 자가포식 유도체를 처리하지 않은 MDA-MB231 세포에 나노파티클 10 μg/mL을 30분간 처리하고 시간에 따라 형광을 관찰하였다. 정상세포에서 본 나노파티클은 오직 노란 형광 시그널만을 나타내었고 이것은 리소좀에 의한 비특이적 분해반응의 결과이며 Atg4B 단백질 분해효소에 의한 형광복원은 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 나노파티클이 자가포식 유도 세포에서만 형광이 복원됨을 알 수 있었다 (도 13).

그리고 아미노산 인식서열을 바꾼 scramble 나노파티클을 사용한 control 실험에서 Atg4B에 의한 형광복원은 관찰되지 않았고 리소좀에 의한 비특이적 분해를 보이는 노란 형광점만이 관찰되었다(도 14).

따라서 상기 결과들을 종합해 보면, 본 발명의 나노파티클은 정상세포에서는 형광복원이 안되지만 자가포식이 유도된 세포에서는 Atg4B 단백질 분해효소에 특이적으로 형광을 복원시킴으로써 세포내에서 실시간으로 자가포식 현상을 영상화할 수 있음을 알 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Biosensor for detecting Atg4B protease <130> DPP20106715KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence specifically recognized by Atg4B protease, wherein 'TFG' is recognition site of Atg4B protease <400> 1 Ser Thr Phe Gly Phe Ser Gly Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of scramble polypeptide which is not recognized by Atg4B protease <400> 2 Ser Thr Phe Trp Phe Ser Gly Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg

Claims

하기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 3개 이상 20개 이하의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드를 함유하는 Atg4B(Arabidopsis autophagy-related proteins 4b) 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서,
<화학식 1>
R1-R2-Gly
상기 화학식 1에서 R1은 Thr 또는 Val이고, R2는 Phe 또는 Tyr다.
상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)를 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
상기 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 나노파티클을 형성할 수 있는 폴리머가 연결된 접합체(conjugate)로 형성된 나노파티클을 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제3항에 있어서, 상기 나노파티클의 내부에 리소좀 염색 염료가 봉입된 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 화학식 1의 서열의 Gly과 카르복시 말단 사이에 Lys 및 Cys으로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상을 포함하는 것인 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노 말단에 형광물질이 연결되고, 화학식 1의 서열의 Gly과 카르복시 말단 사이의 Lys 또는 Cys에 소광체가 연결된 것인 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머는 HGC (Hydrophobically Modified Chitosan) 폴리머인 것인 Atg4B 단백질 분해효소 검출용 바이오 센서.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오 센서를 함유하는 Atg4B 단백질 분해효소 반응용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오 센서를 함유하는 자기포식 영상화용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오 센서를 함유하는 자기포식 관련 질환 진단용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 자기포식 질환은 퇴행성 신경질환, 암, 심근증, 노화, PCD(type II programmed cell death) 및 박테리아 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 것인 자기포식 질환 진단용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 바이오 센서를 함유하는, Atg4B 단백질 분해효소의 과다발현을 억제하는 약물의 스크리닝용 조성물.