CN102666877A - 治疗神经病理性疼痛的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗由SIP30调控的神经病理性疼痛的化合物、组合物、方法、系统和试剂盒。本发明提供了用于治疗神经病理性疼痛的SIP30拮抗剂。

Description

治疗神经病理性疼痛的组合物及方法
与相关申请的交叉引用
根据《美国法典》第35卷第119节e项(35U.S.C.§119(e))，本申请要求2009年9月2日提交的序列号为61/239,065的美国临时专利申请的优先权，此项申请在此以其全文并入本文作为参考。
关于联邦资助研究的声明
产生本发明的研究是由美国国立卫生研究院基金(NIHGrant R01 DA013471)部分支持的。因此，美国政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明涉及在哺乳动物中采用SIP30拮抗剂治疗神经病理性疼痛。
背景技术
神经病理性疼痛是一种复杂的慢性疼痛状态，通常伴有组织损伤。神经病理性疼痛中，神经纤维本身可能是受损的、功能有障碍的或者是损伤的。这些受损的神经纤维将错误的信号发送给其它痛觉中心。神经病理性疼痛的临床病因非常广泛，既包括外伤也包括疾病。例如，大脑或脊髓的外伤性神经压迫或神经挤压和外伤性损伤是神经病理性疼痛的常见病因。此外，大多数外伤性神经损伤还会引起神经瘤的形成，此时，疼痛则是神经异常再生的结果。另外，当肿瘤生长强烈压迫到临近的神经(大脑或脊髓)时便会引发癌症相关性神经病理性疼痛。神经病理性疼痛还和例如糖尿病或酒精中毒等疾病相关。
遗憾的是，目前神经病理性疼痛的的药物治疗方法常常不足以缓解需要此项治疗的患者的疼痛。除此以外，目前的治疗还有严重的副作用，包括，例如认知改变、镇静作用和恶心，在麻醉药物治疗时还会成瘾。很多神经病理性疼痛的患者都是老年人，或者正罹患其它疾病，这尤其限制其对目前药物治疗副作用的耐受力。为数众多的抗炎药、抗焦虑药、麻醉剂，甚至抗惊厥药物都被从业医师用于治疗神经病理性疼痛但是疗效甚微。
目前的缓解神经病理性疼痛的治疗方法的不足急需新的组合物及方法来满足患有这种疾患的病人的生理和社会需求。减轻神经病理性疼痛的方法可以改善那些由外伤或疾病引起的神经病理性疼痛的患者的生活质量。
发明概述
本发明通过提供治疗由SIP30调控的神经病理性疼痛的化合物、组合物、方法和系统满足了前述需求。申请人出人意料地发现，SIP30拮抗剂能有效治疗神经病理性疼痛。本发明还提供了一种筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：提供包含至少部分SIP30多肽的样品；将待测化合物加入到所述样品的至少第一部分中；将来自于样品至少第一部分的至少一个参数与来自于样品至少第二部分的至少一个参数进行比较，其中样品的至少第二部分不包括待测化合物。本申请还包括测定一种物质与SIP30样分子蛋白相互作用的能力，包括以下步骤：a)提供一种SIP30样分子多肽，该多肽包括选自从序列SEQ ID B1到序列SEQ ID B130中的任何一种序列的连续氨基酸序列；和b)测定所述物质与SIP30样分子相互作用的能力。
附图说明
图1描述了接受慢性压迫性损伤(chronic constriction injury，CCI)手术的大鼠热痛觉过敏和机械性痛觉异常的迅速发生，显示慢性压迫性坐骨神经损伤后机械性痛觉异常(A)和热痛觉过敏(B)发展的时间进程(和非CCI手术损伤脚爪相比p＜0.05)。
图2描述了哺乳动物SIP30直系同源基因氨基酸的序列对比显示高度序列同源性，暗示它们具有相似的功能。对公共数据库中的所有哺乳动物SIP30的氨基酸序列进行了比对，序列比对的间隙显示为空白区。与人类SIP30序列相同的氨基酸残基表示为破折号(-)。下划线代表假定卷曲螺旋结构域。每个物种的普通名、拉丁名和3字母缩写如下：人-Homo sapiens-Hsa、黑猩猩-Pan troglodytes-Ptr、恒河猴-Macaca Mulatta-Mml、犬-Canis lupusfamiliaris-Cfa、猪-Sus scrofa-Ssc、牛-Bos taurus-Bta、小鼠-Mus musculus-Mmu和大鼠-RattusNorvegicus-Rno。
图3描述了SIP30在正常大鼠中的表达模式。(A)SIP30在大鼠不同组织表达的Northern印迹分析：两千碱基(kb)大小的SIP30mRNA用箭头标记，18S核糖体RNA作为上样的内对照；每个泳道RNA的组织来源在图的上部标示(横穿凝胶上部标示)。(B)SIP30在背根神经节(dorfsal root ganglion，DRG)的表达。采用抗SIP30抗体(图a)、IB4抗体(图b)和降钙素基因相关肽(CGRP)抗体(图c)进行免疫染色。两两重叠组合图像显示：SIP30和IB4重叠组合图像(图d)、SIP30和CGRP重叠组合图像(图e)以及IB4和CGRP重叠组合图像(图f)。白色箭头标记的是双染色的细胞。(C)SIP30在脊髓中的表达：采用抗SIP30抗体(图a)、抗P物质抗体(图b)和抗CGRP抗体(图c)进行免疫染色。重叠组合图像显示如下：SIP30和P物质重叠组合图像(图d)、SIP30和CGRP(图e)以及SIP30、P物质和CGRP三种组分重叠组合图像(图f)。
图4显示CCI过程上调了SIP30。(A)SIP30mRNA在脊髓的水平(图上部分)和在DRG(图下部分)的水平。实时PCR扩增结果显示了和正常组动物平均水平相比的SIP30mRNA。收集非手术组(正常组)、假CCI手术组(sham CCI，假手术组)或CCI手术组(分别是术后3天和7天组)大鼠脊髓组织，从假手术组和CCI手术组同侧和对侧分离RNA进行实时PCR分析。CCI术后3天和7天，同侧脊髓都能观察到显著性差异(和正常组或假手术组相比p＜0.05)，但在对侧没有观察到显著性差异。DRG没有观察到显著性差异。(B)脊髓中SIP30蛋白水平的Western印迹分析。收集假手术组或CCI手术组(术后3天)大鼠的脊髓组织，从假手术组或CCI手术组同侧和对侧分离蛋白进行Western印迹分析。图上部分代表SIP30蛋白的Western带。β-肌动蛋白作为内对照。图下部分是SIP30蛋白的定量结果，脊髓同侧有显著性差异(和假手术组相比p＜0.05)。(C)DRG中SIP30蛋白水平的Western印迹分析。收集假手术组或CCI手术组大鼠的DRG组织(术后3天)，从假手术组或CCI手术组大鼠的同侧和对侧分离蛋白进行Western印迹分析。图上部分代表SIP30蛋白的Western带。β-肌动蛋白作为内对照。图下部分是SIP30蛋白的定量结果。DRG的同侧和对侧都没有观察到显著性差异。(D)CCI术后同侧脊髓背角SIP30蛋白水平增加。图(a)：免疫荧光分析显示正常大鼠(naive rats)中SIP30-IR细胞的本底表达；图(b)和图(b′)：免疫荧光分析显示CCI同侧脊髓背角SIP30-IR细胞增加(b，5×；b′10×)；图(c)：SIP30在背角表层(I-II层)和深部(IV-V层)的表达水平定量(用30μm切片中SIP30-IR细胞的数目表示)(与对照组相比，p＜0.05，n＝5；ANOVA)。(E)SIP30在CCI脊髓的定位。图(a)：CCI手术3天后，SIP30(红色)和NeuN(一种神经元标记物，绿色)在脊髓背角共定位(20×)。图(b)：图(a)框内部分的放大图像的叠加图像(左图)和未叠加的图像(右上图和右下图)(40×)。图(c)：双免疫荧光染色显示，CCI术后3天，SIP30(红色)与GFAP(绿色)在背角没有共染色区域。图(d)：双免疫荧光染色显示，CCI术后3天，SIP30(红色)与(OX-42)(绿色)在背角没有共染色区域。SIP30与GFAP或OX-42的染色没有重叠。
图5显示SIP30参与了外周神经损伤诱导的神经病理性疼痛的发展和维持的调节。(A)鞘内注射SIP30反义寡核苷酸(AS ODN)4天(从第0天到CCI术后第3天)，CCI同侧脚爪(″Ipsi.f″)因CCI发生的机械性痛觉异常(图a)和热痛觉过敏(图b)得以减少(和NS或MM组相比p＜0.05)，而NS和MM ODN没有效果。同样处理后(图c，d)，对侧脚爪(″Cont.″)没有任何变化。(B)鞘内注射第二种SIP30AS ODN(SIP30ASII，靶向SIP30基因编码区第143-162位核苷酸)4天后(从第0天到CCI术后第3天)，机械性痛觉异常(图a)和热痛觉过敏(图b)在CCI同侧脚爪减轻(和RD组相比p＜0.05，p＜0.01)，而随机寡核苷酸(RD ODN)没有效果。同样处理后(图c，d)，对侧脚爪没有变化。(C)产生机械性痛觉异常和热痛觉过敏后，鞘内注射SIP30AS ODN 4天(从CCI术后第3天到第7天)能显著抑制CCI同侧脚爪的机械性痛觉异常和热痛觉过敏(和NS组或MM组相比，p＜0.05)，而NS组和MMODN组则没有效果。同样处理后(图c，d)，对侧脚爪没有变化。(D)在正常大鼠(naive rats)鞘内注射SIP30AS ODN 4天对于双侧脚爪对Von Frey刺激(图a)或热刺激(图b)的基础反应都没有影响。
图6显示用抗-SIP30的反义寡核苷酸敲降SIP30和SNAP25水平。(A)CCI术后SIP30mRNA增加，这种增加可以被反义寡核苷酸(ODN)削弱。鞘内注射SIP30反义寡核苷酸(AS)或错义(MM)ODN 4次后，最后一次注射6小时后，处死大鼠切下腰髓。实时PCR扩增显示，接受SIP30AS ODN的CCI大鼠和接受MM ODN的CCI大鼠相比同侧脊髓SIP30mRNA显著降低(p＜0.05)。虚线显示假CCI手术组大鼠的mRNA水平。(B)Western印迹显示，接受SIP30AS ODN的CCI大鼠和接受MM ODN或NS的CCI大鼠相比，同侧脊髓SIP30蛋白显著降低。图上部分表示SIP30蛋白的Western带。β-肌动蛋白作为内对照。图下部分是SIP30蛋白定量结果。虚线显示假手术组的蛋白水平。(AS组，感觉这里应该说*是指AS组与NS或MM组相比差异显著)和NS组或MM组相比有显著性差异(p＜0.05)。缩略语：NS，生理盐水；AS ODN，反义寡核苷酸；MM，错义；0-3天，大鼠从第0天(CCI术前6小时)到CCI术后第3天鞘内注射AS、MM或NS；4-7天，大鼠从CCI术后第4天开始到CCI术后第7天鞘内注射AS、MM或NS。(C)实时PCR扩增显示SNAP25mRNA在CCI术后同侧脊髓显著升高(和假手术组相比p＜0.05)。鞘内注射SIP30AS ODN(每24小时一次×4次)导致CCI大鼠同侧脊髓SNAP25mRNA有降低的趋势(虽然没有达到统计学显著性差异)。(D)实时PCR扩增显示CCI术后同侧脊髓PSD95mRNA显著升高(和假手术组相比p＜0.05)。鞘内注射SIP30AS ODN(每24小时一次×4次)对PSD95mRNA水平没有影响。
图7显示，和对照组小鼠相比，在试验的第4、6和8天，A组和B组SIP30小鼠脚爪回缩阈值和对照组相比显著改变(*表示和对照组相比有显著性差异，p＜0.05，).
具体实施方式
为了有助于理解本发明，提供了以下非限制性的定义：
术语″痛觉异常″是指对通常的非痛觉刺激的疼痛反应，可以是静态的，也可以是机械性的。″痛觉异常″的病理生理学被认为不同于提及的疼痛，但可能发生在刺激区域之外。
术语“基因”是指包含生产多肽或其前体所必需的包括控制序列及编码序列的DNA序列。所述多肽可以由完整长度的编码序列(可以是基因组DNA或cDNA)编码或由能保留预期活性的编码序列的任何部分编码。在某些方面，术语“基因”还指能编码所述多肽或其前体的mRNA序列或其一部分。
术语“转染”是指细胞对外源DNA的摄取。当外源(异体)DNA被引入细胞膜内时细胞被“转染”。转染可以是瞬时的(即引入的DNA停留在染色体之外并在细胞分裂时被稀释)或稳定的(即引入的DNA整合到细胞基因组中或维持为稳定的染色体外单元)。
术语“共转染”指两个或更多的载体同时或顺序进入某一个细胞。
术语“启动子元件”或“启动子”是指能与细胞中的RNA聚合酶结合(例如，直接结合或通过其他启动子结合蛋白或启动子结合物质结合)并启动编码序列转录的DNA调控区。通常，启动子序列的3’末端由转录起始位点界定，然后向上游延伸(5’方向)以包括在任何水平启动转录必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中可能会发现转录起始位点(例如，可用核酶S1图谱来方便确定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合区(一致序列)。启动子可以可操作地与其他表达调控序列(包括增强子或抑制子)结合。
术语“可操作地结合”，“以可操作的顺序”或“可操作地连接”是指该核酸序列的连接方式使得能指导某一特定基因转录和/或某一目标蛋白合成的核酸分子能够产生。该术语还指氨基酸序列以能产生功能蛋白的方式连接。
术语“载体”是指能将基因序列转移到靶细胞中的核酸组装体(如病毒载体、非病毒载体、微粒载体和脂质体)。术语“表达载体”是指含有能指导目的序列或基因在细胞中表达的启动子的核酸组装体。载体通常含有编码选择标记物的核酸序列，以选择那些被载体转染的细胞。通常，“载体构建”、“表达载体”和“基因转移载体”是指任何能指导目的基因表达并能将基因序列转移到靶细胞的核酸构建体。因此，该术语除了包括病毒载体还包括克隆和表达载体。
术语“抗体”是指完整的抗体(包括多克隆抗体和单克隆抗体)或其片段(例如，F(ab)2、Fab、FV、VH或VK片段、单链抗体、多亚基单特异性抗体或其片段、双特异性/多异性抗体或其片段。该术语还包括人源化抗体和嵌和抗体。
术语“SIP30”是指编码一个与266个氨基酸的与SNAP25蛋白质相互作用的30kDa的蛋白质的核酸序列。SIP30在神经组织中表达非常丰富，在睾丸和肾也有少量表达。术语“SIP30相关”是指从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130所列的任何核酸序列。
术语“SIP30拮抗剂”是指任何单独或联合作用能阻止、抑制、减少或中和SIP30的表达或其活性，直接或间接调控诱导神经病理性疼痛的中间体神经垂体素II(“NPII”)活性的物质、化合物和组合物，合成的或天然的，包括但不限于反义核酸序列、siRNA、抗体和小分子实体。
术语“SNAREs”是指一种类型的NPII，它是可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白受体，对于神经传递中突触小泡的胞吐作用的调控起着关键作用，包括但不限于25kDa的突触相关蛋白(SNAP25)、突触融合蛋白、突触小泡-相关膜蛋白(VAMP)。
术语“治疗”疾病或疾病的“治疗”是指实施一种方案，该方案可以包括给人类或其他患者使用一种或多种药物，以期减弱该疾病的症状或体征。减弱可以发生在疾病的症状或体征出现之后也可以发生在疾病的症状或体征出现之前。因此，“治疗”疾病或疾病的“治疗”包括“预防”疾病或疾病的“预防”，“治疗”疾病或疾病的“治疗”不需要完全消除症状或体征，不需要治愈，并且特别地包括对患者只有微小效果的方案。
术语“患者”是指可以对其进行治疗的生物系统。该生物系统可能包括例如单个细胞、一组细胞(如细胞培养物)、器官、组织或多细胞生命体。患者可以指人类患者或非人类患者。
术语“痛觉过敏”是指对疼痛敏感性增加，可能是由于伤害性感受器或外周神经的损伤引起。
本发明旨在提供治疗由SIP30调控的神经病理性疼痛的化合物、组合物、方法和系统。申请人出人意料地发现SIP30拮抗剂可以有效治疗神经病理性疼痛。申请人发现SIP30拮抗剂，包括但不限于核苷酸、小干扰RNA(siRNA)分子、与至少部分SIP30核酸序列反应的天然的或人工合成的化合物，能直接或间接通过调节NPII活性有效抑制SIP30表达从而提供了一种治疗SIP30引起的疼痛的方法。
本发明另一方面，提供能改变SIP30依赖性中间体蛋白的构象从而拮抗SIP30表达的小分子。在本发明的另一个实施方式中，拮抗剂的效果可以通过具有特异性底物结合位点(该位点与一个或多个靶核酸区域或靶RNA的一部分互补(即可形成碱基对))的siRNA来实现。优选地，这种互补是100％，然而如果需要，这种互补可以更低，诸如可以是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
因此，本发明的一个方面提供了DNA片段、多肽、化合物及其组合物在患病区拮抗SIP30表达和/或活性的用途。本发明的另一方面在于提供能拮抗NPII活性的人工合成的或天然的化合物。而本发明的另外一个方面旨在提供将适合的分子递送到引发神经病理性疼痛的目标区域的植入储库。
本发明的至少一个方面旨在提供与至少部分诱导神经病理性疼痛的核酸序列反应的、能抑制NPII或任何诱导相关的疼痛的细胞因子在细胞中表达的核酸分子。
本发明的另一方面在于使得本领域的普通技术人员应用设计的分子实体、组合物和/或其他能通过抑制、中和或减少SIP30在神经病理性疼痛发作中的级联作用从而减弱神经病理性疼痛的治疗方式。
本发明的另一方面，发明人提出了治疗神经病理性疼痛的治疗方法，所述神经病理性疼痛包括脊髓介导的疼痛、外周神经损伤相关的疼痛、椎间盘脱出相关疼痛、腕管综合征(Carpeltunnel syndrome)、多发性硬化症、纤维肌痛、带状疱疹、HIV-相关神经病理性疼痛、疼痛性创伤性单神经病变、疼痛性多神经病变(尤其是糖尿病引起的)、中枢疼痛综合征(可能由神经系统的任何水平的病灶引起)、术后疼痛综合征(如乳腺切除术后综合征、开胸手术后综合症和幻觉痛)，以及复杂的区域性疼痛综合征(反射性交感神经萎缩症和灼性神经痛)。
本发明的另一方面是提供一种表达载体，该表达载体包含至少一个编码与至少部分SIP30核酸序列反应的、能抑制疼痛介质在细胞中表达的siRNA分子的DNA序列，该DNA序列可操作地连接到能指导所述siRNA分子在宿主细胞中表达的遗传控制元件。
本发明的另一方面是提供一种治疗患有神经病理性疼痛的机体的方法，该方法包括给所述机体施用选自以下一组化合物中的至少一种化合物：与SIP30核酸序列和/或SIP30蛋白的至少一部分反应并能拮抗其活性的反义序列、siRNA分子、多肽和小分子。
本发明的另一方面旨在提供一种治疗患有神经病理性疼痛的患者的系统，该系统包括至少一种反义或siRNA分子、多肽或小分子，可以单独使用或联合使用，或进一步与其他神经病理性疼痛治疗方法或形式合用，以及最终将所述化合物导入患者靶组织的工具。
本发明的另一方面提供了候选化合物，包括与SIP30核酸序列的至少一部分反应并能通过注射、泵或储库导入靶组织的反义序列、siRNA分子。
本发明的在应用时，可以在机体靶位点或其附近植入储库植入物。这些位点的非限制性的例子包括发炎的神经、大脑或脊髓中受压迫的神经位点或其周围的软组织。
在本发明的另一实施方式中，在患病位置放置了siRNA储库植入物。在本发明的其它实施方式中，可在患者的肩部、髋部、其它关节或脊柱中放置药物储库植入物。
在一种实施方式中，为了方便起见，采用导管作为一种或多种SIP30拮抗剂分子的靶向给药系统。在另一种实施方式中，采用注射针管作为靶向给药系统。
本发明的一个方法中，靶向给药系统包括：药物储库植入系统通过在靶位点或其附近插入导管局部给药，所述导管具有一个近端和一个远端，所述的远端具有用于SIP30拮抗剂原位递送给药的开口，所述近端通过液体连接到药物给药泵。例如，所述导管的近端可以在靶位点10厘米范围内用于分子给药，尤其是可以在靶位点5厘米范围内给药。
本发明的药物储库植入物的一种实施方式中，SIP30拮抗剂可抑制由TNF-α、IL-1、IL-6和其他诱导疼痛的细胞因子介导的其他疼痛介质。
在本发明的一种实施方式中，适合的化合物还进一步包括改变释放途径的药物组合物。该系统可以进一步包括两种或更多的分子组合。在另一种实施方式中，采用导管而不是储库。在这种实施方式中，所述导管具有一个近端和一个远端，所述的远端具有用于SIP30拮抗剂原位给药的开口，所述近端通过液体连接到药物给药泵。
为了更好理解本发明的原理，在最优选的实施方式中使用了参考文献和特定的语言进行描述。然而不能因此理解为意欲限制本发明的范围，这些变化和本发明进一步的改进，以及本发明所描述的原理的其它应用，对于本发明相关技术领域普通技术人员来讲都当理解为正常的。
本发明特别指向了治疗疼痛的组合物和方法，这是源于发明人发现抑制SIP30能减轻神经病理性疼痛。在某些优选的实施方式中，SIP30拮抗剂或相关分子可对在中央或局部引发神经病理性疼痛的神经直接给药，或其附近的组织位点给药。
基于本发明，本领域的技术人员可以推导出，能抑制SIP30的分子可以造成神经病理性疼痛痛觉的减弱。因此，本发明的疼痛治疗适用于神经病理性疼痛，包括脊髓介导的疼痛、压迫性损伤、外周神经损伤相关的疼痛、椎间盘脱出相关疼痛、腕管综合征(Carpel tunnelsyndrome)、多发性硬化症、纤维肌痛、带状疱疹、HIV-相关神经病理性疼痛、疼痛性创伤性单神经病变、疼痛性多神经病变(尤其是糖尿病引起的)、中枢疼痛综合征(可能由神经系统的任何水平的病灶引起)、术后疼痛综合征(如乳腺切除术后综合征、开胸手术后综合症和幻觉痛)，以及复杂的区域性疼痛综合征(反射性交感神经萎缩症和灼性神经痛)。在某些实施方式中，拮抗SIP30或其相关分子的物质可以直接向神经或在神经附近的组织处给药。
本发明通过以下非限制性的实施例进行更充分描述。所引用的所有参考文献在此以其全文并入本文作为参考。以下实施例中的数据显示，SIP30是神经病理性疼痛发展和维持的分子组分，用反义寡核苷酸拮抗SIP30可缓解神经病理性疼痛慢性压迫性损伤(CCI)大鼠模型的疼痛。发明人还表明，哺乳动物SIP30序列是高度相关的。因此，本发明提供了通过拮抗SIP30治疗任何种类的哺乳动物神经病理性疼痛的组合物和方法。基于本发明，本领域的技术人员可以很容易地推导出，任何已知的拮抗方法(包括用诸如寡核苷酸拮抗SIP30mRNA的产生、或用化合物和/或抗体拮抗SIP30蛋白)都能产生本发明公开的缓解疼痛的效果。
另外，本领域技术人员可以很容易地推导出可以通过拮抗与SIP30相关的分子来缓解神经病理性疼痛；这样的分子可以是突触小泡相关蛋白，和/或通常称作SNAREs的分子(Ungar和Hughson，2003；Brunger，2005)。
本发明提供了一种能减轻疼痛的有利策略，所述疼痛是任何与能诱导或表达SIP30蛋白任何部分的医学状态相关或由能诱导或表达SIP30蛋白任何部分的过程引起的疼痛。SIP30在某些哺乳动物组织中很丰富。在大脑中，SIP30在上丘脑和下丘脑高度表达，上丘脑和下丘脑包含着重要的听觉和视觉系统的中继核。GST沉降试验和免疫沉淀实验表明，SIP30与SNAP25直接结合。虽然在GST-pull-down实验中SIP30不直接与突触融合蛋白直接发生相互作用，突触融合蛋白确实与SIP30发生免疫共沉淀，这表明突触融合蛋白可能是通过SNAP25间接与SIP30相关联。
本发明的发明人通过实施例公开了减轻与外周神经损伤相关的神经病理性疼痛的化合物和方法。
在本发明的至少一个方面，SIP30拮抗剂局部给药能防止、降低或至少减少了系统给药的主要副作用。在至少一个实施方式中，使用低剂量的SIP30拮抗剂分子局部给药可获得目标靶位点SIP30拮抗剂的高浓度，减轻了系统副作用的风险。
另外，本发明的另一方面还包括通过将SIP30拮抗剂单独或与其他适合的药物一起结合到可局部或中枢释放该药物的生物可降解储库植入物，以实现药物缓释以长期缓解神经病理性疼痛，所述的其他适合的药物选自抗惊厥剂、抗炎药、靶向不同离子通道的化合物、阿片类物质、钠通道阻断剂、抗抑郁药或麻醉剂，更具体地说，包括但不限于美西律、利多卡因、反胺苯环醇、吗啡、阿芬他尼、克他命、甲基强的松、腺苷、甘氨酸拮抗剂、地昔帕明、文拉法辛和加巴喷丁。
另一方面，本发明采用能与SNAREs的至少部分SIP30细胞因子核酸序列对应的反义分子或siRNA分子，提供了抑制NPII或抑制诱导神经病理性疼痛的细胞因子在细胞中表达试剂、方法和系统。申请人发现靶向NPII和相关细胞因子mRNA的SIP30拮抗剂能有效抑制诱导神经病理性疼痛的细胞因子的表达，从而提供了在机体中治疗疼痛的改进的方法。一方面，本发明的方法可以采用分子生物学常规技术来实现。公开了一般分子生物学方法的基础教科书包括《分子克隆实验手册》(2001年第3版)(Sambrook等)、《现代分子生物学技术》(1994)(Ausubel等)。与本发明相关的更专业的教科书包括《RNA干扰导致基因沉默，技术与应用》(2004)(Sohail)。
本发明的一个大方面涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码与SNAP25相互作用蛋白编码区第11-31位核苷酸互补的核酸序列(GenBank登录号为BC063144)。具体而言，所述分离的核酸分子编码的蛋白质能中和与相关神经病理性疼痛现象相关的SIP30的上调。另外，本发明还旨在提供包含这些核酸分子的载体，以及含有所述载体的宿主细胞。另一方面，具体而言，本发明涉及所述蛋白质本身。
本发明第二个大方面涉及SIP30蛋白和SNAREs(包括大鼠SNAP和如图2所示的所有哺乳动物SIP30的同源的或同源类似物的序列)的特异性抗体。在本发明的一个具体方面，所述的抗体是多克隆抗体。在本发明另一个具体方面，所述的抗体是单克隆抗体。
本发明的第三大方面涉及在产生特异性神经病理性疼痛的组织(例如，脊髓同侧)局部降低SIP30上调或中枢性降低SIP30上调的方法。在一个具体方面，分离的核酸分子在载体内，该载体可以是质粒或病毒(如腺病毒或逆转录病毒)。转染可以发生在体外或通过直接注射分离的核酸分子发生在体内。在一个替代的途径中，SIP30拮抗剂的直接给药也是可能的。
在本发明另一个大方面，发明人发现了一种测定适合的SIP30拮抗剂与SIP30样分子蛋白(包括SNAREs)相互作用能力的方法，该方法包括：a)提供一种SIP30样分子多肽，该多肽包括选自从序列SEQ ID B1到序列SEQ ID B130的任何一种序列的连续的氨基酸序列；和b)测定所述物质与SIP30样分子相互作用的能力。在本发明更具体的一个实施方式中，测定所述物质与SIP30样分子相互作用能力的步骤包括测定所述物质与SIP30样分子的相互作用亲和性。
在另一种实施方式中，发明人公开了一种测定一种物质与SIP30样分子相互作用能力的方法，该方法包括：a)提供一种重组SIP30样分子多肽，该多肽由包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少35个连续的核苷酸序列编码；b)使所述物质与所述重组SIP30样分子多肽接触；和c)测定所述物质与所述重组SIP30样分子结合的能力。在本发明更具体的一个实施方式中，所述核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少45个连续的核苷酸。在本发明另一个更具体的实施方式中，所述核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少50个、75个或100个连续的核苷酸。
本发明的一个方面旨在提供测定适合的SIP30拮抗剂与SNAREs和SIP30样分子多肽相互作用能力的方法，该方法包括测定：a)所述重组SIP30样分子多肽与所述物质相互作用的能力；b)所述物质激活细胞膜离子通道的能力；或c)调节b)部分细胞膜离子通道的能力，具体而言，其中所述重组SIP30样分子多肽是嵌合体。
本发明的另一方面旨在提供测定一种物质与SIP30样分子结合能力的方法，该方法包括：a)在细胞中表达由包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少25个连续碱基的核酸序列编码的重组SIP30多肽；b)使所述物质与所述重组SIP30样分子多肽接触；和c)测定所述物质与所述重组SIP30样分子结合的能力。在本发明这一方面，所述核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少45个连续的核苷酸。在本发明另一个更具体的实施方式中，所述核酸序列包括选自从SEQ ID A1到SEQ ID A130的任一序列的至少40个、45个、50个、75个或100个连续的核苷酸。
本发明一个优选的实施方式提供了与大鼠SIP30编码区的11031核苷酸互补的反义寡脱氧核苷酸。本发明另一方面旨在提供能与至少部分SIP30核酸序列相匹配的siRNA分子、编码SNAREs的mRNA(包括能抑制细胞中所述造成神经病理现象的蛋白或细胞因子表达的SNAP25)。
本发明的siRNA通常都是短的(19-29个核苷酸)、双链RNA分子，能使互补靶mRNA产生序列特异性降解(即RNA干扰，RNAi)(Bass，Nature 411：428(2001))。因此，在某些实施方式中，siRNA分子包含一个双链结构，该双链结构包含一个正义链和一个反义链，其中所述的反义链包含一段核苷酸序列，该核酸序列与多肽、蛋白质或细胞因子至少部分核苷酸序列互补；正义链包括一段核苷酸序列，所述核苷酸序列与所述反义链的核酸序列的至少一部分互补；其中每条正义链和反义链都包含大约19-29个核苷酸。
靶向NPII或疼痛-诱导细胞因子或蛋白的siRNA分子可以基于本领域众所周知的准则进行设计(如Elbashir等，EMBO J.20：6877(2001))。例如，靶mRNA的靶标部分优选以AA(最优选)、TA、GA或CA开始；siRNA分子的GC比优选为45-55％；siRNA分子在一行中优选不含有3个连续相同的核苷酸；siRNA分子在一行中优选不含有7个混杂的G/C；siRNA分子优选在每个3’末端都含有二核苷酸突出(优选TT)；靶标部分优选位于靶mRNA的ORF(开放性阅读框)区，位于起始密码子ATG之后至少75个碱基对，且在终止密码子之前至少75个碱基对；靶标部分优选不含有16-17个连续的与其他编码序列同源的碱基对。基于以上部分或全部准则可以确定优选的疼痛-诱导细胞因子siRNA靶序列。
因此，本发明另一方面提供一种抑制SIP30疼痛-诱导蛋白或细胞因子或其他介质在细胞中表达的方法，该方法包括在细胞中引入至少一个能与疼痛-诱导核酸序列的至少一部分反应的反义分子或siRNA分子。虽然任何细胞都可以作为靶标，但是，引入所述分子的细胞优选是SIP30有上调风险的中枢神经系统区域，更优选为脊髓，或者有疼痛诱导蛋白或细胞因子存在的局部区域。在更优选的实施方式中，所述区域来自遭遇损伤的机体，优选人类患者。
本发明的化合物和分子可以采用本领域众所周知的技术在体外或体内引入细胞内，包括电击、钙磷共沉积、微注射、脂质体转染、多转染和与细胞穿透肽(CPP)偶联。
可替代地，这些靶向诱导疼痛的细胞因子的分子可以在体内通过编码正义序列和反义序列的表达载体内源产生而引入细胞内。
遗传控制元件包括转录启动子，还可以包括转录增强子以增加mRNA表达水平，编码适合的核糖体结合位点的序列，以及终止转录的序列。适合的真核启动子包括组成型RNA聚合酶II启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子区域、包含Rous肉瘤病毒(RSV)3′长末端重复序列的启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子和鸡β-肌动蛋白启动子)，组织特异性RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶III启动子(如U6、HI、7SK和7SL启动子)。
在一些实施方式中，正义链和反义链可以由不同的表达载体编码(即共转染的载体)。在另一些实施方式中，siRNA分子的正义链和反义链由相同的表达载体编码。采用收敛转录或背离式转录(convergent or divergent transcription)，正义链和反义链可以独立地由单一的表达载体表达。
可替代地，正义链和反义链可以由一个单独的表达载体以单个发卡RNA分子的形式共同表达，既可以表达成短发卡RNA(shRNA)分子形式(如Arts等，Genome Res.13：2325(2003))，也可以表达成长发卡RNA分子形式(如Paddison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443(2002))。
诱导神经病理性疼痛的中间体、细胞因子多肽(或其片段)可以采用众所周知的多种免疫方法检测和定量，诸如酶联免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、免疫沉淀法、免疫荧光法和Western印迹。免疫方法中所用的抗前炎性细胞因子抗体(优选抗人前炎性细胞因子抗体)可以从商业渠道获得，如EMD Biosciences(San Diego，CA)，Upstate(Charlottes-ville，VA)，Abcam(Cambridge，MA)，Affinity Bioreagents(Golden，CO)and Novus Biologicals(Littleton，CO)，或可以由本领域熟练技术人员按众所周知的技术制得。
本发明的另一方面，提供了一种筛选方法，该方法包括以下步骤：提供一种含有至少部分SIP30和/或SIP30蛋白的样品；向所述样品中的至少第一部分中加入待测化合物；将来自于至少样品第一部分的参数与来自于至少样品第二部分的一个参数进行比较，其中至少样品的第二部分不包括待测化合物。
来自于至少样品第一部分的至少一个参数和来自于至少样品第二部分的至少一个参数的差别的大小是待测化合物的指标，尤其是它改变SIP30表达和活性的能力，或上调SIP30的能力。
本发明的另一方面提供了试剂盒，包括至少部分SIP30和/或至少部分SIP30蛋白和至少一定量的对照化合物。
本发明的另一方面提供了一种评估机体在术后发生神经病理性疼痛的风险的方法，包括测定SIP30基因产物在机体样品中的量；然后将测定量和对照样品中SIP30基因产物的标准量进行比较，如果发现测定量在SIP30基因产物的标准范围之外即为诊断术后神经病理性疼痛风险的阳性指征。
反义或siRNA分子单独使用或与其他解痉剂、抗炎药、麻醉剂联合使用来抑制诱导神经病理性疼痛细胞因子的表达可作为在机体治疗炎症反应的用途或方法。因此，本发明另一方面提供了一种治疗神经病理性疼痛患者的方法，包括给所述患者引入至少有效量的能与至少部分SIP30核酸序列反应的SIP30拮抗剂。所述治疗炎症的方法可以采用将所述分子向目标组织靶向给药的系统实现。因此，本发明的另一方面提供了将有效量的所述药剂引入患者的组织的方法。在优选地实施方式中，所述的患者是人类。
关于组织的基因递送给药，存在着大量的众所周知的方法，诸如，以导管、注射针管或储库植入物为例。优选的给药系统包括储库植入物。本发明的储库植入物包括有助于在患者的靶位置植入和保留的物理结构。药物储库植入物可以包括微球，微球还可以进一步包括分离的核酸、能给机体靶向提供浓度梯度的药物的siRNA分子。在本发明的另一个实施方式中，微球是注射到靶组织的。
本发明的另一方面，本领域的普通技术人员可以理解，速释制剂或缓释制剂形式存在的产品的不同组合都适合本发明。例如，实施者可以将至少一种SIP30拮抗剂和载有至少一种解痉剂、抗抑郁剂、抗炎剂、阿片类物质或麻醉剂的凝胶和微球一起制成制剂，其中凝胶和微球的组合被置于靶标区域。本发明实施时，可以局部给药或持续给药。
本发明的试剂、方法和系统也都可以用于机体的多种器官。
根据本发明的方法，具体实施方式将用以下的实施例进行描述。虽然本发明采用了具体的实施方式进行描述，这些实施方式应该理解为仅仅是为了形象描述本发明的原理和应用。因此应当理解，这些描述性的实施方式可以进行大量的变化，而其他的安排涉及也不会背离由以下权利要求所定义的本发明的精神和范围。
实施例
实施例1：拮抗SIP30以抑制周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛的发展和持续
材料和方法
实验动物：成年雄性Sprague-Dawley大鼠，200-280克，每笼2只，自由饮食，12∶12小时明暗周期，室温恒定。
鞘内植管。戊巴比妥钠(40mg/kg，腹腔注射)麻醉下，鞘内导管(PE-10导管)通过L4和L5腰椎之间的间隙插入，深入到腰椎膨大的硬膜外腔(L4和L5部分)。导管用无菌生理盐水充满(大约4μl)，外末端塞住。插了导管的大鼠恢复4天，单独饲养。任何表现因手术过程而发生神经性缺陷的大鼠都被剔除出本实验。
坐骨神经的慢性压迫性损伤模型(CCI)。大鼠用戊巴比妥钠((45mg/kg，腹腔注射)深度麻醉，右侧坐骨神经用钝解剖钳暴露在大腿中部。CCI手术组：根据Bennett和Xie(1988)的描述，坐骨神经在其三叉分支的近端用4道铬制肠线(4-0)松弛结扎，彼此相距大约1毫米；假手术组：坐骨神经暴露但不结扎。CCI或假手术后，用4-0丝线分别分层缝合肌肉和皮肤，用抗生素粉抗感染。
反义寡核苷酸(ODN)的制备和给药。反义序列(AS，5′-TTT CTC CGC GTC CGC CAT GGT-3′)SEQ.ID No.B131，与大鼠SNAP25相互作用蛋白30(SIP30，GenBank登录号BC063144)编码区的11-31位核苷酸互补，以及其相应的错配序列SEQ.ID.No.B132(MM，5′-TTT CCTCGC GTC CCG CAT GGT-3′)都为Integrated DNA Technologies公司(Coralville，IA，USA)合成和纯化。
所有的ODN都是采用BLAST算法在GenBank数据库中筛查以排除反义ODN的非特异性结合，并表明错义ODN不与登记的核苷酸序列匹配。ODN在给药前重溶于0.9％的生理盐水(NS)中。大鼠分别鞘内注射NS(10μl)，AS(50μg/10μl)和MM(50μg/10μl)，然后用5μl生理盐水冲洗，每24小时冲洗一次，共冲洗4天(给药方案I：从第0天(CCI术前6小时)到CCI术后第3天；给药方案II：从CCI术后第4天到第7天)。
RNA提取和实时PCR分析。在CCI或假手术术后第3天或第7天处死大鼠。为了评价神经病理性疼痛的发展情况和反义治疗的效果，处死前，按如2.6所述的方法检测大鼠的机械性痛觉异常和热痛觉过敏。来自正常组大鼠、假手术组大鼠和CCI组大鼠的脊髓用AS、MM或NS处理，然后切成两部分，即CCI同侧和CCI对侧。对同样处理的大鼠的DRG(L4-L6)进行解剖。收集两组大鼠同侧和对侧DRG单个样品。
切开后，所有组织迅速在干冰中冷冻并储存于-80℃直到进一步处理。冷冻的脊髓直接用1ml TRIZOL试剂(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)均质化。根据厂家的操作规程略有修改进行总RNA的提取。简单地说，氯仿提取之后，RNA用异丙醇沉淀，沉淀用70％乙醇冲洗两次。在空气中干燥，而后RNA用超纯水重悬。总RNA的质量和数量用电泳法以及A260测定(Agilent 2001 Bioanalyzer，Palo Alto，CA)检测。提取的RNA用DNase I(不含DNA，Ambion)处理以去除基因组DNA。cDNA用随机十聚体引物采用Ambion RETROscript反转录试剂盒根据厂家的操作说明合成。用不含RNA的阴性对照反应来检测试剂是否污染。
实时PCR。在Cepheid Smart Cycler上进行实时PCR分析。循环阈值(Ct)采用Smart CyclerData Analysis Software 2.0(Cepheid)进行计算。PCR反应采用LightCycler DNA Master SYBRGreen I kit在20μl的终体积中进行，包括：12.6μl PCR级水，2.4μl MgCl2(25mM)，2μl 10xLightCycler DNA Master SYBR Green I[Taq DNA聚合酶，反应缓冲液dNTP混合物(用dUTP代替dTTP)，SYBR Green I染料，和10mM MgCl2]，2μl cDNA模板，0.5μl正向和反向引物(100ng/μl)。
扩增方案包括95℃，150秒激活Taq DNA聚合酶；然后40个循环(95℃，10秒变性；58℃，15秒退火和72℃，20秒延伸)。在所有情况下，首先可以观察到样品cDNA的量和Ct的线性关系。每个样品都运行3遍，Ct值取每次反应的平均值。
关于对照，运行无模板的对照，以水代替模板。RT-PCR分析的结果用Ct值表示，用来确定靶基因mRNA相对于参照基因mRNA量的量。在本研究中，采用β-肌动蛋白作为参考基因标准化表达水平。相对基因表达水平用靶基因和β-肌动蛋白基因表达量按照以下公式计算：(Livak和Schmittgen，2001；Marvizon等，2002；Beltramo等，2003)：mRNA相对表达＝2-(靶基因Ct-β-肌动蛋白Ct)。引物用Invitrogen Custom Primer Designer软件设计.
测定机械敏感性的Von Frey纤维试验。后爪回缩阈值采用von Frey纤维(Stoelting，IL，USA)校正系列确定(范围是0.6到18克)。动物各自置于底部带有网眼的电线笼中，适应30分钟。将von Frey纤维系列应用于足底表面中央区，对左后爪施加不断增加的力(0.6，0.9，1.3，2.2，4.8，6，7.2，9，13和18克)，每单次试验时间达6秒。只有大鼠静止并四爪着地时才施用von Frey纤维。只有当后爪完全从带网眼的底部离开时才认为回缩反应是真实有效的。回缩反应成立时，从下一个较低的von Frey纤维开始重复检测该后爪，直到没有反应发生。试验包括给后爪施用von Frey纤维5次/每个后爪，间隔15秒。后爪回缩阈值定义为在施用连续5次时，引起3次回缩的最小的力。一旦左后爪的阈值确定，5分钟后在右后爪重复同样的试验。
哈格里夫后爪热敏感试验(Hargreave′s test)。适应检测管之后，通过测定后爪对辐射热源回缩的潜伏期来测定热痛觉过敏。大鼠各自置于位于升起的平台上的有机玻璃笼中，平台下是通过玻璃板施用于足爪的辐射性热源(336型组合元件，IITC/life Science Instruments，Woodland Hill，CA，USA)当大鼠抬起足爪时关闭热源，测定从施用热源开始到大鼠后爪回缩的时间。
该时间被定义为后爪回缩潜伏期。在没有CCI时，维持在稳定强度的热源将产生稳定的回缩潜伏期(大约8-10秒)。在没有反应时，关闭20秒防止组织损伤。大鼠4只一组，以便在5分钟的间隔内可以对每只大鼠进行一次左后爪(对照)然后一次右后爪的刺激。这种方法再重复2次，每个脚爪测定三次取平均值。
结果
啮齿类模型中神经病理性疼痛的鉴定
为了揭示参与调整神经病理性疼痛信号途径的新的分子成分，发明人采用CCI作为啮齿类神经病理性疼痛模型(Bennett和Xie，1988；Moalem等，2004；Xie等，2005)来寻找CCI大鼠脊髓中差异表达的基因。由于发明人希望鉴定出参与神经病理性疼痛发展阶段的基因，他们首先确定了CCI模型中神经病理性疼痛发展的时间阶段。采用接受单侧CCI手术的S-D大鼠，测定出后爪热和触觉痛觉敏感性(从CCI术后2天开始)。
从图1可以看出，在CCI术后第二天，CCI后爪与对照爪(即未手术侧)，热和触觉痛觉敏感性大大提高，几乎达到了最高值。这些结果与以前的研究(Khalil等，1999)一致，即CCI术后几天之内即会发生机械性痛觉异常和热痛觉过敏。基于这些神经病理性疼痛发展时间进程的信息，发明人选择CCI术后3天作为时间点，选择来自于对照组和CCI组腰椎膨大部分提取RNA，采用如前所述的(Hou等，2004；Jin等，2005；Wang等，2005)自定义构建的cDNA文库芯片进行微阵列分析。
在此过程中鉴定出的一个cDNA克隆是SIP30，即之前被报道与SNAP25相互作用的一种分子(Lee等，2002)。SIP30在大鼠大脑的几个区域都存在(Lee等，2002)，但其分子功能还不清楚。
如图2所示，SIP30同源类似物在几种哺乳动物(包括猩猩、猴子和几种非灵长类哺乳动物)中都有存在。这些序列是高度同源的。对GenBank和其他公共序列库的广泛检索显示SIP30序列存在于灵长类和其他哺乳动物中。
SIP30和小直径神经元标记物共定位。为了评价SIP30在不同中枢神经系统和外周神经组织中的表达模式进行了Northern印迹，结果表明SIP30主要在中枢神经系统表达(图3)。这些结果能够支持之前的报道(Lee等，2002)。
之后对于SIP30在DRG的表达进行了研究。小直径DRG神经元主要是痛觉感受器，在神经化学上可以分为两个群：植物凝集素B4(IB4)-阳性的非肽能神经元和IB4-阴性的肽能神经元。IB4-阴性的神经元表达神经生长因子(NGF)的受体TrkA，依赖NGF生存，并含有神经肽(包括降钙素基因相关肽和P物质)。IB4-阳性的神经元表达神经胶质细胞系衍化神经营养因子(GDNF)、神经营养因子(neurturin)或青蒿琥酯(artemin)的受体。IB4-阳性和IB4-阴性痛觉感受器有着不同的功能(Stucky和Lewin，1999)。据假设，IB4-阴性神经元特异性地在炎症性疼痛中起作用，而IB4阳性神经元则在神经病理性疼痛中起作用(Mantyh和Hunt，1998；Snider和McMahon，1998；Breese等，2005)。
本发明研究了SIP30、IB4及CGRP在正常成年大鼠DRG(L4-L5)中的表达。SIP30在从小直径到中直径的DRG神经元中都有表达(图3)。SIP30在某些神经元中与IB4和CGRP的表达有重叠，但主要是与CGRP(图3)共同表达，这表明其肽能的本质。
本发明还对腰髓中SIP30的免疫反应活性进行了检测，发现它在所有的腰段都有表达。SIP30的免疫反应活性主要集中在脊髓背角表层(第I、II层)(图3)，并表现出很强的与相关神经肽CGRP和P物质共表达的模式(图3)。另外，SIP30免疫染色也出现在第IV-VII层细胞体和脊髓前角运动神经元中。
CCI术后SIP30在脊髓中的上调。CCI组和假手术组大鼠脊髓和DRG中SIP30mRNA的变化用定量实时PCR来检测。其它两种基因的表达水平作为参照以标准化每个样品中总RNA的量。首先采用定量实时PCR方法测定未手术组和CCI组大鼠脊髓和DRG中β-肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达。CCI大鼠β-肌动蛋白和GAPDH的表达用未手术组标准化。结果表明，在脊髓和DRG中β-肌动蛋白的表达比GAPDH更一致(数据未显示)。因此，选择β-肌动蛋白作为本研究中的参照。CCI术后第3天和第7天，和假手术组及未手术组相比，SIP30mRNA在同侧脊髓中有统计学上显著的增高(p＜0.05)，而在对侧脊髓没有观察到增高(图4)。
然而，在DRG，SIP30mRNA表达没有用因CCI手术而改变。假手术组和CCI大鼠同侧和对侧DRG没有差异(图4)。
CCI大鼠脊髓的Western印迹分析也表明了SIP30蛋白的上调。和CCI大鼠的对侧以及假手术组大鼠的双侧相比，腰髓同侧观察到了增强的SIP30信号(图4)。与CCI大鼠和假手术组大鼠SIP30mRNA在DRG的表达相似，CCI术后，DRG双侧都没有观察到增强的Western印迹信号(图4)。
CCI术后第3天和第7天，免疫染色显示脊髓同侧背角SIP30蛋白水平增高(图4)。
考察了SIP30在CCI脊髓中的定位，结果表明，CCI术后第3天，在脊髓背角，SIP30和神经元特异性核蛋白(NeuN，一种神经元标记物)共定位(图4)。SIP30和GFAP或OX-42染色时都没有重叠(图4)。
这些结果显示，在CCI过程中，SIP30水平在脊髓的同侧上调了，显示SIP30水平和神经病理性疼痛的潜在相关性。
SIP30参与神经病理性疼痛的发展和维持。从第0天开始(CCI术前6小时)，SIP30AS(反义核酸)髓鞘内给药(50mg/10μl，每天一次×4天)，到SIP30给药的第4天，机械性痛觉异常和热痛觉敏感的发展都受到部分抑制(图5)。双向ANOVA显示反义组和NS组之间存在统计学显著性差异(p＜0.05)。AS给药停止后2天(CCI术后第5天)，AS组显示和NS组相似的机械性痛觉异常(图5)。CCI术后第7天，出现热痛觉敏感的脚爪回缩潜伏期和NS组相似(图5)。MM给药对机械性痛觉异常和热痛觉敏感的发展没有影响。对侧脚爪回缩阈值和潜伏期不受AS、MM和NS治疗的影响(图5)。
为了进一步证实SIP30特异性作用，考察了用靶向SIP30基因编码区第143-162位核苷酸的第二个SIP30AS ODN SEQ.ID.No.133(AS II：5′-GGC AAT CCT ACA GGT TCC AG-3′)“敲降”SIP30蛋白功能的结果。该AS II还能使CCI诱导的机械性痛觉异常和热痛觉敏感减弱(图5)。双向ANOVA表明反义组和一般对照组(随机ODN，5-ACG TAA GCA ACG CTCAGC TA-3′)之间存在着统计学显著性差异。
CCI术后第3天，大鼠发生机械性痛觉异常和热痛觉敏感。在该点之后神经病理性疼痛建立，用SIP30AS治疗后的第4天，在AS ODN治疗的后期CCI大鼠同侧脚爪回缩阈值和潜伏期增加，
双向ANOVA显示CCI术后第7天和第9天，在反义组和NS组或MM组之间存在着统计学显著性差异(p＜0.05，图5)。AS停药4天后，机械性痛觉异常和热痛觉敏感重新出现。MM ODN或NA都不能改变CCI大鼠对机械刺激和热刺激的脚爪回缩反应。给药期间和给药后，NS、AS和MM ODN对对侧后肢都没有影响(图5)。
SIP30AS ODN(50mg/10μl，每天一次×4天)治疗正常大鼠对于Von Frey和热刺激双侧后肢的反应都没有观察到任何影响(p＞0.05，图5)。另外，为了排除SIP30AS ODN鞘内给药可能产生非特异性运动缺陷的可能性，测定了接受SIP30AS治疗的正常大鼠的自发性运动，在SIP30AS ODN治疗期间没有观察到异常行为或运动缺陷(数据未显示)。
综上所述，这些发现显示抑制脊髓中抑制SIP30水平上调可使神经性疼痛发展阶段和维持阶段的神经性疼痛减弱，表明在SIP30上调和神经性疼痛现象之间存在着因果关系。
寡核苷酸敲降SIP30既能抑制SIP30又能抑制SNAP25在脊髓中的表达。考虑到CCI手术不能影响SIP30的mRNA或蛋白在DRG的表达，以下观察仅集中在脊髓。为了证实SIP30AS ODN髓鞘内给药是否确实能通过破坏SIP30mRNA的翻译敲降SIP30，考察了SIP30ASODN对SIP30mRNA和SIP30蛋白的影响。鞘内注射SIP30AS(50μg/10μl)和MM ODN(50μg/10μl)。最后一次注射6小时后收获脊髓的腰膨大部分。定量PCR显示，和给予SIP30MMODN相比，SIP30AS ODN能显著性降低0-3天或4-7天SIP30mRNA在同侧脊髓的表达(图6)。另外，Western印迹显示，SIP30AS在反复髓鞘内CCI术后给药3天后，能显著降低SIP30在大鼠同侧脊髓中的表达，而MM ODN却不能(图6)，进一步支持AS能介导SIP30蛋白“敲降”。
为了评价SIP30AS的选择性作用，我们还考察了在脊髓表达两个相关的突触蛋白(25kDa的突触小体相关蛋白(SNAP25)和突触后密度蛋白-95(PSD95))的作用。
如图6所示，SNAP25mRNA在CCI术后3天和7天在同侧脊髓表现出显著的上调。而与此相反，直到CCI术后7天，才检测到PSD95mRNA在脊髓的变化。无论SIP30AS或MM ODN都不能阻碍CCI术后7天PSD95mRNA在同侧脊髓的上调(图6)。
实施例2 SIP30增加疼痛敏感的作用
在异氟醚麻醉下，CD-1小鼠鞘内注射SIP30和对照药(以质粒DNA的形式)。无论是使用含有SIP30序列的质粒还是空质粒，都同时给予脂质转染试剂。对照组小鼠(n＝6)每只接受2.0μg空质粒。对于含有SIP30的质粒，A组小鼠(n＝5)每只接受2.0μg SIP30质粒DNA，B组小鼠每只(n＝5)接受5.25μg SIP30质粒DNA。之后24天内，小鼠通过Von Frey纤维接受脚爪回缩阈值试验。
图7描述了试验结果。在试验的第4天、6天和8天，和对照组相比，A组和B组小鼠在脚爪回缩阈值都有显著差异(*，p＜0.05，和对照组相比有显著差异)。测量包括每只小鼠的两侧脚爪。第24天时，脚爪回缩阈值回复到正常水平。本领域的普通技术人员可以理解，SIP30在加重神经病理性疼痛中起着直接作用。本发明的发现对于治疗方案中所需要的SIP30拮抗的时间和程度提供了充分的指导。
虽然本发明采用具体实施方式进行了描述，应当理解这些实施方式都只是为了具体描述本发明的原理和应用。因此可以理解，可以对本发明描述性的实施方式进行大量的改进和其他安排而不会偏离由权利要求定义的本发明的精神和范围。
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Claims (39)

1.一种治疗神经病理性疼痛的方法，包括给予机体有效剂量的拮抗SIP30或SIP30相关大分子的拮抗剂。
2.如权利要求1的方法，其中所述的有效的拮抗剂是小分子核酸组分。
3.如权利要求2的方法，其中所述的核酸是SIP30或SIP30相关序列中部分序列的互补序列。
4.如权利要求3的方法，其中所述的核酸的长度不短于12个碱基。
5.如权利要求2的方法，其中所述的核酸由非修饰碱基组成。
6.如权利要求2的方法，其中所述的核酸由修饰碱基组成。
7.如权利要求2的方法，其中所述的核酸由非修饰碱基和修饰碱基的混合物组成。
8.如权利要求2的方法，其中所述的核酸单独给药，或溶于药学可接受的体内给药溶液给药，和/或与其他治疗药物组合使用。
9.如权利要求8的方法，其中所述的溶液选自以下溶液中的任何一种：脂类、多糖、蛋白质、核酸，或其组合。
10.如权利要求2的方法，其中所述的核酸与常用的增强核酸体内稳定性的物质一起使用。
11.如权利要求10的方法，其中所述增强核酸体内稳定性的物质由酶抑制剂、核酸稳定剂或其组合组成。
12.如权利要求2-11的任一权利要求的方法，其中所述的核酸是控释剂型。
13.如权利要求2-11的任一权利要求的方法，其中所述的核酸是药学常用剂型，包括储库剂型、注射剂型、局部给药剂型、消化道给药剂型、喷剂、吸入剂、电子便携式剂型(electro-poratable form)、其他给药剂型，或其组合。
14.如权利要求1的方法，其中所述的拮抗剂以小分子、核酸、肽、多肽、拟肽或其组合的形式存在。
15.一种筛选能与SIP30或SIP30相关蛋白相互作用的物质的方法，包括以下步骤：
a)提供一种含有选自从序列SEQ ID B1到序列SEQ ID B130的任一序列的连续氨基酸序列的多肽；和
b)检测所述物质与所述SIP30或SIP30相关蛋白相互作用的能力。
16.如权利要求15的方法，其中检测所述物质与所述SIP30或SIP30-相关蛋白相互作用的能力的步骤还进一步包括测定所述物质与所述蛋白相互作用的亲和力。
17.如权利要求15的方法，其中检测所述物质与SIP30分子相互作用的能力的步骤还进一步包括测定所述物质激活SIP30或SIP30-相关大分子的能力。
18.筛选能够治疗神经病理性疼痛的物质的方法，包括如下步骤：
a)提供一种由包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少15个连续核苷酸的核酸序列编码的重组SIP30多肽；
b)使所述物质与所述重组SIP30多肽接触；
c)检测所述物质与所述重组SIP30多肽结合的能力。
19.如权利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少20个连续核苷酸。
20.如权利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少35个连续核苷酸。
21.如权利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少50个连续核苷酸。
22.如权利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少100个连续核苷酸。
23.如权利要求18-22任一权利要求的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ IDA1到序列SEQ ID A130的任一序列。
24.如权利要求18-22任一权利要求的方法，其中检测所述物质与所述重组SIP30多肽相互作用的能力的步骤包括测定：
a)所述重组多肽与所述物质相互作用的能力；
b)所述物质激活细胞膜中离子通道的能力；或
c)所述物质调节b)部分的细胞膜中的离子通道的能力。
25.如权利要求18-22任一权利要求的方法，其中所述的重组SIP30多肽是嵌合体。
26.一种筛选具有SIP30结合能力的物质的方法，包括如下步骤：
a)在细胞中表达由包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ ID A130的任一序列的至少25个连续核苷酸的核酸序列编码的重组SIP30多肽；
b)使所述物质与所述重组SIP30多肽接触；和
c)检测所述物质与所述重组SIP30多肽相互作用的能力。
27.如权利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少40个连续核苷酸。
28.如权利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少45个连续核苷酸。
29.如权利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少50个连续核苷酸。
30.如权利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少75个连续核苷酸。
31.如权利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的至少100个连续核苷酸。
32.如权利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括选自从序列SEQ ID A1到序列SEQ IDA130的任一序列的核苷酸序列。
33.一种筛选方法，包括：
a)提供一种含有至少部分SIP30或SIP30蛋白的样品；
b)向所述样品中加入至少部分SIP30或SIP30蛋白；向所述样品中的至少第一部分中加入待测化合物；和
c)将来自所述样品的至少第一部分的至少一个参数和来自所述样品的至少第二部分的至少一个参数进行比较，其中所述的样品的至少第二部分不包括待测化合物。
34.一种试剂盒，所述试剂盒包括：至少部分SIP30和/或SIP30蛋白，所述至少部分SIP30能与至少部分SNAP25结合；和能与所述至少部分SIP30结合的至少部分SNAP25。
35.一种用于筛选可以降低SNAP25的量的化合物的试剂盒，所述试剂盒包括：调节SIP30转录的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地与编码报告蛋白的核酸序列相连。
36.如权利要求35的试剂盒，所述试剂盒还进一步包括至少一种表达SIP30和SNAP 25的细胞。
37.如权利要求35或36的试剂盒，所述试剂盒还进一步包括将所述的核酸序列递送到表达SIP30和SNAP 25的细胞的工具。
38.如权利要求35-37任一权利要求的试剂盒，其中所述的细胞是神经元。
39.如权利要求35-38任一权利要求的试剂盒，其中所述的报告蛋白选自萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、绿色荧光蛋白、β半乳糖苷酶和氯霉素乙酰基转移酶。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175062A (zh) * 2019-07-05 2021-01-05 中国医学科学院基础医学研究所 Sft2b蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018195361A2 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 John Mansell Compositions and methods for treating pain disorders
CN110499369B (zh) * 2018-05-17 2021-03-23 华中农业大学 用于选择母鸡储精能力的snp分子标记及其应用
CN114920806B (zh) * 2022-06-07 2023-09-12 中南大学 多肽及其抗体、以及检测它们的试剂在制备鼻咽癌诊断、预后或治疗制剂中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014849A2 (en) * 2003-07-03 2005-02-17 Euro-Celtique, S.A. Genes associated with responses to neuropathic pain
US20080268063A1 (en) * 2004-11-04 2008-10-30 Sangyong Jon Coated Controlled Release Polymer Particles as Efficient Oral Delivery Vehicles for Biopharmaceuticals

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006042396A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Universite Laval Modulation of neuroglia-derived bdnf in the treatment and prevention of pain

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014849A2 (en) * 2003-07-03 2005-02-17 Euro-Celtique, S.A. Genes associated with responses to neuropathic pain
US20080268063A1 (en) * 2004-11-04 2008-10-30 Sangyong Jon Coated Controlled Release Polymer Particles as Efficient Oral Delivery Vehicles for Biopharmaceuticals

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANGDUN PENG，ET AL: "SIP30 Is Regulated by ERK in Peripheral Nerve Injury-induced Neuropathic Pain", 《J BIOL CHEM》 *
YU-QIU ZHANG ET AL: "Role of SIP30 in the development and maintenance of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain", 《PAIN》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175062A (zh) * 2019-07-05 2021-01-05 中国医学科学院基础医学研究所 Sft2b蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途
CN112175062B (zh) * 2019-07-05 2022-07-15 中国医学科学院基础医学研究所 Sft2b蛋白线性抗原表位以及其在精神分裂症诊断中的用途

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