EA034924B1 - Олигомеры и олигомерные конъюгаты - Google Patents

Олигомеры и олигомерные конъюгаты Download PDF

Info

Publication number
EA034924B1
EA034924B1 EA201692274A EA201692274A EA034924B1 EA 034924 B1 EA034924 B1 EA 034924B1 EA 201692274 A EA201692274 A EA 201692274A EA 201692274 A EA201692274 A EA 201692274A EA 034924 B1 EA034924 B1 EA 034924B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
oligomer
oligomeric
group
sequence
Prior art date
Application number
EA201692274A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201692274A1 (ru
Inventor
Хассан ЯВАНБАКХТ
Мортен Линдов
Сёрен Оттосен
Original Assignee
Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of EA201692274A1 publication Critical patent/EA201692274A1/ru
Publication of EA034924B1 publication Critical patent/EA034924B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Abstract

Изобретение относится к олигомерному конъюгату для применения при лечении вирусного заболевания. Олигомерный конъюгат содержит a) олигомер, способный модулировать последовательность-мишень в НВх и/или HBsAg вируса гепатита В (HBV) для лечения упомянутого вирусного заболевания; и b) компонент-носитель, способный доставлять олигомер в печень, который связан, предпочтительно конъюгирован, с олигомером.

Description

Область техники
Изобретение относится к области олигомерных лекарственных средств, в частности к олигомерам и олигомерным конъюгатам, нацеленным на вирус гепатита В (HBV). В частности, изобретение относится к области терапевтических олигомерных конъюгатов, где антисмысловые олигонуклеотиды прикреплены к компоненту-носителю. В определенных аспектах изобретение относится к области терапевтических олигомерных конъюгатов, где антисмысловые олигонуклеотиды ковалентно прикреплены к компонентуносителю за счет физиологически лабильных линкеров.
В частности, настоящее изобретение относится к олигомерам, в частности к терапевтическим олигомерным конъюгатам, например настоящее изобретение относится к олигомерам, в частности терапевтическим олигомерным конъюгатам, нацеленным на мРНК HBV в клетке, что приводит к лечению вирусных заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Разрабатываются молекулярные стратегии для модулирования нежелательной генной экспрессии, которая или напрямую вызывает, участвует в, или ухудшает состояние заболевания. Одна такая стратегия предусматривает ингибирование генной экспрессии при помощи олигонуклеотидов, последовательность которых комплементарна матричной РНК вредного целевого гена. Цепь матричной РНК представляет собой копию кодирующей цепи ДНК и поэтому, как и цепь ДНК, называется смысловой цепью. Олигонуклеотиды, которые гибридизуются со смысловой цепью, называют антисмысловыми олигонуклеотидами. Связывание данных цепей с мРНК интерферирует процесс трансляции и, следовательно, генную экспрессию.
Определенные соединения на основе нуклеотидов используют в различных терапевтических применениях. В частности, исследуют различные олигонуклеотиды, включая одноцепочечные и двухцепочечные олигонуклеотиды и аналоги. Для того чтобы быть полезными в применениях in vivo, олигонуклеотиды должны обладать множеством свойств, включая способность проникать через мембрану, обладать хорошей устойчивостью к вне- и внутриклеточным нуклеазам, высокой аффинностью и специфичностью к мишени и предпочтительно обладать способностью рекрутировать (привлекать) эндогенные ферменты, такие как РНК Н, РНК III, РНК L и т.д.
Фундаментальным свойством олигонуклеотидов, которое лежит в основе многих их терапевтических применений, является их способность распознавать и специфично гибридизоваться с комплементарными одноцепочечными нуклеиновыми кислотами за счет или водородного связывания по УотсонуКрику (А-Т и G-C) или других схем водородного связывания, таких как Хугстиновское/обратное Хугстиновское связывание. Аффинность и специфичность представляют собой свойства, обычно служащие для характеристики гибридизационных характеристик конкретного олигонуклеотида. Аффинность представляет собой меру силы связывания олигонуклеотида с его комплементарной мишенью (выражается как термостабильность дуплета (Tm)). Каждое нуклеиновое основание в дуплете увеличивает термостабильность и таким образом увеличивает аффинность с увеличением размера (числа нуклеотидов) олигонуклеотида. Специфичность представляет собой меру способности олигонуклеотида к распознаванию между полностью комплементарной и несовпадающей (не полностью комплементарной) последовательностью-мишенью.
Известно применение модифицированных нуклеиновых кислот для улучшения, например, стабилизации олигонуклеотидов, в частности химерных олигонуклеотидов, таких как в случае, когда один или более модифицированных нуклеотидов присутствуют в любом или обоих участках крыла. Примеры модификаций включают звенья 2'-О-алкил-РНК, звенья 2'-амино-ДНК, звенья 2'-фтор-ДНК, звенья LNA (Locked nucleic acid, закрытая нуклеиновая кислота), звенья арабинонуклеиновой кислоты (ANA), звенья 2'-фтор-ANA, звенья HNA, звенья INA (интеркалирующая нуклеиновая кислота - Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002, 30:4918-4925, включенная в данный документ посредством ссылки), звенья 2'-МОЕ, ENA (этиленнуклеиновая кислота), UNA (незакрытая нуклеиновая кислота, Fluiteretal., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039), трицикло-ДНК (R. Steffens & C.J. Leumann, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 11548-49), cET-LNA (приведена в данном документе) и LNA. Фиг. 4 представляет изображения некоторых данных аналогов.
Конкретная эффективная модифицированная нуклеиновая кислота представляет собой закрытую нуклеиновую кислоту (LNA). LNA описаны в области техники, например, см. международную заявку на патент WO 99/14226; Р. Nielsenetal, J. Chem. Soc., PerkinTrans. 1, 1997, 3423; P. Nielsen et al., Chem. Commun., 1997, 9, 825; N.K. Christensen et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 5458; A.A. Koshkin et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 2778; A.A. Koshkin et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 13252-53; Kumar et al. Bioorg, & Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222 и S. Obika et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 515. Интересно, включение звеньев LNA, содержащих 2'-О,4'-С-метиленовый мостик в последовательность олигонуклеотида приводит к беспрецедентному улучшению стабильности гибридизации модифицированного нуклеотида (см. выше и, например, S.K. Singhetal., Chem. Commun, 1998, 455). Олигонуклеотиды, содержащие звенья (LNA) с 2'-О,4'-С-метиленовым мостиком (и также соответствующим 2'-тио-LNA (тио-LNA), 2'-HN-LNA (амино-LNA) и 2'-N(R)-LNA (амино-R-LNA) аналог, формируют дуплеты с комплементарными ДНК и РНК с термостабильностями, ранее не описанными для олигонуклеотидов с модифициро
- 1 034924 ванными би- и трициклическими нуклеозидами. Повышение в Tm на модификацию варьирует от 3 до 11 °С, и, более того, селективность также улучшена. Ни один другой аналог ДНК не показывает воспроизводимо такую высокую аффинность в отношении нуклеиновых кислот.
В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к терапии вируса гепатита В (HBV). Гепатит В представляет собой вирусное заболевание, вызванное вирусом гепатита В. Оно передается парентерально через контаминированный материал, такой как кровь или продукты с кровью, контаминированные иглы, половым путем или вертикально от инфицированных или матерей-носителей к их плоду. В таких регионах мира, где распространена вертикальная передача заболевания в раннем возрасте, это приводит к высокому проценту инфицированных индивидуумов, становящихся хроническими носителями гепатита В. По оценкам Всемирной организации здравоохранения более 2 млрд людей инфицировано во всем мире, приблизительно 4 млн острых случаев в год, 1 млн смертельных случаев в год и 350-400 млн хронических носителей. Приблизительно 25% носителей умирает от хронического гепатита, цирроза или рака печени и приблизительно 75% хронических носителей является азиатами. Вирус гепатита В является вторым по значимости канцерогеном после табака, вызывая 60-80% всех первичных раков печени. HBV является в 100 раз более контагиозным, чем HIV.
Вирус гепатита В (HBV) представляет собой оболочечный, двухцепочечный ДНК вирус. Компактный 3,2 т.п.н. геном HBV состоит из четырех перекрывающихся открытых рамок считывания (ORF), которые кодируют кор, полимеразу (Pol), оболочку и Х-белки. ORF Pol является наиболее длинной, и ORF оболочки локализована внутри нее, в то же время ORF X и кора перекрываются с ORF Pol.
Жизненный цикл HBV включает два важных события: 1) образование закрытой кольцевой ДНК (cccDNA) из релаксированной кольцевой ДНК (теДНК) и 2) обратная транскрипция прегеномной РНК (pgRNA) для получения гсДНК. Перед инфицированием хозяйских клеток геном HBV существует внутри вириона в виде гсДНК. Определено, что вирионы HBV способны проникать в хозяйские клетки посредством неспецифического связывания с негативно заряженными протеогликанами, присутствующими на поверхности человеческих гепатоцитов, и через специфическое связывание HBV поверхностных антигенов (HBVsAg). Когда вирион проникает в клетку, вирусные коры и инкапсулированная гсДНК транспортируются хозяйскими факторами, при помощи сигнала ядерной локализации в ядро через рецепторы ядерного транспорта Impf/Impa. Внутри ядра хозяйские ферменты репарации ДНК переводят ГСДНК в сссДНК. сссДНК действует в качестве матрицы для всех вирусных мРНК и соответственно ответственна за персистенцию HBV у инфицированных индивидуумов. Транскрипты, получаемые с сссДНК группируют на две категории; pgРНК и субгеномную РНК. Субгеномные транскрипты кодируют три белка оболочки (L, М и S) и X белок, и pgРНК кодирует белки прекора, кора и PoI. Ингибирование генной экспрессии HBV или РНК синтез HBV приводит к ингибированию вирусной репликации HBV и продукции антигенов. Например, IFN-α показал ингибирование репликации HBV и продукции вирусной HBsAg за счет снижения транскрипции прегеномной РНК (pgРНК) и субгеномной РНК с циклической ковалентно замкнутой ДНК (сссДНК) микрохромосомы HBV. Все вирусные мРНК HBV копируются и полиаденилируются, а затем экспортируются в цитоплазму для трансляции. В цитоплазме инициируется сборка новых вирионов и образующаяся pgRBR упаковывается при помощи вирусной PoI, так что может начаться обратная транскрипция pgEnX, через промежуточное соединение одноцепочечную ДНК, в гсДНК. Зрелые нуклеокапсиды, содержащие гсДНК покрываются клеточными липидами и вирусными белками L, М и S, и затем инфекционные частицы HBV высвобождаются посредством отпочковывания от внутриклеточной мембраны. Интересно, что неинфекционные частицы также продуцируются в более превосходящем числе, чем инфекционные вирионы. Данные пустые покрытые частицы (L, М и S) рассматривают в качестве субвирусных частиц. Важно, поскольку субвирусные частицы обладают такими же белками оболочки, как и инфекционные частицы, можно предположить, что они служат ложной целью для иммунной системы хозяина и их применяют в качестве вакцины против HBV. Белки оболочки S, М и L экспрессируются с одной ORF, которая содержит три различных стартовых кодона. Все три белка имеют 226 а/к последовательность, S-домен на их С-терминальном конце. М и L имеют дополнительные пре-Sдомены, Pre-S2 и Pre-S2 и Pre-S1 соответственно. Однако существует S-домен, который имеет эпитоп HBsAg.
Вирусные инфекции гепатита В являются постоянной медицинской проблемой, так как подобно любому быстро реплицирующемуся инфекционному агенту возникают постоянные мутации, которые помогают субпопуляциям HBV становится резистентными к существующим лекарственным средствам. В настоящее время терапии для хронической инфекции HBV, рекомендуемые Американской ассоциацией по изучению заболеваний печени (AASLD) и Европейской ассоциацией по изучению заболеваний печени (EASL), включают интерферон альфа (INF-a), пегилированный интерферон альфа-2а (Peg-IFN2a), энтекавир и тенофовир. Однако обычная терапия интерфероном составляет 48-недель и приводит к серьезным неприятным побочным эффектам, и спустя 24 недели после прекращения лечения сероконверсия HBeAg составляет от 27 до 36%. Сероконверсия HBsAg является даже меньшей: только у 3%, наблюдаемых непосредственно после прекращения лечения, повышается до 12% спустя 5 лет.
- 2 034924
Секреция противовирусных цитокинов гепатоцитами и/или внутрипеченочными иммунными клетками в ответ на инфекцию играет центральную роль в очистке инфицированной печени от вируса. Однако хронически инфицированные пациенты проявляют лишь слабый иммунный ответ из-за различных стратегий избегания, адаптированных вирусом для противодействия системам распознавания хозяйских клеток и последующим противовирусным ответам.
Многие наблюдения показывают, что некоторые вирусные белки HBV могут противодействовать первичному ответу хозяйских клеток посредством интерференции сигнальных систем распознавания вируса и последующей интерферонной (IFN) противовирусной активности. Наряду с этим, избыточная секреция пустых субвирусных частиц HBV (SVP, HBsAg) может участвовать в поддержании иммунологически толерантного состояния, наблюдаемого у хронически инфицированных пациентов (СНВ). В частности, SVP могут усиливать отсутствие антигенной презентации дендритными клетками вместе с утратой HBV-специфической иммунной активации Т-клеток, позволяя вирусу персистировать. Количественная оценка HBsAg является важным биологическим маркером для предсказания исхода инфекции; однако достижение сероконверсии HBsAg редко наблюдается у хронически инфицированных пациентов. Снижение SVP и HBsAg нагрузки предполагается как путь восстановления противовирусной иммунной функции, и таким образом сероконверсия в HBsAg-негативный после противовирусной терапии может служить в качестве показателя восстановления функции и остается конечной цели терапии. Поэтому таргетирование генной экспрессии HBV, приводящее к снижению HBsAg вместе с уровнем ДНК HBV у СНВ-пациентов, может существенно улучшить иммунную реактивацию и ремиссию СНВ-пациентов.
Нуклеозидные и нуклеотидные терапии энтекавиром и тенофовиром успешны при снижении вирусной нагрузки, но скорости потери сероконверсии HBeAg и HBsAg являются еще меньшими, чем таковые полученные при помощи терапии IFN-α. Также применяют другие аналогичные терапии, включающие ламивудин (3ТС), телбивудин (LdT) и адефовир, но для нуклеозид/нуклеотидных терапий в целом возникновение резистентности ограничивает эффективность терапии.
US 8598334 и WO 2012/145697 упоминают применение антисмысловых нуклеотидов для нацеливания на HBV.
Контроль вирусной инфекции требует строгого надзора со стороны врожденной иммунной системы хозяина, которая может реагировать в течение минут-часов после инфекции, влияя на начальный рост вируса и ограничивая развитие хронической и персистирующей инфекции. Несмотря на доступные существующие лекарственные препараты на основе IFN и нуклеотидных/нуклеозидных аналогах, инфекция вируса гепатита В (HBV) остается основной проблемой здравоохранения во всем мире, насчитывая 350 млн хронических носителей, которые имеют более высокий риск цирроза печени и гепатоклеточной карциномы.
Существует необходимость в новых противовирусных терапиях, в частности противо-HBV терапиях. Также существует необходимость терапевтической стратегии, нацеленной на различные генотипы HBV.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к олигомерным конъюгатам, их применениям, способам их получения, приемлемым для медицинского применения, такое как лечение вирусных заболеваний.
В частности, настоящее изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, который приемлем для лечения вирусных заболеваний, где упомянутый олигомер или упомянутый олигомерный конъюгат способен модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно HBx или HBsAg HBV. В конкретных воплощениях компонент-носитель конъюгирован с олигомером.
Изобретение предлагает олигомер и олигомерный конъюгат, как описано в данном документе, где олигомер и олигомерный компонент конъюгата содержит по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 7, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 9, предпочтительно по меньшей мере 10 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 11 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 12 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 13 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 14 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 15 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 16 звеньев, которые по меньшей мере на 80% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 91% идентичны, по меньшей мере на 92% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 93% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 94% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 96% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 97% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичны, предпочтительно идентичны участку, соответствующему гену НВх или гену HBsAg HBV или обратному комплементу участка нуклеиновой кислоты, являющегося мишенью кодирующему НВх HBV или HBsAg HBV.
Изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, как описано в данном документе, где олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 7, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей ме
- 3 034924 ре 9, предпочтительно по меньшей мере 10 звеньев, идентичных участку, соответствующему гену НВх HBV или гену HBsAg или обратному комплементу участка нуклеиновой кислоты, являющегося мишенью, кодирующему НВх HBV или HBsAg HBV.
В случае конкретных воплощений изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, как описано в данном документе, где олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит менее 20 звеньев, например менее 19 звеньев, например менее 18 звеньев, например менее 17 звеньев, например 16 или менее звеньев.
В случае конкретных воплощений изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, как описано в данном документе, где олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит 15 или 16 звеньев.
Изобретение предлагает конъюгат, содержащий олигомер по изобретению и по меньшей мере один не нуклеотид или не полинуклеотидную группу, ковалентно прикрепленную к упомянутому олигомеру.
Изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую олигомер или конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель (такой как вода или солевой раствор), носитель, соль или адъювант.
Изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению для применения в качестве лекарственного препарата, например лекарственного препарата для лечения вирусного заболевания.
Изобретение предлагает применение олигомера или конъюгата по изобретению для производства лекарственного препарата для лечения вирусного заболевания.
Изобретение предлагает способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение эффективного количества олигомера, олигомерного конъюгата или фармацевтической композиции по изобретению, животному, страдающему от или вероятно страдающему от вирусного заболевания (такому как животное, страдающее от или чувствительное к заболеванию или расстройству).
Изобретение предлагает способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение эффективного количества олигомера, олигомерного конъюгата или фармацевтической композиции по изобретению животному, не являющемуся человеком, страдающему или вероятно страдающему от вирусного заболевания (такому как животное, не являющееся человеком, страдающее от или чувствительное к заболеванию или расстройству).
Изобретение предлагает способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение эффективного количества олигомера, олигомерного конъюгата или фармацевтической композиции по изобретению пациенту-человеку, страдающему или вероятно страдающему от вирусного заболевания (такому как пациенту-человеку, страдающему от или чувствительному к заболеванию или расстройству).
Также изобретение представляет собой способы лечения животного (животного, не являющегося человеком или человека), предположительно имеющего или чувствительного к заболеванию или состоянию, ассоциированному с экспрессией или повышенной экспрессией НВх или HBsAg, за счет введения животному, не являющемуся человеком, или человеку терапевтически или профилактически эффективного количества одного или более олигомеров, конъюгатов или фармацевтических композиций по изобретению. Кроме того, предложены способы применения олигомеров для ингибирования экспрессии НВх или HBsAg и лечения заболеваний, ассоциированных с активностью НВх или HBsAg.
В дальнейшем изобретение предлагает фармацевтическую систему, содержащую фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и дополнительный фармацевтический препарат и/или терапевтический препарат. Дополнительный фармацевтический препарат может представлять собой олигомер или олигомерный конъюгат по настоящему изобретению. Дополнительный фармацевтический препарат может представлять собой олигомер или олигомерный конъюгат, способный модулировать последовательность-мишень HBV, которая находится вне НВх или HBsAg. Например, по меньшей мере один олигомер или олигомерный конъюгат может быть способен модулировать последовательностьмишень внутри гена или мРНК HBsAg, HBeAg или ДНК-полимеразы HBV.
В одном воплощении множество олигомеров и олигомерных конъюгатов по изобретению вводят субъекту, нуждающемуся в лечении. Олигомеры или конъюгаты могут быть введены с дополнительными фармацевтическими/терапевтическими агентами.
В одном воплощении заболевание или расстройство или состояние ассоциировано с повышенной экспрессией НВх или HBsAg.
Изобретение предлагает способы модулирования экспрессии НВх или HBsAg в клетке или ткани, способ, содержащий этап контактирования клетки или ткани in vitro или in vivo с эффективным количеством одного или более олигомеров, конъюгатов или их фармацевтических композиций, для эффективного модулирования экспрессии НВх или HBsAg.
Изобретение предлагает способы ингибирования (например, подавления) экспрессии НВх в клетке или ткани, способ, содержащий этап контактирования клетки или ткани in vitro или in vivo с эффективным количеством одного или более олигомеров, конъюгатов или их фармацевтических композиций для эффективного подавления экспрессии НВх или HBsAg.
- 4 034924
Изобретение предлагает способ ингибирования НВх или HBsAg в клетке, экспрессирующей НВх или HBsAg, упомянутый способ, содержащий введение в клетку олигомера или конъюгата по изобретению, для ингибирования НВх или HBsAg в упомянутой клетке.
В дальнейшем предложены способы подавления экспрессии НВх или HBsAg в клетках или тканях, содержащие контактирование упомянутых клеток или тканей in vitro или in vivo, с эффективным количеством одного или более олигомеров, олигомерных конъюгатов или композиций по изобретению.
Аспекты настоящего изобретения предложены в настоящее время.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания;
b) компонент-носитель, предпочтительно для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат, приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньше мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания;
b) компонент-носитель, предпочтительно для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает композицию, приемлемую для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат и по меньшей мере один дополнительный другой олигонуклеотид; где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания;
b) компонент-носитель, предпочтительно для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата, который гибридизуется с последовательностью-мишенью, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более позиций: 1530-1598; 1264-1278 и 670-706 SEQID NO: 3.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомер на основе корового мотива, выбранного из группы, состоящей из любой одной или более:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13); GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11); AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
JCGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19); AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834), способной модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV для лечения вирусного заболевания.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает композицию, приемлемую для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомер и по меньшей мере один дополнительный другой олигонуклеотид; где упомянутый олигомер содержит по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания.
- 5 034924
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества олигомерного конъюгата по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение субъекту, нуждающемуся в лечении эффективного количества олигомера по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую олигомерный конъюгат по изобретению; и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую композицию по изобретению; и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую олигомер по изобретению; и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую систему, содержащую фармацевтическую композицию по изобретению и дополнительный фармацевтический препарат.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает мотив, выбранный из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
для получения олигомерного конъюгата по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает мотив, выбранный из группы, состоящей из любой одной или более из GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO: 13), GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 11) и CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 12) для получения композиции по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает мотив, выбранный из группы, состоящей из любой одной или более из AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO: 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO: 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 18); GAAGTGCACACGG (SEQID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 17); CGAAGTGCACACG (SEQID NO 19) и AGGTGAAGCGAAGT (SEQID NO 27) для получения олигомера по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ производства олигомерного конъюгата по изобретению, содержащий конъюгирование одного или более олигомеров по изобретению с компонентном-носителем по изобретению.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ производства композиции по изобретению, содержащий смешивание олигомерного конъюгата по изобретению с фармацевтически приемлемыми разбавителями, носителями, солями или адъювантами.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: представляет схему этапа конъюгирования LNA олигомера GalNAc.
Фиг. 2: представляет примеры холестерол или моно-GalNAc компонентов-носителей, включающих С6-линкерную группу (участок Е), которую применяют для связи компонента-носителя с олигомером (участок А или с физиологически лабильным линкерным участком PL, таким как линкер РО). Волнистая линия представляет ковалентную связь с олигомером или участком PL.
Фиг. 3: представляет примеры три-GalNAc компонентов-носителей. Конъюгаты 1-4 иллюстрируют 4 приемлемых GalNAc компонента-носителя и конъюгаты 1а-4а относятся к таким же компонентамносителям с дополнительной С6-линкерной группой (участок Е), которую применяют для связи компонента-носителя с олигомером (участок А или физиологически лабильный линкер, участок PL, такой как линкер РО). Волнистая линия представляет ковалентную связь с олигомером или участком PL.
Фиг. 4: представляет примеры олигомерных конъюгатов с трехвалентными компонентаминосителями GalNAc.
Фиг. 5: представляет структуры для серии нуклеозидных аналогов.
Фиг. 6: представляет структуру SEQ ID NO: 808.
Фиг. 7: представляет структуру SEQ ID NO: 814.
Фиг. 8: представляет структуру SEQ ID NO: 815.
Фиг. 9: представляет структуру SEQ ID NO: 825.
Фиг. 10: представляет структуру SEQ ID NO: 826.
- 6 034924
Фиг. 11: снижение SEQ ID NO: 807 HBsAG в дозе 0,28 мг/кг (); 1,4 мг/кг <А) и 7,1 мг/кг SEQ ID NO: 808 в дозе 7,1 мг/кг (), 1,42 мг/кг <А) и 0,29 мг/кг (т); SEQ ID NO: 814 в дозе 0,252 мг/кг и
1,26 мг/кг <т) и 6,15 мг/кгО); SEQ ID NO: 815 в дозе 0,3 мг/кг (); 1,5 мг/кг <А) и 7,5 мг/кг <т>; SEQ ID NO: 825 в дозе 0,3 мг/кг <А>, 1,5 мг/кг <т) и 7,5 мг/кг О); SEQ ID NO: 826 в дозе 7,1 мг/кг (), 1,42 мг/кг <А) и 0,29 мг/кг (т).
Фиг. 12: снижение SEQ ID NO: 807 HBeAG в дозе 0,28 мг/кг <), 1,4 мг/кг <А) и 7,1 мг/кг <т); SEQ ID NO: 808 в дозе 7,1 мг/кг (), 1,42 мг/кг <А) и 0,29 мг/кг <т); SEQ ID NO: 814 в дозе 0,252 мг/кг и
1,26 мг/кг <т), 6,15 мг/кг SEQ ID NO: 815 в дозе 0.3 мг/кг (), 1,5 мг/кг и 7,5 мг/кг (т); SEQ ID NO: 825 в дозе 0,3 мг/кг <т>, 1,5 мг/кг и 7,5 мг/кг (♦); SEQ ID NO: 826 в дозе 7,1 мг/кг (♦), 1,42 мг/кг <А) и 0,29 мг/кг (т);
Фиг. 13: снижение ДНК SEQ ID NO: 807 HBV в дозе 0,28 мг/кг (), 1,4 мг/кг <А) и 7,1 мг/кг <т); SEQ ID NO: 808 в дозе 7,1 мг/кг (), 1,42 мг/кг <А) и 0,29 мг/кг (т); SEQ ID NO: 814 в дозе 0,252 мг/кг и
1,26 мг/кг <т), 6,15 мг/кг (♦); SEQ ID NO: 815 в дозе 0,3 мг/кг (), 1,5 мг/кг <А) и 7,5 мг/кг (т); SEQ ID NO: 825 в дозе 0,3 мг/кг <А), 1,5 мг/кг <т) и 7,5 мг/кг SEQ ID NO: 826 в дозе 7,1 мг/кг (♦), 1,42 мг/кг <А) и 0,29 мг/кг
Фиг. 14: представляет результаты подкожного (ПК) и внутривенного (ВВ) путей введения SEQ ID NO: 807 в дозе 0,2, 1,0 и 5,0 мг/кг. А) представляет снижение HBsAG. В) представляет снижение HBeAG. С) представляет снижение ДНК.
Фиг. 15: представляет результаты неконъюгированных олигомеров <“)(SEQ ID NO: 308 и 303) и конъюгированных олигомеров (т) (SEQ ID NO: 807 и 815), протестированных в эквимолярных дозах олигомеров. А) представляет снижение HBsAG. В) представляет снижение HBeAG. С) представляет снижение ДНК.
Определения/элементы изобретения
Дальнейшее представляет собой определения терминов, которые применяют для всех аспектов настоящего изобретения. Данные определения не являются взаимоисключающими. Данные определения также предлагают дополнительные воплощения в отношении всех аспектов настоящего изобретения.
Олигомер/олигонуклеотид.
В контексте настоящего изобретения ссылки на олигомер и олигонуклеотид, как употреблено в данном документе, также применяют к первому олигомерному участку и/или второму олигомерному участку, например, когда первый олигомерный участок представляет собой олигомерный конъюгат или когда он в несвободной форме (т.е. когда не в олигомерной конъюгате).
Термин олигомер относится к молекуле, формируемой ковалентной связью двух или более нуклеотидов (т.е. олигонуклеотид). Поэтому, как употреблено в данном документе, термины олигомер и олигонуклеотид взаимозаменяемы и имеют идентичное значение. В данном документе единичный нуклеотид (звено) также может быть рассмотрен в качестве мономера или звена. В некоторых воплощениях термины нуклеозид, нуклеотид, звено и мономер применяют взаимозаменяемо. Это следует учитывать при ссылке на последовательность нуклеотидов или звеньев, которая представляет собой последовательность оснований, таких как А, Т, G, С или U.
Как употреблено в данном документе, термины олигомер и олигонуклеотид включают линейные и кольцевые олигомеры натуральных и/или модифицированных звеньев или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) и т.п., способные специфично связываться с полинуклеотидом-мишенью посредством закономерных взаимодействий звено-звено, таких как спаривание оснований по Уотсону-Крику, Хугстеновское или обратно Хугстеновское спаривание оснований и т.п.
Олигонуклеотид может состоять из единственного участка или может состоять из нескольких участков. Олигонуклеотид может быть химерным, т.е. состоящим из различных участков. В контексте данного изобретения химерные антисмысловые соединения являются антисмысловыми соединениями, в частности олигонуклеотидами, которые содержат два или более химических участка, например участок(ки) ДНК, участок(ки) РНК, участок(ки) PNA и т.д. Каждый химический участок состоит по меньшей мере из одного звена, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Данные олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере один участок, где олигонуклеотид модифицирован с целью проявления одного или более искомых свойств. Искомые свойства олигонуклеотида могут представлять собой повышение устойчивости к деградации нуклеазами, усиленный захват клетками и/или повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Различные участки олигонуклеотида таким образом могут обладать различными свойствами. Один или более участок олигонуклеотида может служить субстратом для ферментов, способных расщеплять РНК:ДНК или РНК:РНК гибриды. Существует несколько ферментов с подобным каталитическим эффектом. Способ расщепления РНК в конкретном сайте при помощи антисмыслового олигонуклеотида и РНКазы Н продемонстрирован Minshull et al. (Nucleic Acids Research, 14:6433-6451 (1986)).
- 7 034924
РНКаза Н представляет собой клеточный фермент, который расщепляет цепь РНК дуплета РНК:ДНК. Поэтому активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени. Поэтому эффективность олигонуклеотидного ингибирования генной экспрессии может быть повышена. Другие ферменты, способные к расщеплению представляют собой РНКазу L и РНКазу Р.
Нуклеооснование.
Термин нуклеооснование относится к группе основания нуклеотида и охватывает оба варианта как естественного так и неестественного происхождения.
Таким образом, нуклеооснование охватывает не только известные пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но также гетероциклические аналоги и их таутомеры.
Примеры нуклеооснований включают, но не ограничены, аденин, гуанин, цитозин, тимидин, урацил, ксантин, гипоксантин, 5-метилцитозин, изоцитозин, псевдоцитозиин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 6аминопурин, 2 - аминопурин, инозин, диаминопурин и 2-хлор-6аминопурин.
В некоторых воплощениях по меньшей мере одно нуклеооснование, присутствующее в олигомере, является модифицированным нуклеооснованием, выбранным из группы, состоящей из 5-метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-бромурацила, 5-пропинилурацила, 6аминопурина, 2-аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6аминопурина.
Звенья.
Как употреблено в данном документе, термин звенья или мономеры обычно означают нуклеозидные звенья, связанные фосфодисложноэфирными связями или их аналогами для образования олигонуклеотидов, варьирующих по размеру от нескольких мономерных звеньев, например от приблизительно 3-4 до приблизительно нескольких сотен мономерных звеньев. Аналоги фосфодисложноэфирных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфорнаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п.
Нуклеозиды и нуклеозидные аналоги.
В некоторых воплощениях термины нуклеозидный аналог и нуклеотидный аналог применяют взаимозаменяемо.
Термин нуклеотид, как употреблено в данном документе, относится к гликозиду, содержащему сахарную группу, группу основания и ковалентно связанную группу (связующая группа), такую как фосфатная или фосфоротиоатная межнуклеотидная связующая группа, и охватывает нуклеотиды, как естественного происхождения, такие как ДНК или РНК, так и неестественного происхождения, содержащие модифицированную сахарную группу и/или группу основания, которые также рассматриваются в качестве нуклеотидных аналогов в данном документе. В данном документе единичный нуклеотид (звено) также может быть рассмотрен в качестве мономера или нуклеиново-кислотного звена.
В области биохимии термин нуклеозид применяют относительно гликозида, содержащего сахарную группу и основную группу, и поэтому он может быть применен в отношении нуклеотидных звеньев, которые ковалентно связаны межмолекулярными связями между нуклеотидами олигомера.
В области биотехнологии термин нуклеотид часто применяют в отношении мономера или звена нуклеиновой кислоты, и, например, в контексте олигонуклеотида он относится к основанию, такому как нуклеотидная последовательность и обычно может относиться к нуклеоосновной последовательности (т.е. подразумеваются присутствие сахарного остова и межнуклеозидные связи).
Аналогично, особенно в случае олигонуклеотидов, где одна или более межнуклеозидные связующие группы модифицированы, термин нуклеотид может относиться к нуклеозиду, например термин нуклеотид может быть применен даже в случае специфичности присутствия или природы связей между нуклеозидами.
Специалисты в области техники поймут, что 5'-терминальный нуклеотид олигонуклеотида не содержит 5'-межнуклеотидную связующую группу, хотя может содержать или не содержать 5'-терминальную группу.
Нуклеотиды не естественного происхождения включают нуклеотиды, которые имеют модифицированные сахарные группы, такие как бициклические нуклеотиды или 2'-модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-замещенные нуклеотиды.
Нуклеотидные аналоги представляют собой варианты натуральных нуклеотидов, таких как нуклеотиды ДНК или РНК, посредством модификаций в группах сахаров и/или оснований. Аналоги в принципе могут быть лишь молчащими или эквивалентными естественным нуклеотидам в контексте олигонуклеотида, т.е. не оказывать функционального влияния на то, как нуклеотид работает в отношении ингибирования экспрессии целевого гена. Такие эквивалентные аналоги, тем не менее, могут быть полезны в случае, когда, например, более легкие или дешевые для производства, или более стабильны при хранении или условиях производства, или имеют тег или метку. Однако предпочтительно аналоги оказывают функциональный эффект на тот путь, через который олигомер ингибирует экспрессию; например, посредством достижения повышенной аффинности связывания к мишени и/или повышенной устойчивости к внутриклеточным нуклеазам и/или повышенной простоты транспорта в клетку. Конкретные примеры нуклеозидных аналогов описаны Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinionin Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, и на схеме 1, представленной на фиг. 4.
- 8 034924
Линкер/линкерная группа и т.д.
Термины линкерная группа, связующая группа, линкер, линкерная молекула или межнуклеозидная связь предназначены для обозначения группы, способной ковалентно связывать вместе два вещества, таких как нуклеотиды. Конкретные примеры включают фосфатные группы и фосфоротиоатные группы. Такие линкеры могут содержать спейсерную молекулу, ковалентно прикрепленную к одной или более активированной группе или функциональной группе. Возможно, функциональная группа линкерной молекулы может быть обработана связующим агентом для образования активированной группы. Такие линкеры также включают связывающие молекулы, как описано в данном документе.
Термин ветвящий участок предназначен для обозначения группы или участка, способных ковалентно соединять вместе два или более вещества, таких как нуклеотиды, или для образования кластеров компонента-носителя, таких как галактозные кластеры.
Альтернативно, линкерные группы и ветвящие участки, как описано в данном документе, могут быть применены для ковалентного соединения нуклеотидных участков и не нуклеотидных участков, такую линкерную группу называют L. Например, линкерная группа может быть применена для конъюгирования олигомера по изобретению с компонентом-носителем, описанным в данном документе. Например, ветвящий участок может быть применен для конъюгирования олигомера по изобретению с одним или более компонентом-носителем, описанным в данном документе. Например, ветвящий участок может быть применен для конъюгирования одного или более олигомера по изобретению с компонентомносителем, описанным в данном документе. Например, ветвящий участок может быть применен для конъюгирования одного или более олигомеров по изобретению с компонентами-носителями, описанными в данном документе.
Олигомерный конъюгат.
Термин олигомерный конъюгат предназначен для обозначения гетерогенной молекулы, сформированной посредством связывания (конъюгации), такого как ковалентное связывание, олигомера, как описано в данном документе, с компонентом-носителем.
Связывание, такое как ковалентная конъюгация, может быть химическим по своей природе, например через линкерную группу, или генетическим, например посредством рекомбинантных генетических технологий, таких как слияние белков с, например, репортерной молекулой (например, зеленый флуоресцентный белок, β-галактозидаза, Histag и т.д. Альтернативно, олигомер может быть конъюгирован с компонентом-носителем напрямую без необходимости в какой-либо связывающей молекуле или линкерной группе.
Компонент-носитель.
Как употреблено в данном документе, термин компонент-носитель относится к молекулярному носителю, который предназначен для переноски или передачи олигомеров по изобретению к их месту локализации, такому как желаемая анатомическая локализация.
Компоненты-носители по настоящему изобретению могут быть применены для усиления активности, клеточного распределения и/или клеточного захвата олигомеров.
Может быть применен любой приемлемый компонент-носитель.
Компонент-носитель может представлять собой полинуклеотид. Однако обычно компонентноситель представляет собой не нуклеотидную группу или не полинуклеотидную группу.
Примеры не нуклеотидных или не полинуклеотидных групп включают макромолекулярные агенты, выбранные из группы, состоящей из карбогидратов, лигандов рецепторов клеточной поверхности, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков или их комбинаций. Обычные полимеры могут представлять собой полиэтиленгликоль и/или полипропиленгликоль (PPG).
В некоторых воплощениях компонент-носитель может представлять собой аминокислоту, белок, пептид или полипептид. Обычно белки могут представлять собой ферменты, сывороточные белки (например, сывороточный альбумин человека (HSA), трансферрин или гликопротеины), рецепторы, антитела или производные антител, подобные одноцепочечным вариабельным фрагментам, биспецифическим антителам, триотелам и т.д., разработанным для связывания с желаемым целевым антигеном.
Примеры пептидных компонентов-носителей представляют собой полиЦ-лизин), который существенно повышает клеточную проницаемость и транспортный пептид Antennapedia. Такие конъюгаты описаны Lemaitre et al., Specific antiviral activity of a poly(L-lysine)-conjugated oligodeoxyribonucleotide sequence complementary to vesicular stomatitis virus N protein mRNA initiation site, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:648-652, 1987; US Patent No.: 6166089 и 6086900. Способ в вышеупомянутых публикациях требует, чтобы 3'-терминальный нуклеотид представлял собой рибонуклеотид. Полученные альдегидные группы затем случайно соединяют с эпсилон-амино группами остатков лизина поли(Ь-лизина) за счет образования шиффового основания и затем восстанавливают при помощи цианоборгидрида натрия. Даная процедура переводит 3'-терминальное рибозное кольцо вантисмысловые олигомеры морфолиновой структуры. Пептидный сегмент также может быть синтезирован за счет стратегий, которые совместимы с синтезом ДНК/РНК, например Mmt/Fmoc стратегии. В данном случае пептид может быть синтезирован непосредственно перед или после олигонуклеотидного сегмента. Также существуют способы получения
- 9 034924 пептидного олигонуклеотидного конъюгата после синтеза, например, за счет образования дисульфидного мостика.
В некоторых воплощениях конъюгирующая группа может представлять собой или содержать липофильную конъюгирующую группу. Липофильные конъюгирующие группы могут быть выбраны из группы, состоящей из стеролов, станолов, стероидов, полициклических ароматических групп алифатических групп, липидов, фосфолипидов, липофильных спиртов, жирных кислот и сложных эфиров жирных кислот. В некоторых воплощениях конъюгирующая группа может содержать холестерол.
Компонент-носитель может представлять собой или содержать фармакокинетический модулятор, такой как липофильные или гидрофобные группы. Такие группы раскрыты в WO2012/082046 в контексте миРНК конъюгатов. Гидрофобная группа может содержать С8-С36 жирную кислоту, которая может быть насыщенной или ненасыщенной. В некоторых воплощениях могут быть применены С10, С12, С14, С16, С18, С20, С22, С24, С26, С28, С30, С32 и С34 жирные кислоты. Гидрофобная группа может иметь 16 или более атомов углерода. Типичные приемлемые гидрофобные группы могут быть выбраны из группы, содержащей стерол, холестерол, пальмитоил, гексадек-8-еноил, олеил, (9Е,12Е)-октадека-9,12-диеноил, диоктаноил и С16-С20 ацил. Согласно WO 2012/082046 гидрофобные группы, имеющие менее чем 16 атомов углерода являются менее эффективными в отношении повышения полинуклеотидного таргетинга, но они могут быть применены во множестве копий (например, 2х, таких как 2хС8 или С10, С12 или С14) для повышения эффективности. Фармакокинетические модуляторы, полезные в качестве полинуклеотидных нацеленных групп могут быть выбраны из группы, состоящей из холестерола, алкильной группы, алкенильной группы, алкинильной группы, арильной группы, аралкильной группы, аралкенильной группы и аралкинильной группы, каждая из которых может быть линейной, разветвленной или циклической. Фармакокинетические модуляторы предпочтительно представляют собой углеводороды, содержащие только атомы углерода и водорода. Однако допускаются заместители или гетероатомы, которые поддерживают гидрофобность.
WO 2007/031091 предлагает примеры других приемлемых лигнадов и компонентов-носителей, которые таким образом включены посредством ссылки.
В некоторых воплощениях, компонент-носитель представляет собой или содержит карбогидратную группу. Карбогидратные конъюгирующие группы включают, но не ограничены, галактозу, лактозу, нацетилгалактозамин, маннозу и маннозо-6-фосфат. Карбогидратные конъюгаты могут быть применены для усиления доставки или активности в ряде тканей, таких как печень и/или мышцы. См. например, ЕР 1495769, WO 99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem. (2009), 20(2):213-21. Zatsepin&Oretskaya Chem. Biodivers.(2004) 1(10): 1401-17.
Кроме того, олигомер может дополнительно содержать одну или более дополнительные конъюгирующие группы, из которых особо интересны липофильные и гидрофобные группы. Они могут, например, действовать в качестве фармакокинетических модуляторов и могут быть ковалентно связаны или с карбогидратным конъюгатом, линкерное связывание карбогидратного конъюгата с олигомером или линкерное связывание множества карбогидратных конъюгатов (мультивалентных), или с олигомером, возможно через линкер, такой как физиологически лабильный линкер.
В некоторых воплощениях, компонент-носитель содержит группу, нацеленную на асиалогликопротеновый рецептор (ASGP-R), с аффинностью эквивалентной или превосходящей таковую галактозы. Нацеленная на ASPG-R, группа может быть выбрана из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, Nформил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, и N-изобутаноилгалактозамина. В некоторых воплощениях группа, нацеленная на асиалогликопротеиновый рецептор, является моновалентной. В других воплощениях компонент-носитель содержит галактозный кластер, такой как дивалентная, трехвалентная или четырехвалентная конъюгирующая группа, нацеленная на асиалогликопротеиновый рецептор (т.е. содержащую 1, 2, 3 или 4 терминальные карбогидратные группы, способные к связыванию с асиагликопротеиновым рецептором). В некоторых воплощениях компонент-носитель содержит GalNAc (N-ацетилгалактозамин), такой как моновалентный, двухвалентный, трехвалентный или четырехвалентный GalNAc. GalNAc конъюгаты могут быть применены для нацеливания соединения на печень. Предпочтительный компонентноситель представляет собой N-ацетилглюкозаминовый тример. GalNAc конъюгаты применяют с метилфосфонатными и PNA антиСмысловыми олигонуклеотидами (например, US 5,994517 и Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec; 6(6):695-701) и миРНК (например, WO 2009/126933, WO 2012/089352 и WO 2012/083046) и с LNA и 2'-МОЕ модифицированными нуклеозидами WO 2014/076196, WO 2014/207232, WO 2014/179620 и WO 2014/179627. GalNAc ссылки и специфичные конъюгаты, применяемые в данном документе? таким образом включены в данный документ посредством ссылки. WO 2012/083046 раскрывает миРНК с GalNAc конъюгирующими группами, которые содержат расщепляемые фармакокинетические модуляторы, приемлемые для применения по настоящему изобретению, предпочтительные фармакокинетические модуляторы представляют собой С16-гидрофобные группы, такие как пальмитоил, гексадек-8-еноил, олеил, (9Е,12Е)-октадека-9,12-диеноил, диоктаноил, и С16-С20ацил. WO 2012/083046 расщепляемые фармакокинетические модуляторы также могут представлять собой холестерол.
- 10 034924
Компонент-носитель может быть выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноилгалактозамина, N-изобутаноил-галактозамина, галактозного кластера и N-ацетилгалактозаминового тримера и могут иметь фармакокинетический модулятор, выбранный из группы, состоящей из гидрофобной группы, имеющей 16 или более атомов углерода, гидрофобной группы, имеющей 16-20 атомов углерода, пальмитоила, гексадек-8-еноила, олеила, (9Е,12Е)-октадека-9,12-дианоила, диоктаноила и С16-С20-ацила и холестерола. Конкретные кластеры GalNac, раскрытые в '046 включают (Е)-гексадек-8-еноил (С16), олеил (С18), (9,Е,12Е)-октадека-9,12-диеноил (С18), октаноил (С8), додеканоил (С12), С20-ацил, С24-ацил, диоктаноил (2хС8). Компонент-носитель - фармакокинетический регулятор могут быть связаны с полинуклеотидом через физиологически лабильную связь или, например, дисульфидную связь (РО-линкер), или ПЭГ линкер. Изобретение также относится к применению сложных фосфодиэфирных линкеров между олигомером и компонентом-носителем (соответственно расположенных между олигомером и карбогидратной конъюгирующей группой).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения олигомер связан, предпочтительно конъюгирован с компонентом-носителем, который может быть применен для доставки олигомеров в печень субъекта, например, за счет повышения клеточного захвата олигомеров.
В конкретном воплощении компонент-носитель может представлять собой GalNAc или кластер GalNAc. Фиг. 2 и 3 представляет некоторые компоненты-носители.
Для нацеливания на гепатоциты в печени предпочтительным нацеленным лигандом является галактозный кластер.
Галактозный кластер содержит молекулу, имеющую, например, 2-4 галактозных производных. Как употреблено в данном документе, термин галактозное производное включает как галактозу, так и производные галактозы, имеющие аффинность к ASGP-R эквивалентную или превышающую таковую галактозы. Терминальное галактозное производное прикреплено к молекуле через ее С-1 углерод. ASGP-R уникален для гепатоцитов и связывает разветвленные галактозо-терминальные гликопротеины. Предпочтительный галактозный кластер имеет три терминальных галактозамина или производных галактозамина, каждый имеющий аффинность к асиалогликопротеиновому рецептору. Более предпочтительный галактозный кластер имеет три терминальных N-ацетил-галактозамина. Другие термины, распространенные в области техники, включают трехантеннальную галактозу, трехвалентную галактозу и галактозный тример. Известно, что кластеры производного трехантеннальной галактозы связаны с ASGP-R с большей аффинностью, чем структуры производных биантеннальной и моноантеннальной галактозы (Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982,1. Biol. Chern., 257,939-945). Мультивалентность необходима для достижения нМ аффинности.
Предпочтительное производное галактозы представляет сообой N-ацетил-галактозамин (GalNAc). Другие сахариды, обладающие высокой аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору могут быть выбраны из списка, содержащего: галактозамин, N-н-бутаноилгалактозамин и N-изобутаноилгалактозамин. Аффинности различных производных галактозы к асиалогликопротеиновому рецептору изучены (см.. например, Jobst, S.T. and Drickamer, K.J.B.C. 1996, 271, 6686) или легко определяются при помощи способов обычных в области техники.
Галактозный кластер может содержать два или предпочтительно три производных галактозы, каждое связанное с центральной точкой ветвления. Производные галактозы прикреплены к центральной точке ветвления через C-I углероды сахаридов. Производное галактозы предпочтительно связано с точкой ветвления через линкеры или спейсеры. Предпочтительный спейсер представляет собой гибкий гидрофильный спейсер (U.S.Patent 5885968; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995, Vol. 39, p. 1538-1546). Предпочтительный гибкий гидрофильный спейсер представляет собой ПЭГ спейсер. Предпочтительный ПЭГ спейсер представляет собой ПЭГ3 спейсер (три этиленовых звена). Точка ветвления может представлять собой любую небольшую молекулу, которая делает возможным прикрепление трех производных галактозы и в дальнейшем делает возможным прикрепление точки ветвления к олигомеру. Каждое производное галактозы (карбогидратная группа) в GalNAc кластере (например, GalNAc) может быть соединено с олигомером через спейсер, такой как (поли)этиленгликолевый линкер (ПЭГ), такой как ди-, три-, тетра-, пента-, гексаэтиленгликолевый линкер. ПЭГ группа может формировать спейсер между сахарной группой производного галактозы и пептидным (дилизин показан) линкером. Примером группы точки ветвления является дилизин. Молекула дилизина содержит триаминогруппы, через которые три производных галактозы могут быть прикреплены, и карбоксильную реактивную группу, через которую дилизин может быть прикреплен к олигомеру (см., например, фиг. 4).
Карбогидратный конъюгат (например, GalNAc), или карбогидрат-линкерная группа (например, карбогидрат-ПЭГ группа) могут быть ковалентно соединены (связаны) с олигомером через группу точки ветвления, такую как аминокислота или пептид, которые соответственно содержат две или более аминогруппы (такие как 3, 4 или 5), такую как лизин, дилизин или трилизин или тетрализин. Молекула трилизина содержит четыре аминогруппы, через которые три карбогидратные конъюгирующие группы, такие как галактоза и производные (например, GalNAc) и в дальнейшем конъюгат, такой как гидрофобная и/или липофильная группа, могут быть прикреплены и карбоксильную реактивную группу, через кото
- 11 034924 рую трилизин может быть прикреплен к олигомеру. В дальнейшем конъюгат, такой как липофильная/гидрофобная группа может быть прикреплен к остатку лизина, который прикреплен к олигомеру.
В некоторых воплощениях GalNac кластер содержит пептидный линкер, например, Tyr-Asp(Asp) трипептид или Asp(Asp) дипептид, который прикреплен к олигомеру через бирадикальный линкер, например, кластер GalNac может содержать бирадикальные линкеры, такие как таковые, показанные в качестве Conj 3, 3 а , 4 и 4а на фиг. 3.
Альтернативные ветвящиеся молекулы могут быть выбраны из группы, состоящей из 1,3-бис-[5(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2-цианоэттил)-Щ,№диизопропил)]фосфорамидита (Glen Research Catalogue Number: 10-1920-xx), трис-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2-цианоэтил)-Щ,№диизопропил)]-фосфорамидита (Glen Research Catalogue Number: 10-1922-xx), трис-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]метиленоксипропил-[(2цианоэтил)-Щ,№диизопропил)]-фосфорамидита и 1-[5-(4,4'-диметокси-тритилокси)пентиламидо]-3-[5флуоренометокси-каронил-окси-пентиламидо]-пропил-2-[(2-цианоэтил)-Щ,№диизопропил)]фосфорамидита (Glen Research Catalogue Number: 10-1925-xx). WO 2014/179620 и европейская заявка на патент No. 14188444.5 описывает получение различных GalNAc конъюгирующих групп (таким образом, включенных посредством ссылки). Прикрепление точки ветвления к олигомеру может происходить через линкер или спейсер. Предпочтительный спейсер представляет собой гибкий гидрофильный спейсер. Предпочтительный гибкий гидрофильный спейсер представляет собой ПЭГ спейсер или С6-линкер. Предпочтительный ПЭГ спейсер представляет собой ПЭГ3 спейсер (три этиленовых звена). В предпочтительном воплощении линкер представляет собой физиологически лабильный линкер. Галактозный кластер может быть прикреплен к 3' или 5'-концу олигомера при помощи способов, известных в области техники. В предпочтительных воплощениях конъюгирующая группа, нацеленная на асиалогликопротеиновый рецептор, связана с 5'-концом олигонуклеотида.
Предпочтительный галактозный кластер содержит три терминальных GalNAc группы, связанных через ПЭГ спейсер с дилизиновой ветвящейся молекулой (GalNAc кластер). Предпочтительно ПЭГ спейсер представляет собой 3ПЭГ спейсер. Предпочтительные кластеры GalNAc представляют собой Conj 1, 1а, 2 и 2а. Наиболее предпочтительным является Conj2a (также называемый GalNAc2).
Галактозные кластеры представлены на фиг. 3.
Линкер компонента-носителя.
Компонент-носитель может быть связан с первым олигомерным участком и/или вторым олигомерным участком посредством линкера (L). Может быть применен любой приемлемый линкер.
Карбогидратный конъюгат (например, GalNAc) может быть связан с олигомером через биорасщепляемый линкер, также называемый физиологически лабильным линкером.
Как употреблено в данном документе, физиологически лабильная связь представляет собой лабильную связь, которая расщепляется при условиях, которые обычно встречаются или аналогичны таковым в теле млекопитающего (также рассматривается в качестве физиологически лабильного линкера). Физиологически лабильные связующие группы выбраны так, что они подвергаются химической трансформации (например, расщеплению) при определенных физиологических условиях. Внутриклеточные условия млекопитающих включают химические условия, такие как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты, и концентрацию солей, обнаруживаемые в или аналогичные таковым в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающих, такой как активность протеолитических и гидролитических ферментов.
Химическая трансформация (расщепление или лабильная связь) может возникать спонтанно, в случае молекулы, содержащей лабильную связь, достигать соответствующих внутри- и/или внеклеточных условий среды. Например, рН лабильная связь может быть расщеплена в случае, когда молекула попадает в закисленную эндосому. Таким образом, рН лабильная связь может быть рассмотрена как эндосомально расщепляемая связь. Ферментативно расщепляемые связи могут быть расщеплены под действием ферментов, таких как таковые, присутствующие в эндосоме или лизосоме или в цитоплазме. Дисульфидная связь может быть расщеплена в случае, когда молекула попадает в восстановительные условия в клеточной цитоплазме. Таким образом, дисульфидная связь может быть рассмотрена как цитоплазматически расщепляемая связь. Как употреблено в данном документе, рН-лабильная связь является лабильной связью, которая селективно разрушается при кислых условиях (рН<7). Такие связи также могут быть названы эндосомально лабильными связями, поскольку клеточные эндосомы и лизосомы обладают рН менее 7. Примером другого физиологически лабильного линкера является дилизин, как употреблено в данном документе, в кластерах GalNAc на фиг. 3.
В некоторых воплощениях олигомерный конъюгат по изобретению содержит физиологически лабильный линкер (участок PL, также рассматриваемый как биорасщепляемый линкер или нуклеазочувствительный линкер), который соединяет олигомер (участок А) по изобретению с компонентом-носителем (или участком С).
Для физиологически лабильных линкеров, ассоциированных с компонентом-носителем для целевой доставки, предпочтительно, чтобы скорость расщепления, наблюдаемая в целевой ткани (например,
- 12 034924 мышцы, печень, почки или опухоль), была выше, чем таковая в сыворотке крови. Приемлемые способы для определения уровня (%) расщепления в целевой ткани по сравнению с сывороткой крови описаны в разделе In vitro анализ тканеспецифичного расщепления линкера.
В некоторых воплощениях физиологически лабильный линкер (также рассматриваемый как биорасщепляемый линкер или нуклеазочувствительный линкер) в соединении по изобретению является по меньшей мере на 20% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 30% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 40% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 50% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 60% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 70% расщепляемым, например приблизительно на 75% расщепляемым In vitro анализе тканеспецифичного расщепления линкера в разделе Материалы и методы. В некоторых воплощениях расщепление (%) в сыворотке, как употреблено в In vitro анализ тканеспецифичного расщепления линкера, составляет менее чем приблизительно 20%, например менее чем приблизительно 10%, например менее чем приблизительно 5%, например менее чем приблизительно 1%.
В некоторых воплощениях олигомерный конъюгат по изобретению содержит три участка: i) первый участок (участок А), содержащий 10-18 последовательных нуклеотидов; ii) второй участок (участок PL), содержащий физиологически лабильный линкер; и iii) третий участок (С), содержащий компонентноситель, где третий участок ковалентно связан со вторым участком, который ковалентно связан с первым участком.
В некоторых воплощениях участок А и участок PL ковалентно связаны через фосфатнуклеозидную связь (например, фосфодисложноэфирную, фосфоротиоатную, фосфодитиоатную, боранофосфатную или метилфосфонатную) или триазольную группу. В некоторых воплощениях участок PL и участок С ковалентно связаны через фосфатнуклеозидную связь (например, фосфодисложноэфирную, фосфоротиоатную, фосфодитиоатную, боранофосфатную или метилфосфонатную) или триазольную группу. В некоторых воплощениях участок PL и участок С ковалентно связаны через второй линкер, такой как линкерные участки Е, описанные ниже.
В некоторых воплощениях физиологически лабильный линкер может быть расположен на 5'-конце и/или на 3'-конце олигомера (участок А). В предпочтительном воплощении физиологически лабильный линкер расположен на 5'-конце.
В некоторых воплощениях физиологически лабильный линкер прикреплен своим 3'-концом к 5'-концу участка А, и компонент-носитель (участок С) прикреплен к 5'-концу или физиологически лабильному линкеру (например, РО-линкер), возможно через дополнительный линкерный участок Е.
Нуклеазочувствительный линкер - фосфодисложноэфирный линкер (РО-линкер).
В некоторых воплощениях физиологически лабильный линкер чувствителен к нуклеазе(ам), которые могут, например, экспрессироваться в целевой клетке, и как таковой, как подробно описано в данном документе, линкер может представлять собой короткий участок (например, 1-10) фосфодисложноэфирно связанных нуклеозидов, таких как нуклеозиды ДНК.
В некоторых воплощениях, которые могут быть одинаковыми или различными, физилогически лабильный линкер (участок PL) чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. Чувствительность к расщеплению S1 может быть оценена при помощи S1 нуклеазного исследования, описанного в разделе Тест на расщепление нуклеазой S1.
В некоторых воплощениях физиологически лабильный линкер (также рассматриваемый как физиологически лабильный линкер или нуклеазочувствительный линкер), такой как участок PL, в соединении по изобретению является по меньшей мере приблизительно на 30% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 40% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 50% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 60% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 70% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 80% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 90% расщепляемым, например по меньшей мере приблизительно на 95% расщепляемым после 120 мин инкубации с нуклеазой S1, как описано в разделе Тест на расщепление нуклеазой S1.
В некоторых воплощениях физиологически лабильный линкер (участок PL) представляет собой нуклеазочувствительный линкер, который содержит 1-10 нуклеозидов, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно 2-6 нуклеозидов и наиболее предпочтительно 2-4 связанных нуклеозида. В некоторых воплощениях нуклеазочувствительный линкер является фосфодисложноэфирным нуклеотидным линкером, таким как линкер, также называемый РО-линкер. В предпочтительных воплощениях нуклеазочувствительный линкер (РО-линкер) содержит по меньшей мере один фосфодисложноэфирно-связанный нуклеозид. Предпочтительно, нуклеазочувствительный РО-линкер содержит по меньшей мере две последовательные фосфодисложноэфирные связи, например по меньшей мере 3, или 4, или 5 последовательных фосфодисложноэфирных связей.
В некоторых воплощениях нуклеозиды в РО-линкере (возможно независимо) выбраны из группы, состоящей из ДНК или РНК или их модификаций, которые не интерферируют с нуклеазным расщеплением. Модификации нуклеозидов ДНК и РНК, которые не интерферируют с нуклеазным расщеплением,
- 13 034924 могут представлять собой нуклеооснования неприродного происхождения. Определенные нуклеозиды, модифицированные по сахарам, также делают возможным нуклеазное расщепление, такое как альфа-Lокси-LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды РО-линкера содержат (возможно независимо) или 2'-ОН рибозу (РНК), или
2'-Н сахар, т.е. РНК или ДНК. В некоторых воплощениях нуклеозиды РО-линкера представляют собой нуклеозиды ДНК. В некоторых воплощениях по меньшей мере два последовательных нуклеозида РО-линкера представляют собой нуклеозиды ДНК или РНК (например, по меньшей мере 3, или 4, или 5 последовательных нуклеозида ДНК или РНК). Предпочтительно РО-линкер состоит из 1-5 или 1-4, например 2, 3, 4, последовательных фосфодисложноэфирно-связанных нуклеозидов ДНК. В предпочтительных воплощениях РО-линкер является настолько коротким, что не рекрутирует (не привлекает) РНКазу Н. В некоторых воплощениях РО-линкер содержит не более чем 3 или не более чем 4 последовательных фосфодисложноэфирно связанных ДНК и/или РНК нуклеозидов (таких как нуклеозиды ДНК).
В некоторых воплощениях РО-линкер не комплементарен нуклеиново-кислотной последовательности-мишени или олигомеру в участке А.
В некоторых воплощениях РО-линкер комплементарен нуклеиново-кислотной последовательностимишени. В данном отношении участок А и РО-линкер вместе могут формировать единую непрерывную последовательность, которая комплементарна последовательности-мишени.
В некоторых воплощениях участок А и РО-линкер формируют единую непрерывную нуклеиновокислотную последовательность 10-22, например, 12-20 нуклеотидов в длину. В данном контексте участок А может быть дифференцирован от РО-линкера тем, что он начинается по меньшей мере с одного, предпочтительно по меньшей мере двух модифицированных нуклеозидов с повышенной аффинностью связывания с целевой нуклеиновой кислотой (например, LNA или нуклеозидами с 2' замещенной сахарной группой) и участок А сам по себе способен модулировать экспрессию целевой нуклеиновой кислоты в соответствующей клеточной линии. Более того, если участок А содержит нуклеозиды ДНК или РНК, они связаны устойчивой к нуклеазе межнуклеозидной связью, такой как фосфоротиоат или боранофосфат.
В некоторых аспектах межнуклеозидная связь между первым (участок А) или вторым участком (РО-линкер) может быть рассмотрена как часть второго участка.
В некоторых воплощениях последовательность оснований в РО-линкере выбрана для обеспечения оптимального сайта расщепления эндонуклеазой, на основании преобладающих эндонуклеаз, присутствующих в целевой ткани, или клетке, или субклеточном компартменте. В данном отношении посредством выделения клеточных экстрактов из целевых тканей и нецелевых тканей последовательности эндонуклеаз для применения в РО-линкере могут быть выбраны на основании предпочтительной расщепляющей активности в желаемой целевой клетке (например, печени/гепатоцитах) по сравнению с нецелевой клеткой (например, почки). В этом отношении эффективность соединения для нацеленного подавления может быть оптимизирована для желаемой ткани/клетки.
В некоторых воплощениях РО-линкер содержит динуклеотид последовательности АА, AT, AC, AG, ТА, ТТ, ТС, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC или GG, где С может представлять собой 5-метилцитозин и/или Т может быть замещен U. Предпочтительно межнуклеозидная связь представляет собой фосфодисложноэфирную связь. В предпочтительном воплощении РО-линкер представляет собой динуклеотид СА по меньшей мере с двумя фосфодисложноэфирными связями (одна относится к участку А). В некоторых воплощениях РО-линкер содержит тринуклеотид последовательности ААА, ААТ, AAC, AAG, ATA, ATT, АТС, ATG, АСА, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, ТАА, ТАТ, ТАС, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, ТСА, ТСТ, ТСС, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, САС, CAG, СТА, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC и GGG, где С может представлять собой 5-метилцитозин и/или Т может быть замещен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодисложноэфирные связи. В некоторых воплощениях РО-линкер содержит тетрануклеотид последовательности АААХ, ААТХ, ААСХ, AAGX, АТАХ, АТТХ, АТСХ, ATGX, АСАХ, АСТХ, АССХ, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, ТААХ, ТАТХ, ТАСХ, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, СААХ, САТХ, САСХ, CAGX, CTAX, CTGX, СТСХ, СТТХ, ССАХ, ССТХ, СССХ, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX и GGGX, где X может быть выбран из группы, состоящей из А, Т, U, G, С и их аналогов, где С может представлять собой 5-метилцитозин и/или Т может быть замещен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодисложноэфирные связи. Следует учитывать, что относительно (естественного происхождения) нуклеооснований А, Т, U, G, С они могут быть замещены нуклеотидными аналогами, которые функционируют в качестве эквивалентов естественных нуклеооснований (например, пара оснований с комплементарным нуклеозидом).
В некоторых воплощениях участок PL представляет собой фосфодисложноэфирный нуклеотидный линкер (РО-линкер), ковалентно прикрепленный к липофильной конъюгирующей группе, такой как липид, жирная кислота, стерол, такой как холестерол или токоферол. В некоторых воплощениях, участок PL представляет собой фосфодисложноэфирный нуклеотидный линкер (РО-линкер) ковалентно прикре
- 14 034924 пленный к группе, нацеленной на асиалогликопротеиновый рецептор, такой как GalNAc компонентноситель.
Концепция встройки физиологически лабильного линкера между олигомером и компонентомносителем описана подробно в WO 2014/076195 (таким образом, включена посредством ссылки, в частности фиг. 3 и 4 включены посредством ссылки).
Альтернативные линкеры (участок Е).
В некоторых случаях линкеры необязательно являются физиологически лабильными, но главным образом служат для ковалентного присоединения третьего участка, например компонента-носителя (участок С), к олигомеру (участок А). В данном документе эти линкеры также названы как участок Е. Олигомерные конъюгаты по настоящему изобретению могут быть сконструированы из следующих элементов участка: А-С/С-А, A-PL-C/C-PL-A, A-PL-E-C/C-E-PL-A, A-E-PL-C/C-PL-E-A или А-Е-С/С-Е-А.
В некоторых воплощениях линкер Е содержит цепочечную структуру или олигомер из повторяющихся звеньев, таких как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. Линкер Е может обладать по меньшей мере двумя функциональными группами, одной для прикрепления к олигомеру (возможно при помощи физиологически лабильного линкера) и другой для прикрепления к компоненту-носителю. Примеры линкерных функциональных групп могут быть электрофильными для реакции с нуклеофильными группами на олигомере или компоненте-носителе или нуклеофильными для реакции с электрофильными группами. В некоторых воплощениях линкерные функциональные группы включают амино, гидроксил, карбоновую кислоту, тиол, фосфорамидат, фосфоротиоат, фосфат, фосфит, ненасыщенности (например, двойные или тройные связи) и т.п. Например, карбогидратный компонент-носитель (например, GalNAc) может быть связан с олигомером через линкер, такой как (поли)этиленгликолевый линкер (ПЭГ), такой как ди, три, тетра, пента, гексаэтиленгликолевый линкер.
В некоторых воплощениях линкер (участок Е) представляет собой аминоалкил, такой как С2-С36аминоалкильная группа, включая, например, С6-С12-аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (участок Е) представляет собой С6аминоалкильную группу. Аминоалкильная группа может быть добавлена к олигомеру (участок А или участок A-L/L-A) как часть стандартного синтеза олигомера, например, при помощи (например, защищенные) аминоалкилфосфорамидита. Связующая группа между аминоалкилом и олигомером может представлять собой, например, фосфоротиоат или фосфодисложный эфир или одну из других нуклеозидных связующих групп, упомянутых в данном документе. Аминоалкильная группа ковалентно связана с 5'- или 3'-концом олигомера. Коммерчески доступные аминоалкильные линкеры представляют собой, например, 3'-аминомодифицирующий реагент для связи с 3'-концом олигомера и для связи с 5'-концом олигомера, 5'-аминомодификатор С6 является доступным. Данные реагенты доступны от Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Данные соединения или аналоги были применены Krieg et al., Antisense Research and Development 1991, 1, 161 для присоединения флуоресцеина к 5'-терминальному концу олигомера. Широкий спектр дополнительных линкерных групп известен в области техники и может быть полезен при прикреплении компонентов-носителей к олигомерам. Обзор многих полезных линкерных групп может быть найден, например, в Antisense Research and Applications, S.R Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350. Другие соединения, такие как акридин, прикреплены 3'-терминальной фосфатной группе олигомера через полиметиленовую связь (Asseline et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3297). Любая из вышеупомянутых групп может быть применена в качестве линкера (участок Е) или комбинации с одним или более дополнительными линкерами (участок Е-Е' или участок E-L или L-E).
Линкеры и их применение при получении олигомерных конъюгатов предложены в области техники, например WO 96/11205 и WO 98/52614 и U.S. Pat. No. 4948882; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5580731; 5486603; 5608046; 4587044; 4667025; 5254469; 5245022; 5112963; 5391723; 5510475; 5512667; 5574142; 5684142; 5770716; 6096875; 6335432; и 6335437, WO 2012/083046, каждый из которых включен во всей полноте посредством ссылки. Фиг. 3 представляет пример кластеров GalNAc, Conj 1, 2, 3, 4 и Conj 1а, 2а, 3 а и 4а, обладающих дополнительным С6 линкером, который присоединяет кластер GalNac к олигомеру.
Группа, нацеленная на асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R).
Как употреблено в данном документе, термин группа, нацеленная на асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R) относится к группе, которая взаимодействует с ASGP-R и таким образом приводит олигомер в контакт с или в близость с клеткой, экспрессирующей поверхностный ASGP-R.
Конъюгирующая группа.
В некоторых воплощениях компонент-носитель представляет собой конъюгирующую группу.
Кроме того, одна или более конъюгирующие группы могут быть прикреплены к олигомеру или олигомерному конъюгату в дополнение к компоненту-носителю.
В некоторых воплощениях одна или более конъюгирующая группа может быть прикреплена к олигомеру по настоящему изобретению.
Конъюгирующая группа может быть ненуклеотидной группой или неполинуклеотидной группой.
Конъюгирующая группа может повышать активность, клеточное распределение или клеточный захват олигомера по изобретению. Такие группы включают, но не ограничены, антитела, полипептиды,
- 15 034924 липидные группы, такие как холестериновая группа, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-sтритилтиол, тиохолестерол, алифатическую цепь, например додекандиол или ундециловые остатки, фосфолипиды, например ди-гексадецил-рац-глицерол или триэтиламмоний 1,2-ди-орто-гексадецил-рацглицеро-3-Н-фосфонат, полиамин или полиэтиленгликолевую цепь, адамантин уксусную кислоту, пальмитиловую группу, октадециламин или гексиламино-карбонил-оксихолестериновую группу.
Олигомеры по изобретению также могут быть конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, аспирином, ибупрофеном, лекарственными сульфамидными препаратами, антидиабетическими веществами, антибактериальными или антибиотическими веществами.
В конкретных воплощениях конъюгирующая группа представляет собой стерол, такой как холестерол.
В различных воплощениях конъюгирующая группа содержит или состоит из положительно заряженного полимера, такого как положительно заряженные пептиды, например, 1-50, например, 2-20, например, 3-10 аминокислотных остатков в длину и/или полиалкиленовый оксид, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоль - см. WO 2008/034123, таким образом, включенный посредством ссылки. Приемлемый положительно заряженный полимер, такой как полиалкиленоксид, может быть прикреплен к олигомеру по изобретению через линкер, такой как высвобождаемый линкер, описанный в WO 2008/034123.
Олигомеры и олигомерные конъюгаты по настоящему изобретению могут включать в качестве конъюгирующей группы соответствующую лиганд-связывающую молекулу. Например, олигонуклеотиды могут быть конъюгированы для терапевтического введения лиганд-связывающих молекул, которые распознают молекулы клеточной поверхности, такие как согласно международной заявке на патент WO 91/04753. Лигандсвязывающая молекула может содержать, например, антитело к антигену клеточной поверхности, антитело к рецептору клеточной поверхности, фактор роста, имеющий соответствующий рецептор клеточной поверхности, антитело к такому фактору роста, или антитело, которое распознает комплекс фактора роста и его рецептора. Способы конъюгирования лиганд-связывающих молекул с олигонуклеотидами описаны подробно в WO 91/04753. Более того способы конъюгирования и способы улучшения клеточного захвата, которые могут быть применены, описаны в следующих международных заявках на патент WO 96/40961, WO 99/64449, WO 99/02673, WO 98/03533, WO 00/15265 и патентах США 5856438 и 5138045.
Посредством дальнейшего примера конъюгирующая группа может представлять собой ростовой фактор, такой как трансферрин или фолат. Комплексы трансферрин-полилизин-олигонуклеотид или комплексы фолат-полилизин-олигонуклеотид могут быть получены для захвата клетками, экспрессирующими высокие уровни рецептора трансферрина или фолата. Получение трансферриновых комплексов в качестве компонентов-носителей, усиливающих захват олигонуклеотидов клетками описано Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Клеточная доставка фолат-макромолекулярных конъюгатов посредством эндоцитоза, опосредованного фолатным рецептором, включая доставку антисмыслового олигонуклеотида, описана Low et al., патент США 5108921. Также см. Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991).
Целевая нуклеиновая кислота/ последовательность-мишень.
В предпочтительных аспектах термины целевая нуклеиновая кислота и последовательностьмишень, как употреблено в данном документе, относятся к ДНК или РНК, кодирующим полипептид НВх или HBsAg, такой как последовательность, содержащаяся внутри любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Термины целевая нуклеиновая кислота и последовательность-мишень, таким образом, включают НВх- или HBsAg-кодирующие нуклеиновые кислоты или их варианты естественного происхождения и РНК нуклеиновые кислоты, полученные из них, предпочтительно мРНК, такую как премРНК, хотя предпочтительно зрелую мРНК. В некоторых воплощениях, например, при применении в исследовании или диагностике целевая нуклеиновая кислота или последовательность-мишень может представлять собой кДНК или синтетический олигонуклеотид, полученный из вышеупомянутых ДНК или РНК нуклеиново-кислотных мишеней. Олигомер по изобретению предпочтительно способен гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой.
Идентичность/гомология.
Как употреблено в данном документе, термины гомологичный и гомология являются взаимозаменяемыми с терминами идентичный и идентичность.
Соответствующий/соответствовать.
Термины соответствующий и соответствовать относятся к сравнению между нуклеотидной последовательностью олигомера (т.е. нуклеооснованию или последовательности нуклеооснований) или его непрерывной нуклеотидной последовательности и эквивалентной нуклеотидной последовательности, дополнительной последовательности, выбранной из или i) субпоследовательности, обратного комплемента нуклеиново-кислотной мишени, такой как мРНК, кодирующей последовательность целевого белка, такую как любая последовательность мРНК внутри SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3; и/или ii) последовательности любой специфичной нуклеотидной последовательности, предложенной в данном документе, или ее субпоследовательности. Нуклеотидные аналоги сравнивают
- 16 034924 непосредственно с их эквивалентом или соответствующими нуклеотидами. Последовательность, которая соответствует дальнейшей последовательности i) или ii), обычно идентична сверх длины первой последовательности (такой как непрерывная нуклеотидная последовательность) или, как описано в данном документе, может в некоторых воплощениях быть по меньшей мере на 80% гомологичной соответствующей последовательности, например по меньшей мере на 85% гомологичной, по меньшей мере на 90% гомологичной, по меньшей мере на 91% гомологичной, по меньшей мере на 92% гомологичной, по меньшей мере на 93% гомологичной, по меньшей мере на 94% гомологичной, по меньшей мере на 95% гомологичной, по меньшей мере на 96% гомологичной, например по меньшей мере на 100% гомологичной (идентичной). Процент идентичности последовательности может быть вычислен за счет подсчета числа выравненных нуклеотидов, которые идентичны между двумя последовательностями, разделенного на общее число звеньев олигомера и умноженное на 100.
Термины соответствующий нуклеотидный аналог и соответствующий нуклеотид предназначены для обозначения того, что нуклеотид в последовательности нуклеотидного аналога и нуклеотид естественного происхождения идентичны. Например, в случае, когда 2-дезоксирибозное звено нуклеотида связано с аденином, соответствующий нуклеотидный аналог содержит пентозное звено (отличное от 2-дезоксирибозы), связанное с аденином.
Комплементарность.
Термин комплементарность означает, что две последовательности комплементарны в случае, когда последовательность один связывается антипараллельно с другой последовательностью, где 3'-конец каждой последовательности связывается с 5'-концом другой последовательности, и каждый A, T(U), G и С одной последовательности затем выравнен с T(U), А, С и G, соответственно другой последовательности. Обычно комплементарная последовательность олигонуклеотида по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно на 100% комплементарна определенной последовательности.
При определении степени комплементарности между олигомерами по изобретению (или их участками) и последовательностью-мишенью, такой как последовательность-мишень НВх или HBsAg, степень комплементарности (также гомологичности или идентичности) выражают в процентах идентичности (или процентах гомологичности) между последовательностью олигомера (или ее участком) и последовательностью целевого участка (или обратного комплемента целевого участка), которая наилучшим образом выравнена с ней. Процент вычисляют на основании подсчета числа выравненных оснований, которые идентичны между двумя последовательностями, разделив на общее число непрерывных звеньев олигомера и умножив на 100. При таком сравнении, если существуют гэпы, предпочтительно чтобы скорее такие гэпы не совпадали, чем области, где число звеньев внутри гэпа отличается между олигомером по изобретению и целевым участком.
В частности, термин комплементарность означает способность к спариванию нуклеотидов между первой нуклеиновой кислотой и второй нуклеиновой кислотой. Две последовательности комплементарны в случае, когда одна может антипараллельно связываться с другой последовательностью, где 3'-конец каждой последовательности связывается с 5'-концом другой последовательности, и каждое нуклеооснование A, T(U), G и С одной последовательности затем выравнивают с T(U), А, С и G соответственно другой последовательности. При определении степени комплементарности между олигомерами по изобретению (или их участками) и последовательностью-мишенью, такой как последовательность-мишень НВх или HBsAg, степень комплементарности выражают в виде процента комплементарности между последовательностью олигомера (или ее участком) и последовательностью целевого участка, которая наилучшим образом выравнена с ней. Процент вычисляют на основании подсчета числа выравненных оснований, которые формируют пары между двумя последовательностями, разделив на общее число непрерывных звеньев олигомера и умножив на 100. При таком сравнении нуклеооснование/нуклеотид, который не выравнен, называют несовпадением. Обычно комплементарная последовательность олигонуклеотида по настоящему изобретению по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 100%, комплементарна определенной последовательности.
Термин комплементарная последовательность в отношении полинуклеотидной последовательности относится к нуклеотидной последовательности в другой молекуле нуклеиновой кислоты на основании правила спаривания оснований. В частности, термин или подобные термины относятся к гибридизации или спариванию нуклеотидов между нуклеотидами или нуклеиновыми кислотами, такими как, например, между двумя цепями молекулы двухцепочечной ДНК или между олигонуклеотидным праймером и сайтом связывания праймера на одноцепочечной нуклеиновой кислоте, подлежащей секвенированию или амплификации. Комплементарные нуклеотиды обычно представляют собой А и Т (или А и U) или С и G. Две одноцепочечные молекулы РНК или ДНК являются, по существу, комплементарными в случае, когда нуклеотиды одной цепи, оптимально выравненные и сравненные и с соответствующими нуклеотидными инсерциями или делениями, парны по меньшей мере приблизительно на 95% нуклеотидам другой цепи, обычно по меньшей мере приблизительно на 98% и более предпочтительно от приблизительно 99 до приблизительно 100%. Комплементарность полинуклеотидных последовательностей мо
- 17 034924 жет быть идентифицирована посредством различных способов, включая применение хорошо известных компьютерных алгоритмов и программного обеспечения, например программы BLAST.
Обратно комплементарный/обратный комплемент/обратная комплементарность.
Термины обратный комплемент и обратная комплементарность употребляют в данном документе взаимозаменяемо с терминами комплементарный и комплементарность.
Несовпадение.
Термин несовпадение, который иногда относится к не комплементарному нуклеооснованию, относится к нуклеооснованию или нуклеотиду в данной позиции в первой нуклеиновой кислоте, который не может быть спарен по Уотсону-Крику с соответствующим нуклеооснованием или нуклеотидом во второй нуклеиновой кислоте, в случае, когда первая нуклеиновая кислота выравнена со второй нуклеиновой кислотой. Первая нуклеиновая кислота может, например, представлять собой олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению и вторая нуклеиновая кислота может представлять собой, например, последовательность-мишень. В олигомере или олигомерном конъюгате, содержащем множественные несовпадения, несовпадения могут или быть прилегающими друг к другу, или быть разбросанными.
Варианты естественного происхождения.
Термин варианты их естественного происхождения относится к вариантам последовательностимишени, которая существует в природе внутри определенной таксономической группы, такой как генотипы A-HHBV. Обычно в случае, когда рассматриваются варианты естественного происхождения полинуклеотида термин также может охватывать любой аллельный вариант последовательности-мишени, кодирующей геномную ДНК, которая обнаруживается посредством хромосомных транслокаций или дупликаций и РНК, такую как мРНК, полученную из нее. Варианты естественного происхождения могут также включать варианты, полученные в результате альтернативного сплайсинга последовательностимишени мРНК. В случае ссылки на специфичную полипептидную последовательность, например, термин также включает формы белка естественного происхождения, которые в следствии этого могут быть процессированы, например посредством ко-или посттрансляционных модификаций, таких как расщепление сигнального пептида, протеолитическое расщепление, гликозилирование и т.д.
Расположенный ниже.
Как употреблено в данном документе, термин расположенный ниже при употреблении со ссылкой на направление вдоль нуклеотидной последовательности означает в направлении от 5'- к 3'-концу. Аналогично, термин расположенный выше означает направление от 3'- к 5'-концу.
LNA.
Термин LNA относится к бициклическому нуклеозидному аналогу, известному как закрытая нуклеиновая кислота. Он может относиться к звену LNA или в случае применения в контексте нуклеотида LNA, LNA относится к олигонуклеотиду, содержащему один или более бициклический нуклеотидный аналог. Нуклеотиды LNA характеризуются присутствием линкерной группы (такой как мостик) между С2' и С4' кольца рибозы, например, как показано в качестве бирадикалов R -R , как описано ниже.
Как употреблено в данном документе, термины LNA олигонуклеотид и LNAмодифицированный олигонуклеотид включают любой олигонуклеотид или полностью, или частично модифицированный при помощи звеньев LNA. Таким образом, LNA-модифицированный олигонуклеотид может полностью состоять из звеньев LNA или LNA-модифицированный олигонуклеотид может содержать одно звено LNA.
LNA, примененная в соединениях олигонуклеотида по изобретению, предпочтительно обладают структурой формулы I
Формула 1 где для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации;
X выбран из -О-, -S-, -N(Rn*)-, -C(R6R6*)-, такой как в некоторых воплощениях -О-;
В выбран из водорода, возможно замещенного Ci-4-алкокси, возможно замещенного Cl-4алкила, возможно замещенного C1-4ацилокси, нуклеооснований, включая естественного происхождения и аналогов нуклеооснваний, ДНК интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатных группы, репортерных групп, и лигандов; предпочтительно В является нуклеооснованием или аналогом нуклеооснования;
Р означает межнуклеотидную связь с прилегающим звеном, или 5'-терминальную группу, такую как межнуклеотидная связь, или 5'-терминальную группу, включающую заместитель R5 или эквивалентно применяемый заместитель R ;
Р* обозначает межнуклеотидную связь с прилегающим звеном, или 3'-терминальную группу;
- 18 034924
4* 2*
R и R вместе обозначают бивалентную линкерную группу, состоящую из 1-4 групп/атомов, выбранных из -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- и >C=Z, где Z выбран из -O-, -S-u-N(Ra)- и Ra и Rb, каждый независимо, выбраны из водорода, возможно замещенного C1-12алкила, возможно замещенного С2-12алкенила, возможно замещенного С2-12алкинила, гидрокси, возможно з амещенного ^-^алкокси, С2-12алкоксиалкила, ^-^алкенилокси, карбокси, ^-^алкоксикарбонила, C1-12алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6алкил)аминокарбонила, амино-С1-6алкил-минокарбонила, моно- и ди(С1-6алкил)амино-С1-6алкиламинокарбонила, С1-6алкилкарбониламино, карбамидо, C1-6алканоилокси, сульфоно, С1-6алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С1-6алкилтио, галогена, ДНК интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатных групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть возможно замещены и где два геминальных заместителя Ra и Rb вместе могут означать возможно замещенный метилен (=СН2), где для всех хиральных центров, асимметричные группы могут быть обнаружены или в R-, или в S-ориентации; и каждый из заместителей R1*, R2, R3, R5, R5*, R6 и R6*, который присутствует, независимо выбран из водорода, возможно замещенного С1-12алкила, возможно замещенного С2-12алкенила, возможно замещенного С2-12алкинила, гидрокси, С1-12алкокси,С2-12алкоксиалкила, С2-12алкенилокси, карбокси, С1-12алкоксикарбонила, С1-12алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6алкил)аминокарбонила, амино^^алкиламинокарбонила, моно- и ди^^алкил^мино-^^алкиламинокарбонила, ^^алкилкарбониламино, карбамидо, C1-6алканоилокси, сульфоно, C1-6алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, ^алкил™, галогена, ДНК интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатных групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть возможно замещены и где два геминальных заместителя вместе могут означать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен; где RN выбран из водорода и C1-4алкила, и где два прилегающих (не геминальных) заместителя могут обозначать дополнительную связь, приводящую к двойной связи; и RN*, в случае когда присутствует и не вовлечен в бирадикал, выбран из водорода и C1-4алкила;
и его основных солей или солей добавления кислоты.
Для всех хиральных центров, асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации.
4* 2*
В некоторых воплощениях R и R вместе означают бирадикал, состоящий из функциональных групп, выбранных из группы, состоящей из C(RaRb)-C(RaRb)-, C(RaRb)-O-, C(RaRb)-NRa-, C(RaRb)-S- и C(RaRb)-C(RaRb)-O-, где каждый Ra и Rb может быть выбран независимо.
В некоторых воплощениях Ra и Rb может быть независимо выбран из группы, состоящей из водорода и C1-6алкила, такого как метил, например водорода.
В некоторых воплощениях R4* и Р2*вместе означают бирадикал -О-С^С^ОСН^^Юметоксиэтилбициклическую нуклеиновую кислоту (Seth et al., 2010, J. Org. Chem.) или в R- или в S-конфигурации.
В некоторых воплощениях R4* и R2* вместе означают бирадикал -О-СЩСН^НД-^Юэтилбициклическую нуклеиновую кислоту (Seth et al., 2010, J. Org. Chem.) - или в R-, или в S-конфигурации.
4* 2*
В некоторых воплощениях R и R вместе означают бирадикал -О-СН(СН3)- - или в R-, или в S-конфигурации. В некоторых воплощениях R4* и R2* вместе означают бирадикал -О-СН2-О-СН2- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem.).
В некоторых воплощениях R4* и R2* вместе означают бирадикал -O-NR-CH3- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem.).
В некоторых воплощениях звенья LNA обладают структурой, выбранной из следующей группы:
(R,S)-cEt (R,S)-cMOE (7?,S)-5'-Me-LNA
1* 2 3 5 5*
В некоторых воплощениях R , R , R , R , R независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, С1-6алкила, замещенного C1-6алкила, С2-6алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила, ^^алкоксила, замещенного C1-6алкоксила, ацила, замещенного ацила, C1-6аминоалкила или замещенного C1-6аминоалкила. Для всех хиральных заместителей асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации.
1* 2 3 5 5*
В некоторых воплощениях R , R , R , R , R представляют собой водород.
В некоторых воплощениях R1*, R2, R3 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C1-6алкила, замещенного C1-6алкила, С2-6 алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила, ^^алкоксила, замещенного ^^алкоксила, ацила, замещенного ацила,
- 19 034924
С1_баминоалкила или замещенного С1_баминоалкила. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации.
В некоторых воплощениях R1 , R2, R3 представляют собой водород.
В некоторых воплощениях R5 и R5 каждый независимо выбраны из группы, состоящей из Н, -СН3, -СН2-СН3,- СН2-О-СН3 и -СН=СН2. Соответственно в некоторых воплощениях или R5, или R5 представляют собой водород, где другая группа (R5 или R5 соответственно) выбрана из группы, состоящей из C1-5-алкила, С2-6алкенила, С2-6алкинила, замещенного C1-6алкила, замещенного С2-6алкенила, замещенного С2-6алкинила или замещенного ацила (-С(=О)-); где каждая замещенная группа является моно- или полизамещенной при помощи заместителей, выбранных из галогена, C1-6алкила, замещенного C1-6алкила, С2-6алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила, замещенного С2-6алкинила, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 или N(H)C(=X)N(H)J2, где X представляет собой О или S; и каждый J1 и J2 представляет собой независимо Н, ^^алкил, замещенный C1-6алкил, С2-6алкенил, замещенный С2-6алкенил, С2-6алкинил, замещенный С2-6алкинил, C1-6аминоалкил, замещенный C1-6аминоалкил или защитную группу. В некоторых воплощениях или R5, или R5 замещены ^^алкилом. В некоторых воплощениях или R5, или R5 замещен метиленом, где группа предпочтительных заместителей включает одну или более группу, независимо выбранную из F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ, J2 или N(H)C(O)N(H)J2. В некоторых воплощениях каждый J1 и J2 независимо представляют собой Н или C1-6алкил. В некоторых воплощениях или R5 или R5 представляет собой метил, этил или метоксиметил. В некоторых воплощениях или R5, или R5 представляют собой метил. В дальнейшем воплощении или R5, или R5 представляет собой этиленил. В некоторых воплощениях или R5, или R5 представляет собой замещенный ацил. В некоторых воплощениях или R5, или R5* представляет собой C(=O)NJ1J2. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации. Такие 5' модифицированные бициклические нуклеотиды раскрыты в WO 2007/134181, который таким образом включен во всей полноте посредством ссылки.
В некоторых воплощениях В представляет собой нуклеооснование, включая аналоги нуклеооснований и нуклеооснования естественного происхождения, такие как пуринил и пиримидин или замещенный пуринил и замещенный пиримидин, такие как нуклеооснование, упомянутое в настоящем документе, выбранное из группы, состоящей из аденина, цитозина, тимина, аденина, урацила и/или модифицированного или замещенного нуклеооснования, такого как 5-тиазоло-урацил, 2-тио-урацил, 5-пропинил-урацил, 2'тио-тимин, 5-метилцитозин, 5-тиозоло-цитозин, 5-пропинил-цитозин и 2,6-диаминопурин.
В некоторых воплощениях R4 и R2 вместе означают бирадикал, выбранный m-C(RaRb)-O-, т?сТ?Д П ГТРСР'/ (VOtf П iVT?aT?b7 П П ГТРСР'/ п
-C(R R )-C(R R )-O-, -C(R R )-C(R R )-C(R R )-O-, -C(R R )-O-C(R R )-, -C(R R )-O-C(R R )-O-, CVPaPb^ Г7РсрА C7PaPb^ C7PCPd^ Г7РеР^ ГГРсрА iVPaPb4 МЕРА
-C(R R )-C(R R )-, -C(R R )-C(R R )-C(R R )-, C(R )=C(R )-C(R R )-, -C(R R )-N(R )-, -C(R R )-C(R R )-N(R )-, -C(R R )-N(R )-O- и -C(R R )-S-, -C(R R )-C(R R )-S-, где R , R , R , R , R и R , каждый независимо, выбраны из водорода, возможно замещенного С1-12алкила, возможно замещенного ^-^алкенила, возможно замещенного С2-12алкинила, гидрокси, С1-12алкокси, C2-12алкоксиалкила, С2-12алкенилокси, карбокси, С1-12алкоксикарбонила, С1-1-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6)алкиламинокарбонила, амино-С1-6алкиламинокарбонила, моно- и ди(С1-6алкил)амино-С1-6алкиламинокарбонила, C1-6алкилкарбониламино, карбамидо, ^^алканоилокси, сульфоно, C1-6алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, ^^алкилтю, галогена, ДНК интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатных групп, репортерных групп и лигандов, где арил и гетероарил могут быть возможно замещены и где два геминальных заместителя Ra и Rb вместе могут означать возможно замещенный метилен (=СН2). Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации.
В дальнейшем воплощении R4 и R2 вместе означают бирадикал (бивалентную группу), выбранный из -СН2-О-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -СН2-СН2-О-, -СН2-СН(СН3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -СНг-СНг-СНг-О-, -СН2-СН2-СН(СН3)-, -СН=СН-СН2-, -СН2-О-СН2-О-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -СН2-О-СН2-, -СН(СН3)-О-и -СН(СН2-О-СН3)-О- и/или -СН2-СН2- и -СН=СН-. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или S-ориентации.
В некоторых воплощениях R4* и R2* вместе означают бирадикал C(RaRb)-N(RC)-O-, где Ra и Rb независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, С1-6алкила, замещенного С1-6алкила, С2-6алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила, C1-6алкоксила, замещенного C1-6алкоксила, ацила, замещенного ацила, C1-6аминоалкила или замещенного C1-6аминоалкила, такого как водород, и где Rc выбран из группы, состоящей из водорода, галогена C1-6алкила, замещенного C1-6алкила, С2-6алкенила, алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила, ^^алкоксила, замещенного C1-6алкоксила, ацила, замещенного ацила, C1-6аминоалкила или замещенного ^^аминоалкила, такого как водород.
В некоторых воплощениях R4* и R2* вместе означают бирадикал C(RaRb)-O-C(RCRd)-O-, где Ra, Rb, Rc и Rd независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, C1-6алкила, замещенного C1-6алкила, С2-6алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила,
- 20 034924
С1.6алкоксила, замещенного С|-6алкоксила. ацила, замещенного ацила, С|-6аминоалкила или замещенного С1_баминоалкила, например водорода.
В некоторых воплощениях R4 и R2 формируют бирадикал -CH(Z)-O-, где Z выбран из группы, состоящей из C1-6алкила, С2-6алкенила, С2-6алкинила, замещенного ^^алкила, замещенного С2-6алкенила, замещенного С2-6алкинила, ацила, замещенного ацила, замещенного амида, тиола или замещенного тио; и где каждая из замещенных групп независимо является моно или полизамещенной возможно защитными замещающими группами, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 и CN, где каждый J1, J2 и J3 независимо представляет собой Н или C1-6алкил и X представляет собой О, S или NJ1. В некоторых воплощениях Z представляет собой C1-6алкил или замещенный C1-6алкил. В некоторых воплощениях Z представляет собой метил. В некоторых воплощениях Z замещен ^^алкилом. В некоторых воплощениях упомянутая замещающая группа представляет собой C1-6алкокси. В некоторых воплощениях Z представляет собой СН3ОСН2-. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации. Такие бициклические нуклеотиды раскрыты в US 7399845, который, таким образом, включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых воплощениях R1 , R2, R3, R5, R5 представляют собой водород. В некоторых воплощениях R1 , R2, R3 представляют собой водород и один или оба из R5, R5 могут представлять собой иное, чем водород, как описано выше и в WO 2007/134181.
В некоторых воплощениях R4 и R2 вместе означают бирадикал, который содержит замещенную аминогруппу в мостике, например состоит из или содержит бирадикал -CH2-N(Rc)-, где Rc представляет 4* 2* собой C1-12алкилокси. В некоторых воплощениях R и R вместе означают бирадикал -Cq3q4-NOR-, где q3 и q4 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, ^^алкила, замещенного C1-6алкила, С2-6алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила, C1-6алкоксила, замещенного C1-6алкоксила, ацила, замещенного ацила, C1-6аминоалкила или замещенного C1-6аминоалкила; где каждая замещенная группа является независимо моно или поли замещенной замещающими группами, независимо выбранными из галогена, OJ1, SJ1, NJ1J2, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2 или N(H)C(=X=N(H)J2, где X представляет собой О или S и каждый из J1 и J2 независимо представляет собой, Н, ^^алкил, С2-6алкенил, С2-6алкинил, C1-6аминоалкил или защитную группу. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации. Такие бициклические нуклеотиды раскрыты в WO 2008/150729, который включен в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
1* 2 3 5 5*
В некоторых воплощениях R1 , R2, R3, R5, R5 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, галогена, ^^алкила, замещенного ^^алкила, С2-6алкенила, замещенного С2-6алкенила, С2-6алкинила или замещенного С2-6алкинила, ^^алкоксила, замещенного C1-6алкоксила, ацила, замещенного ацила, 1* 2 3 5 5*
C1-6аминоалкила или замещенного C1-6аминоалкила. В некоторых воплощениях R , R , R , R , R представляют собой водород. В некоторых воплощениях R1 , R2, R3 представляют собой водород и один или более R5, R5* могут представлять собой иное, чем водород, как описано выше и в WO 2007/134181. В некоторых воплощениях R4 и R2 вместе означают бирадикал (бивалентнуюгруппу) C(RaRb)-O-, где Ra и Rb каждый независимо представляют собой галоген, С1-С12-алкил, замещенный С1-С12-алкил, С2-С12алкенил, замещенный С2-С12-алкенил, C2-C12-алкинил, замещенный С2-С12-алкинил, С1-С12-алкокси, замещенный С1-С12-алкокси, OJ1SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 или N(H)C(=S)NJ1J2 или Ra и Rb вместе представляют собой =C(q3)(q4); q3 и q4, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, С1-С12-алкил или замещенный С1-С12-алкил; каждая замещенная группа независимо является моно или полизамещенной замещающей группой, независимо выбранной из галогена, С1-С6-алкила, замещенного С1-С6-алкила, С2-С6-алкенила, замещенного С2-С6-алкенила, С2-С6-алкинила, замещенного С2-С6-алкинила, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 или N(H)C(=S)NJJ2 и каждый J1 и J2 независимо представляет собой Н, С1-С6-алкил, замещенный С1-С6-алкил, С2-С6-алкенил, замещенный С2-С6-алкенил, С2-С6-алкинил, замещенный С2-С6-алкинил С2-С6-алкинил, С1-С6-аминоалкил, замещенный С1-С6-аминоалкил или защитную группу. Такие соединения раскрыты в WO 2009/006478A, включенный в данный документ во всей полноте посредством ссылки.
4* 2*
В некоторых воплощениях R и R формируют бирадикал -Q-, где Q представляет собой C(q1)(q2)C(q3)(q4), C(q1)=C(q3), C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4) или C(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]; qb q2, q3, q4, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, С1-12алкил, замещенный С1-12алкил, С2-12алкенил, замещенный С1-12алкокси, OJ1, SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)-NJ1J2, C(=O)J1, C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 или N(H)C(=S)NJ1J2; каждый J1 и J2 независимо представляют собой Н, C1-6алкил, С2-6алкенил, С2-6алкинил, C1-6аминоалкил или защитную группу; и возможно, где в случае, когда Q представляет собой C(q1)(q2)(q3)(q4) и один из q3 или q4 представляет собой СН3, по меньшей мере один из других q3 или q4 или один из q1 и q2 представляют собой иное, чем Н.
1* 2 3 5 5*
В некоторых воплощениях R1 , R2, R3, R5, R5 представляют собой водород. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации. Такие бициклические нуклеотиды раскрыты в WO 2008/154401, который включен в данный документ во всей своей полноте посред1* 2 3 5 5* ством ссылки. В некоторых воплощениях R1 , R2, R3, R5, R5 независимо выбраны из группы, состоящей
- 21 034924 из водорода, галогена, С1_6алкила, замещенного С1_6алкила, С2-6алкенила, замещенного С2_6алкенила, С2_6алкинила или замещенного С2-6алкинила, С1-6алкоксила, замещенного С1-6алкоксила, ацила, замещенного ацила, C1-6аминоалкила или замещенного C1-6аминоалкила. В некоторых воплощениях R1 , R2, R3, 5 5* 1*23
R , R представляют собой водород. В некоторых воплощениях R , R , R представляют собой водород и один или оба R5, R5 могут представлять собой иное, чем водород, как описано выше и в WO 2007/134181 или WO 2009/067647 (аналоги альфа-Ь-бициклических нуклеиновых кислот).
Дополнительные бициклические нуклеозидные аналоги и их применение в антисмысловых олигонуклеотидах раскрыты в WO2011/115818, WO 2011/085102, WO 2011/017521, WO 09/100320, WO 10/036698, WO 09/124295 и WO 09/006478.
Такие нуклеозидные аналоги могут в некоторых аспектах быть полезны в соединениях по настоящему изобретению.
В некоторых воплощениях LNA, примененная в олигонуклеотидных соединениях по изобретению, предпочтительно обладает структурой общей формулы II
Формула II где Y выбран из группы, состоящей из -О-, -СН2О-, -S-, -NH-, N(Re) и/или -СН2-;
Z и Z* независимо выбраны из межнуклеотидной связи, RH, терминальной группы или защитной группы;
В представляет собой нуклеотидную группу естественного или неестественного происхождения (нуклеооснование) и RH выбран из водорода и С1-4-алкила;
Ra, RbRc, Rd и Re возможно независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного С1-12алкила, возможно замещенного С2-12алкенила, возможно замещенного С2-12алкинила, гидрокси, С1-12алкокси, С2-12алкоксиалкила,С2-12алкенилокси, карбокси, С1-12алкоксикарбонила, С1-12алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С1-6алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С1-6алкил)аминокарбонила, амино-С1-6алкиламинокарбонила, моно- и ди(С1-6алкил)амино-С1-6алкил-аминокарбонила, С1-6алкил-карбониламино, карбамидо, С1-6алканоилокси, сульфоно, С1-6алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С1-6алкилтио, галогена, ДНК интеркаляторов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатных групп и лигандов, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены и где два геминальных заместителя Ra и Rb вместе могут означать возможно замещенный метилен (=СН2); и RH выбран из водорода и С1-4-алкила.
В некоторых воплощениях Ra, RbRc, Rd и Re возможно независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и С1-6алкила, такого как метил. Для всех хиральных центров асимметричные группы могут быть или в R-, или в S-ориентации, например два примера стереохимических изомеров включают бета-D и альфа-L изоформы, которые могут быть проиллюстрированы следующим образом:
- 22 034924
Конкретные примеры звеньев LNA приведены ниже:
P-D-okcm-LNA
β-D-TMO-LNA
β-0-3ΜΜΗ0-Ι_ΝΑ
Термин тио-LNA подразумевает закрытый нуклеотид, в котором Y в общей формуле, упомянутой выше, выбран из S или -CH2-S-. Тио-LNA может быть как в бета-D, так и в альфаЪ-конфигурации.
Термин амино-LNA подразумевает закрытый нуклеотид, в котором Y в общей формуле, упомянутой выше, выбран из -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)- и -CH2-N(R)-, где R выбран из водорода и С1-4алкила. Амино-LNA может быть как в бета-D, так и в альфа^-конфигурации.
Термин окси-LNA подразумевает закрытый нуклеотид, в котором Y в общей формуле, упомянутой выше, представляет собой -О-. Окси-LNA может быть как в бета-D, так и в альфаЪ-конфигурации.
Термин ENA подразумевает закрытый нуклеотид, в котором Y в общей формуле, упомянутой выше, представляет собой -СН2-О- (где атом кислорода -СН2-О- прикреплен к 2'-позиции относительно основания В). Re представляет собой водород или метил.
В некоторых примерах воплощений LNA выбрана из бета-D-окси-LNA, а.льфа-1 .-окси-I .NA, бета-Dамино-LNA и бета-D-тио-LNA, в частности бета-D-окси-LNA.
LNA-модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды могут быть применены в комбинациях. Например, смесь различных LNA-модифицированных олигонуклеотидов, направленных против различных участков одного и того же гена, может быть введена одновременно или раздельно.
Хэдмер (англ. - headmer).
Хэдмер определен как олигомер, содержащий участок X' и участок Y', который прилегает к нему, с 5'-звена участка Y', связанного с З'-звеном участка X'. Участок X' содержит непрерывный участок нуклеозидных аналогов, не привлекающих РНКазу, и участок Y' содержит непрерывный участок (такой как имеющий по меньшей мере семь непрерывных звеньев) звеньев ДНК или звеньев нуклеозидного аналога, распознаваемых и расщепляемых РНКазой.
Тэйлмер (англ. - tailmer).
Тэйлмер определен как олигомер, содержащий участок X и участок Y, который прилегает к нему, с 5'-звена участка Y, связанного с З'-звеном участка X. Участок X содержит непрерывный участок (такой как имеющий по меньшей мере семь непрерывных звеньев) звеньев ДНК и звеньев нуклеозидного аналога, распознаваемых или расщепляемых РНКазой и участок X содержит непрерывный участок нуклеозидных аналогов, не привлекающих РНКазу.
Химерные олигомеры/миксмеры.
Химерные олигомеры, называемые миксмеры состоят из альтернативной композиции (i) звеньев ДНК или звеньев нуклеозидного аналога, распознаваемых или расщепляемых РНКазой, и (ii) звеньев нуклеозидного аналога, не привлекающего РНКазу.
Фотохимически активные группы.
В настоящем контексте термин фотохимически активные группы относится к соединениям, которые способны подвергаться химическим реакциям под действием облучения светом. Иллюстративные примеры функциональных групп в данном документе представляют собой хиноны, в частности 6-метил1,4-нафтохинон, антрахинон, нафтохинон и 1,4-диметил-антрахинон, диазирин, ароматические азиды, бензофеноны, псоралены, диазо соединения и диазирино соединения.
Как употреблено в данном документе, основанный на означает, что олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, предпочтительно 90%, предпочтительно 95%, предпочтительно все нуклеотиды корового мотива или последовательности и
- 23 034924 возможно, где один или более нуклеотидов могут представлять собой модифицированный нуклеотид.
Соответственно, в определенных воплощениях термин основанный на означает, что олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит все нуклеотиды корового мотива или последовательности, и возможно где один или более нуклеотидов могут представлять собой модифицированный нуклеотид.
Для конкретных воплощений термин основанный на означает, что олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит все нуклеотиды корового мотива или последовательности, и где один или более нуклеотидов представляют собой модифицированный нуклеотид.
Для конкретных воплощений термин основанный на означает, что олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно все нуклеотиды корового мотива или последовательности, и где один или более нуклеотидов могут представлять собой модифицированный нуклеотид; и где упомянутый олигомер представляет собой гэпмер мотива X-Y-Z, где каждый из X и Z независимо представляет собой крыло, содержащее по меньшей мере один модифицированный нуклеотид и Y представляет собой центральный участок нуклеотидов.
Соответственно, для определенных воплощений, термин основанный на означает, что олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит все нуклеотиды корового мотива или последовательности, и где один или более нуклеотид может представлять собой модифицированный нуклеотид; и где упомянутый олигомер является гэпмером мотива X-Y-Z, где каждый X и Z независимо представляет собой крыло, содержащее по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, и Y представляет собой центральный участок нуклеотидов.
Стабильность
Термин стабильность в отношении образования дуплета или триплета обычно указывает на то, насколько сильно антисмысловой олигонуклеотид связывается со своей предполагаемой последовательностью-мишенью; в частности, стабильность означает свободную энергию образования дуплета или триплета при физиологических условиях. Температура плавления при стандартных условиях, например, как описано ниже, является удобной мерой стабильности дуплета и/или триплета. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по изобретению выбраны так, что имеют температуры плавления по меньшей мере 45°С, в случае измерения в 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 10 мМ водном растворе фосфатного буфера, рН 7,0 при концентрации цепей как антисмыслового олигонуклеотида, так и целевой нуклеиновой кислоты 1,5 мкМ. Таким образом, при применении при физиологических условиях образованию дуплета или триплета будет благоприятствовать состояние, при котором антисмысловой олигонуклеотид и мишень диссоциированы. Следует понимать, что стабильный дуплет или триплет может в некоторых воплощениях включать несовпадения между парами оснований и/или триплетами оснований в случае триплетов. Предпочтительно LNA модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды по изобретению формируют абсолютно совпадающие дуплеты и/или триплеты с их целевыми нуклеиновыми кислотами.
Сильный ингибитор.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат представляет собой сильный ингибитор, в частности НВх или HBsAg.
Как употреблено в данном документе, фраза сильный ингибитор относится к олигомеру с IC50 менее чем 5 нМ, как определено посредством трансфекционного анализа с применением липофектамина. В некоторых воплощениях IC50 составляет менее 4 нМ, например менее 2 нМ.
Сильный ингибитор, как употреблено в данном документе, посредством гимнозис, где гимнозис описывает доставку олигомера в культивированные клетки без применения трансфекционного агента, относится к IC50 менее чем 5 мкм в анализе гимнозиса или в in vivo AAV/HBV мышиной модели. В некоторых воплощениях IC50 составляет менее чем 2 мкм, например менее 1 мкм.
Лечить/лечение.
Термины лечить/лечение и т.д. включают одно или более из устранения, облегчения, предупреждения или детекции. В определенных воплощениях термины лечить/лечение и т.д. означают устранение или облегчение.
Термин облегчение включает облегчение симптомов и/или состояний, сопутствующих или ассоциированных с вирусным заболеванием.
Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к олигомерам или олигомерным конъюгатам, приемлемым для их применениям и способам их применения для устранения, облегчения, предупреждения или детекции вирусного заболевания.
Соответственно в определенных аспектах настоящее изобретение относится к олигомерам или олигомерным конъюгатам, приемлемым для и их применениям и способам их применения для устранения или облегчения вирусного заболевания.
В некоторых воплощениях термин лечение, как употреблено в данном документе, относится или к лечению существующего заболевания (например, заболевания или расстройства, как употреблено в данном документе), или предупреждению заболевания, т.е. профилактики. Поэтому следует понимать, что лечение, как рассмотрено в данном документе, может в некоторых воплощениях быть профилактиче
- 24 034924 ским.
Лечение заболевания или состояния у субъекта или лечение субъекта, имеющего заболевание или состояние, относящееся к подверганию индивидуума фармацевтическому лечению, например введению лекарственного средства, такому что по меньшей мере один симптом или состояние ослаблены или стабилизированы.
Пациент, нуждающийся в лечении, представляет собой пациента, страдающего или вероятно страдающего от заболевания.
Посредством профилактическое лечение заболевания или состояния у субъекта подразумевают снижение или элиминацию риска развития (т.е. инцидент) или снижение тяжести заболевания или состояния перед проявлением по меньшей мере одного симптома заболевания.
Агент.
Термин агент означает любое соединение, например антитело или терапевтический агент, детектируемую метку (например, маркер, метка или визуализирующее соединение).
Терапевтический агент.
Термин терапевтический агент означает любое соединение, обладающее биологической активностью. Терапевтические агенты могут быть полезны для лечения состояний или заболеваний. Конкретные агенты по изобретению могут представлять собой олигомеры. Конкретные терапевтические агенты могут представлять собой олигомеры или олигомерные конъюгаты по настоящему изобретению.
Доставка упомянутого олигомера в печень.
Как употреблено в данном документе, термин доставка упомянутого олигомера в печень относится к способу, посредством которого олигомер приводят в контакт или в близость с клетками или тканями печени. Это включает доставку олигомера в кровеносную сеть внутри или вокруг печени. Олигомер может быть доставлен или перенесен из участка попадания в тело к печени или тканям вокруг печени.
Доставка упомянутого олигомера к гепатоцитам.
Как употреблено в данном документе, термин доставка упомянутого олигомера к гепатоцитам относится к способу, которым олигомер приводят в контакт или в близость с гепатоцитом печени. Это включает доставку олигомера в кровяную сеть внутри или вокруг гепатоцита. Олигомер может быть доставлен или перенесен из участка попадания в тело к гепатоциту.
Вирусное заболевание.
Термин вирусное заболевание в контексте настоящего изобретения относится к любому расстройству или заболеванию, которое ассоциировано с вирусной инфекцией.
Фармацевтические носители/фармацевтически приемлемые носители.
Фармацевтические носители или фармацевтически приемлемые носители следует отличать от компонент-носитель по изобретению, как описано выше. Фармацевтический носитель и компонентноситель являются взаимоисключающими терминами в контексте настоящего изобретения.
Введение.
Термин введение предназначен для обозначения способа доставки, включая, но не ограничено, интраартериальное, интраназальное, интраперитонеальное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, чрескожноее или пероральное. Ежедневная доза может быть разделена на одну, две и более дозы в приемлемой форме, подлежащей введению один, два или более раз в течение периода времени.
Подробное описание изобретения
Введение.
Настоящее изобретение относится к олигомерам (также рассматриваемым в качестве олигомерных молекул) и/или олигомерным конъюгатам.
Олигомеры и олигомерные конъюгаты полезны для лечения вирусного заболевания.
В конкретных воплощениях олигомеры и олигомерные конъюгаты по изобретению способны модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV.
Олигомеры по изобретению могут быть конъюгированы с компонентом-носителем.
Предпочтительно компонент-носитель может быть способен к доставке олигомера к печени субъекта, подлежащего лечению.
Настоящее изобретение, таким образом, использует олигомеры и олигомерные конъюгаты для применения при модулировании функции нуклеиново-кислотных молекул, кодирующих НВх или HBsAg HBV, таких как HBV нуклеиново-кислотной молекулы, представленной в виде SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и вариантов таких нуклеомолекул естественного происхождения, кодирующих HBV НВх или HBV HBsAg.
Свойства олигомеров.
Олигомер или олигомер олигомерного конъюгата могут состоять из или содержать непрерывную нуклеотидную последовательность длиной 8-50, 8-30, 8-25, 8-20, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13 или 812 нуклеотидов, предпочтительно 8-16 нуклеотидов в длину, более предпочтительно длиной 10-20 нуклеотидов.
Для некоторых воплощений олигомер или олигомер олигомерного конъюгата могут содержать или состоять из непрерывной нуклеотидной последовательности длиной 10-50, например 10-30, 10-20, 10-18,
- 25 034924
10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13 или 10-12 нуклеотидов ну, предпочтительно длиной 10-20 нуклеотидов, более предпочтительно длиной 10-18 нуклеотидов, наиболее предпочтительно длиной 10-16 нуклеотидов.
Для некоторых воплощений олигомер или олигомер олигомерного конъюгата может содержать или состоять из непрерывной нуклеотидной последовательности длиной 12-50, например длиной 12-30, 1220, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14 или 12-13 нуклеотидов, предпочтительно длиной 12-16 нуклеотидов.
Для некоторых воплощений олигомер или олигомер олигомерного конъюгата могут содержать или состоять из непрерывной нуклеотидной последовательности длиной 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов.
Для некоторых воплощений олигомер или олигомерный компонент олигомерных конъюгатов по настоящему изобретению может содержать или состоять из непрерывной нуклеотидной последовательности всего длиной 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 непрерывных нуклеотидов.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности длиной всего 8-22, например 8-20, например 8-18, например, 8-17 или 8-16, непрерывных нуклеотидов.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности длиной всего 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непрерывных нуклеотидов.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности длиной всего 15 или 16 непрерывных нуклеотидов.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата по изобретению состоит из не более чем 22 нуклеотидов, например не более чем 20 нуклеотидов, например не более чем 18 нуклеотидов, например 15, 16 или 17 нуклеотидов.
В некоторых воплощениях, предпочтительно олигомер или олигомер олигомерного конъюагата по изобретению содержит менее 20 нуклеотидов.
Следует понимать, что в случае, когда диапазон приведен для длины олигомера или непрерывной нуклеотидной последовательности, он включает меньшую и большую длину, приведенную в диапазоне, например, (или между) 10-30, включают как 10, так и 30.
Длина олигонуклеотидных групп достаточна большая для уверенности в том, что специфичное связывание имеет место только с желаемым целевым полинуклеотидом, а не с другими случайными сайтами, как пояснено во многих ссылках, Rosenberg et.al., Международная заявка на патент PCT/US92/05305 или Szostak et al., Meth. Enzymol, 68:419-429 (1979). Верхний предел длины определен несколькими факторами, включая сложности и дороговизну синтеза и очистки олигомеров свыше 30-40 нуклеотидов в длину, большей толерантностью более длинных олигонуклеотидов к несовпадениям, чем более коротких, или из-за присутствия модификаций для усиления связывания или специфичности, или при желании связывания дуплета или триплета и т.п.
Олигомер или олигомер олигомерного конъюагата может содержать или состоять из простой последовательности нуклеотидов естественного происхождения, предпочтительно 2'-дезоксинуклеотидов (в данном документе обычно упоминаемы как ДНК), а также возможно рибонуклеотидов (обычно упоминаемых в данном документе как РНК) или комбинации таких нуклеотидов естественного происхождения и одного или более нуклеотидов не естественного происхождения, т.е. нуклеотидных аналогов. Такие нуклеотидные аналоги могут соответственно повышать аффинность олигомера к последовательности-мишени.
Примеры приемлемых и предпочтительных нуклеотидных предложены в WO 2007/031091 или упомянуты в данном документе.
Примеры нуклеотидных аналогов включают нуклеотиды, которые могут быть модифицированы. Примеры таких модификаций включают модификации сахарной группы для получения 2'-замещающей группы или для получения соединенной мостиковой связью (закрытая нуклеиновая кислота) структуры, которая повышает аффинность связывания и также может обеспечить повышенную устойчивость к нуклеазам. Данные модифицированные нуклеотидные аналоги могут, таким образом, быть усиливающими аффинность нуклеотидными аналогами.
Включение усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов в олигомер или олигомер олигомерного конъюгата, такого как LNA или 2'-замещенные сахара, позволяет уменьшить размер специфично связывающегося олигомера, а также могут уменьшать верхний предел размера олигомера до того, как будет иметь место его неспецифичное или ошибочное связывание.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог. В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога. В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюагата содержит 2-8 нуклеотидных аналога, например 6 или 7 нуклеотидных аналогов. В самых предпочтительных воплощениях по меньшей мере один из упомянутых нуклеотидных аналогов представляет собой закрытую нуклеиновую кислоту (LNA); например, по меньшей ме
- 26 034924 ре 2, 3 или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6, или по меньшей мере 7, или 8 нуклеотидных аналогов могут представлять собой LNA. В некоторых воплощениях все нуклеотидные аналоги могут представлять собой LNA.
Следует учитывать, что при ссылке на предпочтительный мотив нуклеотидной последовательности или нуклеотидную последовательность, которая состоит только из нуклеотидов олигомеры или олигомерные конъюгаты по изобретению, которые определены посредством этой последовательности, могут содержать соответствующий нуклеотидный аналог вместо одного или более нуклеотидов, присутствующих в упомянутой последовательности, такой как звенья
LNA или другие нуклеотидные аналоги, повышающие стабильность дуплета/Тт олигомера/дуплетамишени (т.е. усиливающие аффинность нуклеотидные аналоги).
Предпочтительный нуклеотидный аналог представляет собой LNA, такую как окси-LNA (такую как бета-П-окси-LNA, и альфа-Е-окси-LNA), и/или амино-LNA (такую как бета-П-амино-LNA и альфа-Lамино-LNA), и/или тио-LNA (такую как бета-О-тио-LNA и альфа-Е-тио-LNA), и/или ENA (такую как бета-D-ENA и альфа-L-ENA). Наиболее предпочтительна бета-П-окси-LNA.
В некоторых воплощениях нуклеотидные аналоги, присутствующие в олигомере или олигомере олигомерного конъюгата по изобретению (таком как участок W и участок Y гэпмеров, как упомянуто в данном документе), независимо выбраны, например, из звеньев 2'-О-алкил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, звеньев LNA, арабинонуклеиновой кислоты (АНК), звеньев 2'-фтор-АНК, звеньев HNA, звеньев ИНК (интеркалирующей нуклеиновой кислоты - Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002, 30:4918-4925, включенной в данный документ посредством ссылки) и звеньев 2'-МОЕ. В некоторых воплощениях существует только один из вышеупомянутых типов нуклеотидных аналогов, присутствующих в олигомере по изобретению или его непрерывной нуклеотидной последовательности.
В некоторых воплощениях нуклеотидные аналоги представляют собой 2'-О-метоксиэтил-РНК (2'-МОЕ), звенья 2'-фтор-ДНК или нуклеотидные аналоги LNA, и, например, олигонуклеотид по изобретению может содержать нуклеотидные аналоги, которые независимо выбраны из данных трех типов аналогов или могут содержать только один тип аналога, выбранного из трех типов. В некоторых воплощениях по меньшей мере один из упомянутых нуклеотидных аналогов представляет собой 2'-MOE-RNA, такой как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 2'-МОЕ-РНК нуклеотидные звенья. В некоторых воплощениях по меньшей мере один из упомянутых нуклеотидных аналогов представляет собой 2'-фтор-ДНК, такую как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 2'-фтор-ДНК нуклеотидных звена.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата по изобретению содержит по меньшей мере одно звено закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 звеньев LNA, например, 3-7 или 4 -8 звеньев LNA или 3, 4, 5, 6 или 7 звеньев LNA. В некоторых воплощениях все нуклеотидные аналоги представляют собой LNA.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата могут содержать как бета-П-окси-LNA, так и одно или более из следующих звеньев LNA: тио-LNA, амино-LNA, окси-LNA и/или ENA или в бета-D или альфа-L конфигурации или их комбинации. В некоторых воплощениях все цитозиновые звенья LNA представляют собой 5'-метил-цитозин.
В некоторых воплощениях изобретения олигомер или олигомер олигомерного конъюгата может содержать как звенья LNA, так и звенья ДНК. Предпочтительно общее число звеньев LNA и ДНК составляет 10-25, например 10-24, предпочтительно 10-20, предпочтительно 10-18, даже более предпочтительно 12-16. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотидная последовательность олигомера, такая как непрерывная нуклеотидная последовательность, состоит по меньшей мере из одной LNA, и оставшиеся нуклеотидные звенья представляют собой звенья ДНК.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата содержит только LNA нуклеотидные аналоги и нуклеотиды естественного происхождения (такие как РНК или ДНК, наиболее предпочтительно ДНК нуклеотиды), возможно с модифицированными межнуклеотидными связями, такими как фосфоротиоат.
В некоторых воплощениях любые несовпадения между нуклеотидной последовательностью олигомера и последовательностью-мишенью предпочтительно обнаруживают в участках вне усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов. Примеры таких участков вне усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов в гэпмерах включают участок X, как упомянуто в данном документе, и/или участок V, как упомянуто в данном документе, и/или участок Z, как упомянуто в данном документе, и/или в участке не модифицированных нуклеотидов в олигонуклеотиде, и/или в участках, которые являются 5' или 3' в отношении непрерывной нуклеотидной последовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата по изобретению не содержит РНК (звеньев). Предпочтительно олигомер или олигомер олигомерного конъюгата по изобретению представляет собой линейную молекулу или синтезирован в качестве линейной молекулы. Предпочтительно олигомер или олигомер олигомерного конъюгата представляет собой одноцепочечную молекулу и предпочтительно не содержит коротких участков, например, по меньшей мере из 3, 4 или 5 непрерывных нуклеотидов, которые комплементарны эквивалентным участкам внутри того же олигомера (т.е. дуплетам). В данном отношении олигомер или олигомер олигомерного конъюгата не является (по суще
- 27 034924 ству) двухцепочечным. В некоторых воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата, по существу, является одноцепочечным. В различных воплощениях олигомер или олигомер олигомерного конъюгата по изобретению может полностью состоять из непрерывного нуклеотидного участка. Таким образом, олигомер или олигомер олигомерного конъюгата, по существу, не является самокомплементарным.
Следовательно, в определенных аспектах изобретение предлагает олигомер или олигомер олигомерного конъюгата, обладающий олигомерным компонентом длиной 5-50, например, 5-30, или, например, 5-20, например, 8-30, например, 8-20, например, 8-18, например, 8-16, например, 10-16, например, 10-15, например, 12-16, например, 12-15 нуклеотидов, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность (первый участок) из всего по меньшей мере 5, например, по меньшей мере 8 нуклеотидов, где упомянутая непрерывная последовательность (первый участок) по меньшей мере на 80% (например, 85, 90, 95, 98 или 99%) гомологична участку, соответствующему обратно комплементарной последовательности гена НВх HBV или гена HBsAg HBV или мРНК, как любая последовательность внутри любой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 естественного происхождения. Таким образом, например, олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата гибридизуется с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность части любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, предпочтительно внутри любой SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Олигомер или олигомерный компонент может гибридизоваться с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность части последовательности, показанной в позиции с 200 по 1900 SEQ ID NO: 3). Олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может гибридизоваться с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, показанную в позиции с 1264 по 1598 или с 691 по 706 SEQ ID NO: 3. Олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может гибридизоваться с одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из следующих позиций в SEQ ID NO: 3: позиции 1-1944, позиции 157-1840, позиции 1196-1941, позиции 1376-1840 и позиции 3158-3182. Предпочтительно олигомерный конъюгат гибридизуется с молекулой одноцепочечной нуклеиновой кислоты с последовательностью, выбранной внутри позиции 15301598 SEQ ID NO: 3, в частности внутри позиции 1577-1598 SEQ ID NO: 3 и наиболее предпочтительно внутри позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3. Олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может гибридизоваться с молекулой одноцепочечной нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из позиций: 1264-1278; 1265-1277; 1530-1543; 1530-1544; 1531-1543; 1551-1565; 1551-1566; 1577-1589; 1577-1591; 1577-1592; 1578-1590; 1578-1592; 1583-1598; 1584-1598 и 1585-1598 или 670-706, 691-705; 691-706; 692-706; 693-706 и 694-706 SEQ ID NO: 3.
Предпочтительно олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может гибридизоваться с молекулой одноцепочечной нуклеиновой кислоты внутри позиции 1530-1598 SEQ ID NO: 3, более предпочтительно внутри позиций 1530-1543 или позиций 1577-1598 SEQ ID NO: 3.
Для конкретных воплощений изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, имеющий олигомер на основе корового мотива, выбранного из группы, состоящей из любой одной или более: GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6); CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19); AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834), которые способны модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV для лечения
- 28 034924 вирусного заболевания.
Олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более:
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO 303);
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO 301);
GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668);
AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308); CGAaccactgaACA (SEQ ID NO 297); CGCagtatggaTC (SEQ ID NO 300);
AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315); AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316);
GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 294);
CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO 295);
CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO 296);
CGAaccactgaAC (SEQ ID NO 298);
CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO 299); CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302); AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO 304);
GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO 305);
GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO 306);
GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 307);
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO 309); GAAccactgaaCAAA (SEQ ID NO 585);
CGAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 588) GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 628); TAGtaaactgagCCA (SEQ ID NO 678);
CGAaccactgAAC (SEQ ID NO 600);
AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и CGAaccactgAACA (SEQ ID NO 597), где прописные буквы означают звенья LNA и строчные буквы означают звенья ДНК.
В конкретных воплощениях олигомер или дополнительный олигомер или олигомерный компонент дополнительного олигомерного конъюгата может содержать последовательность, основанную на последовательности, выбранной из списка:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26) и AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27).
В другом воплощении последовательность мотива выбрана из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); и AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18)
В другом воплощении последовательность мотива выбрана из GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO: 13) GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 11) и CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 12).
- 29 034924
В другом воплощении последовательность мотива выбрана из AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO: 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO: 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 18); GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO: 19) и AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO: 27).
В другом воплощении последовательность мотива выбрана из CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO: 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO: 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO: 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO: 6); CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO: 8) и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO: 834).
В другом воплощении последовательность мотива выбрана из CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO: 9) и CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO: 10).
В другом воплощении последовательность мотива выбрана из AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO: 14) и GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO: 15).
В конкретных воплощениях олигомер или дополнительный олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать или состоять из последовательности, выбранной из группы, представленной ниже:
GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO 303);
GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO 301);
GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668);
AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308);
CGAaccactgaACA (SEQ ID NO 297);
CGCagtatggaTC (SEQ ID NO 300);
AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315);
AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316);
GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 294);
CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO 295);
CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO 296);
CGAaccactgaAC (SEQ ID NO 298);
CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO 299);
CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302);
AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO 304);
GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO 305);
GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO 306);
GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 307);
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO 309);
GAAccactgaaCAAA (SEQ ID NO 585);
CGAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 588)
GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 628);
TAGtaaactgagCCA (SEQ ID NO 678);
CGAaccactgAAC (SEQ ID NO 600);
AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и CGAaccactgAACA (SEQ ID NO 597).
где прописные буквы означают нуклеотидные аналоги усиливающие аффинность и строчные буквы означают звенья ДНК.
В другом воплощении последовательность выбрана из:
GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO 303);
GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO 301);
GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302);
AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO 304);
GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO 305);
GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO 306);
GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 307);
- 30 034924
GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 628);
AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308);
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO 309);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315);
AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316);
AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668).
В одном воплощении последовательность выбрана из:
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO 303);
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO 301);
GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668); и
AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308).
В одном воплощении последовательность выбрана из GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO: 303); GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 301); GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 618) и CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 302).
В другом воплощении последовательность выбрана из AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 310); AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 315); AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 316); GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO: 628); AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 668); AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 308); GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO: 306); GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 307); CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 309) и AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 317).
В другом воплощении последовательность выбрана из CGAaccactgaACA (SEQ ID NO: 297); GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO: 294); CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO: 295); CGAaccactgaaCAA (SEQ ID NO: 296); CGAaccactgaAC (SEQ ID NO: 298); CGAaccactgAACA (SEQ ID NO: 597) и TAGtaaactgagCCA (SEQ ID NO: 678).
В другом воплощении последовательность выбрана из CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO: 299) и CGCagtatggaTC (SEQ ID NO: 300).
В другом воплощении последовательность выбрана из AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 304) и GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 305).
- 31 034924
Олигомерный конъюгат может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более:
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO 815)
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 814)
5'-GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO 825)
5'- GN2-C6 caAsGs C$9sasas9s^s9scsascs^s CsG-3 (SEQ ID NO 808)
5’-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs csgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 826)
5'- GN2-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO807)
5'- GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO799)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO800)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasasmCsAsA-3' (SEQ ID NO801)
5'- GN2-C6 ca Cs CsGscsasgstgastsgsgsasTs CsG-3 (SEQ ID NO802)
5'- GN2-C6 camCsGsmCsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO803)
5'- GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO804)
5'- GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas CsGsG-3' (SEQ ID NO805)
5'- GN2-C6 caGs mCsGsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO806)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasgsTsGs mC-3' (SEQ ID NO809)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasGsTsG-3' (SEQ ID NO810)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasAsmCsA-3' (SEQ ID NO811)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasAs mC-3' (SEQ ID NO812)
5'- GN2-C6 camCsGsmCsasgstsastsgsgsasTs mC-3' (SEQ ID NO813)
5'- GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mcsGsG-3' (SEQ ID NO816)
5'-GN2-C6 camCsGsAsasgstsgscsascsasmCsG-3' (SEQ ID NO 817)
5'-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasAsGsT-3' (SEQ ID NO 818)
5’-GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasas mCsAsAsA-3’ (SEQ ID NO 819)
5’-GN2-C6 camCsGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3’ (SEQ ID NO 820)
-GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas CsGsG-3 (SEQ ID NO821)
5’-GN2-C6 caTsAsGstsasasascstsgsasgs Cs CSAS3’ (SEQ ID NO822)
5’-GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsAsAs mC-3’ (SEQ ID NO823)
5'-GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsAsAsmCsA-3' (SEQ ID NO824) где прописные буквы означают звенья бета-В-окси-ЬКЛ; строчные буквы означают звенья ДНК; нижний индекс s означает фосфоротиоатную связь; верхний индекс m означает звено ДНК или бетаВ-оокси-ЬНЛ, содержащее 5-метилцитозиновое основание; GN2-C6 означает GalNAc2 компонентноситель с С6 линкером. В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
- 32 034924
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO815)
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO814)
5'-GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO 825)
5'- GN2-C6 camCsGsmCsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO803)
5'- GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO804)
5'- GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas CsGsG-3' (SEQ ID NO805)
5'- GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mcsGsG-3' (SEQ ID NO816)
5'- GN2-C6 caGs mCsGsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO806)
5-GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas CsGsG-3 (SEQ ID NO821)
5'- GN2-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO807)
5'-GN2-C6 ca CsGsAsasgstsgscsascsas CsG-3' (SEQ ID NO817)
5'- GN2-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsAsmCsG-3' (SEQ ID NO808)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasgsTsGs mC-3' (SEQ ID NO809)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasGsTsG-3' (SEQ ID NO810)
5'-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasAsGsT-3' (SEQ ID NO818)
5’-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs mcsgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO826)
В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO 815)
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 814)
5'-GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO825)
5'- GN2-C6 caAsGs Cs9sasas9s^s9scsascs^s CsG-3' (SEQ ID NO 808)
5’-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs csgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 826)
5'- GN2-C6 caAsGs Cs9sasas9s^s9scsascsas (SEQ ID NO807)
В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO 815)
5'- GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 814)
5'-GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO 825)
5'- GN2-C6 camCsGsmCsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 803)
- 33 034924
В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
5'-GN2-C6 caAsGs CsgsasasgstsgscsascsAs CsG-3' (SEQ ID NO 808)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasgsTsGs mC-3' (SEQ ID NO 809)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasGsTsG-3' (SEQ ID NO 810)
5'-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasAsGsT-3' (SEQ ID NO 818)
5’-GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mCsGsG-3’ (SEQ ID NO 821)
5’-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs mcsgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 826)
5'-GN2-C6 caAsGs Csgsasasgstsgscsascsas CsGsG-3' (SEQ ID NO 807)
5'-GN2-C6 camCsGsAsasgstsgscsascsasmCsG-3' (SEQ ID NO 817)
5'- GN2-C6 caGs mCsGsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO 806)
5'- GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mcsGsG-3' (SEQ ID NO 816)
В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
5'- GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO 799)
5'-GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO800)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasasmCsAsA-3' (SEQ ID NO801)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasAsmCsA-3' (SEQ ID NO811)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasAs mC-3' (SEQ ID NO812)
5'-GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsAsAsmCsA-3' (SEQ ID NO824)
-GN2-C6 caTsAsGstsasasascstsgsasgs Cs CSAS3 (SEQ ID NO822)
В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
5'- GN2-C6 camCsmCsGscsasgstsastsgsgsasTs mCsG-3' (SEQ ID NO 802)
5'- GN2-C6 camCsGsmCsasgstsastsgsgsasTs mC-3' (SEQ ID NO 813)
В другом воплощении олигомерный конъюгат выбран из:
5·- GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO 804)
5'- GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO 805)
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO: 13) или ее субпоследовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO: 20) или ее субпоследовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 11) или ее субпоследовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO: 26) или ее субпоследовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 18) или ее субпоследовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO: 7) или ее суб последовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на мотиве последовательности CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO: 9) или ее субпоследовательности.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO: 303).
- 34 034924
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 301).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 618).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 310).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 668).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 308).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на CGAaccactgaACA (SEQ ID NO: 297).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из, или содержит, или основан на CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO: 299).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
5'- GN2-C6 caGs Cs®sEasasas9sas9sas®s®'^' (SEQ ID NO 815).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
5'- GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 814).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
5'-GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsAsGsG3' (SEQ ID NO 825).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
15'- GN2-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsAsmCsG-3' (SEQ ID NO 808).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
5’-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs csgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 826).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
5'- GN2-C6 caAsGs Csgsasasgstsgscsascsas CsGsG-3' (SEQ ID NO 807).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
5'- GN2-C6 ca CsGsAsascscsascstsgsasAs CsA-3' (SEQ ID NO 811).
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению состоит из или содержит
15'- GN2-C6 camCsmCsGscsasgstsastsgsgsasTs mCsG-3' (SEQ ID NO 802).
Гэпмер.
Предпочтительно олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата по изобретению представляет собой гэпмер (иногда упоминаемый как гэпмерный олигомер). Предпочтительно олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA.
Обычно, гэпмерный олигомер по настоящему изобретению или гэпмерный олигомерный компонент олигомерного конъюгата по изобретению может быть представлен любой одной из следующих формул:
- 35 034924
W - X - Y;
V - W - X - Y; W-X-Y-Z;
V - W-X-Y - Z;
где для каждой формулы:
W представляет собой участок одного или более усиливающих аффинность нуклеотидных аналога (участок W);
X представляет собой участок, содержащий участок из нуклеотидов, способных привлекать РНКазу (участок X);
Y представляет собой участок одного или более усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов (участок Y);
V представляет собой участок одного или более нуклеотидных звеньев (участок V);
Z представляет собой участок одного или более нуклеотидных звеньев (участок Z).
Любой из участков V, W, X, Y или Z может содержать дополнительные нуклеотиды или усиливающие аффинность нуклеотидные аналоги.
Обычно поэтому гэпмерный олигомер представляет собой олигомер, который содержит непрерывный участок нуклеотидов, который способен привлекать РНКазу, такую как РНКаза Н, такой как участок по меньшей мере из 6 или 7 нуклеотидов ДНК, которые представляют собой участок X; где участок X фланкирован как 5', так и 3' участками усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов, например 5' и 3' непрерывными участками нуклеотидов из 1-6 нуклеотидных аналогов, которые способны привлекать РНКазу - данные участки представляют собой участок W и участок Y соответственно.
В некоторых воплощениях звенья, которые спосбны привлекать РНКазу, выбраны из группы, состоящей из звеньев ДНК, звеньев альфа-L-LNA, С4' алкилированных звеньев ДНК (см. РСТ/ЕР2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008), 2296-2300, включенные в данный документ посредством ссылки), и нуклеотидов UNA (несвязанная нуклеиновая кислота) (см. Fluiterefa/., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенный в данный документ посредством ссылки). UNA представляет собой незакрытую нуклеиновую кислоту, обычно где С2-С3 С-С связь рибозы удалена, формируя незакрытый сахарный остаток. Предпочтительно гэпмер содержит (поли)нуклеотидную последовательность формулы (5'-3'), W-X-Y, или возможно W-X-Y-Z или V-W-X-Y, где участок W (W) (5' участок) состоит из или содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, такой как по меньшей мере одно звено LNA, например 1-6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA и участок X (X) состоит из или содержит по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов, которые способны привлекать РНКазу (в случае формирования дуплета с комплементарной молекулой РНК, такой как мРНК мишень), такой как нуклеотиды ДНК, и участок Y (Y) (3' участок) состоит из или содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, такой как по меньшей мере одно звено LNA, такой как 1-6 нуклеотидных аналогов, такой как звенья LNA, и участок V (V) и/или Z (Z), когда присутствует, состоит из или содержит 1, 2 или 3 нуклеотидных звена, таких как нуклеотиды ДНК.
В некоторых воплощениях участок W состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, например 2-5 нуклеотидных аналога, таких как 2-5 звена LNA, например 3 или 4 нуклеотидных аналога, таких как 2, 3 или 4 звена LNA.
В некоторых воплощениях участок Y состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA, например 2-5 нуклеотидных аналогов, таких как 2-5 звеньев LNA, например 2, 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как 3 или 4 звена LNA.
В некоторых воплощениях участок X состоит из или содержит 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных нуклеотидов, которые способны привлекать РНКазу, или 6-10 или 7-9, например 8, последовательных нуклеотидов, которые способны привлекать РНКазу.
В некоторых воплощениях участок X состоит из или содержит по меньшей мере одно нуклеотидное звено ДНК, например 1-12 звена ДНК, предпочтительно 4-12 звеньев ДНК, более предпочтительно 6-10 звеньев ДНК, например 7-10 звеньев ДНК, наиболее предпочтительно 8, 9 или 10 звеньев ДНК.
В некоторых воплощениях участок W состоит из 2, 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как LNA, участок X состоит из 7, 8, 9 или 10 звеньев ДНК, и участок Y состоит из 2, 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как LNA. Такой дизайн включает (W-X-Y) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-84, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3, 3-10-2, 3-9-2, 3-8-2, 3-7-2, 4-10-2, 4-9-2, 4-8-2, 4-7-2 и может дополнительно включать участок V, который может иметь 1, 2 или 3 нуклеотидных звена, таких как звенья ДНК, и/или участок Z, который может иметь 1, 2 или 3 нуклеотидных звена, таких как звенья ДНК.
Дальнейшие дизайны гэпмеров раскрыты в WO 2004/046160, который включен в данный документ посредством ссылки. WO 2008/113832, который заявляет приоритет перед предварительной заявкой на патент США 60/977,409, включенный в данный документ посредством ссылки, относится к шортмер (англ. - shortmer) гэпмерным олигомерам. В некоторых воплощениях олигомеры, представленные в данном документе, могут представлять собой такие шортмер гэпмеры.
- 36 034924
В некоторых воплощениях олигомер состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности всего из 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеотидных звеньев, где непрерывная нуклеотидная последовательность представляет собой формулу (5'-3'), W-X-Y или возможно W-X-Y-Z или V-W-X-Y, где W состоит из 1, 2 или 3 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA; X состоит из 7, 8 или 9 непрерывных нуклеотидных звеньев, которые способны привлекать РНКазу, в случае формирования дуплета с комплементарной молекулой РНК (такой как мРНК мишень); и Y состоит из 1, 2 или 3 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звенья LNA. В случае, когда присутствует, V состоит из 1 или 2 звеньев ДНК. В случае, когда присутствует, Z состоит из 1 или 2 звеньев ДНК.
В некоторых воплощениях W состоит из 1 звена LNA. В некоторых воплощениях W состоит из 2 звеньев LNA. В некоторых воплощениях W состоит из 3 звеньев LNA.
В некоторых воплощениях Y состоит из 1 звена LNA. В некоторых воплощениях Y состоит из 2 звеньев LNA. В некоторых воплощениях Y состоит из 3 звеньев LNA.
В некоторых воплощениях X состоит из 7 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях X состоит из 8 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях X состоит из 9 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях участок X состоит из 10 нуклеозидных звеньев. В некоторых воплощениях участок X содержит 1-10 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях X содержит 1 - 9 звеньев ДНК, таких как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях X состоит из звеньев ДНК. В некоторых воплощениях X содержит по меньшей мере одно звено LNA, которое присутствует в альфа-L конфигурации, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев LNA в альфа-Ь-конфигурации. В некоторы воплощениях X содержит по меньшей мере одно альфа-С-окси звено LNA, или где все звенья LNA в альфа-Lконфигурации представляют собой альфа-С-окси звенья LNA.
В некоторых воплощениях число нуклеотидов, присутствующих в W-X-Y выбрано из группы, состоящей из (звенья нуклеотидных аналогов - участок X-звенья нуклеотидных аналогов): 1-8-1, 1-8-2,
2- 8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, или 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3,
3- 9-1, 4-9-1, 1-9-4, или 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1,2-10-2, 1-10-3, 3-10-1,3-10-2, 2-10-3, 3-10-3.
В некоторых воплощениях число нуклеотидов в W-X-Y выбрано из группы, состоящей из 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4 и 4-7-3; в некоторых воплощениях предпочтительные мотивы представляют собой 3-10-3, 3-9-3, 3-8-3, 3-8-2.
В некоторых воплощениях каждый из участков W и Y состоит из 2 или 3 звеньев LNA и участок X состоит из 8 или 9 или 10 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК.
В некоторых воплощениях как W, так и Y состоят из 2 или 3 звеньев LNA каждый и X состоит из 8 или 9 нуклеотидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК.
В различных воплощениях другие дизайны гэпмеров включают таковые, где участки W и/или Y состоят из 3, 4, 5 или 6 нуклеозидных аналогов, таких как звенья, содержащие сахар 2'-О-метоксиэтилрибозу (2'-МОЕ) или звенья, содержащие сахар 2'-фтор-дезоксирибозу, и участок X состоит из 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеозидов, таких как звенья ДНК, где участки W-X-Y имеют 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 или 4-12-4 звена.
Дальнейшие дизайны гэпмеров раскрыты в WO 2007/146511А2, включенный в данный документ посредством ссылки.
Соответственно, олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 модифицированных нуклеотида на 5'-конце вышеупомянутых последовательностей. Например, один или более предпочтительно всех модифицированных нуклеотидов могут представлять собой звенья LNA.
Олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 модифицированных нуклеотида на 3'-конце вышеупомянутых последовательностей. Например, один или более предпочтительно все модифицированные нуклеотиды могут представлять собой звенья LNA.
Олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 модифицированных нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце последовательностей, раскрытых в данном документе. Например, один или более предпочтительно все модифицированные нуклеотиды могут представлять собой звенья LNA.
В конкретных воплощениях олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 модифицированных нуклеотида на 5'- и/или 3'конце последовательностей, раскрытых в данном документе. Например, два или более, предпочтительно все, нуклеотида могут представлять собой звенья LNA.
В конкретных воплощениях олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать по меньшей мере 3 модифицированных нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце последовательностей, раскрытых в данном документе. Например, три или более, предпочтительно все, модифицированныхе нуклеотида могут представлять собой звенья LNA.
Для конкретных воплощений олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать 2 модифицированных нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце последовательности, раскрытой в данном документе. Например, модифицированные нуклеотиды могут представлять собой звенья LNA.
- 37 034924
Для конкретных воплощений олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать 3 модифицированных нуклеотида на 5'- и на 3'-конце последовательности, раскрытой в данном документе. Например, один или более, предпочтительно все, модифицированный нуклеотид могут представлять собой звенья LNA.
Для некоторых воплощений олигомер может содержать дополнительный динуклеотидный мотив СА.
В конкретных аспектах предпочтительно олигомер не является GAGGCATAGCAGCAGG (SEQ ID NO: 102).
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой из мотивов: 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 2-9-2, 3-9-3, 2-9-3, 3-9-2, 2-10-2, 3-10-3, 3-10-2, 2-10-3, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла LNA, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла LNA.
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать любой из мотивов: 3-8-3, 3-8-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-10-3, 3-10-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла LNA, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла LNA.
Для конкретных воплощений изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, как определено в данном документе, где олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата является гэпмером, и где вся последовательность содержит по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 7, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 9, предпочтительно по меньшей мере 10 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 11 звеньев, предпочтительно по меньшей мере 12 звеньев, которые являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентичными участку, соответствующему части гена НВх HBV, такому как часть SEQ ID NO: 1, или части гена HBsAg, такой как SEQ ID NO: 2, или обратно комплементарны целевому участку нуклеиновой кислоты, который кодирует НВх HBV или HBsAg HBV.
Для конкретных воплощений изобретение предлагает олигомер или олигомерный конъюгат, как определено в данном документе, где олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата представляет собой гэпмер и где последовательность центрального участка содержит по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 7, предпочтительно по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 9, предпочтительно по меньшей мере 10 звеньев, которые по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей на 95%, по меньшей мере на 98% идентичны участку, соответствующему части гена НВх HBV, такой как часть SEQ ID NO: 1, или части гена HBsAg, такой как SEQ ID NO: 2, или обратно комплементарной последовательности целевого участка нуклеиновой кислоты, который кодирует НВх HBV или HBsAg HBV.
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6); CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и
TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834),
- 38 034924 где 1, 2, 3 или 4 из трех-четырех 5' терминальных нуклеотидов являются модифицированными нуклеотидами, например, звеньями LNA; и 1, 2, 3 или 4 из трех-четырех 3' терминальных нуклеотидов являются модифицированными нуклеотидами, например, звеньями LNA.
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой из: GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); JCGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6); CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19); AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834), где 2 или 3 из трех 5' терминальных нуклеотидов, например звеньев LNA;
или 3 из трех 3' терминальных нуклеотидов являются модифицированными нуклеотидами, например звеньями LNA.
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13); GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11); AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6); CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19); AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834), где три 5' терминальных нуклеотида являются модифицированными нуклеотидами, например звеньями LNA;
или 3 из трех 3' терминальных нуклеотидов являются модифицированными нуклеотидами, например, звеньями LNA.
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной
- 39 034924 или более:
GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO 303);
GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO 301);
GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668);
AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308);
CGAaccactgaACA (SEQ ID NO 297);
CGCagtatggaTC (SEQ ID NO 300);
AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315)
AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316);
GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 294);
CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO 295);
CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO 296);
CGAaccactgaAC (SEQ ID NO 298);
CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO 299);
CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302);
AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO 304); GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO 305);
GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO 306);
GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 307);
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO 309); GAAccactgaaCAAA (SEQ ID NO 585);
CGAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 588)
GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 628);
TAGtaaactgagCCA (SEQ ID NO 678);
CGAaccactgAAC (SEQ ID NO 600);
AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и
CGAaccactgAACA (SEQ ID NO 597), где прописные буквы означают нуклеотиды, которые могут быть модифицированными нуклеотидами, например, звеньями LNA.
Для конкретных воплощений изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более:
5'- АМ-С6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO 303)
5'- АМ-С6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 301)
5'-АМ-С6 caGs Cs®s^sasasas9sas9s^s®s®’^' (SEQ ID NO 618)
5'- АМ-С6 caAsGs Cs9sasas9s^s9scsascs^s CsG-3' (SEQ ID NO 310)
5 -AM-C6 caAsGsgstsgsasasgs csgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 668)
5'- AM-C6 caAsGs Cs9sasas9s^s9scsascsas (SEQ ID NO 308)
5'- AM-C6 caGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO 294)
5 - AM-C6 ca CsGsAsascscsascstsgsasascsAsAsA-3 (SEQ ID NO 295)
- 40 034924
5 - АМ-С6 са CsGsAsascscsascstsgsasas CsAsA-3 (SEQ ID NO 296)
5'- АМ-С6 са Cs CsGscsasgstsastsgsgsasTs CsG-3 (SEQ ID NO 299)
5'- AM-C6 ca CSGS CsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 302)
5 - AM-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 304)
5'- AM-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas CsGsG-3' (SEQ ID NO 305)
5'- AM-C6 caGs CsGsasasgstsgscsascsas CsGsG-3’ (SEQ ID NO 307)
5 - AM-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasgsTsGs C-3 (SEQ ID N0315)
5'- AM-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasGsTsG-3' (SEQ ID NO 316)
5'- AM-C6 ca CsGsAsascscsascstsgsasAs CsA-3' (SEQ ID NO 297)
5 - AM-C6 ca Cs®s^s^s^s^s®s^s^s9s®s^s (SEQ ID NO 298)
5'- AM-C6 ca CSGS CsasgstsastsgsgsasTs C-3' (SEQ ID NO 300)
5 - AM-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas csGsG-3 (SEQ ID NO 306)
5'-AM-C6 ca CsGsAsasgstsgscsascsas CsG-3' (SEQ ID NO 309)
5 -AM-C6 caAgGgGgtgggagaggg (SEQ ID NO 317)
5 -AM-C6 caGsAsAgCgCgagCgtgQgagag CgAgAgA_3 (SEQ ID NO 585)
5 -AM-C6 ca CsGsAsAsCscsascstsgsasascsAsAsA-3 (SEQ ID NO 588)
5’-AM-C6 CaGgAgAgggtgggCgasCgag CgGgG-3 (SEQ ID NO 628)
5 -AM-C6 CaTgAgGgtgasagagCgtgggaggg Cg CgAg3 (SEQ ID NO 678)
5’-AM-C6 camCsGsAgasCscsascstsgsAsAs mC-3’ (SEQ ID NO 600)
5'-AM-C6 CamCgGgAgasCgCgagCgtggsAgAs mCgA-3' (SEQ ID NO 597)
где прописные буквы означают звенья бета-D-OKcn-LNA;
строчные буквы означают звенья ДНК;
нижний индекс s означает фосфоротиоатную связь;
верхний индекс m означает звено ДНК или бета-D-окcи-LNA, содержащее 5-метилцитозиновое основание;
АМ-С6 представляет собой амино-С6 линкер; где 5' терминальная группа АМ-С6 са является дополнительной.
АМ-С6 представляет собой амино-С6 линкер: 6-аминогексанол в 5'-концеолигонуклеотида, связанного через фосфодисложный эфир или фосфоротиоат Соответственно, для конкретных воплощений изобретения, олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может быть основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более:
- 41 034924
GmCGtaaagagaGG (SEQ ID NO 303);
GmCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO 301); GmCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618); AGmCgaagtgcacAmCG (SEQ ID NO 310) AGgtgaagCgaAGTG (SEQ ID NO 668); AGmCgaagtgcacamCGG (SEQ ID NO 308); mCGAaccactgaAmCA (SEQ ID NO 297); mCGmCagtatggaTmC (SEQ ID NO 300); AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315); AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316); GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 294); mCGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO 295); mCGAaccactgaamCAA (SEQ ID NO 296); mCGAaccactgaAmC (SEQ ID NO 298); mCmCGcagtatggaTmCG (SEQ ID NO 299); mCGmCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302); AGAaggcacagamCGG (SEQ ID NO 304); GAGaaggcacagamCGG (SEQ ID NO 305); GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 306); GmCGaagtgcacamCGG (SEQ ID NO 307); mCGAagtgcacamCG (SEQ ID NO 309); GAAccactgaamCAAA (SEQ ID NO 585); mCGAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 588) GAAgtgcacamCGG (SEQ ID NO 628);
TAGtaaactgagmCmCA (SEQ ID NO 678); mCGAaccactgAAmC (SEQ ID NO 600); AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и mCGAaccactgAAmCA (SEQ ID NO 597), где прописные буквы обозначают звенья бета-О-океи-ЬЫЛ;
строчные буквы обозначают звенья ДНК;
все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи;
верхний индекс m обозначает звено ДНК или бета-О-окси-ЬЫЛ, содержащей 5-метитцитозиновое основание.
В конкретных предпочтительных аспектах олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число модифицированных нуклеотидов в участке крыла, предпочтительно по меньшей мере один, являющийся звеном LNA, предпочтительно все, являющиеся звеном LNA, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке, и третье число представляет собой число модифицированных нуклеотидов в участке крыла, предпочтительно по меньшей мере один, являющийся звеном LNA, предпочтительно по меньшей мере все, являющиеся звеном LNA.
Как указано, олигомер по изобретению может содержать или может представлять собой гэпмер. Альтернативно, гэпмерный олигомер представляет собой олигомер, содержащий непрерывный участок нуклеотидов, способных привлекать РНКазу, такую как РНКаза Н, например участок по меньшей мере 6 или 7 нуклеотидов ДНК, именуемый в данном документе участок GH (GH), где участок GH как с 5', так и с 3' фланкирован участками усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов, такими как 1-6 нуклеотидных аналога 5' и 3' к непрерывному участку нуклеотидов, которые способны привлекать РНКазу данные участки, рассматриваемые как участки GX' (GX') и GZ' (GZ').
Участки GX, GH и GZ соответствуют участкам W, X и Y соответственно.
В некоторых воплощениях звенья, которые способны привлекать РНКазу, выбраны из группы, состоящей из звеньев ДНК, звеньев альфа-L-LNA, С4' алкилированных звеньев ДНК (см. РСТ/ЕР2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008), 2296-2300, включенный в данный документ посредством ссылки), и нуклеотидов UNA (несвязанной нуклеиновой кислоты) (см. Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенный в данный документ посредством ссылки). UNA представляет собой незакрытую нуклеиновую кислоту, обычно где С2-С3 С-С связь рибозы удалена, формируя незакрытый сахарный остаток. Предпочтительно гэпмер содержит (поли)нуклеотидную последовательность формулы (5'-3'), GX'-GH-GZ', где участок GX' (GX') (5' участок) состоит из или содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, такой как по меньшей мере одно звено ΒΝΛ (например, LNA), на
- 42 034924 пример, 1-6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья BNA (например, LNA), и участок GH (Н) состоит из или содержит по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов, способных привлекать РНКазу (в случае формирования дуплета с комплементарной молекулой РНК, такой как мРНК мишень), таких как нуклеотиды ДНК, и участок GZ' (GZ') (3' участок) состоит из или содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог, такой как по меньшей мере одно звено BNA (например звено LNA), например, 1-6 нуклеотидных аналога, таких как звенья BNA (например, LNA).
В некоторых воплощениях участок GX' состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, таких как звеньев BNA (например, LNA), например 2-5 нуклеотидных аналога, таких как 2-5 звена LNA, например 3 или 4 нуклеотидных аналога, таких как 3 или 4 звена LNA; и/или участок GZ' состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидных аналогов, таких как звенья BNA (например, LNA), например 2-5 нуклеотидных аналогов, таких как 2-5 BNA (например, звеньев LNA), например 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как 3 или 4 звена BNA (например, LNA).
В некоторых воплощениях GH состоит из или содержит 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных нуклеотидов, способных привлекать РНКазу или 6-10, или 7-9, например 8, последовательных нуклеотидов, способных привлекать РНКазу. В некоторых воплощениях участок GH состоит из или содержит по меньшей мере одно нуклеотидное звено ДНК, например 1-12 звеньев ДНК, предпочтительно 4-12 звеньев ДНК, более предпочтительно 6-10 звеньев ДНК, например 7-10 звеньев ДНК, наиболее предпочтительно 8, 9 или 10 звеньев ДНК.
В некоторых воплощениях участок GX' состоит из 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как BNA (например, LNA), участок X' состоит из 7, 8, 9 или 10 звеньев ДНК и участок Z' состоит из 3 или 4 нуклеотидных аналогов, таких как BNA (например,LNA). Такие дизайны включают (GX'-GH-GZ') 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3.
В некоторых воплощениях олигомер, например, участок GX', состоит из непрерывной последовательности нуклеотидов всего из 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеотидных звеньев, где непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или представляет собой формулу (5'-3'), GX'-GH-GZ', где GX' состоит из 1, 2 или 3 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как BNA (например, LNA); GH состоит из 7, 8 или 9 непрерывных нуклеотидных звеньев, способных привлекать РНКазу, в случае формирования дуплета с комплементарной молекулой РНК (такой как мишень мРНК); и GZ' состоит из 1, 2 или 3 звеньев нуклеотидных аналогов, таких как звеньев BNA (например, LNA).
В некоторых воплощениях GX' состоит из 1 звена BNA (например, LNA). В некоторых воплощениях GX' состоит из 2 звеньев BNA (например, LNA). В некоторых воплощениях GX' состоит из 3 звеньев BNA (например, LNA). В некоторых воплощениях GZ' состоит из 1 звена BNA (например, LNA). В некоторых воплощениях GZ' состоит из 2 звеньев BNA (например, LNA). В некоторых воплощениях GZ' состоит из 3 звеньев BNA (например, LNA). В некоторых воплощениях GH состоит из 7 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях GH состоит из 8 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях GH состоит из 9 нуклеотидных звеньев. В некоторых воплощениях участок GH состоит из 10 нуклеозидных звеньев. В конкретных воплощениях участок GH состоит из или содержит 1-10 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях GH содержит 1-9 звеньев ДНК, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях GH состоит из звеньев ДНК. В некоторых воплощениях GH содержит по меньшей мере одно звено BNA, которое может быть в альфа-Е-конфигурации, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев LNA в альфа-Ь-конфигурации. В некоторых воплощениях GH содержит по меньшей мере одно звено альфа-Ь-окси BNA/LNA или все звенья LNA в альфа-L- конфигурации представляют собой звенья альфа-Ь-окси LNA. В некоторых воплощениях число нуклеотидов, присутствующих в GX'-GH-GZ', выбрано из группы, состоящей из (звенья нуклеотидных аналогов - участок GH - звенья нуклеотидных аналогов): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, или 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, или 1-10-1, 1 -10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1. В некоторых воплощениях число нуклеотидов в GX'-GH-GZ' выбрано из группы, состоящей из 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4 и 4-7-3. В конкретных воплощениях каждый из участков GX' и GH состоит из трех звеньев BNA (например, LNA) и участок GH состоит из 8, или 9, или 10 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. В некоторых воплощениях как GX', так и GZ' состоит из двух звеньев BNA (например, LNA) каждое и GH состоит из 8 или 9 нуклеотидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. В различных воплощениях другие дизайны гэпмеров включают таковые, где участок GX' и/или GZ состоит из 3, 4, 5 или 6 нуклеозидных аналогов, таких как звенья, содержащие 2'-О-метоксиэтил-рибозу (2'-МОЕ) или звенья, содержащие 2'-фтор-дезоксирибозу и участок Н состоит из 8, 9, 10, 11 или 12 нуклеозидов, таких как звенья ДНК, где участки GX'-GH-GZ' имеют 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 или 4-12-4 звеньев.
BNA и LNA гэпмеры.
Термины BNA и LNA взаимозаменяемы. Гэпмер BNA представляет собой гэпмерный олигомер (участок GA), содержащий по меньшей мере один нуклеотид BNA. LNA гэпмер представляет собой гэпмерный олигомер (участок GA), содержащий по меньшей мере один нуклеотид LNA.
Межнуклеотидные связи.
Звенья олигомеров и олигомерных конъюгатов, описанных в данном документе, соединены вместе через связующие группы. Приемлемо, каждое звено связано с 3' прилегающего звена через связующую
- 43 034924 группу.
Специалистам в области техники будет понятно, что в контексте настоящего изобретения 5' звено на конце олигомера не содержит 5' связующую группу, хотя оно может содержать или не содержать 5' терминальную группу.
Нуклеотиды олигомера по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность соединены вместе через связующие группы. Соответственно каждый нуклеотид связан с 3' прилегающим нуклеотидом через связующую группу.
Возможно, олигонуклеотид по изобретению или олигонуклеотидный конъюгат по изобретению может содержать одну или более линкерную группу и/или один или более ветвящий участок. В различных воплощениях линкерные группы представляют собой межнуклеозидные или межнуклеотидные связи.
Приемлемые межнуклеотидные связи включают таковые, приведенные в WO 2007/031091, например межнуклеотидные связи, приведенные в первом абзаце с. 34 WO 2007/031091 (включенного в данный документ посредством ссылки).
Для некоторых воплощений предпочтительно модифицировать межнуклеотидную связь из нормальной фосфодисложноэфирной до таковой более устойчивой к воздействию нуклеазы, такой как фосфоротиоатная или боранофсофатная - эти две связи, расщепляемые РНКазой Н, также делают возможным антисмысловое ингибирование при снижении экспрессии целевого гена.
Приемлемые предложенные в данном документе серосодержащие (S) межнуклеотидные связи могут быть предпочтительны. Фосфоротиоатные межнуклеотидные связи также предпочтительны, в частности, для гэп участка (X) гэпмеров. Фосфоротиоатные связи могут также быть применены для фланкирующих участков (W и Y, и для связи W или Y с V или Z, и внутри участка V или участка Z, при необходимости).
Участки W, X и Y могут, однако, содержать межнуклеотидные связи другие, чем фосфоротиоат, такие как фосфодисложноэфирные связи, в частности, например, в случае применения нуклеотидных аналогов, защищающих межнуклеотдные связи внутри участков W и Y от эндонуклеазной деградации, такой как в случае с участками W и Y, содержат нуклеотиды LNA.
Межнуклеотидные связи в олигомере могут представлять собой фосфодисложный эфир, фосфоротиоат или боранофосфат, так что делает возможным расщепление целевой РНК РНКазой Н. Фосфоротиоат предпочтителен для улучшенной нуклеазной устойчивости и по другим причинам, таким как легкость производства.
В одном аспекте олигомера по изобретению нуклеотиды и/или нуклеотидные аналоги связаны друг с другом посредством фосфоротиоатных групп.
Следует понимать, что включение фосфодисложноэфирных связей, например одной или двух связей, в другой фосфоротиоатный олигомер, особенно между или прилегая к звеньям нуклеотидных аналогов (обычно в участке W и/или Y) может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигомера - см. WO 2008/113832, включенного в данный документ посредством ссылки.
В некоторых воплощениях, упомянутых выше, где соответственно и не специфично указано, все оставшиеся связующие группы являются или фосфодисложноэфирными, или фосфоротиоатными, или их смесью.
В некоторых вопллощениях все межнуклеотидные связующие группы являются фосфоротиоатом.
В случае ссылки на специфичные гэпмерные олигонуклеотидные последовательности, как любые из таковых специфичных последовательностей, предложенных в данном документе, следует понимать, что в различных воплощениях в случае, когда связи являются фосфоротиоатными связями, альтернативные связи, такие как таковые, раскрытые в данном документе, могут быть применены, например фосфатные (фосфодисложноэфирные) связи могут быть применены, в частности связи между нуклеотидными аналогами, такими как звенья LNA. Аналогично, в случае ссылки на специфичные гэпмерные олигонуклеотидные последовательности, такие как любые из таковых специфичных последовательностей, предложенных в данном документе, в случае когда остатки С аннотированы как 5' метил-модифицированный цитозин, в различных воплощениях, один или более С, присутствующих в олигомере, может представлять собой немодифицированные остатки С.
WO 09/124238 относится к олигомерным соединениям, обладающим по меньшей мере одним бициклическим нуклеозидом, прикрепленным к 3' или 5' терминальному концу за счет нейтральной межнуклеозидной связи. Олигомеры по изобретению могут, таким образом, иметь по меньшей мере один бициклический нуклеозид, прикрепленный к 3' или 5' терминальному концу за счет нейтральной межнуклеозидной связи, такой как один или более фосфодисложный эфир, метилфосфонат, MMI, амид-3, формацеталь или тиоформацеталь. Оставшиеся связи могут представлять собой фосфоротиоат.
Носитель.
В некоторых воплощениях олигомер по настоящему изобретению связан с одним или более компонентом-носителем, который может быть одним и тем же или различным.
В некоторых воплощениях олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
Компонент-носитель - L-первый олигомерный участок,
- 44 034924 где L представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу. Предпочтительно L выбран из физиологически лабильного линкера (участок PL), или альтернативного линкера (участок Е), или комбинации обоих.
Первый олигомерный участок может быть связан с линкером или носителем через 5'-конец следующим образом:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу; или
Альтернативно первый олигомерный участок может быть связан с линкером или носителем через 3'-конец, следующим образом:
Первый олигомерный участок - L2 - компонент-носитель, где L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую мо лекулу, или мостиковую группу.
Для конкретных воплощений предпочтительно олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок, где L1 представляет собой дополнительный линкер.
Для конкретных воплощений предпочтительно присутствует линкер 1.
Для конкретных воплощений предпочтительно упомянутый компонент-носитель связан, предпочтительно конъюгирован с упомянутым олигомерным участком.
Для конкретных воплощений предпочтительно упомянутый компонент-носитель связан, предпочтительно конъюгирован с 5'-концом упомянутого олигомера.
Для конкретных воплощений предпочтительно упомянутый компонент-носитель связан, предпочтительно конъюгирован с 5'-концом упомянутого олигомера посредством линкерной группы или ветвящего участка или связывающей молекулы или мостиковой группы.
Для конкретных воплощений предпочтительно линкерная группа или ветвящий участок представляют собой физиологически лабильную линкерную группу или физиологически лабильный ветвящий участок или физиологически лабильную связывающую молекулу или физиологически лабильную мости ковую группу.
Для конкретных воплощений предпочтительно физиологически лабильная линкерная группа представляет собой линкер, чувствительный к нуклеазе, предпочтительно фосфодисложноэфирный линкер.
Для конкретных воплощений предпочтительный L1 линкер состоит из физиологически лабильного линкера и С2-С36 аминоалкильной группы, включая, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер L1 состоит из линкера РО и С6 аминолинкера.
В некоторых воплощениях компонент-носитель выбран из карбогидратного конъюгата или липофильного конъюгата или компонент-носитель содержит как карбогидратный, так и липофильный конъю гаты.
Карбогидратная конъюгирующая группа может быть выбрана, например, из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина. Предпочтительно карбогидратная конъюгирующая группа представляет собой конъюгирующую группу, нацеленную на асиалогикопротеиновый рецептор. Липофильный конъюгат может представлять собой гидрофобную группу, такую как С16-20 гидрофобную группу, стерол, холестерол. Другие карбогидратные и липофильные группы, которые могут быть применены, представляют собой, например, раскрытое в данном документе.
Для некоторых воплощений олигомер может содержать дополнительный динуклеотидный мотив СА. Предпочтительно в контексте олигомерного конъюгата, мотив СА расположен между компонентомносителем и олигомером. Мотив СА предпочтительно содержит фосфодисложноэфирную связь и служит в качестве РО линкера между олигомером и компонентом-носителем.
Вирус гепатита В (HBV).
Предполагается, что все олигомеры и олигомерные конъюгаты, описанные в данном документе, могут быть применены для лечения вирусного заболевания, в частности заболевания, ассоциированного с HBV. Такие применения формируют часть настоящего изобретения.
Предполагается, что все олигомеры и олигомерные конъюгаты, описанные в данном документе, могут быть применены при производстве лекарственного препарата для лечения вирусного заболевания, в частности заболевания, ассоциированного с HBV. Такие применения формируют часть настоящего изобретения.
Предполагается, что все олигомеры и олигомерные конъюгаты, описанные в данном документе, могут быть введены субъекту как часть способа для облегчения, устранения или лечения вирусного заболевания, в частности заболевания, ассоциированного с HBV. Такие способы формирую часть настоящего изобретения.
Предполагается, что все олигомеры или олигомерные конъюгаты, описанные в данном документе, могут составлять часть фармацевтической композиции для лечения вирусного заболевания, в частности
- 45 034924 заболевания, ассоциированного с HBV. Такие фармацевтические композиции формируют часть настоящего изобретения.
Вирус гепатита В (HBV) является видом рода Orthohepadnavirus, который является частью семейства Hepadnaviridae. Вирус вызвает заболевание гепатитом В. Помимо гепатита, инфицирование HBV может приводить к циррозу и гепатоклеточной карциноме. Также показано, что оно может повышать риск рака печени.
Вирус делят на четыре основных серотипа (adr, adw, ayr, ayw) на основании антигенных эпитопов, представленных на его белках оболочки, или на восемь генотипов (А-Н) согласно всем вариациям нуклеотидной последовательности генома. Генотипы имеют различное географическое распределение, и различия между генотипами влияют на сложность заболевания, направление и вероятность осложнений, и ответ на лечение и возможно вакцинацию. Генотипы различаются по меньшей мере на 8%. Тип F, который отличается от других геномов на 14%, является наиболее дивергентным типом из известных. Тип А преобладает в Европе, африке и Юго-Восточной азии, включая Филиппины. Типы В и С преобладают в Азии; тип D наиболее распространен в районе Средиземноморья, среднем Востоке и Индии; тип Е локализован в странах Африки к югу от Сахары; тип Е (илиН) ограничен Центральной и Южной Америкой. Тип G обнаруживают во Франции и Германии. Генотипы A, D и F преобладают в Бразилии, и все генотипы встречаются в Соединенных штатах с частотами в зависимости от этнической принадлежности.
HBV обладает геномом из кольцевой ДНК, однако ДНК не является полностью двухцепочечной, поскольку на одном конце полноразмерной цепи связана с вирусной ДНК полимеразой. Геном имеет в длину 3020-3320 нуклеотидов (для полноразмерной цепи) и 1700-2800 нуклеотидов (для короткой цепи).
Существуют четыре известных гена, кодируемых геномом HBV (С, Р, S и X). Ген С кодирует белок кора (HBcAg), и его старт-кодону предшествует расположенный выше AUG старт-кодон, с которого образуется пре-белок кора. HBeAg образуется посредством протеолиза пре-белка кора. Ген Р кодирует ДНК полимеразу.
НВх.
Полипептид НВх представляет собой белок из 154 остатков, который влияет на транскрипцию, сигнальную трансдукцию, прогресс клеточного цикла, белковую деградацию, апоптоз и хромосомную стабильность у хозяина. Он формирует гетеродимерный комплекс со своим клеточным целевым белком (НВХ взаимодействующий белок: HBXIP), и данное взаимодействие нарушает динамику центросомы и образование митотического веретена. Он взаимодействует с DDB1 (белок 1, связывающийся с поврежденной ДНК), перенаправляя активность убихитин-лигазы комплексов CUL4-DDB1 Е3, которые тесно вовлечены во внутриклеточную регуляцию репликации и репарации ДНК, транскрипцию и сигнальную трансдукцию.
Хотя полипептид утратил существенную идентичность последовательности с каким-либо известным белком позвоночных, он, вероятно, должен был развиться из ДНК гликозилазы. У трансгенных мышей, экспрессирующих X белок в печени, с большей вероятностью, чем у дикого типа, развивается гепатоклеточная карцинома. Поскольку белок X обеспечивает развитие клеточного цикла, несмотря на связывание с и ингибирование функции белка опухолевого супрессора р53. Экспериментальные наблюдения также подтверждают, что белок НВх повышает TERT и теломеразную активность, продлевая срок жизни гепатоцитов и способствуя злокачественной трансформации.
В исследовании выделенных раковых клеток печени, инфицированных HBV, уровень экспрессии белка аргинин метилтрансферазы 1 (PRMT1) был ассоциирован с изменениями в транскрипции из-за метилтрансферазной функции PRMT1. Повышенная экспрессия вызывает снижение числа транскрибируемых генов HBV, в тоже время наоборот, пониженная экспрессия вызывает повышение. Для PRMT1 также обнаружено, что он рекрутируется (привлекается) ДНК HBV во время репликации для регуляции процесса транскрипции. Повышенная экспрессия НВх, напротив, приводит к ингибированию PRMT1опосредованного метилирования белка, давая преимущество вирусной репликации.
Последовательность-мишень НВх содержит последовательности, начиная с первого описанного сайта инициации транскрипции в позиции 1196 до сайта полиаденилирования в позиции 1941. Последовательность от позиции 1196 до 1941 последовательности U95551 представлена в виде SEQ ID NO: 1. Последовательность U95551 представлена в виде SEQ ID NO: 3.
HBsAg.
HBsAg (также известный как основной поверхностный антиген, основной поверхностный антиген HBV, основной поверхностный антиген HBV и 'S') представляет собой поверхностный антиген HBV.
Ген S представляет собой ген, кодирующий поверхностный антиген (HBsAg). Ген HBsAg является одной длинной открытой рамкой считывания, но содержит в рамке три старт-кодона (ATG), которые разделяют ген на три части пре-SC пре^2 и S. Учитывая множество старт-кодонов, образуются полипептиды трех различных размеров, называемые большой, средний и малый (пре-S! + пре^2 + S, пре^2 + S, или S).
HBsAg кодирует три гликопротеина. Белки транслируются в одной и той же рамке считывания, но начиная с различных старт-кодонов AUG; таким образом, все имеют одинаковый С-конец. Наибольшим
- 46 034924 белком является белок L (42 кДа), внутри которого заключен гликопротеин. Гликопротеин S (27 кДа) заключен внутри белка М. Белок HBsAg также секретируется в сыворотке пациентов, где он может быть обнаружен в виде сферических (в основном самоассоциированный белок S) или филаментных частиц (также в основном белок S, но с некоторым L и М). Образование является меньшим, чем реальный вирус, но филаменты могут быть довольно большими (несколько сотен нанометров).
S-HBsAg составляет в длину 226 аминокислотных остатков. Он представляет собой интегральный мембранный гликопротеин, который заякорен в липидном бислое ЭР через аминотерминальный трансмембранный домен (TMD-I) между остатками 4 и 24. Он содержит нижерасположенную цитозольную петлю (CYL-I) между остатками 24 и 80, второй трансмембранный домен (TMD-II) между остатками 80 и 100 и антигенную петлю (AGL), охватывающую остатки 101-164, обращенные в полость ЭР (или поверхности экстрацеллюлярных частиц). Карбоксильный конец (остатки 165-226) содержит два TMD (TMD-III и -IV), расположенных в позициях 173-193 и 202-222 соответственно, разделенных короткой последовательностью (остатки 194-201), упоминаемой в данном документе как цитозольная петля II (CYL-II), поскольку она предположительно представляет собой остаток на цитозольной стороне мембраны ЭР. Последовательность белка M-HBsAg является более длинной, чем таковая S-HBsAg на 55 остатков (пре^2 домен) на амино-терминальном конце; она объединена с последней в вирусной оболочке, но является необязательной как для морфогенеза, так и для инфицирования in vitro. L-HBsAg содержит полный полипептид М с дополнительным амино-терминальным участком М (пре-S!) из 108-119 остатков в зависимости от генотипа HBV. Для него описаны две топологии с аминотерминальным пре-S доменом (пре-St плюс пре^2). являющимся цитозольным на мембране ЭР (изнутри на секретируемых вирионах) или люминальным (экспонируемым на поверхности вириона). Внутрення конформация вовлечена в рекрутирование нуклеокапсида для сборки вируса, тогда как внешнее расположение соответствует рецептор-связывающей функции при проникновении вируса.
Все три белка оболочки синтезируются в мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР), где они агрегируют через белок-белковые взаимодействия, приводящие в первую очередь к секреции пустых S-HBsAg-покрытых субвирусных частиц (SVPs). Это только в случае, когда L-HBsAg присутствует в агрегатах белка оболочки на мембране ЭР для того, чтобы нуклеокапсид HBV мог быть вовлечен в сборку комплекса и высвобожден в виде зрелого вириона. Вследствие преодоления активности S-HBsAg для самосборки по сравнению с таковой L-HBsAg образование вириона HBV происходит только в редких случаях.
Последовательность-мишень HBsAg содержит последовательности, начинающиеся с кольцевой последовательности U95551 с участка старта транскрипции в позиции 3158-3182 и с позиции 1 до сайта полиаденилирования в позиции 1941. Таким образом, последовательность-мишень HBsAg содержит последовательности комбинированных последовательностей с позиции 3158 по 3182 и позиции 1-1944 кольцевой последовательности U95551. Данная последовательность-мишень представлена как SEQ ID NO: 2. Последовательность U95551 представлена в виде SEQ ID NO: 3.
Мишень.
В предпочтительном аспекте,соответственно олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен модулировать последовательность-мишень НВх или HBsAg вируса гепатита В (HBV). B данном отношении олигомер по изобретению может оказывать влияние на ингибирование последовательности-мишени, обычно в клетках млекопитающих, таких как клетки человека, таких как клетки печени.
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению связывается с целевой нуклеиновой кислотой и модулирует экспрессию по меньшей мере на 10 или 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, более предпочтительно по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии (таким как уровень экспрессии в отсутствии олигомера(ов) или олигомерного конъюгата(ов)).
В одном воплощении олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к понижению (например, ингибированию, уменьшению или устранению) экспрессии гена НВх или HBsAg. В данном отношении олигомер по изобретению может влиять на ингибирование НВх или HBsAg. Такое ингибирование обычно может происходить в клетке млекопитающего, такой как клетка человека, такая как клетка печени. В некоторых воплощениях олигомеры по изобретению связываются с целевой нуклеиновой кислотой и влияют на ингибирование экспрессии по меньшей мере на 10 или 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, более предпочтительно по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% ингибирования по сравнению с нормальным уровнем экспрессии (таким как уровень экспрессии в отсутствии олигомера(ов) или олигомерного конъюагата(ов)).
В некоторых воплощениях, такое модулирование обнаруживается, в случае применения 0,04-25 нМ, такой как 0,8-20 нМ концентрации соединения по изобретению. В одном и том же или разных воплощениях модулирование экспрессии составляет менее 100%, например менее 98%, менее 95%, менее 90%, менее 80%, например менее 70%. Модулирование уровня экспрессии может быть определено за счет измерения уровней белка, например, при помощи таких методов, как SDS-PAGE с последующим Вестернблотом при помощи соответствующих антител к целевому белку. Альтернативно, модулирование уровней экспрессии может быть определено за счет измерения уровней мРНК, например при помощи Нозерн
- 47 034924 блота или количественной РВ-ПЦР. В случае измерения через уровни мРНК уровень понижения при применении соответствующей дозы, такой как концентрация 0,04-25 нМ, например 0,8-20 нМ, в некоторых воплощениях обычно составляет 10-20% нормальных уровней в отсутствие соединения, конъюгата или композиции по изобретению.
Как показано в данном документе, клетки могут представлять собой in vitro трансфецированные клетки. Применяемая концентрация олигомера или олигомерного конъюгата в некоторых воплощениях, составляет 5 нМ. Применяемая концентрация олигомера может в некоторых воплощениях составлять 25 нМ. Применяемая концентрация олигомера и олигомерного конъюгата в некоторых воплощениях составляет 1 нМ. Следует отметить, что концентрацию олигомера, применяемую для лечения клетки обычно получают в клеточном исследовании in vitro, при помощи трансфекции (Lipofecton), как показано в примерах. В отсутствие трансфецирующего агента концентрация олигомера или олигомерного конъюгата, необходимая для достижения снижения экспрессии мишени обычно составляет 1-25 мкМ, например 5 мкМ.
Таким образом, изобретение предлагает способ снижения и ингибирования экспрессии белка НВх или HBsAg и/или мРНК в клетке, которая экспрессирует белок НВх или HBsAg и мРНК, упомянутый способ, содержащий введение олигомера или конъюгата по изобретению в упомянутую клетку для снижения или ингибирования экспрессии белка НВх или HBsAg и/или мРНК в упомянутой клетке. Соответственно, клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. В некоторых воплощениях ведение может быть осуществлено in vitro. В некоторых воплощениях введение может быть осуществлено in vivo.
Для конкретных воплощений олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата, нацеленного на НВх, также связывается с HBsAg.
Последовательность-мишень.
Олигомеры или олигомерные конъюгаты содержат или состоят из непрерывной нуклеотидной последовательности, соответствующей обратно комплементарной последовательности нуклеотидной последовательности, присутствующей в последовательности-мишени.
Последовательность-мишень может представлять собой ген или мРНК, такой как кодирующий или некодирующий участок гена или мРНК. Например, последовательность-мишень может представлять собой кодирующий или некодирующий экзон. Последовательность-мишень может содержать по меньшей мере часть экзона. Последовательность-мишень может представлять собой часть экзона, такую как внутренняя часть экзона.
В практике настоящего изобретения последовательность-мишень может представлять собой одноцепочечную или двухцепочечную ДНК или РНК; однако предпочтительны одноцепочечные ДНК и РНК мишени. Следует понимать, что последовательность-мишень, на которую направлены антисмысловые олигонуклеотиды по изобретению, включает аллельные формы целевого гена и соответствующие мРНК, включая варианты сплайсинга. Существует значительное число руководств в литературе по выбору конкретных последовательностей антисмысловых олигонуклеотидов с учетом знания последовательности целевого полинуклеотида, например, Cook ST. Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, Marcel Dekker, Inc, 2001; Peyman and Ulmann, Chemical Reviews, 90:543-584, 1990 и Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376 (1992). мРНК мишени могут включать 5' кэп-сайт, участок связывания праймера тРНК, сайт инициаторного кодона, донорный сайт сплайсинга мРНК и акцепторный сайт сплайсинга мРНК.
В случае, когда полинуклеотидная последовательность-мишень содержит транскрипт мРНК, последовательность комплементарных олигонуклеотидов может гибридизоваться с любой желаемой частью транскрипта. Такие олигонуклеотиды в принципе эффективны для ингибирования трансляции и способны индуцировать эффекты, описанные в данном документе. Предполагается, что трансляция наиболее эффективно ингибируется за счет блокирования мРНК в сайте или близко к инициаторному кодону. Таким образом, олигонуклеотиды могут быть комплементарны 5'-участку транскрипта мРНК. Олигонуклеотиды могут быть комплементарны мРНК, включая инициаторный кодон (первый кодон на 5'-конце транслируемой части транскрипта), или кодоны, прилегающие к инициаторному кодону.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентичной у генотипов А-Н HBV (подробно описано ниже).
В одном воплощении последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любому одному или более генотипу А-Н HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу A HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу В HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу С HBV. Например, последова
- 48 034924 тельность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу D HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу Е HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу F HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу G HBV. Например, последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична генотипу Н HBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична двум или более генотипам А-Н HBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентична у двух или более генотипов А, В, С и D HBV. Последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична у генотипов А и В HBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентична у двух или более генотипов А, В, С и D HBV. Последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична у генотипов А и С HBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентична у трех или более генотипов А, В, С и D HBV. Последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична у генотипов А, В, С и D HBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентична трем или более генотипам А, В, С и D HBV. Последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична генотипам А, В и С HBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентична у трех или более генотипов А, В, С и D HBV. Последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% идентична у генотипов А, В и DHBV.
В одном воплощении последовательность-мишень может быть идентична у всех генотипов А, В, С и D HBV. Последовательность-мишень может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична у генотипов А, В, С и D HBV.
В различных воплощениях последовательность-мишень находится внутри последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 3.
В одном воплощении последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения.
В различных воплощениях последовательность-мишень представляет собой НВх или HBsAg или их вариант естественного происхождения.
В различных воплощениях последовательность-мишень находится внутри последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 1.
В различных воплощениях последовательность-мишень находится внутри последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 2.
В различных воплощениях последовательность-мишень выбрана из одной или более позиций в SEQ ID NO: 3: позиция 1-1944, позиция 157 - 1840, позиция 1196-1941, позиция 1376-1840 и позиция 3158-3182. Предпочтительно последовательность-мишень выбрана из позиции 1530-1598 SEQ ID NO: 3, более предпочтительно из позиции 1577-1598 SEQ ID NO: 3 и наиболее предпочтительно из позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3.
В различных воплощениях последовательность-мишень может быть выбрана из группы, состоящей из любой одной или более из позиций:
1264-1278;
1265-1277;
1530-1543;
1530-1544;
1531-1543;
1551-1565;
- 49 034924
1551-1566;
1577-1589;
1577-1591;
1577-1592;
1577-1598;
1578-1590;
1578-1592;
1583-1598;
1584-1598;
1585-1598;
670-706;
670-684;
691-705;
691-706;
692-706;
693-706;
694-706;
SEQ ID NO: 3.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию на 8-30, 8-20, 8-18, 8-16, 8-14, 8-12 или 8-10 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 1200-1900, предпочтительно позиция 1530-1598, более предпочтительно позиция 15771598, наиболее предпочтительно позиция 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 1200-1900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577- 1598, наиболее предпочтительно позиции 530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутый непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 8 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 12001900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 9 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 1200 1900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 10 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 12001900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению нацелен по меньшей мере на 11 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 1200-1900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтиетльно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 12 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 12001900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 13 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 12001900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 14 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 12001900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее пред
- 50 034924 почтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 15 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в качестве позиции 1200-1900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В аспекте олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способен к нацеливанию по меньшей мере на 16 непрерывных нуклеотидов внутри последовательности, показанной в виде позиции 12001900, предпочтительно позиции 1530-1598, более предпочтительно позиции 1577-1598, наиболее предпочтительно позиции 1530-1543 SEQ ID NO: 3; предпочтительно, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат комплементарен упомянутым непрерывным нуклеотидам.
В одном воплощении последовательность-мишень содержит последовательность внутри последовательности, указанной для SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с ними. Таким образом, олигомер или олигомерный конъюгат может содержать или состоять из корового мотива, выбранного из группы, представленной в данном документе, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат (или его непрерывная нуклеотидная часть) могут, при желании, иметь одно, два или три несоответствия относительно упомянутой выбранной последовательности мотива:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6); CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19); AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834)
В одном воплощении последовательность-мишень содержит последовательность, указанную ниже или последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью любой из них. Таким образом, олигомер или олигомерный конъюгат может содержать или состоять из последовательности, гибридизующейся с последовательностью-мишенью, выбранной из группы, представленной ниже, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат (или его непрерывная нуклеотидная часть) могут, возможно, иметь одно, два или три несоответствия относительно упомянутой выбранной последовательностимишени.
последовательность-мишень acggggcgcacctctctttacgcg (SEQ ID NO 827) cgtgtgcacttcgcttcacctc (SEQ ID NO 828) ccgtctgtgccttctc (SEQ ID NO 829) cgatccatactgcgg (SEQ ID NO 830) tggctcagtttacta (SEQ ID NO 831) ctagtgccatttgtt(SEQ ID NO 833)
В некоторых воплощениях олигомер или олигомерный конъюгат могут допускать 1, 2, 3 или 4 (или более) несоответствияй, в случае с гибридизацией с последовательностью-мишенью и еще достаточным связыванием с мишенью для получения желаемого эффекта, т.е. снижения экспрессии мишени. Несоответствия могут быть, например, компенсированы за счет повышенной длины олигомерной нуклеотидной последовательности и/или повышенного числа нуклеотидных аналогов, таких как LNA, присутствующих
- 51 034924 внутри нуклеотидной последовательности.
В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит не более 3, например не более 2, несоответствий в случае гибридизации с последовательностью-мишенью, такой как соответствующий участок нуклеиновой кислоты, которая кодирует НВх или HBsAg.
В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит не более чем одно несоответствие в случае гибридизации с последовательностью-мишенью, такой как соответствующий участок нуклеиновой кислоты, которая кодирует НВх или HBsAg.
В случае когда мишенью является НВх, нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична (иногда упоминается как гомология или гомологична) соответствующей последовательности, выбранной из нуклеотидных последовательностей, представленных в данном документе, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% гомологична, по меньшей мере на 97% гомологична, по меньшей мере на 98% гомологична, по меньшей мере на 99% гомологична, например на 100% гомологична (идентична).
В случае когда мишенью является НВх, нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична (упоминается как гомология или гомологична) обратно комплементарной последовательности соответствующей последовательности внутри последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 1, например по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% гомологична, по меньшей мере на 97% гомологична, по меньшей мере на 98% гомологична, по меньшей мере на 99% гомологична, например на 100% гомологична (идентична).
В случае, когда мишенью является НВх, нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% комплементарна субпоследовательности, присутствующей внутри последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% комплементарна, по меньшей мере на 97% комплементарна, по меньшей мере на 98% комплементарна, по меньшей мере на 99% комплементарна, например, на 100% комплементарна (абсолютно комплементарна).
В некоторых воплощениях в случае, когда мишенью является НВх, олигомер или олигомерный конъюгат (или его непрерывная нуклеотидная часть) выбран из или содержит одну из последовательностей, представленных в данном документе, или ее субпоследовательность по меньшей мере из 10 непрерывных нуклеотидов, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат (или его непрерывная нуклеотидная часть) может при желании содержать одно, два или три несоответствия в сравнении с последовательностью.
В случае, когда мишенью является HBsAg, нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична (иногда упоминается как гомология или гомологична) соответствующей последовательности, выбранной из группы, представленной в данном документе, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% гомологична, по меньшей мере на 97% гомологична, по меньшей мере на 98% гомологична, по меньшей мере на 99% гомологична, например на 100% гомологична (идентична).
В случае, когда мишенью является HBsAg, нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична (иногда упоминается как гомология или гомологична) обратно комплементарной последовательности соответствующей последовательности, присутствующей внутри последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 2, например по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% гомологична, по меньшей мере на 97% гомологична, по меньшей мере на 98% гомологична, по меньшей мере на 99% гомологична, наприме, на 100% гомологична (идентична).
В случае, когда мишенью является HBsAg, нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению или непрерывная нуклеотидная последовательность предпочтительно по меньшей мере на 80% комплементарна субпоследовательности, присутствующей внутри последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 2, например по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% комплементарна, по меньшей мере на 97% комплементарна, по меньшей мере на 98% комплементарна, по меньшей мере на 99% комплемен
- 52 034924 тарна, например на 100% комплементарна (абсолютно комплементарна).
В некоторых воплощениях в случае, когда мишенью является HBsAg, олигомер или олигомерный конъюгат (или его непрерывная нуклеотидная часть) выбран из или содержит одну из последовательностей, выбранных из группы, представленной в данном документе, или ее субпоследовательности по меньшей мере из 10 непрерывных нуклеотидов, где упомянутый олигомер или олигомерный конъюгат (или его непрерывная нуклеотидная часть) могут возможно содержать один, два или три несоответствия, при сравнении с последовательностью.
В некоторых воплощениях субпоследовательность может состоять из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 непрерывных нуклеотидов, например из 12-22, например из 1218, например из 12-16 нуклеотидов. Соответственно в некоторых воплощениях субпоследовательность имеет такую же длину, как и непрерывная нуклеотидная последовательность олигомера по изобретению.
Однако считается, что в некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность олигомера или олигомерного конъюгата может содержать дополнительные 5' или 3' нуклеотиды, например независимо, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов 5' и/или 3', которые некомплементарны последовательности-мишени. В этом отношении олигомер по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, которая фланкирована 5' и/или 3' дополнительными нуклеотидами. В некоторых воплощениях дополнительные 5' или 3' нуклеотиды представляют собой нуклеотиды естественного происхождения, такие как ДНК или РНК. В некоторых воплощениях дополнительные 5' или 3' нуклеотиды могут представлять участок D, как упомянуто в контексте гэпмерного олигомера или олигомерного конъюгата в данном документе.
Рекрутирование (привлечение) РНКазы.
Считают, что олигомерная молекула может функционировать через деградацию мРНК, не опосредованную РНКазой, такую как стерическое препятствие трансляции или другие способы.
Для некоторых воплощений олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению способны рекрутировать (привлекать) эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н.
Предпочтительно, что олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению содержит участок по меньшей мере из 6, например по меньшей мере 7, непрерывных нуклеотидных звеньев, например по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 непрерывных нуклеотидных звеньев (остатки), включая 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непрерывных нуклеотидов, которые в случае формирования дуплета с комплементарной целевой РНК способны рекрутировать РНКазу. Непрерывная последовательность, способная рекрутировать РНКазу, может представлять собой участок X, как упомянуто в контексте гэпмера, как описано в данном документе. В некоторых воплощениях размер непрерывной последовательности, которая способна рекрутировать РНКазу, такой как участок X, может быть большим, например 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных звеньев.
ЕР 1222309 предлагает in vitro способы определения активности РНКазы, которые могут быть применены для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Олигомер считается способным рекрутировать РНКазу Н, если в случае присутствия вместе с комплементарной РНК мишенью он имеет начальную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 1%, например по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 10% или более чем 20% начальной скорости, определенной при помощи только ДНК олигонуклеотида, имеющего одну и ту же нуклеотидную последовательность, но содержащую только ДНК звенья, без 2' замен, с фосфоротиоатными связующими группами между всеми звеньями в олигонуклеотиде, при помощи методологии, предложенной в примерах 91-95 ЕР 1222309.
В некоторых воплощениях олигомер считают практически не способным рекрутировать РНКазу Н, если в случае присутсвия вместе с комплементарной РНК мишенью и РНКазой Н, начальная скорость РНКазы Н, измеренная в пмоль/л/мин, составляет менее 1%, например менее 5%, например менее 10% или менее 20% мощи эквивалентного только ДНК олигонуклеотида, без 2' замен, с фосфоротиоатными связующими группами между всеми нуклеотидами в олигонуклеотиде при помощи методологии, предложенной в примерах 91-95 ЕР 1222309.
В других воплощениях олигомер считают способным рекрутировать РНКазу Н, если в случае присутствия с комплентарной РНК мишенью и РНКазой Н начальная скорость РНКазы Н, измеренная в пмоль/л/мин, составляет по меньшей мере 20%, например по меньшей мере 40%, например по меньшей мере 60%, например по меньшей мере 80% начальной скорости, определенной при помощи эквивалентного только ДНК олигонуклеотида, без 2' замен, с фосфоротиоатными связующими группами между всеми нуклеотидами в олигонуклеотиде, при помощи методологии, предложенной в примерах 91-95 ЕР 1222309.
Обычно участок олигомера или олигомерного конъюгата по изобретению, который формирует последовательные нуклеотидные звенья, которые при формировании в дуплете с комплементарной целевой РНК способны рекрутировать РНКазу, состоит из нуклеотидных звеньев, которые формируют дуплет, подобный ДНК/РНК с РНК-мишенью, и включают как ДНК, так и LNA звенья, которые присуствуют в альфа-L конфигурации, в частности предпочтительно альфа-L-окси-LNA.
Олигомер или олигомерный конъюгат по изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, которая содержит как нуклеотиды, так и нуклеотидные аналоги и может быть в виде гэпмера,
- 53 034924 хэдмера или миксмера.
В некоторых воплощениях, в дополнение к усилению аффинности олигомера в отношении целевого участка, некоторые нуклеозидные аналоги могут опосредовать связывание РНКазой (например, РНКазой Н) и расщепление. Поскольку звенья α-L-LNA рекрутируют в определенной степени активность РНКазы
H, в некоторых воплощениях участки гэпов (например, участок X, как упомянуто в данном документе) олигомеров, содержащих звенья α-L-LNA, состоят из нескольких звеньев, распознаваемых и расщепляемых РНКазой Н, и вводят большую гибкость в конструкцию миксмера.
Синтез.
Настоящее изобретение предлагает способ производства олигомерного конъюгата, содержащий конъюгирование по меньшей мере одного олигомера с компонентном-носителем, где упомянутый олигомерный конъюгат приемлем для лечения вирусного заболевания.
Настоящее изобретение также предлагает способ производства полиолигомерного конъюгата, как описано в данном документе, содержащий прикрепление одного или более олигомеров к линкерной группе (Е или L) или симметричному ветвящему участку F, который затем прикреплен к компонентуносителю, как описано в данном документе, где упомянутый олигомерный конъюгат приемлем для лечения вирусного заболевания.
В некоторых воплощениях симметричный ветвящий участок представляет собой или
I, 3-пентиламидопропил (от 1,3-бис-[5-(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2-цианоэтил)- (Ν,Ν-диизопропил^фосфорамидит), трис-2,2,2-(пропилоксиметил)этил (от трис-2,2,2-[3-(4,4'диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2-цианоэтил)-(У№диизопропил)]фосфорамидит), или трис-2,2,2-(пропилоксиметил)метиленоксипропил (от трис-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]метиленоксипропил-[(2-цианоэтил)-(У№диизопропил)]фосфорамидит). В некоторых воплощениях асимметричный ветвящий участок представляет собой 1,3-пентиламидопропил (от 1-[5-{4,4'диметокситритилокси)пентиламидо]-3-[5-флуоренометоксикарбонилоксипентиламидо]-пропил-2-[(2цианоэтил)-(У^диизопропил)]-осфорамидит), GlenReseach, USA предлагает такие приемлемые ветвители (например, каталожный номер 0-1920, 10-1922 и 10-1925).
Линкерные группы и ветвящие участки, как описано в данном документе, могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.
В дальнейшем аспекте предложен способ производства композиции по изобретению, содержащей смешивание олигомерного конъюгата по изобретению с фармацевтически приемлемым разбавителем, растворителем, носителем, солью и/или адъювантом.
Активированные олигомеры.
Термин активированный олигомер, как употреблено в данном документе, относится к олигомеру по изобретению, который ковалентно связан (т.е. функционализирован) по меньшей мере с одной функциональной группой, которая делает возможным ковалентное связывание олигомера с одной или более конъюгированной группой, т.е. группой, которая сама не является нуклеиновой кислотой или звеньями, с образованием конъюгатов, описанных в данном документе. Обычно функциональная группа будет содержать химическую группу, способную ковалентно связываться с олигомером, например, через 3'-гидроксильную группу или экзоциклическую NH2-группу аденинового основания, спейсер, который предпочтительно представляет собой гидрофильную и терминальную группу, способную связываться с конъюгированной группой (например, амино, сульфгидрильная или гидроксильная группа). В некоторых воплощениях данная терминальная группа не защищена, например, представляет собой ИП2-группу. В других воплощениях терминальная группа защищена, например, посредством любой приемлемой защитной группы, такой как таковые, описанные в Защитные группы в Органическом синтезе Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts, 3rd edition (Jon Wiley&Sons, 1999). Примеры приемлемых гидроксильных защитных групп включают сложные эфиры, такие как сложный ацетатный эфир, аралкильные группы, такие как бензил, дифенилметил или трифенилметил и тетрагидропиранил. Примеры приемлемых аминозащитных групп включают бензил, альфа-метилбензил, дифенилметил, трифенилметил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и ацильные группы, такие как трихлорацетил или трифторацетил. В некоторых воплощениях функциональная группа является саморасщепляемой. В других воплощениях функциональная группа является биодеградируемой. См., например, U.S. Patent No. 7087229, который включен в данный документ во всей полноте посредством ссылки.
В некоторых воплощениях олигомеры по изобретению функционализированы на 5'-конце, чтобы сделать возможным ковалентное прикрепление конъюгированной группы к 5'-концу олигомера. В других воплощениях олигомеры по изобретению могут быть функционализированы на 3'-конце. В других воплощениях олигомеры по изобретению могут быть функционализированы вдоль цепи или по гетероциклической группе основания. В других воплощениях олигомеры по изобретению могут быть функционализированы более чем по одной позиции, выбранной из 5'-конца и 3'-конца, цепи и основания.
В некоторых воплощениях активированные олигомеры по изобретению синтезируют при помощи включения во время синтеза одного или более звеньев, ковалентно прикрепленных к функциональной группе. В других воплощениях активированные олигомеры по изобретению синтезируют при помощи
- 54 034924 звеньев, которые не функционализированы,и олигомер функционализируют после завершения синтеза. В некоторых воплощениях олигомеры функционализированы при помощи затрудненного сложного эфира, содержащего аминоалкильный линкер, где алкильная часть имеет формулу (CH2)w, где w представляет собой целое число, варьирующее от 1 до 10, предпочтительно приблизительно 6, где алкильная часть алкиламино группы может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь и где функциональная группа прикреплена к олигомеру через сложноэфирную группу (-O-C(O)-(CH2)wNH).
В других воплощениях олигомеры функционализированы при помощи затрудненного сложного эфира, содержащего(СН2^-сульфгидрильный (SH) линкер, где w представляет собой целое число, варьирующее от 1 до 10, предпочтительно приблизительно 6, где алкильная часть алкиламино группы может представлять собой прямую цепь или разветвленную цепь, и где функциональная группа прикреплена к олигомеру через сложноэфирную группу (-O-C(O)-(CH2)wSH). В некоторых воплощениях сульфгидрилактивированные олигонуклеотиды конъюгированы с полимерными группами, такими как полиэтиленгликоль или пептида (через образование дисульфидной связи).
Активированные олигомеры, содержащие затрудненные сложные эфиры, как описано выше, могут быть синтезированы посредством любого способа, известного в области техники, и в частности способов, раскрытых в РСТ Publication No. WO 2008/034122 и примерах в нем, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В других воплощениях олигомеры по изобретению функционализированы посредством введения сульфгидрильной, амино или гидроксильной группы в олигомер при помощи функционализирующего реагента фактически, как описанного в U.S. Patent Nos. 4962029 и 4914210, т.е., по существу, линейного реагента, содержащего фосфорамидит на одном конце, связанном через цепь спейсера с противоположным концом, который содержит защищенную или не защищенную сульфгидрильную, амино или гидроксильную группу. Такие реагенты в первую очередь реагируют с гидроксильныим группами олигомера. В некоторых воплощениях такие активированные олигомеры имеют функционализированный реагент, соединенный с 5'-гидроксильной группой олигомера. В других воплощениях активированные олигомеры имеют функционализированный реагент, соединенный с 3'-гидроксильной группой. В других воплощениях активированные олигомеры по изобретению имеют функционализированный реагент, соединенный с гидроксильной группой на остове олигомера. В дальнейших воплощениях олигомер по изобретению функционализирован при помощи более чем одного функционализирующего реагента, как описано в патентах США 4962029 и 4914210, включенных в данный документе посредством ссылки во всей их полноте. Способы синтеза таких функционализирующих реагентов и их включение в звенья или олигомеры раскрыты в патентах США 4962029 и 4914210.
В некоторых воплощениях 5'-терминальный конец олигомера, связанного с твердой фазой, функционализируют при помощи производного диенилфосфорамидита, с последующей конъюгацией незащищенного олигомера, например, с аминокислотой или пептидом через реакцию циклоприсоединения Дильса-Альдера.
В различных воплощениях включение звеньев, содержащих модификации 2'-сахара, такие как 2'-карбамат замещенный сахар или 2'-(О-пентил-№фталимидо)дезоксирибозу, в олигомер способствует ковалентному прикреплению конъюгированных групп к сахарам олигомера. В других воплощениях олигомер с аминосодержащим линкером в 2'-позиции одного или более звеньев получают при помощи реагента, такого как, например, 5'-диметокситритил-2'-О-(е-фталимидиламинопентил)-2'-дезоксиаденозин3'-^№диизопропил-цианоэтоксифосфорамидит (см., например, Manoharan et al., Tetrahedron Letters, 199 34, 7171.).
В дальнейших воплощениях олигомеры по изобретению могут иметь аминсодержащие функциональные группы на нуклеоосновании, в том числе на N6 аминогруппе пурина, на внециклическом N2 гуанина или на N4 или 5 позициях цитозина. В различных воплощениях такая функционализация может быть достигнута при помощи коммерческого реагента, который уже функционализирован при синтезе олигомера.
Некоторые функциональные группы коммерчески доступны, например гетеробифункциональные и гомобифункциональные связующие группы доступны от PierceCo. (Rockford, III.). Другие коммерчески доступные связующие группы представляют собой 5'-амино-модификатор С6 и 3'-амино-модификатор, оба доступные от Glen Research Corporation (Sterling, Va.). 5'-Амино-модификатор С6 также доступен от ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) в виде Aminolink-2, и 3'-амино-модификатор также доступен от Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.).
Полиолигомеры.
Как указано выше, в некоторых воплощениях настоящего изобретения олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата может содержать или быть частью молекулы, которая имеет две нацеливающие последовательности. В некоторых случаях данные молекулы также называют полиолигомерами.
В некоторых воплощениях олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую мо
- 55 034924 лекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L1 и L2 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок - L3 - компонент-носитель, где L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
компонент-носитель 1 - L1 - первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок - L3 компонент-носитель 2, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными, компонент-носитель 1 и компонент-носитель 2 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L1 - компонент-носитель 1 - L2 - второй олигомерный участок, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L1 и L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L1 - компонент-носитель 1 - L2 - второй олигомерный участок - L3 компонент-носитель 2, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L1 и L2 могут быть одинаковыми или различными, компонент-носитель 1 и компонент-носитель 2 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
компонент-носитель 1 - L1 - первый олигомерный участок - L2 - компонент-носитель 2 - L3 - второй олигомерный участок - L4 - компонент-носитель 3, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными, компонент-носитель 1, компонент-носитель 2 и компонент-носитель 3 могут быть одинаковыми или различными.
В некоторых воплощениях предпочтителен олигомерный конъюгат для применения по настоящему изобретению, где упомянутый олигомерный конъюгат имеет или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок, где L1 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой дополнительный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу, где L1 и L2 могут быть одинаковыми или различными.
В некоторых воплощениях присутствует линкер 1.
В некоторых воплощениях присутствует линкер 2.
В некоторых воплощениях присутствует линкер 3.
- 56 034924
В некоторых воплощениях компонент-носитель связан, предпочтительно конъюгирован с упомянутым первым олигомерным участком.
В некоторых воплощениях компонент-носитель связан, предпочтительно конъюгирован с 5'-концом упомянутого олигомера.
В некоторых воплощениях каждый и первый олигомерный участок, и второй олигомерный участок связан, предпочтительно конъюгирован при помощи линкера или ветвящего участка.
В некоторых воплощениях каждый и первый олигомерный участок, и второй олигомерный участок связан, предпочтительно конъюгирован при помощи физиологически лабильной линкерной группы или физиологически лабильного ветвящего участка.
В некоторых воплощениях изобретение предлагает полиолигомерное соединение, которое может содержать первый участок (участок РА), второй участок (участок РВ) и третий участок (участок PC), где первый участок ковалентно связан по меньшей мере с одним последующим олигомерным соединением (участок РА'), где первый участок (участок РА) и участок РА ковалентно связан через биорасщепляемый линкер (участок РВ'), который может быть, например, вторым участком, как раскрыто в данном документе, например участком по меньшей мере одной фосфодисложноэфирно связанной ДНК или РНК (такой как ДНК), например два, три, четыре или пять фосфодисложноэфирно связанных нуклеозида ДНК или РНК (например, ДНК нуклеозиды). Участки РВ и РВ' могут в некоторых воплощениях иметь одинаковую структуру, например одинаковое число нуклеозидов ДНК/РНК и фосфодисложноэфирных связей и/или одинаковую нуклеиновую последовательность. В других воплощениях участки РВ и РВ' могут быть различными. Например, полиолигомерные соединения могут обладать структурой, такой как (5'-3' или 3'-5') конъюгат/соединение носитель-PO-ON-PO'-ON', где конъюгат/соединение-носитель представляет собой участок PC, PO представляет собой участок РВ, РО' представляет собой участок РВ', и ON представляет собой участок РА, и ON' представляет собой участок РА.
Следует понимать, что участок РА может в некоторых воплощениях содержать множество дополнительных олигомерных соединений (например, дополнительных 2 или 3 олигомерных соединения), связанных последовательно (или в параллель) через биорасщепляемые линкеры, например конъюгат/соединение-носитель-PO-ON-PO-ON'-PO''-ON или конъюгат/соединение-носитель-PO-ON-pOON']n, где n может, например, представлять собой 1, 2 или 3, и каждый ON' может быть одинаковым или различным и, если различным, иметь одинаковую или различные мишени.
В аспекте настоящее изобретение предлагает полиолигомерные соединения (также упоминаемые в данном документе как олигомерные соединения) для применения при модулировании, таком как ингибирование целевой нуклеиновой кислоты в клетке, например НВх или HBsAg HBV. Олигомерное соединение содержит по меньшей мере два олигомерных участка, например (РА и РА'), и может содержать дополнительные олигомерные участки (например, РА). По меньшей мере один олигомерный участок представляет собой олигомер, который способен модулирвоать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV, например, олигомер, предложенный настоящим изобретением. В конкретных воплощениях каждый из РА, РА' (и РА, если присутствует) может представлять собой олигомер, который способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV, например, олигомер, предложенный настоящим изобретением. РА и РА' могут быть комплементарны различным позициям в последовательности-мишени.
В некоторых воплощениях РА может представлять собой олигомер, способный модулировать последовательность-мишень в НВх и РА (и/или РА, если присутствует) могут представлять собой олигомеры, способные модулировать различную последовательность-мишень. В конкретных воплощениях РА (и/или РА, если присутствует) может быть способен модулировать последовательность-мишень в HBsAg HBV. Например, РА (и/или РА, если присутствует) может представлять собой олигомер, способный модулировать последовательность-мишень в HBsAg HBV, как описано в данном документе.
В некоторых воплощениях РА может представлять собой олигомер, способный модулировать последовательность-мишень в НВх и РА (и/или РА, если присутствует) может представлять собой олигомеры, способные модулировать различные последовательности-мишени HBV. В конкретных воплощениях РА (и/или РА, если присутствует) может быть способен модулировать последовательность-мишень в HBsAg HBV. Например, РА (и/или РА, если присутствует) может представлять собой олигомер, способный модулировать последовательность-мишень в HBsAg HBV, как описано в данном документе.
Каждый олигомерный участок может быть фланкирован биорасщепляемым участком (участок РВ), который может, например, представлять собой дополнительный участок из 1-10 непрерывных нуклеотидов (участок РВ), который содержит по меньшей мере одну фосфодисложноэфирную связь, могут быть применены другие физиологически лабильные нуклеозидные участки.
В некоторых воплощениях олигомерные соединения по изобретению ковалентно связаны с конъюгирующей группой, нацеленной группой, реактивной группой, активирующей группой или блокирующей группой, возможно, через короткий участок, содержащий (например, 1-10) фосфодисложноэфирно связанных нуклеозидов ДНК или РНК. Примеры таких групп представляют собой компоненты-носители и конъюгатные компоненты, упомянутые в данном документе.
- 57 034924
В некоторых воплощениях соединение по изобретению не содержит РНК (звеньев). В некоторых воплощениях соединение по изобретению формирует единственную непрерывную последовательность, возможно связанную с функциональной группой, такой как конъюгирующая группа, и представляет собой линейную молекулу или синтезируется в виде линейной молекулы. Олигомерное соединение может таким образом представлять собой одноцепочечную молекулу. В некоторых воплощениях олигомер не содержит короткие участки, например по меньшей мере 3, 4 или 5 непрерывных нуклеотидов, которые, комплементарны эквивалентным участкам внутри одного и того же олигомерного соединения (т.е. дуплеты). Олигомер в некоторых воплощениях может не быть (в сущности) двухцепочечным. В некоторых воплощениях олигомер, по существу, является не двухцепочечным, например, не является миРНК.
Олигомерные участки РА, РА' и, если присутствует, РА, являются фосфоротиоатными олигомерами, т.е. по меньшей мере 70% межнуклеозидных связей внутри каждого олигомерного участка РА, РА' и если присутствует РА, являются фосфоротиоатными связями, например по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% или все межнуклеозидные связи, если присутствуют олигомерные участки РА, РА' и РА (если присутствует), являются фосфоротиоатными.
В некоторых воплощениях олигомерные участки РА, РА и если присутствует РА, могут формировать единственную непрерывную олигонуклеотидную последовательность. Участки РА, РА' и РА разрежены участками РВ, например, из 1, 2, 3, 4 или 5 фосфодисложноэфирно связанных нуклеозида ДНК.
В случае, когда участок РВ содержит только 1 нуклеозид, по меньшей мере одна или обе межнуклеозидные связи между нуклеозидами участка РВ (например, нуклеозид ДНК) могут представлять собой фосфодисложноэфирные связи. В случае, когда участок РВ содержит только два или более нуклеозида, межнуклеозидные связи между нуклеозидами участка РВ (например, нуклеозидами ДНК) могут представлять собой фосфодисложноэфирные связи и/или могут представлять собой другие межнуклеозидные связи, такие как фосфоротиоатные связи.
Олигомеры по изобретению, такие как РА, РА' и, если присутствует, РА, не формируют часть комплекса миРНК. Олигомеры по изобретению, такие как РА, РА' и если присутствует РА, являются не компементарными, например они не гибридизуются друг с другом с образованием участка из более чем 8 или в некоторых воплощениях более чем 6 непрерывных пар оснований. В некоторых воплощениях участки РА и РА не гибридизуются друг с другом с образованием более чем 4 непрерывных пар оснований. Примеры пар оснований могут представлять собой А-Т, G-C или A-U. В случае, когда присутствуют три олигомерных участка, РА, РА' и РА, существует некомплементарность между РА и РА', и РА' и РА, а также РА и РА.
Олигомерные участки РА, РА' и, если присутствует, РА, существуют не в виде дуплета (по существу) с комплементарным олигонуклеотидом, например не в виде миРНК.
В некоторых воплощениях олигомерные участки РА, РА' и РА имеют одинаковую непрерывную последовательность. В некоторых воплощениях олигомерные участки РА и РА' имеют одинаковую непрерывную нуклеотидную последовательность. В данном отношении изобретение предлагает одно соединение, которое может быть применено для доставки множества копий олигомера (т.е. с одинаковой непрерывной нуклеиновой последовательностью и возможно одинаковыми химическими модификациями) в целевую ткань.
Олигомерные участки (РА, РА' и, если присутствует, РА) связаны по меньшей мере через один биорасщепляемый участок, упомянутый в данном документе как участок РВ (и где существует более чем один участок РВ, участок РВ' и участок РВ). В некоторых воплощениях участок РВ содержит 1-10 нуклеозидов, которые формируют физиологически лабильный участок между олигомерными участками или между (или каждым) олигомерным участком и связующей группой. Могут быть применены участки из фосфодисложноэфирных нуклеозидов ДНК, но другие нуклеотидные участки могут быть применены, если они приемлемо физиологически лабильны.
В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь между олигомерным участком (РА, РА' или, если присутствует, РА) и (каждым) вторым участком РВ, связанным фосфодисложноэфирной связью с первым (или только) нуклеозидом ДНК или РНК участка РВ содержит по меньшей мере один фосфодисложноэфирно связанный нуклеозид ДНК или РНК.
Участок РВ может в некоторых воплощениях содержать дополнительные нуклеозиды ДНК и РНК, которые могут быть фосфодисложноэфирно связаны.
Как пояснено в данном документе, участок РВ может также быть применен для связи функциональной группы с олигомерным участком(ми), возможно через дополнительную связующую группу (PY). Применение участка РВ в качестве расщепляемого линкера для соединения функциональных групп с олигомером описано подробно в РСТ/ЕР2013/073858, который включен в данный документ посредством ссылки.
В некоторых воплощениях участок РВ является дополнительно ковалентно связанным с третьим участком, который может, например, представлять собой конъюгирующую, нацеливающую группу, реактивную группу и/или блокирующую группу (PC). Группа (PC) может представлять собой компонентноситель, как описано в данном документе.
- 58 034924
В некоторых воплощениях настоящее изобретение основано на обеспечении физиологически лабильного участка, второго участка, связывающего первый участок, например, антисмысловой олигонуклеотид, и конъюгирующую или функциональную группу, например компонент-носитель. Физиологически лабильный участок может содержать по меньшей мере один фосфодисложноэфирно связанный нуклеозид, такой как нуклеозид ДНК или РНК, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фосфодисложноэфирно связанных нуклеозидов, таких как ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигомерное соединение содержит расщепляемый (физиологически лабильный) линкер. В данном отношении расщепляемый линкер предпочтительно присутствует в участке РВ (или в некоторых воплощениях между участком РА и РВ).
В некоторых воплощениях один (или более или все) участок РВ может содержать или состоять по меньшей мере из одного нуклеозида ДНК или РНК, связанного с первым участком через фосфодисложноэфирную связь. В некоторых аспектах межнуклеозидную связь между олигомерным участком и вторым участком рассматривают как часть участка РВ.
В некоторых воплощениях (или более или каждый) участок РВ содержит или состоит по меньшей мере из 1-10 связанных нуклеозидов, таких как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 связанных нуклеотидов ДНК или РНК. В тоже время участок фосфодисложного эфира ДНК/РНК является важным в обеспечении расщепляемого линкера, возможно, что участок РВ также содержит нуклеозидные аналоги с модифицированным сахаром, такие как таковые рассматриваемые для первого участка, упомянутого выше. Однако в некоторых воплощениях нуклеозиды участка РВ (возможно независимо) выбраны из группы, состоящей из ДНК или РНК. В некоторых воплощениях нуклеозиды участка РВ (возможно независимо) представляют собой ДНК. Следует учитывать, что нуклеозиды участка РВ могут содержать нуклеотидные основания естественного или неестественного происхождения. Обычно участок РВ содержит по меньшей мере один сложноэфирносвязанный нуклеозид ДНК или РНК (который может в некоторых воплощениях быть первым нуклеозидом, прилегающим к олигомеру). В случае, когда участок РВ содержит другие нуклеозиды, участок РВ также может содержать нуклеозидные связи, отличные от фосфодисложноэфирных, такие как (возможно независимо) фосфоротиоатную, фосфодитиоатную, боранофосфатную или метилфосфатную. Однако в других воплощениях, приведенных для примера, все межнуклеозидные связи участка РВ представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все нуклеозидные связи участка РВ содержат (возможно независимо) или 2'-ОН-рибозу (РНК) или 2'-Н-сахар, т.е. РНК или ДНК. 1-5 или 1-4, например, 2, 3, 4 фосфат (фосфатдисложный эфир) связанных нуклеозида ДНК особо полезны в соединениях по изобретению.
В некоторых воплощениях второй участок содержит или состоит по меньшей мере из 1-10 (например, фосфодисложноэфирно) связанных нуклеозидов ДНК или РНК, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (например, фосфодисложноэфирно) связанных нуклеотидов ДНК или РНК.
В некоторых воплощениях участок РВ содержит не более чем 3 или не более чем 4 последовательных нуклеозида ДНК или РНК (таких как нуклеозиды ДНК). Так, участок РВ может быть таким коротким, что не будет рекрутировать РНКазу Н, аспект, который может быть важным в воплощениях, когда участок РВ не формирует часть единой непрерывной нуклеиновой последовательности, которая комплементарна мишени. Более короткий участок РВ, например, из 1-4 нуклеотидов в длину также может быть предпочтителен в некоторых воплощениях, поскольку они маловероятно будут последовательностьюмишенью специфических рестрицирующих ферментов. Например, возможно варьировать чувствительность участка РВ к расщеплению эндонуклеазами и таким образом улучшить скорость активации активного олигомера in vivo или даже внутриклеточно. Соответственно, при необходимости очень быстрой активации, более длинные участки РВ могут быть применены и/или участки В, которые содержат сайты распознавания (например, клеточно- или тканеспецифично или различно экспрессируемые) рестрикционные ферменты.
В некоторых воплощениях участок РВ может быть конъюгирован с функциональной группой (PC), такой как конъюгирующая, нацеливающая реактивная группа, активирующая группа или блокирующая группа, возможно через линкерную группу (PY как таковые предложенные в данном документе).
Функциональные группы также могут быть присоединены к олигомерному участку или соединению по изобретению другими способами, например, через фосфат нуклеозидную связь (например, фосфодисложноэфирную, фосфоротиоатную, фосфодитиоатную, боранофосфатную или метилфосфонатную) или тиазольную группу. В некоторых аспектах связующая группа является такой же, как участок РВ по меньшей мере между двумя олигомерными участками, и например, может представлять собой фосфодисложноэфирную связь.
В некоторых воплощениях нуклеотиды ДНК или РНК (или более или каждый) участка РВ независимо выбраны из нуклеотидов ДНК или РНК. В некоторых воплощениях нуклеотиды ДНК или РНК (или более или каждый) участка РВ представляют собой нуклеотиды ДНК. В некоторых воплощениях нуклеотиды ДНК или РНК (или более или каждый) участка РВ представляют собой нуклеотиды РНК.
В контексте второго участка термин нуклеозид ДНК или РНК может содержать основание естественного или неестественного происхождения (также рассматриваемое как аналог основания или модифицированное основание).
- 59 034924
Следует понимать, что в некоторых воплощениях (или более или каждый) участок РВ может дополнительно содержать другие нуклеотиды или нуклеотидные аналоги. В некоторых воплощениях (или более или каждый) участок РВ содержит нуклеозиды только ДНК или РНК. В некоторых воплощениях (или более или каждый) участок РВ содержит более чем один нуклеозид, межнуклеозидные связи в или каждом участке РВ содержат фосфодисложноэфирные связи. В некоторых воплощениях, в случае когда (или более или каждый) участок РВ содержат более чем один нуклеозид, все межнуклеозидные связи во втором участке содержат фосфодисложноэфирные связи.
В некоторых воплощениях по меньшей мере два последовательных нуклеозида (или более или каждый) участка РВ представляют собой нуклеозиды ДНК (например, по меньшей мере 3 или 4 или 5 последовательных нуклеотидов ДНК). В некоторых воплощениях по меньшей мере два последовательных нуклеозида (или более или каждый) участка РВ представляют собой нуклеозиды РНК (например, по меньшей мере 3 или 4 или 5 последовательных нуклеотидов РНК). В некоторых воплощениях по меньшей мере два последовательных нуклеозида (или более или каждый) участка РВ представляют собой по меньшей мере один нуклеозид ДНК и по меньшей мере один нуклеозид РНК. Межнуклеозидная связь между участком РА и участком РВ может представлять собой фосфодисложноэфирную связь. В некоторых воплощениях в случае, когда участок РВ содержит более чем один нуклеозид, по меньшей мере одна дополнительная межнуклеозидная связь является фосфодисложноэфирной, например связующая группа(ы) между 2 (или 3 или 4 или 5) нуклеозидами, прилегающими к участку РА.
Участок РВ может быть фланкирован по меньшей мере с одной стороны (или 5' или 3') первым участком, например, антисмысловым олигонуклеотидом, и с другой стороны (или 3' или 5' соответственно, через дополнительный олигомерный участок (РА), или конъюгирующую группу или аналогичную группу (например, блокирующую группу, нацеливающую группу или группу небольшой терапевтической молекулы), возможно через линкерную группу (т.е. между вторым участком и конъюгирующей/блокирующей группой и т.д.).
В некоторых воплощениях, участок РВ не формирует комплементарной последовательности в случае, когда олигомерный участок (например, РА, РА' и/или РА) и РВ выравнены с комплементарной последовательностью-мишенью.
В некоторых воплощениях участок РВ не формирует комплементарной последовательности в случае, когда олигомерный участок (например, РА, РА' и/или РА) и РВ выравнен с комплементарной последовательностью-мишенью. В этом отношении участок РА и РВ вместе могут формировать единую непрерывную последовательность, которая комплементарна последовательности-мишени.
В некоторых воплощениях последовательность оснований в участке РВ выбрана для обеспечения оптимального сайта расщепления эндонуклеазой, на основании преобладающих эндонуклеаз, присутствующих в целевой ткани или клетке или субклеточном компартменте. В данном отношении посредством выделения клеточных экстрактов из целевых тканей и не целевых тканей, последовательности, расщепляемые эндонуклеазами для применения в участке РВ, могут быть выбраны на основании предпочтительной расщепляющей активности в желаемой целевой клетке (например, печень/гепатоциты) по сравнению с нецелевой клеткой (например, почка). В данном отношении эффективность соединения для нацеленного снижения экспрессии может быть оптимизирована для желаемой ткани/клетки.
В некоторых воплощениях участок РВ содержит динуклеотид последовательности АА, AT, AC, AG, ТА, ТТ, ТС, TG,CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC или GG, где С может представлять собой 5-метилцитозин и/или Т может быть замещен U.
В некоторых воплощениях участок РВ содержит тринуклеотид последовательности ААА, ААТ, AAC, AAG, ATA, ATT, АТС, ATG, АСА, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, ТСТ, ТСС, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, СТА, CTG, СТС, СТТ, ССА, ССТ, ССС, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC и GGG, где С может представлять собой 5-метилцитозин и/или Т может быть замещен U.
В некоторых воплощениях участок РВ содержит тетрануклеотид последовательности АААХ, ААТХ, ААСХ, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, АСАХ, АСТХ, АССХ, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, ТААХ, ТАТХ, ТАСХ, TAGX, ТТАХ, ТТТХ, ТТСХ, TAGX, ТСАХ, ТСТХ, ТССХ, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, СААХ, САТХ, САСХ, CAGX, СТАХ, CTGX, СТСХ, СТТХ, ССАХ, ССТХ, СССХ, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX и GGGX, где X может быть выбран из группы, состоящей из А, Т, U, G, С и их аналогов, где С может представлять собой 5-метилцитозин и/или Т может быть замещен U. Следует понимать, что ссылки на (естественного происхождения) нуклеотидные основания А, Т, U, G, С, они могут быть замещены нуклеотидными аналогами, которые функционируют эквивалентно нуклеотидам естественного происхождения (например, пара оснований с комплементарным нуклеозидом).
В некоторых воплощениях соединение по изобретению может содержать более чем одну конъюгирующую группу (или более чем одну функциональную группу РХ, такую как конъюгирующая, нацеливающая, блокирующая или активирующая группа), например 2 или 3 такие группы. В некоторых вопло
- 60 034924 щениях участок РВ ковалентно связан, возможно через [например, не нуклеотидную] линкерную группу), по меньшей мере с одной функциональной группой, например двумя или тремя функциональными группами. В некоторых воплощениях первый участок (РА) может быть ковалентно связан (например, через межнуклеозидные связи, такие как фосфодисложноэфирные связи) с двумя участками РВ, например один 5' и один 3' с первым участком РА, где каждый участок РВ может быть (возможно независимо) выбран из участка РВ, описанного в данном документе.
Композиция.
Олигомеры по изобретению и олигомерные конъюгаты по изобретению могут быть применены в фармацевтических препаратах и композициях. Соответственно такие композиции содержат фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант. WO 2007/03109 предлагает приемлемый и предпочтительный фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель и адъювант, который включен в данный документ посредством ссылки. Приемлемые дозы, препараты, пути введения, композиции, дозированные формы, комбинации с другими терапевтическими агентами, пролекарственные препараты также предложены в WO 2007/03109, который также включен в данный документ посредством ссылки.
Фармацевтические композиции по изобретению могут включать фармацевтически приемлемый носитель, который может содержать различные компоненты, которые обеспечивают различные функции, включая регуляцию концентрации лекарственного средства, регуляцию растворимости, химическую стабилизацию, регуляцию вязкости, повышение абсорбции, регуляцию рН и т.п.
Фармацевтический носитель может содержать приемлемый жидкий носитель или эксципиент и возможную вспомогательную добавку или добавки. Жидкие носители и эксципиенты являются обычными и коммерчески доступными. Примерами таковых являются дистиллированная вода, физиологический раствор, водные растворы декстрозы и т.п. Для водорастворимых препаратов, фармацевтическая композиция предпочтительно включает буфер, такой как фосфатный буфер, или другие соли органических кислот, предпочтительно при рН в диапазоне 6,5-8. Для препаратов, содержащих слаборастворимые антисмысловые соединения, могут быть применены микроэмульсии, например, при помощи неионного поверхностно-активного вещества, такого как полисорбат 80 в количестве 0,04-0,05% (мас./об.), для повышения растворимости. Другие компоненты могут включать антиокислители, такие как аскорбиновая кислота, гидрофильные полимеры, такие как моносахара, дисахара, и другие углеводороды, включая целлюлозу и ее производные, декстрины, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, и подобные компоненты, хорошо известные в фармацевтической области, например в Remington's Pharmaceutical Science, latest edition (Mack Publishing Company, Easton, Pa.).
Олигонуклеотиды по изобретению включают их фармацевтически приемлемые соли, включая соли щелочноземельных металлов, например натрия или магния, аммония или NX4 +, где X представляет собой С1-С4-алкил. Другие фармацевтически приемлемые соли включают органические карбоновые кислоты, такие как муравьиная, уксусная, молочная, винная, яблочная, изэтиновая, лактобионовая и янтарная кислоты; органические сульфоновые кислоты, такие как метансульфоновая, этансульфоновая, толуолсульфоновая кислота и бензолсульфоновая; и неорганические кислоты, такие как соляная, серная, ортофосфорная и сульфаминовая кислоты. Фармацевтически приемлемые соли соединения, имеющие гидроксильную группу, включают анион такого соединения с приемлемым катионом, таким как Na+, NH4+ или т.п.
Пациент должен получать достаточную ежедневную дозу олигонуклеотида для достижения эффективной безопасной внутриклеточной концентрации комбинированных олигонуклеотидов. Специалисты в области техники должны быть способны быстро определять соответствующие дозы и схемы введения для того, чтобы удовлетворить специфические условия и потребности пациента.
Эффективность лечения может быть оценена при помощи обычных способов, которые применяют для определения будет или нет возникать ремиссия. Такие способы обычно основаны на морфологических, цитохимических, цитогенетических и молекулярных анализах. Кроме того, ремиссия может быть оценена генетически посредством анализа уровня экспрессии одного или более соответствующих генов. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть применена для определения даже очень небольших количеств транскрипта мРНК.
Способы доставки олигонуклеотида.
Олигонуклеотиды и конъюгаты по изобретению предпочтительно могут быть введены субъекту орально или местно, но также могут быть введены внутривенно посредством инъекции. Дизайн носителя разрабатывается соответственно. Альтернативно, олигонуклеотид может быть введен подкожно через дозированные формы с контролируемым высвобождением или обычные препараты для внутривенной инъекции. Предпочтительный способ введения олигонуклеотидов содержит или местную, системную, или регионарную перфузию, как соответствует. Согласно способу регионарной перфузии, приносящие и выносящие сосуды, снабжающие конечность, имеющую повреждение, изолируют и соединяют с низкопоточным перфузионным насосом совместно с оксигенатором и теплообменником. Подвздошные сосуды могут быть применены для перфузии нижней конечности. Подмышечные сосуды высоко канюлируют в подмышечной области для повреждений верхней конечности. Олигонуклеотиды добавляют в перфузионный ток, и перфузию продолжают в течение соответствующего периода времени, например 1 ч. Могут
- 61 034924 быть применены скорости перфузии от приблизительно 100 до 150 мл/мин для повреждений нижней конечности, в то же время половина данной скорости должная быть применена для повреждений верхней конечности. Системная гепаринизация может быть применена во время перфузии и завершена после прекращения перфузии. Данная перфузионная техника выделения делает возможным введение более высоких доз хемотерапевтического агента, чем те, которые будут толерантными, при артериальной или системной венной циркуляции.
В конкретном воплощении олигомеры и конъюгаты по изобретению вводят системно или получают для системного введения.
Для системной инфузии олигонуклеотиды предпочтительно доставляют через центральный венозный катетер, соединенный с соответствующим устройством для непрерывной инфузии. Полостные катетеры обеспечивают долгосрочный доступ к внутривенной циркуляции для частого введения лекарственного средства в течение длительного периода времени. Их обычно хирургически вводят в поверхностную мозговую или внутреннюю яремную вену при общей или местной анестезии.
Подключичная вена является другим распространенным участком катетеризации. Инфузионная помпа может быть внешней или может формировать часть полностью имплантируемой в центральную вену системы, такой как система INFUSAPORT, доступная от Infusaid Corp., Norwood, Mass, и система PORT-A-CATH, доступная от Pharmacia Laboratories, Piscataway, N.J. Данные устройства имплантируют в подкожный мешок при местной анестезии. Катетер, соединенный с впускным отверстием помпы, продевают через подключичную вену к верхней полой вене. Имплант содержит источник олигонуклеотидов в резервуаре, который может быть снова пополнен при необходимости при помощи инъекции дополнительного лекарственного средства из гиподермальной иглы через самовосстанавливающуюся перегородку в резервуаре. Предпочтительны полностью имплантируемые инфузоры, поскольку они обычно хорошо переносятся пациентом ввиду удобства, легкости поддержания и косметических преимуществ таких устройств.
Олигонуклеотиды и конъюгаты по изобретению могут быть введены посредством любого способа, описанного в патенте США 4740463, включенном в данный документ посредством ссылки. Одна из техник представляет собой трансфекцию in vitro, которая может быть выполнена посредством различных способов. Один из способов трансфекции включает добавление DEAE-декстрана для усиления захвата депротеинизированных молекул ДНК клетками-реципиентами. См. Me Cutchin, J.H. and Pagano, J.S., J. Natl. Cancerlnst. 41, 351-7 (1968). Другой способ трансфекции представляет собой способ кальцийфосфатной преципитации, который зависит от добавления Са2+ к фосфатсодержащему раствору ДНК. Получаемый осадок должен включать ДНК в ассоциации с кальций-фосфатными кристаллами. Данные кристаллы располагаются на клеточном монослое; полученное соприкосновение кристаллов и клеточной поверхности приводит к захвату ДНК. Небольшая часть захваченной ДНК экспрессируется в трансфектанте, а также в его клонах. См. Graham, F.L. and van der Eb, A. J., Virology, 52, 456-467 (1973) and Virology, 54, 536-539 (1973).
Трансфекция также может быть выполнена посредством доставки, опосредованной катионными фосфолипидами. В частности, могут быть сформированы поликатионные липосомы из Н-|1-(2.3-диолеилокси)пропил]-Н,^№триметиламмоний хлорид (DOT-MA). См. Felgneretal., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413-7417 (1987) (ДНК-трансфекция); Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 6077-6081 (1989) (РНКтрансфекция).
Для системного или регионарного in vivo введения, количества олигонуклеотидов могут варьировать в зависимости от природы и степени заболевания, конкретных используемых олигонуклеотидов и других факторов. Действительные применяемые дозы могут учитывать размер и массу пациента, или учитывать, является лечение профилактическим или терапевтическим, возраст, здоровье и пол пациента, путь введения, или учитывать, является ли лечение системным или регионарным, и другие факторы.
Кроме того, введение при помощи обычных фармацевтических носителей, антисмысловых олигонуклеотидов может быть выполнено при помощи различных специализированных способов доставки олигонуклеотидов. Системы замедленного высвобождения, приемлемые для применения с фармацевтическими композициями по изобретению, включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде пленок, микрокапсул или т.п., которые могут содержать полилактид; сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Е-глутамата, поли(2-гидроксиэтилметакрилата), и подобные материалы, например Rosenberg et al., International application PCT/US92/05305.
Олигонуклеотиды и конъюгаты могут быть инкапсулированы в липосомы для терапевтической доставки, как описано, например, в Liposome Technology, Vol. II, Incorporation of Drugs, Proteins, and Genetic Material, CRC Press. Олигонуклеотиды в зависимости от их растворимости могут присутствовать как в водном слое, так и в липидном слое или в том, что обычно называют липосомной суспензией. Г идрофобный слой обычно, но не исключительно, содержит фосфолипиды, такие как лецитин и сфингомиелин, стероиды, такие как холестерол, ионные поверхностно-активные вещества, такие как диацетилфосфат, стеариламин или фосфатидная кислота, и/или другие материалы гидрофобной природы. Также содержимое представляет собой новые катионные амфифилы, называемые молекулярными зонтиками, которые описаны в (DeLongetal, Nucl. Acid. Res., 1999, 27(16), 3334-3341).
- 62 034924
Воплощения настоящего изобретения могут быть доставлены при помощи способов дисперсных систем и/или полимеров. Дисперсные системы и полимеры для in vitro и in vivo доставки полинуклеотидов подробно рассмотрены Feigner в Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 163-187 (1990). Способы прямой доставки также описаны в Cook S.T. Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, Marcel Dekker, Inc, 2001.
Пролекарственные средства.
Олигонуклеотиды могут быть синтезированы в качестве пролекарственных средств, несущих липофильные группы, такие как, например, метил-SATE (S-ацетилтиоэтил) или трет-Bu-SATE (S-пивалоилтиоэтил) защитные группы, которые придают олигонуклеотиду устойчивость к нуклеазам, улучшают клеточный захват и селективно снимают защиту после введения в клетку, как описано в Vives et. al. Nucl. Acids Res. 1999, Vol. 27, 4071-4076.
Кольцевые молекулы.
Олигонуклеотиды могут быть синтезированы в виде кольцевых молекул, в которых 5'- и 3'-концы олигонуклеотидов ковалентно связаны или удерживаются вместе за счет аффинности пары, один из членов которой прикреплен ковалентно к 5'-концу, а другой прикреплен ковалентно к 3'-концу. Такая циркуляризация защищает олигонуклеотид от разрушения экзонуклеазами и может улучшать клеточный захват и распределение. В одном аспекте изобретения группа, связывающая 5'- и 3'-конец кольцевого олигонуклеотида расщепляется автоматически после попадания в любой тип клетки человека или позвоночного, таким образом линеализируя олигонуклеотид и делая его способным к гибридизации с последовательностью-мишенью. В другом аспекте группа, связывающая 5'- и 3'-концы олигонуклеотида, конструируется так, что расщепление предпочтительно происходит только в определенном типе клеток, которые экспрессируют мРНК, являющуюся мишенью для антисмыслового олигонуклеотида. Например, кольцевой антисмысловой олигонуклеотид, направленный против гена, вовлеченного в вирусное заболевание, может быть приведен в действие только за счет линеаризации только в субпопуляции клеток, экспрессирующих интересующий ген, например, НВх или HBsAg HBV.
Дополнительное фармацевтическое вещество.
Олигомеры и олигомерные конъюгаты по изобретению могут быть применены в качестве в первую очередь терапевтических средств для лечения заболевания или могут быть применены в комбинации с не олигонуклеотидными лекарственными средствами.
Соответственно, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую систему, содержащую фармацевтическую композицию, как описано в данном документе, и дополнительное фармацевтическое вещество. Дополнительное фармацевтическое вещество может представлять собой любой терапевтический агент, известный в области техники. Например, дополнительное фармацевтическое вещество может представлять собой антитело, небольшую терапевтическую молекулу, полинуклеотид или вектор для генной терапии (например, вектор, способный экспрессировать терапевтические полипептиды или агенты РНК-интерференции).
Таким образом, олигомер или олигомерный конъюгат по настоящему изобретению может быть применен в комбинации с другими активными веществами, например другими противовирусными веществами.
Например, олигомер или олигомерный конъюгат по настоящему изобретению может быть применены в комбинации с другими активными веществами, такими как противовирусные вещества на основе олигонуклеотидов, например противовирусные активные вещества со специфичной олигонуклеотидной последовательностью, действуя или через антисмысловые (включая другие олигомеры LNA), миРНК (такие как ARC520), аптамеры, морфолиновые олигомеры или любые другие противовирусные, основанные на нуклеотидной последовательности способы действия.
Например, олигомер или олигомерный конъюгат по настоящему изобретению может быть применен в комбинации с другими активными веществами, такими как противовирусные соединения, стимулирующие иммунитет, такие как интерферон (например, пегилированный интерферон альфа), TLR7 агонисты (например, GS-9620) или терапевтические вакцины.
Например, олигомер или олигомерный конъюгат по настоящему изобретению может быть применен в сочетании с другими активными веществами, такими как небольшие молекулы, с противовирусной активностью. Такие другие активные вещества могут представлять собой, например, нуклеозид/нуклеотидные ингибиторы (например, энтекавир или тенофовир дизопропоксил фумарат), ингибиторов инкапсуляции, ингибиторов входа (например, Myrcludex В).
В конкретных воплощениях дополнительный терапевтический агент может представлять собой агент HBV, агент вирус гепатита С (HCV), хемотерапевтический агент, антибиотик, анальгетик, нестероидный противовоспалительный (NSAID) агент, фунгальный агент, антипаразитарный агент, агент против тошноты, противодиарейный агент или иммуносупрессирующий агент.
В конкретных близких воплощениях дополнительный агент HBV может представлять собой интерферон-альфа-2Ъ, интерферон-альфа-2а и интерферон-альфакон-1 (пегилированный и непегилированный), рибавирин; ингибитор репликации РНК HBV; второй антисмысловой олигомер; терапевтическую вакцину против HBV; профилактическую вакцину против HBV; ламивудин (3ТС); энтекавир (ETV); тенофо
- 63 034924 вирдиизопропоксилфумарат (TDF); телбивудин (LdT); адефовир или терапевтическое антитело к HBV (моноклональное или поликлональное).
В других конкретных близких воплощениях дополнительный агент HCV может представлять собой интерферон-альфа-2Ъ, интерферон-альфа-2а и интерферон-альфакон-1 (пегилированный и непегилированный); рибаверин; ингибитор репликации РНК HCV (например, ViroPharma's серии VP50406); антисмысловой агент HCV; терапевтическую вакцину против HCV; ингибитор протеазы HCV; ингибитор геликазы HCV; или моноклональное или поликлональное терапевтическое антитело к HCV.
Дополнительное фармацевтическое вещество может представлять собой олигомер или олигомерный конъюгат, как определено в данном документе.
В конкретных воплощениях фармацевтическая система может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, до множества олигомеров или олигомерных конъюгатов, предложенных настоящим изобретением.
В конкретных воплощениях дополнительное фармацевтическое вещество может представлять собой олигомер или олигомерный конъюгат способный модулировать последовательность-мишень в HBV. Олигомеры или конъюгаты могут каждый быть способны модулировать последовательность-мишень в HBV НВх или HBsAg. Олигомеры или конъюгаты могут быть способны модулировать последовательность-мишень в HBV, которая не находится внутри НВх или HBsAg. Например, по меньшей мере один олигомер или конъюгат может быть способен модулировать последовательность-мишень внутри гена HBV или мРНК HBcAg, HBeAg, или ДНК полимеразы.
В конкретных воплощениях олигомер или дополнительный олигомер или конъюгат или дополнительный конъюгат могут быть способны модулировать последовательность-мишень в гене HBV или мРНК HBsAg.
В случае применения комбинации олигонуклеотидов, нацеленных на различные последовательности-мишени, соотношение количеств различных типов олигонуклеотида может варьировать в очень широком диапазоне. Согласно одному предпочтительному воплощению изобретения олигонуклеотиды всех типов присутствуют в приблизительно эквивалентных молярных количествах.
Введение и дозировка.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат терапевтически эффективное количество конъюгата по изобретению. Композиция может быть получена для применения в различных системах доставки лекарственного средства. Один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов или носителей также могут быть включены в композицию для надлежащего препарата. Приемлемые препараты для применения по настоящему изобретению найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985.
Для краткого обзора способов доставки лекарственного средства см., например, Langer (Science, 249:1527-1533, 1990).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предназначены для парентерального, интраназального, местного, орального или локального введения, такого как трансдермальное, для профилактического и/или терапевтического лечения. Фармацевтические композиции могут быть введены парентерально (например, внутривенная, внутримышечная или подкожная инъекция) или посредством перорального приема внутрь, или посредством местного применения или внутрисуставной инъекции. Дополнительные пути введения включают внутрисосудистое, внутриартериальное, внутриопухолевое, интраперитонеальное, интравентрикулярное, интраэпидуральное, а также назальное, офтальмическое, интрасклеральное, интраорбитальное, ректальное местное или аэрозольно-ингаляционное введение. Введение с замедленным высвобождением также отдельно включено в изобретение, посредством инъекции вещества замедленного всасывания или эродируемые импланты или компоненты. Таким образом, изобретение предлагает композиции для парентерального введения, которые содержат вышеупомянутые агенты, растворенные или суспендированные в приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе, например, воде, забуференной воде, солевом растворе, PBS и т.п. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требуемые для аппроксимации физиологических условий, такие как агенты регуляции рН и забуферивающие агенты, агенты, регулирующие тоничность, увлажняющие агенты, детергенты и т.п. Изобретение также предлагает композиции для оральной доставки, которые могут содержать инертные ингредиенты, такие как связующие вещества или наполнители для получения таблетки, капсулы и т.п. Более того, данное изобретение предлагает композиции для локального введения, которые могут содержать инертные ингредиенты, такие как растворители или эмульгаторы для получения крема, мази и т.п.
В конкретном воплощении олигомеры и конъюгаты по изобретению вводят подкожно или получают для подкожного введения.
Данные композиции могут быть стерилизованы обычными способами стерилизации, например стерильным фильтрованием. Полученные водные растворы могут быть упакованы как есть или лиофилизированы, лиофилизированный препарат комбинируют со стерильным водным носителем перед введением. рН препаратов будет составлять от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 или от 6 до 8 и наиболее предпочтительно от 7 до 8, например от 7 до 7,5. Полученные композиции в твердой форме могут быть
- 64 034924 упакованы в виде множественных дозированных форм, каждая, содержащих фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов, таких как запаянная упаковка таблеток или капсул. Композиция в твердой форме может также быть упакована в гибкий контейнер, такой как сжимаемая туба, разработанная для местно применяемого крема или мази.
Композиции, содержащие эффективное количество, могут быть введены для профилактического или терапевтического лечения. В профилактических применениях композиции могут быть введены субъекту с клинически определенной предрасположенностью или повышенной чувствительностью к развитию опухоли или рака, нейродегенеративного заболевания или лизосомального расстройства. Композиции по изобретению могут быть введены пациенту (например, человеку) в количестве, достаточном для задержки, уменьшения или предпочтительно предупреждения возникновения клинического заболевания или опухолеобразования. В терапевтических применениях композиции вводят субъекту (например, человеку), уже страдающему заболеванием (например, рак, нейродегенеративное расстройство или лизосомальная болезнь накопления), в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере частичного, прекращения симптомов состояния и его осложнений. Количество, подходящее для удовлетворения данной цели, определено в виде терапевтически эффективной дозы количества соединения, достаточного для существенного улучшения некоего симптома, ассоциированного с заболеванием или медицинским состоянием. Например, при лечении рака, нейродегенеративного заболевания или лизосомальной болезни накопления агент или соединение, которое снижает, предотвращает, задерживает, подавляет или останавливает любой симптом заболевания или состояния будет терапевтически эффективным. Терапевтически эффективное количество агента или соединения не требуется для лечения заболевания или состояния, но будет обеспечивать лечение заболевания или состояния, так что возникновение заболевания или состояния задерживается, блокируется или предотвращается или заболевание или симптомы состояния улучшаются, или термин заболевание или состояние изменен или, например, является менее серьезным, или восстановление усилено у индивидуума. Количества, эффективные для данного применения, могут зависеть от серьезности заболевания или состояния и массы и общего состояния пациента, но обычно варьируют от приблизительно 0,5 до приблизительно 3000 мг агента или агентов на дозу на пациента. Приемлемые режимы для начального введения и бустерные введения типизированы посредством начального введения с последующими повторными дозами в интервал 1 ч или более, 1 день, 1 неделя или 1 месяц при помощи последующего введения. Общее эффективное количество агента, присутствующего в композициях по изобретению, может быть введено млекопитающему в виде единичной дозы или в виде болюса или посредством инфузии через относительно короткие периоды времени или может быть введено при помощи фракционированного протокола лечения, в котором множественные дозы вводят в течение более длительного периода времени (например, доза каждые 4-6, 8-12, 14-16 или 18-24 ч или каждые 2-4 дня, 1-2 недели, раз в месяц). Альтернативно предполагают непрерывную внутривенную инфузию, достаточную для поддержания терапевтически эффективных концентраций в крови.
Терапевтически эффективное количество одного или более агентов, присутствующее внутри композиций по изобретению и применяемое в способах применения данного изобретения у млекопитающих (например, людей), может быть определено специалистами в области техники при рассмотрении индивидуальных различий в возрасте, массе и состоянии млекопитающего. Агенты по изобретению вводят субъекту (например, млекопитающему, такому как человек) в эффективном количестве, которое дает желаемый результат у субъекта, получающего лечение (например, замедление или ремиссию рака или нейродегенеративного расстройства). Терапевтически эффективные количества могут быть определены эмпирически специалистами в области техники.
Пациент также может получать агент в диапазоне от приблизительно 0,1 до 3000 мг на дозу один или более раз в неделю (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 или более раз в неделю), 0,1-2500 мг дозы в неделю (например, 2000, 1500, 1000, 500, 100, 10, 1, 0,5 или 0,1). Пациент также может получать агент композиции в диапазоне от приблизительно 0,1 до 3000 мг на дозу раз в две или три недели. Единичные или множественные применения композиций по изобретению, содержащие эффективные количества, могут быть выполнены с уровнями доз и паттерном, выбранными лечащим врачом. Доза и схема введения могут быть определены и подведены на основании тяжести заболевания или состояния у пациента, которое может быть мониторировано во время курса лечения согласно способам, широко практикуемым клиницистами или таковым, описанным в данном документе.
Носитель и конъюгаты по настоящему изобретению могут быть применены в комбинации с или обычными способами лечения или терапией или могут быть применены отдельно от обычных способов лечения или терапии.
В случае, когда конъюгаты по данному изобретению вводят в комбинации с терапиями другими агентами, они могут быть введены индивидууму последовательно или параллельно. Альтернативно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут входить в состав комбинации с конъюгатом носитель-агент по настоящему изобретению в ассоциации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, как описано в данном документе, и другим терапевтическим или профилактическим агентом, известным в области техники.
- 65 034924
Дальнейшие применения.
Олигомеры по изобретению могут быть применены в качестве исследовательских реагентов, например, для диагностики, терапии или профилактики.
При исследовании такие олигомеры могут быть применены для специфичного ингибирования экспрессии продукта последовательности-мишени (обычно посредством деградации или ингибирования мРНК и таким образом предотвращения образования белка) в клетках и экспериментальных животных, таким образом усиливая функциональный анализ мишени или оценки ее полезности в качестве мишени для терапевтического вмешательства.
В диагностике олигомеры могут быть применены для детекции и количественного анализа продукта экспрессии последовательности-мишени в клетках или тканях при помощи Нозерн-блота, гибридизации in situ или сходных техник.
В случае терапии животное или человека, предположительно имеющего заболевание или расстройство, которые могут быть вылечены посредством модулирования экспрессии последовательностимишени, лечат при помощи введения олигомерных соединений по данному изобретению. Предложенное в дальнейшем представляет собой способы лечения млекопитающего, такие как лечение человека, предположительно имеющего склонность к заболеванию или состоянию, ассоциированному с экспрессией последовательности-мишени посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества одного или более олигомеров или композиций по изобретению. Олигомер, конъюгат или фармацевтическую композицию по изобретению обычно вводят в эффективном количестве.
Изобретение также предлагает применение соединения или конъюгата по изобретению, как описано в данном документе, для производства лекарственного препарата для лечения заболевания, упоминаемого в данном документе, или способ лечения заболевания, упоминаемого в данном документе.
Изобретение также предлагает способ лечения заболевания, упоминаемого в данном документе, упомянутый способ, содержащий введение соединения по изобретению, как описано в данном документе, и/или фармацевтической композиции по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Вирусные заболевания.
Олигомеры, олигомерные конъюгаты и другие композиции по изобретению могут быть применены для лечения состояний, ассоциированных с последовательностью-мишенью, таких как повышенная экспрессия или экспрессия мутированного варианта последовательности-мишени.
Изобретение в дальнейшем предлагает применение соединения по изобретению при производстве лекарственного препарата для лечения заболевания, расстройства или состояния, упоминаемых в данном документе.
В контексте настоящего изобретения упомянутое заболевание, расстройство или состояние могут представлять собой вирусное заболевание.
В одном воплощении вирусное заболевание ассоциировано с экспрессией или повышенной экспрессией НВх или HBsAg. Вирусное заболевание может представлять собой заболевание, ассоциированное с HBV. Примеры таких вирусных заболеваний включают, но не ограничены, гепатит В, цирроз, рак печени (например, гепатоклеточную карциному), холангиокарциному.
В одном воплощении вирусное заболевание представляет собой гепатит В. Как будет понятно специалистам в области техники, термин гепатит В в контексте настоящего изобретения относится к инфекционному заболеванию печени, вызываемому HBV. Гепатит В может быть острым или хроническим. Острое заболевание вызывает воспаление печени, рвоту, разлитие желчи и изредка смерть. Хронический гепатит В может вызывать цирроз и рак печени.
В одном воплощении вирусное заболевание представляет собой цирроз. Как будет понятно специалистам в области техники, термин цирроз в контексте настоящего изобретения относится к прогрессирующему заболеванию печени, характеризующемуся присутствием фиброза и регенеративных узлов в печени. Данные изменения могут привести к потере функции печени.
В одном воплощении вирусное заболевание представляет собой рак печени. Как будет понятно специалистам в области техники, термин рак печени в контексте настоящего изобретения относится к злокачественному заболеванию, которое возникает в печени.
В одном воплощении вирусное заболевание представляет собой гепатоклеточную карциному (НСС). Как будет понятно специалистам в области техники, термин НСС в контексте настоящего изобретения относится к типу рака печения, который обычно возникает вторично после вирусной гепатитной инфекции, например гепатита В. Макроскопически, НСС выглядит как узелковая или инфильтрирующая опухоль. Узелковый тип может быть солитарным (большая масса) или множественным (когда развивается как осложнение после цирроза). Опухолевые узелки выглядят овальными, серыми или зелеными (если опухоль продуцирует желчь), хорошо очерченными, но не инкапсулированными. Диффузный тип хуже очерчен и инфильтрирует портальные вены или печеночные вены (редко). Микроскопически существуют четыре архитектурных и цитологических типа (паттерна) НСС: фиброламеллярный, псевдожелезистый (аденоидный), плейоморфный (гигантно-клеточный) и светлоклеточный. В хорошо дифференцируемых формах опухолевые клетки, похожие на гепатоциты, формируют трабекулы, тяжи и скопления и могут содержать желчный пигмент в цитоплазме. В плохо дифференцируемых формах зло
- 66 034924 качественные эпителиальные клетки являются несвязанными, плейоморфными, анапластическими, гигантскими. Опухоль имеет ограниченную строму и центральный некроз из-за плохой васкуляризации.
В одном воплощении вирусное заболевание представляет собой холангиокарциному. Как будет понятно специалистам в области техники, термин холангиокарцинома в контексте настоящего изобретения относится к форме рака, который состоит из мутированных эпителиальных клеток (или клеток, проявляющих характеристики эпителиальной дифференциации), которые возникают в желчных протоках, дренирующих желчь из печени в тонкий кишечник.
В то время как различные воплощения, раскрытые в данном документе, относятся к вирусному заболеванию, ассоциированному с инфекцией HBV, настоящее изобретение не ограничено данными примерами воплощений. Скорее, настоящее изобретение применимо к любому расстройству, ассоциированному с вирусной инфекцией.
Обычно один аспект изобретения направлен на способ лечения млекопитающего, страдающего от или чувствительного к состояниям, ассоциированным с ненормальными уровнями экспрессии продукта последовательности-мишени, содержащий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества олигомера, нацеленного на последовательность-мишень. Олигомер по изобретению может содержать одно или более звено LNA. Олигомер, конъюгат или фармацевтическую композицию по изобретению обычно вводят в эффективном количестве.
Интересный аспект изобретения направлен на применение олигомера (соединения), как определено в данном документе, или олигомерного конъюгата, как определено в данном документе, для получения лекарственного препарата для лечения заболевания, расстройства или состояния, как упомянуто в данном документе.
Способы по изобретению предпочтительно применяют для лечения или профилактики заболеваний, вызванных ненормальными уровнями НВх или HBsAg.
Альтернативно, в некоторых воплощениях изобретение в дальнейшем направлено на способ лечения ненормальных уровней НВх или HBsAg, упомянутый способ, содержащий введение олигомера по изобретению или конъюгата по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Изобретение также относится к олигомеру, композиции или олигомерному конъюгату, как определено в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.
Изобретение в дальнейшем относится к применению соединения или конъюгата, как определено в данном документе, для производства лекарственного препарата для лечения ненормальных уровней НВх или HBsAg или экспрессии мутантных форм НВх или HBsAg (таких как аллельные варианты, такие как таковые, ассоциированные с одним из заболеваний, упомянутых в данном документе).
Более того, изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего от заболевания или состояния, как такового, упомянутого в данном документе.
Пациент, который нуждается в лечение, представляет собой пациента, страдающего от или вероятно страдающего от заболевания или расстройства.
Примеры олигомеров
Примеры олигомеров для применения по настоящему изобретению представлены в следующих таблицах.
Табл. 1 показывает долю консервативности внутри всех опубликованных полноразмерных геномных последовательностей генотипов А, В, С и D (GenBank), означая, что данный олигомерный мотив будет на 100% комплементарен данной части последовательностей-мишеней внутри генотипа. Все олигомерные мотивы выбраны так, что они будут, по существу, нацелены почти на все последовательности внутри генотипов А, В, С и D, таким образом делая возможным лечение индивидуума, инфицированного любым из данных четырех генотипов.
- 67 034924
Таблица 1. Мотивы олигонуклеотидной последовательности, примененные для дизайна модифицированных олигонуклеотидов LNA.
SEQ ID NO МИШ ень НВх мише нь HBsA g Старт овая позиц ИЯ U955 51 Мотив олигонуклеотидной последовательности Доля консервативности внутри всех последовательностей генотипа
А В С D
SeqID 29 X 201 AAAACCCCGCCTGT 0,97 0,98 0,95 0,99
SeqID 30 X 202 AAAACCCCGCCTG 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 31 X 245 ACGAGTCTAGACTCT 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 32 X 245 CACGAGTCTAGACTCT 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 33 X 246 ACGAGTCTAGACTC 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 34 X 246 CACGAGTCTAGACTC 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 35 X 246 CCACGAGTCTAGACTC 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 36 X 247 ACGAGTCTAGACT 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 37 X 247 CACGAGTCTAGACT 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 38 X 247 CCACGAGTCTAGACT 0,96 0,97 0,97 0,97
SeqID 39 X 247 ACCACGAGTCTAGACT 0,96 0,98 0,97 0,98
SeqID 40 X 248 ACGAGTCTAGAC 0,96 0,97 0,97 0,98
SeqID 41 X 248 CACGAGTCTAGAC 0,96 0,97 0,97 0,98
SeqID 42 X 248 CCACGAGTCTAGAC 0,96 0,97 0,97 0,97
- 68 034924
SeqID 43 X 248 ACCACGAGTCTAGAC 0,96 0,97 0,96 0,97
SeqID 44 X 248 CACCACGAGTCTAGAC 0,99 0,97 0,97 0,98
SeqID 45 X 249 ACCACGAGTCTAGA 0,99 0,97 0,97 0,98
SeqID 46 X 249 CACCACGAGTCTAGA 0,99 0,97 0,97 0,98
SeqID 47 X 249 CCACCACGAGTCTAGA 0,99 0,98 0,97 0,98
SeqID 48 X 250 CCACCACGAGTCTAG 0,99 0,98 0,97 0,98
SeqID 49 X 250 TCCACCACGAGTCTAG 0,99 0,98 0,97 0,98
SeqID 50 X 251 CCACCACGAGTCTA 0,99 0,98 0,97 0,98
SeqID 51 X 251 TCCACCACGAGTCTA 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 52 X 251 GTCCACCACGAGTCTA 0,99 0,98 0,97 0,98
SeqID 53 X 252 TCCACCACGAGTCT 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 54 X 252 GTCCACCACGAGTCT 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 55 X 252 AGTCCACCACGAGTCT 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 56 X 253 GTCCACCACGAGTC 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID X 253 AGTCCACCACGAGTC 0,98 0,97 0,97 0,98
- 69 034924
57
SeqID 58 X 253 AAGTCCACCACGAGTC 0,98 0,97 0,98 0,99
SeqID 59 X 254 AGTCCACCACGAGT 0,98 0,97 0,98 0,99
SeqID 60 X 254 AAGTCCACCACGAGT 0,98 0,97 0,97 0,99
SeqID 61 X 254 GAAGTCCACCACGAG T 0,98 0,97 0,98 0,99
SeqID 62 X 255 AAGTCCACCACGAG 0,98 0,97 0,98 0,99
SeqID 63 X 255 GAAGTCCACCACGAG 0,97 0,97 0,98 0,99
SeqID 64 X 255 AGAAGTCCACCACGA G 0,97 0,97 0,98 0,99
SeqID 65 X 256 AGAAGTCCACCACGA 0,97 0,97 0,98 0,99
SeqID 66 X 256 GAGAAGTCCACCACG A 0,97 0,97 0,98 0,99
SeqID 67 X 257 GAGAAGTCCACCACG 0,97 0,97 0,97 0,98
SeqID 68 X 257 AGAGAAGTCCACCAC G 0,98 0,99 0,98 0,99
SeqID 69 X 258 GAGAGAAGTCCACCA C 0,98 0,99 0,98 0,99
SeqID 70 X 259 GAGAGAAGTCCACCA 0,98 0,99 0,98 0,99
SeqID 71 X 259 TGAGAGAAGTCCACCA 0,98 0,99 0,98 0,99
- 70 034924
SeqID 72 X 260 GAGAGAAGTCCACC 0,98 0,99 0,98 0,99
SeqID 73 X 260 TGAGAGAAGTCCACC 0,98 0,99 0,98 0,99
SeqID 74 X 261 TGAGAGAAGTCCAC 0,99 0,96 0,95 0,98
SeqID 75 X 384 AAAACGCCGCAGA 0,98 0,96 0,95 0,98
SeqID 76 X 384 TAAAACGCCGCAGA 0,98 0,96 0,95 0,97
SeqID 77 X 384 ATAAAACGCCGCAGA 0,98 0,96 0,95 0,97
SeqID 78 X 384 GATAAAACGCCGCAGA 0,98 0,97 0,96 0,97
SeqID 79 X 385 ATAAAACGCCGCAG 0,98 0,97 0,96 0,97
SeqID 80 X 385 GATAAAACGCCGCAG 0,98 0,97 0,96 0,97
SeqID 81 X 385 TGATAAAACGCCGCAG 0,98 0,97 0,96 0,98
SeqID 82 X 386 ATAAAACGCCGCA 0,98 0,97 0,96 0,98
SeqID 83 X 386 GATAAAACGCCGCA 0,98 0,97 0,96 0,98
SeqID 84 X 386 TGATAAAACGCCGCA 0,98 0,97 0,96 0,98
SeqID 85 X 386 ATGATAAAACGCCGCA 0,98 0,98 0,97 0,98
SeqID X 387 ATAAAACGCCGC 0,98 0,98 0,97 0,98
- 71 034924
86
SeqID 87 X 387 GATAAAACGCCGC 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 88 X 387 TGATAAAACGCCGC 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 89 X 387 ATGATAAAACGCCGC 0,98 0,98 0,97 0,98
SeqID 90 X 388 GATAAAACGCCG 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 91 X 388 TGATAAAACGCCG 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 92 X 388 ATGATAAAACGCCG 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 93 X 389 TGATAAAACGCC 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 94 X 389 ATGATAAAACGCC 0,98 0,97 0,97 0,98
SeqID 95 X 390 ATGATAAAACGC 1,00 0,99 0,98 0,97
SeqID 96 X 411 TAGCAGCAGGATG 1,00 0,99 0,98 0,97
SeqID 97 X 411 ATAGCAGCAGGATG 1,00 0,99 0,98 0,97
SeqID 98 X 411 CATAGCAGCAGGATG 1,00 0,98 0,98 0,97
SeqID 99 X 411 GCATAGCAGCAGGATG 1,00 0,99 0,98 0,97
SeqID 100 X 412 GCATAGCAGCAGGAT 1,00 0,99 0,98 0,97
- 72 034924
SeqID 101 X 412 GGCATAGCAGCAGGAT 0,99 0,98 0,98 0,97
SeqID 102 X 414 GAGGCATAGCAGCAG G 0,99 0,98 0,98 0,97
SeqID 103 X 415 TGAGGCATAGCAGCAG 0,99 0,98 0,98 0,97
SeqID 104 X 416 TGAGGCATAGCAGCA 0,99 0,97 0,96 0,96
SeqID 105 X 416 ATGAGGCATAGCAGCA 0,99 0,98 0,98 0,97
SeqID 106 X 417 TGAGGCATAGCAGC 0,99 0,97 0,96 0,96
SeqID 107 X 417 ATGAGGCATAGCAGC 0,99 0,97 0,96 0,96
SeqID 108 X 417 GATGAGGCATAGCAGC 1,00 0,97 0,96 0,96
SeqID 109 X 418 GATGAGGCATAGCAG 1,00 0,97 0,96 0,96
SeqID 110 X 418 AGATGAGGCATAGCAG 1,00 0,97 0,97 0,96
SeqID 111 X 419 GATGAGGCATAGCA 1,00 0,97 0,97 0,96
SeqID 112 X 419 AGATGAGGCATAGCA 1,00 0,97 0,97 0,96
SeqID 113 X 419 AAGATGAGGCATAGCA 1,00 0,96 0,97 0,98
SeqID 114 X 422 AAGAAGATGAGGCATA 1,00 0,96 0,97 0,98
SeqID X 423 AAGAAGATGAGGCAT 0,98 0,99 1,00 0,99
- 73 034924
115
SeqID 116 X 601 TGGGATGGGAATACA 0,98 0,99 0,99 0,99
SeqID 117 X 601 ATGGGATGGGAATACA 0,98 0,99 1,00 0,99
SeqID 118 X 602 TGGGATGGGAATAC 0,98 0,99 1,00 0,99
SeqID 119 X 602 ATGGGATGGGAATAC 0,97 0,99 0,99 0,99
SeqID 120 X 602 GATGGGATGGGAATAC 0,98 0,99 1,00 0,99
SeqID 121 X 603 ATGGGATGGGAATA 0,97 0,99 0,99 0,99
SeqID 122 X 603 GATGGGATGGGAATA 0,97 0,99 0,99 0,99
SeqID 123 X 604 GATGGGATGGGAAT 0,99 0,97 0,96 0,98
SeqID 834 670 TAGTAAACTGAGCCA
SeqID 835 670 CTAGTAAACTGAGCCA
SeqID 836 671 CTAGTAAACTGAGCC
SeqID 837 674 GCACTAGTAAACTGA
SeqID 838 674 GGCACTAGTAAACTGA
SeqID 124 X 691 AACCACTGAACAAA 0,99 0,97 0,96 0,98
- 74 034924
SeqID 4 X 691 GAACCACTGAACAAA 0,99 0,97 0,96 0,98
SeqID 5 X 691 CGAACCACTGAACAAA 0,99 0,97 0,96 0,98
SeqID 6 X 692 CGAACCACTGAACAA 0,99 0,97 0,96 0,98
SeqID 7 X 693 CGAACCACTGAACA 0,99 0,98 0,96 0,98
SeqID 8 X 694 CGAACCACTGAAC 0,99 0,98 0,96 0,98
SeqID 125 X 695 CGAACCACTGAA 0,98 0,97 0,98 0,98
SeqID 126 X 708 GGGGGAAAGCCCT 0,97 0,97 0,98 0,98
SeqID 127 X 708 TGGGGGAAAGCCCT 0,99 0,97 0,97 0,99
SeqID 839 1141 CAACGGGGTAAAGGT
SeqID 128 X 1142 GCAACGGGGTAAAGG 0,99 0,97 0,97 0,99
SeqID 129 X 1143 GCAACGGGGTAAAG 0,99 0,97 0,97 0,99
SeqID 130 X 1144 GCAACGGGGTAAA 0,99 0,98 0,97 0,99
SeqID 131 X 1176 AGCAAACACTTGGCA 0,99 0,98 0,97 0,99
SeqID 132 X 1176 CAGCAAACACTTGGCA 0,99 0,98 0,97 0,99
SeqID X 1177 CAGCAAACACTTGGC 0,99 0,98 0,97 0,99
- 75 034924
133
SeqID 134 X 1177 TCAGCAAACACTTGGC 0,99 0,98 0,97 0,99
SeqID 135 X 1178 TCAGCAAACACTTGG 0,98 0,96 0,96 0,97
SeqID 840 1261 CAGTATGGATCGGCA
SeqID 136 X 1264 GCAGTATGGATCG 0,98 0,95 0,96 0,97
SeqID 137 X 1264 CGCAGTATGGATCG 0,98 0,95 0,96 0,97
SeqID 9 X 1264 CCGCAGTATGGATCG 0,98 0,95 0,96 0,97
SeqID 138 X 1264 TCCGCAGTATGGATCG 0,98 0,95 0,96 0,97
SeqID 832 1264 CCGCAGTATGGATCG
SeqID 10 X 1265 CGCAGTATGGATC 0,98 0,95 0,96 0,97
SeqID 139 X 1265 CCGCAGTATGGATC 0,98 0,95 0,96 0,97
SeqID 140 X 1265 TCCGCAGTATGGATC 0,99 0,96 0,97 0,97
SeqID 841 1265 TTCCGCAGTATGGATC
SeqID 842 1266 TTCCGCAGTATGGAT
SeqID 843 1266 GTTCCGCAGTATGGAT
- 76 034924
SeqID 141 X 1266 CGCAGTATGGAT 0,99 0,96 0,97 0,97
SeqID 142 X 1266 CCGCAGTATGGAT 0,99 0,96 0,97 0,97
SeqID 143 X 1266 TCCGCAGTATGGAT 0,99 0,96 0,97 0,97
SeqID 144 X 1267 TCCGCAGTATGGA 0,99 0,95 0,97 0,97
SeqID 844 1267 GTTCCGCAGTATGGA
SeqID 845 1267 AGTTCCGCAGTATGGA
SeqID 846 1268 AGTTCCGCAGTATGG
SeqID 847 1268 GAGTTCCGCAGTATGG
SeqID 848 1269 GAGTTCCGCAGTATG
SeqID 849 1269 GGAGTTCCGCAGTATG
SeqID 145 X 1269 TTCCGCAGTATG 0,99 0,99 0,99 0,99
SeqID 850 1525 TAAAGAGAGGTGCGC C
SeqID 851 1526 TAAAGAGAGGTGCGC
SeqID 852 1526 GTAAAGAGAGGTGCG C
SeqID 1527 GTAAAGAGAGGTGCG
- 77 034924
853
SeqID 854 1527 CGTAAAGAGAGGTGC G
SeqID 855 1528 CGTAAAGAGAGGTGC
SeqID 856 1528 GCGTAAAGAGAGGTG C
SeqID 857 1529 GCGTAAAGAGAGGTG
SeqID 858 1529 CGCGTAAAGAGAGGT G
SeqID 146 X 1530 CGTAAAGAGAGGT 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 11 X 1530 GCGTAAAGAGAGGT 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 12 X 1530 CGCGTAAAGAGAGGT 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 147 X 1530 CCGCGTAAAGAGAGG T 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 148 X 1531 CGTAAAGAGAGG 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 13 X 1531 GCGTAAAGAGAGG 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 149 X 1531 CGCGTAAAGAGAGG 0,99 0,98 0,99 0,99
SeqID 150 X 1531 CCGCGTAAAGAGAGG 0,99 0,98 0,99 1,00
SeqID 151 X 1532 CGCGTAAAGAGAG 0,99 0,98 0,99 1,00
- 78 034924
SeqID 152 X 1532 CCGCGTAAAGAGAG 0,99 0,98 0,99 1,00
SeqID 153 X 1533 CGCGTAAAGAGA 0,99 0,98 0,99 1,00
SeqID 154 X 1533 CCGCGTAAAGAGA 0,99 0,99 0,99 1,00
SeqID 155 X 1534 CCGCGTAAAGAG 0,98 0,98 0,99 1,00
SeqID 156 X 1547 GGCACAGACGGGGAG 0,98 0,98 0,99 1,00
SeqID 157 X 1547 AGGCACAGACGGGGA G 0,98 0,99 0,99 1,00
SeqID 158 X 1548 GGCACAGACGGGGA 0,98 0,98 0,99 1,00
SeqID 159 X 1548 AGGCACAGACGGGGA 0,98 0,98 0,99 1,00
SeqID 160 X 1548 AAGGCACAGACGGGG A 0,98 0,98 0,99 1,00
SeqID 161 X 1549 AGGCACAGACGGGG 0,98 0,98 0,99 1,00
SeqID 162 X 1549 AAGGCACAGACGGGG 0,98 0,97 0,99 0,99
SeqID 163 X 1549 GAAGGCACAGACGGG G 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 164 X 1550 AGAAGGCACAGACGG G 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 14 X 1551 AGAAGGCACAGACGG 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID X 1551 GAGAAGGCACAGACG 0,97 0,98 0,98 0,98
- 79 034924
15 G
SeqID 165 X 1552 GAGAAGGCACAGACG 0,99 0,99 0,99 0,98
SeqID 859 1552 TGAGAAGGCACAGAC G
SeqID 16 X 1577 GAAGTGCACACGG 0,99 0,99 0,99 0,98
SeqID 166 X 1577 CGAAGTGCACACGG 0,98 0,99 0,99 0,98
SeqID 17 X 1577 GCGAAGTGCACACGG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 18 X 1577 AGCGAAGTGCACACG G 0,99 0,99 0,99 0,98
SeqID 19 X 1578 CGAAGTGCACACG 0,98 0,99 0,99 0,98
SeqID 167 X 1578 GCGAAGTGCACACG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 20 X 1578 AGCGAAGTGCACACG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 21 X 1578 AAGCGAAGTGCACAC G 0,98 0,99 0,99 0,98
SeqID 168 X 1579 GCGAAGTGCACAC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 169 X 1579 AGCGAAGTGCACAC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 170 X 1579 AAGCGAAGTGCACAC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 171 X 1579 GAAGCGAAGTGCACA C 0,98 0,99 0,99 0,96
- 80 034924
SeqID 172 X 1580 AGCGAAGTGCACA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 173 X 1580 AAGCGAAGTGCACA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 22 X 1580 GAAGCGAAGTGCACA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 174 X 1580 TGAAGCGAAGTGCAC A 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 175 X 1581 AAGCGAAGTGCAC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 176 X 1581 GAAGCGAAGTGCAC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 177 X 1581 TGAAGCGAAGTGCAC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 178 X 1581 GTGAAGCGAAGTGCA C 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 179 X 1582 AAGCGAAGTGCA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 180 X 1582 GAAGCGAAGTGCA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 181 X 1582 TGAAGCGAAGTGCA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 182 X 1582 GTGAAGCGAAGTGCA 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 23 X 1582 GGTGAAGCGAAGTGC A 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 183 X 1583 TGAAGCGAAGTGC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID X 1583 GTGAAGCGAAGTGC 0,98 0,99 0,99 0,96
- 81 034924
184
SeqID 24 X 1583 GGTGAAGCGAAGTGC 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 25 X 1583 AGGTGAAGCGAAGTG C 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 185 X 1584 GTGAAGCGAAGTG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 186 X 1584 GGTGAAGCGAAGTG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 26 X 1584 AGGTGAAGCGAAGTG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 187 X 1584 GAGGTGAAGCGAAGT G 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 188 X 1585 GTGAAGCGAAGT 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 189 X 1585 GGTGAAGCGAAGT 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 27 X 1585 AGGTGAAGCGAAGT 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 190 X 1585 GAGGTGAAGCGAAGT 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 191 X 1585 AGAGGTGAAGCGAAG T 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 192 X 1586 AGAGGTGAAGCGAAG 0,98 0,99 0,99 0,96
SeqID 193 X 1586 CAGAGGTGAAGCGAA G 0,99 0,99 0,99 0,96
SeqID 194 X 1587 AGAGGTGAAGCGAA 0,99 0,99 0,99 0,96
- 82 034924
SeqID 195 X 1587 CAGAGGTGAAGCGAA 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 196 X 1587 GCAGAGGTGAAGCGA A 0,99 0,99 0,99 0,97
SeqID 28 X 1588 CAGAGGTGAAGCGA 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 197 X 1588 GCAGAGGTGAAGCGA 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 198 X 1588 TGCAGAGGTGAAGCG A 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 199 X 1589 TGCAGAGGTGAAGCG 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 200 X 1589 GTGCAGAGGTGAAGC G 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 201 X 1590 CGTGCAGAGGTGAAG C 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 202 X 1591 CGTGCAGAGGTGAAG 0,99 0,99 0,98 0,96
SeqID 203 X 1591 ACGTGCAGAGGTGAA G 1,00 0,99 0,98 0,96
SeqID 204 X 1592 CGTGCAGAGGTGAA 1,00 0,99 0,98 0,96
SeqID 205 X 1592 ACGTGCAGAGGTGAA 1,00 0,99 0,98 0,99
SeqID 206 X 1593 CGTGCAGAGGTGA 1,00 0,99 0,98 0,99
SeqID 207 X 1593 ACGTGCAGAGGTGA 0,98 0,97 0,96 0,97
SeqID X 1616 CGTTCACGGTGGT 0,98 0,96 0,96 0,95
- 83 034924
208
SeqID 209 X 1690 CTCAAGGTCGGTC 0,99 0,97 0,98 0,96
SeqID 860 1690 GCCTCAAGGTCGGTC
SeqID 210 X 1691 CCTCAAGGTCGGT 0,99 0,97 0,98 0,95
SeqID 211 X 1691 GCCTCAAGGTCGGT 0,98 0,97 0,98 0,99
SeqID 212 X 1706 ACAGTCTTTGAAGTA 0,99 0,95 0,95 0,99
SeqID 861 1778 ATGCCTACAGCCTCC
SeqID 213 X 1783 TTTATGCCTACAG 0,99 0,96 0,95 0,99
SeqID 214 X 1784 AATTTATGCCTACA 0,99 0,96 0,95 0,99
SeqID 215 X 1785 AATTTATGCCTAC 0,99 0,95 0,96 0,99
SeqID 862 1785 ACCAATTTATGCCTAC
SeqID 216 X 1787 CCAATTTATGCCT 0,97 0,99 0,99 0,98
SeqID 217 X 1865 GCTTGGAGGCTTGAA 0,97 0,99 0,98 0,98
SeqID 218 X 1865 AGCTTGGAGGCTTGAA 0,97 0,99 0,99 0,98
SeqID 219 X 1866 GCTTGGAGGCTTGA 0,97 0,99 0,99 0,98
- 84 034924
SeqID 220 X 1866 AGCTTGGAGGCTTGA 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 221 X 1866 CAGCTTGGAGGCTTG A 0,97 0,99 0,99 0,98
SeqID 222 X 1867 GCTTGGAGGCTTG 0,97 0,99 0,99 0,98
SeqID 223 X 1867 AGCTTGGAGGCTTG 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 224 X 1867 CAGCTTGGAGGCTTG 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 225 X 1867 ACAGCTTGGAGGCTT G 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 226 X 1868 CACAGCTTGGAGGCTT 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 227 X 1869 CACAGCTTGGAGGCT 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 228 X 1869 GCACAGCTTGGAGGC T 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 229 X 1870 GCACAGCTTGGAGGC 0,97 0,98 0,98 0,98
SeqID 230 X 1870 GGCACAGCTTGGAGG C 0,96 0,98 0,98 0,98
SeqID 231 X 1871 AGGCACAGCTTGGAG G 0,96 0,98 0,98 0,99
SeqID 232 X 1872 AGGCACAGCTTGGAG 0,96 0,97 0,98 0,99
SeqID 233 X 1872 AAGGCACAGCTTGGA G 0,96 0,97 0,98 0,99
SeqID X 1873 AAGGCACAGCTTGGA 0,96 0,97 0,98 0,98
- 85 034924
234
SeqID 235 X 1873 CAAGGCACAGCTTGG A 0,96 0,97 0,98 0,99
SeqID 236 X 1874 AAGGCACAGCTTGG 0,96 0,97 0,98 0,99
SeqID 237 X 1874 CAAGGCACAGCTTGG 0,96 0,97 0,97 0,98
SeqID 238 X 1874 CCAAGGCACAGCTTG G 0,96 0,97 0,98 0,99
SeqID 239 X 1875 CAAGGCACAGCTTG 0,96 0,97 0,97 0,98
SeqID 240 X 1875 CCAAGGCACAGCTTG 0,96 0,97 0,97 0,99
SeqID 241 X 1876 CCAAGGCACAGCTT 0,96 0,97 0,96 0,97
SeqID 242 2272 TGCGAATCCACAC 0,96 0,97 0,96 0,97
SeqID 243 2272 GTGCGAATCCACAC 0,96 0,96 0,98 0,97
SeqID 244 2370 GGAGTTCTTCTTCTA 0,96 0,96 0,98 0,97
SeqID 245 2370 GGGAGTTCTTCTTCTA 0,96 0,96 0,98 0,97
SeqID 246 2371 GGGAGTTCTTCTTCT 0,96 0,96 0,98 0,97
SeqID 247 2371 AGGGAGTTCTTCTTCT 0,96 0,98 0,98 0,97
SeqID 248 2372 AGGGAGTTCTTCTTC 0,96 0,98 0,97 0,97
- 86 034924
SeqID 249 2372 GAGGGAGTTCTTCTTC 0,97 0,98 0,98 0,97
SeqID 250 2373 AGGGAGTTCTTCTT 0,97 0,98 0,98 0,97
SeqID 251 2373 GAGGGAGTTCTTCTT 0,97 0,95 0,97 0,95
SeqID 252 2373 CGAGGGAGTTCTTCTT 0,97 0,95 0,97 0,96
SeqID 253 2374 CGAGGGAGTTCTTCT 0,97 0,95 0,97 0,96
SeqID 254 2374 GCGAGGGAGTTCTTCT 0,97 0,96 0,97 0,96
SeqID 255 2375 GCGAGGGAGTTCTTC 0,97 0,96 0,97 0,96
SeqID 256 2375 GGCGAGGGAGTTCTT C 0,97 0,96 0,97 0,96
SeqID 257 2376 GCGAGGGAGTTCTT 0,97 0,96 0,97 0,96
SeqID 258 2376 GGCGAGGGAGTTCTT 0,97 0,96 0,97 0,96
SeqID 259 2376 AGGCGAGGGAGTTCT T 0,98 0,96 0,97 0,96
SeqID 260 2377 GCGAGGGAGTTCT 0,98 0,96 0,97 0,96
SeqID 261 2377 GGCGAGGGAGTTCT 0,98 0,96 0,97 0,96
SeqID 262 2377 AGGCGAGGGAGTTCT 0,98 0,96 0,97 0,96
SeqID 2377 GAGGCGAGGGAGTTC 0,99 0,96 0,98 0,97
- 87 034924
263 T
SeqID 264 2378 GGCGAGGGAGTTC 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 265 2378 AGGCGAGGGAGTTC 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 266 2378 GAGGCGAGGGAGTTC 0,99 0,96 0,97 0,97
SeqID 267 2378 CGAGGCGAGGGAGTT C 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 268 2379 AGGCGAGGGAGTT 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 269 2379 GAGGCGAGGGAGTT 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 270 2379 CGAGGCGAGGGAGTT 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 271 2379 GCGAGGCGAGGGAGT T 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 272 2380 GAGGCGAGGGAGT 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 273 2380 CGAGGCGAGGGAGT 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 274 2380 GCGAGGCGAGGGAGT 0,99 0,96 0,97 0,96
SeqID 275 2380 TGCGAGGCGAGGGAG T 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 276 2381 CGAGGCGAGGGAG 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 277 2381 GCGAGGCGAGGGAG 0,99 0,96 0,97 0,97
- 88 034924
SeqID 278 2381 TGCGAGGCGAGGGAG 0,97 0,96 0,96 0,96
SeqID 279 2381 CTGCGAGGCGAGGGA G 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 280 2382 CGAGGCGAGGGA 0,99 0,96 0,98 0,97
SeqID 281 2382 GCGAGGCGAGGGA 0,99 0,96 0,97 0,97
SeqID 282 2382 TGCGAGGCGAGGGA 0,97 0,96 0,96 0,96
SeqID 283 2382 CTGCGAGGCGAGGGA 0,97 0,96 0,96 0,96
SeqID 284 2382 TCTGCGAGGCGAGGG A 0,97 0,96 0,96 0,96
SeqID 285 2383 TCTGCGAGGCGAGGG 0,97 0,96 0,96 0,96
SeqID 286 2383 GTCTGCGAGGCGAGG G 0,98 0,97 0,96 0,95
SeqID 287 2824 GTTCCCAAGAATAT 0,98 0,97 0,96 0,95
SeqID 288 2824 TGTTCCCAAGAATAT 0,98 0,98 0,97 0,96
SeqID 289 2825 GTTCCCAAGAATA 0,98 0,98 0,97 0,96
SeqID 290 2825 TGTTCCCAAGAATA 0,97 0,97 0,96 0,96
SeqID 291 2825 TTGTTCCCAAGAATA 0,98 0,98 0,97 0,96
SeqID 2826 TGTTCCCAAGAAT 0,97 0,97 0,96 0,96
292
SeqID 293 2826 TTGTTCCCAAGAAT
- 89 034924
Таблица 2. Набор олигомерных мотивов из табл. 1.
SEQ ID NO Мишень HBx Мишень HBsAg Стартовая позиция на U95551 Последовательность олигонуклеотида
SeqID 4 X 691 GAACCACTGAACAAA
SeqID 5 X 691 CGAACCACTGAACAAA
SeqID 6 X 692 CGAACCACTGAACAA
SeqID 7 X 693 CGAACCACTGAACA
SeqID 8 X 694 CGAACCACTGAAC
SeqID 9 X 1264 CCGCAGTATGGATCG
SeqID 10 X 1265 CGCAGTATGGATC
SeqID 11 X 1530 GCGTAAAGAGAGGT
SeqID 12 X 1530 CGCGTAAAGAGAGGT
SeqID 13 X 1531 GCGTAAAGAGAGG
SeqID 14 X 1551 AGAAGGCACAGACGG
SeqID 15 X 1551 GAGAAGGCACAGACGG
SeqID 16 X 1577 GAAGTGCACACGG
SeqID 17 X 1577 GCGAAGTGCACACGG
SeqID 18 X 1577 AGCGAAGTGCACACGG
SeqID 19 X 1578 CGAAGTGCACACG
SeqID 20 X 1578 AGCGAAGTGCACACG
SeqID 21 X 1578 AAGCGAAGTGCACACG
SeqID 22 X 1580 GAAGCGAAGTGCACA
SeqID 23 X 1582 GGTGAAGCGAAGTGCA
SeqID 24 X 1583 GGTGAAGCGAAGTGC
SeqID 25 X 1583 AGGTGAAGCGAAGTGC
SeqID 26 X 1584 AGGTGAAGCGAAGTG
SeqID 27 X 1585 AGGTGAAGCGAAGT
SeqID 28 X 1588 CAGAGGTGAAGCGA
- 90 034924
Таблица 3. Олигомеры.
Заглавные буквы обозначают бета-О-окси-ЕХЛ. CLNA представляет собой 5-метил CLNA, строчные буквы обозначают ДНК, mc обозначает 5-метилцитозин ДНК, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
SEQ ID NO Мишень НВх мишень HBsAg Стартовая позиция на U95551 Последовательность олигонуклеотида
SeqID 294 X 691 G AAccactg aacAAA
SeqID 295 X 691 CG Aaccactg aacAAA
SeqID 296 X 692 CG Aaccactg aaCAA
SeqID 297 X 693 CG Aaccactg aACA
SeqID 298 X 694 CG Aaccactg aAC
SeqID 299 X 1264 CCGcagtatggaTCG
SeqID 300 X 1265 CGCagtatggaTC
SeqID 301 X 1530 GCGtaaagagaGGT
SeqID 302 X 1530 CGCgtaaagagaGGT
SeqID 303 X 1531 GCGtaaagagaGG
SeqID 304 X 1551 AGAaggcacagaCGG
SeqID 305 X 1551 GAG aag g cacag aCG G
SeqID 306 X 1577 GAAgtgcacamcGG
SeqID 307 X 1577 GCGaagtgcacaCGG
SeqID 308 X 1577 AGCgaagtgcacaCGG
SeqID 309 X 1578 CGAagtgcacaCG
SeqID 310 X 1578 AGCgaagtgcacACG
SeqID 311 X 1578 AAGmcgaagtgcacACG
- 91 034924
SeqID 312 X 1580 G AAg mcg aag tg cAC A
SeqID 313 X 1582 GGTgaagmcgaagtGCA
SeqID 314 X 1583 GGTgaagmcgaagTGC
SeqID 315 X 1583 AG Gtg aag mcg aagTG C
SeqID 316 X 1584 AG Gtg aag mcg aaGTG
SeqID 317 X 1585 AG Gtg aag mcg aAGT
SeqID 318 X 1588 CAGaggtgaagCGA
SeqID 319 X 201 AAAacccmcgccT GT
SeqID 320 X 202 AAAacccmcgccT G
SeqID 321 X 245 ACGagtctagacTCT
SeqID 322 X 245 C ACg ag tctag acT CT
SeqID 323 X 246 ACGagtctagaCTC
SeqID 324 X 246 C ACg ag tctag aCTC
SeqID 325 X 246 CCAmcgagtctagaCT C
SeqID 326 X 247 ACGagtctagaCT
SeqID 327 X 247 CACgagtctagACT
SeqID 328 X 247 CCAmcgagtctagACT
SeqID 329 X 247 ACCamcg agtctag ACT
SeqID 330 X 248 ACgagtctagAC
SeqID 331 X 248 CACgagtctagAC
SeqID 332 X 248 CCAmcgagtctaGAC
SeqID 333 X 248 ACCamcg agtctaG AC
SeqID 334 X 248 CACcamcg agtctaG AC
SeqID 335 X 249 ACCamcgagtctAGA
SeqID 336 X 249 CACcamcg agtctAG A
SeqID 337 X 249 CCAccamcg agtctAG A
SeqID 338 X 250 CCAccamcg agtcTAG
SeqID 339 X 250 T CCaccamcgagtcTAG
SeqID 340 X 251 CCAccamcg agtCTA
SeqID 341 X 251 T CCaccamcgagtCTA
SeqID 342 X 251 GT CcaccamcgagtCTA
- 92 034924
SeqID 343 X 252 T CCaccamcgagT CT
SeqID 344 X 252 GT Ccaccamcg agT CT
SeqID 345 X 252 AGTccaccamcgagT CT
SeqID 346 X 253 GT Ccaccamcg aGTC
SeqID 347 X 253 AGTccaccamcgaGT C
SeqID 348 X 253 AAGtccaccamcgaGT C
SeqID 349 X 254 AGTccaccamcgAGT
SeqID 350 X 254 AAGtccaccamcgAGT
SeqID 351 X 254 GAAgtccaccamcgAGT
SeqID 352 X 255 AAGtccaccamcgAG
SeqID 353 X 255 GAAgtccaccamcgAG
SeqID 354 X 255 AGAagtccaccamcgAG
SeqID 355 X 256 AGAagtccaccaCGA
SeqID 356 X 256 GAG aag tccaccaCG A
SeqID 357 X 257 GAG aag tccaccACG
SeqID 358 X 257 AGAgaagtccaccACG
SeqID 359 X 258 G AG ag aag tccacC AC
SeqID 360 X 259 GAGagaagtccaCCA
SeqID 361 X 259 TG Ag ag aag tccaCC A
SeqID 362 X 260 GAGagaagtccACC
SeqID 363 X 260 TGAgagaagtccACC
SeqID 364 X 261 TG Ag ag aag tcC AC
SeqID 365 X 384 AAAamcgcmcgcaGA
SeqID 366 X 384 TAAaamcgcmcgcAGA
SeqID 367 X 384 ATAaaamcgcmcgcAGA
SeqID 368 X 384 GATaaaamcgcmcgcAGA
SeqID 369 X 385 ATAaaamcgcmcgCAG
SeqID 370 X 385 GATaaaamcgcmcgCAG
SeqID 371 X 385 T G Ataaaamcg cmcg C AG
SeqID 372 X 386 ATAaaamcgcmcgCA
SeqID 373 X 386 GATaaaamcgcmcGCA
- 93 034924
SeqID 374 X 386 T GAtaaaamcgcmcGCA
SeqID 375 X 386 AT GataaaamcgcmcGCA
SeqID 376 X 387 ATaaaamcgcmcGC
SeqID 377 X 387 GATaaaamcgcmcGC
SeqID 378 X 387 TGAtaaaamcgcCGC
SeqID 379 X 387 AT GataaaamcgcCGC
SeqID 380 X 388 GAtaaaamcgcCG
SeqID 381 X 388 TGAtaaaamcgcCG
SeqID 382 X 388 AT GataaaamcgCCG
SeqID 383 X 389 TGataaaamcgCC
SeqID 384 X 389 ATGataaaamcgCC
SeqID 385 X 390 ATgataaaamcGC
SeqID 386 X 411 TAGcagcaggaTG
SeqID 387 X 411 ATAgcagcagg AT G
SeqID 388 X 411 CATagcagcagg AT G
SeqID 389 X 411 GCAtagcagcaggAT G
SeqID 390 X 412 GCAtagcagcagGAT
SeqID 391 X 412 GGCatagcagcagGAT
SeqID 392 X 414 GAGgcatagcagcAGG
SeqID 393 X 415 TGAggcatagcagCAG
SeqID 394 X 416 T GAggcatagcaGCA
SeqID 395 X 416 AT GaggcatagcaGCA
SeqID 396 X 417 TGAggcatagcAGC
SeqID 397 X 417 AT GaggcatagcAGC
SeqID 398 X 417 G ATg ag gcatag cAG C
SeqID 399 X 418 GATgaggcatagCAG
SeqID 400 X 418 AG Atg agg catag CAG
SeqID 401 X 419 GATgaggcataGCA
SeqID 402 X 419 AGAtgaggcataGCA
SeqID 403 X 419 AAGatgaggcataGCA
SeqID 404 X 422 AAGaagatgaggcATA
- 94 034924
SeqID 405 X 423 AAGaagatgaggCAT
SeqID 406 X 601 TGGgatgggaatACA
SeqID 407 X 601 AT GggatgggaatACA
SeqID 408 X 602 TGGgatgggaaTAC
SeqID 409 X 602 ATGggatgggaaTAC
SeqID 410 X 602 GATgggatgggaaTAC
SeqID 411 X 603 ATGggatgggaATA
SeqID 412 X 603 GATgggatgggaATA
SeqID 413 X 604 GATgggatgggAAT
SeqID 414 X 691 AACcactgaacAAA
SeqID 415 X 695 CGaaccactgAA
SeqID 416 X 708 GGGggaaagccCT
SeqID 417 X 708 TGGgggaaagcCCT
SeqID 418 X 1142 GCAamcggggtaaAGG
SeqID 419 X 1143 GCAamcggggtaAAG
SeqID 420 X 1144 GCAamcggggtaAA
SeqID 421 X 1176 AGCaaacacttgGCA
SeqID 422 X 1176 CAGcaaacacttgGCA
SeqID 423 X 1177 CAGcaaacacttGGC
SeqID 424 X 1177 TCAgcaaacacttGGC
SeqID 425 X 1178 T CAgcaaacactT GG
SeqID 426 X 1264 GCAgtatggatCG
SeqID 427 X 1264 CGCagtatggaTCG
SeqID 428 X 1264 TCCgcagtatggaTCG
SeqID 429 X 1265 CCGcagtatggATC
SeqID 430 X 1265 TCCgcagtatggATC
SeqID 431 X 1266 CGcagtatggAT
SeqID 432 X 1266 CCGcagtatggAT
SeqID 433 X 1266 TCCgcagtatgGAT
SeqID 434 X 1267 TCCgcagtatgGA
SeqID 435 X 1269 TTcmcgcagtaTG
- 95 034924
SeqID 436 X 1530 CGTaaagagagGT
SeqID 437 X 1530 CCGmcgtaaagagaGGT
SeqID 438 X 1531 CGtaaagagaGG
SeqID 439 X 1531 CGCgtaaagagAGG
SeqID 440 X 1531 CCGmcgtaaagagAGG
SeqID 441 X 1532 CGCgtaaagagAG
SeqID 442 X 1532 CCG mcgtaaag aG AG
SeqID 443 X 1533 CGmcgtaaagaGA
SeqID 444 X 1533 CCGmcgtaaagaGA
SeqID 445 X 1534 CCgmcgtaaagAG
SeqID 446 X 1547 GGCacagamcgggGAG
SeqID 447 X 1547 AGGcacag amcggg G AG
SeqID 448 X 1548 GGCacagamcggGGA
SeqID 449 X 1548 AGGcacagamcggGGA
SeqID 450 X 1548 AAGgcacagamcggGGA
SeqID 451 X 1549 AGGcacagamcgGGG
SeqID 452 X 1549 AAGgcacagamcgGGG
SeqID 453 X 1549 GAAggcacagamcgGGG
SeqID 454 X 1550 AGAaggcacagamcGGG
SeqID 455 X 1552 GAGaaggcacagACG
SeqID 456 X 1577 CGAagtgcacaCGG
SeqID 457 X 1578 GCGaagtgcacACG
SeqID 458 X 1579 GCGaagtgcacAC
SeqID 459 X 1579 AGCgaagtgcaCAC
SeqID 460 X 1579 AAG mcg aag tg caC AC
SeqID 461 X 1579 G AAg mcg aag tg caC AC
SeqID 462 X 1580 AGCgaagtgcaCA
SeqID 463 X 1580 AAG mcg aag tg cAC A
SeqID 464 X 1580 TG Aag mcg aag tg cAC A
SeqID 465 X 1581 AAGmcgaagtgcAC
SeqID 466 X 1581 G AAg mcg aag tg C AC
- 96 034924
SeqID 467 X 1581 TGAagmcgaagtgCAC
SeqID 468 X 1581 GTGaagmcgaagtgCAC
SeqID 469 X 1582 AAgmcgaagtgCA
SeqID 470 X 1582 GAAgmcgaagtgCA
SeqID 471 X 1582 TGAagmcgaagtGCA
SeqID 472 X 1582 GTGaagmcgaagtGCA
SeqID 473 X 1583 TGAagmcgaagtGC
SeqID 474 X 1583 GTGaagmcgaagTGC
SeqID 475 X 1584 GTGaagmcgaagTG
SeqID 476 X 1584 GGTgaagmcgaaGTG
SeqID 477 X 1584 GAGgtgaagmcgaaGTG
SeqID 478 X 1585 GTgaagmcgaaGT
SeqID 479 X 1585 GGTgaagmcgaaGT
SeqID 480 X 1585 GAGgtgaagmcgaAGT
SeqID 481 X 1585 AG Ag g tg aag mcg aAGT
SeqID 482 X 1586 AGAggtgaagmcgAAG
SeqID 483 X 1586 CAGaggtgaagmcgAAG
SeqID 484 X 1587 AGAggtgaagmcGAA
SeqID 485 X 1587 CAGaggtgaagmcGAA
SeqID 486 X 1587 GCAgaggtgaagmcGAA
SeqID 487 X 1588 GCAgaggtgaagCGA
SeqID 488 X 1588 TGCagaggtgaagCGA
SeqID 489 X 1589 TGCagaggtgaaGCG
SeqID 490 X 1589 GT GcagaggtgaaGCG
SeqID 491 X 1590 CGTgcagaggtgaAGC
SeqID 492 X 1591 CGTgcagaggtgAAG
SeqID 493 X 1591 ACGtgcagaggtgAAG
SeqID 494 X 1592 CGTgcagaggtGAA
SeqID 495 X 1592 ACGtgcagaggtGAA
SeqID 496 X 1593 CGTgcagaggtGA
SeqID 497 X 1593 ACGtgcagaggTGA
- 97 034924
SeqID 498 X 1616 CGTtcamcggtgGT
SeqID 499 X 1690 CTCaaggtmcggTC
SeqID 500 X 1691 CCTcaaggtmcgGT
SeqID 501 X 1691 GCCtcaaggtmcGGT
SeqID 502 X 1706 ACAgtctttgaaGTA
SeqID 503 X 1783 TTTatgcctacAG
SeqID 504 X 1784 AATttatgcctACA
SeqID 505 X 1785 AATttatgcctAC
SeqID 506 X 1787 CCAatttatgcCT
SeqID 507 X 1865 GCTtggaggcttGAA
SeqID 508 X 1865 AGCttggaggcttGAA
SeqID 509 X 1866 GCTtggaggctTGA
SeqID 510 X 1866 AGCttggaggctTGA
SeqID 511 X 1866 CAGcttggaggctTGA
SeqID 512 X 1867 GCTtggaggctTG
SeqID 513 X 1867 AGCttggaggcTTG
SeqID 514 X 1867 CAGcttggaggcTTG
SeqID 515 X 1867 ACAgcttggaggcTTG
SeqID 516 X 1868 CACagcttggaggCTT
SeqID 517 X 1869 CACagcttggagGCT
SeqID 518 X 1869 GCAcagcttggagGCT
SeqID 519 X 1870 GCAcagcttggaGGC
SeqID 520 X 1870 GGCacagcttggaGGC
SeqID 521 X 1871 AGGcacagcttggAGG
SeqID 522 X 1872 AGGcacagcttgGAG
SeqID 523 X 1872 AAGgcacagcttgGAG
SeqID 524 X 1873 AAGgcacagcttGGA
SeqID 525 X 1873 CAAggcacagcttGGA
SeqID 526 X 1874 AAGgcacagctTGG
SeqID 527 X 1874 CAAggcacagctT GG
SeqID 528 X 1874 CCAaggcacagctT GG
- 98 034924
SeqID 529 X 1875 C AAg g cacag cTT G
SeqID 530 X 1875 CCAaggcacagcTT G
SeqID 531 X 1876 CCAaggcacagCTT
SeqID 532 2272 TGCgaatccacAC
SeqID 533 2272 GTGmcgaatccaCAC
SeqID 534 2370 GGAgttcttcttCTA
SeqID 535 2370 GGGagttcttcttCTA
SeqID 536 2371 GGGagttcttctTCT
SeqID 537 2371 AGGgagttcttctTCT
SeqID 538 2372 AGGgagttcttcTTC
SeqID 539 2372 G AGg g ag ttcttcTT C
SeqID 540 2373 AGGgagttcttCTT
SeqID 541 2373 GAGggagttcttCTT
SeqID 542 2373 CGAgggagttcttCTT
SeqID 543 2374 CGAgggagttctTCT
SeqID 544 2374 GCGagggagttctTCT
SeqID 545 2375 GCGagggagttcTT C
SeqID 546 2375 GGCgagggagttcTT C
SeqID 547 2376 GCGagggagttCTT
SeqID 548 2376 GGCgagggagttCTT
SeqID 549 2376 AG G mcg ag gg ag ttCTT
SeqID 550 2377 GCGagggagttCT
SeqID 551 2377 GGCgagggagtTCT
SeqID 552 2377 AG G mcg ag gg ag tTCT
SeqID 553 2377 GAGgmcgagggagtT CT
SeqID 554 2378 GGCgagggagtTC
SeqID 555 2378 AGGmcgagggagTTC
SeqID 556 2378 GAGgmcgagggagTT C
SeqID 557 2378 CGAggmcgagggagTTC
SeqID 558 2379 AGGmcgagggagTT
SeqID 559 2379 G AGg mcg aggg aGTT
- 99 034924
SeqID 560 2379 CGAggmcgagggaGTT
SeqID 561 2379 GCGaggmcgagggaGTT
SeqID 562 2380 GAGgmcgagggaGT
SeqID 563 2380 CGAggmcgagggAGT
SeqID 564 2380 GCGaggmcgagggAGT
SeqID 565 2380 TGCgaggmcgagggAGT
SeqID 566 2381 CGAggmcgagggAG
SeqID 567 2381 GCGaggmcgaggGAG
SeqID 568 2381 TGCgaggmcgaggGAG
SeqID 569 2381 CTG mcg ag g mcg ag g G AG
SeqID 570 2382 CGaggmcgaggGA
SeqID 571 2382 GCGaggmcgaggGA
SeqID 572 2382 TGCgaggmcgagGGA
SeqID 573 2382 CT GmcgaggmcgagGGA
SeqID 574 2382 TCTgmcgaggmcgagGGA
SeqID 575 2383 TCTg mcg ag g mcg aG G G
SeqID 576 2383 GTCtgmcgaggmcgaGGG
SeqID 577 2824 GTTcccaagaaTAT
SeqID 578 2824 TGTtcccaagaaTAT
SeqID 579 2825 GTTcccaagaaTA
SeqID 580 2825 TGTtcccaagaATA
SeqID 581 2825 TT Gttcccaag aATA
SeqID 582 2826 TGTtcccaagaAT
SeqID 583 2826 TTGttcccaagAAT
SeqID 584 X 414 GAGGcatagcagCAGG
SeqID 585 691 G AAccactg aaC AAA
SeqID 586 691 G AACcactg aacAAA
SeqID 587 691 CG aaccactg aaC AAA
SeqID 588 691 CG AAccactg aacAAA
SeqID 589 691 CG Aaccactg aaCAAA
SeqID 590 691 CG AAccactg aacaAA
- 100 034924
SeqID 591 691 CG AAccactg aaCAAA
SeqID 592 692 CG AAccactg aacAA
SeqID 593 692 CG AAccactg aaCAA
SeqID 594 692 CG Aaccactg aACAA
SeqID 595 693 CGaaccactgAACA
SeqID 596 693 CG AAccactg aaCA
SeqID 597 693 CGAaccactgAACA
SeqID 598 693 CG AAccactg aACA
SeqID 599 694 CGaaccactgAAC
SeqID 600 694 CGAaccactgAAC
SeqID 601 1264 CCgcagtatggAT CG
SeqID 602 1264 CCGCagtatggatCG
SeqID 603 1264 CCGCagtatggaTCG
SeqID 604 1264 CCGcagtatggAT CG
SeqID 605 1265 CGCAgtatggaTC
SeqID 606 1265 CGcagtatggATC
SeqID 607 1265 CGCagtatggATC
SeqID 608 1265 CGcagtatgGATC
SeqID 609 1530 GCGTaaagagagGT
SeqID 610 1530 GCgtaaagagAGGT
SeqID 611 1530 GCGtaaagagAGGT
SeqID 612 1530 GCGTaaagagaGGT
SeqID 613 1530 CGCGtaaagagagGT
SeqID 614 1530 CGcgtaaagagAGGT
SeqID 615 1530 CGCGtaaagagaGGT
SeqID 616 1530 CGCgtaaagagAGGT
SeqID 617 1531 GCgtaaagagAGG
SeqID 618 1531 GCGtaaagagAGG
SeqID 619 1531 GCgtaaagaGAGG
SeqID 620 1531 GCGTaaagagaGG
SeqID 621 1551 AGaaggcacagACGG
- 101 034924
SeqID 622 1551 AGAaggcacagACGG
SeqID 623 1551 AGAAggcacagaCGG
SeqID 624 1551 G AG Aag g cacag aCG G
SeqID 625 1551 GAGaaggcacagACGG
SeqID 626 1551 GAG Aag g cacag ACG G
SeqID 627 1577 GAagtgcacaCGG
SeqID 628 1577 GAAgtgcacaCGG
SeqID 629 1577 GAAGtgcacaCGG
SeqID 630 1577 GAAgtgcacACGG
SeqID 631 1577 G Cg aag tg cacaCG G
SeqID 632 1577 GCGaagtgcacacGG
SeqID 633 1577 GCGAagtgcacacGG
SeqID 634 1577 G Cg aag tg cacACG G
SeqID 635 1577 AGCGaagtgcacacGG
SeqID 636 1577 AGmcgaagtgcacACGG
SeqID 637 1577 AGmcgaagtgcacaCGG
SeqID 638 1577 AG Cg aag tg cacacGG
SeqID 639 1578 CGaagtgcaCACG
SeqID 640 1578 CGAagtgcacACG
SeqID 641 1578 CGaagtgcacACG
SeqID 642 1578 AGCgaagtgcaCACG
SeqID 643 1578 AGCGaagtgcacACG
SeqID 644 1578 AGCGaagtgcacaCG
SeqID 645 1578 AGmcgaagtgcaCACG
SeqID 646 1578 AAgmcgaagtgcaCACG
SeqID 647 1578 AAG Cg aag tg cacaCG
SeqID 648 1578 AAGmcgaagtgcaCACG
SeqID 649 1578 AAGCgaagtgcacACG
SeqID 650 1578 AAGCgaagtgcaCACG
SeqID 651 1580 G Aag mcg aag tg C AC A
SeqID 652 1580 G AAG mcg aag tg caC A
- 102 034924
SeqID 653 1580 G AAg mcg aag tg C AC A
SeqID 654 1580 G AAG mcg aag tg C AC A
SeqID 655 1582 G G tg aag mcg aag tG C A
SeqID 656 1582 GGTgaagmcgaagtgCA
SeqID 657 1582 GGTGaagmcgaagtgCA
SeqID 658 1582 GGtgaagmcgaagT GCA
SeqID 659 1583 GGtgaagmcgaagT GC
SeqID 660 1583 GGTgaagmcgaagtGC
SeqID 661 1583 GGTGaagmcgaagtGC
SeqID 662 1583 GGtgaagmcgaaGTGC
SeqID 663 1583 AGg tg aag mcg aag TGC
SeqID 664 1583 AG Gtg aag mcg aag tG C
SeqID 665 1583 AG GTg aag mcg aag tG C
SeqID 666 1583 AGg tg aag mcg aaGTG C
SeqID 667 1584 AGGTgaagmcgaagTG
SeqID 668 1584 AGgtgaagmcgaAGTG
SeqID 669 1584 AG Gtg aag mcg aAGT G
SeqID 670 1584 AGGTgaagmcgaaGTG
SeqID 671 1585 AGGTgaagmcgaaGT
SeqID 672 1585 AGgtgaagmcgAAGT
SeqID 673 1585 AG Gtg aag mcg AAGT
SeqID 674 1585 AG GTg aag mcg aAGT
SeqID 675 1588 CAGAggtgaagcGA
SeqID 676 1588 CAgaggtgaaGCGA
SeqID 677 1588 CAGaggtgaaGCGA
SeqID 678 670 TAGtaaactgagCCA
SeqID 679 670 TAgtaaactgaGCCA
SeqID 680 670 TAGTaaactgagcCA
SeqID 681 670 TAGtaaactgaGCCA
SeqID 682 670 TAGTaaactgagCCA
SeqID 683 670 CTAgtaaactgagCCA
- 103 034924
SeqID 684 670 CTagtaaactgaGCCA
SeqID 685 670 CTAGtaaactg ag cC A
SeqID 686 671 CTAgtaaactgaGCC
SeqID 687 671 CTagtaaactgAGCC
SeqID 688 671 CTAGtaaactg agCC
SeqID 689 671 CTagtaaactgaGCC
SeqID 690 671 CTAgtaaactgagCC
SeqID 691 674 GCActagtaaacT GA
SeqID 692 674 GCactagtaaaCT GA
SeqID 693 674 G C ACtag taaactG A
SeqID 694 674 GCActagtaaaCT GA
SeqID 695 674 GCACtagtaaacT GA
SeqID 696 674 GGCactagtaaacT GA
SeqID 697 674 GGcactagtaaaCT GA
SeqID 698 674 G G C Actag taaactG A
SeqID 699 1141 CAAmcggggtaaaGGT
SeqID 700 1141 CAamcggggtaaAGGT
SeqID 701 1141 CAACggggtaaagGT
SeqID 702 1141 CAAmcggggtaaAGGT
SeqID 703 1141 CAACggggtaaaGGT
SeqID 704 1261 CAGtatggatmcgGCA
SeqID 705 1261 CAgtatggatmcGGCA
SeqID 706 1261 CAgtatggatmcgGCA
SeqID 707 1261 CAGtatgg atmcgg CA
SeqID 708 1265 TT CmcgcagtatggAT C
SeqID 709 1265 TTcmcgcagtatgGAT C
SeqID 710 1265 TTCCgcagtatggaTC
SeqID 711 1265 TTCmcgcagtatgGATC
SeqID 712 1265 TT CCgcagtatggAT C
SeqID 713 1266 TT CmcgcagtatgGAT
SeqID 714 1266 TTcmcgcagtatGGAT
- 104 034924
SeqID 715 1266 TTCCgcagtatggAT
SeqID 716 1266 TT CmcgcagtatGGAT
SeqID 717 1266 TTCCgcagtatgGAT
SeqID 718 1266 GTTcmcgcagtatgGAT
SeqID 719 1266 GTtcmcgcagtatGGAT
SeqID 720 1266 GTT Cmcgcagtatgg AT
SeqID 721 1267 GTtcmcgcagtaTGGA
SeqID 722 1267 GTTCmcgcagtatgGA
SeqID 723 1267 GTtcmcgcagtatGGA
SeqID 724 1267 GTTcmcgcagtatgGA
SeqID 725 1267 AGTtcmcgcagtatGGA
SeqID 726 1267 AGTTcmcgcagtatgGA
SeqID 727 1267 AGttcmcgcagtatGGA
SeqID 728 1267 AGTtcmcgcagtatgGA
SeqID 729 1267 AGttcmcgcagtatgGA
SeqID 730 1268 AGTtcmcgcagtaTGG
SeqID 731 1268 AGttcmcgcagtaT GG
SeqID 732 1268 AGTtcmcgcagtatGG
SeqID 733 1268 AGttcmcgcagtatGG
SeqID 734 1268 GAgttcmcgcagtaTGG
SeqID 735 1268 GAGttcmcgcagtatGG
SeqID 736 1268 GAgttcmcgcagtatGG
SeqID 737 1269 GAGTtcmcgcagtaT G
SeqID 738 1269 GAgttcmcgcagtATG
SeqID 739 1269 GAGttcmcgcagtaT G
SeqID 740 1269 GAgttcmcgcagtaTG
SeqID 741 1269 GGAGttcmcgcagtaT G
SeqID 742 1269 GGagttcmcgcagtAT G
SeqID 743 1269 GGAgttcmcgcagtaTG
SeqID 744 1269 GGagttcmcgcagtaT G
SeqID 745 1525 TAAagagaggtgmcGCC
- 105 034924
SeqID 746 1525 TAaagagaggtgCGCC
SeqID 747 1525 TAAAg ag agg tg mcg CC
SeqID 748 1525 TAAagagaggtgCGCC
SeqID 749 1525 TAAAgagaggtgmcGCC
SeqID 750 1526 TAAagagaggtgCGC
SeqID 751 1526 TAaagagaggtGCGC
SeqID 752 1526 TAAagagaggtGCGC
SeqID 753 1526 TAAAgagaggtgCGC
SeqID 754 1526 GTAaagagaggtgCGC
SeqID 755 1526 GTaaagagaggtGCGC
SeqID 756 1527 GTAaagagaggtGCG
SeqID 757 1527 GTaaagagaggT GCG
SeqID 758 1527 GTAaagagaggTGCG
SeqID 759 1527 GTAAagagaggtGCG
SeqID 760 1527 CGtaaagagaggTGCG
SeqID 761 1527 CGTAaagagaggtgCG
SeqID 762 1527 CGTaaagagaggT GCG
SeqID 763 1527 CGTAaagagaggtGCG
SeqID 764 1528 CGTaaagagaggT GC
SeqID 765 1528 CGtaaagagagGTGC
SeqID 766 1528 CGTAaagagaggtGC
SeqID 767 1528 CGTaaagagagGTGC
SeqID 768 1528 CGTAaagagaggTGC
SeqID 769 1528 GCGtaaagagaggTGC
SeqID 770 1528 G Cg taaag ag ag GTG C
SeqID 771 1528 G Cg taaag ag ag gTG C
SeqID 772 1528 GCGtaaagagaggtGC
SeqID 773 1529 GCGtaaagagagGTG
SeqID 774 1529 G Cg taaag ag aG GTG
SeqID 775 1529 GCGTaaagagaggTG
SeqID 776 1529 GCGtaaagagaGGT G
- 106 034924
SeqID 777 1529 GCGTaaagagagGTG
SeqID 778 1529 CGCgtaaagagagGTG
SeqID 779 1529 mcg mcgtaaag ag aGGTG
SeqID 780 1529 CGCGtaaagagaggTG
SeqID 781 1529 CGCgtaaagagaGGT G
SeqID 782 1529 CGCGtaaagagagGT G
SeqID 783 1552 TGAgaaggcacagACG
SeqID 784 1552 TGagaaggcacaGACG
SeqID 785 1552 TG AG aag g cacag aCG
SeqID 786 1552 TGAgaaggcacaGACG
SeqID 787 1552 T GAGaaggcacag ACG
SeqID 788 1690 GCctcaaggtmcgGT C
SeqID 789 1690 GCCtcaaggtmcggT C
SeqID 790 1690 GCctcaaggtmcggT C
SeqID 791 1778 AT gcctacagccT CC
SeqID 792 1778 AT GcctacagcctCC
SeqID 793 1778 ATgcctacagcctCC
SeqID 794 1785 ACCAatttatgcCTAC
SeqID 795 1785 ACCaatttatgcCTAC
SeqID 796 1785 ACCAatttatgccTAC
SeqID 797 1785 ACCaatttatgcCTAC
SeqID 798 1785 ACcaatttatgcCTAC
Таблица 4. Олигомеры LNA с GalNAc2 с конъюгирующей группой, связанной через С6 аминолинкер и расщепляемую са фосфодисложноэфирную связь с олигомером. GalNAc2 конъюгирующая группа также может быть замещена другими GalNA с конъюгирующими группами или стерольными группами. Мотив олигомерной последовательности, на котором основаны данные олигомеры, представляет собой вариант из табл. 2 и 3.
Заглавные буквы обозначают бета-П-окси LNA, строчные буквы обозначают ДНК, mc/mC обозначает 5-метилцитозин ДНК/LNA, s обозначает фосфоротиоатные' межнуклеозидные связи. В случаях, когда не определено, связь представляет собой фосфодисложноэфирную межнуклеозидную связь.
- 107 034924
SEQ ID NO Дизайн
SeqID 799 5- GN2-C6 caGgAgAgCgCgagCgtgggagagCgAgAgA_3
SeqID 800 5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasascsAsAsA-3'
SeqID 801 5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasasmCsAsA-3'
SeqID 802 5'- GN2-C6 ca Cs CsGscsasgstsastsgsgsasTs CsG-3'
SeqID 803 5'- GN2-C6 ca CSGS CsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3'
SeqID 804 5'- GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3'
SeqID 805 5'- GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3'
SeqID 806 5'- GN2-C6 caGs mCsGsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3'
SeqID 807 5'- GN2-C6 caAsGs Csgsasasgstsgscsascsas CsGsG-3'
SeqID 808 5'- GN2-C6 caAsGs CsgsasasgstsgscsascsAs CsG-3'
SeqID 809 5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasgsTsGs C-3'
SeqID 810 5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasGsTsG-3'
SeqID 811 5'- GN2-C6 ca CsGsAsascscsascstsgsasAs
SeqID 812 5- GN2-C6 ca OgGgAgagCgCgagCgtgggagAg C_3
SeqID 813 5'- GN2-C6 ca CSGS CsasgstsastsgsgsasTs C-3'
SeqID 814 5'- GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3'
SeqID 815 5'- GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsasGsG-3'
SeqID 816 5'- GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mcsGsG-3'
SeqID 817 5'-GN2-C6 ca CsGsAsasgstsgscsascsas CsG-3'
SeqID 818 5 -GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs CsgsagAgGgT_3
SeqID 819 5’-GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasas mCsAsAsA-3’
SeqID 820 5 -GN2-C6 ca CsGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3
SeqID 821 5 -GN2-C6 caGsAsAsggtsgscsascsas CgGgG_3
SeqID 822 5’-GN2-C6 caTsAsGstsasasascstsgsasgs Cs CSAS3’
SeqID 823 5 -GN2-C6 ca OgGgAgagCgCgagCgtgggAgAg C_3
SeqID 824 5 -GN2-C6 ca ^s^sAgagCgCgagCgtgggAgAg CgA_3
SeqID 825 5'-GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsAsGsG-3'
SeqID 826 5 -GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs csgsasAsGsTsG-3'
- 108 034924
Перед конъюгацией с GalNAc, олигомеры LNA из табл. 4 представляют собой АМ-С6 са-олигомер, где АМ-С6 представляет собой аминолинкер, готовый для конъюгации, и са представляет собой расщепляемую фосфодисложноэфирную связь. Данные олигомеры включены посредством ссылки из табл. 4 в приоритетной заявке GB1408623.5.
Воплощения.
Следующие воплощения настоящего изобретения, представленные в виде пронумерованных абзацев, могут быть применены в комбинации с другими воплощениями, описанными в данном документе.
1. Олигомерный конъюгат для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
2. Олигомерный конъюгат для применения по п.1, где упомянутый компонент-носитель способен к доставке упомянутого олигомера в печень субъекта, подлежащего лечению посредством введения упомянутого олигомерного конъюгата.
3. Олигомерный конъюгат для применения по п.1 или 2, где упомянутый компонент-носитель способен к доставке упомянутого олигомера к гепатоциту субъекта, подлежащего лечению посредством введения упомянутого олигомерного кандидата.
4. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-3, где упомянутый компонентноситель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу.
5. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-4, где упомянутый компонентноситель представляет собой группу, нацеленную на асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R).
6. Олигомерный конъюгат для применения по п.4 или 5, где упомянутая карбогидратная группа или нацеленная на ASGP-R группа выбрана из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формилгалактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноилгалактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них.
7. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-6, где упомянутый компонентноситель представляет собой кластер GalNAc, содержащий 2-4 терминальных производных галактозы, гидрофильный спейсер, связывающий каждое производное галактозы с группой точки ветвления.
8. Олигомерный конъюгат для применения по п.7, где производные галактозы представляют собой GalNAc, спейсер представляет собой ПЭГ спейсер и группа точки ветвления содержит пептид с двумя или более аминогруппами, такими как дилизин или трилизин.
9. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-8, где упомянутый компонентноситель представляет собой GalNAc2.
10. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-9, где упомянутый первый олигомерный участок по меньшей мере на 80% комплементарен последовательности-мишени.
11. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-10, где упомянутый первый олигомерный участок содержит одно или более звено LNA.
12. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-11, где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер.
13. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-12, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено - запертую нуклеиновую кислоту (LNA, от англ. locked nucleic acid).
14. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-13, где упомянутый первый олигомерный участок содержит любой из мотивов: 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 2-9-2, 3-9-3, 2-9-3, 3-9-2, 2-10-2, 3-10-3, 3-10-2, 2-10-3, где первое число представляет собой число звеньев LNA в 5' участке крыла LNA, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке, и третье число представляет собой число звеньев LNA в 3' участке крыла LNA.
15. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-13, где упомянутый первый олигомерный участок составляет 8-30 нуклеотидов в длину.
16. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-15, где упомянутый первый олигомерный участок составляет 10-20 нуклеотидов в длину.
17. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-16, где упомянутый первый олигомерный участок составляет 10-16 нуклеотидов в длину.
18. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-17, где упомянутый первый олигомерный участок составляет 10-14 нуклеотидов в длину.
19. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-18, где упомянутый первый олигомерный участок связывается с последовательностью-мишенью.
20. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-19, где упомянутый первый олигомерный участок способен ингибировать любой один или более экспрессию, репликацию или трансляцию
- 109 034924 последовательности-мишени.
21. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-20, где упомянутый первый олигомерный участок способен ингибировать экспрессию последовательности-мишени.
22. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-21, где упомянутая последовательность-мишень представляет собой ген или мРНК.
23. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-22, где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или ее вариант естественного происхождения.
24. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-23, где упомянутая последовательность-мишень представляет собой ген или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или ее вариант естественного происхождения.
25. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-24, где упомянутая последовательность-мишень расположена внутри последовательности, показанной как SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2, или последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична ей, предпочтительно по меньшей мере 85% идентична ей, предпочтительного меньшей мере на 90% идентична ей, предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична ей.
26. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-24, где упомянутая последовательность-мишень расположена внутри последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 1 и \SEQ ID NO: 2.
27. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-26, где упомянутая последовательность-мишень по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична любой одной или более из HBV генотипов А-Н.
28. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-27, где упомянутая последовательность-мишень выбрана из группы, состоящей из любой одной или более позиций:
1264-1278;
1530-1544;
1551-1566;
1577 to 1598;
691-706;
670-684,
SEQ ID NO: 3.
29. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-28, где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7);
GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5);
CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834).
30. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-29, где упомянутый первый олигомерный участок основан на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более:
- 110 034924
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO 303); GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO 301); GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668);
AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308);
CGAaccactgaACA (SEQ ID NO 297);
CGCagtatggaTC (SEQ ID NO 300);
AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315);
AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316);
GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 294);
CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO 295);
CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO 296);
CGAaccactgaAC (SEQ ID NO 298);
CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO 299);
CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302);
AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO 304);
GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO 305);
GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO 306);
GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 307);
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO 309);
GAAccactgaaCAAA (SEQ ID NO 585);
CGAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 588)
GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 628);
TAGtaaactgagCCA (SEQ ID NO 678);
CGAaccactgAAC (SEQ ID NO 600);
AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и CGAaccactgAACA (SEQ ID NO 597).
где прописные буквы обозначают звенья LNA и строчные буквы обозначают звенья ДНК.
31. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-30, где упомянутый олигомерный конъюгат выбран из группы, состоящей из любой одной или более:
- 111 034924
5'- GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO 815)
5'- GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 814)
5'-GN2-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsAsGsG-3 (SEQ ID NO 825)
5'- GN2-C6 caAsGs CsgsasasgstsgscsascsAs CsG-3' (SEQ ID NO 808)
5’-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs csgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 826)
5 - GN2-C6 caAsGs Cs9sasas9s^s9scsascsas (SEQ ID NO 807)
5- GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3 (SEQ ID NO 799)
5- GN2-C6 ca CgGgAgagCgCgagCgtgQgagagCgAgAgA_3 (SEQ ID NO 800)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasasmCsAsA-3' (SEQ ID NO 801)
5'- GN2-C6 ca Cs CsGscsasgstsastsgsgsasTs CsG-3 (SEQ ID NO 802)
5'- GN2-C6 ca CSGS CsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 803)
5'- GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas CsGsG-3' (SEQ ID NO 804)
5 - GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 805)
5'- GN2-C6 caGs CsGsasasgstsgscsascsas CsGsG-3' (SEQ ID NO 806)
5'- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasgsTsGs C-3' (SEQ ID NO 809)
5- GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasGsTsG-3 (SEQ ID NO 810)
5'- GN2-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasAsmCsA-3' (SEQ ID NO 811)
5 - GN2-C6 ca CgGgAgagCgCgagCgtgggagAg θ 3 (SEQ ID NO 812)
5'- GN2-C6 ca CSGS CsasgstsastsgsgsasTs C-3 (SEQ ID NO 813)
5'- GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mcsGsG-3' (SEQ ID NO 816)
5'-GN2-C6 ca CsGsAsasgstsgscsascsas CsG-3' (SEQ ID NO 817)
(SEQ ID NO 818)
-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasAsGsT-3
5 -GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasas CsAsAsA-3 (SEQ ID NO 819)
5’-GN2-C6 camCsGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3’ (SEQ ID NO 820)
5 -GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 821)
5 -GN2-C6 caTsAsGstsasasascstsgsasgs Cs CSAS3 (SEQ ID NO 822)
5 -GN2-C6 ca CsGsAsasCsCsasCstsgsAsAs G 3 (SEQ ID NO 823)
5'-GN2-C6 ca CsGsAsascscsascstsgsAsAs CsA-3 (SEQ ID NO 824)
где прописные буквы обозначают звенья бета-D-OKCH-LNA;
строчные буквы обозначают звенья ДНК;
нижний индекс s означает фосфоротиоатную связь;
верхний индекс m означает звено ДНК или бета-D-окси-LNA, содержащее 5-метилцитозиновое основание;
GN2-C6 обозначает GalNAc2 компонент-носитель с С6 линкером.
32. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-29, где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
- 112 034924
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13)
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11) и CGCGTAAAGAGAGGT (SEQIDNO 12).
33. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-29, где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из одной или более из:
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19) и AGGTGAAGCGAAGT (SEQIDNO 27).
34. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-33, где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок, где L1 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу, или где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L2 - компонент-носитель, где L2 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу.
35. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-34, где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок где L1 представляет собой возможный линкер.
36. Олигомерный конъюгат для применения по п.34 или 35, где присутствует упомянутый линкер 1.
37. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-36, где упомянутый компонентноситель связан, предпочтительно конъюгирован с 5'-концом упомянутого олигомера.
38. Олигомерный конъюгат для применения по пп.34-37, где линкерная группа или ветвящий участок представляет собой физиологически лабильную линкерную группу, или физиологически лабильный ветвящий участок, или физиологически лабильную связывающую молекулу, или физиологически лабильную мостиковую группу.
39. Олигомерный конъюгат для применения по п.38, где физиологически лабильная линкерная группа представляет собой линкер, чувствительный к нуклеазе.
40. Олигомерный конъюгат для применения по п.38 или 39, где физиологически лабильный линкер в дальнейшем конъюгирован с С6-С12 аминоалкильной группой.
41. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-40, который в дальнейшем содержит второй олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень.
42. Олигомерный конъюгат для применения по п.41, где каждый из первого олигомерного участка и второго олигомерного участка способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV.
43. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.31 или 42, где каждый из первого олигомерного участка и второго олигомерного участка способен модулировать последовательностьмишень в НВх или HBsAg HBV; где упомянутые целевые участки различаются.
44. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.41-43, где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок, где L1 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L1 и L2 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок - L3 -компонент-носитель, где L2 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
- 113 034924 компонент-носитель 1 - L1 - первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок - L3 компонент-носитель 2, где L1 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу, где L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными, компонент-носитель 1 и компонент-носитель 2 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L1 -компонент-носитель 1 - L2 - второй олигомерный участок, где L1 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой возможный линкер или ветвящий участок или связывающую молекулу или мостиковую группу где L1 и L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными; или где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
первый олигомерный участок - L1 -компонент-носитель 1 - L2 - второй олигомерный участок - L3 компонент-носитель 2, где L1 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L2 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу, или мостиковую группу,
L3 представляет собой возможный линкер, или ветвящий участок, или связывающую молекулу или мостиковую группу,
L1 и L2 могут быть одинаковыми или различными, компонент-носитель 1 и компонент-носитель 2 могут быть одинаковыми илитразличными; или где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
компонент-носитель 1 - L1 - первый олигомерный участок - L2 -компонент-носитель 2 - L3 - второй олигомерный участок - L4 - компонент-носитель 3, где L1 представляет собой возможный линкер или ветвящий участок или связывающую молекулу или мостиковую группу
L2 представляет собой возможный линкер или ветвящий участок или связывающую молекулу или мостиковую группу,
L3 представляет собой возможный линкер или ветвящий участок или связывающую молекулу или мостиковую группу,
L1, L2 и L3 могут быть одинаковыми или различными, компонент-носитель 1, компонент-носитель 2 и компонент-носитель 3 могут быть одинаковыми или различными.
45. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.39-43, где упомянутый олигомерный конъюгат обладает или содержит структуру:
Компонент-носитель - L1 - первый олигомерный участок - L2 - второй олигомерный участок, где L1 представляет собой возможный линкер или ветвящий участок или связывающую молекулу или мостиковую группу,
L2 представляет собой возможный линкер или ветвящий участок или связывающую молекулу или мостиковую группу,
L1 и L2 могут быть одинаковыми или различными.
46. Олигомерный конъюгат для применения по п.45, где присутствует упомянутый линкер 1.
47. Олигомерный конъюгат для применения по п.45 или 46, где присутствует упомянутый линкер 2.
48. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.41-46, где упомянутый компонентноситель связан, предпочтительно конъюгирован с 5'-концом упомянутого олигомера.
49. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.41-48, где каждый из первого олигомерного участка и второго олигомерного участка связан, предпочтительно конъюгирован посредством линкера или ветвящего участка.
50. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.41-49, где каждый и первый олигомерный участок и второй олигомерный участок связаны, предпочтительно конъюгированы за счет физиологически лабильной линкерной группы или физиологически лабильного участка.
51. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-50, где упомянутое вирусное заболевание представляет собой гепатит В или заболевание, ассоциированное с HBV.
52. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-51, где вирусное заболевание ассоциировано с экспрессией или повышенной экспрессией НВх или HBsAg.
53. Олигомерный конъюгат для применения по любому из пп.1-52, где упомянутый олигомерный
- 114 034924 конъюгат вводят подкожно.
54. Композиция для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат, как определено в любом из пп.1-53 и по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид.
55. Композиция для применения по п.54, где по меньшей мере один из упомянутых дополнительных отличающихся олигонуклеотидов представляет собой олигомерный конъюгат.
56. Композиция для применения по п.54 или .55, где каждый упомянутый дополнительный отличающийся олигонуклеотид представляет собой олигомерный конъюгат.
57. Композиция для применения по любому из пп.54-56, где упомянутый дополнительный отличающийся олигонуклеотид способен модулировать последовательность-мишень в HBV.
58. Композиция для применения по любому из пп.54-57, где по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV.
59. Композиция для применения по любому из пп.54-58, где по меньшей мере один упомянутый дополнительный отличающийся олигонуклеотид способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV; и где упомянутый по меньшей мере один из дополнительных упомянутых отличающихся олигонуклеотидов способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV отличную от той, на которую нацелен олигомерный конъюгат по любому из пп.1-53.
60. Композиция для применения по любому из пп.54-59, где каждый упомянутый дополнительный отличающийся олигонуклеотид способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV.
61. Композиция для применения по любому из пп.54-60, где каждый из упомянутых дополнительных отличающихся олигонуклеотидов способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV; и где каждый дополнительный отличающийся олигонуклеотид способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV, отличающуюся от той, на которую нацелен олигомерный конъюгат по любому из пп.1 - 53.
62. Олигомерный конъюгат приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного расстройства; и
b) компонент-носитель для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
63. Олигомерный конъюгат по п.62, где упомянутый олигомер определен в любом из пп.1-53.
64. Композиция, приемлемая для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат и по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид; где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
65. Композиция по п.64, где упомянутый олигомерный конъюгат представляет собой олигомерный конъюгат, определенный в любом из пп.1-53 или любом из пп.62, 63.
66. Композиция по п.64 или 65, где упомянутый дополнительный отличающийся олигонуклеотид определен в любом из пп.62, 63.
67. Олигомер, основанный на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
- 115 034924
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7);
GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5);
CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и
TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834) который способен модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg HBV для лечения вирусного заболевания.
68. Олигомер по п.67, где упомянутый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13)
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11) и
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12).
69. Олигомер по п.67, где олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19) и
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27).
70. Олигомер по любому из пп.67-69, где упомянутый олигомер содержит одно или более звено LNA.
71. Олигомер по любому из пп.67-70, где упомянутый олигомер представляет собой гэпмер.
72. Олигомер по любому из пп.67-71, где упомянутый олигомер содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, где каждое крыло независимо содержит одно или более звеньев LNA.
73. Олигомер по любому из пп.67-72, где упомянутый олигомер любой один из мотивов: 2-8-2, 3-83, 2-8-3, 3-8-2, 2-9-2, 3-9-3, 2-9-3, 3-9-2, 2-10-2, 3-10-3, 3-10-2, 2-10-3, где первое число представляет собой звенья LNA в участке крыла LNA, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке, и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла LNA.
74. Олигомер по любому из пп.67-73, где упомянутый первый олигомерный участок составляет в длину 10-18 нуклеотидов.
75. Олигомер по любому из пп.67-74, где упомянутый первый олигомерный участок составляет в длину 10-16 нуклеотидов.
76. Олигомер по любому из пп.67-75, где упомянутый первый олигомерный участок составляет в длину 10-14 нуклеотидов.
77. Олигомер по любому из пп.67-76, основанный на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO 303);
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO 301);
GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO 618);
AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO 310)
- 116 034924
AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO 668); AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 308); CGAaccactgaACA (SEQ ID NO 297); CGCagtatggaTC (SEQ ID NO 300); AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO 315); AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO 316); GAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 294); CGAaccactgaacAAA (SEQ ID NO 295); CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO 296); CGAaccactgaAC (SEQ ID NO 298); CCGcagtatggaTCG (SEQ ID NO 299); CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO 302); AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO 304); GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO 305); GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO 306); GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO 307);
CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO 309); GAAccactgaaCAAA (SEQ ID NO 585); CGAAccactgaacAAA (SEQ ID NO 588) GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO 628); TAGtaaactgagCCA (SEQ ID NO 678);
CGAaccactgAAC (SEQ ID NO 600);
AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO 317); и
CGAaccactgAACA (SEQ ID NO 597), где прописные буквы обозначают усиливающие аффинность нуклеотидные аналоги, и строчные буквы обозначают звенья ДНК.
78. Олигомер по любому из пп.67-77, основанный на последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой одной или более из:
5'- АМ-С6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO 303)
5'- AM-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO 301)
5'-AM-C6 caGs CsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO 618)
5'- AM-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsAsrnCsG-3' (SEQ ID NO 310)
5’-AM-C6 caAsGsgstsgsasasgs mcsgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO 668)
- 117 034924
5'- АМ-С6 caAsGs Csgsasasgstsgscsascsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 308)
5'- АМ-С6 caGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO 294)
5'- AM-C6 ca CsGsAsascscsascstsgsasascsAsAsA-3 (SEQ ID NO 295)
5'- AM-C6 camCsGsAsascscsascstsgsasasmCsAsA-3' (SEQ ID NO 296)
5'- AM-C6 ca Cs CsGscsasgstsastsgsgsasTs CsG-3' (SEQ ID NO 299)
5'- AM-C6 ca CSGS CsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3 (SEQ ID NO 302)
5'- AM-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas CsGsG-3' (SEQ ID NO 304)
5 - AM-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 305)
5'- AM-C6 caGs CsGsasasggtsgscsascsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 307)
5'- AM-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasgsTsGs C-3' (SEQ ID N0315)
5 - AM-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasasGsTsG-3 (SEQ ID NO 316)
5 - AM-C6 ca OgGgAgagCgCgagCgtgggagAg (SEQ ID NO 297)
5 - AM-C6 ca OgGgAgagCgCgagCgtgggagAg (SEQ ID NO 298)
5'- AM-C6 ca CSGS CsasgstsastsgsgsasTs 0-3' (SEQ ID NO 300)
5'- AM-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas csGsG-3' (SEQ ID NO 306)
5'-AM-C6 ca CsGsAsasgstsgscsascsas CsG-3' (SEQ ID NO 309)
5'-AM-C6 caAsGsGstsgsasasgs csgsasAsGsT-3 (SEQ ID NO 317)
5 -AM-C6 caGsAsAgCgCgagCgtgQgagag CgAgAgA_3 (SEQ ID NO 585)
5’-AM-C6 camCsGsAsAsCsCsasCstsgsasasCsAsAsA-3’ (SEQ ID NO 588)
5’-AM-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas CsGsG-3 (SEQ ID NO 628)
5 -AM-C6 caTsAsGstsasasascstsgsasgs Cs CSAS3 (SEQ ID NO 678)
5’-AM-C6 camCsGsAsascscsascstsgsAsAs mC-3’ (SEQ ID NO 600)
M-C6 ca Cs®s^sascscsascs^s9s^s^s (SEQ ID NO 597)
где прописные буквы обозначают звенья бета-D-OKCH-LNA;
строчные буквы обозначают звенья ДНК;
нижний индекс s обозначает фосфоротиоатную связь;
верхний индекс m обозначает звено ДНК или бета-D-окси-LNA, содержащее 5-метилцитозиновое основание;
АМ-С6 представляет собой амино-С6 линкер; где 5' терминальная группа АМ-С6 са является возможной.
79. Олигомеры по любому из пп.67-78 для применения при медицинском лечении.
80. Олигомеры по любому из пп.67-79 для применения при лечении вирусного заболевания.
81. Олигомеры по п.79 или п.80, где упомянутый олигомер определен в любом из пп. 1-53.
82. Олигомеры по п.79 или п.81, где упомянутое заболевание определено в любом из пп. 1-53.
83. Композиция, приемлемая для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид; где упомянутый олигомер содержит по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания.
84. Композиция по п.83, где упомянутый олигомер представляет собой олигомер по любому из пп.67-82.
85. Композиция по п.83 или п.84, где упомянутый по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид представляет собой дополнительный отличающийся олигонуклеотид по лю
- 118 034924 бому из пп.54-61.
86. Способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества олигомерного конъюгата по п.62 или 63 или олигомерного конъюгата по любому из пп.1-52.
87. Способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции по любому из пп.64-66 или композиции по любому из пп.54-61 или композиции по любому из пп.83-85.
88. Способ лечения вирусного заболевания, упомянутый способ, содержащий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества олигомера по любому из пп.67-82.
89. Фармацевтическая композиция, содержащая олигомерный конъюгат по п.62 или п.63 или олигомерный конъюгат по любому из пп.1-53 и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
90. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из пп.64-66 или композици по любому из пп.54-61, или композицию по любому из пп.83-85 и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
91. Фармацевтическая композиция, содержащая олигомер по любому из пп.67-82 и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
Фармацевтическая система, содержащая фармацевтическую композицию по любому из пп.89-91 и дополнительное фармацевтическое вещество.
92. Способ производства олигомерного конъюгата по любому из пп.1-52, содержащий один или более олигомер по любому из пп.1-52, содержащий конъюгирование одного или более олигомера, определенного в любому из пп.1-53, с компонентом-носителем по любому из пп.1-53.
93. Способ производства композиции по любому из пп.64-66, содержащий смешивание олигомерного конъюгата по любому из пп.1-53 с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солью или адъювантом.
94. Способ производства композиции по п.91, содержащий смешивание олигомера по любому из пп.67-82 с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солью или адъювантом.
95. Изобретение по любому из пп.1-93, где олигомер или олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число модифицированных нуклеотидов в участке крыла, предпочтительно по меньшей мере один, представляющий собой звено LNA, предпочтительно все представляющие собой звено LNA, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке, и третье число представляет собой число модифицированных нуклеотидов в участке крыла, предпочтительно по меньшей мере один, представляющий собой звено LNA, предпочтительно все, представляющие собой звено LNA.
96. Олигомерный конъюгат, по существу, определенный в данном документе, и со ссылкой на примеры.
97. Композиция, по существу, определенная в данном документе и со ссылкой на примеры.
98. Олигомер, по существу, определенный в данном документе и со ссылкой на примеры.
99. Способ, по существу, определенный в данном документе и со ссылкой на примеры.
Конкретные воплощения
Настоящее изобретение относится к олигомерному конъюгату для применения при лечении вирусного заболевания. Олигомерный конъюгат содержит:
a) олигомер, способный модулировать последовательность-мишень в НВх или HBsAg вируса гепатита В (HBV) для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель, конъюгированный с упомянутым олигомером. Предпочтительно компонент-носитель служит для доставки упомянутого первого олигомера в печень.
Предпочтительные аспекты для конкретных воплощений настоящего изобретения в настоящем приведены.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень в вирусе гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель, где упомянутый первый олигомерный участок составляет в длину 8-16 нуклеотидов; где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звеньев LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из
- 119 034924 них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит кластер GalNAc или GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат, приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель, где упомянутый первый олигомерный участок составляет в длину 8-16 нуклеотидов; где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит кластер GalNAc или GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает композицию, приемлемую для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат и по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид; где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень в вирусе гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного расстройства; и
b) компонент-носитель, где упомянутый первый олигомерный участок составляет 8-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формилгалактозамина, N-ацетил-галактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноилгалактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них;
предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит кластер GalNAc или GalNAc; предпочтительно компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующей НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый первый олигомерный участок составляет 8-16 нуклеотидов в длину; где упомянутый первый олигомерный участок представляет сбой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонкулеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звеньев LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамин или кластер любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит кластер GalNAc или GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
- 120 034924
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834).
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат, приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый олигомерный участок составляет 8-16 олигонуклеотидов в длину; где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит кластер GalNAc или GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
- 121 034924
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7);
GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5);
CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает композицию, приемлемую для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат и по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид; где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного расстройства; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый первый олигомерный участок составляет 8-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звеньев LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7);
GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5);
CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
- 122 034924
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый первый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где олигомерный конъюгат содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-82, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крылв, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат, приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один олигомерный участок способный модулировать последовательностьмишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину; где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть или мРНК, кодирующей НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения; где олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает композицию, приемлемую для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат и по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид; где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомяну
- 123 034924 того вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину; где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или боле звено LNA; где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формилгалактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноилгалактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат для применения при лечении вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый первый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); JCGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834;
- 124 034924 где олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомерный конъюгат, приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый первый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер,предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7);
GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5);
CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и
TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834);
где олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает композицию, приемлемую для лечения вирусного заболевания, где упомянутая композиция содержит олигомерный конъюгат и по меньшей мере один дополнительный отличающийся олигонуклеотид; где упомянутый олигомерный конъюгат содержит:
a) по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и
b) компонент-носитель;
где упомянутый первый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный
- 125 034924 с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый компонент-носитель представляет собой карбогидратную конъюгирующую группу, предпочтительно упомянутый компонент-носитель выбран из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина, N-изобутаноилгалактозамина или кластера любого одного или более из них; предпочтительно упомянутый компонент-носитель содержит GalNAc или кластер GalNAc; предпочтительно упомянутый компонент-носитель представляет собой GalNAc2;
где упомянутая последовательность-мишень содержит по меньшей мере часть гена или мРНК, кодирующую НВх или HBsAg или его вариант естественного происхождения;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26);
AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18);
JCGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7);
GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4);
CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5);
CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10);
CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12);
AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14);
GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16);
GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17);
CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834;
где олигомерный компонент олигомерного конъюгата содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке, и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомер для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомер содержит по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания; и где упомянутый первый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину;
где упомянутый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звеньев LNA;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
- 126 034924
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20);
AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); CGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834;
где олигомер содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
В одном аспекте настоящее изобретение предлагает олигомер, приемлемый для лечения вирусного заболевания, где упомянутый олигомер содержит по меньшей мере один первый олигомерный участок, способный модулировать последовательность-мишень вируса гепатита В (HBV), предпочтительно НВх или HBsAg HBV, для лечения упомянутого вирусного заболевания, и где упомянутый первый олигомерный участок составляет 12-16 нуклеотидов в длину; где упомянутый первый олигомерный участок представляет собой гэпмер, предпочтительно, где упомянутый первый олигомерный участок содержит 2'дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, предпочтительно, где каждое крыло независимо содержит одно или более звено LNA;
где упомянутый первый олигомерный участок основан на коровом мотиве, выбранном из группы, состоящей из любой одной или более из:
GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO 13);
GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 11);
AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 20); AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO 26); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 18); JCGAACCACTGAACA (SEQ ID NO 7); GAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 4); CGAACCACTGAACAAA (SEQ ID NO 5); CGAACCACTGAACAA (SEQ ID NO 6);
CGAACCACTGAAC (SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG (SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC (SEQ ID NO 10); CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO 12); AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 16); GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO 17); CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO 19);
AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO 27); и TAGTAAACTGAGCCA (SEQ ID NO 834;
где олигомер содержит любой один из мотивов: 3-10-3, 3-10-2, 3-9-3, 3-9-2, 3-8-3, 3-8-2, где первое число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла, второе число представляет собой число нуклеотидов в гэп участке и третье число представляет собой число звеньев LNA в участке крыла.
- 127 034924
Примеры
Материалы и методы.
Детекция HBsAg и HBeAg.
Сывороточный уровень HBsAg и НВеАд определяли в сыворотке инфицированных AAV-HBV мышей при помощи HBsAg хемолюминесцентного иммуноанализа (CLIA) и НВеАд кита CLIA (Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou, China, Cat. no. CL0310-2 и CL0312-2 соответственно) согласно протоколу производителя. Вкратце, 50 мкл сыворотки переносили в соответствующий микропланшет, покрытый антителами, и добавляли 50 мкл реагента конъюгата фермента. Планшет инкубировали в течение 60 мин на шейкере при комнатной температуре перед тем, как все лунки промывали 6 раз буфером для промывки при помощи автоматического вошера. К каждой лунке добавляли 25 мкл субстрата А и затем 25 мкл субстрата В. Планшет инкубировали в течение 10 мин при КТ (комнатной температуре) перед измерением люминесценции при помощи ридера люминесценции Envision. HBsAg дана в виде единицы МЕ/мл; где 1 нг HBsAg =1,14 ME. HBeAg дана в виде единицы ТЕ/мл сыворотки.
Экстракция ДНК HBV и количественная ПЦР (qPCR).
Первично сыворотку мыши разбавляли с фактором разведения 10 (1:10) фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). ДНК экстрагировали при помощи робота MagNA Pure 96 (Roche). 50 мкл разбавленной сыворотки смешивали в рабочем картридже с 200 мкл внешнего лизисного буфера MagNA Pure 96 (Roche, Cat. no. 06374913001) и инкубировали в течение 10 мин. Затем ДНК экстрагировали при помощи MagNA Pure 96 DNAand Viral Nucleic Acid Small Volume Kit (Roche, Cat. no. 06543588001) и протокола Viral NA Plasma SV external lysis 2.0. Элюирующий объем ДНК составил 50 мкл.
Количественную оценку экстрагированной ДНК HBV выполняли при помощи Taqman qPCR machine (VNA7, life technologies). Каждый образец ДНК тестировали в дупликате в ходе ПЦР. 5 мкл образца ДНК добавляли к 15 мкл ПЦР-смеси, содержащей 10 мкл TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Cat. no. 4369016), 0,5 мкл PrimeTime XL qPCR Primer/Probe (IDT) и 4,5 мкл дистиллированной воды в 384 луночном планшете и ПУР проводили при следующих условиях: UDG-инкубация (2 мин, 50°С), активация фермента (10 мин, 95°С) и ПЦР (40 циклов: 15 с, 95° для денатурации и 1 мин, 60°С для отжига и удлинения). Число копий ДНК вычисляли исходя из значений Ct на основании стандартной кривой для плазмидной ДНК HBV при помощи программного обеспечения VNA7. Последовательности TaqMan праймеров и проб (IDT): Прямой праймер на кор (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG СТТ Т Обратный праймер (R3_core): AAG GAAAGAAGT CAG AAG GCAAAA Taqman проба (P3_core): 56-FAM/AGC ТСС ААА /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ
In vitro анализ тканеспецифичного расщепления линкера FAM-меченные олигомеры с физиологически лабильным линкером, подлежащие тестированию (например, ДНК фосфодисложноэфирный линкер (РО линкер)) подвергали расщеплению in vitro при помощи гомогенатов соответствующих тканей (например, печень или почки) и сыворотки.
Образцы тканей и сыворотки собирали от приемлемых животных (например, мышь, обезьяна, свинья или крыса) и гомогенизировали в буфере для гомогенизации (0,5% Igepal CA-630, 25 мМ Трис рН 8,0, 100 мМ NaCl, pH 8,0 (подведенного 1н. NaOH). Тканевые гомогенаты и сыворотку обогащали олигомером до концентрации 200 мкг/г ткани. Образцы инкубировали в течение 24 ч при 37°С, и затем образцы экстрагировали при помощи фенол-хлороформа. Растворы подвергали анионообменной ВЭЖХ на Dionex Ultimate 3000 при помощи Dionex DNApac р-100 колонки и градиента, варьирующего от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и не расщепленного олигомера определяли относительно стандарта при помощи как флуоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ-детектора при 260 нм.
Анализ расщепления нуклеазой S1.
FAM-меченные олигомеры с линкерами, чувствительными к нуклеазе S1, (например, ДНК фосфодисложноэфирным линкером (РО линкер)) подвергали расщеплению in vitro в экстракте нуклеазы S1 или сыворотке.
100 мкМ олигомер подвергали расщеплению in vitro нуклеазой S1 в нуклеазном буфере (60 ед/100 мкл) в течение 20 и 120 мин. Ферментативную активность останавливали посредством добавления ЭДТА к буферному раствору. Растворы подвергали анионообменной ВЭЖХ на Dionex Ultimate 3000 при помощи Dionex DNApac р-100 колонки и градиента, варьирующего от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и не расщепленного олигомера определяли относительно стандарта при помощи как флуоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ-детектора при 260 нм.
Пример 1.
Конструкция конъюгатов.
Олигонуклеотиды синтезировали на уридиновых универсальных подложках или подложке UnyLinker от Kinovate при помощи фосфорамидитного метода на синтезаторе ДНК/РНК MerMade12 или OligoMaker при масштабе 4 мкмоль. В конце синтеза олигонуклеотиды отщепляли от твердой подложки при помощи водного аммиака в течение 1-2 ч при комнатной температуре и в дальнейшем депротектиро
- 128 034924 вали в течение 16 ч при 65°С. Олигонуклеотиды очищали при помощи обратно-фазовой ВЭЖХ (RP-HPLC) и характеризовали посредством ВЭЖХ, и молекулярные массы в дальнейшем подтверждали посредством ESI-MS (масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением). Подробнее см. ниже.
Удлинение олигонуклеотида.
Соединение β-цианоэтил-фосфорамидитов (DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5метил-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf), LNA-T или амино-С6 линкер) проводили при помощи раствора 0,1 М 5'-О-DMT-защищенного фосфорамидита в ацетонитриле и DCI (4,5-дицианоимидазоле) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Тиолирование для введения фосфотиоатных связей выполняли при помощи гидрида ксантана (0,01 М в ацетонитрил/пиридин 9:1). Фосфодисложноэфирные связи вводили при помощи 0,02 М йодина в ТГФ/пиридин/вода 7:2:1. Остальные реагенты представляли собой таковые, обычно применяемые для синтеза олигонуклеотидов. Для конъюгирования после твердофазного синтеза применяли коммерчески доступный С6 аминолинкер фосфорамидит в последнем цикле твердофазного синтеза и после депротектирования и отщепления от твердой подложки, изолировали аминосвязанный депротектированный олигонуклеотид. Конъюгат вводили через активацию карбоновой кислоты и последующую реакцию с амином на 5'-конце олигонуклеотида при помощи способов стандартного синтеза.
Очистка посредством ОФ-ВЭЖХ.
Неочищенное соединение очищали при помощи препаративной ОФ-ВЭЖХ на Phenomenex Jupiter C18 10 мкм 150x10 мм колонке. 0,1 М ацетат аммония рН 8 и ацетонитрил применяли в качестве буферов при скорости тока 5 мл/мин. Собранные фракции лиофилизировали для получения очищенного соединения, обычно в виде белого твердого вещества.
Сокращения:
DCI: 4,5-дицианоимидазол,
ДХМ: дихлорметан,
ДМФ: диметилформамид,
DMT: 4,4'-диметокситритил,
ТГФ: тетрагидрофуран,
Bz: бензоил,
Ibu: изобутирил,
ОФ-ВЭЖХ: обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.
Пример 2.
Анализ эффективности in vitro.
Введение.
HbsAg анализ, выполненный в следующих исследованиях, является стандартным методом. Он измеряет количество образующегося вируса. Таким образом, он измеряет снижение вируса за счет олигомеров или олигомерных конъюгатов, нацеленных на НВх или HBsAg. Кроме того, олигомеры или олигомерные конъюгаты, которые нацелены на транскрипт НВх также будут нацелены на транскрипт HbsAg (см. также столбец 3 и 4 в таблице результатов).
Клеточные линии.
HepG2.2.15 клетки культивировали в DMEM+Glutamax-I среде (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen) и G418 (Invitrogen) в конечной концентрации 200 мг/л и поддерживали при 5% СО2 при 37°С.
HBsAg анализ.
HepG2.2.15 клетки (клеточная линия, постоянно экспрессирующая HBV) засевали в дупликатах в белые 96-луночные планшеты при 1,5x104 клеток/лунку. Клетки обрабатывали отдельными концентрациями олигомеров или сериями трехкратных серийных разведений соединений в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в каждой лунке составляла 1%, и ДМСО применяли в качестве контроля.
Кит для HBsAg хемилюминесцентного анализа (CLIA) (Autobio Diagnostics Co., Zhengzhou, China) применяли для полуколичественного измерения уровней секретируемых HBV-антигенов. Для детекции применяли 50 мкл/лунку супернатанта культуры, и процедуру проводили согласно инструкции производителя. Цитотоксичность измеряли при помощи CellTiter-Glo (Promega, Madison, Wl, USA, Cat# G7571). При помощи E-WorkBook Suite (ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK) получали кривые дозовой зависимости и экстраполировали значения IC50 и СС50.
IC50 и СС50 определяют как концентрацию соединения (или log разведения кондиционированной среды), при котором секреция и цитотоксичность (IC50) и (СС50), HBsAg соответственно снижены на 50% по сравнению с контролем. Данные могут быть представлены в виде значения ЕС50 для олигомера, в случае тестирования в диапазоне концентраций, или в качестве абсолютного уровня HBsAg в супернатанте в виде процента уровней HBsAg в контрольных образцах без лекарственного средства, в случае тестирования с единственной концентрацией.
Результаты обработки отдельными концентрациями.
Всего 290 олигомеров без конъюгата скринировали в анализе эффективности in vitro при помощи
- 129 034924 единственной дозы 25 мкМ олигомера. Секрецию HBV антигена (HBsAg) измеряли после 13 дней. Табл. 5 ниже показывает результаты скрининга. Олигомеры SEQ ID NO: 294 - SEQ ID NO: 318, все, снижали активность HBsAg до менее 40% от контроля. Олигомер SEQ ID NO: 584 соответствует олигомеру, раскрытому как SEQ ID NO: 16 в US 8598334.
Дополнительные 213 олигомеров скринировали в анализе эффективности in vitro при помощи единственной дозы 25 мкМ олигомера. Результаты приведены на фиг. 5а.
Таблица 5. Активность HBsAg при 25 мкМ олигомера как % контроля.
О Z Q 0 Ш ω Олигомеры, которые связывают как транскрипт HBsAg, так и НВх (SEQ ID NO 2) Олигомеры, которые связывают транскрипты HBsAg (SEQ ID NO 3), но не транскрипт НВх Старт-позиции олигомера U95551 (SEQ ID NO 1) _ LNA олигомерные последовательности (заглавные буквы - бета-Dокси LNA; С LNA представляет собой 5метил С LNA; прописные буквы - ДНК; тс - 5метилцитозин ДНК; все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи) Активность (HBsAg уровни в супернатант е культуры в виде процента клеток, обработанн ых ДМСО) Станд артное отклон ение
SeqID 294 X 691 G AAccactg аасААА 22,07 2,28
SeqID 295 X 691 CG Aaccactg аасААА 18,38 2,08
SeqID 296 X 692 CG Aaccactg ааСАА 10,28 0,83
SeqID 297 X 693 CG Aaccactg аАСА 14,74 1,99
SeqID 298 X 694 CG Aaccactg аАС 15,68 1,09
SeqID 299 X 126 4 CCGcagtatggaTCG 38,83 4,40
SeqID 300 X 126 5 CGCagtatggaTC 26,86 2,15
SeqID 301 X 153 0 GCGtaaagagaGGT 34,38 1,52
- 130 034924
SeqID 302 X 153 0 CGCgtaaagagaGGT 38,30 6,35
SeqID 303 X 153 1 GCGtaaagagaGG 37,42 3,29
SeqID 304 X 155 1 AGAaggcacagaCGG 25,28 1,62
SeqID 305 X 155 1 GAGaaggcacagaCGG 25,02 1,51
SeqID 306 X 157 7 GAAgtgcacaCGG 14,81 3,11
SeqID 307 X 157 7 GCGaagtgcacaCGG 21,88 2,55
SeqID 308 X 157 7 AGCgaagtgcacaCGG 16,33 2,31
SeqID 309 X 157 8 CGAagtgcacaCG 25,64 2,12
SeqID X 157 AGCgaagtgcacACG 23,45 1,99
310 8
SeqID 311 X 157 8 AAGmcgaagtgcacACG 31,48 2,85
SeqID 312 X 158 0 GAAgCgaagtgcACA 35,14 0,93
SeqID 313 X 158 2 GGTgaagCgaagtGCA 38,27 2,92
SeqID 314 X 158 3 GGTgaagCgaagTGC 30,58 4,73
SeqID 315 X 158 3 AGGtgaagmcgaagTGC 15,21 1,90
SeqID 316 X 158 4 AGGtg aag mcg aaGT G 13,27 0,84
SeqID 317 X 158 5 AGGtgaagmcgaAGT 13,29 0,75
SeqID 318 X 158 8 CAGaggtgaagCGA 32,61 2,06
SeqID 319 X 201 AAAacccCgccTGT 72,50 5,31
SeqID 320 X 202 AAAacccCgccTG 69,30 7,61
SeqID 321 X 245 ACGagtctagacTCT 99,91 3,04
SeqID 322 X 245 C ACg ag tctag acT CT 88,47 3,67
SeqID 323 X 246 ACGagtctagaCTC 96,60 5,49
SeqID 324 X 246 CACgagtctagaCTC 94,04 2,94
SeqID 325 X 246 CCACgagtctagaCT C 75,51 2,45
SeqID 326 X 247 ACGagtctagaCT 75,87 2,71
SeqID X 247 CACgagtctagACT 85,96 5,46
- 131 034924
327
SeqID 328 X 247 CCAmcgagtctagACT 65,26 8,04
SeqID 329 X 247 ACCamcg agtctag ACT 73,80 4,94
SeqID 330 SeqID 331 SeqID 332 SeqID 333 SeqID 334 SeqID 335 X X X X X X 248 248 248 248 248 249 ACgagtctagAC CACgagtctagAC CCAmcgagtctaGAC ACCamcgagtctaGAC CACcamcg agtctaG AC ACCamcgagtctAGA 92,49 83,99 72,31 69,87 74,68 78,52 5,72 4,30 5,85 4,09 5,33 3,55
SeqID 336 X 249 CACcamcg agtctAG A 78,82 0,55
SeqID 337 X 249 CCAccamcg agtctAG A 70,68 10,64
SeqID 338 X 250 CCAccamcg agtcTAG 72,06 4,76
SeqID 339 X 250 T CCaccamcgagtcTAG 96,44 19,49
SeqID 340 X 251 CCAccamcg agtCTA 62,36 3,29
SeqID 341 X 251 T CCaccamcgagtCTA 74,38 12,81
SeqID 342 X 251 GTCcaccamcgagtCTA 66,96 8,93
SeqID 343 X 252 TCCaccamcgagTCT 88,72 6,91
SeqID X 252 GT Ccaccamcg agT CT 81,54 3,34
344
SeqID 345 X 252 AGTccaccamcgagT CT 73,05 5,43
SeqID 346 X 253 GTCcaccamcgaGTC 86,41 4,93
SeqID 347 X 253 AGTccaccamcg aGTC 68,79 2,19
SeqID 348 X 253 AAGtccaccamcgaGT C 55,97 4,51
SeqID 349 X 254 AGTccaccamcgAGT 74,01 6,04
SeqID 350 X 254 AAGtccaccamcgAGT 64,64 2,31
SeqID 351 X 254 GAAgtccaccamcgAGT 71,86 2,47
SeqID 352 X 255 AAGtccaccamcgAG 74,30 9,08
- 132 034924
SeqID 353 X 255 GAAgtccaccamcgAG 72,50 1,71
SeqID 354 X 255 AGAagtccaccamcgAG 70,48 1,43
SeqID 355 X 256 AGAagtccaccaCGA 60,35 2,15
SeqID 356 X 256 GAGaagtccaccaCGA 50,28 3,88
SeqID 357 X 257 GAGaagtccaccACG 67,82 4,14
SeqID 358 X 257 AG Ag aagtccaccACG 67,76 2,44
SeqID 359 X 258 GAGagaagtccacCAC 62,90 3,23
SeqID 360 X 259 GAGagaagtccaCCA 74,92 3,15
SeqID X 259 TG Ag ag aag tccaCC A 73,90 3,92
361
SeqID 362 X 260 GAGagaagtccACC 87,37 7,72
SeqID 363 X 260 TGAgagaagtccACC 65,36 4,30
SeqID 364 X 261 TGAgagaagtcCAC 109,45 11,99
SeqID 365 X 384 AAAamcgcmcgcaGA 70,63 10,93
SeqID 366 X 384 TAAaamcgcmcgcAGA 76,98 11,99
SeqID 367 X 384 ATAaaamcgcmcgcAGA 67,24 7,92
SeqID 368 X 384 GATaaaamcgcmcgcAGA 35,91 1,17
SeqID 369 X 385 ATAaaamcgcmcgCAG 80,52 2,79
SeqID 370 X 385 GATaaaamcgcmcgCAG 57,46 3,54
SeqID 371 X 385 T GAtaaaamcgcmcgCAG 62,20 3,88
SeqID 372 X 386 ATAaaamcgcmcgCA 82,52 1,41
SeqID 373 X 386 GATaaaamcgcmcGCA 58,35 1,00
SeqID 374 X 386 T GAtaaaamcgcmcGCA 46,17 4,23
SeqID 375 X 386 AT GataaaamcgcmcGCA 42,47 2,86
SeqID 376 X 387 ATaaaamcgcmcGC 86,96 6,36
SeqID 377 X 387 GATaaaamcgcmcGC 61,13 4,90
SeqID X 387 T GAtaaaamcgcCGC 55,76 4,38
- 133 034924
378
SeqID 379 X 387 AT GataaaamcgcCGC 35,38 4,12
SeqID 380 X 388 GAtaaaamcgcCG 71,71 3,20
SeqID 381 SeqID 382 SeqID 383 SeqID 384 SeqID 385 SeqID 386 SeqID 387 SeqID 388 SeqID 389 SeqID 390 SeqID 391 SeqID 392 SeqID 393 SeqID 394 SeqID X X X X X X X X X X X X X X X 388 388 389 389 390 411 411 411 411 412 412 414 415 416 416 TGAtaaaamcgcCG AT GataaaamcgCCG TGataaaamcgCC ATGataaaamcgCC ATgataaaamcGC TAGcagcaggaTG ATAgcagcagg AT G CATagcagcagg AT G GCAtagcagcagg AT G GCAtagcagcagGAT GGCatagcagcagGAT GAGgcatagcagcAGG TG Ag g catag сад C AG T GAggcatagcaGCA AT GaggcatagcaGCA 56,48 64,46 87.42 53,02 103,50 47.43 59,29 52,52 40.12 33.12 34,61 57,92 44,07 59,87 57.12 9.26 2,93 18,65 0,62 4,41 1.27 9.28 5,05 5,45 2,79 1,30 6,48 1.35 0,84 5.36
395
SeqID 396 X 417 TGAggcatagcAGC 60,89 4,54
SeqID 397 X 417 AT GaggcatagcAGC 53,18 3,00
SeqID 398 X 417 G ATg ag gcatag cAG C 35,17 4,19
SeqID 399 X 418 GATgaggcatagCAG 51,50 4,39
SeqID 400 X 418 AG Atg agg catag CAG 30,80 2,00
SeqID 401 X 419 GATgaggcataGCA 56,86 2,93
SeqID 402 X 419 AGAtgaggcataGCA 26,45 3,15
SeqID 403 X 419 AAGatgaggcataGCA 42,05 1,52
- 134 034924
SeqID 404 X 422 AAGaagatgaggcATA 50,42 4,13
SeqID 405 X 423 AAGaagatgaggCAT 47,84 4,75
SeqID 406 X 601 TGGgatgggaatACA 127,91 11,95
SeqID 407 X 601 AT GggatgggaatACA 104,41 6,06
SeqID 408 X 602 TGGgatgggaaTAC 97,86 33,35
SeqID 409 X 602 ATGggatgggaaTAC 100,98 11,30
SeqID 410 X 602 GAT g gg atggg aaTAC 80,86 4,66
SeqID 411 X 603 ATGggatgggaATA 101,56 17,94
SeqID X 603 GATgggatgggaATA 95,71 10,78
412
SeqID 413 X 604 GATgggatgggAAT 136,89 7,88
SeqID 414 X 691 AACcactgaacAAA 56,01 3,86
SeqID 415 X 695 CGaaccactgAA 67,83 3,12
SeqID 416 X 708 GGGggaaagccCT 61,65 34,06
SeqID 417 X 708 TGGgggaaagcCCT 166,53 7,16
SeqID 418 X 1142 GCAamcggggtaaAGG 99,66 2,38
SeqID 419 X 1143 GCAamcggggtaAAG 128,31 18,17
SeqID 420 X 1144 GCAamcggggtaAA 142,61 5,42
SeqID 421 X 1176 AGCaaacacttgGCA 81,61 3,37
SeqID 422 X 1176 CAGcaaacacttgGCA 59,14 4,84
SeqID 423 X 1177 CAGcaaacacttGGC 47,64 0,61
SeqID 424 X 1177 TCAgcaaacacttGGC 28,43 2,09
SeqID 425 X 1178 TCAgcaaacactTGG 53,37 9,79
SeqID 426 X 126 4 GCAgtatggatCG 51,14 8,21
SeqID 427 X 126 4 CGCagtatggaTCG 45,10 12,21
SeqID 428 X 126 4 TCCgcagtatggaTCG 40,99 6,50
SeqID X 126 CCGcagtatggATC 144,18 11,10
- 135 034924
429 5
SeqID 430 X 126 5 TCCgcagtatggATC 74,40 9,23
SeqID 431 X 126 6 CGcagtatggAT 77,64 7,37
SeqID 432 SeqID 433 SeqID 434 SeqID 435 SeqID 436 SeqID 437 X X X X X X 126 6 126 6 126 7 126 9 153 0 153 0 CCGcagtatggAT TCCgcagtatgGAT TCCgcagtatgGA TTcmcgcagtaTG CGTaaagagagGT CCGmcgtaaagagaGGT 86,57 86,85 90,43 70,69 65,75 62,74 3,84 16.10 0,25 5.10 2,97 2,15
SeqID 438 X 153 1 CGtaaagagaGG 73,84 4,24
SeqID 439 X 153 1 CGCgtaaagagAGG 93,28 8,65
SeqID 440 X 153 1 CCGmcgtaaagagAGG 64,33 0,96
SeqID 441 X 153 2 CGCgtaaagagAG 92,93 7,76
SeqID 442 X 153 2 CCGmcgtaaagaGAG 46,68 2,09
SeqID 443 X 153 3 CGmcgtaaagaGA 96,70 11,51
SeqID 444 X 153 3 CCGmcgtaaagaGA 63,96 2,03
SeqID 445 X 153 4 CCgmcgtaaagAG 60,43 4,10
SeqID X 154 GGCacagamcgggGAG 105,39 4,49
446 7
SeqID 447 X 154 7 AGGcacag amcggg G AG 65,54 1,27
SeqID 448 X 154 8 GGCacagamcggGGA 114,17 2,09
SeqID 449 X 154 8 AGGcacagamcggGGA 63,67 1,22
SeqID 450 X 154 8 AAGgcacagamcggGGA 52,62 1,97
SeqID 451 X 154 9 AGGcacagamcgGGG 117,50 7,77
SeqID 452 X 154 9 AAGgcacagamcgGGG 105,77 3,94
SeqID 453 X 154 9 GAAggcacagamcgGGG 109,39 7,50
SeqID 454 X 155 0 AGAaggcacagarT1cGGG 60,92 7,17
- 136 034924
SeqID 455 X 155 2 GAGaaggcacagACG 43,34 2,63
SeqID 456 X 157 7 CGAagtgcacaCGG 35,27 4,48
SeqID 457 X 157 8 GCGaagtgcacACG 49,25 1,43
SeqID 458 X 157 9 GCGaagtgcacAC 65,82 7,11
SeqID 459 X 157 9 AGCgaagtgcaCAC 64,47 2,76
SeqID 460 X 157 9 AAGmcgaagtgcaCAC 42,82 5,42
SeqID 461 X 157 9 GAAgmcgaagtgcaCAC 37,15 4,92
SeqID 462 X 158 0 AGCgaagtgcaCA 59,26 7,36
SeqID X 158 AAGmcgaagtgcACA 56,58 1,80
463 0
SeqID 464 X 158 0 TGAagmcgaagtgcACA 58,81 5,72
SeqID 465 X 158 1 AAGmcgaagtgcAC 61,08 10,94
SeqID 466 X 158 1 GAAgmcgaagtgCAC 87,45 24,12
SeqID 467 X 158 1 T G Aag mcg aag tg CAC 70,27 2,31
SeqID 468 X 158 1 GTGaagmcgaagtgCAC 91,50 6,40
SeqID 469 X 158 2 AAgmcgaagtgCA 75,07 12,27
SeqID 470 X 158 2 GAAgmcgaagtgCA 52,66 2,00
SeqID 471 X 158 2 TGAagmcgaagtGCA 55,33 5,23
SeqID 472 X 158 2 GTGaagmcgaagtGCA 45,56 1,33
SeqID 473 X 158 3 TGAagmcgaagtGC 47,33 2,27
SeqID 474 X 158 3 GTGaagmcgaagTGC 48,90 0,54
SeqID 475 X 158 4 GTGaagmcgaagTG 44,41 3,30
SeqID 476 X 158 4 GGTgaagmcgaaGTG 39,79 2,48
SeqID 477 X 158 4 GAGgtgaagmcgaaGTG 45,00 0,65
SeqID 478 X 158 5 GTgaagmcgaaGT 62,45 5,15
SeqID 479 X 158 5 GGTgaagmcgaaGT 43,08 2,85
SeqID X 158 GAGgtgaagmcgaAGT 55,57 2,43
- 137 034924
480 5
SeqID 481 X 158 5 AG Ag g tg aag mcg aAGT 39,17 2,82
SeqID 482 X 158 6 AG Aggtg aag mcg AAG 41,25 0,88
SeqID 483 X 158 6 CAGaggtgaagmcgAAG 53,21 3,02
SeqID 484 X 158 7 AGAggtgaagmcGAA 38,81 4,56
SeqID 485 X 158 7 CAGaggtgaagmcGAA 42,07 2,56
SeqID 486 X 158 7 GCAgaggtgaagmcGAA 56,89 8,91
SeqID 487 X 158 8 GCAgaggtgaagCGA 53,71 4,36
SeqID 488 X 158 8 TGCagaggtgaagCGA 70,80 5,16
SeqID 489 X 158 9 TGCagaggtgaaGCG 92,30 7,94
SeqID 490 X 158 9 GTGcagaggtgaaGCG 70,51 10,18
SeqID 491 X 159 0 CGTgcagaggtgaAGC 130,05 13,54
SeqID 492 X 159 1 CGTgcagaggtgAAG 91,47 26,28
SeqID 493 X 159 1 ACGtgcagaggtgAAG 90,23 8,21
SeqID 494 X 159 2 CGTgcagaggtGAA 64,85 22,74
SeqID 495 X 159 2 ACGtgcagaggtGAA 58,06 4,58
SeqID 496 X 159 3 CGTgcagaggtGA 81,44 11,66
SeqID X 159 ACGtgcagaggTGA 50,58 6,38
497 3
SeqID 498 X 161 6 CGTtcamcggtgGT 54,29 3,89
SeqID 499 X 169 0 CTCaaggtmcggTC 68,75 3,36
SeqID 500 X 169 1 CCTcaaggtmcgGT 110,10 6,42
SeqID 501 X 169 1 GCCtcaaggtmcGGT 94,30 7,43
SeqID 502 X 170 6 ACAgtctttgaaGTA 90,33 13,01
SeqID 503 X 178 3 TTTatgcctacAG 98,15 8,26
SeqID 504 X 178 4 AATttatgcctACA 115,05 4,58
SeqID 505 X 178 5 AATttatgcctAC 126,86 2,63
- 138 034924
CCAatttatgcCT
SeqID
SeqID
GCTtggaggcttGAA
SeqID
AGCttggaggcttGAA
133,58
SeqID
GCTtggaggctTGA
79,26
SeqID
AGCttggaggctTGA
122,38
CAGcttggaggctTGA
SeqID
132,43
SeqID
GCTtggaggctTG
SeqID
AGCttggaggcTTG
SeqID
CAGcttggaggcTTG
ACAgcttggaggcTTG
SeqID
SeqID
CACagcttg g agg CTT
CACagcttggagGCT
SeqID
123,68
GCAcagcttggagGCT
SeqID
145,75
SeqID
GCAcagcttggaGGC
146,57
SeqID
GGCacagcttggaGGC
SeqID
AGGcacagcttggAGG
126,44
SeqID
AGGcacagcttgGAG
AAGgcacagcttgGAG
AAGgcacagcttGGA
CAAggcacagcttGGA
AAGgcacagctTGG
CAAggcacagctT GG
108,76
CCAaggcacagctT GG
111,82
CAAggcacagcTTG
111,24
CCAaggcacagcTT G
SeqID
CCAaggcacagCTT
93,54
SeqID
523
SeqID
524
SeqID
525
SeqID
529
SeqID
530
111,03
SeqID
526
SeqID
527
SeqID
528
9,51
- 139 034924
531 6
SeqID 532 X 227 2 TGCgaatccacAC 111,18 2,58
SeqID 533 X 227 2 GTGmcgaatccaCAC 116,70 3,36
SeqID 534 X 237 0 GGAgttcttcttCTA 117,09 3,11
SeqID 535 X 237 0 GGGagttcttcttCTA 138,82 2,94
SeqID 536 X 237 1 GGGagttcttctTCT 112,95 5,88
SeqID 537 X 237 1 AGGgagttcttctTCT 115,73 2,39
SeqID 538 X 237 2 AGGgagttcttcTTC 115,60 13,69
SeqID 539 X 237 2 GAGggagttcttcTTC 160,52 12,84
SeqID 540 X 237 3 AGGgagttcttCTT 187,99 14,17
SeqID 541 X 237 3 GAGggagttcttCTT 152,23 3,57
SeqID 542 X 237 3 CGAgggagttcttCTT 125,29 10,56
SeqID 543 X 237 4 CGAgggagttctTCT 125,58 12,12
SeqID 544 X 237 4 GCGagggagttctTCT 127,13 7,13
SeqID 545 X 237 5 GCGagggagttcTTC 140,39 2,94
SeqID 546 X 237 5 GGCgagggagttcTT C 103,21 15,13
SeqID 547 X 237 6 GCGagggagttCTT 104,72 31,01
SeqID X 237 GGCgagggagttCTT 120,43 4,29
548 6
SeqID 549 X 237 6 AGGmcgagggagttCTT 126,12 8,49
SeqID 550 X 237 7 GCGagggagttCT 99,63 21,49
SeqID 551 X 237 7 GGCgagggagtTCT 126,46 5,07
SeqID 552 X 237 7 AGGmcgagggagtTCT 124,41 7,46
SeqID 553 X 237 7 GAGgmcgagggagtTCT 122,05 4,13
SeqID 554 X 237 8 GGCgagggagtTC 93,75 32,13
SeqID 555 X 237 8 AGGmcgagggagTTC 97,91 10,99
SeqID 556 X 237 8 GAGgmcgagggagTT C 125,97 14,10
- 140 034924
SeqID 557 X 237 8 CGAggmcgagggagTTC 114,85 11,32
SeqID 558 X 237 9 AGGmcgagggagTT 161,79 17,40
SeqID 559 X 237 9 GAGgmcgagggaGTT 112,49 14,53
SeqID 560 X 237 9 CGAggmcgagggaGTT 99,73 6,03
SeqID 561 X 237 9 GCGaggmcgagggaGTT 26,82 16,61
SeqID 562 X 238 0 GAGgmcgagggaGT 126,11 10,60
SeqID 563 X 238 0 CGAggmcgagggAGT 113,92 2,48
SeqID 564 X 238 0 GCGaggmcgagggAGT 114,21 22,83
SeqID X 238 TGCgaggmcgagggAGT 120,75 7,83
565 0
SeqID 566 X 238 1 CGAggmcgagggAG 96,48 7,91
SeqID 567 X 238 1 GCGaggmcgaggGAG 111,38 23,08
SeqID 568 X 238 1 TGCgaggmcgaggGAG 150,61 9,91
SeqID 569 X 238 1 CTGmcgaggmcgaggGAG 115,39 3,45
SeqID 570 X 238 2 CGaggmcgaggGA 94,94 9,74
SeqID 571 X 238 2 GCGaggmcgaggGA 107,97 15,32
SeqID 572 X 238 2 TGCgaggmcgagGGA 90,20 10,52
SeqID 573 X 238 2 CTGmcgaggmcgagGGA 117,46 22,79
SeqID 574 X 238 2 TCTgmcgaggmcgagGGA 119,40 1,22
SeqID 575 X 238 3 TCTg mcgaggmcgaGGG 139,98 6,20
SeqID 576 X 238 3 GTCtgmcgaggmcgaGGG 17,32 7,04
SeqID 577 X 282 4 GTTcccaagaaTAT 121,37 5,20
SeqID 578 X 282 4 TGTtcccaagaaTAT 119,62 5,98
SeqID 579 X 282 5 GTTcccaagaaTA 118,81 12,04
SeqID 580 X 282 5 TGTtcccaagaATA 119,14 20,21
SeqID 581 X 282 5 TTGttcccaagaATA 109,70 3,36
SeqID X 282 TGTtcccaagaAT 110,02 17,04
- 141 034924
582 6
SeqID 583 X 282 6 TTGttcccaagAAT 132,22 4,26
SeqID 584 X 414 GAGGcatagcagCAGG 79,64 10,52
Таблица 5 а. Активность HBsAg 25 мкМ олигомера в виде % контроля.
SEQ ID NO Стартпозиция олигомер a U95551 (SEQ ID NO 1) LNA олигомерные последовательности (заглавные буквы - бета-О-окси LNA; С LNA представляет сбой 5метил С LNA; прописные буквы ДНК; тс - 5-метилцитозин ДНК; все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи) Активность (HBsAg уровни в супернатанте культуры в виде процента клеток, обработанных ДМСО) Стандар тное отклоне ние
585 691 G AAccactg aaC AAA 31,9 2,6
586 691 G AACcactg aacAAA 35,1 1,3
587 691 CGaaccactgaaCAAA 45,5 2,4
588 691 CG AAccactg aacAAA 18,3 2,2
589 691 CG Aaccactg aaCAAA 36,2 9,1
590 691 CG AAccactg aacaAA 22,4 1,6
591 691 CG AAccactg aaCAAA 26,3 2,3
592 692 CG AAccactg aacAA 11,8 1,2
593 692 CGAAccactgaaCAA 21,9 8,5
594 692 CG Aaccactg aACAA 18,3 0,6
595 693 CGaaccactgAACA 25,8 1,6
596 693 CGAAccactgaaCA 9,5 1,5
597 693 CGAaccactgAACA 23,6 2,0
598 693 CGAAccactgaACA 14,6 0,9
599 694 CGaaccactgAAC 42,1 3,8
600 694 CGAaccactgAAC 25,0 1,7
601 1264 CCgcagtatggATCG 98,7 16,4
602 1264 CCGCagtatggatCG 62,0 2,0
603 1264 CCGCagtatggaTCG 79,6 21,3
604 1264 CCGcagtatggAT CG 113,3 12,3
605 1265 CGCAgtatggaTC 43,0 5,9
606 1265 CGcagtatggATC 97,7 22,6
607 1265 CGCagtatggATC 80,1 21,3
608 1265 CGcagtatgGATC 110,0 11,2
609 1530 GCGTaaagagagGT 65,2 6,6
610 1530 GCgtaaagagAGGT 43,4 6,1
- 142 034924
611 1530 GCGtaaagagAGGT 59,9 5,8
612 1530 GCGTaaagagaGGT 52,7 1,9
613 1530 CGCGtaaagagagGT 96,7 9,7
614 1530 CGmcgtaaagagAGGT 35,9 1,1
615 1530 CGCGtaaagagaGGT 63,1 3,9
616 1530 CGCgtaaagagAGGT 65,0 4,6
617 1531 GCgtaaagagAGG 24,6 1,5
618 1531 GCGtaaagagAGG 32,2 1,3
619 1531 GCgtaaagaGAGG 54,7 4,7
620 1531 GCGTaaagagaGG 59,0 0,4
621 1551 AGaaggcacagACGG 41,2 4,2
622 1551 AGAaggcacagACGG 45,4 10,9
623 1551 AGAAggcacagaCGG 38,3 4,0
624 1551 GAGAaggcacagaCGG 35,0 11,1
625 1551 GAGaaggcacagACGG 50,3 10,2
626 1551 GAGAaggcacagACGG 48,1 2,1
627 1577 GAagtgcacaCGG 21,5 2,1
628 1577 GAAgtgcacaCGG 23,7 1,4
629 1577 GAAGtgcacaCGG 41,2 1,3
630 1577 GAAgtgcacACGG 29,3 1,3
631 1577 G Cg aag tg cacaCG G 54,0 19,6
632 1577 GCGaagtgcacamcGG 49,7 10,7
633 1577 GCGAagtgcacamcGG 30,3 5,2
634 1577 GCgaagtgcacACGG 46,9 7,3
635 1577 AGCGaagtgcacamcGG 47,5 10,3
636 1577 AGmcgaagtgcacACGG 38,1 4,2
637 1577 AGmcgaagtgcacaCGG 83,2 37,3
638 1577 AGCgaagtgcacamcGG 43,1 17,7
639 1578 CGaagtgcaCACG 58,3 6,9
640 1578 CGAagtgcacACG 30,9 2,7
641 1578 CGaagtgcacACG 45,4 2,1
642 1578 AGCgaagtgcaCACG 128,1 7,6
643 1578 AGCGaagtgcacACG 49,6 5,3
644 1578 AGCGaagtgcacaCG 47,4 5,3
645 1578 AGmcgaagtgcaCACG 59,1 3,5
646 1578 AAgmcgaagtgcaCACG 91,7 20,2
647 1578 AAG Cg aag tg cacaCG 49,5 3,0
648 1578 AAGmcgaagtgcaCACG 63,2 1,9
649 1578 AAGCgaagtgcacACG 41,9 2,1
650 1578 AAGCgaagtgcaCACG 64,7 4,5
651 1580 G Aag mcg aag tg C AC A 142,9 18,3
652 1580 GAAGmcgaagtgcaCA 61,5 4,1
653 1580 G AAg mcg aag tg C AC A 152,1 21,8
654 1580 G AAG mcg aag tg C AC A 167,2 17,5
655 1582 GGtgaagmcgaagtGCA 117,8 18,0
656 1582 GGTgaagmcgaagtgCA 108,0 10,4
657 1582 GGTGaagmcgaagtgCA 93,5 24,7
658 1582 GGtgaagmcgaagT GCA 125,1 18,6
659 1583 GGtgaagmcgaagT GC 109,4 18,5
660 1583 GGTgaagmcgaagtGC 104,1 14,0
- 143 034924
661 1583 GGTGaagmcgaagtGC 84,4 23,1
662 1583 GGtgaagmcgaaGTGC 60,1 9,7
663 1583 AGgtgaagmcgaagTGC 48,4 5,5
664 1583 AGGtgaagmcgaagtGC 42,3 3,7
665 1583 AGGTgaagmcgaagtGC 71,6 12,3
666 1583 AGgtgaagmcgaaGTGC 50,7 10,7
667 1584 AGGTgaagmcgaagTG 47,7 44,6
668 1584 AGg tg aag mcg aAGTG 27,7 2,1
669 1584 AGGtgaagmcgaAGTG 15,7 2,1
670 1584 AGGTgaagmcgaaGTG 58,8 49,5
671 1585 AGGTgaagmcgaaGT 118,2 14,8
672 1585 AGgtgaagmcgAAGT 31,5 38,6
673 1585 AG Gtg aag mcg AAGT 25,8 4,4
674 1585 AGGTgaagmcgaAGT 48,2 37,8
675 1588 CAGAggtgaagmcGA 52,4 4,6
676 1588 CAgaggtgaaGCGA 67,4 0,1
677 1588 CAGaggtgaaGCGA 79,0 9,4
678 670 TAGtaaactgagCCA 31,3 2,7
679 670 TAgtaaactgaGCCA 93,0 12,1
680 670 TAGTaaactgagcCA 15,8 2,4
681 670 TAGtaaactgaGCCA 66,9 6,6
682 670 TAGTaaactgagCCA 26,6 4,9
683 670 CTAgtaaactgagCCA 101,6 6,7
684 670 CTagtaaactgaGCCA 158,0 11,6
685 670 CTAGtaaactgagcCA 102,4 34,7
686 671 CTAgtaaactgaGCC 76,3 32,9
687 671 CTagtaaactgAGCC 53,0 13,8
688 671 CTAGtaaactgagCC 41,9 5,1
689 671 CTagtaaactgaGCC 31,8 2,2
690 671 CTAgtaaactgagCC 102,9 10,2
691 674 GCActagtaaacT GA 53,6 4,8
692 674 GCactagtaaaCTGA 74,4 1,5
693 674 GCACtagtaaactGA 81,9 10,6
694 674 GCActagtaaaCTGA 54,5 1,5
695 674 GCACtagtaaacTGA 74,9 4,5
696 674 GGCactagtaaacT GA 42,8 60,5
697 674 GGcactagtaaaCT GA 47,1 38,9
698 674 GGCActagtaaactGA 147,7 7,1
699 1141 CAAmcggggtaaaGGT 187,2 5,6
700 1141 CAamcggggtaaAGGT 176,2 18,0
701 1141 CAACggggtaaagGT 187,9 3,8
702 1141 CAAmcggggtaaAGGT 142,7 19,7
703 1141 CAACggggtaaaGGT 144,8 31,8
704 1261 CAGtatggatmcgGCA 59,6 19,9
705 1261 CAgtatggatmcGGCA 54,3 4,1
706 1261 CAgtatggatmcgGCA 70,0 8,6
707 1261 CAGtatggatmcggCA 60,3 8,0
708 1265 TT CmcgcagtatggAT C 110,7 2,0
709 1265 TTcmcgcagtatgGAT C 105,5 4,2
710 1265 TTCCgcagtatggaTC 104,1 6,7
- 144 034924
711 1265 TTCmcgcagtatgGATC 107,1 8,8
712 1265 TTCCgcagtatggATC 119,0 9,6
713 1266 TTCmcgcagtatgGAT 99,8 6,8
714 1266 TTcmcgcagtatGGAT 92,3 5,1
715 1266 TTCCgcagtatggAT 104,7 3,6
716 1266 TTCmcgcagtatGGAT 108,7 3,8
717 1266 TTCCgcagtatgGAT 112,0 2,1
718 1266 GTTcmcgcagtatgGAT 85,5 4,5
719 1266 GTtcmcgcagtatGGAT 80,0 6,7
720 1266 GTT Cmcgcagtatgg AT 127,9 16,9
721 1267 GTtcmcgcagtaT GG A 67,2 5,0
722 1267 GTTCmcgcagtatgGA 150,8 5,9
723 1267 GTtcmcgcagtatGGA 78,6 8,0
724 1267 GTTcmcgcagtatgGA 76,5 7,9
725 1267 AGTtcmcgcagtatGGA 72,6 5,2
726 1267 AGTTcmcgcagtatgGA 87,1 5,6
727 1267 AGttcmcgcagtatGGA 83,1 4,3
728 1267 AGTtcmcgcag tatg GA 79,4 5,6
729 1267 AGttcmcgcagtatgGA 89,9 2,0
730 1268 AGTtcmcgcagtaTGG 51,2 4,0
731 1268 AGttcmcgcagtaT GG 63,6 0,5
732 1268 AGTtcmcgcagtatGG 65,9 1,6
733 1268 AGttcmcgcagtatGG 80,9 2,5
734 1268 GAgttcmcgcagtaT GG 49,2 4,7
735 1268 GAGttcmcgcagtatGG 60,1 6,1
736 1268 GAgttcmcgcagtatGG 73,9 1,1
737 1269 GAGTtcmcgcagtaT G 58,6 6,6
738 1269 GAgttcmcgcagtAT G 57,1 8,1
739 1269 GAGttcmcgcagtaTG 49,8 6,8
740 1269 GAgttcmcgcagtaTG 60,8 1,6
741 1269 GGAGttcmcgcagtaT G 137,3 2,6
742 1269 GGagttcmcgcagtAT G 90,5 22,8
743 1269 GGAgttcmcgcagtaT G 117,5 2,4
744 1269 GGagttcmcgcagtaTG 124,7 6,4
745 1525 TAAagagaggtgmcGCC 71,3 60,7
746 1525 TAaagagaggtgCGCC 73,9 59,0
747 1525 TAAAgagaggtgmcgCC 79,5 45,6
748 1525 TAAag ag agg tg CG CC 93,6 4,6
749 1525 TAAAgagaggtgmcGCC 28,0 22,3
750 1526 TAAagagaggtgCGC 96,3 22,2
751 1526 TAaagagaggtGCGC 101,9 73,2
752 1526 TAAagagaggtGCGC 44,3 72,6
753 1526 TAAAgagaggtgCGC 64,1 50,8
754 1526 GTAaagagaggtgCGC 27,0 47,8
755 1526 GTaaagagaggtGCGC 65,6 58,8
756 1527 GTAaagagaggtGCG 23,6 42,9
757 1527 GTaaagagaggTGCG 80,5 2,4
758 1527 GTAaagagaggTGCG 81,8 61,8
759 1527 GTAAagagaggtGCG 31,5 35,2
760 1527 CGtaaagagaggTGCG 91,5 62,5
- 145 034924
761 1527 CGTAaagagaggtgCG 70,5 60,0
762 1527 CGTaaagagaggT GCG 79,6 60,1
763 1527 CGTAaagagaggtGCG 4,5 4,1
764 1528 CGTaaagagaggT GC 37,0 55,1
765 1528 CGtaaagagagGTGC 89,4 17,7
766 1528 CGTAaagagaggtGC 93,3 17,1
767 1528 CGTaaagagagGTGC 63,4 4,2
768 1528 CGTAaagagaggTGC 34,1 51,7
769 1528 GCGtaaagagaggTGC 50,5 83,8
770 1528 GCgtaaagagagGTGC 43,6 73,2
771 1528 GCgtaaagagaggTGC 31,3 53,0
772 1528 GCGtaaagagaggtGC 43,9 69,9
773 1529 GCGtaaagagagGTG 53,2 67,4
774 1529 GCgtaaagagaGGTG 2,9 3,1
775 1529 GCGTaaagagaggTG 44,0 32,8
776 1529 GCGtaaagagaGGT G 8,8 4,3
777 1529 GCGTaaagagagGTG -0,6 0,6
778 1529 CG Cg taaag ag ag GTG 43,2 40,7
779 1529 mcg mcgtaaag ag aGGTG 8,3 5,3
780 1529 CGCGtaaagagaggTG 37,6 40,0
781 1529 CGCgtaaagagaGGT G 33,5 40,4
782 1529 CGCGtaaagagagGT G 33,5 54,0
783 1552 TGAgaaggcacagACG 95,2 5,5
784 1552 TGagaaggcacaGACG 54,4 48,4
785 1552 TGAGaaggcacagaCG 67,2 6,3
786 1552 TGAgaaggcacaGACG 49,4 43,8
787 1552 T GAGaaggcacag ACG 56,1 9,5
788 1690 GCctcaaggtmcgGT C 78,8 70,1
789 1690 GCCtcaaggtmcggT C 21,6 40,1
790 1690 GCctcaaggtmcggTC 46,7 74,2
791 1778 AT gcctacagccT CC 51,8 1,4
792 1778 ATGcctacagcctCC 51,1 2,2
793 1778 ATgcctacagcctCC 59,4 7,0
794 1785 ACCAatttatgcCTAC 145,3 4,8
795 1785 ACCaatttatgcCTAC 138,6 10,2
796 1785 ACCAatttatgccTAC 137,4 0,4
797 1785 ACCaatttatgcCTAC 131,3 9,2
798 1785 ACcaatttatgcCTAC 126,0 8,7
Результаты обработки множеством концентраций.
Набор олигонуклеотидов из таблицы 5 тестировали при помощи трехкратных серийных разведений (25,000, 8,3333, 2,7778, 0,9259, 0,0343, 0,0114, 0,0038, 0,0013 мкМ олигомера) в анализе эффективности in vitro для оценки значений IC50 и СС50 для олигомеров. Секрецию антигена HBV (HBsAg) измеряли спустя 13 дней. В табл. 6 ниже представлены результаты анализа. Олигомер SEQ ID NO: 585 соответствует олигомеру, раскрытому как SEQ ID NO: 16 в US 8598334.
- 146 034924
Таблица 6
SEQ ID NO IC50 (mkM) CC50 (mkM)
SeqID 294 2,07 >25
SeqID 295 2,05 >25
SeqID 296 1,72 <0,0013
SeqID 297 0,45 >25
SeqID 298 0,44 >25
SeqID 300 0,54 >25
SeqID 301 0,96 >25
SeqID 303 2,57 >25
SeqID 304 1,70 <0,0013
SeqID 305 2,05 >25
SeqID 306 1,18 >25
SeqID 307 0,68 >25
SeqID 308 2,62 >25
SeqID 309 2,15 >25
SeqID 310 2,04 >25
SeqID 311 9,75 >25
SeqID 315 1,12 >25
SeqID 316 1,13 >25
SeqID 317 0,80 >25
SeqID 318 5,27 >25
SeqID 368 >25 <0,0013
SeqID 386 12,32 >25
SeqID 389 23,43 >25
SeqID 390 2,57 >25
SeqID 391 5,91 >25
SeqID 393 3,08 >25
SeqID 398 19,84 >25
SeqID 400 3,07 >25
SeqID 402 2,00 >25
SeqID 424 2,43 >25
SeqID 427 0,61 >25
SeqID 442 2,24 >25
SeqID 456 0,78 >25
SeqID 457 6,05 >25
SeqID 473 3,91 >25
SeqID 474 4,67 >25
SeqID 475 6,15 >25
SeqID 476 3,82 >25
SeqID 479 5,88 >25
SeqID 481 6,63 >25
SeqID 482 10,10 >25
SeqID 484 17,04 >25
SeqID 485 4,34 >25
SeqID 584 >25 >25
- 147 034924
Пример 3.
In vivo мышиная модель AAV/HBV.
Анти-HBV LNA могут быть оценены в мышиной модели AAV/HBV. В данной модели мышь, инфицированная рекомбинантным аденоассоциированным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), поддерживает стабильную виремию и антигенемию в течение более чем 30 недель (Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology, 11, 71-78).
Самцов мышей C57BL/6 (4-6 недельных), свободных от специфичного патогена, закупали у SLAC (Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences) и держали в условиях уходя за животными в отдельных вентилируемых клетках. Следовали рекомендациям по содержанию и использованию животных, указанным WuXi IACUC (Комитет по содержанию и использованию лабораторных животных, WUXI IACUC протокол номер Р20131126-мышь). Мышам позволяли адаптироваться к новым условиям среды в течение 3 дней и затем разделяли на группы согласно дизайну эксперимента.
Рекомбинантный AAV-HBV разводили в PBS, 200 мкл на инъекцию. Данный рекомбинантный вирус содержит 1, 3 копии генома HBV (генотип D, серотип ayw).
На день 0 всем мышам инъецировали в хвостовую вену 200 мкл AAV-HBV. На день 6, 13 и 20 после инъекции AAV у всех мышей субмандибулярно брали кровь (0,1 мл крови/мышь) для сбора сыворотки. На день 22 после инфекции мыши со стабильной виремией получали носитель или анти-HBV LNA внутривенно в дозе 5 мг/кг. Олигомеры LNA могут быть неконъюгированными или GalNAc конъюгированными.
Мыши получали дозу дважды в неделю в течение двух недель. На день 3, 7, 10 и 14 после первого дозирования LNA у всех мышей субмандибулярно брали кровь (0,1 мл крови/мышь) для сбора сыворотки и мониторирования HBV поверхностного антигена (HBsAg), HBV e антигена (HBeAg) и геномной ДНК HBV в сыворотке.
Пример 4.
In vivo исследование при инъекциях дважды в неделю одной и той же дозой.
Мышиную модель AAV/HBV, как показано в примере 3, применяли в данном исследовании. Тестировали десять GalNAc конъюгированных анти-HBV LNA олигомеров с солевым раствором в качестве контроля в мышах C57BL/6 со стабильной виремией. Некоторые из олигомеров сравнивали со стандартом лечения нуклеозидным аналогом, Энтекавиром (ETV), вводимым как предписано ежедневно в дозе 0,03 мг/кг орально.
Мышам инъецировали дозу дважды в неделю подкожно в течение двух недель на день 0, 3, 7 и 10 или день 0, 3, 6 и 9 в дозе 2 мг/кг. HBV поверхностный антиген (HBsAg), HBVe антиген (HBeAg) и геномную ДНК HBV в сыворотке измеряли в указанные дни при помощи способов, описанных в разделе Материалы и методы. Мышей наблюдали в течение 23-24 дней.
Результаты приведены в табл. 7А-С.
Таблица 7А-С. Сывороточный уровень HBsAg (log10 (МЕ/мл)) при дозе 2 мг/кг дважды в неделю. Данные трех независимых экспериментов.
А Солевой раствор SEQ ID NO 806 SEQ ID NO 807 SEQ ID NO 815 SEQ ID NO 800 SEQ ID NO 802 ETV
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
день С.о. С.о. C.o. C.o. C.o. C.o. C.o.
0 4,23 0,53 4,79 0,04 4,68 0,04 4,06 0,76 4,73 0,01 4,07 0,37 4,49 0,24
3 4,05 0,40 4,48 0,16 4,00 0,12 3,48 0,83 4,08 0,14 3,89 0,24 4,37 0,30
7 4,26 0,22 4,17 0,13 3,37 0,20 2,68 0,71 3,23 0,23 3,57 0,52 4,33 0,33
10 4,38 0,17 4,09 0,14 3,12 0,17 2,60 0,61 2,90 0,30 3,66 0,53 4,43 0,25
14 4,37 0,20 3,86 0,33 2,82 0,21 2,69 0,45 2,67 0,38 3,52 0,52 4,53 0,22
17 4,47 0,12 4,10 0,23 3,03 0,20 2,91 0,36 2,20 0,84 3,62 0,49 3,71 1,52
21 4,55 0,12 4,21 0,22 3,37 0,20 3,36 0,44 2,92 0,24 3,72 0,50 4,64 0,11
24 4,57 0,11 4,36 0,20 3,67 0,08 3,91 0,34 3,21 0,25 4,06 0,32 4,72 0,15
С.о. - стандартное отклонение.
- 148 034924
в Солевой раствор SEQ ID NO 808 SEQ ID NO 814 SEQ ID NO 826 SEQ ID NO 825
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
день С.о. С.о. C.o. C.o. C.o.
0 4,68 0,10 4,64 0,05 4,67 0,07 4,00 0,43 4,50 0,09
3 4,40 0,12 3,99 0,09 3,64 0,16 3,21 0,90 3,44 0,05
6 4,49 0,09 3,56 0,07 2,78 0,20 2,62 1,03 2,59 0,13
9 4,50 0,07 3,24 0,07 2,36 0,16 2,32 1,00 2,16 0,20
13 4,71 0,07 3,16 0,14 2,29 0,15 2,21 1,03 2,03 0,22
16 4,58 0,05 3,10 0,15 2,64 0,08 2,37 1,05 2,27 0,21
20 4,71 0,03 3,37 0,21 3,05 0,14 2,45 1,18 2,47 0,33
23 4,62 0,08 3,47 0,23 3,36 0,12 2,68 1,24 2,54 0,62
C Солевой раствор SEQ ID 824
HBsAg HBsAg
день C.o. C.o.
0 4,49 0,13 4,67 0,03
3 4,62 0,13 4,14 0,06
6 4,50 0,14 3,00 0,13
9 4,45 0,21 2,35 0,15
13 4,36 0,38 2,19 0,25
16 4,20 0,66 2,45 0,20
20 4,46 0,09 3,45 0,22
23 3,97 1,05 2,42 0,18
Исходя из этих данных может быть сделан вывод, что in vivo все GalNAc конъюгированные антиHBV антисмысловые олигомеры способны снижать уровни HBV s антигена (HBsAg) до уровня, меньшего, чем солевой раствор и стандарт лечения. В частности, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826 демонстрировали значительное снижение сывороточных уровней HBsAg.
Таблица 8А-С. Сывороточный уровень HBeAg (logo (ТЕ/мл)) при дозе 2 мг/кг дважды в неделю.
A Солевой раствор SEQ ID NO 806 SEQ ID NO 807 SEQ ID N0 815 SEQ ID NO 800 SEQ ID NO 802 ETV
HBeAg HBeAg HBeAg HBeAg HBeAg HBeAg HBeAg
день C.o. C.o. C.o. C.o. C.o. C.o. C.o.
0 3,63 0,05 3,66 0,05 3,62 0,03 3,65 0,04 3,63 0,03 3,63 0,03 3,59 0,05
3 3,54 0,04 3,21 0,06 2,91 0,05 3,04 0,05 2,65 0,03 3,43 0,04 3,62 0,03
7 3,61 0,08 3,00 0,05 2,41 0,14 2,54 0,13 2,19 0,05 3,37 0,03 3,64 0,02
10 3,63 0,05 2,21 1,05 2,21 0,11 2,35 0,93 1,96 0,05 2,29 0,91 3,67 0,02
14 3,63 0,04 2,69 0,34 2,09 0,10 2,95 0,29 1,98 0,10 2,96 0,33 3,67 0,03
17 3,66 0,06 2,90 0,24 2,27 0,10 2,84 0,30 1,73 0,54 2,83 0,25 2,96 1,20
21 3,67 0,04 3,05 0,08 2,45 0,09 2,82 0,10 2,07 0,20 3,33 0,03 3,68 0,01
24 3,70 0,07 3,27 0,03 2,66 0,06 3,12 0,06 2,29 0,03 3,40 0,02 3,74 0,04
- 149 034924
В Солевой раствор SEQ ID NO 808 SEQ ID NO 814 SEQ ID NO 826 SEQ ID NO 825
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
день С.о. С.о. С.о. С.о. С.о.
0 3,72 0,08 3,63 0,03 3,56 0,03 3,32 0,17 3,51 0,12
3 3,43 0,06 2,74 0,03 2,48 0,08 2,82 0,18 2,31 0,07
6 3,44 0,02 2,35 0,06 1,98 0,07 2,43 0,16 1,94 0,06
9 3,36 0,02 2,03 0,11 1,84 0,07 2,22 0,11 1,76 0,05
13 3,72 0,05 2,25 0,08 1,96 0,03 2,23 0,09 1,95 0,08
16 3,66 0,10 2,32 0,06 2,08 0,04 2,45 0,15 1,98 0,08
20 3,74 0,01 2,58 0,04 2,36 0,05 2,67 0,18 2,21 0,11
23 3,65 0,05 2,60 0,07 2,52 0,08 2,82 0,10 2,33 0,11
С Солевой раствор НВеАд SEQ ID NO 824 НВеАд
день С.о. С.о.
0 3,75 0,02 3,74 0,02
3 3,52 0,09 2,35 0,07
6 3,45 0,06 1,89 0,03
9 3,60 0,06 1,94 0,04
13 3,58 0,10 1,58 0,04
16 3,58 0,15 1,64 0,04
20 3,48 0,13 2,69 0,05
23 3,59 0,12 1,75 0,02
Исходя из этих данных, можно сделать вывод о том, что in vivo все GalNAc конъюгированные антиHBV антисмысловые олигомеры способны снижать сывороточные уровни HBeAg до уровня меньшего, чем солевой раствор или стандарт лечения. В частности, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826 продемонстрировали значительное снижение сывороточных уровней HBeAg.
Таблица 9А-С. Сывороточный уровень ДНК HBV (log10 число копий) при дозе 2 мг/кг дважды в не делю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 806 SEQ ID NO 807 SEQ ID NO 815 SEQ ID NO 800 SEQ ID NO 802 ETV
ДНК ДНК ДНК ДНК ДНК ДНК ДНК
день С.о. С.о. С.о. С.о. С.о. С.о. С.о.
0 7,08 0,54 7,78 0,08 7,27 0,38 7,06 0,39 7,26 0,35 6,92 0,31 7,30 0,37
3 7,21 0,36 7,28 0,20 6,45 0,54 6,11 0,41 5,99 0,45 6,78 0,33 5,73 0,83
7 6,81 0,54 6,53 0,15 5,16 0,86 4,52 0,38 5,16 0,50 6,43 0,58 5,15 0,50
10 7,64 0,14 6,38 0,37 4,72 0,52 4,23 LLOQ 4,23 LLOQ 6,39 0,60 4,23 LLOQ
14 7,71 0,09 5,97 0,70 4,23 LLOQ 4,23 LLOQ 4,23 LLOQ 6,12 0,46 4,23 LLOQ
17 7,76 0,04 6,13 0,57 4,23 LLOQ 4,56 0,57 4,23 LLOQ 6,07 0,58 4,23 LLOQ
21 7,80 0,08 6,62 0,43 4,29 0,11 4,65 0,49 4,44 0,35 6,54 0,42 4,89 0,41
24 8,01 0,03 6,91 0,34 4,65 0,41 5,60 0,68 4,23 LLOQ 7,01 0,33 5,22 0,57
LLOQ = нижний предел количественного вычисления.
- 150 034924
в Солевой раствор SEQ ID NO 808 SEQ ID NO 814 SEQ ID NO 826 SEQ ID NO 825
ДНК ДНК ДНК ДНК ДНК
Де нь С.о. С.о. С.о. С.о. С.о.
0 6,95 0,35 6,79 0,30 7,13 0,24 6,94 0,40 7,02 0,18
3 7,15 0,26 5,92 0,27 5,88 0,15 6,25 0,50 5,90 0,35
6 7,26 0,22 4,80 0,64 4,44 0,48 5,34 0,70 4,56 0,68
9 7,44 0,23 4,16 LLOQ 4,16 LLOQ 4,78 0,62 4,16 LLOQ
13 7,13 0,26 4,16 LLOQ 4,16 LLOQ 4,35 0,33 4,16 LLOQ
16 7,04 0,44 4,16 LLOQ 4,16 LLOQ 4,27 0,20 4,16 LLOQ
20 7,04 0,36 4,16 LLOQ 4,16 LLOQ 4,40 0,41 4,16 LLOQ
23 7,24 0,14 4,16 LLOQ 4,16 LLOQ 4,77 0,63 4,34 0,30
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
C Солевой раствор SEQ ID NO 824
ДНК ДНК
день С.о. С.о.
0 7,47 0,23 7,33 0,16
3 7,55 0,21 5,99 0,25
6 7,74 0,19 4,89 0,48
9 7,76 0,21 4,51 0,40
13 7,82 0,27 4,32 LLOQ
16 7,60 0,42 4,32 LLOQ
20 7,42 0,16 5,03 0,53
23 7,58 0,57 4,32 LLOQ
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
Исходя из этих данных, можно сделать вывод о том, что все GalNAc конъюгированные анти-HBV антисмысловые олигомеры способны снижать сывороточные уровни геномной ДНК HBV до уровня меньшего, чем солевой раствор или эквивалентного ETV (клинический стандарт лечения). В частности, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826 продемонстрировали значительное снижение сывороточных уровней геномной ДНК HBV.
Общий вывод из этих данных заключается в том, что in vivo GalNAc-конъюгированные HBV-нацеленные LNA могут нацеливаться и снижать экспрессию HBsAg и HBeAg лучше, чем ETV (клинический стандарт лечения) и сывороточную ДНК HBV с эквивалентной или лучшей эффективностью по сравнению с ETV. Учитывая более широкое влияние на вирусную транскрипционную программу, чем нуклеозидного аналога ETV, эти данные подтверждают, что применение GalNAc конъюгированных HBV-нацеленных LNA в клинике, вероятно, приводит к намного более лучшему результату, включая существенное повышение уровня излечения для пациентов хронически инфицированных HBV. В частности, снижение иммунного супрессора HBsAg будет приводить к восстановлению HBVнаправленного хозяйского иммунного ответа.
Пример 5.
In vivo исследование инъекцией дважды в неделю при нескольких дозах.
AAV/HBV мышиную модель, как описано в примере 3, применяли в данном исследовании. Семь GalNAc конъюгированных анти-HBV LNA олигомеров тестировали в различных дозах с солевым раствором в качестве контроля на мышах C57BL/6 со стабильной виремией.
Мышам вводили дозу подкожно дважды в неделю в течение двух недель на день 0, 3, 7 и 10 или день 0, 3, 6 и 9 при дозах в мг/кг на инъекцию, указанных в таблицах ниже. HBV поверхностный антиген (HBsAg), HBV e антиген (HBeAg) и геномную ДНК HBV в сыворотке измеряли в указанные дни при помощи способов, описанных в разделе Материалы и методы. Мышей наблюдали в течение 23-24 дней.
Результаты приведены в таблицах ниже.
- 151 034924
Таблица 10A-G. Сывороточный уровень HBsAg (log10 (МЕ/мл)) при дозировании в разных концентрациях, указанных ниже, дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 807
7,1 мг/кг 1,4 мг/кг 0,28 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден Сыворо С.о. Сыворо С.о. Сыворо С.о. Сыворо С.о.
ь точный уровень точный уровень точный уровень точный уровень
0 4,63 0,12 4,74 0,06 4,71 0,05 4,51 0,24
3 4,67 0,09 3,79 0,19 4,23 0,08 4,23 0,45
6 4,63 0,11 2,68 0,15 3,50 0,08 3,83 0,52
9 4,62 0,10 2,09 0,09 2,95 0,05 3,62 0,42
13 4,64 0,06 1,84 0,09 2,50 0,04 3,54 0,28
16 4,56 0,05 1,72 0,05 2,53 0,13 3,63 0,35
20 4,69 0,03 1,97 0,29 2,92 0,17 3,91 0,25
23 4,67 0,10 1,78 0,11 3,18 0,15 4,08 0,20
В Солевой раствор SEQ ID NO 815
7,5 мг/кг 1,5 мг/кг 0,3 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,63 0,12 4,74 0,05 4,67 0,18 4,14 0,61
3 4,67 0,09 3,47 0,10 3,55 0,38 3,46 0,99
7 4,63 0,11 2,25 0,20 2,70 0,32 3,02 0,99
10 4,62 0,10 1,89 0,17 2,07 0,27 2,68 1,14
14 4,64 0,06 1,48 0,19 1,81 0,24 2,60 1,07
17 4,56 0,05 1,59 0,19 2,22 0,21 2,79 1,13
21 4,69 0,03 1,68 0,16 2,99 0,16 3,24 1,15
24 4,67 0,10 2,17 0,29 3,54 0,16 3,53 1,11
С Солевой раствор SEQ ID NO 814
6,15 мг/кг 1,26 мг/кг 0,252 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный С.о. Сыворо точный С.о. Сыворо точный С.о. Сыворо точный С.о.
уровень уровень уровень уровень
0 4,49 0,13 4,59 0,07 4,55 0,17 4,48 0,18
3 4,62 0,13 3,56 0,21 4,02 0,29 4,51 0,18
7 4,5 0,14 2,22 0,23 3,26 0,23 4,25 0,23
10 4,45 0,21 1,89 0,24 2,9 0,2 4,21 0,22
14 4,36 0,38 1,69 0,27 2,77 0,24 4,33 0,16
17 4,2 0,66 1,75 0,2 3,02 0,19 4,4 0,09
21 4,46 0,09 2,13 0,21 3,5 0,29 4,31 0,17
24 3,97 1,05 2,45 0,17 3,54 0,36 4,51 0,09
- 152 034924
D Солевой раствор SEQ ID NO 825
7,5 мг/кг 1,5 мг/кг 0,3 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,49 0,13 4,62 0,06 4,51 0,04 4,48 0,25
3 4,62 0,13 3,56 0,18 3,73 0,15 4,47 0,31
7 4,5 0,14 2,36 0,12 2,84 0,16 4,15 0,32
10 4,45 0,21 1,99 0,08 2,43 0,15 3,95 0,35
14 4,36 0,38 1,87 0,09 2,2 0,12 4,01 0,25
17 4,2 0,66 1,93 0,06 2,51 0,12 4,1 0,22
21 4,46 0,09 2,2 0,11 3,04 0,14 4,42 0,13
24 3,97 1,05 2,45 0,19 3,32 0,17 4,49 0,08
Е Солевой раствор SEQ ID NO 808
7,1 мг/кг ПК 1,42 мг/кг ПК 0,29 мг/кг ПК
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,78 0,11 4,58 0,29 4,86 0,08 4,55 0,34
3 4,75 0,1 3,38 0,72 4,27 0,24 4,36 0,43
7 4,85 0,05 2,8 0,55 3,7 0,45 4,25 0,37
10 4,81 0,08 2,31 0,43 3,42 0,35 4,06 0,5
14 4,99 0,02 2,36 0,31 3,51 0,4 4,18 0,68
17 4,91 0,04 2,36 0,31 3,52 0,3 4,11 0,68
21 4,89 0,04 2,26 0,34 3,66 0,35 4,32 0,64
24 4,8 0,06 2,4 0,28 3,87 0,3 4,45 0,47
F Солевой раствор SEQ ID NO 824
7,4 мг/кг ПК 1,5 мг/кг ПК 0,3 мг/кг ПК
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,78 0,11 4,78 0,05 4,57 0,34 4,7 0,11
3 4,75 0,1 3,86 0,23 4 0,51 4,6 0,15
7 4,85 0,05 2,44 0,32 2,87 0,54 4,15 0,16
10 4,81 0,08 2,38 0,25 2,18 0,58 3,86 0,17
14 4,99 0,02 2,85 0,4 2,21 0,82 3,84 0,28
17 4,91 0,04 2,85 0,41 2,28 0,82 3,49 0,54
21 4,89 0,04 2,25 0,91 3,63 0,74
24 4,8 0,06 2,2 0,76 3,7 0,66
- 153 034924
G Солевой раствор SEQ ID NO 826
7,1 мг/кг 1,42 мг/кг 0,29 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,78 0,11 4,61 0,26 4,67 0,06 4,57 0,14
3 4,75 0,1 3,78 0,45 4,42 0,03 4,66 0,2
7 4,85 0,05 2,46 0,51 3,84 0,13 4,52 0,2
10 4,81 0,08 2,02 0,57 3,61 0,11 4,42 0,24
14 4,99 0,02 2,08 0,63 3,65 0,27 4,63 0,21
17 4,91 0,04 1,94 0,55 3,73 0,18 4,57 0,21
21 4,89 0,04 2,54 0,25 4,09 0,13 4,73 0,2
24 4,8 0,06 3,04 0,21 4,23 0,17 4,79 0,24
Вышеуказанные данные также представлены на фиг. 11.
Таблица 11A-G. Сывороточный уровень HBeAg (log10 (ТЕ/мл)) при дозировании дважды в неделю в различных указанных концентрациях.
А Солевой раствор SEQ ID NO 807
7,1 мг/кг 1,4 мг/кг 0,28 мг/кг
HBeAg HBeAg HBeAg HBeAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,83 0,04 3,82 0,02 3,78 0,02 3,75 0,03
3 3,74 0,02 2,24 0,04 2,83 0,07 3,39 0,05
6 3,69 0,02 1,67 0,04 2,32 0,06 3,16 0,03
9 3,68 0,03 1,48 0,05 2,04 0,03 3,01 0,02
13 3,66 0,03 1,53 0,02 1,75 0,03 2,83 0,14
16 3,69 0,03 1,21 0,07 1,85 0,03 2,98 0,04
20 3,66 0,04 1,48 0,07 1,98 0,05 3,12 0,04
23 3,63 0,04 1,34 0,09 2,19 0,06 3,24 0,07
- 154 034924
В Солевой раствор SEQ ID NO 815
7,5 мг/кг 1,5 мг/кг 0,3 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,83 0,04 3,80 0,07 3,77 0,03 3,67 0,15
3 3,74 0,02 2,00 0,08 2,56 0,12 3,37 0,15
7 3,69 0,02 1,60 0,05 2,02 0,08 3,04 0,11
10 3,68 0,03 1,47 0,03 1,85 0,10 2,75 0,38
14 3,66 0,03 1,40 0,39 1,64 0,09 2,81 0,10
17 3,69 0,03 1,29 0,12 1,85 0,09 2,78 0,29
21 3,66 0,04 1,74 0,14 2,27 0,09 3,10 0,23
24 3,63 0,04 1,88 0,07 2,50 0,09 3,19 0,18
С Солевой раствор SEQ ID NO 814
6,15 мг/кг 1,26 мг/кг 0,252 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,75 0,02 3,8 0,08 3,8 0,05 3,75 0,08
3 3,52 0,09 2,15 0,06 2,97 0,05 3,46 0,09
7 3,45 0,06 1,73 0,05 2,47 0,02 3,22 0,09
10 3,6 0,06 1,7 0,07 2,32 0,05 3,2 0,08
14 3,58 0,1 1,4 0,05 2,15 0,04 3,24 0,12
17 3,58 0,15 1,55 0,05 2,44 0,06 3,34 0,1
21 3,48 0,13 1,75 0,04 2,7 0,05 3,34 0,15
24 3,59 0,12 1,92 0,05 2,8 0,04 3,44 0,13
D Солевой раствор SEQ ID NO 825
7,5 мг/кг 1,5 мг/кг 0,3 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,75 0,02 3,72 0,08 3,71 0,09 3,93 0,16
3 3,52 0,09 2,22 0,1 2,68 0,06 3,39 0,06
7 3,45 0,06 1,77 0,1 2,36 0,05 3,14 0,12
10 3,6 0,06 1,7 0,05 2,18 0,1 3,17 0,1
14 3,58 0,1 1,47 0,07 1,92 0,07 3,14 0,02
17 3,58 0,15 1,69 0,06 2,17 0,13 3,25 0,04
21 3,48 0,13 1,87 0,08 2,4 0,08 3,38 0,05
24 3,59 0,12 1,98 0,09 2,55 0,06 3,48 0,02
- 155 034924
Е Солевой раствор SEQ ID NO 808
7,1 мг/кг ПК 1,42 мг/кг ПК 0,29 мг/кг ПК
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,59 0,06 3,51 0,04 3,56 0,01 3,47 0,07
3 3,59 0,03 2,5 0,06 2,98 0,02 3,4 0,07
7 3,69 0,02 2,05 0,08 2,63 0,03 3,2 0,07
10 3,67 0,04 1,84 0,11 2,46 0,04 3,19 0,06
14 3,81 0,03 1,72 0,07 2,45 0,02 3,27 0,07
17 3,74 0,03 1,68 0,14 2,5 0,02 3,27 0,07
21 3,72 0,03 1,58 0,18 2,64 0,04 3,35 0,08
24 3,73 0,06 1,77 0,19 2,8 0,04 3,55 0,05
F Солевой раствор SEQ ID NO 824
7,4 мг/кг ПК 1,5 мг/кг ПК 0,3 мг/кг ПК
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,59 0,06 3,5 0,03 3,51 0,02 3,49 0,03
3 3,59 0,03 2,09 0,08 2,47 0,13 3,28 0,03
7 3,69 0,02 1,81 0,05 1,95 0,05 2,88 0,04
10 3,67 0,04 1,88 0,07 1,88 0,03 2,65 0,06
14 3,81 0,03 1,71 0,06 1,72 0,1 2,48 0,05
17 3,74 0,03 1,68 0,06 1,68 0,05 2,56 0,05
21 3,72 0,03 1,8 0,04 2,63 0,08
24 3,73 0,06 2,02 0,06 2,81 0,05
G Солевой раствор SEQ ID NO 826
7,1 мг/кг 1,42 мг/кг 0,29 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,59 0,06 3,44 0,09 3,45 0,06 3,5 0,02
3 3,59 0,03 2,58 0,08 3,17 0,07 3,52 0,02
7 3,69 0,02 1,81 0,08 2,8 0,1 3,4 0,03
10 3,67 0,04 1,45 0,06 2,67 0,09 3,37 0,05
14 3,81 0,03 1,27 0,05 2,54 0,12 3,39 0,07
17 3,74 0,03 1,51 0,05 2,76 0,08 3,45 0,04
21 3,72 0,03 1,83 0,11 2,9 0,08 3,54 0,03
24 3,73 0,06 2,23 0,18 3,18 0,1 3,66 0,03
Вышеуказанные данные также представлена на фиг. 12.
- 156 034924
Таблица 12A-G. Сывороточный уровень tog10 (ДНК HBV (число копий) при дозировании в указанных концентрациях дважды в неделю.
Солевой раствор
SEQ ID NO 807
7,1 мг/кг
1,4 мг/кг
0,28 мг/кг
Сывор о
точный уровен ь
ДНК
ДНК
ДНК
6,64
0,31
Сывор точный уровен
Сыворо точный уровень
6,77
0,57
6,58
0,42
4,86
0,58
7,25
0,49
4,43
0,18
7,14
0,23
4,32
LLOQ
7,32
0,33
4,30
LLOQ
7,28
0,27
4,30
LLOQ
7,23
7,43
0,31
4,30
LLOQ
0,28
4,30
LLOQ
Сыворо точный уровень
0,22
0,49
LLOQ
0,01
LLOQ
LLOQ
0,17
LLOQ
6,80
6,10
5,87
5,19
5,23
5,60
6,05
6,41
0,31
0,58
0,54
0,27
0,19
0,20
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
В Солевой раствор SEQ ID N0 815
7,5 мг/кг 1,5 мг/кг 0,3 мг/кг
ДНК ДНК ДНК ДНК
Де нь Сывор о точный уровен ь С.о. Сывор о точный уровен ь С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 6,64 0,31 6,64 0,32 6,48 0,31 6,54 0,42
3 6,58 0,42 4,44 0,21 4,59 0,46 4,95 0,67
7 7,25 0,49 4,32 LLOQ 4,32 LLOQ 4,56 0,41
10 7,14 0,23 4,31 0,01 4,32 LLOQ 4,38 0,11
14 7,32 0,33 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
17 7,28 0,27 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ 4,64 0,58
21 7,23 0,31 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ 5,12 0,87
24 7,43 0,28 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ 5,37 1,08
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
- 157 034924
С Солевой раствор SEQ ID NO 814
6,15 мг/кг 1,26 мг/кг 0,252 мг/кг
ДНК ДНК ДНК ДНК
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 7,47 0,23 7,55 0,18 7,48 0,22 7,64 0,17
3 7,55 0,21 6,2 0,18 6,44 0,26 7,37 0,14
7 7,74 0,19 5,31 0,25 5,53 0,36 7,31 0,08
10 7,76 0,21 4,46 0,19 4,65 0,49 7,22 0,1
14 7,82 0,27 4,32 0 4,32 0 7,27 0,09
17 7,6 0,42 4,32 0,01 4,38 0,09 7,41 0,14
21 7,42 0,16 4,32 0 4,62 0,56 7,42 0,09
24 7,58 0,57 4,32 0 5,48 0,7 7,66 0,16
D Солевой раствор SEQ IDNO 825
7,5 мг/кг 1,5 мг/кг 0,3 мг/кг
ДНК ДНК ДНК ДНК
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 7,47 0,23 7,36 0,28 7,41 0,32 7,5 0,44
3 7,55 0,21 5,89 0,31 5,84 0,67 6,95 0,43
7 7,74 0,19 4,75 0,57 4,92 0,55 6,73 0,43
10 7,76 0,21 4,35 0,13 4,28 0 6,49 0,44
14 7,82 0,27 4,32 0 4,32 0 6,52 0,48
17 7,6 0,42 4,32 0,01 4,31 0,01 6,68 0,26
21 7,42 0,16 4,32 0 4,32 0 6,82 0,57
24 7,58 0,57 4,32 0,01 4,63 0,31 7,19 0,32
Е Солевой раствор SEQ ID NO 808
7,1 мг/кг ПК 1,42 мг/кг ПК 0,29 мг/кг ПК
ДНК ДНК ДНК ДНК
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 7,77 0,17 7,97 0,26 7,93 0,11 7,93 0,24
3 7,8 0,05 6,29 0,4 6,69 0,21 7,31 0,35
7 7,75 0,15 5,02 0,59 5,67 0,43 7,24 0,35
10 7,79 0,09 4,5 0,36 4,95 0,75 6,98 0,3
14 8,01 0,09 4,29 0 4,56 0,46 6,83 0,55
17 7,89 0,13 4,29 0 4,29 0 6,97 0,46
21 7,94 0,06 4,29 0 4,72 0,47 7,13 0,41
24 7,83 0,08 4,29 0 4,97 0,45 7,37 0,36
- 158 034924
F Солевой растовр SEQ ID NO 824
7,4 мг/кг ПК 1,5 мг/кг ПК 0,3 мг/кг ПК
ДНК ДНК ДНК ДНК
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 7,77 0,17 8 0,24 7,98 0,23 7,87 0,17
3 7,8 0,05 6,64 0,22 6,44 0,47 7,05 0,24
7 7,75 0,15 5,58 0,32 5,34 0,75 6,25 0,26
10 7,79 0,09 4,59 0,36 4,87 0,4 5,64 0,3
14 8,01 0,09 4,29 0 4,59 0,2 4,81 0,35
17 7,89 0,13 4,29 0 4,29 0 4,61 0,37
21 7,94 0,06 4,29 0 4,94 0,43
24 7,83 0,08 4,29 0 5,24 0,56
G Солевой раствор SEQ ID NO 826
7,1 мг/кг 1,42 мг/кг 0,29 мг/кг
ДНК ДНК ДНК ДНК
ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 7,77 0,17 7,86 0,29 7,86 0,18 7,87 0,22
3 7,8 0,05 6,45 0,24 7,05 0,34 7,72 0,18
7 7,75 0,15 5,32 0,47 6,42 0,31 7,57 0,16
10 7,79 0,09 4,76 0,47 6,01 0,48 7,53 0,12
14 8,01 0,09 4,29 0 5,39 0,7 7,53 0,14
17 7,89 0,13 4,29 0 5,47 0,83 7,57 0,16
21 7,94 0,06 4,29 0 6,24 0,5 7,66 0,16
24 7,83 0,08 4,29 0 6,43 0,55 7,74 0,16
Вышеуказанные данные также представлены на фиг. 13.
Исходя из этих данных, можно сделать вывод о том, что все GalNAc конъюгированные анти-HBV антисмысловые олигомеры способны снижать сывороточные уровни HBsAG, HBeAG и геномной ДНК HBV до уровня меньшего, чем таковой для солевого раствора. В частности, SEQ ID NO: 807, 814, 815 и 825 показывают очень эффективное снижение HBsAG даже при промежуточных дозах. При наивысшей дозе снижение антигена поддерживается по меньшей мере 11 дней после окончания лечения для SEQ ID NO: 807 и 815. SEQ ID NO: 814, 815 и 825 демонстрируют наиболее эффективное снижение вирусной сывороточной ДНК, демонстрируя в частности сильное влияние на вирусные полимеразоэкспрессирующие транскрипты.
Пример 6.
Сравнение антивирусной эффективности различных путей введения.
В данном исследовании применяли AAV/HBV мышиную модель, как описано в примере 3. GalNAc конъюгированный анти-HBV LNA олигомер тестировали в различных дозах, применяя или подкожный (ПК) или внутривенный (ВВ) путь введения с солевым раствором в качестве контроля на мышах C57BL/6 со стабильной виремией.
Мышам вводили дозу подкожно или внутривенно дважды в неделю в течение двух недель на день 0, 3, 6 и 9 в дозе в мг/кг на инъекцию, указанную в таблицах ниже. Поверхностный антиген HBV (HBsAg), HBV e антиген (HBeAg) и геномную ДНК HBV в сыворотке измеряли в указанные дни при помощи спсообов, описанных в разделе Материалы и методы. Мышей наблюдали в течение 23 дней после первого дозирования.
Результаты приведены в таблицах ниже.
- 159 034924
Таблица 13А. Сывороточный уровень HBsAg (log10 (МЕ/мл)) при подкожном введении дозы в указанных концентрациях дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 807
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,64 0,11 4,55 0,08 4,46 0,13 4,69 0,07
3 4,61 0,11 4,44 0,06 3,80 0,22 3,64 0,10
6 4,58 0,07 4,29 0,08 3,33 0,19 2,54 0,12
9 4,57 0,10 4,11 0,05 2,98 0,20 1,83 0,14
13 4,67 0,08 3,93 0,18 2,85 0,23 2,00 0,08
16 4,61 0,08 3,98 0,15 2,93 0,19 2,05 0,09
20 4,52 0,08 4,08 0,11 3,11 0,31 1,98 0,11
23 4,25 0,52 3,97 0,26 3,30 0,33 2,05 0,16
Таблица 13В. Сывороточный уровень HBsAg (log10 (МЕ/мл)) при введении дозы в указанной концентрации внутривенно дважды в неделю.
В Солевой раствор SEQ ID NO 807
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 4,64 0,11 4,61 0,09 4,60 0,11 4,63 0,12
3 4,61 0,11 4,39 0,06 4,19 0,12 3,93 0,11
6 4,58 0,07 4,13 0,05 3,69 0,13 3,17 0,13
9 4,57 0,10 3,91 0,12 3,36 0,15 2,73 0,20
13 4,67 0,08 3,72 0,21 3,16 0,02 2,36 0,14
16 4,61 0,08 3,70 0,30 3,14 0,14 2,47 0,16
20 4,52 0,08 3,86 0,28 3,31 0,14 2,57 0,12
23 4,25 0,52 3,99 0,34 3,59 0,13 2,86 0,11
Таблица 14А. Сывороточный уровень HBeAg (log10 (МЕ/мл)) при подкожном введении дозы в указанной концентрации дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 807
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
HBeAg HBeAg HBeAg HBeAg
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,57 0,06 3,57 0,04 3,57 0,04 6,85 0,60
3 3,63 0,04 3,43 0,03 2,87 0,07 5,74 0,82
6 3,61 0,04 3,28 0,03 2,42 0,09 5,27 0,60
9 3,63 0,05 3,15 0,03 2,14 0,09 4,57 0,40
13 3,49 0,07 2,84 0,09 2,01 0,05 4,30 LLOQ
16 3,53 0,06 3,06 0,04 2,09 0,06 4,30 LLOQ
20 3,56 0,05 3,21 0,03 2,24 0,08 4,30 LLOQ
23 3,64 0,06 3,29 0,03 2,46 0,09 4,85 0,54
LLOQ - нижний предел количественного вычисления
- 160 034924
Таблица 14В. Сывороточный уровень HBeAg (log10 (МЕ/мл)) при внутривенном введении дозы в указанной концентрации дважды в неделю.
в Солевой раствор SEQ ID NO 807
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 3,57 0,06 3,65 0,06 3,62 0,04 3,61 0,08
3 3,63 0,04 2,13 0,06 3,37 0,05 2,96 0,03
6 3,61 0,04 1,59 0,05 3,05 0,04 2,52 0,07
9 3,63 0,05 1,39 0,07 2,88 0,06 2,35 0,03
13 3,49 0,07 1,55 0,03 2,63 0,04 2,10 0,04
16 3,53 0,06 1,59 0,04 2,73 0,06 2,18 0,08
20 3,56 0,05 1,60 0,03 3,01 0,06 2,37 0,11
23 3,64 0,06 1,64 0,08 3,22 0,05 2,60 0,07
Таблица 15А. Сывороточный уровень ДНК HBV (log10 (число копий)) при подкожном введении доз в указанных концентрациях дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 807
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
ДНК ДНК ДНК ДНК
Де нь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 6,50 0,21 6,56 0,19 6,85 0,60 6,48 0,14
3 6,65 0,31 6,30 0,33 5,74 0,82 4,34 LLOQ
6 6,83 0,31 6,20 0,33 5,27 0,60 4,34 LLOQ
9 6,94 0,37 5,90 0,32 4,57 0,40 4,73 0,67
13 7,13 0,21 5,82 0,88 4,30 LLOQ 4,56 0,46
16 7,12 0,31 6,23 0,38 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
20 7,06 0,17 6,27 0,35 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
23 6,94 0,32 6,42 0,32 4,85 0,54 4,30 LLOQ
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
- 161 034924
Таблица 15В. Сывороточный уровень ДНК HBV (logic (число копий)) при внутривенном введении доз в указанных концентрациях дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 807
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
ДНК ДНК ДНК ДНК
Де нь Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о. Сыворо точный уровень С.о.
0 6,50 0,21 6,71 0,59 6,62 0,23 6,71 0,45
3 6,65 0,31 6,20 0,59 5,50 0,43 5,24 0,69
6 6,83 0,31 5,50 0,90 4,62 0,48 4,34 LLOQ
9 6,94 0,37 5,18 0,85 4,34 LLOQ 4,34 LLOQ
13 7,13 0,21 5,05 0,76 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
16 7,12 0,31 5,13 0,84 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
20 7,06 0,17 5,50 0,80 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
0,2 мг/кг 1,0 мг/кг 5,0 мг/кг
23 6,94 0,32 5,99 0,41 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
Данные также представлены на фиг. 14.
Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что введение GalNAc конъюгированных анти-HBV антисмысловых олигомеров более эффективно снижает сывороточные уровни HBsAG, HBeAG и геномной ДНК HBV до уровня, меньшего, чем таковой для солевого раствора, в случае подкожного введения дозы, по сравнению с внутривенным введением.
Пример 7.
Сравнение конъюгированных и неконъюгированных олигонуклеотидов.
В данном исследовании применяли мышиную модель AAV/HBV, как описано в примере 3. Неконъюгированные и (SEQ ID NO: 308 и 303) и GalNAc конъюгированные (SEQ ID NO: 807 и 815) антиHBV LNA олигомеры тестировали при эквимолярных дозах олигомера с солевым раствором в качестве контроля на мышах C57BL/6 со стабильной виремией.
Мышам подкожно вводили дозу дважды в неделю в течение двух недель на день 0, 3, 6 и 9 в дозе в мг/кг на инъекцию, указанной в таблицах ниже. HBV поверхностный антиген (HBsAg), HBV e антиген (HBeAg) и геномную ДНК HBV в сыворотке измеряли в указанные дни при помощи способов описанных в разделе Материалы и методы. Мышей наблюдали в течение 23 дней.
Результаты приведены в таблицах ниже.
Таблица 16А, В. Сывороточный уровень HBsAg (log10 (МЕ/мл)) при введении эквимолярных концентрация дважды в неделю.
A Солевой раствор SEQ ID NO 308 SEQ ID NO 807
5 мг/кг 7,1 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сывороточн ый уровень С.о. Сывороточный уровень С.о. Сывороточн ый уровень С.о.
0 4,63 0,12 4,70 0,05 4,74 0,06
3 4,67 0,09 4,44 0,14 3,79 0,19
6 4,63 0,11 3,91 0,44 2,68 0,15
9 4,62 0,10 3,50 0,44 2,09 0,09
13 4,64 0,06 3,27 0,43 1,84 0,09
16 4,56 0,05 3,20 0,53 1,72 0,05
20 4,69 0,03 3,61 0,54 1,97 0,29
23 4,67 0,10 3,96 0,34 1,78 0,11
- 162 034924
В Солевой раствор SEQ ID NO 303 SEQ ID NO 815
1 мг/кг 1,5 мг/кг
HBsAg HBsAg HBsAg
Ден ь Сывороточн ый уровень С.о. Сывороточны й уровень С.о. Сывороточн ый уровень С.о.
0 4,63 0,28 4,49 0,54 4,62 0,25
3 4,70 0,17 4,58 0,38 3,31 0,09
6 4,84 0,12 4,78 0,17 3,21 0,14
9 4,81 0,13 4,81 0,13 2,64 0,22
13 4,86 0,12 4,91 0,06 2,63 0,58
16 4,83 0,13 4,85 0,10 2,04 0,57
20 4,73 0,18 4,68 0,14 2,26 0,58
23 4,66 0,20 4,48 0,40 2,74 0,64
Таблица 17А, В. Сывороточный уровень HBeAg (log10 (МЕ/мл)) при введении доз в эквимолярных концентрациях дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 308 SEQ ID NO 807
5 мг/кг 7,1 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сывороточн ый уровень С.о. Сывороточны й уровень С.о. Сывороточн ый уровень С.о.
0 3,83 0,04 3,79 0,05 3,82 0,02
3 3,74 0,02 3,39 0,08 2,24 0,04
6 3,69 0,02 3,07 0,02 1,67 0,04
9 3,68 0,03 2,82 0,04 1,48 0,05
13 3,66 0,03 2,66 0,03 1,53 0,02
16 3,69 0,03 2,75 0,03 1,21 0,07
20 3,66 0,04 3,01 0,02 1,48 0,07
23 3,63 0,04 3,10 0,05 1,34 0,09
В Солевой раствор SEQ ID NO 303 SEQ ID NO 815
1 мг/кг 1,5 мг/кг
НВеАд НВеАд НВеАд
Ден ь Сывороточн ый уровень С.о. Сывороточны й уровень С.о. Сывороточн ый уровень С.о.
0 3,82 0,03 3,74 0,04 3,80 0,06
3 3,82 0,03 3,78 0,02 2,48 0,10
6 3,85 0,02 3,83 0,06 2,70 0,05
9 3,81 0,03 3,75 0,02 2,29 0,07
13 3,84 0,02 3,84 0,03 2,45 0,08
16 3,84 0,04 3,80 0,02 2,19 0,02
20 3,78 0,04 3,73 0,04 2,27 0,06
23 3,79 0,03 3,79 0,01 2,60 0,04
- 163 034924
Таблица 18А, В. Сывороточный уровень ДНК HBV (log10 (число копий)) при введении доз в эквимолярных концентрациях дважды в неделю.
А Солевой раствор SEQ ID NO 308 SEQ ID NO 807
ДНК ДНК ДНК
5 мг/кг 7,1 мг/кг
Ден ь Сывороточн ый уровень С.о. Сывороточны й уровень С.о. Сывороточн ый уровень С.о.
0 6,64 0,31 6,53 0,26 6,77 0,57
3 6,58 0,42 5,18 0,88 4,86 0,58
6 7,25 0,49 5,05 0,73 4,43 0,18
9 7,14 0,23 4,54 0,37 4,32 LLOQ
13 7,32 0,33 4,30 LLOQ 4,30 LLOQ
16 7,28 0,27 4,41 0,19 4,30 LLOQ
20 7,23 0,31 4,63 0,57 4,30 LLOQ
23 7,43 0,28 5,23 0,93 4,30 LLOQ
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
В Солевой расвтор SEQ ID NO 303 SEQ ID NO 815
ДНК ДНК ДНК
1 мг/кг 1,5 мг/кг
Ден ь Сывороточн ый уровень С.о. Сывороточный уровень С.о. Сывороточн ый уровень С.о.
0 7,89 0,16 7,91 0,42 7,91 0,23
3 8,28 0,13 8,06 0,41 6,54 0,25
6 8,03 0,13 7,94 0,20 5,38 0,63
9 8,19 0,13 8,07 0,14 4,30 LLOQ
13 8,37 0,16 8,31 0,13 4,30 LLOQ
16 8,41 0,19 8,16 0,18 4,30 LLOQ
20 8,23 0,09 7,94 0,19 4,30 LLOQ
23 8,20 0,06 7,89 0,28 4,30 LLOQ
LLOQ - нижний предел количественного вычисления.
Данные также представлены на фиг. 15.
Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что введение GalNAc конъюгированных анти-HBV антисмысловых олигомеров более эффективно снижает сывороточные уровни HBsAG и HBeAG до уровня меньшего, чем таковой для солевого раствора, в случае подкожного введения дозы по сравнению с внутривенным введением. ДНК HBV в сыворотке снижается с эквивалентной эффективностью двумя способами доставки, хотя ограничение исследования препятствует выявлению различий при высоких дозах.
Все ссылки, включая публикации, заявки на патент и патенты, процитированные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте и в той же степени, как если бы каждая ссылка была бы отдельно и специально указана для включения посредством ссылки и изложена во всей их полноте в данном документе (с максимальной степенью, разрешенной правом). Все заголовки и подзаголовки применены в данном документе только для удобства и не должны трактоваться как ограничивающие объем изобретения каким-либо образом. Применение любых и всех примеров или референсных выражений (например, такой как), предложенных в данном документе, предназначено исключительно для иллюстрации изобретения и не ограничивают объем изобретения, если не указано иное. Отсутствие формулировки в описании должно трактоваться в качестве указания на то, что любой незаявленный элемент, по существу, не является необходимым для практического воплощения изобретения. Цитирование и включение патентных документов в данный документ приведено только для справки и не отражает оценки действительности, патентоспособности и/или правового обеспечения таких патентных документов. Данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, определенного в прилагаемой формуле изобретения, как допущено применяемыми правовыми нормами.

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Олигомерный конъюгат для модуляции последовательности-мишени вируса гепатита В (HBV), содержащий:
    a) по меньшей мере один олигомер составляющий в длину от 10 до 20 нуклеотидов и на 100% комплементарный последовательности от позиции 1530 до позиции 1598 в SEQ ID NO: 3; и
    b) компонент-носитель, представляющий собой кластер GalNAc, содержащий от двух до четырех терминальных GalNAc групп.
  2. 2. Олигомерный конъюгат по п.1, где олигомер на 100% комплементарен последовательности от позиции 1530 до позиции 1544 или от позиции 1551 до позиции 1566 в SEQ ID NO: 3.
  3. 3. Олигомерный конъюгат по п.1 или 2, где указанный олигомер содержит 2'-дезоксирибонуклеотидный гэп, фланкированный с каждой стороны крылом, где каждое крыло независимо содержит одно или более звеньев - закрытую нуклеиновую кислоту (LNA, от англ. locked nucleic acid).
  4. 4. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-3, где указанный кластер GalNAc содержит ПЭГ (полиэтиленгликоль) спейсер, связывающий каждую GalNAc группу с группой точки разветвления.
  5. 5. Олигомерный конъюгат по п.4, где кластер GalNAc представляет собой трехвалентный GalNAc, выбранный из группы, состоящей из Conj 1, 2, 1а или 2а.
  6. 6. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-5, где указанный компонент-носитель представляет собой GalNAc2, имеющий следующую структуру:
    L OHJ -Л- - 1 ЙНАс 0 ' c 1 -1 й J. h i ·. r GalNAc2 f o ji i riC< 'ЧН
    Ччлс
  7. 7. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-6, где указанный компонент-носитель связан с олигомером посредством РО-линкера, содержащего 2, 3, 4 или 5 фосфодисложноэфирно-связанных ДНК или РНК нуклеозидов.
  8. 8. Олигомерный конъюгат по п.7, где РО-линкер состоит из динуклеотидной последовательности СА.
  9. 9. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-8, где указанный олигомер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO: 13);
    GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 11);
    CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 12);
    AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO: 14); GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO: 15); AGCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 18); GAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 16);
    GCGAAGTGCACACGG (SEQ ID NO: 17);
    AGCGAAGTGCACACG (SEQ ID NO: 20);
    CGAAGTGCACACG (SEQ ID NO: 19);
    AGGTGAAGCGAAGTG (SEQ ID NO: 26) и AGGTGAAGCGAAGT (SEQ ID NO: 27).
  10. 10. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-9, где указанный олигомер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    GCGTAAAGAGAGG (SEQ ID NO: 13);
    GCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 11);
    CGCGTAAAGAGAGGT (SEQ ID NO: 12);
    AGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO: 14) и GAGAAGGCACAGACGG (SEQ ID NO: 15).
  11. 11. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-10, где указанный олигомер состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
    - 165 034924
    GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO: 303);
    GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 301);
    GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 618);
    CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 302);
    AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 304); GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 305);
    GAAgtgcacacGG (SEQ ID NO: 306);
    GCGaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 307);
    GAAgtgcacaCGG (SEQ ID NO: 628);
    AGCgaagtgcacaCGG (SEQ ID NO: 308);
    CGAagtgcacaCG (SEQ ID NO: 309);
    AGCgaagtgcacACG (SEQ ID NO: 310);
    AGGtgaagcgaagTGC (SEQ ID NO: 315);
    AGGtgaagcgaaGTG (SEQ ID NO: 316);
    AGGtgaagcgaAGT (SEQ ID NO: 317) и AGgtgaagcgaAGTG (SEQ ID NO: 668), где прописные буквы обозначают звенья LNA, а строчные буквы обозначают звенья ДНК.
  12. 12. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-11, где указанный олигомер состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
    GCGtaaagagaGG (SEQ ID NO: 303);
    GCGtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 301);
    GCGtaaagagAGG (SEQ ID NO: 618);
    CGCgtaaagagaGGT (SEQ ID NO: 302);
    AGAaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 304) и GAGaaggcacagaCGG (SEQ ID NO: 305), где прописные буквы обозначают звенья LNA, а строчные буквы обозначают звенья ДНК.
  13. 13. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-12, выбранный из группы, состоящей из любой одной или более из:
    5'-GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO: 815);
    5'-GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO: 814);
    5'-GN2-C6 caGs mCsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO: 825);
    5'-GN2-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsAsmCsG-3' (SEQ ID NO: 808);
    5'-GN2-C6 caAsGsgstsgsasasgs mcsgsasAsGsTsG-3' (SEQ ID NO: 826);
    5'-GN2-C6 caAsGs mCsgsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO: 807);
    5'-GN2-C6 camCsGsmCsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO: 803);
    5'-GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO: 804);
    5'-GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO: 805);
    5'-GN2-C6 caGs mCsGsasasgstsgscsascsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO: 806);
    5'-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasgsTsGs mC-3' (SEQ ID NO: 809);
    5'-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasasGsTsG-3' (SEQ ID NO: 810);
    5'-GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mcsGsG-3' (SEQ ID NO: 816);
    5'-GN2-C6 camCsGsAsasgstsgscsascsasmCsG-3' (SEQ ID NO: 817);
    5'-GN2-C6 caAsGsGstsgsasasgs mcsgsasAsGsT-3' (SEQ ID NO: 818);
    5'-GN2-C6 caGsAsAscscsascstsgsasas mCsAsAsA-3' (SEQ ID NO: 819);
    5'-GN2-C6 camCsGsAsAscscsascstsgsasascsAsAsA-3' (SEQ ID NO: 820);
    5'-GN2-C6 caGsAsAsgstsgscsascsas mCsGsG-3' (SEQ ID NO: 821) и
    5'-GN2-C6 caTsAsGstsasasascstsgsasgs mCsmCsAs-3' (SEQ ID NO: 822), где прописные буквы обозначают звенья бета-О-окси-LNA;
    строчные буквы обозначают звенья ДНК;
    нижний индекс s обозначает фосфоротиоатную связь;
    верхний индекс m обозначает звено ДНК или бета-О-окси-LNA, содержащее 5-метилцитозиновое основание;
    GN2-C6 обозначает GalNAc2 компонент-носитель с С6 линкером.
  14. 14. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-13, выбранный из группы, состоящей из любой одной или более из:
    5'-GN2-C6 caGsmCsGstsasasasgsasgsasGsG-3' (SEQ ID NO: 815);
    5'-GN2-C6 caGsmCsGstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO: 814);
    5'-GN2-C6 caGsmCsGstsasasasgsasgsAsGsG-3' (SEQ ID NO: 825);
    5'-GN2-C6 camCsGsmCsgstsasasasgsasgsasGsGsT-3' (SEQ ID NO: 803);
    5'-GN2-C6 caAsGsAsasgsgscsascsasgsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO: 804) и
    5'-GN2-C6 caGsAsGsasasgsgscsascsasgsasmCsGsG-3' (SEQ ID NO: 805), где прописные буквы обозначают звенья бета-D-окси-LNA; строчные буквы обозначают звенья
    - 166 034924
    ДНК; нижний индекс s обозначает фосфоротиоатную связь; верхний индекс m обозначает звено ДНК или бета-П-окси-ЕНЛ, содержащее 5-метилцитозиновое основание; GN2-C6 обозначает GalNAc2 компонент-носитель с С6 линкером.
  15. 15. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-14, имеющий структуру
    SEQ ID N0 815.
  16. 16. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-14, имеющий структуру
    SEQID N0 814.
  17. 17. Олигомерный конъюгат по любому из пп.1-14, имеющий структуру
    SEQ ID N0 825.
    - 167 034924
  18. 18. Фармацевтическая композиция для модуляции последовательности-мишени вируса гепатита В (HBV), содержащая олигомерный конъюгат по любому из пп.1-17 и один или более фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.
  19. 19. Применение олигомерного конъюгата по любому из пп.1-17 в лечении вирусного заболевания печени.
  20. 20. Применение фармацевтической композиции по п.18 в лечении вирусного заболевания печени.
  21. 21. Применение олигомерного конъюгата по любому из пп.1-17 для производства лекарственного препарата для лечения вирусного заболевания печени.
EA201692274A 2014-05-15 2015-05-12 Олигомеры и олигомерные конъюгаты EA034924B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1408623.5A GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-05-15 Oligomers and oligomer conjugates
PCT/EP2015/060402 WO2015173208A2 (en) 2014-05-15 2015-05-12 Oligomers and oligomer conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201692274A1 EA201692274A1 (ru) 2017-06-30
EA034924B1 true EA034924B1 (ru) 2020-04-07

Family

ID=51134907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201692274A EA034924B1 (ru) 2014-05-15 2015-05-12 Олигомеры и олигомерные конъюгаты

Country Status (23)

Country Link
US (4) US10421967B2 (ru)
EP (2) EP3143142A2 (ru)
JP (4) JP6306745B2 (ru)
KR (3) KR20180081180A (ru)
CN (2) CN106470688B (ru)
AR (1) AR100445A1 (ru)
AU (2) AU2015260991B2 (ru)
BR (1) BR112016026777A2 (ru)
CA (1) CA2948946A1 (ru)
CL (2) CL2016002849A1 (ru)
CR (1) CR20160520A (ru)
EA (1) EA034924B1 (ru)
GB (1) GB201408623D0 (ru)
IL (1) IL248526A0 (ru)
MA (2) MA49715A (ru)
MX (1) MX2016014866A (ru)
MY (1) MY176428A (ru)
PE (1) PE20170262A1 (ru)
PH (1) PH12016502102A1 (ru)
SG (2) SG11201609501WA (ru)
TW (2) TW201825101A (ru)
WO (1) WO2015173208A2 (ru)
ZA (1) ZA201607251B (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012008865A2 (pt) 2009-10-16 2019-09-24 Glaxo Group Ltd inibidores de hbv anti-sentido.
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
EP3325097B1 (en) 2015-07-17 2021-09-01 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against hepatitis b virus and uses thereof
US20170137821A1 (en) 2015-07-17 2017-05-18 Arcturus Therapeutics, Inc. Molecules and agents for treating hepatitis b virus
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
WO2018177881A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Unylinker rapid cleavage
WO2018215049A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
KR20200100601A (ko) * 2017-09-14 2020-08-26 얀센 바이오파마, 인크. GalNAc 유도체
SG11202003461TA (en) * 2017-10-16 2020-05-28 Hoffmann La Roche NUCLEIC ACID MOLECULE FOR REDUCTION OF PAPD5 AND PAPD7 mRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION
BR112020007476A2 (pt) * 2017-10-20 2020-10-27 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. métodos para tratamento da infecção por hepatite b
AU2019247645A1 (en) 2018-04-05 2020-10-15 Centre Leon Berard Use of FUBP1 inhibitors for treating hepatitis B virus infection
CA3103054A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating tau expression
AU2019300324A1 (en) 2018-07-13 2021-01-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating RTEL1 expression
WO2020243490A2 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 Aligos Therapeutics, Inc. Modified gapmer oligonucleotides and methods of use
EP4031140A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 F. Hoffmann-La Roche AG Method of treating hbv infection using a core protein allosteric modulator
WO2021122735A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP2023506547A (ja) 2019-12-19 2023-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｃｏｐｓ３阻害剤の使用
EP4077671A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of saraf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077668A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of scamp3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077669A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
CA3163646A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 F. Hoffman-La Roche Ag Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv
MX2022007911A (es) 2019-12-24 2022-07-21 Hoffmann La Roche Procedimiento de tratamiento de una infeccion virica usando un agonista de tlr7.
EP4081639A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combination of a therapeutic oligonucleotide targeting hbv and a tlr7 agonist for treatment of hbv
WO2021207641A1 (en) * 2020-04-10 2021-10-14 Aligos Therapeutics, Inc. Antisense oligonucleotide (aso) molecules and uses thereof for coronavirus diseases
CN115702006A (zh) * 2020-06-10 2023-02-14 南京明德新药研发有限公司 缀合基团及其缀合物
AR122731A1 (es) 2020-06-26 2022-10-05 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para modular la expresión de fubp1
JP2023538630A (ja) 2020-08-21 2023-09-08 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのａ１ｃｆ阻害剤の使用
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
AU2022384619A1 (en) 2021-11-11 2024-04-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016312A2 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
WO2002081494A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
US20040054156A1 (en) * 1992-05-14 2004-03-18 Kenneth Draper Method and reagent for inhibiting hepatitis B viral replication
WO2005021800A2 (en) * 2003-08-22 2005-03-10 Sirna Therapeutics, Inc. Detection and quantitation of nucleic acid molecules in biological samples
WO2011047312A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Glaxo Group Limited Hbv antisense inhibitors
US8642752B2 (en) * 2011-04-21 2014-02-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of Hepatitis B virus (HBV) expression

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US4740463A (en) 1984-04-13 1988-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and artificial genes for antagonizing the function of an oncogene
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4962029A (en) 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
JPH07501204A (ja) 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
US20040127446A1 (en) 1992-05-14 2004-07-01 Lawrence Blatt Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis B virus and hepatitis C virus replication
US20030206887A1 (en) * 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5652332A (en) 1993-03-12 1997-07-29 Xoma Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof
US6413949B1 (en) 1995-06-07 2002-07-02 D-Pharm, Ltd. Prodrugs with enhanced penetration into cells
EP0751949A4 (en) 1993-12-23 1997-08-20 Apollon Inc VIRAL ANTI-HEPATITIS B OLIGONUCLEOTIDES
US5728518A (en) 1994-01-12 1998-03-17 The Immune Response Corporation Antiviral poly-and oligonucleotides
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
PT804456E (pt) 1994-10-06 2003-01-31 Peter Eigil Nielsen Conjugados de acidos nucleicos dos peptidos
US5856459A (en) 1995-06-06 1999-01-05 Hybridon, Inc. Oligonucleotides specific for hepatitis B virus
US5736392A (en) 1995-06-07 1998-04-07 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
WO1998003533A1 (en) 1996-07-24 1998-01-29 Oligos Etc. And Oligos Therapeutics, Inc. Antisense oligonucleotides as antibacterial agents
WO1998042876A1 (en) 1997-03-26 1998-10-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for using membrane-penetrating proteins to carry materials across cell membranes
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
US6306993B1 (en) 1997-05-21 2001-10-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Jr. University Method and composition for enhancing transport across biological membranes
US6610539B1 (en) 1997-07-10 2003-08-26 Genesense Technologies, Inc. Antisense oligonucleotide sequences as inhibitors of microorganisms
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
AU4281999A (en) 1998-06-10 1999-12-30 Queen's University Of Belfast, The Peptide
US6300319B1 (en) * 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
AU6258999A (en) 1998-09-16 2000-04-03 Vitagenix, Inc. Compositions and methods of use of uptake mechanisms for diagnostic and therapeutic applications of oligonucleotides targeting bacteria
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
ES2607471T3 (es) 2002-11-18 2017-03-31 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Diseño antisentido
DK1495769T3 (da) 2003-07-11 2008-06-23 Lbr Medbiotech B V Mannose-6-phosphat-receptormedieret gentransfer til muskelceller
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
CA2651042A1 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of sglt2
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
KR20090055623A (ko) 2006-09-15 2009-06-02 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 방해된 에스테르 기재 생분해성 링커
WO2008034123A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
WO2009060316A2 (en) * 2007-09-14 2009-05-14 The Governors Of The University Of Alberta Hepatitis b virus-binding polypeptides and methods of use thereof
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
WO2009100320A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
EP2285819B1 (en) 2008-04-04 2013-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
WO2009124295A2 (en) 2008-04-04 2009-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
AR076053A1 (es) * 2009-04-14 2011-05-18 Schering Corp Derivados de pirazolo[1,5-a]pirimidina como inhibidores de mtor
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US8779118B2 (en) 2010-01-11 2014-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US9193752B2 (en) 2010-03-17 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
CA2807307C (en) 2010-08-17 2021-02-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
ES2638062T3 (es) 2010-12-13 2017-10-18 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Intercambio de parámetros relativos a periodos de medición
CA2816155C (en) * 2010-12-17 2020-10-27 Arrowhead Research Corporation Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for sirna
ES2605990T3 (es) 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
US20120295961A1 (en) * 2011-04-21 2012-11-22 Swayze Eric E Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
US8809293B2 (en) * 2011-06-30 2014-08-19 Arrowhead Madison Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis B virus
AU2012308320C1 (en) * 2011-09-14 2018-08-23 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
KR20140036498A (ko) * 2012-09-17 2014-03-26 김문섭 와이-클립 이어폰 줄정리기
MX363068B (es) 2012-11-15 2019-03-07 Roche Innovation Ct Copenhagen As Conjugados de oligonucleotido.
CA2893801A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
PL2992009T3 (pl) 2013-05-01 2020-11-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby modulowania ekspresji apolipoproteiny(a)
PE20160158A1 (es) 2013-06-27 2016-03-18 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligomeros antisentido y conjugados con diana en pcsk9
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
SG11201702877TA (en) 2014-10-10 2017-05-30 Hoffmann La Roche Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040054156A1 (en) * 1992-05-14 2004-03-18 Kenneth Draper Method and reagent for inhibiting hepatitis B viral replication
WO2001016312A2 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based modulators of gene expression
JP2004512810A (ja) * 1999-08-31 2004-04-30 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 核酸に基づく遺伝子発現の調節剤
WO2002081494A1 (en) * 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
JP2004532022A (ja) * 2001-03-26 2004-10-21 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｂ型肝炎ウイルスおよびｃ型肝炎ウイルスの複製のオリゴヌクレオチド媒介性阻害
WO2005021800A2 (en) * 2003-08-22 2005-03-10 Sirna Therapeutics, Inc. Detection and quantitation of nucleic acid molecules in biological samples
WO2011047312A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Glaxo Group Limited Hbv antisense inhibitors
US8642752B2 (en) * 2011-04-21 2014-02-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of Hepatitis B virus (HBV) expression

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALKRISHEN BHAT ET AL.: "RG-101, a GalNAc-conjugated anti-miR Employinga Unique Mechanism of Action by Targeting Host Factor MicroRNA-122 ( miR-122), Demonstrates Potent Activity and Reduction of HCV in Preclinical Studies", 4 November 2013 (2013-11-04), XP55113633, Retrieved from the Internet: URL:http://www.regulusrx.com/wp-content/uploads/2013/11/RT13-002-Neben_AASLD-LFP_final.pdf [retrieved on 2014-04-11], the whole document *
BALKRISHEN BHAT, STEVEN NEBEN, JIA TAY, KAI LIU, NELSON CHAU, DANIEL HOGAN, DEIDRE MACKENNA, NEIL GIBSON: "RG-101, a GalNAC-conjugated anti-miR employing a unique mechanism of action by targeting host factor microRNA-122 (miR-122), demonstrates potent activity and reduction of HCV in preclinical studies", HEPATOLOGY, JOHN WILEY & SONS, INC., US, vol. 58, no. 6, suppl., LB-28, 1 December 2013 (2013-12-01), US, pages 1393A, XP002723153, ISSN: 0270-9139 *
C KLEIN, BOCK CT, WEDEMEYER H, W�STFELD T, LOCARNINI S, DIENES HP, KUBICKA S, MANNS MP, TRAUTWEIN C: "Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA", GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER, 1 July 2003 (2003-07-01), pages 9 - 18, XP055204617, DOI: 10.1016/S0016-5085(03)00720-0 *
JESPER B. BRAMSEN, J�RGEN KJEMS: "Development of Therapeutic-Grade Small Interfering RNAs by Chemical Engineering", FRONTIERS IN GENETICS, FRONTIERS RESEARCH FOUNDATION, vol. 3, 1 January 2012 (2012-01-01), XP055134928, ISSN: 16648021, DOI: 10.3389/fgene.2012.00154 *
YING, R.S. ZHU, C. FAN, X.G. LI, N. TIAN, X.F. LIU, H.B. ZHANG, B.X.: "Hepatitis B virus is inhibited by RNA interference in cell culture and in mice", ANTIVIRAL RESEARCH, ELSEVIER BV, NL, vol. 73, no. 1, 14 January 2007 (2007-01-14), NL, pages 24 - 30, XP022575657, ISSN: 0166-3542, DOI: 10.1016/j.antiviral.2006.05.022 *
YONG CHEN ET AL.: "RNAi for Treating Hepatitis B Viral Infection", PHARMACEUTICAL RESEARCH, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS, NL, vol. 25, no. 1, 12 December 2007 (2007-12-12), pages 72-86, XP019579496, ISSN: 1573-904X, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CL2019000621A1 (es) 2019-07-26
US20160010093A1 (en) 2016-01-14
KR101878587B1 (ko) 2018-07-16
EP3143142A2 (en) 2017-03-22
MA49715A (fr) 2019-10-09
US10767181B2 (en) 2020-09-08
JP2022048397A (ja) 2022-03-25
JP6306745B2 (ja) 2018-04-04
GB201408623D0 (en) 2014-07-02
CL2016002849A1 (es) 2017-12-11
US20200024605A1 (en) 2020-01-23
JP2017515862A (ja) 2017-06-15
US10421967B2 (en) 2019-09-24
TW201607541A (zh) 2016-03-01
US20210054381A1 (en) 2021-02-25
KR20180081180A (ko) 2018-07-13
JP2018087202A (ja) 2018-06-07
JP2019108405A (ja) 2019-07-04
US20240035032A1 (en) 2024-02-01
KR101953074B1 (ko) 2019-02-27
US11591598B2 (en) 2023-02-28
WO2015173208A9 (en) 2015-12-30
CR20160520A (es) 2017-01-06
EA201692274A1 (ru) 2017-06-30
JP6522814B2 (ja) 2019-05-29
WO2015173208A3 (en) 2016-02-18
CN106470688A (zh) 2017-03-01
CN106470688B (zh) 2020-10-27
AR100445A1 (es) 2016-10-05
PH12016502102A1 (en) 2017-01-09
CN112274647A (zh) 2021-01-29
BR112016026777A2 (pt) 2017-12-12
TW201825101A (zh) 2018-07-16
IL248526A0 (en) 2016-12-29
ZA201607251B (en) 2019-04-24
SG10201800655YA (en) 2018-02-27
PE20170262A1 (es) 2017-03-30
MA39996A (fr) 2015-11-19
TWI639432B (zh) 2018-11-01
AU2019202556A1 (en) 2019-05-02
KR20180008923A (ko) 2018-01-24
MY176428A (en) 2020-08-07
AU2015260991B2 (en) 2019-01-17
AU2015260991A1 (en) 2016-11-17
MX2016014866A (es) 2017-02-27
CA2948946A1 (en) 2015-11-19
CN112274647B (zh) 2024-04-23
EP3550023A1 (en) 2019-10-09
SG11201609501WA (en) 2016-12-29
KR20170007414A (ko) 2017-01-18
WO2015173208A2 (en) 2015-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11591598B2 (en) Oligomers and oligomer conjugates
JP7447073B2 (ja) Ｐｄ－ｌ１発現低減用のオリゴヌクレオチド
US20230113497A1 (en) NUCLEIC ACID MOLECULE FOR REDUCTION OF PAPD5 AND PAPD7 mRNA FOR TREATING HEPATITIS B INFECTION
JP2023538630A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置するためのａ１ｃｆ阻害剤の使用
JP2023506540A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓｃａｍｐ３阻害剤の使用
EP4081217A1 (en) Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv
JP2023506547A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｃｏｐｓ３阻害剤の使用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU