TWI639432B - 寡聚物及寡聚物結合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於用於治療病毒病症之寡聚物結合物。該寡聚物結合物包含：a)能夠調節B型肝炎病毒(HBV)之HBx及/或HBsAg中之靶序列以治療該病毒病症之寡聚物；及b)能夠將該寡聚物遞送至肝之載劑組份，其連接、較佳結合至該寡聚物。

Description

寡聚物及寡聚物結合物
本發明係關於寡聚物治療劑之領域，且具體而言係關於靶向B型肝炎病毒(HBV)之寡聚物及寡聚物結合物。具體而言，本發明係關於寡聚物結合物治療劑之領域，其中反義寡核苷酸附接至載劑組份。在某些態樣中，本發明係關於寡聚物結合物治療劑之領域，其中反義寡核苷酸藉助生理上不穩定之連接體共價附接至載劑組份。
更特定而言，本發明係關於靶向細胞中之HBV mRNA從而引起治療病毒病症之寡聚物、具體而言寡聚物結合物治療劑。
正研發分子策略以調節直接引起、參與或加重疾病狀態之不期望基因表現。一種該策略涉及利用序列與有害靶基因之信使RNA互補之寡核苷酸抑制基因表現。信使RNA鏈係編碼DNA鏈之拷貝且因此，作為DNA鏈，稱作有義鏈。與有義鏈雜交之寡核苷酸稱作反義寡核苷酸。該等鏈與mRNA之結合干擾轉譯過程且因此干擾基因表現。
某些基於核苷酸之化合物已用於各種治療應用中。具體而言，已研究各種寡核苷酸，包括單鏈及雙鏈寡核苷酸及類似物。為可用於活體內應用，寡核苷酸必須具有許多性質(包括穿透細胞膜之能力)，對細胞外及細胞內核酸酶具有良好抗性，對靶標具有高親和力及特異性且較佳具有招募內源酶(例如RNA酶H、RNAaseIII、RNA酶L等)之能力。
寡核苷酸之強調其許多潛在治療應用之基本性質係其識別採用Watson-Crick氫鍵結(A-T及G-C)或其他氫鍵結方案(例如Hoogsteen/逆Hoogsteen模式)之互補單鏈核酸並與其特異性雜交的能力。親和力及特異性係常用於表徵特定寡核苷酸之雜交特徵的性質。親和力係寡核苷酸與其互補靶標之結合強度之量度(表示為雙螺旋之熱穩定性(Tm))。雙螺旋中之每一核鹼基對增大熱穩定性且因此親和力隨著寡核苷酸之大小(核鹼基之數目)增加而增加。特異性係寡核苷酸區分完全互補及失配靶序列之能力的量度。
已知使用經修飾之核酸以改良(例如)寡核苷酸之穩定性，具體而言用於缺口聚物(gapmer)設計，例如在翼區域中之一者或二者中存在1或多個經修飾之核苷酸時。修飾形式之實例包括2’-O-烷基-RNA單元、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、LNA單元、阿拉伯核酸(ANA)單元、2’-氟-ANA單元、HNA單元、INA(嵌入核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30：4918-4925，以引用方式併入本文中)單元、2’MOE單元、ENA(乙烯核酸)、UNA(解鎖核酸，Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039)、三環DNA(R.Steffens及C.J.Leumann,J.Am.Chem.Soc,1997,119,11548-49)、cET-LNA(本文所示)及LNA。圖4提供一些該等類似物之圖示。
特定有效之經修飾之核酸稱作鎖核酸(LNA)。業內已報導LNA-例如，參見國際專利申請案WO 99/14226；P.Nielsen等人，J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,1997,3423；P.Nielsen等人，Chem.Commun.,1997,9,825；N.K.Christensen等人，J.Am.Chem.Soc.,1998,120,5458；A.A.Koshkin等人，J.Org.Chem.,1998,63,2778；A.A Koshkin等人，J.Am.Chem.Soc.1998,120,13252-53；Kumar等人Bioorg,& Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；及S.Obika等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1999,515。令人感興趣的是，向寡核苷酸 序列中納入含有2’-O,4’-C-亞甲基橋之LNA單元導致經修飾之寡核苷酸之雜交穩定性之空前改良(參見上文及例如S.K.Singh等人，Chem.Commun,1998,455)。包含2’-O,4’-C-亞甲基橋(LNA)單元亦及相應2’-硫基-LNA(硫基-LNA)、2’-HN-LNA(胺基-LNA)及2’-N(R)-LNA(胺基-R-LNA)類似物之寡核苷酸與互補DNA及RNA形成具有先前針對二環及三環核苷修飾之寡核苷酸未觀察到之熱穩定性的雙螺旋。每修飾形式之Tm增加自+3℃至+11℃變化，且此外，亦改良選擇性。無其他DNA類似物可重現地顯示對核酸之該高親和力。
在特定態樣中，本發明係關於B型肝炎病毒(HBV)療法。B型肝炎係由B型肝炎病毒(HBV)引起之病毒疾病。其係藉由污染物質(例如血液及血液產品、污染針)、性及自感染或攜帶者母體至其後代垂直、非經腸傳播。在其中常見該疾病的世界之彼等區域中，幼年時之垂直傳播導致高比例之感染個體變成B型肝炎之長期攜帶者。世界衛生組織(World Health Organization)估計在世界範圍內20億以上人受感染，其中每年約400萬急性病例，每年100萬死亡，且3.5-4億為長期攜帶者。約25%攜帶者死於慢性肝炎、硬化或肝癌且幾乎75%長期攜帶者係亞洲人。B型肝炎病毒係次於菸草之第二最顯著致癌物，引起60%至80%之所有原發性肝癌。HBV之傳染性係HIV之100倍。
B型肝炎病毒(HBV)係包膜之部分雙鏈DNA病毒。緻密3.2kb HBV基因體由四個重疊開放閱讀框(ORF)組成，該等開放閱讀框編碼核心、聚合酶(Pol)、包膜及X蛋白。Pol ORF最長且包膜ORF位於其中，而X及核心ORF與Pol ORF重疊。HBV之生命週期具有兩個主要事件：1)自松環DNA(RC DNA)生成閉環DNA(cccDNA)，及2)前基因體RNA(pgRNA)反轉錄以產生RC DNA。在宿主細胞感染之前，HBV基因體以RC DNA形式存於病毒體內。已確定HBV病毒體能夠藉由非特異性結合至人類肝細胞表面上存在之帶負電之蛋白多糖及經由 HBV表面抗原(HBV sAg)之特異性結合獲得進入宿主細胞之入口。一旦病毒體進入細胞，則病毒核心及衣殼化RC DNA由宿主因子經由核定位信號經由Impβ/Impα核轉運受體轉運至核中。在核內部，宿主DNA修復酶將RC DNA轉化成cccDNA。cccDNA用作所有病毒mRNA之模板，且因此負責感染個體中之HBV持久性。將自cccDNA產生之轉錄物分成兩類；pgRNA及亞基因體RNA。亞基因體轉錄物編碼三種包膜(L、M及S)及X蛋白，且pgRNA編碼前核心、核心及Pol蛋白。 HBV基因表現或HBV RNA合成之抑制導致HBV病毒複製及抗原產生之抑制。舉例而言，顯示IFN-α藉由減少前基因組RNA(pgRNA)及亞基因體RNA自HBV共價閉環DNA(cccDNA)微型染色體之轉錄來抑制HBV複製及病毒HBsAg產生。所有HBV病毒mRNA皆經封端及聚腺苷酸化，且隨後輸出至細胞質用於轉譯。在細胞質中，起始新病毒體之裝配且利用病毒Pol封裝新生pgRNA，以使可開始經由單鏈DNA中間體之pgRNA反轉錄成RC DNA。含有RC DNA之成熟核酸蛋白殼經細胞脂質及病毒L、M及S蛋白包膜且隨後感染HBV粒子藉由在細胞內膜處芽生隨後釋放。令人感興趣的是，亦產生非感染粒子，其數目大大超過感染病毒體。該等包膜空粒子(L、M及S)稱作亞病毒粒子。重要的是，由於亞病毒粒子與感染粒子共享相同包膜蛋白，故推測其用作宿主免疫系統之引誘物且已用於HBV疫苗。S、M及L包膜蛋白係自含有三個不同起始密碼子之單一ORF表現。所有三種蛋白在其C末端處共享226aa序列，即S-結構域。M及L具有額外前-S結構域，分別為前-S2及前-S2及前-S1。然而，S-結構域具有HBsAg表位。
B型肝炎病毒感染係持續之醫學問題，此乃因與任何快速複製傳染原一樣，存在有助於HBV之亞群對當前治療方案具有抗性之持續突變。當前，由American Association for the Study of Liver Diseases(AASLD)及European Association for the Study of the Liver(EASL)推 薦之用於慢性HBV感染之療法包括干擾素α(INFa)、聚乙二醇化干擾素α-2a(Peg-IFN2a)、恩替卡韋(entecavir)及泰諾福韋(tenofovir)。然而，典型干擾素療法係48週且產生嚴重且令人討厭之副作用，且停止療法後24週之HBeAg血清轉化介於僅27%至36%範圍內。HBsAg之血清轉化甚至更低-在治療停止後僅3%立刻觀察到，且5年後向上增加至12%。
由肝細胞及/或肝內免疫細胞因應HBV感染之抗病毒細胞介素之分泌在感染肝之病毒清除中起關鍵作用。然而，由於由病毒採取以抵抗宿主細胞識別系統及後續抗病毒反應之各種逸出策略，慢性感染患者僅展示弱免疫反應。
許多觀察顯示若干HBV病毒蛋白可藉由干擾病毒識別信號傳導系統及隨後干擾干擾素(IFN)抗病毒活性抵抗初始宿主細胞反應。其中，HBV空亞病毒粒子(SVP、HBsAg)之過度分泌可參與維持慢性感染患者(CHB)中觀察之觀察之免疫耐受狀態。具體而言，SVP可促使不存在由樹突細胞抗原呈遞以及缺乏HBV特異性T細胞免疫活化以使得病毒持續。HBsAg量化係用以預測感染結果之顯著生物標記；然而，在慢性感染患者中極少觀察到達成HBsAg血清轉化。認為SVP及HBsAg負荷降低係恢復抗病毒免疫功能之路徑，且抗病毒療法後血清轉化成HBsAg陰性可視為作為功能治癒之指示且仍為療法之最終目標。因此，靶向導致CHB患者中HBsAg以及HBV DNA含量降低之HBV基因表現可顯著改良CHB患者免疫重新活化及緩解。
核苷及核苷酸療法恩替卡韋及泰諾福韋成功降低病毒負荷，但HBeAg血清轉化之比率及HBsAg損失甚至低於彼等使用IFNa療法獲得者。亦使用其他類似療法(包括拉米夫定(lamivudine)(3TC)、替比夫定(telbivudine)(LdT)及阿德福韋(adefovir))，一般核苷/核苷酸療法除外，抗性之出現限制治療效能。
US 8,598,334及WO 2012/145697提及反義寡核苷酸之使用以靶向HBV。
病毒感染之控制需要緊密監督宿主先天免疫系統，其可在感染後數分鐘至數小時內反應以影響病毒之初始生長並限制長期且持續感染之發生。儘管基於IFN及核苷(核苷酸)類似物之可用當前治療，但B型肝炎病毒(HBV)感染仍為世界範圍內之主要健康問題，其涉及估計3.5億具有肝硬化及肝細胞癌之較高風險之長期攜帶者。
需要新抗病毒療法，具體而言抗HBV療法。亦需要具有使得能夠靶向不同類型之HBV基因型之治療策略。
本發明係關於適用於醫學、例如治療病毒病症之寡聚物結合物、其用途、其使用方法。
具體而言，本發明提供適用於治療病毒病症之寡聚物或寡聚物結合物，其中該寡聚物或寡聚物結合物之該寡聚物能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列。在某些實施例中，載劑組份結合至寡聚物。
本發明提供如本文中所定義寡聚物或寡聚物結合物，其中寡聚物結合物之寡聚物或寡聚物組份包含至少6個、較佳至少7個、較佳至少8個、較佳至少9個、較佳至少10個單元、較佳至少11個單元、較佳至少12個單元、較佳至少13個單元、較佳至少14個單元、較佳至少15個單元、較佳至少16個單元，該等單元與對應於HBV HBx基因或HBsAg基因之區域或編碼HBV HBx或HBV HBsAg之核酸之靶區域之反向補體至少80%一致、較佳至少85%一致、較佳至少90%一致、較佳至少91%一致、較佳至少92%一致、較佳至少93%一致、較佳至少94%一致、較佳至少95%一致、較佳至少96%一致、較佳至少97%一致、較佳至少98%一致、較佳至少99%一致、較佳一致。
本發明提供如本文中所定義寡聚物或寡聚物結合物，其中寡聚物結合物之寡聚物或寡聚物組份包含至少6個、較佳至少7個、較佳至少8個、較佳至少9個、較佳至少10個單元，該等單元與對應於HBV HBx基因或HBsAg基因之區域或編碼HBV HBx或HBV HBsAg之核酸之靶區域之反向補體一致。
對於某些實施例而言，本發明提供如本文中所定義寡聚物或寡聚物結合物，其中寡聚物結合物之寡聚物或寡聚物組份包含小於20個單元，例如小於19個單元，例如小於18個單元，例如小於17個單元，例如16個或更少單元。
對於某些實施例而言，本發明提供如本文中所定義寡聚物或寡聚物結合物，其中寡聚物結合物之寡聚物或寡聚物組份包含15個單元或16個單元。
本發明提供包含本發明之寡聚物及至少一個共價附接至該寡聚物之非核苷酸或非多核苷酸部分的結合物。
本發明提供包含本發明之寡聚物或結合物及醫藥上可接受之稀釋劑(例如水或鹽水)、載劑、鹽或佐劑之醫藥組合物。
本發明提供本發明之寡聚物或結合物，其用作用於(例如)治療病毒病症之藥劑。
本發明提供本發明之寡聚物或結合物之用途，其用於製造用於治療病毒病症之藥劑。
本發明提供治療病毒病症之方法，該方法包含向患有或可能患有病毒病症之動物(例如患有或易患該疾病或病症之動物)投與有效量之本發明之寡聚物、寡聚物結合物或醫藥組合物。
本發明提供治療病毒病症之方法，該方法包含向患有或可能患有病毒病症之非人類動物(例如患有或易患該疾病或病症之非人類動物)投與有效量之本發明之寡聚物、寡聚物結合物或醫藥組合物。
本發明提供治療病毒病症之方法，該方法包含向患有或可能患有病毒病症之人類患者(例如患有或易患該疾病或病症之人類患者)投與有效量之本發明之寡聚物、寡聚物結合物或醫藥組合物。
亦揭示治療懷疑患有或易患與HBx或HBsAg之表現或過表現相關之疾病或病況之動物(非人類動物或人類)的方法，其係藉由向該非人類動物或人類投與治療或預防有效量之本發明之寡聚物、結合物或醫藥組合物中之一或多者來達成。此外，提供使用寡聚物抑制HBx或HBsAg之表現及治療與HBx或HBsAg之活性相關之疾病的方法。
本發明進一步提供包含本發明之醫藥組合物及額外醫藥實體/治療實體的醫藥系統。額外醫藥實體可為本發明之寡聚物或寡聚物結合物。額外醫藥實體可為能夠調節HBV中並不在HBx或HBsAg內之靶序列的寡聚物或寡聚物結合物。舉例而言，至少一種寡聚物或寡聚物結合物可能夠調節基因或mRNA內用於HBV HBsAg、HBeAg或DNA聚合酶之靶序列
在一個實施例中，向需要治療之個體投與複數種本發明之寡聚物或結合物。寡聚物或結合物可與額外醫藥劑/治療劑一起投與。
在一個實施例中，該疾病或病症或病況與HBx或HBsAg之過表現相關。
本發明提供調節細胞或組織中之HBx或HBsAg之表現的方法，該方法包含如下步驟：使活體外或活體內細胞或組織與有效量之一或多種寡聚物、結合物或其醫藥組合物接觸以實現HBx或HBsAg之表現之調節。
本發明提供抑制(例如，藉由下調)細胞或組織中之HBx之表現的方法，該方法包含如下步驟：使活體外或活體內細胞或組織與有效量一或多種寡聚物、結合物或其醫藥組合物接觸以實現HBx或HBsAg之表現之下調。
本發明提供抑制表現HBx或HBsAg之細胞中之HBx或HBsAg的方法，該方法包含向該細胞投與本發明之寡聚物或結合物以便影響該細胞中之HBx或HBsAg之抑制。
進一步提供下調細胞或組織中之HBx或HBsAg之表現的方法，其包含使活體外或活體內該等細胞或組織與有效量之一或多種本發明之寡聚物、寡聚物結合物或組合物接觸。
現提供本發明之態樣。
在一個態樣中，本發明提供用於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份。較佳地，用於將該第一寡聚物遞送至肝。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份。較佳地，用於將該第一寡聚物遞送至肝。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之組合物，其中該組合物包含寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份。較佳地，用於將該第一寡聚物遞送至肝。
在一個態樣中，本發明提供與選自由以下位置中之任一或多者組成之群之靶序列雜交之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份：SEQ ID NO：3之1530至1598、1264-1278及670至706。
在一個態樣中，本發明提供基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序的寡聚物：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)，其能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列以治療病毒病症。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之組合物，其中該組合物包含寡聚物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物包含至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳 HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症。
在一個態樣中，本發明提供治療病毒病症之方法，該方法包含向需要治療之個體投與有效量之本發明之寡聚物結合物。
在一個態樣中，本發明提供治療病毒病症之方法，該方法包含向需要治療之個體投與有效量之本發明之組合物。
在一個態樣中，本發明提供治療病毒病症之方法，該方法包含向需要治療之個體投與有效量之本發明之寡聚物。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明之寡聚物結合物及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑的醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明之組合物及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑的醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明之寡聚物及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑的醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供包含本發明之醫藥組合物及額外醫藥實體的醫藥系統。
在一個態樣中，本發明提供選自由以下中之任一或多者組成之群之基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；其用於構築本發明之寡聚物結合物。
在一個態樣中，本發明提供選自由以下中之任一或多者組成之群之基序：NO：13)GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)及CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)，其用於構築本發明之組合 物。
在一個態樣中，本發明提供選自由以下中之任一或多者組成之群之基序：AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)及AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)，其用於構築本發明之寡聚物。
在一個態樣中，本發明提供製造本發明之寡聚物結合物之方法，其包含使一或多種本發明之寡聚物與本發明之載劑組份結合。
在一個態樣中，本發明提供製造本發明之組合物之方法，其包含混合本發明之寡聚物結合物與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。
本發明之定義/要素
下文提供適於本發明之所有態樣之術語之定義。該等定義並不相互排他。該等定義亦教示與本發明之所有態樣有關之其他實施例。
寡聚物/寡核苷酸
在本發明之上下文中，在提及如本文中所用「寡聚物」及「寡核苷酸」時亦適於第一寡聚物區域及/或第二寡聚物區域-例如在第一寡聚物區域在寡聚物結合物中時或在其並不呈游離形式時(即在不在寡聚物結合物中時)。
術語「寡聚物」係指由兩個或更多個核苷酸之共價連接形成之分子(即寡核苷酸)。因此，如本文所用術語「寡聚物」及「寡核苷酸」可互換且具有相同含義。在本文中，單一核苷酸(單元)亦可稱作單體或單元。在一些實施例中，術語「核苷」、「核苷酸」、「單元」及「單體」可互換使用。應認識到，在提及核苷酸或單元之序列時，所提及者係鹼基(例如A、T、G、C或U)之序列。
如本文所用術語「寡聚物」及「寡核苷酸」包括天然及/或經修 飾單元或連接之線性或環狀寡聚物，包括去氧核糖核苷、核糖核苷、其經取代及α-變旋異構形式、肽核酸(PNA)及諸如此類，其能夠藉助單元-對-單元相互作用之規則型式(例如Watson-Crick型鹼基配對、Hoogsteen或逆Hoogsteen型鹼基配對或諸如此類)特異性結合至靶多核苷酸。
寡核苷酸可由單一區域組成或可由若干區域組成。寡核苷酸可為「嵌合」寡核苷酸，亦即，由不同區域組成。在本發明之上下文中，「嵌合」反義化合物係反義化合物、具體而言寡核苷酸，其含有兩個或更多個化學區域，例如DNA區域、RNA區域、PNA區域等。在寡核苷酸化合物之情形下，每一化學區域係由至少一個單元(亦即，核苷酸)組成。該等寡核苷酸通常含有至少一個對寡核苷酸進行修飾以顯示一或多種期望性質之區域。寡核苷酸之期望性質可為對核酸酶降解之抗性增加、細胞攝取增加及/或對靶核酸之結合親和力增加。因此，寡核苷酸之不同區域可具有不同性質。寡核苷酸之一或多個區域可用作能夠裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜合體之酶之受質。存在若干具有催化效應之酶。在特定位置處用反義寡核苷酸及RNA酶H消解RNA之方法已由Minshull等人(Nucleic Acids Research,14：6433-6451(1986))展示。RNA酶H係裂解RNA：DNA雙螺旋之RNA鏈之細胞內切核酸酶。因此，RNA酶H之活化引起RNA靶標之裂解。因此，可能增強基因表現之寡核苷酸抑制之效率。能夠裂解之其他酶係RNA酶L及RNA酶P。
核鹼基
術語「核鹼基」係指核苷酸之鹼基部分且涵蓋天然以及非天然變體。
因此，「核鹼基」不僅涵蓋已知嘌呤及嘧啶雜環，且亦涵蓋其雜環類似物及互變異構物。
核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
在一些實施例中，寡聚物中存在之核鹼基中之至少一者係選自由以下組成之群之經修飾之核鹼基：5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
單元
如本文所用術語「單元」或「單體」通常指示藉由磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小介於數個單體單元(例如，約3-4個)至約數百個單體單元範圍內之寡核苷酸的核苷單體。磷酸二酯連接之類似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、胺基磷酸酯及諸如此類。
核苷及核苷類似物
在一些實施例中，術語「核苷類似物」及「核苷酸類似物」可互換使用。
如本文所用術語「核苷酸」係指包含糖部分、鹼部分及共價連接基團(連接基團)(例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸間連接基團)之糖苷，且涵蓋天然核苷酸(例如DNA或RNA)及非天然核苷酸(包含經修飾之糖及/或鹼部分)，其在本文中亦稱作「核苷酸類似物」。本文中之單一核苷酸(單元)亦可稱作單體或核酸單元。
在生物化學領域中，術語「核苷」通常用於指包含糖部分及鹼部分之糖苷，且因此在指核苷酸單元時可使用，該等核苷酸單元在寡聚物之核苷酸之間由核苷酸間連接共價連接。
在生物技術領域中，術語「核苷酸」通常用於指核酸單體或單 元，且因此在寡核苷酸之上下文中可指鹼-例如「核苷酸序列」-且通常可指核鹼基序列(即糖主鏈及核苷間連接之存在係隱含的)。
同樣，尤其在一或多個核苷間連接基團經修飾之寡核苷酸之情形下，術語「核苷酸」可指「核苷」，例如即使在指定核苷之間之連接之存在或性質時，亦可使用術語「核苷酸」。
如由彼等熟習此項技術者應認識到，寡核苷酸之5’末端核苷酸不包含5’核苷酸間連接基團，但可包含或可不包含5’末端基團。
非天然核苷酸包括具有經修飾之糖部分之核苷酸，例如二環核苷酸或2’修飾之核苷酸，例如2’取代之核苷酸。
「核苷酸類似物」係藉助糖及/或鹼部分之修飾之天然核苷酸之變體，例如DNA或RNA核苷酸。在寡核苷酸上下文中，類似物原則上可僅對天然核苷酸「沉默」或與其「等效」，亦即，對寡核苷酸工作以抑制靶基因表現之方式無功能效應。然而，若該等「等效」類似物(例如)製造起來較容易或較廉價，或對於儲存或製造條件更穩定，或代表標籤或標記，則其可有用。較佳地，然而，類似物應對寡聚物工作以抑制表現之方式具有功能效應；例如藉由產生對靶標之增加結合親和力及/或對細胞內核酸酶之增加抗性及/或增加易於轉運至細胞中。核苷類似物之具體實例由(例如)Freier及Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443及Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213及圖4中提供之方案1闡述。
連接體/連接體基團等
術語「連接體基團」、「連接基團」、「連接體」、「連接體分子」或「核苷間連接」欲指能夠將兩個實體(例如核苷酸)共價偶合在一起之基團。具體實例包括磷酸酯基團及硫代磷酸酯基團。該等連接體可含有共價附接至一或多個活化基團或官能基之間隔體分子。視情況，可用偶合劑處理連接體分子之官能基以形成活化基團。該等連 接體亦包括如本文中所述系鏈分子。
術語「支鏈區域」欲指能夠使兩個或更多個實體(例如核苷酸)共價偶合在一起或用於生成載劑組份簇(例如半乳糖簇)之基團或區域。
或者，如本文中所述「連接體基團」及「支鏈區域」可用於共價偶合核苷酸區域與非核苷酸區域，該連接體基團稱作L。舉例而言，連接體基團可用於將本發明寡聚物結合至本文所述載劑組份。舉例而言，支鏈區域可用於將本發明寡聚物結合至本文所述一或多種載劑組份。舉例而言，支鏈區域可用於將一或多種本發明寡聚物結合至本文所述載劑組份。舉例而言，支鏈區域可用於將一或多種本發明寡聚物結合至一或多種本文所述載劑組份。
寡聚物結合物
術語「寡聚物結合物」意欲指示藉由將如本文中所述寡聚物附接(「結合」)、例如共價附接至載劑組份形成之異源分子。
連接、例如共價結合(例如)在與(例如)報導基因分子(例如綠色螢光蛋白、β-半乳糖苷酶、Histag等)之融合蛋白中之性質可為化學的(例如經由連接體基團)或其性質可為遺傳的(例如藉由重組遺傳技術)。或者，寡聚物可直接結合至載劑組份而無需任何系鏈分子或連接體基團。
載劑組份
如本文所用術語「載劑組份」係關於意欲將本發明寡聚物攜帶或傳送至其期望位置(例如期望解剖位置)之分子媒劑。
本發明之載劑組份可用於增強寡聚物之活性、細胞分佈及/或細胞攝取。
可使用任何適宜載劑組份。
載劑組份可為多核苷酸。然而，通常，載劑組份係非核苷酸部分或非多核苷酸部分。
非核苷酸或非多核苷酸部分之實例包括選自由以下組成之群之巨分子試劑：碳水化合物、細胞表面受體配體、原料藥、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白質或其組合。典型聚合物可為聚乙二醇及/或聚丙二醇(PPG)。
在一些實施例中，載劑組份可為胺基酸、蛋白質、肽或多肽。 通常，蛋白質可為經設計以結合期望靶抗原之酶、血清蛋白(例如人類血清白蛋白(HSA)、轉鐵蛋白或糖蛋白)、受體、抗體或其抗體衍生物(如單鏈可變片段、雙特異性抗體、三價抗體等)。
肽載劑組份之實例係聚(L-離胺酸)(其顯著增加細胞滲透)及觸角足轉運肽。該等結合物由Lemaitre等人，「Specific antiviral activity of a poly(L-lysine)-conjugated oligodeoxyribonucleotide sequence complementary to vesicular stomatitis virus N protein mRNA initiation site」Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：648-652,1987；美國專利第6,166,089號及第6,086,900號闡述。上述公開案中之程序要求3'-末端核苷酸為核糖核苷酸。隨後藉由席夫鹼(Schiff base)形成將所得醛基團隨機偶合至聚(L-離胺酸)之離胺酸殘基之ε-胺基，且隨後用氰基硼氫化鈉還原。此程序將3'-末端核糖環轉化成嗎啉結構反義寡聚物。肽區段亦可藉由與DNA/RNA合成相容之策略(例如Mmt/Fmoc策略)合成。在該情形下，肽可在寡核苷酸區段之前或之後直接合成。亦存在在合成後藉由(例如)形成二硫橋製備肽寡核苷酸結合物的方法。
在一些實施例中，結合物部分可為或包含親脂性結合物部分。 親脂性結合物部分可選自由以下組成之群：固醇、烷醇、類固醇、多環芳香族基團、脂肪族基團、脂質、磷脂、親脂性醇、脂肪酸及脂肪酯。在一些實施例中，結合物部分包含膽固醇。
載劑組份可為或包含藥物動力學調節劑，例如親脂性或疏水性部分。在siRNA結合物之上下文中，該等部分揭示於WO2012/082046 中。疏水性部分可包含C8-C36脂肪酸，其可為飽和或不飽和的。在一些實施例中，可使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32及C34脂肪酸。疏水基團可具有16或更多個碳原子。實例性適宜疏水基團可選自包含以下之群：固醇、膽固醇、棕櫚醯基、十六-8-烯醯基、油基、(9E,12E)-十八-9,12-二烯醯基、二辛醯基及C16-C20醯基。根據WO2012/082046，具有少於16個碳原子之疏水基團在增強多核苷酸靶向中較不有效，但其可用於多個拷貝(例如2×，例如2×C8或C10、C12或C14)中以增強效能。用作多核苷酸靶向部分之藥物動力學調節劑可選自由以下組成之群：膽固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可為直鏈、具支鏈或環狀。藥物動力學調節劑較佳係僅含有碳及氫原子之烴。然而，可允許維持疏水性之取代或雜原子，例如氟。
WO2007/031091提供其他適宜配體及載劑組份之實例，其以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，載劑組份係或包含碳水化合物部分。碳水化合物結合物部分包括(但不限於)半乳糖、乳糖、n-乙醯基半乳胺糖、甘露糖及甘露糖-6-磷酸酯。碳水化合物結合物可用於增強多種組織(例如肝及/或肌肉)中之遞送或活性。參見(例如)EP1495769,WO99/65925,Yang等人，Bioconjug Chem(2009)20(2)：213-21.Zatsepin及Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10)：1401-17。
另外，寡聚物可進一步包含一或多個額外結合物部分，其中親脂性或疏水性部分尤其令人感興趣。該等結合物部分可(例如)用作藥物動力學調節劑，且可共價連接至碳水化合物結合物、將碳水化合物結合物連接至寡聚物之連接體或連接多種碳水化合物結合物(多價)結合物之連接體，或可視情況經由連接體(例如生理上不穩定之連接體)連接至寡聚物。
在一些實施例中，載劑組份包含具有與半乳糖相等或較大親和力之去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)靶向部分。ASPG-R靶向部分可選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖。在一些實施例中，去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分係單價。在其他實施例中，載劑組份包含半乳糖簇，例如二價、三價或四價去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分(即含有1、2、3或4個能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體之末端碳水化合物部分)。 在一些實施例中，載劑組份包含GalNAc(N-乙醯基半乳胺糖)，例如單價、二價、三價或四價GalNAc。GalNAc結合物可用於將化合物靶向肝。較佳載劑組份係N-乙醯基半乳胺糖三聚物。GalNAc結合物已與甲基膦酸酯及PNA反義寡核苷酸(例如US 5,994517及Hangeland等人，Bioconjug Chem.1995年11月至12月；6(6)：695-701)及siRNA(例如WO2009/126933、WO2012/089352及WO2012/083046)且與LNA及2'-MOE修飾之核苷(WO 2014/076196、WO 2014/207232、WO 2014/179620及WO 2014/179627)一起使用。GalNAc參考文獻及其中使用之具體結合物以引用方式併入本文中。WO2012/083046揭示具有GalNAc結合物部分之siRNA，該等結合物部分包含可裂解之藥物動力學調節劑，其適用於本發明中，較佳藥物動力學調節劑係C16疏水基團，例如棕櫚醯基、十六-8-烯醯基、油基、(9E,12E)-十八-9,12-二烯醯基、二辛醯基及C16-C20醯基。WO2012/083046之可裂解之藥物動力學調節劑亦可為膽固醇。
載劑組份可選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異-丁醯基半乳胺糖、半乳糖簇及N-乙醯基半乳胺糖三聚物且可具有選自由以下組成之群之藥物動力學調節劑：具有16或更 多個碳原子之疏水基團、具有16至20個碳原子之疏水基團、棕櫚醯基、十六-8-烯醯基、油基、(9E,12E)-十八-9,12二烯醯基、二辛醯基及C16-C20醯基及膽固醇。揭示於‘046中之某些GalNac簇包括：(E)-十六-8-烯醯基(C16)、油基(C18)、(9,E,12E)-十八-9,12-二烯醯基(C18)、辛醯基(C8)、十二醯基(C12)、C-20醯基、C24醯基、二辛醯基(2×C8)。載劑組份-藥物動力學調節劑可經由生理上不穩定之鍵或例如二硫鍵(PO-連接體)或PEG連接體連接至多核苷酸。本發明亦係關於寡聚物與載劑組份之間之磷酸二酯連接體(適宜地位於寡聚物與碳水化合物結合物基團之間)的用途。
在本發明之一個實施例中，寡聚物連接、較佳結合至載劑組份，其可用於藉由(例如)增加寡聚物之細胞攝取將寡聚物遞送至個體之肝。
在具體實施例中，載劑組份可為GalNAc或GalNAc簇。圖2及3提供一些載劑組份。
對於靶向肝中之肝細胞，較佳靶向配體係半乳糖簇。
半乳糖簇包含具有(例如包含)2至4個末端半乳糖衍生物之分子。 如本文所用術語半乳糖衍生物包括半乳糖及對ASGP-R具有等於或大於半乳糖之親和力之親和力的半乳糖之衍生物。末端半乳糖衍生物經由其C-1碳附接至分子。ASGP-R對於肝細胞係獨特的且結合具支鏈半乳糖-末端糖蛋白。較佳半乳糖簇具有三個末端半乳胺糖或半乳胺糖衍生物，其各自對去唾液酸糖蛋白受體具有親和力。更佳半乳糖簇具有末端N-乙醯基-半乳胺糖。業內常見之其他術語包括三觸角半乳糖、三價半乳糖及半乳糖三聚物。已知三觸角半乳糖衍生物簇以較二-觸角或單-觸角半乳糖衍生物結構大之親和力結合至ASGP-R(Baenziger及Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等人，1982,1.Biol.Chern.,257,939-945)。需要多價以達成nM親和力。
較佳半乳糖衍生物係N-乙醯基-半乳胺糖(GalNAc)。對去唾液酸糖蛋白受體具有親和力之其他糖可選自包含以下之列表：半乳胺糖、N-正-丁醯基半乳胺糖及N-異-丁醯基半乳胺糖。已研究多種半乳糖衍生物對去唾液酸糖蛋白受體之親和力(例如，參見：Jobst,S.T.及Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或其係使用業內典型方法容易地測定。
半乳糖簇可包含兩個或較佳三個半乳糖衍生物，其各自連接至中心分支點。半乳糖衍生物經由糖之C-1碳附接至中心分支點。半乳糖衍生物較佳經由連接體或間隔體連接至分支點。較佳間隔體係撓性親水性間隔體(美國專利5885968；Biessen等人，J.Med.Chern.1995，第39卷，第1538-1546頁)。較佳撓性親水性間隔體係PEG間隔體。較佳PEG間隔體係PEG3間隔體(三個伸乙基單元)。分支點可為允許三個半乳糖衍生物附接且進一步允許分支點附接至寡聚物之任何小分子。GalNAc簇中之每一半乳糖衍生物(碳水化合物部分)(例如GalNAc)可經由間隔體(例如(聚)乙二醇連接體(PEG)，例如二-、三-、四-、五-、六-乙二醇連接體)接合至寡聚物。PEG部分可在半乳糖衍生物糖部分與肽(顯示二-離胺酸)連接體之間形成間隔體。實例性分支點基團係二-離胺酸。二-離胺酸分子含有三個胺基團(經由其可附接三個半乳糖衍生物)及羧基反應基團(經由其，二-離胺酸可附接至寡聚物)(例如參見圖4)。
碳水化合物結合物(例如GalNAc)或碳水化合物-連接體部分(例如碳水化合物-PEG部分)可經由分支點基團(例如胺基酸或肽，其適宜地包含兩個或更多個胺基(例如3、4或5個)，例如離胺酸、二-離胺酸或三-離胺酸或四-離胺酸)共價接合(連接)至寡聚物。三-離胺酸分子含有四個胺基團，經由其可附接三個碳水化合物結合物基團(例如半乳糖及衍生物(例如GalNAc)及又一結合物，例如疏水或親脂性部分/基 團)及羧基反應基團(經由其，三-離胺酸可附接至寡聚物)。又一結合物(例如親脂性/疏水性部分)可附接至離胺酸殘基，該離胺酸殘基附接至寡聚物。
在一些實施例中，GalNac簇包含肽連接體，例如Tyr-Asp(Asp)三肽或Asp(Asp)二肽，其經由二基團連接體附接至寡聚物，例如GalNac簇可包含二基團連接體，例如彼等於圖3中闡釋為結合物3、3a、4及4a者。
替代支鏈分子可選自由以下組成之群：1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1920-xx)、參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1922-xx)、參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]亞甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲基氧基)戊基醯胺基]-3-[5-茀并甲氧基-羰基-氧基-戊基醯胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1925-xx)。 WO 2014/179620及歐洲申請案第14188444.5號闡述各種GalNAc結合物部分之生成(以引用方式併入本文中)。分支點與寡聚物之附接可經由連接體或間隔體發生。較佳間隔體係撓性親水性間隔體。較佳撓性親水性間隔體係PEG間隔體或C6連接體、較佳PEG間隔體係PEG3間隔體(三個伸乙基單元)。在較佳實施例中，連接體係生理上不穩定之連接體。半乳糖簇可使用業內已知之方法附接至寡聚物之3'或5'端。 在較佳實施例中，去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分連接至之寡核苷酸5’端。
較佳半乳糖簇包含經由PEG間隔體連接至二-離胺酸支鏈分子之三個末端GalNAc部分(GalNAc簇)。較佳地，PEG間隔體係3PEG間隔 體。較佳GalNAc簇係結合物1、1a、2及2a。最佳係結合物2a(亦稱作GalNAc2)。
半乳糖簇提供於圖3中。
載劑組份連接體
載劑組份可藉助連接體(L)連接至第一寡聚物區域及/或第二寡聚物區域。可使用任一適宜連接體。
碳水化合物結合物(例如GalNAc)可經由生物可裂解之連接體(亦稱作生理上不穩定之連接體)連接至寡聚物。
如本文所用，生理上不穩定之鍵係在通常遇到之條件或類似於彼等於哺乳動物體內遇到之條件下可裂解之不穩定鍵(亦稱作生理上不穩定之連接體)。生理上不穩定之連接基團經選擇，使得在某些生理條件中存在時，其經歷化學轉變(例如，裂解)。哺乳動物細胞內條件包括化學條件，例如哺乳動物細胞中發現或類似於彼等於哺乳動物細胞中遇到者之pH、溫度、氧化或還原條件或試劑及鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括存在通常在哺乳動物細胞中存在之酶活性，例如來自蛋白水解或水解酶。
化學轉變(不穩定鍵之裂解)可藉由向細胞中添加醫藥上可接受之試劑來起始或在含有不穩定鍵之分子達成適當細胞內及/或細胞外環境時，可自發發生。舉例而言，在分子進入酸化胞內體時，pH不穩定鍵可裂解。因此，可將pH不穩定鍵視為胞內體可裂解之鍵。在暴露於酶(例如彼等存於胞內體或溶酶體或細胞質中者)時，酶可裂解之鍵可裂解。在分子進入細胞質之更具還原性環境時，二硫鍵可裂解。 因此，可將二硫化物視為細胞質可裂解之鍵。如本文所用，pH-不穩定鍵係在酸性條件(pH<7)下選擇性斷裂之不穩定鍵。該等鍵亦可稱作胞內體不穩定鍵，此乃因細胞胞內體及溶酶體具有小於7之pH。另一生理上不穩定之連接體之實例係如圖3中之GalNAc簇中所用之二-離 胺酸。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物包含生理上不穩定之連接體(區域PL，亦稱作生物可裂解之連接體或核酸酶易感性連接體)，其將本發明之寡聚物(區域A)接合至載劑組份(或區域C)。
對於與用於靶向遞送之載劑組份相關之生理上不穩定之連接體，較佳地，靶組織(例如肌肉、肝、腎或腫瘤)中觀察到之裂解速率大於血清中所發現者。適於測定靶組織對血清中之裂解程度(%)之方法闡述於「組織特異性活體外連接體裂解分析」部分中。在一些實施例中，在「材料及方法」部分中之「組織特異性活體外連接體裂解分析」中，本發明化合物中之生理上不穩定之連接體(亦稱作生物可裂解之連接體或核酸酶易感性連接體)至少約20%裂解，例如至少約30%裂解，例如至少約40%裂解，例如至少約50%裂解，例如至少約60%裂解，例如至少約70%裂解，例如至少約75%裂解。在一些實施例中，如「組織特異性活體外連接體裂解分析」中所用之血清中之裂解率(%)小於約20%，例如小於約10%，例如小於5%，例如小於約1%。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物包含三個區域：i)第一區域(區域A)，其包含10至18個鄰接核苷酸；ii)第二區域(區域PL)，其包含生理上不穩定之連接體，及iii)第三區域(C)，其包含載劑組份，其中第三區域共價連接至第二區域，該第二區域共價連接至第一區域。
在一些實施例中，經由磷酸酯核苷連接(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯)或三唑基團共價連接區域A及區域PL。在一些實施例中，經由磷酸酯核苷連接(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯)或三唑基團共價連接區域PL及區域C。在一些實施例中，經由第二連接體(例如下述區域E連接體)共價連接區域PL及區域C。
在一些實施例中，生理上不穩定之連接體可位於寡聚物(區域A)之5’端及/或3’端。在較佳實施例中，生理上不穩定之連接體係於5’端處。
在一些實施例中，生理上不穩定之連接體於其3’端處附接至區域A之5’端且載劑組份(區域C)視情況經由額外連接體區域E附接至5’端或生理上不穩定之連接體(例如PO-連接體)。
核酸酶易感性連接體-磷酸二酯連接體(PO-連接體)
在一些實施例中，生理上不穩定之連接體對可(例如)在靶細胞中表現之核酸酶易感-且因此，如本文中詳述，連接體可為短區域(例如1-10)磷酸二酯連接之核苷，例如DNA核苷。
在可相同或不同之一些實施例中，生理上不穩定之連接體(區域PL)對S1核酸酶裂解易感。可使用「S1核酸酶裂解分析」部分中所述之S1核酸酶分析評估對S1裂解之易感性。在一些實施例中，如「材料及方法」部分中之「S1核酸酶裂解分析」中所述，在與S1核酸酶一起培育120min後，本發明化合物中之生理上不穩定之連接體(亦稱作生理上不穩定之連接體或核酸酶易感性連接體)(例如區域PL)至少約30%裂解，例如至少約40%裂解，例如至少約50%裂解，例如至少約60%裂解，例如至少約70%裂解，例如至少約80%裂解，例如至少約90%裂解，例如至少95%裂解。
在一些實施例中，生理上不穩定之連接體(區域PL)係核酸酶易感性連接體，其包含介於1個與10個之間的核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷、更佳介於2個與6個之間的核苷且最佳介於2個與4個之間的連接核苷。在一些實施例中，核酸酶易感性連接體係磷酸二酯核苷酸連接體，該連接體亦稱作PO-連接體。在較佳實施例中，核酸酶易感性連接體(PO-連接體)包含至少一個磷酸二酯連接核苷。較佳地，核酸酶易感性PO-連接體包含至少兩個連續磷酸二酯連 接，例如至少3或4或5個連續磷酸二酯連接。
在一些實施例中，PO-連接體中之核苷(視情況獨立地)選自由以下組成之群：DNA及RNA或其不干擾核酸酶裂解之修飾形式。不干擾核酸酶裂解之DNA及RNA核苷之修飾形式可為非天然核鹼基。某些糖修飾之核苷亦可容許核酸酶裂解，例如α-L-氧基-LNA。在一些實施例中，PO-連接體之所有核苷包含(視情況獨立地)2’-OH核糖(RNA)或2’-H糖-即RNA或DNA。在一些實施例中，PO-連接體之核苷係DNA核苷。在一些實施例中，PO-連接體之至少兩個連續核苷係DNA或RNA核苷(例如至少3或4或5個連續DNA或RNA核苷)。較佳地，PO-連接體由1至5或1至4(例如2、3、4)個連續磷酸二酯連接之DNA核苷組成。在較佳實施例中，PO-連接體如此短以致於其不招募RNA酶H。在一些實施例中，PO-連接體包含不超過3個或不超過4個連續磷酸二酯連接之DNA及/或RNA核苷(例如DNA核苷)。
在一些實施例中，PO-連接體與靶核酸序列或區域A中之寡聚物不互補。
在一些實施例中，PO-連接體與靶核酸序列互補。就此而言，區域A及PO-連接體可一起形成與靶序列互補之單一鄰接序列。
在一些實施例中，區域A及PO-連接體形成10至22、例如12至20個核苷酸長之單一鄰接核苷酸序列。在此背景下，區域A與PO-連接體之不同之處可在於其以至少一個、較佳至少兩個對靶核酸(例如具有2’取代之糖部分之LNA或核苷)具有增加結合親和力之經修飾之核苷開始，且區域A自身能夠調節有關細胞系中之靶核酸之表現。此外，若區域A包含DNA或RNA核苷，則該等核苷與核酸酶抗性核苷間連接(例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯)連接。
在一些態樣中，可將第一區域(區域A)與第二區域(PO-連接體)之間之核苷間連接視為第二區域之一部分。
在一些實施例中，基於靶組織或細胞或亞細胞區室中存在之主要內切核酸酶裂解酶，PO-連接體中之鹼基之序列經選擇以提供最佳內切核酸酶裂解點。就此而言，藉由自靶組織及非靶組織分離細胞萃取物，用於PO-連接體中之內切核酸酶裂解序列可基於與非靶細胞(例如腎)相比期望靶細胞(例如肝/肝細胞)中之優先裂解活性進行選擇。 就此而言，可針對期望組織/細胞最佳化用於靶標下調之化合物之功效。
在一些實施例中，PO-連接體包含序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG之二核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶，及/或T可經U置換。較佳地，核苷間連接係磷酸二酯連接。在較佳實施例中，PO-連接體係具有至少兩個磷酸二酯連接(一個連接至區域A)之CA二核苷酸。在一些實施例中，PO-連接體包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC及GGG之三核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U置換。較佳地，核苷間連接係磷酸二酯連接。在一些實施例中，PO-連接體包含序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、 CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX及GGGX之三核苷酸，其中X可選自由以下組成之群：A、T、U、G、C及其類似物，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U置換。較佳地，核苷間連接係磷酸二酯連接。應認識到，在提及(天然)核鹼基A、T、U、G、C時，該等核鹼基可經起等效天然核鹼基(例如具有互補核苷之鹼基對)作用之核鹼基類似物替代。
在一些實施例中，區域PL係共價附接至親脂性結合物部分(例如脂質、脂肪酸、固醇，例如膽固醇或生育酚)之磷酸二酯核苷酸連接體(PO-連接體)。在一些實施例中，區域PL係共價附接至去唾液酸糖蛋白受體靶向部分(例如GalNAc載劑組份)之磷酸二酯核苷酸連接體(PO-連接體)。
在寡聚物與載劑組份之間插入生理上不穩定之連接體之概念詳細闡述於WO 2014/076195(以引用方式併入本文中，具體而言圖3及4以引用方式併入)中。
替代連接體(區域E)
在一些情況下，連接體不必生理上不穩定，但主要用於將第三區域(例如載劑組份(區域C))共價連接至寡聚物(區域A)。本文中之該等連接體亦稱作區域E。本發明之寡聚物結合物可由以下區域要素A-C/C-A、A-PL-C/C-PL-A、A-PL-E-C/C-E-PL-A、A-E-PL-C/C-PL-E-A或A-E-C/C-E-A構成。
在一些實施例中，連接體E包含重複單元(例如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基)之鏈結構或寡聚物。連接體E可具有至少兩個官能基，一者用於附接至寡聚物(視情況利用生理上不穩定之連接體)且另一者用於附接至載劑組份。實例性連接體官能基可對與寡聚物或載劑組份 上之親核基團之反應具有親電子，或對與親電子基團之反應具有親核性。在一些實施例中，連接體官能基包括胺基、羥基、羧酸、硫醇、胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亞磷酸酯、不飽和基團(例如，雙鍵或三鍵)及諸如此類。舉例而言，碳水化合物載劑組份(例如GalNAc)可經由連接體(例如(聚)乙二醇連接體(PEG)，例如二-、三-、四-、五-、六-乙二醇連接體)連接至寡聚物。
在一些實施例中，連接體(區域E)係胺基烷基，例如C2-C36胺基烷基，包括(例如)C6至C12胺基烷基。在較佳實施例中，連接體(區域E)係C6胺基烷基。可(例如)使用(例如經保護之)胺基烷基亞磷醯胺將胺基烷基加至寡聚物(區域A或區域A-L/L-A)作為標準寡聚物合成之一部分。胺基烷基與寡聚物之間之連接基團可為(例如)硫代磷酸酯或磷酸二酯或本文中提及之其他核苷連接基團中之一者。胺基烷基共價連接至寡聚物之5’或3’端。市售胺基烷基連接體係(例如)用於在寡聚物之3’端連接之3'-胺基-調節劑試劑，且對於在寡聚物之5'端處之連接，可使用5'-胺基-調節劑C6。該等試劑可自Glen Research公司(Sterling,Va.)購得。該等化合物或類似物係由Krieg等人，Antisense Research and Development 1991,1,161採用以將螢光黃連接至寡聚物之5'-末端。多種其他連接體基團為業內已知且可用於將載劑組份附接至寡聚物。許多有用連接體基團之綜述可參見(例如)Antisense Research and Applications,S.T.Crooke及B.Lebleu編輯，CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993，第303-350頁。其他化合物(例如吖啶)經由聚亞甲基連接附接至寡聚物之3'-末端磷酸酯基團(Asseline，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81,3297)。上述基團中之任一者皆可用作單一連接體(區域E)或與一或多種其他連接體(區域E-E’或區域E-L或L-E)組合使用。
連接體及其於製備寡聚物之結合物中之用途貫穿業內提供於以 下中，例如WO 96/11205及WO 98/52614及美國專利第4,948,882號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,580,731號；第5,486,603號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,667,025號；第5,254,469號；第5,245,022號；第5,112,963號；第5,391,723號；第5,510475號；第5,512,667號；第5,574,142號；第5,684,142號；第5,770,716號；第6,096,875號；第6,335,432號及第6,335,437號、WO 2012/083046，其各自之全文以引用方式併入本文中。圖3提供實例性GalNAc簇、具有將GalNac簇接合至寡聚物之可選C6連接體之結合物1、2、3、4及結合物1a、2a、3a及4a。
去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)靶向部分
如本文所用術語「去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)靶向部分」係關於與ASGP-R相互作用且藉此使寡聚物與表現表面ASGP-R之細胞接觸或使寡聚物靠近該細胞的部分。
結合物部分
在一些實施例中，載劑組份係結合物部分。
另外，除載劑組份外，一或多個結合物部分亦可附接至寡聚物或寡聚物結合物。
在一些實施例中，一或多個結合物部分可附接至本發明之寡聚物。
結合物部分可為非核苷酸部分或非多核苷酸部分。
結合物部分可增強本發明之寡聚物之活性、細胞分佈或細胞攝取。該等部分包括(但不限於)抗體、多肽、脂質部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-s-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂肪族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己基 胺基-羰基-氧基膽固醇部分。
本發明之寡聚物亦可結合至活性原料藥，例如阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、磺胺藥物、抗糖尿病藥、抗細菌劑或抗生素。
在某些實施例中，結合部分係固醇，例如膽固醇。
在各個實施例中，結合物部分包含(例如)1至50、例如2至20、例如3至10胺基酸殘基長之帶正電之聚合物(例如帶正電之肽)、及/或聚環氧烷(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇)或由其組成-參見WO 2008/034123，其以引用方式併入本文中。適宜地，帶正電之聚合物(例如聚環氧烷)可經由連接體(例如WO 2008/034123中所述之可釋放連接體)附接至本發明之寡聚物。
本發明之寡聚物及寡聚物結合物可包括作為結合物部分之適當配體結合分子。舉例而言，根據(例如)國際專利申請案WO 91/04753，寡核苷酸可經結合用於治療性投與至識別細胞表面分子之配體結合分子。配體結合分子可包含(例如)抵抗細胞表面抗原之抗體、抵抗細胞表面受體之抗體、具有相應細胞表面受體之生長因子、針對該生長因子之抗體或識別生長因子與其受體之複合物之抗體。將配體結合分子結合至寡核苷酸之方法詳述於WO 91/04753中。此外，可使用之結合方法及用以改良細胞攝取之方法闡述於以下國際專利申請案WO 9640961、WO9964449、WO9902673、WO9803533、WO0015265及美國專利5856438及5138045中。
藉由進一步舉例，結合物部分可為生長因子，例如轉鐵蛋白或葉酸鹽。轉鐵蛋白-聚離胺酸-寡核苷酸複合物或葉酸鹽-聚離胺酸-寡核苷酸複合物可製備用於由表現高含量之轉鐵蛋白或葉酸鹽受體之細胞攝取。作為有利於寡核苷酸攝取至細胞中之載劑組份之轉鐵蛋白複合物之製備由Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3410-3414 (1990)闡述。經由葉酸鹽受體胞吞作用之葉酸鹽-大分子結合物之細胞遞送(包括反義寡核苷酸之遞送)由Low等人、美國專利5,108,921闡述。亦參見Leamon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88,5572(1991)。
靶核酸/靶序列
在較佳態樣中，如本文所用術語「靶核酸」及「靶序列」係指編碼HBx或HBsAg多肽之DNA或RNA，例如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中之任一者中所含有之序列。因此，術語「靶核酸」及「靶序列」包括HBx-或HBsAg-編碼核酸或其天然變體、及自其衍生之RNA核酸，較佳mRNA，例如前-mRNA，但較佳為成熟mRNA。在一些實施例中，例如在用於研究或診斷時，「靶核酸」或「靶序列」可為自上述DNA或RNA核酸靶標之衍生之cDNA或合成寡核苷酸。本發明之寡聚物較佳能夠與靶核酸雜交。
一致性/同源性
如本文所用術語「同源」及「同源性」可與術語「一致性」及「一致」互換。
對應於(Corresponding to/corresponds to)
術語「對應於」(「corresponding to」及「corresponds to」)係指寡聚物之核苷酸序列(即核鹼基或鹼基序列)或其鄰接核苷酸序列與選自以下之又一序列之等效鄰接核苷酸序列之間的比較：i)核酸靶標之反向補體之子序列，例如編碼靶序列蛋白之mRNA，例如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3內之任一序列，及/或ii)本文提供之具體核苷酸序列中之任一者或其子序列之序列。將核苷酸類似物與其等效或相應核苷酸直接進行比較。對應於i)或ii)下之又一序列之序列通常與超過第一序列(例如鄰接核苷酸序列)之長度之該序列一致，或如本文中所述，在一些實施例中，可與相應序列至少80%同源、例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%同源，例如100%同源(一致)。序列一致性%可藉由對2個序列間一致之比對鹼基之數目進行計數、除以寡聚物中之單元之總數目並乘以100來計算。
術語「相應核苷酸類似物」及「相應核苷酸」意欲指示核苷酸類似物中之核苷酸與天然核苷酸一致。舉例而言，在核苷酸之2-去氧核糖單元連接至腺嘌呤時，「相應核苷酸類似物」含有連接至腺嘌呤之戊糖單元(不同於2-去氧核糖)。
互補
術語「互補」意指在一個序列可以反平行意義結合至另一序列(其中每一序列之3'端結合至另一序列之5'端)且一個序列之每一A、T(U)、G及C隨後分別與另一序列之T(U)、A、C及G比對時，該兩個序列互補。通常，寡核苷酸之互補序列與界定序列至少90%、較佳95%、最佳100%互補。
在測定本發明寡聚物(或其區域)與靶序列(例如HBx或HBsAg靶序列)之間之「互補」程度中，「互補」(亦，「同源性」或「一致性」)程度表示為寡聚物(或其區域)之序列與同其最佳比對之靶區域(或靶區域之反向補體)之序列之間之一致性%(或同源性%)。百分比係藉由對2個序列間相同之比對鹼基之數目進行計數、除以寡聚物中之鄰接單元之總數目並乘以100來計算。在該比較中，若存在缺口，則該等缺口較佳僅失配而非缺口內單元之數目在在本發明寡聚物與靶區域之間不同的區域。
具體而言，術語「互補」意指第一核酸中之核鹼基與第二核酸中之核鹼基配對之能力。在一個序列可以反平行意義結合至另一序列(其中每一序列之3'端結合至另一序列之5'端)且一個序列之每一核鹼基A、T(U)、G及C隨後分別與另一序列之T(U)、A、C及G比對時，該兩個序列互補。在測定本發明寡聚物(或其區域)與靶序列(例如HBx或 HBsAg靶序列)之間之互補程度中，互補程度表示為寡聚物(或其區域)之序列與同其最佳比對之靶區域之序列之間之互補%。百分比係藉由對2個序列間形成對之比對鹼基之數目進行計數、除以寡聚物中之鄰接單元之總數目並乘以100來計算。在該比較重，不比對之核鹼基/核苷酸稱作失配。通常，本發明寡核苷酸之互補序列與界定序列至少80%、較佳85%、較佳90%、更佳95%、最佳100%互補。
術語「互補序列」在涉及多核苷酸序列時係指依據鹼基配對規則之另一核酸分子中之鹼基序列。更具體而言，該術語或類似術語係指核苷酸或核酸之間、例如雙鏈DNA分子之兩條鏈之間或寡核苷酸引子與欲測序或擴增之單鏈核酸上之引子結合位點之間的雜交或鹼基配對。互補核苷酸通常係A及T(或A及U)或C及G。在經最佳比對及比較且具有適當核苷酸插入或缺失之一條鏈之核苷酸與另一鏈之核苷酸至少約95%、通常至少約98%且更佳約99%至約100%配對時，據稱兩個單鏈RNA或DNA分子實質上互補。互補多核苷酸序列可藉由多種方法(包括使用熟知電腦算法及軟體，例如BLAST程式)鑑別。
反向補體/反向互補(reverse complementary)/反向互補(reverse complementarity)
如本文所用術語「反向補體」、「反向互補」(「reverse complementary」)及「反向互補」(「reverse complementarity」)與術語「補體」、「互補」(「complementary」)及「互補」(「complementarity」)可互換。
失配
術語「失配」-有時稱作非互補核鹼基-係指在第一核酸與第二核酸比對時第一核酸中給定位置處之核鹼基或核苷酸與第二核酸中之相應核鹼基或核苷酸不構成Watson-Crick鹼基配對。第一核酸可為(例如)本發明之寡聚物或寡聚物結合物且第二核酸可為(例如)靶序 列。在含有多個失配之寡聚物或寡聚物結合物中，失配可彼此毗鄰或間雜排列。
其天然變體
術語「其天然變體」係指在界定分類學基團中天然存在之靶序列之變體，例如HBV基因型A-H。通常，在提及多核苷酸之「天然變體」時，該術語亦涵蓋編碼基因體DNA(其係藉由染色體易位或複製發現)及RNA(例如自其衍生之mRNA)之靶序列之任何等位基因變體。「天然變體」亦可包括自靶序列mRNA之選擇性剪接衍生之變體。在提及具體多肽序列時，例如，該術語亦包括因此可藉由(例如)共轉譯或轉譯後修飾(例如信號肽裂解、蛋白水解裂解、糖基化等)處理之蛋白質之天然形式。
下游
如本文所用術語「下游」在參照沿核苷酸序列之方向使用時意指在自5’端至3’端之方向上。類似地，術語「上游」意指在自3'端至5'端之方向上。
LNA
術語「LNA」係指二環核苷類似物，稱作「鎖核酸」。其可指LNA單元，或在「LNA寡核苷酸」之上下文中使用時，LNA係指含有一或多種該等二環核苷酸類似物之寡核苷酸。LNA核苷酸之特徵在於在核糖環之C2’與C4’之間存在連接體基團(例如橋)-例如如示為如下文所述之二基團R4*-R2*。
如本文所用術語「LNA寡核苷酸」及「LNA-修飾之寡核苷酸」包括經LNA單元完全或部分修飾之任何寡核苷酸。因此，LNA-修飾之寡核苷酸可完全由LNA單元組成，或LNA-修飾之寡核苷酸可包含一個LNA單元。
本發明之寡核苷酸化合物中所用之LNA較佳具有通式I之結構
其中對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向；其中X係選自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-，例如，在一些實施例中為-O-；B係選自氫、視情況經取代之C1-4-烷氧基、視情況經取代之C1-4-烷基、視情況經取代之C1-4-醯氧基、核鹼基(包括天然核鹼基及核鹼基類似物)、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體；較佳地，B係核鹼基或核鹼基類似物；P指示與毗鄰單元之核苷酸間連接或5'-末端基團，該核苷酸間連接或5'-末端基團視情況包括取代基R5或同樣適用於取代基R5*；P*指示與毗鄰單元之核苷酸間連接或3'-末端基團；R4*與R2*一起指示由1至4個基團/原子組成之選自以下之二價連接體基團：-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-及>C=Z，其中Z係選自-O-、-S-及-N(Ra)-，且Ra與Rb各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1-12-烷基、視情況經取代之C2-12-烯基、視情況經取代之C2-12-炔基、羥基、視情況經取代之C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C1-6-烷醯基氧基、磺醯基(sulphono)、C1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C1-6-烷 硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代之且其中兩個孿取代基Ra與Rb可一起指示視情況經取代之亞甲基(=CH2)，其中對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向，且； 所存在之取代基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6及R6*各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1-12-烷基、視情況經取代之C2-12-烯基、視情況經取代之C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C1-6-烷醯基氧基、磺醯基、C1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個孿取代基可一起指示側氧基、硫酮基(thioxo)、亞胺基或視情況經取代之亞甲基；其中RN係選自氫及C1-4-烷基，且其中兩個毗鄰(非孿)取代基可指示產生雙鍵之額外鍵；且RN*在存在且不涉及二基團時係選自氫及C1-4-烷基；及其鹼性鹽及酸性鹽。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。
在一些實施例中，R4*與R2*一起指示由選自由以下組成之群之官能基組成之二基團：C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-及C(RaRb)-C(RaRb)-O-，其中Ra及Rb可各自視情況獨立地經選擇。在一些實施例中，Ra及Rb可視情況獨立地選自由以下組成之群：氫及C1-6烷基，例如甲基，例如氫。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示呈R-或S-構形之二基團-O- CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基二環核酸-Seth等人，2010,J.Org.Chem)。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示呈R-或S-構形之二基團-O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基二環核酸-Seth等人，2010,J.Org.Chem)。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示呈R-或S-構形之二基團-O-CH(CH3)-。在一些實施例中，R4*及R2*一起指示二基團-O-CH2-O-CH2-(Seth等人，2010,J.Org.Chem)。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示二基團-O-NR-CH3--(Seth等人，2010,J.Org.Chem)。
在一些實施例中，LNA單元具有選自以下之群之結構：
在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。
在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係氫。
在一些實施例中，R1*、R2、R3係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。
在一些實施例中，R1*、R2、R3係氫。
在一些實施例中，R5及R5*係各自獨立地選自由以下組成之群：H、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3及-CH=CH2。適宜地，在一些實施例中，R5或R5*係氫，其中作為另一基團(分別R5或R5*)係選自由以下組成之群：C1-5烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、經取代之C1-6烷基、經取代之C2-6烯基、經取代之C2-6炔基或經取代之醯基(-C(=O)-)；其中每一經取代之基團經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基、經取代之C2-6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ、J2或N(H)C(=X)N(H)J2，其中X係O或S；且J1及J2各自獨立地係H、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基、經取代之C2-6炔基、C1-6胺基烷基、經取代之C1-6胺基烷基或保護基團。在一些實施例中，R5或R5*係經取代之C1-6烷基。在一些實施例中，R5或R5*係經取代之亞甲基，其中較佳取代基包括一或多個獨立地選自以下之基團：F、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ、J2或N(H)C(O)N(H)J2。在一些實施例中，J1及J2各自獨立地係H或C1-6烷基。在一些實施例中，R5或R5*係甲基、乙基或甲氧基甲基。在一些實施例中，R5或R5*係甲基。在又一實施例中，R5或R5*係乙烯基。在一些實施例中，R5或R5*係經取代之醯基。在一些實施例中，R5或R5*係C(=O)NJ1J2。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。該等5’修飾之二環核苷酸揭示於WO 2007/134181中，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，B係核鹼基，包括核鹼基類似物及天然核鹼基，例如嘌呤或嘧啶或經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，例如本文中提及之核鹼基，例如選自由以下組成之群之核鹼基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶，及/或經修飾或取代之核鹼基，例如5- 噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2’硫基-胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示選自以下之二基團：-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-及-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re及Rf係各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1-12-烷基、視情況經取代之C2-12-烯基、視情況經取代之C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C1-6-烷醯基氧基、磺醯基、C1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿取代基Ra與Rb可一起指示視情況經取代之亞甲基(=CH2)。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。
在又一實施例中，R4*及R2*一起指示選自以下之二基團(二價基團)：-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O- CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-及-CH(CH2-O-CH3)-O-及/或-CH2-CH2-及-CH=CH-。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示二基團C(RaRb)-N(Rc)-O-，其中Ra及Rb係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基，例如氫，且；其中Rc係選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基，例如氫。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示二基團C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-，其中Ra、Rb、Rc及Rd係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基，例如氫。
在一些實施例中，R4*與R2*形成二基團-CH(Z)-O-，其中Z係選自由以下組成之群：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、經取代之C1-6烷基、經取代之C2-6烯基、經取代之C2-6炔基、醯基、經取代之醯基、經取代之醯胺、硫醇或經取代之硫基；且其中經取代之基團各自獨立地經獨立地選自以下之視情況經保護之取代基單取代或多取代：鹵素、側氧基、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2及CN，其中J1、J2及J3各自獨立地係H或C1-6烷基，且X係O、S或NJ1。在一些實施例中，Z係C1-6烷基或經取代之C1-6烷基。在一些實施例中，Z係甲基。在一些實施例中，Z係經 取代之C1-6烷基。在一些實施例中，該取代基係C1-6烷氧基。在一些實施例中，Z係CH3OCH2-。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。該等二環核苷酸揭示於US 7,399,845中，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係氫。 在一些實施例中，R1*、R2、R3*係氫，且R5、R5*中之一者或二者可不為氫，如上文及WO 2007/134181中所提及。
在一些實施例中，R4*及R2*一起指示橋中包含經取代之胺基、例如由二基團-CH2-N(Rc)-組成或包含二基團-CH2-N(Rc)-的二基團，其中Rc係C1-12烷基氧基。在一些實施例中，R4*及R2*一起指示二基團-Cq3q4-NOR-，其中q3及q4係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基；其中經取代之基團各自獨立地經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2或N(H)C(=X=N(H)J2，其中X係O或S；且J1及J2各自獨立地係H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6胺基烷基或保護基團。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。該等二環核苷酸揭示於WO2008/150729中，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基。在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係氫。在一些實施例中，R1*、R2、R3係氫且R5、R5*中之一者或二者可不為氫，如上文及WO 2007/134181中所提及。在一些實施例中，R4*及R2*一起指示二基團(二價基團) C(RaRb)-O-，其中Ra及Rb各自獨立地係鹵素、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、經取代之C1-C12烷氧基、OJ1SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2或N(H)C(=S)NJ1J2；或Ra及Rb合起來係=C(q3)(q4)；q3及q4各自獨立地係H、鹵素、C1-C12烷基或經取代之C1-C12烷基；經取代之基團各自獨立地經獨立地選自以下之取代基單取代或多取代：鹵素、C1-C6烷基、經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基、經取代之C2-C6烯基、C2-C6炔基、經取代之C2-C6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2或N(H)C(=S)NJ1J2，且；J1及J2各自獨立地係H、C1-C6烷基、經取代之C1-C6烷基、C2-C6烯基、經取代之C2-C6烯基、C2-C6炔基、經取代之C2-C6炔基、C1-C6胺基烷基、經取代之C1-C6胺基烷基或保護基團。該等化合物揭示於WO2009006478A中，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，R4*與R2*形成二基團-Q-，其中Q係C(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)=C(q3)、C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)或C(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]；q1、q2、q3、q4各自獨立地係H、鹵素、C1-12烷基、經取代之C1-12烷基、C2-12烯基、經取代之C1-12烷氧基、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)-NJ1J2、C(=O)J1、-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2或N(H)C(=S)NJ1J2；J1及J2各自獨立地係H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6胺基烷基或保護基團；且視情況其中在Q係C(q1)(q2)(q3)(q4)且q3或q4中之一者係CH3時，則q3或q4中之另一者或q1及q2中之一者中之至少一者不為H。在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係氫。對於所有手性中 心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向。該等二環核苷酸揭示於WO2008/154401中，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、C1-6烷基、經取代之C1-6烷基、C2-6烯基、經取代之C2-6烯基、C2-6炔基或經取代之C2-6炔基、C1-6烷氧基、經取代之C1-6烷氧基、醯基、經取代之醯基、C1-6胺基烷基或經取代之C1-6胺基烷基。在一些實施例中，R1*、R2、R3、R5、R5*係氫。在一些實施例中，R1*、R2、R3係氫且R5、R5*中之一者或二者可不為氫，如上文及WO 2007/134181或WO2009/067647中所提及(α-L-二環核酸類似物)。
其他二環核苷類似物及其於反義寡核苷酸中之使用揭示於WO2011/115818、WO2011/085102、WO2011/017521、WO09/100320、WO10/036698、WO09/124295及WO09/006478中。在一些態樣中，該等核苷類似物可用於本發明化合物中。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸化合物中所用之LNA較佳具有通式II之結構：
其中Y係選自由以下組成之群：-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)及/或-CH2-；Z及Z*係獨立地選自核苷酸間連接、RH、末端基團或保護基團；B構成天然或非天然核苷酸鹼基部分(核鹼基)，且RH係選自氫及C1-4-烷基；Ra、RbRc、Rd及Re係視情況獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1-12-烷基、視情況經取代之C2-12-烯基、視情況經取代之C2-12-炔基、羥基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基 氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C1-6-烷基)胺基-C1-6-烷基-胺基羰基、C1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C1-6-烷醯基氧基、磺醯基、C1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、鹵素、DNA嵌入劑、光化學活性基團、熱化學活性基團、螯合基團、報導基因基團及配體，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿取代基Ra及Rb可一起指示視情況經取代之亞甲基(=CH2)；且RH係選自氫及C1-4-烷基。在一些實施例中，Ra、RbRc、Rd及Re係視情況獨立地選自由以下組成之群：氫及C1-6烷基，例如甲基。對於所有手性中心而言，可發現不對稱基團呈R或S取向，例如，兩個實例性立體化學異構物包括β-D及α-L同種型，其可如下闡釋：
下文顯示具體實例性LNA單元：
術語「硫基-LNA」包含鎖核苷酸，其中上述通式中之Y係選自S或-CH2-S-。硫基-LNA可呈β-D及α-L-構形二者。
術語「胺基-LNA」包含鎖核苷酸，其中上述通式中之Y係選自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-及-CH2-N(R)-，其中R係選自氫及C1-4-烷基。胺基-LNA可呈β-D及α-L-構形二者。
術語「氧基-LNA」包含鎖核苷酸，其中上述通式中之Y代表-O-。氧基-LNA可呈β-D及α-L-構形二者。
術語「ENA」包含鎖核苷酸，其中上述通式中之Y係-CH2-O-(其中-CH2-O-之氧原子附接至相對於鹼基B之2’-位)。Re係氫或甲基。
在一些實例性實施例中，LNA係選自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-胺基-LNA及β-D-硫基-LNA，具體而言β-D-氧基-LNA。
LNA修飾之反義寡核苷酸可組合使用。舉例而言，針對相同基因之不同區域之若干不同LNA修飾之寡核苷酸之混合劑可同時或分開投與。
頭聚物
「頭聚物」定義為包含區域X’及與其鄰接之區域Y’之寡聚物，其中區域Y’之5’-端單元連接至區域X’之3’-端單元。區域X’包含招募核苷類似物之非RNA酶之鄰接伸展部分且區域Y’包含可由RNA酶識別及裂解之DNA單元或核苷類似物單元的鄰接伸展部分(例如至少7個鄰接單元)。
尾聚物
「尾聚物」定義為包含區域X”及與其鄰接之區域Y”之寡聚物，其中區域Y”之5’-端單元連接至區域X”之3’-端單元。區域X”包含可由RNA酶識別及裂解之DNA單元或核苷類似物單元之鄰接伸展部分(例如至少7個鄰接單元)，且區域X”包含招募核苷類似物之非RNA酶之鄰接伸展部分。
嵌合寡聚物/混合聚物
「嵌合」寡聚物(稱為「混合聚物」)由以下之交替組合物組成：(i)可由RNA酶識別及裂解之DNA單元或核苷類似物單元，及(ii)招募核苷類似物單元之非RNA酶。
光化學活性基團
在本上下文中，術語「光化學活性基團」係指在用光輻照時能夠經歷化學反應之化合物。本文之官能基之闡釋性實例係醌(尤其6-甲基-1,4-萘醌、蒽醌、萘醌及1,4-二甲基-蒽醌)、二氮雜環丙烯、芳香族疊氮化物、二苯甲酮、補骨脂素、重氮化合物及二氮雜環丙烯基化合物。
基於
如本文所用術語「基於」意指寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含至少80%、較佳至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳全部核心基序或序列之核苷酸，且視情況其中一或多個核苷酸可為經修飾之核苷酸。
因此，對於某些實施例而言，術語「基於」意指寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含所有核心基序或序列之核苷酸，且視情況其中一或多個核苷酸可為經修飾之核苷酸。
對於某些實施例而言，術語「基於」意指寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含所有核心基序或序列之核苷酸且其中一或多個核苷酸係經修飾之核苷酸。
對於某些實施例而言，術語「基於」意指寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含至少80%、較佳至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳所有核心基序或序列之核苷酸且其中一或多個核苷酸可為經修飾之核苷酸；且其中該寡聚物係基序X-Y-Z之缺口聚物，其中X及Z各自獨立地係包含至少一個經修飾之核苷酸之翼且Y係核苷酸之 中心區域。
因此，對於某些實施例而言，術語「基於」意指寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含所有核心基序或序列之核苷酸且其中一或多個核苷酸可為經修飾之核苷酸；且其中該寡聚物係基序X-Y-Z之缺口聚物，其中X及Z各自獨立地係包含至少一個經修飾之核苷酸之翼且Y係核苷酸之中心區域。
穩定性
術語「穩定性」在提及雙螺旋或三螺旋形成時通常指示反義寡核苷酸結合至其預期靶序列之緊密程度；更具體而言，「穩定性」指示在生理條件下雙螺旋或三螺旋之形成之自由能。例如，如下文所述一組標準條件下之熔融溫度係雙螺旋及/或三螺旋穩定性之便捷量度。較佳地，選擇在100mM NaCl、0.1mM EDTA及10mM磷酸鹽緩衝液水溶液(pH 7.0)中於1.5μM之反義寡核苷酸及靶核酸二者之鏈濃度下量測時具有至少45℃之熔融溫度的本發明之反義寡核苷酸。因此，在生理條件下使用時，相對於反義寡核苷酸及其靶標解離之狀態，傾向於雙螺旋或三螺旋形成。應理解，在一些實施例中，穩定雙螺旋或三螺旋可包括鹼基對之間及/或在三螺旋情形下鹼基三重峰之間之失配。較佳地，本發明之LNA修飾之反義寡核苷酸與其靶核酸形成完美匹配之雙螺旋及/或三螺旋。
有效力之抑制劑
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物係(具體而言)HBx或HBsAg之有效力之抑制劑。
如本文所用片語「有效力之抑制劑」係指如藉由脂質體轉染分析測定之IC50小於5nM的寡聚物。在一些實施例中，IC50小於4nM，例如小於2nM。
如藉由「剝裸」(「gymnosis」)(其中剝裸闡述在不使用轉染劑 情形下寡聚物至培養細胞之遞送)測定之「有效力之抑制劑」係指在剝裸分析中或在活體內AAV/HBV小鼠模型中IC50小於5μm。在一些實施例中，IC50小於2μm，例如小於1μm。
治療(Treat/Treatment)
術語「治療」(「treat」/「treatment」)等包括治癒、緩和、預防或檢測中之一或多者。在某些較佳實施例中，術語「治療」(「treat」/「treatment」)意指治癒或緩和。術語「緩和」包括緩和歸因於病毒病症或與其相關之症狀及/或病況。
因此，在一些態樣中，本發明係關於適於治癒、緩和、預防或檢測病毒病症之寡聚物或寡聚物結合物及其用於此之用途及使用方法。
因此，在某些態樣中，本發明係關於適於治癒或緩和病毒病症之寡聚物或寡聚物結合物及其用途及用於此之使用方法。
在一些實施例中，如本文所用術語「治療」係指現有疾病(例如如本文中提及之疾病或病症)之治療或疾病之防止，亦即預防。因此，應認識到，在一些實施例中，如本文中提及之治療可為預防性。
「治療」個體之疾病或病況或「治療」患有疾病或病況之個體係指使個體經受醫藥治療，例如投與藥物，使得疾病或病況之至少一種症狀減輕或穩定。
需要治療之患者係患有或可能患有疾病或病症之患者。
「預防性治療」個體之疾病或病況意指在疾病之至少一種症狀出現之前降低或消除疾病或病況發生之風險(即，發病率)或降低疾病或病況之嚴重程度。
試劑
術語「試劑」意指任何化合物，例如抗體或治療劑、可檢測標記(例如，標記物、示蹤劑或成像化合物)。
治療劑
術語「治療劑」意指具有生物活性之任何化合物。治療劑可用於治療病況或疾病。本發明之具體治療劑可為寡聚物。具體治療劑可為本發明之寡聚物或寡聚物結合物。
遞送該寡聚物至肝
如本文所用術語「遞送該寡聚物至肝」係指使寡聚物與肝之細胞或組織接觸或使寡聚物靠近肝之細胞或組織的過程。此包括肝內或其周圍之寡聚物至血液供應的遞送。寡聚物可自進入身體之位點遞送或攜帶至肝或肝周圍之組織。
遞送該寡聚物至肝細胞
如本文所用術語「遞送該寡聚物至肝細胞」係指使寡聚物與肝之肝細胞接觸或使寡聚物靠近肝之肝細胞的過程。此包括肝細胞內或其周圍之寡聚物至血液供應的遞送。寡聚物可自進入身體之位點遞送或攜帶至肝細胞。
病毒病症
術語「病毒病症」在本發明上下文中係指與病毒感染相關之任何病症或疾病。
醫藥載劑/醫藥上可接受之載劑
「醫藥載劑」或「醫藥上可接受之載劑」不同於如上文所述本發明之「載劑組份」。在本發明上下文中，「醫藥載劑」及「載劑組份」欲處理為互斥術語。
投與(Administering/Administration)
術語「投與」(「administering」及「administration」)欲指包括但不限於動脈內、鼻內、腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、經皮或經口之遞送模式。日劑量可分成一個、兩個或更多個呈適於在整個時間段一次、兩次或更多次投與之形式的劑量。
圖1：提供LNA寡聚物GalNAc結合步驟之方案。
圖2：提供包括C6連接體部分(區域E)之膽固醇或單-GalNAc載劑組份的實例，該連接體部分用於連接載劑組份與寡聚物(區域A或生理上不穩定之連接體區域PL，例如PO連接體)。波形線代表與寡聚物或區域PL共價連接。
圖3：提供三-GalNAc載劑組份之實例。結合物1-4闡釋4種適宜GalNAc載劑組份，且結合物1a-4a係指具有額外C6連接體部分(區域E)之相同載劑組份，該連接體部分用於連接載劑組份與寡聚物(區域A或生理上不穩定之連接體，區域PL，例如PO連接體)。波形線代表與寡聚物或區域PL共價連接。
圖4：提供具有三價GalNAc載劑組份之寡聚物結合物之實例。
圖5：提供一系列核苷類似物之結構。
圖6：提供SEQ ID NO：808之結構
圖7：提供SEQ ID NO：814之結構
圖8：提供SEQ ID NO：815之結構
圖9：提供SEQ ID NO：825之結構
圖10：提供SEQ ID NO：826之結構
圖11：以下序列之HBsAG減少：於劑量0.28mpk(■)、1.4mg/kg(▲)及7.1mpk(▼)下SEQ ID NO：807；於劑量7.1mg/kg(■)、1.42mg/kg(▲)及0.29mg/kg(▼)下SEQ ID NO：808；於劑量0.252mg/kg(▲)及1.26mg/kg(▼)、6.15mg/kg(◆)下SEQ ID NO：814；於劑量0.3mg/kg(■)、1.5mg/kg(▲)及7.5mg/kg(▼)下SEQ ID NO：815；於劑量0.3mg/kg(▲)、1.5mg/kg(▼)及7.5mg/kg(◆)下SEQ ID NO：825；於劑量7.1mg/kg(■)、1.42mg/kg(▲)及0.29mg/kg(▼)下SEQ ID NO：826。
圖12：以下序列之HBeAG減少：於劑量0.28mg/kg(■)、1.4mg/kg(▲)及7.1mg/kg(▼)下SEQ ID NO：807；於劑量7.1mg/kg(■)、1.42mg/kg(▲)及0.29mg/kg(▼)下SEQ ID NO：808；於劑量0.252mg/kg(▲)及1.26mg/kg(▼)、6.15mg/kg(◆)下SEQ ID NO：814；於劑量0.3mg/kg(■)、1.5mg/kg(▲)及7.5mg/kg(▼)下SEQ ID NO：815；於劑量0.3mg/kg(▲)、1.5mg/kg(▼)及7.5mg/kg(◆)下SEQ ID NO：825；於劑量7.1mg/kg(◆)、1.42mg/kg(▲)及0.29mg/kg(▼)下SEQ ID NO：826。
圖13：以下序列之HBV DNA減少：於劑量0.28mg/kg(■)、1.4mg/kg(▲)及7.1mg/kg(▼)下SEQ ID NO：807；於劑量7.1mg/kg(■)、1.42mg/kg(▲)及0.29mg/kg(▼)下SEQ ID NO：808；於劑量0.252mg/kg(▲)及1.26mg/kg(▼)、6.15mg/kg(◆)下SEQ ID NO：814；於劑量0.3mg/kg(■)、1.5mg/kg(▲)及7.5mg/kg(▼)下SEQ ID NO：815； 於劑量0.3mg/kg(▲)、1.5mg/kg(▼)及7.5mg/kg(◆)下SEQ ID NO：825；於劑量7.1mg/kg(◆)、1.42mg/kg(▲)及0.29mg/kg(▼)下SEQ ID NO：826。
圖14：提供於劑量0.2mg/kg、1.0mg/kg及5.0mg/kg下SEQ ID NO：807之皮下(SC)及靜脈內(IV)投與途徑的結果。A)提供HBsAG減少。B)提供HBeAG減少。C)提供DNA減少。
圖15：提供關於以等莫耳寡聚物劑量測試之未結合寡聚物(■)(SEQ ID NO：308及303)及結合寡聚物(▼)(SEQ ID NO：807及815)的結果。A)提供HBsAG減少。B)提供HBeAG減少。C)提供DNA減少。
導論
本發明係關於寡聚物(亦稱作寡聚物分子)及/或寡聚物結合物。
寡聚物及寡聚物結合物可用於治療病毒病症。
在特定實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠調節HBV HBx或HBsAg中之靶序列。
本發明之寡聚物可結合至載劑組份。
較佳地，載劑組份能夠遞送寡聚物至欲治療個體之肝。
因此，本發明採用寡聚物或寡聚物結合物，其用於調節編碼HBV HBx或HBsAg之核酸分子(例如表示為SEQ ID no 1或SEQ ID No 2之HBV核酸分子)及編碼HBV HBx或HBV HBsAg之該等核酸分子之天然變體的功能。
寡聚物特徵
寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可由8-50、8-30、8-25、8-20、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13或8-12個核苷酸長、較佳8-16個核苷酸長、更佳10至20個核苷酸長之鄰接核苷酸序列組成或包含該序列。
對於一些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含10-50、例如10-30、10-20、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13或10-12個核苷酸長、較佳10-20個核苷酸長、更佳10至18個核苷酸長、最佳10至16個核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
對於一些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含12-50、例如12-30、12-20、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14或12-13個核苷酸長、較佳12-16個核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
對於一些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
對於一些實施例而言，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可包含總共8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鄰接核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含總共8-22、例如8-20、例如8-18、例如8-17或8-16個鄰接核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含總共8、9、10、11、12、13、14、15或16個鄰接核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含總共15或16個鄰接核苷酸長之鄰接核苷酸序列或由其組成。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物由不超過22個核苷酸、例如不超過20個核苷酸、例如不超過18個核苷酸(例如15或16或17個核苷酸)組成。
在一些實施例中，較佳地，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含小於20個核苷酸。
應瞭解，在針對寡聚物或鄰接核苷酸序列長度給出範圍時，其包括範圍中所提供之上限及下限長度，例如自10至30(或介於其之間)包括10及30二者。
寡核苷酸部分之長度足夠大以確保特異性結合僅在期望靶多核苷酸處發生而不在其他偶然位點處發生，如許多參考文獻中所解釋，例如Rosenberg等人，國際申請案PCT/US92/05305；或Szostak等人，Meth.Enzymol,68：419-429(1979)。長度之上限範圍係由若干因素決 定，該等因素包括合成及純化大於約30-40個核苷酸長之寡聚物之不便及花費、較長寡核苷酸較較短寡核苷酸對失配之耐受性大、是否存在用以增強結合或特異性之修飾形式、雙螺旋或三螺旋結合是否期望及諸如此類。
寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含或天然核苷酸(較佳2’-去氧核苷酸(本文中通常稱作「DNA」)，但亦可能核糖核苷酸(本文中通常稱作「RNA」))或該等天然核苷酸與一或多種非天然核苷酸(即核苷酸類似物)之組合的簡單序列由其組成。該等核苷酸類似物可適宜地增強寡聚物對靶序列之親和力。
適宜且較佳之核苷酸類似物之實例由WO2007/031091提供或於其中提及。
核苷酸類似物之實例包括經修飾之核苷酸。該等修飾之實例包括修飾糖部分以提供2’-取代基或產生增強結合親和力且亦提供增強核酸酶耐性之橋接(鎖核酸)結構。因此，該等經修飾之核苷酸類似物可為親和力增強核苷酸類似物。
在寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物中納入親和力增強核苷酸類似物(例如LNA或2’-取代之糖)可容許減小特異性結合寡聚物之大小，且亦可將上限降低至在非特異性或異常結合發生之前之寡聚物大小。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含至少1個核苷酸類似物。在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含至少2個核苷酸類似物。在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包含2至8個核苷酸類似物，例如6或7個核苷酸類似物。在迄今為止最佳之實施例中，該等核苷酸類似物中之至少一者係鎖核酸(LNA)；例如至少2、3或至少4、或至少5、或至少6、或至少7或8個核苷酸類似物可為LNA。在一些實施例中，所有核苷酸類似物皆可為LNA。
應認識到，在提及較佳核苷酸序列基序或核苷酸序列(其僅由核苷酸組成)時，由該序列界定之本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含代替該序列中存在之一或多種核苷酸之相應核苷酸類似物，例如LNA單元或其他核苷酸類似物，其提高寡聚物/靶雙螺旋之雙螺旋穩定性/Tm(即親和力增強核苷酸類似物)。
較佳核苷酸類似物係LNA，例如氧基-LNA(例如β-D-氧基-LNA及α-L-氧基-LNA)、及/或胺基-LNA(例如β-D-胺基-LNA及α-L-胺基-LNA)及/或硫基-LNA(例如β-D-硫基-LNA及α-L-硫基-LNA)及/或ENA(例如β-D-ENA及α-L-ENA)。最佳者係β-D-氧基-LNA。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物內(例如缺口聚物之區域W及區域Y中-如本文中所提及)存在之核苷酸類似物係獨立地選自(例如)：2’-O-烷基-RNA單元、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、LNA單元、阿拉伯核酸(ANA)單元、2’-氟-ANA單元、HNA單元、INA(嵌入核酸-Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30：4918-4925，以引用方式併入本文中)單元及2’MOE單元。在一些實施例中，僅存在本發明寡聚物或其鄰接核苷酸序列中存在之上述類型之核苷酸類似物中之一者。
在一些實施例中，核苷酸類似物係2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’MOE)、2’-氟-DNA單元或LNA核苷酸類似物，且因此，本發明之寡核苷酸可包含獨立地選自該三種類型之類似物之核苷酸類似物，或可僅包含一種類型之選自三種類型之類似物。在一些實施例中，該等核苷酸類似物中之至少一者係2’-MOE-RNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2’-MOE-RNA核苷酸單元。在一些實施例中，該等核苷酸類似物中之至少一者係2’-氟DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2’-氟-DNA核苷酸單元。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物包 含至少一個鎖核酸(LNA)單元，例如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA單元，例如3至7或4至8個LNA單元、或3、4、5、6或7個LNA單元。 在一些實施例中，所有核苷酸類似物皆係LNA。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含β-D-氧基-LNA以及以下LNA單元中之一或多者：呈β-D或α-L構形之硫基-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA及/或ENA或其組合。在一些實施例中，所有LNA胞嘧啶單元皆係5’甲基-胞嘧啶。
在本發明之一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可包含LNA及DNA單元二者。較佳地，LNA及DNA單元之組合總計係係10-25、例如10-24、較佳10-20、例如10-18、甚至更佳12-16。在本發明之一些實施例中，寡聚物之核苷酸序列(例如鄰接核苷酸序列)由至少一個LNA組成且剩餘核苷酸單元係DNA單元。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物僅包含LNA核苷酸類似物及天然核苷酸(例如RNA或DNA，最佳DNA核苷酸)，視情況具有經修飾之核苷酸間連接(例如硫代磷酸酯)。
在一些實施例中，寡聚物之核苷酸序列與靶序列之間之任何失配較佳係在親和力增強核苷酸類似物外之區域中發現。缺口聚物中親和力增強核苷酸類似物外之該等區域之實例包括如本文中提及之區域X及/或如本文中提及之區域V及/或如本文中提及之區域Z、及/或寡核苷酸中未經修飾之核苷酸之位點處及/或鄰接核苷酸序列之5’或3’之區域中。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物不包含RNA(單元)。本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物較佳係線性分子或係合成為線性分子。較佳地，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物係單鏈分子，且較佳不包含(例如)至少3、4或5個鄰接核苷酸之短區域，其與相同寡聚物(即雙螺旋)內之等效區域互補。就此而言，寡 聚物或寡聚物結合物之寡聚物(基本上)不為雙鏈。在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物基本上係單鏈。在各個實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物可完全由鄰接核苷酸區域組成。因此，較佳地，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物實質上並不自身互補。
因此，在某些態樣中，本發明提供寡聚物或具有5-50、例如5-30、或例如5-20、例如8-30、例如8-20、例如8-18、例如8-16、例如10-16、例如10-15、例如12-16、例如12-15個核苷酸長之寡聚物組份的寡聚物結合物，其包含總共至少5個、例如至少8個核苷酸之鄰接核苷酸序列(第一區域)，其中該鄰接核苷酸序列(第一區域)與對應於HBV HBx或HBsAg基因或mRNA之反向補體之區域至少80%(例如，85%、90%、95%、98%或99%)同源，該任何序列在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3或其天然變體中之任一者內。因此，例如，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份與具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3中任一者、較佳SEQ ID No.1及SEQ ID No.2中任一者內之一部分之序列的單鏈核酸分子雜交。寡聚物或寡聚物組份可與具有顯示為SEQ ID No.3之位置200至1900之一部分序列之序列的單鏈核酸分子雜交。寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可與具有顯示為SEQ ID NO：3之位置1264至1598或691至706之序列的單鏈核酸分子雜交。寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可與具有選自由以下組成之群之序列的單鏈核酸分子雜交：SEQ ID NO 3中之以下位置：位置1至1944、位置157至1840、位置1196至1941、位置1376至1840及位置3158-3182。較佳地，寡聚物結合物與具有以下選擇序列之單鏈核酸分子雜交：SEQ ID NO：3之位置1530至1598內、更佳SEQ ID NO：3之位置1577至1598內且最佳SEQ ID NO：3之位置1530至1543內。寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可與選自由以下位置組成之 群之單鏈核酸分子雜交：SEQ ID NO：3之1264-1278；1265-1277；1530-1543；1530-1544；1531-1543；1551-1565；1551-1566；1577-1589；1577-1591；1577-1592；1578-1590；1578-1592；1583-1598；1584-1598；及1585-1598；或670-706,691-705；691-706；692-706；693-706；及694-706。較佳地，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可與SEQ ID NO：3之位置1530至1598內、更佳SEQ ID NO：3之位置1530-1543或位置1577-1598內之單鏈核酸分子雜交。
對於某些實施例而言，本發明提供基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序之寡聚物或具有寡聚物的寡聚物結合物：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)； CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)，其能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列以治療病毒病症。
寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)；CGCagtatggaTC(SEQ ID NO：300)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO：296)；CGAaccactgaAC(SEQ ID NO：298)；CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)； CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；GAAccactgaaCAAA(SEQ ID NO：585)；CGAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：588) GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；TAGtaaactgagCCA(SEQ ID NO：678)；CGAaccactgAAC(SEQ ID NO：600)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及CGAaccactgAACA(SEQ ID NO：597)，其中大寫字母表示LNA單元且小寫字母表示DNA單元。
在某些實施例中，寡聚物、或額外寡聚物、或寡聚物結合物之寡聚物組份或額外寡聚物結合物之寡聚物組份可包含基於選擇以下列表之序列之序列：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；及AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)。
在另一實施例中，基序序列係選自：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)； GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；及AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)
在另一實施例中，基序序列係選自GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)、GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)及CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)。
在另一實施例中，基序序列係選自AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)及AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)。
在另一實施例中，基序序列係選自CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8)及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)。
在另一實施例中，基序序列係選自CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9)及CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)。
在另一實施例中，基序序列係選自AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)及GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15)。
在某些實施例中，寡聚物、或額外寡聚物、或寡聚物結合物之寡聚物組份或額外寡聚物結合物之寡聚物組份可包含選自下文所提供之群之序列或由其組成：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)； GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)；CGCagtatggaTC(SEQ ID NO：300)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO：296)；CGAaccactgaAC(SEQ ID NO：298)；CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；GAAccactgaaCAAA(SEQ ID NO：585)；CGAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：588) GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；TAGtaaactgagCCA(SEQ ID NO：678)；CGAaccactgAAC(SEQ ID NO：600)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及 CGAaccactgAACA(SEQ ID NO：597)。
其中大寫字母表示親和力增強核苷酸類似物且小寫字母表示DNA單元。
在另一實施例中，序列係選自：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)；GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)。
在一個實施例中，序列係選自：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；及 AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)。
在一個實施例中，序列係選自GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)及CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)。
在另一實施例中，序列係選自AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；及AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)。
在另一實施例中，序列係選自CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)；GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO：296)；CGAaccactgaAC(SEQ ID NO：298)；CGAaccactgAACA(SEQ ID NO：597)及TAGtaaactgagCCA(SEQ ID NO：678)。
在另一實施例中，序列係選自CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)及CGCagtatggaTC(SEQ ID NO：300)。
在另一實施例中，序列係選自AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)及GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)。
寡聚物結合物可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：
其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯連接；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元；GN2-C6表示具有C6連接體之GalNAc2載劑組份。
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G-3'(SEQ ID NO：815)
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：
在另一實施例中，寡聚物結合物係選自：
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序 GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由序列基序CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9)或其子序列組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物由CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)組成或包含或係基於該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G-3'(SEQ ID NO：815)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G s T-3'(SEQ ID NO：814)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgs A s G s G-3'(SEQ ID NO：825)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 caA s G s m C s gsasasgstsgscsascs A s m C s G-3'(SEQ ID NO：808)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5’-GN2-C6 caA s G s gstsgsasasgs mcsgsas A s G s T s G-3'(SEQ ID NO：826)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 caA s G s m C s gsasasgstsgscsascsas m C s G s G-3'(SEQ ID NO：807)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 cam C s G s A s ascscsascstsgsas A s m C s A-3'(SEQ ID NO：811)組成或包含該序列。
在一些實施例中，本發明之寡聚物結合物由5'-GN2-C6 ca m C s m C s G s csasgstsastsgsgsas T s m C s G-3'(SEQ ID NO：802)組成或包含該 序列。
缺口聚物
較佳地，本發明之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份係缺口聚物(有時稱作缺口聚物寡聚物)。較佳地，寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元。
通常，本發明之缺口聚物寡聚物或本發明之寡聚物結合物之缺口聚物寡聚物組份可由下式中之任一者代表：W-X-Y；V-W-X-Y；W-X-Y-Z；V-W-X-Y-Z；其中對於每一式：W代表一或多個親和力增強核苷酸類似物之區域(區域W)
X代表包含能夠招募RNA酶之核苷酸之伸展部分的區域(區域X)
Y代表一或多個親和力增強核苷酸類似物之區域(區域Y)
V代表一或多個核苷酸單元之區域(區域V)
Z代表一或多個核苷酸單元之區域(區域Z)。
區域V、W、X、Y或Z中之任一者可含有額外核苷酸或親和力增強核苷酸類似物。
通常，因此，缺口聚物寡聚物係包含能夠招募RNA酶(例如RNA酶H)之核苷酸之鄰接伸展部分的寡聚物，例如至少6或7個DNA核苷酸之區域，其係區域X；其中區域X之5’及3’二者皆側接親和力增強核苷酸類似物(例如1-6個能夠招募RNA酶之核苷酸之鄰接伸展部分之5’及3’之核苷酸類似物)之區域-該等區域分別係區域W及區域Y。
在一些實施例中，能夠招募RNA酶之單元係選自由以下組成之 群：DNA單元、α-L-LNA單元、C4’烷基化DNA單元(參見PCT/EP2009/050349及Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，以引用方式併入本文中)及UNA(未連接之核酸)核苷酸(參見Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，以引用方式併入本文中)。UNA係解鎖核酸，通常其中移除核糖之C2-C3 C-C鍵，從而形成解鎖「糖」殘基。較佳地，缺口聚物包含式(5’至3’)W-X-Y、或視情況W-X-Y-Z或V-W-X-Y之(聚)核苷酸序列，其中：區域W(W)(5’區域)由至少一個核苷酸類似物(例如至少一個LNA單元，例如1-6個核苷酸類似物，例如LNA單元)組成或包含該等核苷酸類似物，且；區域X(X)由至少五個連續核苷酸(其能夠招募RNA酶(在與互補RNA分子、例如mRNA靶標以雙螺旋形成時)，例如DNA核苷酸)組成或包含該等核苷酸，且；區域Y(Y)(3’區域)由至少一個(例如至少一個LNA單元，例如1-6個核苷酸類似物，例如LNA單元)組成或包含該等核苷酸類似物，且；區域V(V)及/或區域Z(Z)(在存在時)由1、2或3個核苷酸單元(例如DNA核苷酸)組成或包含該等核苷酸單元。
在一些實施例中，區域W由1、2、3、4、5或6個核苷酸類似物(例如LNA單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如2-5個LNA單元，例如3或4個核苷酸類似物，例如2、3或4個LNA單元)組成。
在一些實施例中，區域Y由1、2、3、4、5或6個核苷酸類似物(例如LNA單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如2-5個LNA單元，例如2、3或4個核苷酸類似物，例如3或4個LNA單元)組成。
在一些實施例中，區域X由5、6、7、8、9、10、11或12個能夠招募RNA酶之連續核苷酸、或6-10、或7-9(例如8)個能夠招募RNA酶之連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸。
在一些實施例中，區域X由至少一個DNA核苷酸單元(例如1-12個DNA單元、較佳4-12個DNA單元、更佳6-10個DNA單元，例如7-10個 DNA單元、最佳8、9或10個DNA單元)組成或包含該等DNA核苷酸單元。
在一些實施例中，區域W由2、3或4個核苷酸類似物(例如LNA)組成，區域X由7、8、9或10個DNA單元組成，且區域Y由2、3或4個核苷酸類似物(例如LNA)組成。該等設計包括(W-X-Y)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3、3-10-2、3-9-2、3-8-2、3-7-2、4-10-2、4-9-2、4-8-2、4-7-2；且可進一步包括區域V(其可進一1、2或3個核苷酸單元(例如DNA單元))及/或區域Z(其可具有1、2或3個核苷酸單元(例如DNA單元))。
其他缺口聚物設計揭示於WO2004/046160中，其以引用方式併入本文中。WO2008/113832主張自以引用方式併入本文中之美國臨時申請案60/977,409之優先權，其提及「短聚物」缺口聚物寡聚物。在一些實施例中，此處提供之寡聚物可為該等短聚物缺口聚物。
在一些實施例中，寡聚物係由總共10、11、12、13或14個核苷酸單元之鄰接核苷酸序列組成，其中鄰接核苷酸序列具有式(5’-3’)W-X-Y、或視情況W-X-Y-Z或V-W-X-Y，其中：W由1、2或3個核苷酸類似物單元(例如LNA單元)組成；X由7、8或9個在與互補RNA分子(例如mRNA靶標)以雙螺旋形成時能夠招募RNA酶之鄰接核苷酸單元組成；且Y由1、2或3個核苷酸類似物單元(例如LNA單元)組成。在存在時，V由1或2個DNA單元組成。在存在時，Z由1或2個DNA單元組成。
在一些實施例中，W由1個LNA單元組成。在一些實施例中，W由2個LNA單元組成。在一些實施例中，W由3個LNA單元組成。
在一些實施例中，Y由1個LNA單元組成。在一些實施例中，Y由2個LNA單元組成。在一些實施例中，Y由3個LNA單元組成。
在一些實施例中，X由7個核苷酸單元組成。在一些實施例中，X 由8個核苷酸單元組成。在一些實施例中，X由9個核苷酸單元組成。在某些實施例中，區域X由10個核苷單元組成。在某些實施例中，區域X包含1-10個DNA單元。在一些實施例中，X包含1-9個DNA單元，例如2、3、4、5、6、7、8或9個DNA單元。在一些實施例中，X由DNA單元組成。在一些實施例中，X包含至少一個呈α-L構形之LNA單元，例如2、3、4、5、6、7、8或9個呈α-L-構形之LNA單元。在一些實施例中，X包含至少一個α-L-氧基LNA單元或其中呈α-L-構形之所有LNA單元皆係α-L-氧基LNA單元。
在一些實施例中，W-X-Y中存在之核苷酸之數目係選自由以下組成之群：(核苷酸類似物單元-區域X-核苷酸類似物單元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、或；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4，或；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1、3-10-2、2-10-3、3-10-3。
在一些實施例中，W-X-Y中核苷酸之數目係選自由以下組成之群：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4及4-7-3；在一些實施例中，較佳基序係3-10-3、3-9-3、3-8-3、3-8-2。
在某些實施例中，區域W及Y中之每一者皆由2或3個LNA單元組成，且區域X由8或9或10個核苷單元(較佳DNA單元)組成。
在一些實施例中，W及Y二者各自由2或3個LNA單元組成，且X由8或9個核苷酸單元(較佳DNA單元)組成。
在各個實施例中，其他缺口聚物設計包括彼等以下者：其中區域W及/或Y由3、4、5或6個核苷類似物(例如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)之單元或含有2’-氟-去氧核糖之單元)組成且區域X由8、9、10、11或12個核苷(例如DNA單元)組成，其中區域W-X-Y具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4個單元。
其他缺口聚物設計揭示於WO 2007/146511A2中，其以引用方式併入本文中。
因此，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在上述序列之5’端可包含至少1個、至少2個或至少3個經修飾之核苷酸。舉例而言，一個或更佳全部經修飾之核苷酸可為LNA單元。
寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在上述序列之3’端可包含至少1個、至少2個或至少3個經修飾之核苷酸。舉例而言，一個或更佳全部經修飾之核苷酸可為LNA單元。
寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在本文揭示之序列之5’及/或3’端可包含至少1個、至少2個或至少3個經修飾之核苷酸。舉例而言，一個或更佳全部經修飾之核苷酸可為LNA單元。
對於某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在本文揭示之序列之5’及/或3’端可包含至少2個或至少3個經修飾之核苷酸。舉例而言，兩個或更佳全部核苷酸可為LNA單元。
對於某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在本文揭示之序列之5’及/或3’端可包含至少3個經修飾之核苷酸。舉例而言，三個或更佳全部經修飾之核苷酸可為LNA單元。
對於某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在本文揭示之序列之5’及/或3’端可包含3個經修飾之核苷酸。舉例而言，經修飾之核苷酸可為LNA單元。
對於某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份在本文揭示之序列之5’端及3’端可包含3個經修飾之核苷酸。舉例而言，一個或更佳全部經修飾之核苷酸可為LNA單元。
對於一些實施例而言，寡聚物可包含額外CA二核苷酸基序。
在某些態樣中，較佳地，寡聚物並非GAGGCATAGCAGCAGG(SEQ ID NO：102)。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份包含以下基序中之任一者：2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、2-9-2、3-9-3、2-9-3、3-9-2、2-10-2、3-10-3、3-10-2、2-10-3，其中第一個數字係LNA翼區中LNA單元之數目，且第二個數字係缺口區域中核苷酸之數目，且第三個數字係LNA翼區中LNA單元之數目。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份包含基序3-8-3、3-8-2、3-9-3、3-9-2、3-10-3、3-10-2中之任一者，其中第一個數字係LNA翼區中LNA單元之數目，第二個數字係缺口區域中核苷酸之數目，且第三個數字係LNA翼區中LNA單元之數目。
對於某些實施例而言，本發明提供如本文中所定義寡聚物或寡聚物結合物，其中寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份係缺口聚物，且其中整體序列包含至少6個、較佳至少7個、較佳至少8個、較佳至少9個、較佳至少10單元個、較佳至少11單元個、較佳至少12個與對應於HBV HBx基因之一部分(例如SEQ ID No.1之一部分)、或HBsAg基因之一部分(例如SEQ ID No.2)之區域、或編碼HBV HBx或HBV HBsAg之核酸之靶區域之反向補體至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致的單元。
對於某些實施例而言，本發明提供如本文中所定義寡聚物或寡聚物結合物，其中寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份係缺口聚物，且其中中心區域之序列包含至少6個、較佳至少7個、較佳至少8個、較佳至少9個、較佳至少10個與對應於HBV HBx基因之一部分(例如SEQ ID No.1之一部分)、或HBsAg基因之一部分(例如SEQ ID No.2)之區域、或編碼HBV HBx或HBV HBsAg之核酸之靶區域之反向補體至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致的單元。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚 物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)，其中三至四個5’末端核苷酸中之1、2、3或4者係經修飾之核苷酸，例如LNA單元；且三至四個3’末端核苷酸中之1、2、3或4者係經修飾之核苷酸，例如LNA單元。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列： GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)，其中三個5’末端核苷酸中之2或3者係經修飾之核苷酸，例如LNA單元；三個3’末端核苷酸中之2或3者係經修飾之核苷酸，例如LNA單元。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚 物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)，其中三個5’末端核苷酸係經修飾之核苷酸，例如LNA單元；三個3’末端核苷酸中之2或3者係經修飾之核苷酸，例如LNA單元。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚 物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)；CGCagtatggaTC(SEQ ID NO：300)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315) AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO：296)；CGAaccactgaAC(SEQ ID NO：298)；CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；GAAccactgaaCAAA(SEQ ID NO：585)；CGAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：588) GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；TAGtaaactgagCCA(SEQ ID NO：678)； CGAaccactgAAC(SEQ ID NO：600)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及CGAaccactgAACA(SEQ ID NO：597)，其中大寫字母表示可為經修飾之核苷酸(例如INA單元)之核苷酸。
對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：
其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯連接；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元；AM-C6係胺基-C6連接體；其中5’末端基團「AM-C6 c a」係可選的。
AM-C6係胺基-C6連接體：經由磷酸二酯或硫代磷酸酯連接之寡核苷酸之5’端中之6-胺基己醇。
因此，對於本發明之某些實施例而言，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GmCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GmCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GmCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGmCgaagtgcacAmCG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagmcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGmCgaagtgcacamCGG(SEQ ID NO：308)；mCGAaccactgaAmCA(SEQ ID NO：297)；mCGmCagtatggaTmC(SEQ ID NO：300)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagmcgaaGTG(SEQ ID NO：316)； GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；mCGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；mCGAaccactgaamCAA(SEQ ID NO：296)；mCGAaccactgaAmC(SEQ ID NO：298)；mCmCGcagtatggaTmCG(SEQ ID NO：299)；mCGmCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagamCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagamCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacamcGG(SEQ ID NO：306)；GmCGaagtgcacamCGG(SEQ ID NO：307)；mCGAagtgcacamCG(SEQ ID NO：309)；GAAccactgaamCAAA(SEQ ID NO：585)；mCGAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：588) GAAgtgcacamCGG(SEQ ID NO：628)；TAGtaaactgagmCmCA(SEQ ID NO：678)；mCGAaccactgAAmC(SEQ ID NO：600)；AGGtgaagmcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及mCGAaccactgAAmCA(SEQ ID NO：597)，其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；所有核苷間連接皆係硫代磷酸酯連接；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元。
在某些較佳態樣中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份包含以下基序中之任一者：3-10-3、3-10-2、3-9-3、3-9-2、3-8-3、3-8-2，其中第一個數字係翼區中經修飾之核苷酸之數目，較佳至少一個 係LNA單元，較佳全部係LNA單元；第二個數字係缺口區域中核苷酸之數目；且第三個數字係翼區中經修飾之核苷酸之數目，較佳至少一個係LNA單元，較佳全部係LNA單元。
如所指示，本發明之寡聚物可包含或可為缺口聚物。換言之，缺口聚物寡聚物係包含能夠招募RNA酶(例如RNA酶H)之核苷酸之鄰接伸展部分、例如至少6或7個DNA核苷酸之區域(本文中稱作區域GH(GH))之寡聚物，其中區域GH之5’及3’兩端側接親和力增強核苷酸類似物的區域，例如在能夠招募RNA酶之核苷酸之鄰接伸展部分之5’及3’之1-6個核苷酸類似物-該等區域稱作區域GX’(GX’)及GZ’(GZ’)。區域GX、GH及GZ分別對應於區域W、X及Y。
在一些實施例中，能夠招募RNA酶之單元係選自由以下組成之群：DNA單元、α-L-LNA單元、C4’烷基化DNA單元(參見PCT/EP2009/050349及Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，以引用方式併入本文中)及UNA(未連接之核酸)核苷酸(參見Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，以引用方式併入本文中)。UNA係解鎖核酸，通常其中移除核糖之C2-C3 C-C鍵，從而形成解鎖「糖」殘基。較佳地，缺口聚物包含式(5’至3’)GX’-GH-GZ’之(聚)核苷酸序列，其中：區域GX’(GX’)(5’區域)由至少一個核苷酸類似物(例如至少一個BNA(例如LNA)單元，例如1-6個核苷酸類似物，例如BNA(例如LNA)單元)組成或包含該等核苷酸類似物，且；區域GH(H)由至少五個連續核苷酸(其能夠招募RNA酶(在與互補RNA分子、例如mRNA靶標以雙螺旋形成時)，例如DNA核苷酸)組成或包含該等核苷酸，且；區域GZ’(GZ’)(3’區域)由至少一個核苷酸類似物(例如至少一個BNA(例如LNA單元)，例如1-6個核苷酸類似物，例如BNA(例如LNA)單元)組成或包含該等核苷酸類似物。
在一些實施例中，區域GX’由1、2、3、4、5或6個核苷酸類似物 (例如BNA(例如LNA)單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如2-5個LNA單元，例如3或4個核苷酸類似物，例如3或4個LNA單元)組成；及/或區域GZ’由1、2、3、4、5或6個核苷酸類似物(例如BNA(例如LNA)單元，例如2-5個核苷酸類似物，例如2-5個BNA(例如LNA單元)，例如3或4個核苷酸類似物，例如3或4個BNA(例如LNA)單元)組成。
在一些實施例中，GH由5、6、7、8、9、10、11或12個能夠招募RNA酶之連續核苷酸、或6-10、或7-9(例如8)個能夠招募RNA酶之連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸。在一些實施例中，區域GH由至少一個DNA核苷酸單元(例如1-12個DNA單元、較佳4-12個DNA單元、更佳6-10個DNA單元，例如7-10個DNA單元、最佳8、9或10個DNA單元)組成或包含該等DNA核苷酸單元。
在一些實施例中，區域GX’由3或4個核苷酸類似物(例如BNA(例如LNA))組成，區域X’由7、8、9或10個DNA單元組成，且區域Z’由3或4個核苷酸類似物(例如BNA(例如LNA))組成。該等設計包括(GX’-GH-GZ’)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3。
在一些實施例中，寡聚物(例如區域GX’)係由總共10、11、12、13或14個核苷酸單元之鄰接核苷酸序列組成，其中鄰接核苷酸序列包含或具有式(5’-3’)GX’-GH-GZ’，其中：GX’由1、2或3個核苷酸類似物單元(例如BNA(例如LNA)單元)組成；GH由7、8或9個在與互補RNA分子(例如mRNA靶標)以雙螺旋形成時能夠招募RNA酶之鄰接核苷酸單元組成；且GZ’由1、2或3個核苷酸類似物單元(例如BNA(例如LNA)單元)組成。
在一些實施例中，GX’由1個BNA(例如LNA)單元組成。在一些實施例中，GX’由2個BNA(例如LNA)單元組成。在一些實施例中，GX’由3個BNA(例如LNA)單元組成。在一些實施例中，GZ’由1個 BNA(例如LNA)單元組成。在一些實施例中，GZ’由2個BNA(例如LNA)單元組成。在一些實施例中，GZ’由3個BNA(例如LNA)單元組成。在一些實施例中，GH由7個核苷酸單元組成。在一些實施例中，GH由8個核苷酸單元組成。在一些實施例中，GH由9個核苷酸單元組成。在某些實施例中，區域GH由10個核苷單元組成。在某些實施例中，區域GH由1-10個DNA單元組成或包含該等DNA單元。在一些實施例中，GH包含1-9個DNA單元，例如2、3、4、5、6、7、8或9個DNA單元。在一些實施例中，GH由DNA單元組成。在一些實施例中，GH包含至少一個呈α-L構形之BNA單元，例如2、3、4、5、6、7、8或9個呈α-L-構形之LNA單元。在一些實施例中，GH包含至少一個α-L-氧基BNA/LNA單元或其中呈α-L-構形之全部LNA單元皆係α-L-氧基LNA單元。在一些實施例中，GX’-GH-GZ’中存在之核苷酸之數目係選自由以下組成之群：(核苷酸類似物單元-區域GH-核苷酸類似物單元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4，或；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、或；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1。在一些實施例中，GX’-GH-GZ’中核苷酸之數目係選自由以下組成之群：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4及4-7-3。在某些實施例中，區域GX’及GH中之每一者皆由三個BNA(例如LNA)單元組成，且區域GH由8或9或10個核苷單元(較佳DNA單元)組成。在一些實施例中，GX’及GZ’二者各自由兩個BNA(例如LNA)單元組成，且GH由8或9個核苷酸單元(較佳DNA單元)組成。在各個實施例中，其他缺口聚物設計包括彼等以下者：其中區域GX’及/或GZ’由3、4、5或6個核苷類似物(例如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)之單元或含有2’-氟-去氧核糖之單元)組成且區域H由8、9、10、11或12個核苷(例如DNA單元)組成，其中區域GX’- GH-GZ’具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4個單元。
BNA及LNA缺口聚物：術語BNA及LNA可互換使用。BNA缺口聚物係包含至少一個BNA核苷酸之缺口聚物寡聚物(區域GA)。LNA缺口聚物係包含至少一個LNA核苷酸之缺口聚物寡聚物(區域GA)。
核苷酸間連接
本文所述寡聚物及寡聚物結合物之單元經由連接基團偶合在一起。適宜地，每一單元經由連接基團連接至3’毗鄰單元。
熟習此項技術者應瞭解，在本發明上下文中，寡聚物末端處之5’單元不包含5’連接基團，但其可包含或可不包含5’末端基團。
本發明之寡聚物之核苷酸或其鄰接核苷酸序列經由連接基團偶合在一起。適宜地，每一核苷酸經由連接基團連接至3’毗鄰核苷酸。
視情況，本發明之寡核苷酸或本發明之寡核苷酸結合物可包含一或多個連接體基團及/或一或多個支鏈區域。在各個實施例中，連接體基團係核苷間或核苷酸間連接。
適宜核苷酸間連接包括彼等列舉於WO2007/031091中者，例如於WO2007/031091(以引用方式併人本文中)之第34頁之第一段中所列舉之核苷酸間連接。
對於一些實施例而言，較佳將核苷酸間連接自其正常磷酸二酯修飾成對核酸酶攻擊更具抗性者(例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，該二者可由RNA酶H裂解)，其亦容許減少靶基因之表現之反義抑制的途徑。
如本文提供之適宜含硫(S)核苷酸間連接可較佳。尤其對於缺口聚物之缺口區域(X)，硫代磷酸酯核苷酸間連接亦較佳。硫代磷酸酯連接亦可用於側接區域(W及Y，及用於將W或Y連接至V或Z，及在區域V或區域Z內，若適當)。
然而，區域W、X及Y可包含不為硫代磷酸酯之核苷酸間連接(例 如磷酸二酯連接)，尤其例如在使用核苷酸類似物保護區域W及Y內之核苷酸間連接免於內切核酸酶降解時-例如在區域W及Y包含LNA核苷酸時。
寡聚物中之核苷酸間連接可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，以便容許靶向RNA之RNA酶H裂解。對於改良之核酸酶抗性及其他原因(例如便於製造)，硫代磷酸酯較佳。
在本發明寡聚物之一個態樣中，核苷酸及/或核苷酸類似物藉助硫代磷酸酯基團連接至彼此。
應認識到，尤其在核苷酸類似物單元(通常區域W及或Y中)之間或毗鄰該等核苷酸類似物單元向其他硫代磷酸酯寡聚物中納入磷酸二酯連接(例如一個或兩個連接)可改良寡聚物之生物利用度及/或生物分佈-參見WO2008/113832，其以引用方式併入本文中。
在一些實施例(例如上文提及之實施例)中，若適宜且未明確指示，則所有剩餘連接基團皆係磷酸二酯或硫代磷酸酯或其混合物。
在一些實施例中，所有核苷酸間連接基團皆係硫代磷酸酯。
在提及具體缺口聚物寡核苷酸序列(例如本文提供之彼等具體序列中之任一者)時，應瞭解，在各個實施例中，在連接係硫代磷酸酯連接時，可使用替代連接(例如本文中揭示之彼等)，可使用(例如)磷酸酯(磷酸二酯)連接，尤其用於核苷酸類似物(例如LNA單元)之間之連接。同樣，在提及具體缺口聚物寡核苷酸序列(例如本文提供之彼等具體序列中之任一者)時，在C殘基注釋為5’甲基修飾之胞嘧啶時，在各個實施例中，寡聚物中存在之一或多個C可為未經修飾之C殘基。
WO09124238提及具有至少一個藉由中性核苷間連接附接至3'或5'末端之二環核苷的寡聚物化合物。因此，本發明之寡聚物可具有至少一個藉由中性核苷間連接(例如一或多個磷酸三酯、甲基膦酸酯、 MMI、醯胺-3、甲縮醛(formacetal)或硫代甲縮醛)附接至3'或5'末端之二環核苷。剩餘連接可為硫代磷酸酯。
載劑
在一些實施例中，本發明之寡聚物連接至一或多種可相同或不同之載劑組份。
在一些實施例中，寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L-第一寡聚物區域
其中L係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分。較佳地，L係選自生理上不穩定之連接體(區域PL)或替代連接體(區域E)或二者之組合。
第一寡聚物區域可經由5’端連接至連接體或載劑，如下所闡釋：載劑組份-L1-第一寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分；或或者，第一寡聚物區域可經由3’端連接至連接體或載劑，如下所闡釋：第一寡聚物區域-L2-載劑組份
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分。
對於某些實施例而言，較佳地，寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域
其中L1係可選連接體。
對於某些實施例而言，較佳地，連接體1存在。
對於某些實施例而言，較佳地，該載劑組份連接、較佳結合至該第一寡聚物區域。
對於某些實施例而言，較佳地，該載劑組份連接、較佳結合至該寡聚物之5’端。
對於某些實施例而言，較佳地，該載劑組份藉助連接體基團或 支鏈區域或系鏈分子或橋接部分連接、較佳結合至該寡聚物之5’端。
對於某些實施例而言，較佳地，連接體基團或支鏈區域係生理上不穩定之連接體基團或生理上不穩定之支鏈區域或生理上不穩定之系鏈分子或生理上不穩定之橋接部分。
對於某些實施例而言，較佳地，生理上不穩定之連接體基團係核酸酶易感性連接體，較佳磷酸二酯連接體。
對於某些實施例而言，較佳L1連接體係由生理上不穩定之連接體及C2-C36胺基烷基(包括例如C6至C12胺基烷基)組成。在較佳實施例中，L1連接體係由PO連接體及C6胺基連接體組成。
在一些實施例中，載劑組份係選自碳水化合物結合物或親脂性結合物，或載劑組份包含碳水化合物及親脂性結合物二者。
碳水化合物結合物部分可(例如)選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳糖-胺。較佳地，碳水化合物結合物部分係去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分。親脂性結合物可為疏水基團，例如C16-20疏水基團、固醇、膽固醇。可使用之其他碳水化合物及親脂性基團係(例如)揭示於本文中。
對於一些實施例而言，寡聚物可包含額外CA二核苷酸基序。較佳地，在寡聚物結合物之上下文中，CA基序位於載劑組份與寡聚物之間。CA基序較佳包含磷酸二酯連接且用作寡聚物與載劑組份之間之PO連接體。
B型肝炎病毒(HBV)
如本文中所述所有寡聚物及寡聚物結合物意欲能夠用於治療病毒病症、具體而言與HBV相關之病症。該等用途構成本發明之一部分。
如本文中所述所有寡聚物及寡聚物結合物意欲能夠用於製造用 於治療病毒病症、具體而言與HBV相關之病症之藥劑。該等用途構成本發明之一部分。
如本文中所述所有寡聚物及寡聚物結合物意欲能夠投與個體作為用於緩和、治癒或治療病毒病症、具體而言與HBV相關之病症之方法的一部分。該等用途構成本發明之一部分。
如本文中所述所有寡聚物及寡聚物結合物意欲能夠包含醫藥組合物之一部分以治療病毒病症、具體而言與HBV相關之病症。該等醫藥組合物構成本發明之一部分。
B型肝炎病毒(HBV)係正嗜肝性DNA病毒(orthohepadnavirus)屬(其係肝脫氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)家族之一部分)之物種。 該病毒引起疾病B型肝炎。除引起肝炎外，感染HBV亦可導致硬化及肝細胞癌。亦已表明其可增加胰臟癌之風險。
該病毒基於其包膜蛋白上存在之抗原表位分成四個主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)，且根據基因體之整體核苷酸序列變化分成八個基因型(A-H)。該等基因型具有不同地理分佈且基因型之間之差異影響疾病嚴重程度、病程及併發症之可能性及對治療及可能疫苗接種之反應。基因型相差至少8%。偏離其他基因體14%之F型係已知之最大偏離類型。A型在歐洲、非洲及東南亞(包括菲律賓)盛行。B及C型主要在亞洲；D型在地中海地區、中東及印度常見；E型集中於撒哈拉以南非洲；F(或H)型限於中南美洲。G型已在法國及德國發現。基因型A、D及F主要在巴西且所有基因型皆在美國出現，其中頻率取決於族群。
HBV具有環形DNA基因體，然而，DNA並非完全雙鏈，此乃因全長鏈之一端連接至病毒DNA聚合酶。基因體係3020-3320個核苷酸長(對於全長鏈)及1700-2800個核苷酸長(對於短長度之鏈)。
存在四種已知由HBV基因體編碼之基因(C,P,S及X)。核心蛋白 係由基因C(HBcAg)編碼，且其起始密碼子之前係上游框架內AUG起始密碼子，自其產生前-核心蛋白。HBeAg係藉由前-核心蛋白之蛋白水解處理產生。DNA聚合酶係由基因P編碼。
HBx
HBx多肽係干擾宿主中之轉錄、信號轉導、細胞週期過程、蛋白質降解、細胞凋亡及染色體穩定性的154個殘基蛋白。其與其細胞靶蛋白(HBX相互作用蛋白：HBXIP)形成異二聚體複合物，且此相互作用使中心體動力學及有絲分裂紡錘體形成失調。其與更改CUL4-DDB1 E3複合物之泛素連接酶活性之DDB1(受損DNA結合蛋白1)相互作用，該等複合物密切參與DNA複製及修復、轉錄及信號轉導之細胞內調節。
儘管其缺乏與任何已知脊椎動物蛋白之顯著序列一致性，但可能自DNA糖基化酶釋出。表現肝中之X蛋白之轉基因小鼠較野生型更可能發生肝細胞癌。此乃因X蛋白促進細胞週期進展，同時結合至腫瘤阻抑劑蛋白p53並抑制其實施其作用。實驗觀察亦表明，HBx蛋白增加TERT及端粒酶活性，從而延長肝細胞之壽命並促使惡性轉變。
在純化感染HBV之癌性肝細胞之研究中，發現蛋白精胺酸甲基轉移酶1(PRMT1)之表現程度由於PRMT1之甲基轉移酶功能與轉錄變化相關。過表現引起轉錄之HBV基因之數目減少，但相反，降低表現引起增加。亦發現在複製過程期間PRMT1欲由HBV DNA招募以調控轉錄過程。增加之HBx表現進而導致抑制PRMT1介導之蛋白甲基化，從而有益於病毒複製。
HBx靶序列包含以位置1196處之第一報告轉錄起始位點開始至位置1941處之多聚腺苷酸化位點的序列。自U95551序列之位置1196至1941之序列表示為SEQ ID No.1。U95551序列表示為SEQ ID No.3。
HBsAg
HBsAg(亦稱作主要表面抗原、HBV主要表面抗原、HBV表面抗原及「S」)係HBV之表面抗原。
基因S係編碼表面抗原(HBsAg)之基因。HBsAg基因係一個長的開放閱讀框，但含有三個框架內「起始」(ATG)密碼子，其將基因分成三個部分，即前-S1、前-S2及S。由於多個起始密碼子，產生稱作大、中及小之三個不同大小之多肽(前-S1+前-S2+S、前-S2+S或S)。
HBsAg係由三種由相同基因編碼之糖蛋白構成。該等蛋白質在相同閱讀框中轉譯，但以不同AUG起始密碼子開始；因此，所有皆具有相同C-末端。最大蛋白質係L蛋白(42kd)且M糖蛋白含於其中。S糖蛋白(27kD)含有M蛋白中。HBsAg蛋白亦分泌至患者之血清中，其中其可視為球形(大部分自身相關之S蛋白)或絲狀粒子(亦大部分S蛋白但具有一些L及M)。前者小於真實病毒，但細絲可相當大(幾百奈米)。
S-HBsAg係226個胺基酸殘基長。其係經由殘基4與24之間之胺基-末端跨膜結構域(TMD-I)錨定於ER脂質雙層中的整體膜糖蛋白。其包含殘基24與80之間之下游細胞溶解環(CYL-I)、殘基80與100之間之第二跨膜結構域(TMD-II)及涵蓋殘基101至164、面向ER腔(或細胞外粒子之表面)之抗原環(AGL)。預測羧基末端(殘基165至226)含有兩個TMD(TMD-III及-IV)，其分別位於位置173至193及202至222，由此處稱作細胞溶解環II(CYL-II)之短序列(殘基194至201)隔開，此乃因預測其位於ER膜之細胞溶解側。M-HBsAg蛋白序列在其胺基末端較S-HBsAg之蛋白序列長55個殘基(前-S2結構域)；其與後者在病毒套膜中共裝配，但對於形態發生及活體外感染性二者並非必需。L-HBsAg包含端視HBV基因型而定具有108至119個殘基之額外胺基-末端延伸(前-S1)的整個M多肽。其已利用兩種拓撲闡述，其中胺基-末端前-S結構域(前-S1加上前-S2)在ER膜(分泌病毒體上內部)或管腔(於病毒體表面 暴露)處細胞溶解。內部構象參與招募核酸蛋白殼用於病毒體裝配，而外部位置對應於病毒入口處之受體結合功能。
所有三種包膜蛋白皆係在內質網(ER)膜處合成，其中其經由蛋白-蛋白相互作用聚集，從而主要導致分泌空S-HBsAg塗佈之亞病毒粒子(SVP)。僅在L-HBsAg存於ER膜處之包膜蛋白聚集物中時，HBV核酸蛋白殼可招募於芽生複合物中並釋放為成熟病毒體。由於與L-HBsAg之活性相比，S-HBsAg對於自裝配之極大活性，HBV病毒體形成僅偶爾發生。
HBsAg靶序列包含自位置3158至3182之轉錄起始位點及自位置1至位置1941處之多聚腺苷酸化位點之環形U95551序列開始的序列。因此，HBsAg靶序列包含自環形U95551序列之位置3158至3182及位置1至1944之組合序列的序列。此靶序列表示為SEQ ID no.2。U95551序列表示為SEQ ID No.3。
靶標
在較佳態樣中，適宜地，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠調節B型肝炎病毒(HBV)之HBx或HBsAg中之靶序列。就此而言，本發明之寡聚物可影響通常哺乳動物細胞(例如人類細胞，例如肝細胞)中靶序列之抑制。
在一些實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物結合至靶核酸並與正常表現程度相比調節表現達至少10%或20%、更佳與正常表現程度(例如在不存在寡聚物或寡聚物結合物下之表現程度)相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在一個實施例中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠下調(例如抑制、降低或移除)HBx或HBsAg基因之表現。就此而言，本發明之寡聚物可影響HBx或HBsAg之抑制。該抑制通常可發生於哺乳動物細胞(例如人類細胞、例如肝細胞)中。在一些實施例中，本發明之寡 聚物結合至靶核酸並與正常表現程度相比影響表現之抑制至少10%或20%、更佳與正常表現程度(例如在不存在寡聚物或寡聚物結合物下之表現程度)相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%抑制。
在一些實施例中，在使用0.04nM及25nM(例如0.8nM及20nM)濃度本發明之化合物時，觀察到該調節。在相同或不同實施例中，表現之調節小於100%、例如小於98%、小於95%、小於90%、小於80%、例如小於70%。表現程度之調節可藉由量測蛋白含量(例如藉由諸如SDS-PAGE等方法，之後使用針對靶蛋白之適宜抗體之西方墨點法)來測定。或者，表現程度之調節可藉由量測mRNA之含量(例如藉由北方墨點法或定量RT-PCR)測定。在經由mRNA含量量測時，在一些實施例中，在使用適當劑量(例如0.04nM及25nM，例如0.8nM及20nM濃度)時下調之量通常係至在不存在本發明之化合物、結合物或組合物下正常量之10-20%之量。
如本文中所闡釋，細胞可為活體外轉染細胞。在一些實施例中，所用寡聚物或寡聚物結合物之濃度可為5nM。在一些實施例中，所用寡聚物濃度可為25nM。在一些實施例中，所用寡聚物或寡聚物結合物之濃度可為1nM。應注意，用於處理細胞之寡聚物之濃度通常係在活體外細胞分析中使用轉染(Lipofecton)實施，如實例中所闡釋。在不存在轉染劑下，獲得靶標之下調所需之寡聚物或寡聚物結合物之濃度通常介於1μM與25μM之間，例如5μM。
因此，本發明提供下調或抑制表現HBx或HBsAg蛋白及/或mRNA之細胞中HBx或HBsAg蛋白及/或mRNA之表現的方法，該方法包含向該細胞投與本發明之寡聚物或結合物以下調或抑制該細胞中HBx或HBsAg蛋白及/或mRNA之表現。適宜地，該細胞係哺乳動物細胞，例如人類細胞。在一些實施例中，投與可在活體外發生。在一些實施例 中，投與可在活體內發生。
對於某些實施例而言，靶向HBx之寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份亦結合至HBsAg。
靶序列
寡聚物或寡聚物結合物包含對應於靶序列中存在之核苷酸序列之反向補體的鄰接核苷酸序列或由其組成。
靶序列可為基因或mRNA，例如基因或mRNA之編碼或非編碼區域。舉例而言，靶序列可為編碼或非編碼外顯子。靶序列可包含外顯子之至少一部分。靶序列可為外顯子之一部分，例如在外顯子內。
在本發明實踐中，靶序列可為單鏈或雙鏈DNA或RNA；然而，單鏈DNA或RNA靶標較佳。應理解，本發明之反義寡核苷酸針對之靶序列包括靶向基因及相應mRNA(包括剪接變體)之等位基因形式。對於在瞭解靶多核苷酸之序列之之情況下選擇反義寡核苷酸之特定序列，文獻中有大量指南，例如Cook S.T.Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,Marcel Dekker公司，2001；Peyman及Ulmann,Chemical Reviews,90：543-584,1990；及Crooke,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32：329-376(1992)。mRNA靶標可包括5'加帽位點、tRNA引子結合位點、起始密碼子位點、mRNA供體剪接位點及mRNA受體剪接位點。
若靶多核苷酸序列包含mRNA轉錄，則序列互補寡核苷酸可與轉錄物之任何期望部分雜交。該等寡核苷酸原則上可有效抑制轉譯且能夠誘發本文所述效應。假設藉由阻斷起始密碼子處或附近之位點處之mRNA更有效地抑制轉譯。因此，寡核苷酸可與mRNA轉錄物之5'-區域互補。寡核苷酸可與mRNA(包括起始密碼子(轉錄物之轉譯部分之5'端處之第一密碼子)或毗鄰起始密碼子之密碼子)互補。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A-H之間具有一致性 (如下文詳細闡述)。
在一個實施例中，靶序列可與HBV基因型A-H中之一或多者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型A具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型B具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型C具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型D具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型E具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型F具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型G具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。舉例而言，靶序列可與HBV基因型H具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A-H中之兩者或更多者之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A、B、C及D中之兩者或更多者之間具有一致性。靶序列可在HBV基因型A與B之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A、B、C及D中之兩者或更多者之間具有一致性。靶序列可在HBV基因型A與C之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A、B、C及D中之三者或更多者之間具有一致性。靶序列可在HBV基因型A、B、C及D之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A、B、C及D中之三者或更多者之間具有一致性。靶序列可在HBV基因型A、B及C之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在HBV基因型A、B、C及D中之三者或更多者之間具有一致性。靶序列可在HBV基因型A、B及D之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%一致性。
在一個實施例中，靶序列可在所有HBV基因型A、B、C及D之間具有一致性。靶序列可在HBV基因型A、B、C及D之間具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。
在各個實施例中，靶序列係在顯示為SEQ ID No.3之序列內。
在一個實施例中，靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA的至少一部分。
在各個實施例中，靶序列係HBx或HBsAg或其天然變體。
在各個實施例中，靶序列係在顯示為SEQ ID No.1之序列內。
在各個實施例中，靶序列係在顯示為SEQ ID No.2之序列內。
在各個實施例中，靶序列係選自SEQ ID NO 3中之以下位置中之一或多者：位置1至1944、位置157至1840、位置1196至1941、位置1376至1840及位置3158-3182。較佳地，靶序列係選自SEQ ID NO：3之位置1530至1598，更佳選自SEQ ID NO：3之位置1577至1598且最佳選自SEQ ID NO：3之位置1530至1543。
在各個實施例中，靶序列可選自由SEQ ID No.3之以下位置中之任一或多者組成之群：1264-1278； 1265-1277；1530-1543；1530-1544；1531-1543；1551-1565；1551-1566；1577-1589；1577-1591；1577-1592；1577至1598；1578-1590；1578-1592；1583-1598；1584-1598；1585-1598；670-706 670-684 691-705；691-706；692-706；693-706；694-706。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內之8-30、8-20、8-18、8-16、8-14、8-12或8-10個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合 物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少8個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少9個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少10個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少11個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少12個鄰接核苷酸；較佳 地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少13個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少14個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少15個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在態樣中，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠靶向顯示為SEQ ID NO：3之位置1200至1900、較佳位置1530至1598、更佳位置1577至1598、最佳位置1530至1543之序列內的至少16個鄰接核苷酸；較佳地，其中該寡聚物或寡聚物結合物與該等鄰接核苷酸互補。
在一個實施例中，靶序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID No 2或SEQ ID No 3中闡述之序列內的序列或與其具有至少80%一致性之序列。因此，寡聚物或寡聚物結合物可包含選自本文提供之群之核心基序或由其組成，其中該寡聚物或寡聚物結合物(或其鄰接核苷酸部分)可視情況針對該所選基序序列具有一個、兩個或三個失配：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)； AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)
在一個實施例中，靶序列包含下述序列或與其任一者具有至少80%一致性之序列。因此，寡聚物或寡聚物結合物可包含與選自下文提供之群之靶序列雜交之序列或由其組成，其中該寡聚物或寡聚物結合物(或其鄰接核苷酸部分)可視情況針對該所選靶序列具有一個、兩個或三個失配。
在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物在與靶序列雜交時可耐受1、2、3或4個(或更多個)失配，且仍足夠結合至靶標以顯示期望效應，即靶標之下調。失配可(例如)藉由寡聚物核苷酸序列之增加長度及/或核苷酸序列內存在之核苷酸類似物(例如LNA)之增加數目得以補償。
在一些實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列(例如編碼HBx或HBsAg之核酸之相應區域)雜交時包含不超過3個、例如不超過2個失配。
在一些實施例中，鄰接核苷酸序列在與靶序列(例如編碼HBx或HBsAg之核酸之相應區域)雜交時包含不超過單一失配。
若靶標係HBx，則本發明之寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與選自本文提供之核苷酸序列之相應序列較佳具有至少80%一致性(有時稱作同源性或同源)，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%同源、至少97%同源、至少98%同源、至少99%同源，例如100%同源(一致)。
若靶標係HBx，則本發明之寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與表示為SEQ ID No.1之序列內之相應序列的反向補體較佳具有至少80%一致性(有時稱作同源性或同源)，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%同源、至少97%同源、至少98%同源、至少99%同源，例如100%同源(一致)。
若靶標係HBx，則本發明之寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與表示為SEQ ID No.1之序列內存在之子序列較佳 至少80%互補，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%互補、至少97%互補、至少98%互補、至少99%互補，例如100%互補(較佳互補)。
在一些實施例中，若靶標係HBx，則寡聚物或寡聚物結合物(或其鄰接核苷酸部分)係選自或包含本文提供之序列中之一者或至少10個其鄰接核苷酸之子序列，其中該寡聚物或寡聚物結合物(或其鄰接核苷酸部分)在與該序列比較時可視情況包含一個、兩個或三個失配。
若靶標係HBsAg，則本發明之寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與選自本文提供之群之相應序列較佳具有至少80%一致性(有時稱作同源性或同源)，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%同源、至少97%同源、至少98%同源、至少99%同源，例如100%同源(一致)。
若靶標係HBsAg，則本發明之寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與表示為SEQ ID No.2之序列內存在之相應序列之反向補體較佳具有至少80%一致性(有時稱作同源性或同源)，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%同源、至少97%同源、至少98%同源、至少99%同源，例如100%同源(一致)。
若靶標係HBsAg，則本發明之寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列或鄰接核苷酸序列與表示為SEQ ID No.2之序列內存在之子序列較佳至少80%互補，例如至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%互補、至少97%互補、至少98%互補、至少99%互補，例如100%互補(較佳互補)。
在一些實施例中，若靶標係HBsAg，則寡聚物或寡聚物結合物(或其鄰接核苷酸部分)係選自或包含選自本文提供之群之序列中之一 者或至少10個其鄰接核苷酸之子序列，其中該寡聚物或寡聚物結合物(或其鄰接核苷酸部分)在與該序列比較時可視情況包含一個、兩個或三個失配。
在一些實施例中，子序列可由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個鄰接核苷酸、例如12-22、例如12-18、例如12-16個核苷酸組成。適宜地，在一些實施例中，子序列與本發明寡聚物之鄰接核苷酸序列具有相同長度。
然而，應認識到，在一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之核苷酸序列可包含額外5’或3’核苷酸，例如獨立地1、2、3、4或5個額外核苷酸5’及/或3’，其與靶序列不互補。就此而言，在一些實施例中，本發明之寡聚物可包含5’及或3’側接額外核苷酸之鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，額外5’或3’核苷酸係天然核苷酸，例如DNA或RNA。在一些實施例中，額外5’或3’核苷酸可代表區域D，如本文缺口聚物寡聚物或寡聚物結合物之上下文中所提及。
RNA酶招募
應認識到，寡聚物分子可經由非RNA酶介導之靶mRNA降解、例如藉由轉譯之立體阻礙或其他方法起作用。
對於一些實施例而言，本發明之寡聚物或寡聚物結合物能夠招募核糖核酸內切酶(RNA酶)，例如RNA酶H。
本發明之寡聚物或寡聚物結合物較佳包含至少6個、例如至少7個連續核苷酸單元、例如至少8或至少9個連續核苷酸單元(殘基)、包括7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續核苷酸之區域，該等連續核苷酸在與互補靶RNA以雙螺旋形成時能夠招募RNA酶。能夠招募RNA酶之鄰接序列可為區域X，如本文中所述缺口聚物之上下文中所提及。在一些實施例中，能夠招募RNA酶之鄰接序列(例如區域X)之大小可高於(例如)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或 20個核苷酸單元。
EP 1 222 309提供用於測定RNA酶H活性之活體外方法，其可用於測定招募RNA酶H之能力。若在提供有互補RNA靶標時寡聚物具有使用僅DNA寡核苷酸測定之初始速率之至少1%、例如至少5%、例如至少10%或20%以上之初始速率(如以pmol/l/min量測)，則認為該寡聚物能夠招募RNA酶H，該僅DNA寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有DNA單元，無2’取代，該寡核苷酸中所有單元之間皆具有硫代磷酸酯連接基團，使用由EP 1 222 309之實例91-95提供之方法。
在一些實施例中，若在提供有互補RNA靶標及RNA酶H時，RNA酶H初始速率(如以pmol/l/min量測)係使用等效僅DNA寡核苷酸測定之初始速率之小於1%、例如小於5%、例如小於10%或小於20%，則認為該寡聚物基本上能夠招募RNA酶H，其中無2’取代，該寡核苷酸之所有核苷酸之間皆具有硫代磷酸酯連接基團，使用由EP 1 222 309之實例91-95提供之方法。
在其他實施例中，若在提供有互補RNA靶標及RNA酶H時，RNA酶H初始速率(如以pmol/l/min量測)係使用等效僅DNA寡核苷酸測定之初始速率之至少20%、例如至少40%、例如至少60%、例如至少80%，則認為該寡聚物能夠招募RNA酶H，其中無2’取代，該寡核苷酸中所有核苷酸之間皆具有硫代磷酸酯連接基團，使用由EP 1 222 309之實例91-95提供之方法。
通常，形成連續核苷酸單元之本發明之寡聚物或寡聚物結合物之區域由與RNA靶標形成DNA/RNA樣雙螺旋之核苷酸單元組成-且包括呈α-L構形之DNA單元及LNA單元，尤佳係α-L-氧基LNA，該等連續核苷酸單元在與互補靶RNA以雙螺旋形成時能夠招募RNA酶。
本發明之寡聚物或寡聚物結合物可包含包含核苷酸及核苷酸類似物二者之核苷酸序列，且可呈缺口聚物、頭聚物或混合聚物形式。
在一些實施例中，除增強寡聚物對靶區域之親和力外，一些核苷類似物亦介導RNA酶(例如，RNA酶H)結合及裂解。由於α-L-LNA單元在某一程度上招募RNA酶H活性，故在一些實施例中，含有α-L-LNA單元之寡聚物之缺口區域(例如，如本文中提及之區域X)由可由RNA酶H識別及裂解之較少單元組成，且混合聚物構築中引入更大撓性。
合成
本發明提供製造寡聚物結合物之方法，其包含使至少一種寡聚物結合至載劑組份，其中該寡聚物結合物適於治療病毒病症。
本發明亦提供製造如本文中所述多寡聚物結合物之方法，其包含使一或多種寡聚物附接至連接體基團(E或L)或對稱支鏈區域F，其隨後附接至如本文中所述載劑組份，其中該寡聚物結合物適於治療病毒病症。
在一些實施例中，對稱支鏈區域係1,3-戊基醯胺基丙基(來自1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺)、參-2,2,2-(丙基氧基甲基)乙基(來自參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺)或參-2,2,2-(丙基氧基甲基)亞甲基氧基丙基(來自參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]亞甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺)。在一些實施例中，不對稱支鏈區域係1,3-戊基醯胺基丙基(來自1-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]-3-[5-茀并甲氧基羰基氧基戊基醯胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺)，Glen Reseach,USA提供該等適宜支鏈(例如目錄號0-1920、10-1922及10-1925)。
如本文中所述連接體基團及支鏈區域可裂解或不可裂解。
在又一態樣中，提供製造本發明組合物之方法，其包含混合本 發明之寡聚物結合物與醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
活化寡聚物
如本文所用術語「活化寡聚物」係指共價連接至(即，官能化成)至少一個官能部分之本發明寡聚物，該官能部分允許寡聚物共價連接至一或多個結合部分(即自身並非核酸或單元之部分)，以形成本文所述結合物。通常，官能部分將包含能夠經由(例如)腺嘌呤鹼基之3’-羥基或環外NH2基團共價鍵結至寡聚物之化學基團、較佳親水之間隔體及能夠結合至結合部分之末端基團(例如，胺基、硫氫基或羥基)。在一些實施例中，此末端基團未經保護，例如係NH2基團。在其他實施例中，末端基團由(例如)任何適宜保護基團保護，例如彼等闡述於「Protective Groups in Organic Synthesis」，Theodora W Greene及Peter G M Wuts，第3版(John Wiley & Sons,1999)中者。適宜羥基保護基團之實例包括酯(例如乙酸酯)、芳烷基(例如苄基、二苯基甲基或三苯基甲基)及四氫吡喃基。適宜胺基保護基團之實例包括苄基、α-甲基苄基、二苯基甲基、三苯基甲基、苄基氧基羰基、第三丁氧基羰基及醯基(例如三氯乙醯基或三氟乙醯基)。在一些實施例中，官能部分自身裂解。在其他實施例中，官能部分可生物降解。例如，參見美國專利第7,087,229號，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之寡聚物在5’端經官能化以容許結合部分共價附接至寡聚物之5’端。在其他實施例中，本發明之寡聚物可在3’端經官能化。在其他實施例中，本發明之寡聚物可沿主鏈或在雜環鹼基部分上經官能化。在其他實施例中，本發明之寡聚物可在一個以上獨立地選自以下之位置處經官能化：5’端、3’端、主鏈及鹼基。
在一些實施例中，本發明之活化寡聚物係藉由在合成期間納入一或多個共價附接至官能部分之單元來合成。在其他實施例中，本發 明之活化寡聚物係利用尚未經官能化之單元合成，且在合成完成後，寡聚物經官能化。在一些實施例中，寡聚物經含有胺基烷基連接體之受阻酯官能化，其中烷基部分具有式(CH2)w，其中w係介於1至10範圍內之整數，較佳約6，其中烷基胺基之烷基部分可為直鏈或具支鏈，且其中官能基經由酯基團(-O-C(O)-(CH2)wNH)附接至寡聚物。
在其他實施例中，寡聚物經含有(CH2)w-硫氫基(SH)連接體之受阻酯官能化，其中w係介於1至10範圍內之整數，較佳約6，其中烷基胺基之烷基部分可為直鏈或具支鏈，且其中官能基經由酯基團(-O-C(O)-(CH2)wSH)附接至寡聚物。在一些實施例中，硫氫基-活化寡核苷酸與聚合物部分(例如聚乙二醇或肽)結合(經由形成二硫鍵)。
如上文所述含有受阻酯之活化寡聚物可藉由業內已知之任何方法且具體而言藉由PCT公開案第WO 2008/034122號及其中之實例揭示之方法來合成，該案件之全文以引用方式併入本文中。
在其他實施例中，本發明之寡聚物藉助實質上如美國專利第4,962,029號及第4,914,210號中所述之官能化試劑、即具有在一端經由親水性間隔體鏈連接至相對端之亞磷醯胺的實質上線性試劑(其包含經保護或未經保護之硫氫基、胺基或羥基)藉由向寡聚物中引入硫氫基、胺基或羥基來官能化。該等試劑主要與寡聚物之羥基反應。在一些實施例中，該等活化寡聚物具有偶合至寡聚物之5’-羥基之官能化試劑。在其他實施例中，活化寡聚物具有偶合至3’-羥基之官能化試劑。在其他實施例中，本發明之活化寡聚物具有偶合至寡聚物之主鏈上之羥基的官能化試劑。在其他實施例中，本發明之寡聚物經一種以上官能化試劑官能化，如美國專利第4,962,029號及第4,914,210號中所述，其全文以引用方式併入本文中。合成該等官能化試劑及將其納入單元或寡聚物中之方法揭示於美國專利第4,962,029號及第4,914,210號中。
在一些實施例中，個相結合之寡聚物之5’-末端經二烯基亞磷醯胺衍生物官能化，之後經由Diels-Alder環加成反應使去保護之寡聚物與(例如)胺基酸或肽結合。
在各個實施例中，向寡聚物中納入含有2’-糖修飾形式(例如2’-胺基甲酸酯取代之糖或2'-(O-戊基-N-酞醯亞胺基)-去氧核糖)之單元有利於結合部分共價附接至寡聚物之糖。在其他實施例中，在一或多個單元之2'-位置處具有含有胺基之連接體之寡聚物係使用諸如5'-二甲氧基三苯甲基-2'-O-(e-鄰苯二甲醯亞胺基胺基戊基)-2'-去氧腺苷-3'-N,N-二異丙基-氰基乙氧基亞磷醯胺等試劑來製備(例如，參見Manoharan等人，Tetrahedron Letters,1991,34,7171)。
在其他實施例中，本發明之寡聚物可在核鹼基上(包括在N6嘌呤胺基上、在鳥嘌呤之環外N2上或在胞嘧啶之N4或5位置上)具有含胺之官能部分。在各個實施例中，該官能化可藉由使用在寡聚物合成中已經官能化之市售試劑達成。
一些官能部分有市售，例如異雙官能及同雙官能連接部分係自Pierce公司(Rockford,Ill.)購得。其他市售連接基團係5'-胺基-調節劑C6及3'-胺基-調節劑試劑，二者皆係自Glen Research公司(Sterling,Va.)購得。5'-胺基-調節劑C6亦係自ABI(Applied Biosystems公司，Foster City,Calif.)以Aminolink-2購得且3'-胺基-調節劑亦係自Clontech Laboratories公司(Palo Alto,Calif.)購得。
多寡聚物
如上文所指示，在本發明之一些實施例中，寡聚物或寡聚物結合物之寡聚物組份可包含或具有兩個靶向序列之分子或作為該分子之一部分。在一些情況下，該等分子稱作多寡聚物。
在一些實施例中，寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域-L3-載劑組份
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2及L3可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份1-L1-第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域-L3-載劑組份2
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1、L2及L3可相同或不同
其中載劑組份1及載劑組份2可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L1-載劑組份1-L2-第二寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2及L3可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L1-載劑組份1-L2-第二寡聚物區域-L3-載劑組份2
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2可相同或不同
其中載劑組份1及載劑組份2可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份1-L1-第一寡聚物區域-L2-載劑組份2-L3-第二寡聚物區域-L4-載劑組份3
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1、L2及L3可相同或不同
其中載劑組份1、載劑組份2及載劑組份3可相同或不同。
在一些實施例中，較佳地，用於根據本發明使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2可相同或不同。
在一些實施例中，存在連接體1。
在一些實施例中，存在連接體2。
在一些實施例中，存在連接體3。
在一些實施例中，載劑組份連接、較佳結合至該第一寡聚物區域。
在一些實施例中，載劑組份連接、較佳結合至該寡聚物之5’端。
在一些實施例中，第一寡聚物區域及第二寡聚物區域各自藉助連接體或支鏈區域連接、較佳結合。
在一些實施例中，第一寡聚物區域及第二寡聚物區域各自藉助 生理上不穩定之連接體基團或生理上不穩定之支鏈區域連接、較佳結合。
在一些實施例中，本發明提供多寡聚物化合物，其可包含第一區域(區域PA)、第二區域(區域PB)及第三區域(區域PC)，其中第一區域共價連接至至少一種其他寡聚物化合物(區域PA’)，其中第一區域(區域PA)及區域PA’經由生物可裂解之連接體(區域PB’)共價連接，該生物可裂解之連接體可(例如，如根據此處揭示之第二區域)為(例如)至少一個磷酸二酯連接之DNA或RNA(例如DNA)(例如兩個、三個、四個或五個磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷(例如DNA核苷))的區域。在一些實施例中，區域PB及PB’可具有相同結構、例如相同數目之DNA/RNA核苷及磷酸二酯連接及/或相同核鹼基序列。在其他實施例中，區域PB及PB’可不同。舉例而言，該等多寡聚物化合物可藉由結構例如：(5’-3’或3’-5’)結合物/載劑化合物-PO-ON-PO’-ON’，其中結合物/載劑化合物係區域PC，PO係區域PB，PO’係區域PB’，且ON係區域PA，且ON’係區域PA’。
應瞭解，在一些實施例中，區域PA’可包含多個經由生物可裂解之連接體串聯(或平行)連接之其他寡聚物化合物(例如又一2或3種寡聚物化合物)，例如：結合物/載劑化合物-PO-ON-PO-ON’-PO”-ON”，或結合物/載劑化合物-PO-ON-[PO-ON’]n，其中n可為(例如)1、2或3，且每一ON’可相同或不同，且若不同可具有相同或不同靶標。
在態樣中，本發明採用多寡聚物化合物(本文中亦稱作寡聚物化合物)，其用於調節(例如抑制)細胞、例如HBV HBx或HBsAg中之靶核酸。寡聚物化合物包含至少兩個寡聚物區域(例如(PA及PA’))且可包含其他寡聚物區域(例如PA”)。至少一個寡聚物區域係能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列的寡聚物，例如如由本發明提供之寡聚物。在某些實施例中，PA、PA’(及PA”，若存在)中之每一者皆可 為能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列的寡聚物，例如如由本發明提供之寡聚物。PA及PA’可為靶序列中之不同位置之補體。
在一些實施例中，PA可為能夠調節HBx中之靶序列的寡聚物且PA’(及/或PA”，若存在)可為能夠調節不同靶序列之寡聚物。在某些實施例中，PA’(及/或PA”，若存在)可能夠調節HBV之HBsAg中之靶序列。舉例而言，PA’(及/或PA”，若存在)可為能夠調節HBV之HBsAg中之靶序列的寡聚物，如本文中所述。
在一些實施例中，PA’可為能夠調節HBx中之靶序列的寡聚物且PA(及/或PA”，若存在)可為能夠調節HBV之不同靶序列之寡聚物。 在某些實施例中，PA(及/或PA”，若存在)可能夠調節HBV之HBsAg中之靶序列。舉例而言，PA(及/或PA”，若存在)可為能夠調節HBV之HBsAg中之靶序列的寡聚物，如本文中所述。
每一寡聚物區域皆可側接生物可裂解之區域(區域PB)，其可為(例如)1-10個鄰接核苷酸之又一區域(區域PB)，該區域包含至少一個磷酸二酯連接。可使用其他生理上不穩定之核苷區域。
在一些實施例中，本發明之寡聚物化合物視情況經由包含(例如1-10個)磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷之短區域共價連接至結合物基團、靶向基團、反應基團、活化基團或封端基團。該等基團之實例係本文提及之載劑組份及結合物組份。
在一些實施例中，本發明化合物並不包含RNA(單元)。在一些實施例中，本發明化合物形成視情況連接至官能基(例如結合物基團)之單一鄰接序列，且係該線性分子或合成為線性分子。因此，寡聚物化合物可為單鏈分子。在一些實施例中，寡聚物並不包含(例如)至少3,4或5個鄰接核苷酸之短區域，其與相同寡聚物化合物(即雙螺旋)內之等效區域互補。在一些實施例中，寡聚物可(基本上)不為雙鏈。在一些實施例中，寡聚物基本上不為雙鏈，例如不為siRNA。
寡聚物區域PA、PA’及(若存在)PA”係硫代磷酸酯寡聚物，即每一寡聚物區域PA、PA’及(若存在)PA”內之至少70%核苷間連接係硫代磷酸酯連接，例如寡聚物區域PA、PA’及PA”(若存在)內之至少80%或至少90%或全部核苷間連接(若存在)係硫代磷酸酯。
在一些實施例中，寡聚物區域PA、PA’及(若存在)PA”可形成單一鄰接寡核苷酸序列。區域PA、PA’及PA”由區域PB(例如1、2、3、4或5個磷酸二酯連接之DNA核苷之區域)間隔。
在區域PB僅包含1個核苷時，區域PB核苷(例如DNA核苷)之間之核苷間連接中之至少一者或二者可為磷酸二酯連接。在區域PB僅包含2個或更多個核苷時，區域PB核苷(例如DNA核苷)之間之核苷間連接可為磷酸二酯連接及/或可為另一核苷間連接(例如硫代磷酸酯連接)。
本發明之寡聚物(例如PA、PA’及(若存在)PA”)並不形成siRNA複合物之一部分。本發明之寡聚物(例如PA、PA’及(若存在)PA”)並不互補，例如其並不彼此雜交以形成8個以上或在一些實施例中6個以上鄰接鹼基對之區域。在一些實施例中，區域PA及PA”並不彼此雜交以形成4個以上鄰接鹼基對之區域。實例性鹼基對可介於A-T、G-C或A-U之間。在存在三個寡聚物區域PA、PA’及PA”之情形下，非互補介於PA與PA’之間、及PA’與PA”之間以及PA與PA”之間。
寡聚物區域PA、PA’及(若存在)PA”並不與(實質上)互補寡核苷酸呈雙螺旋形式-例如並非siRNA。
在一些實施例中，寡聚物區域PA、PA’及PA”共享相同鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，寡聚物區域PA及PA’共享相同鄰接核苷酸序列。就此而言，本發明提供單一化合物，其可用於遞送寡聚物之多個拷貝(即具有相同鄰接核鹼基序列及視情況相同化學修飾形式)至靶組織。
寡聚物區域(PA、PA’及(若存在)PA”)經由至少一個生物可裂解之區域(本文中稱作區域PB(且其中存在一個以上區域PB、區域PB’及區域PB”))連接。在一些實施例中，區域PB包含1-10個核苷，其在寡聚物區域之間或(或每一)寡聚物區域與連接基團之間形成生理上不穩定之區域。可使用DNA磷酸二酯核苷之區域，但若其適宜地生理上不穩定，可使用其他核苷酸區域。
在一些實施例中，寡聚物區域(PA、PA’或若存在PA”)與(每一)第二區域PB之間之核苷間連接係連接至區域PB之第一(或唯一)DNA或RNA核苷之磷酸二酯，該區域PB包含至少一個磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷。
在一些實施例中，區域PB可包含可為磷酸二酯連接之其他DNA或RNA核苷。
如本文所解釋，區域PB亦可用於視情況經由又一連接基團(PY)將官能基接合至寡聚物區域。使用區域PB作為可裂解之連接體以將官能基接合至寡聚物詳細闡述於PCT/EP2013/073858中，其以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，區域PB進一步共價連接至第三區域，其可為(例如)結合物、靶向基團、反應基團及/或封端基團(PC)。基團(PC)可為如本文中所述載劑組份。
在一些態樣中，本發明係基於提供生理上不穩定之區域，即連接第一區域(例如反義寡核苷酸)及結合物或官能基(例如載劑組份)之第二區域。生理上不穩定之區域可包含至少一個磷酸二酯連接之核苷，例如DNA或RNA核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個磷酸二酯連接之核苷，例如DNA或RNA。在一些實施例中，寡聚物化合物包含可裂解之(生理上不穩定之)連接體。就此而言，可裂解之連接體較佳存於區域PB中(或在一些實施例中，介於區域PA與PB之 間)。
在一些實施例中，一或(或多個或全部)區域PB可包含至少一個經由磷酸二酯連接連接至第一區域之DNA或RNA核苷或由其組成。在一些態樣中，將寡聚物區域與第二區域之間之核苷間連接視為區域PB之一部分。
在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB包含至少1個與10個之間之連接核苷(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個連接之DNA或RNA核苷酸)或由其組成。儘管DNA/RNA磷酸二酯之區域被認為在可裂解之連接體之提供中係重要的，但區域PB亦可包含糖修飾之核苷類似物，例如彼等在上述第一區域下提及者。然而，在一些實施例中，區域PB之核苷係(視情況獨立地)選自由以下組成之群：DNA及RNA。在一些實施例中，區域PB之核苷係(視情況獨立地)DNA。
應認識到，區域PB之核苷可包含天然或非天然核鹼基。通常，區域PB包含至少一個磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷(在一些實施例中，其可為毗鄰寡聚物之第一核苷)。若區域PB包含其他核苷，則區域PB亦可包含不為磷酸二酯之其他核苷連接，例如(視情況獨立地)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或膦酸甲基酯。然而，在其他例示實施例中，區域PB中之所有核苷間連接皆係硫代磷酸酯。在一些實施例中，區域PB之所有核苷皆包含(視情況獨立地)2’-OH核糖(RNA)或2’-H糖-即RNA或DNA。已顯示介於1個至5個、或1個至4個之間(例如2、3、4個)磷酸酯(磷酸二酯)連接之DNA核苷尤其可用於本發明化合物。
在一些實施例中，第二區域包含至少1個與10個之間(例如磷酸二酯)連接之DNA或RNA核苷(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(例如磷酸二酯)連接在DNA或RNA核苷酸)或由其組成。
在一些實施例中，區域PB包含不超過3個或不超過4個連續DNA 或RNA核苷(例如DNA核苷)。因此，區域PB可短至無法招募RNA酶H，此態樣在區域PB不形成與靶標互補之單一鄰接核鹼基序列之一部分之實施例中可能很重要。在一些實施例中，較短區域PB(例如1-4nt長)亦可較佳，此乃因其不可能為序列特異性限制酶之靶標。因此，可改變區域PB對內切核酸酶裂解之易感性，且藉此微調活體內或甚至細胞內活性寡聚物之活化速率。適宜地，若需要極快活化，則可採用較長區域PB及/或包含(例如細胞或組織特異性或差異表現之)限制酶之識別位點的區域B。
在一些實施例中，區域PB可視情況經由連接體基團(PY，例如本文中提供之彼等)結合至官能基(PC)，例如結合物、靶向反應基團、活化基團或封端基團。官能基亦可經由其他方式(例如經由磷酸酯核苷連接(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯或甲基膦酸酯)或三唑基團)接合至寡聚物區域或本發明化合物。在一些態樣中，連接基團與至少兩個寡聚物區域之間之區域PB相同，且因此可為磷酸二酯連接。
在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB之DNA或RNA核苷酸係獨立地選自DNA及RNA核苷酸。在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB之DNA或RNA核苷酸係DNA核苷酸。在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB之DNA或RNA核苷酸係RNA核苷酸。
在第二區域之上下文中，術語DNA及RNA核苷可包含天然或非天然鹼基(亦稱作鹼基類似物或經修飾之鹼基)。
應認識到，在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB可進一步包含其他核苷酸或核苷酸類似物。在一些實施例中，(或多個或每一)區域PB僅包含DNA或RNA核苷。在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB包含一個以上核苷，一個或每一區域PB中之核苷間連接包含磷酸二酯連接。在一些實施例中，在一個(或多個或每一)區域PB 包含一個以上核苷時，第二區域中之所有核苷間連接皆包含磷酸二酯連接。
在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB之至少兩個連續核苷係DNA核苷(例如至少3或4或5個連續DNA核苷酸)。在一些實施例中，一個(或多個或每一)區域PB之至少兩個連續核苷係RNA核苷(例如至少3或4或5個連續RNA核苷酸)。在一些實施例中，(或多個或每一)區域PB之至少兩個連續核苷係至少一個DNA及至少一個RNA核苷。區域PA與區域PB之間之核苷間連接可為磷酸二酯連接。在一些實施例中，在區域PB包含一個以上核苷時，至少一個其他核苷間連接係磷酸二酯-例如毗鄰區域PA之2(或3或4或5)個核苷之間之連接基團。
區域PB可在至少一側(5’或3’)上側接第一區域(例如反義寡核苷酸)，且在另一側(各別地3’或5’)上視情況經由連接體基團(即介於第二區域與結合物/封端基團等部分之間)側接另一寡聚物區域(PA’)或結合物部分或類似基團(例如封端部分/基團、靶向部分/基團或治療性小分子部分)。
在一些實施例中，在寡聚物區域(例如PA、PA’及/或PA”)及PB與互補靶序列比對時，區域PB不形成互補序列。
在一些實施例中，在寡聚物區域(例如PA、PA’及/或PA”)及PB與互補靶序列比對時，區域PB不形成互補序列。就此而言，區域PA及PB可一起形成與靶序列互補之單一鄰接序列。
在一些實施例中，基於靶組織或細胞或亞細胞區室中存在之主要內切核酸酶裂解酶，選擇區域PB中之鹼基之序列以提供最佳內切核酸酶裂解點。就此而言，藉由自靶組織及非靶組織分離細胞萃取物，可基於與非靶細胞(例如腎)相比期望靶細胞(例如肝/肝細胞)中之優先裂解活性選擇用於區域PB中之內切核酸酶裂解序列。就此而 言，可針對期望組織/細胞最佳化用於靶標下調之化合物之功效。
在一些實施例中，區域PB包含序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG之二核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶，及/或T可經U置換。
在一些實施例中，區域PB包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC及GGG之三核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U置換。
在一些實施例中，區域PB包含序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX及GGGX之三核苷酸，其中X可選自由以下組成之群：A、T、U、G、C及其類似物，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U置換。應認識到，在提及(天然)核鹼基A、T、U、G、C時，該等核鹼基可經用作等效天然核鹼基(例如具有互補核苷之鹼基對)之核鹼基類似物取代。
在一些實施例中，本發明化合物可包含一個以上結合物基團(或 一個以上官能基PX-例如結合物、靶向、封端或活化基團或反應或活化基團)，例如2或2個該等基團。在一些實施例中，區域PB視情況經由[例如非核苷酸]連接體基團共價連接至至少一個官能基，例如兩個或三個官能基。在一些實施例中，第一區域(PA)可共價連接(例如經由核苷間連接，例如磷酸二酯連接)至兩個區域PB，例如一個5’及一個3’至第一區域PA，其中每一區域PB可(視情況獨立地)選自本文所述區域PB。
組合物
本發明之寡聚物及本發明之寡聚物結合物可用於醫藥調配物及組合物。適宜地，該等組合物包含醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。WO 2007/03109提供適宜且較佳之醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑-其以引用方式併入本文中。適宜劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物亦提供於WO 2007/03109中-其亦以引用方式併入本文中。
本發明之醫藥組合物可包括可含有多種組份之醫藥上可接受之載劑，該等組份提供多種功能，包括調控藥物濃度、調控溶解性、化學穩定、調控黏度、吸收增強、調控pH及諸如此類。
醫藥載劑可包含適宜液體媒劑或賦形劑及一或多種可選輔助添加劑。液體媒劑及賦形劑係習用且有市售。其闡釋性實例係蒸餾水、生理鹽水、右旋糖水溶液及諸如此類。對於水溶性調配物，醫藥組合物較佳包括緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液)或其他有機酸鹽(較佳pH在6.5至8之範圍內)。對於含有弱可溶性反義化合物之調配物，可(例如)藉由使用0.04-0.05%(w/v)之量之非離子型表面活性劑(例如聚山梨醇酯80)以增加溶解性來採用微乳液。其他組份可包括抗氧化劑，例如抗壞血酸、親水聚合物(例如單糖、二糖及其他碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、糊精)、螯合劑(例如EDTA)及彼等熟習醫藥科學(例如 Remington's Pharmaceutical Science，最新版(Mack Publishing公司，Easton,Pa.))者熟知之類似組份。
本發明之寡核苷酸包括其醫藥上可接受之鹽，包括鹼土金屬鹽(例如鈉或鎂)、銨或NX4 +(其中X係C1-C4烷基)之彼等。其他醫藥上可接受之鹽包括有機羧酸，例如甲酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、羥乙磺酸、乳糖酸及琥珀酸；有機磺酸，例如甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸及苯磺酸；及無機酸，例如氫氯酸、硫酸、磷酸及磺胺酸。 具有羥基之化合物之醫藥上可接受之鹽包括具有適宜陽離子(例如Na+、NH4 +或諸如此類)之該化合物之陰離子。
患者應服用足夠日劑量之寡核苷酸以獲得有效但安全細胞間濃度之組合寡核苷酸。熟習此項技術者應能夠容易地得出適當劑量及投與時間表以適合特定情形及患者之需要。
治療之有效性可藉由常規方法評價，該等方法用於確定是否發生緩解。該等方法通常取決於形態、細胞化學、細胞發生、免疫及分子分析。另外，可藉由探測一或多個有關基因之表現程度在遺傳上評價緩解。可使用逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法以檢測甚至極低數目之mRNA轉錄。
寡核苷酸遞送技術
本發明之寡核苷酸及結合物可較佳經口或外敷投與個體但亦可藉由注射靜脈內投與。相應地設計媒劑。或者，寡核苷酸可經由控制釋放劑型皮下投與或經由習用靜脈內注射調配物投與。若適當，寡苷酸之較佳投與方法包含外敷、全身或局部灌注。根據局部灌注之方法，供應含有病灶之肢體之輸入及輸出血管經分離且連接至與充氧器及熱交換器相連之低流量灌注幫浦。髂血管用於灌注下肢。對於上肢病灶，在腋窩中向腋血管高位插入套管。將寡核苷酸添加至灌注循環中，且繼續灌注適當時間段，例如一小時。對於下肢病灶採用約100 ml/分鐘至約150ml/分鐘之灌注速率，而對於上肢病灶應採用一半該速率。可在整個灌注中使用全身性肝素化，且在灌注完成後逆轉。此分離灌注技術允許投與較在輸注至動脈或靜脈全身循環後原本可耐受高之劑量之化學治療劑。
在具體實施例中，本發明之寡聚物及結合物係全身投與或經調配用於全身投與。
對於全身輸注，寡核苷酸較佳係經由中央靜脈導管來遞送，該中央靜脈導管連接至適當連續輸注裝置。留置導管提供靜脈內循環之長期通路用於在延長時間段內頻繁投與藥物。該等留置導管通常在全身或局部麻醉下以手術插入外頭或內頸靜脈中。鎖骨下靜脈係係導管插入之另一常見位點。輸注器幫浦可為外部，或可形成整個可植入中央靜脈系統(例如可自Infusaid公司，Norwood,Mass.購得之INFUSAPORT系統及可自Pharmacia Laboratories,Piscataway,N.J.購得之PORT-A-CATH系統)之一部分。該等裝置係在局部麻醉下植入皮下袋中。使連接至幫浦注射口之導管穿過鎖骨下靜脈至上大靜脈。植入體含有儲存器中之大量寡核苷酸，該儲存器可視需要藉由自皮下針穿過儲存器中之自封閉隔膜注射額外藥物補足。完全可植入輸注器較佳，此乃因其由於該等裝置之便利、易於維持及美觀優點通常被患者充分接受。
可藉由美國專利4,740,463中所述之任一方法引入本發明之寡核苷酸及結合物，該專利以引用方式併入本文中。一種技術係活體外轉染，其可藉由若干不同方法進行。一種轉染方法涉及添加DEAE-聚葡萄糖以增加裸DNA分子由接受者細胞之攝取。參見McCutchin,J.H.及Pagano,J.S.,J.Natl.Cancer Inst.41,351-7(1968)。另一轉染方法係磷酸鈣沈澱技術，其取決於向含有磷酸酯之DNA溶液中添加Ca2+。所得沈澱明顯包括與磷酸鈣晶體結合之DNA。該等晶體沉降至細胞單層 上；晶體及細胞表面之所得並置似乎導致DNA之攝取。小比例之吸收DNA在轉染子中以及在其純系後代中表現。參見Graham,F.L.及van der Eb,A.J.,Virology 52,456-467(1973)及Virology 54,536-539(1973)。
轉染亦可藉由陽離子磷脂介導之遞送實施。具體而言，多陽離子脂質體可自N-[1-(2,3-二-油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOT-MA)形成。參見Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,84,7413-7417(1987)(DNA-轉染)；Malone等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,86,6077-6081(1989)(RNA-轉染)。
對於全身或局部活體內投與，寡核苷酸之量可端視疾病之性質及程度、所用特定寡核苷酸及其他因素而變。投與之實際劑量可慮及患者之大小及重量、治療之性質本質上係預防性或治療性、患者之年齡、健康及性別、投與途徑、治療係局部或全身及其他因素。
除與習用醫藥載劑一起投與外，反義寡核苷酸亦可藉由多種專門寡核苷酸遞送技術投與。適於與本發明醫藥組合物一起使用之持續釋放系統包括呈膜、微膠囊或諸如此類形式之半滲透聚合物基質，其可包含聚乳酸交酯；L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)及類似材料，例如Rosenberg等人，國際申請案PCT/US92/05305。
寡核苷酸及結合物可囊封於脂質體中用於治療性遞送，如(例如)Liposome Technology，第II卷，Incorporation of Drugs,Proteins,and Genetic Material,CRC Press中所述。寡核苷酸端視其溶解性而定可存於水層及脂質層中，或存於通常稱作微脂體懸浮液者中。疏水層通常但非排他地包含磷脂(例如卵磷脂及鞘磷脂)、類固醇(例如膽固醇)、離子型表面活性劑(例如二乙醯基磷酸酯、硬脂胺或磷脂酸)及/或疏水性質之其他材料。亦包含新穎陽離子兩親性化合物，稱作「分子 傘」，其闡述於(DeLong等人，Nucl.Acid.Res.,1999,27(16),3334-3341)中。
本發明之實施例可藉助顆粒系統及/或聚合物遞送。用於多核苷酸之活體外及活體內遞送之顆粒系統及聚合物由Felgner，Advanced Drug Delivery Reviews 5,163-187(1990)廣泛綜述。直接遞送之技術亦闡述於Cook S.T.Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,Marcel Dekker公司，2001中。
前藥
寡核苷酸可合成為帶有親脂性基團(例如甲基-SATE(S-乙醯基硫代乙基)或t-Bu-SATE(S-特戊醯基硫代乙基)保護基團)之前藥，該等基團賦予核酸酶對寡核苷酸之抗性、改良細胞攝取並在進入細胞後選擇性去保護，如Vives等人，Nucl.Acids Res.1999，第27卷，4071-4076中所述。
環形分子
寡核苷酸可合成為環形分子，其中寡核苷酸之5'及3'端藉由親和力對(其一個成員共價附接至5'且另一者共價附接至3'短)共價連接或保持在一起。該環化保護寡核苷酸抵抗由核酸外切酶降解且亦可改良細胞攝取及分佈。在本發明之一個態樣中，連接環形寡核苷酸之5'及3'端之部分在進入任一類型之人類或脊椎動物細胞後自動裂解，藉此線性化寡核苷酸並使其能夠與其靶序列有效雜交。在另一態樣中，連接寡核苷酸之5'及3'端之部分經設計以使裂解較佳僅在表現mRNA之特定類型之細胞中發生，該mRNA係反義寡核苷酸之靶標。舉例而言，針對參與病毒病症之基因之環形反義寡核苷酸可藉由線性化僅在表現所討論基因(例如HBV HBx或HBsAg)之細胞之亞組中起作用。
額外醫藥實體
本發明之寡聚物及寡聚物結合物可作為主要治療劑用於治療疾 病狀態，或可與非寡核苷酸藥物組合使用。
因此，本發明提供包含如本文中所述醫藥組合物及額外醫藥實體之醫藥系統。額外醫藥實體可為業內已知之任何治療劑。舉例而言，額外醫藥實體可為抗體、小分子治療劑、多核苷酸或基因療法載體(例如能夠表現治療性多肽或RNAi試劑之載體)。
因此，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性物(例如其他抗病毒活性物)組合使用。
舉例而言，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性物組合使用，該等活性物係例如基於寡核苷酸之抗病毒劑，例如序列特異性的基於寡核苷酸之抗病毒劑，其經由反義物(包括其他LNA寡聚物)、siRNA(例如ARC520)、適配體、嗎啉基或任何其他核苷酸序列依賴性抗病毒作用模式起作用。
進一步舉例而言，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性物組合使用，該等活性物係例如免疫刺激抗病毒化合物，例如干擾素(例如聚乙二醇化干擾素α)、TLR7激動劑(例如GS-9620)或治療疫苗。
進一步舉例而言，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性物(例如具有抗病毒活性之小分子)組合使用。該等其他活性物可為(例如)核苷/核苷酸抑制劑(例如恩替卡韋或泰諾福韋雙索酯富馬酸鹽)、衣殼化抑制劑、進入抑制劑(例如美盧德B(Myrcludex B))。
在某些實施例中，額外治療劑可為HBV試劑、C型肝炎病毒(HCV)試劑、化學治療劑、抗生素、鎮痛藥、非類固醇抗發炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗噁心劑、抗腹瀉劑或免疫阻抑劑。
在特定相關實施例中，額外HBV試劑可為干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素α con-1(聚乙二醇化及非聚乙二醇化)、利巴韋林；HBV RNA複製抑制劑；第二反義寡聚物；HBV治療疫苗；HBV預防疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韋(ETV)；泰諾福韋雙索酯富馬酸鹽(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韋；或HBV抗體療法(單株或多株)。
在其他特定相關實施例中，額外HCV試劑可為干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素α con-1(聚乙二醇化及非聚乙二醇化)；利巴韋林；HCV RNA複製抑制劑(例如，ViroPharma之VP50406系列)；HCV反義試劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解旋酶抑制劑；或HCV單株或多株抗體療法。
額外醫藥實體可為如本文定義之寡聚物或寡聚物結合物。
在某些實施例中，醫藥系統可包含至少一種、至少兩種、至少三種、至多複數種本發明提供之寡聚物或寡聚物結合物。
在某些實施例中，額外醫藥實體可為能夠調節HBV中之靶序列之寡聚物或寡聚物結合物。寡聚物或結合物各自可能夠調節HBV HBx或HBsAg中之靶序列。寡聚物或結合物可能夠調節HBV中並不在HBx或HBsAg內之靶序列。舉例而言，至少一種寡聚物或結合物可能夠調節HBcAg、HBeAg或DNA聚合酶之HBV基因或mRNA內之靶序列。
在某些實施例中，寡聚物或額外寡聚物或結合物或額外結合物可能夠調節HBsAg之HBV基因或mRNA中之靶序列。
在採用靶向不同靶序列之寡核苷酸之組合時，不同類型之寡核苷酸之量之比率可在寬範圍內變化。根據本發明之一個較佳實施例，所有類型之寡核苷酸皆以相等量(以莫耳濃度計)存在。
投與及劑量
本發明亦係關於含有治療有效量之本發明結合物之醫藥組合物。該組合物可經調配用於多種藥物遞送系統中。組合物亦可包括一或多種生理上可接受之賦形劑或載劑用於適當調配。用於本發明中之 適宜調配物參見Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing公司，Philadelphia,Pa.，第17版，1985。關於藥物遞送方法之簡單綜述，參見(例如)Langer(Science 249：1527-1533,1990)。
本發明之醫藥組合物意欲非經腸、鼻內、外敷、經口或局部投與，例如藉由經皮方式用於預防性及/或治療性治療。醫藥組合物可非經腸(例如，藉由靜脈內、肌內或皮下注射)、或藉由經口攝取、或藉由外敷施用或關節內注射投與。額外投與途徑包括血管內、動脈內、腫瘤內、腹膜內、室內、硬膜內、以及經鼻、眼、鞏膜內、眶內、直腸、外敷或氣溶膠吸入投與。本發明中亦特別包括持續釋放投與，藉由該方式呈積存注射劑或可侵蝕植入體或組份形式。因此，本發明提供用於非經腸投與之組合物，其包含溶解或懸浮於可接受之載劑(較佳水性載劑，例如水、緩衝水、鹽水、PBS及諸如此類)中之上文提及之試劑。組合物可含有如近似生理條件所需之醫藥上可接受之輔助物質，例如pH調節及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑、清潔劑及諸如此類。本發明亦提供用於經口遞送之組合物，其可含有惰性成份，例如用於錠劑、膠囊及諸如此類之調配之黏合劑或填充劑。此外，本發明提供用於局部投與之組合物，其可含有惰性成份，例如用於乳霜、軟膏劑及諸如此類之調配之溶劑或乳化劑。
在具體實施例中，本發明之寡聚物及結合物係皮下投與或經調配用於皮下投與。
該等組合物可藉由習用滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。所得水溶液可經包裝以按原樣使用或凍乾，在投與前將此凍乾製劑與無菌水性載劑組合。製劑之pH通常將介於3與11之間，更佳介於5與9之間或介於6與8之間，且最佳介於7與8之間，例如7至7.5。呈固體形式之所得組合物可包裝於多個單一劑量單元(其各自含有固定量之一或多種上文提及之試劑)中，例如包裝於錠劑或膠囊之密封包裝中。呈固 體形式之組合物亦可針對撓性量包裝於容器中，例如包裝於經設計用於外敷施用乳霜或軟膏劑之可壓擠管中。
含有有效量之組合物可投與用於預防性或治療性治療。在預防性應用中，組合物可投與對腫瘤或癌症、神經變性疾病或溶酶體病症之發展具有臨床測定之傾向性或增加之易感性的個體。本發明組合物可以足以延遲、減輕或較佳預防臨床疾病或腫瘤形成之發作的量投與患者(例如，人類)。在治療性應用中，組合物係以足以治癒或至少部分停滯病況及其併發症之症狀之量投與已經患有疾病(例如，癌症、神經變性疾病或溶酶體儲存病症)之個體(例如，人類)。足以完成此目的之量定義為「治療有效劑量」，即足以實質上改良一些與疾病或醫學病況相關之症狀的化合物之量。舉例而言，在癌症、神經變性疾病或溶酶體儲存疾病之治療中，減少、預防、延遲、阻抑或停滯疾病或病況之任何症狀之藥劑或化合物可治療有效。無需藥劑或化合物之治療有效量以治癒疾病或病況，但將治療疾病或病況使得疾病或病況之發作延遲、受阻或受預防，或疾病或病況症狀改善，或疾病或病況之期限改變或例如較不嚴重或個體中之恢復加速。對於此用途有效之量可端視疾病或病況之嚴重程度及患者之重量及一般狀態而定，但通常在約0.5mg至約3000mg藥劑/劑量/患者範圍內。適於初始投與及加強投與之方案之典型為初始投與，之後以一或多個每小時、每日、每週或每月間隔藉由隨後投與重複劑量。本發明組合物中存在之藥劑之總有效量可以單一劑量形式、以濃注形式或藉由在相對短之時間段內輸注投與哺乳動物，或可使用分次治療方案投與，其中在更延長時間段內投與多個劑量(例如，每4-6、8-12、14-16或18-24個小時、或每2-4天、1-2週、每月一次劑量)。或者，涵蓋足以維持血液中之治療有效濃度之連續靜脈內輸注。
本發明組合物內存在及用於本發明方法中之施用至哺乳動物(例 如，人類)之一或多種藥劑之治療有效量可由熟練技術人員考慮哺乳動物之年齡、腫瘤及病況之個體差異來確定。本發明之藥劑係以有效量投與至個體(例如哺乳動物，例如人類)，該有效量係在經治療個體中產生期望結果(例如減緩或緩解癌症或神經變性病症)之量。治療有效量可由彼等熟習此項技術者憑經驗確定。
患者亦可接受每週一或多次(例如，每週2、3、4、5、6或7次或更多次)約0.1mg至3,000mg/劑量、每週0.1mg至2,500(例如，2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5或0.1)mg劑量範圍內之藥劑。患者亦可接受每兩週或三週一次0.1mg至3,000mg/劑量範圍內之組合物之藥劑。包含有效量之本發明組合物之單一或多次投與可以由治療醫師選擇之劑量量及型式實施。劑量及投與時間表可基於患者之疾病或病況之嚴重程度加以確定及調節，可在整個療程中根據通常由臨床醫師實踐之方法或彼等本文所述者監測該嚴重程度。
本發明之載劑及結合物可與習用治療或療法之方法組合使用，或可與習用治療或療法之方法分開使用。
在組合療法中投與本發明結合物與其他藥劑時，可依序或同時將其投與患者。或者，本發明之醫藥組合物可包括與如本文中所述醫藥上可接受之賦形劑結合之本發明之載劑-藥劑結合物及業內已知之另一治療或預防劑的組合。
其他應用
本發明之寡聚物可作為研究試劑用於(例如)診斷、治療及預防。
在研究中，該等寡聚物可用於特異性抑制細胞及實驗動物中之靶序列之表現產物之合成(通常藉由降解或抑制mRNA且藉此防止蛋白質形成)且藉此有利於靶標之功能分析或其作為用於治療介入之靶標之有用性的評估。
在診斷中，寡聚物可用於藉由北方墨點法、原位雜交或類似技 術檢測並定量細胞及組織中靶序列之表現產物之表現。
對於治療而言，藉由投與本發明之寡聚物化合物來治療懷疑患有可藉由調節靶序列之表現進行治療之疾病或病症的動物或人類。進一步提供藉由投與治療或預防有效量之一或多種本發明寡聚物或組合物來治療懷疑患有或易患與靶序列之表現相關之疾病或病況之哺乳動物(例如治療人類)的方法。本發明之寡聚物、結合物或醫藥組合物通常係以有效量投與。
本發明亦提供如所述本發明之化合物或結合物之用途，其用於製造用於治療如本文中提及之病症之藥劑，或用於治療如本文中提及之病症之方法。
本發明亦提供治療如本文中提及之病症之方法，該方法包含向有需要之患者投與如本文所述之本發明化合物、及/或本發明之結合物及/或本發明之醫藥組合物。
病毒病症
本發明之寡聚物、寡聚物結合物及其他組合物可用於治療與靶序列(例如靶序列之突變型式之過表現或表現)相關之病況。
本發明進一步提供本發明化合物之用途，其用於製造用於治療如本文中提及之疾病、病症或病況之藥劑。
在本發明上下文中，該疾病、病症或病況可為病毒病症。
在一個實施例中，病毒病症與HBx或HBsAg之表現或過表現相關。病毒病症可為與HBV相關之病症。該等病毒病症之實例包括(但不限於)B型肝炎、硬化、肝癌(例如肝細胞癌)、膽道癌。
在一個實施例中，病毒病症係B型肝炎。如熟習此項技術者應認識到，術語「B型肝炎」在本發明上下文中係指由HBV引起之肝之感染病症。B型肝炎可為急性或慢性。急性疾病引起肝發炎、嘔吐、黃疸及偶爾死亡。慢性B型肝炎可引起硬化及肝癌。
在一個實施例中，病毒病症係硬化。如熟習此項技術者應認識到，術語「硬化」在本發明上下文中係指晚期肝疾病，其特徵在於肝中存在纖維化及再生性結節。該等變化可導致肝功能損失。
在一個實施例中，病毒病症係肝癌。如熟習此項技術者應認識到，「肝癌」在本發明上下文中係指起源於肝中之惡性病。
在一個實施例中，病毒病症係肝細胞癌(HCC)。如熟習此項技術者應認識到，「HCC」在本發明上下文中係指通常繼發於病毒性肝炎感染(例如B型肝炎)之一類肝癌。宏觀地，HCC以結節性或浸潤性腫瘤形式出現。結節型可為單獨的(大塊)或多個(在發展為硬化之併發症時)。腫瘤結節係為圓形至卵形、灰色或綠色(若腫瘤產生膽汁)、清楚地確定界限但並未經囊封。彌散型界限較差且浸潤門靜脈或肝靜脈(極少)。微觀地，存在四種構造及細胞學類型(型式)之HCC：纖維層狀、假腺體(腺樣)、多型(巨大細胞)及透明細胞。在充分分化形式中，腫瘤細胞類似於肝細胞，形成小柱、索及巢，且可含有細胞質中之膽汁色素。在較差分化形式中，惡性上皮細胞係脫內聚、多型、退行性、巨大的。由於血管形成不良，腫瘤具有不足間質及中心性壞死。
在一個實施例中，病毒病症係膽道癌。如熟習此項技術者應認識到，「膽道癌」在本發明上下文中係指由起源於自肝排出膽汁進入小腸中之膽道中的突變上皮細胞(或顯示上皮分化之特徵之細胞)組成之癌症之形式。
儘管本文揭示之各個實施例係指與HBV感染相關之病毒病症，但本發明並不限於該等實例性實施例。而是本發明適於任何與病毒感染相關之病症。
一般而言，本發明之一個態樣係關於治療患有或易患與靶序列之表現產物之異常含量相關之病況之哺乳動物的方法，其包含向哺乳 動物投與治療有效量之靶向靶序列之寡聚物。本發明之寡聚物可包含一或多個LNA單元。本發明之寡聚物、結合物或醫藥組合物通常係以有效量投與。
本發明之令人感興趣之態樣係關於如本文所定義寡聚物(化合物)或如本文所定義寡聚物結合物之用途，其用於製備用於治療如本文中提及之疾病、病症或病況之藥劑。
本發明之方法較佳用於針對由HBx或HBsAg之異常含量引起之疾病進行之治療或預防。
或者說明，在一些實施例中，本發明進一步係關於治療HBx或HBsAg之異常含量之方法，該方法包含向有需要之患者投與本發明之寡聚物、或本發明之結合物或本發明之醫藥組合物。
本發明亦係關於如本文定義之寡聚物、組合物或寡聚物結合物，其用作藥劑。
本發明進一步係關於如本文定義之化合物、組合物或結合物之用途，其用於製造用於治療HBx或HBsAg或HBx之異常含量或HBsAg之突變體形式(例如等位基因變體，例如彼等與本文提及之疾病中之一者相關者)之表現的藥劑。
此外，本發明係關於治療患有疾病或病況(例如彼等本文提及者)之個體的方法。
需要治療之患者係患有或可能患有疾病或病症之患者。
實例性寡聚物
用於本發明中之寡聚物之實例提供於下表中。
表1 用於設計LNA修飾之寡聚物之寡核苷酸序列基序.
該表指示基因型A、B、C及D(GenBank)之所有已公開全長基因型序列內保守之分數，其意指給定寡聚物基序將與基因型內之靶序列之給定部分100%互補。所有寡聚物基序皆經選擇使得其將基本上靶 向基因型A、B、C及D內之幾乎所有序列，藉此容許治療經該四個基因型中之任一者感染之個體。
表3 LNA寡聚物
大寫字母表示β-D-氧基LNA，C LNA係5-甲基C LNA，小寫字母表示DNA，mc表示5-甲基胞嘧啶DNA，所有核苷間連接皆係硫代磷酸酯核苷間連接。
表4 具有經由C6胺基連接體及可裂解之ca磷酸二酯連接連接至寡聚物之GalNAc2結合物部分的LNA寡聚物. GalNAc2結合物部分亦可經其他GalNAc結合物部分或固醇部分取代。基於寡聚物序列基序之該等寡聚物之寡聚物序列基序係表2及3之子集。
大寫字母表示β-D-氧基LNA，小寫字母表示DNA，mc/mC表示5-甲基胞嘧啶DNA/LNA，s表示硫代磷酸酯核苷間連接。若任何事情皆未指定，則連接係磷酸二酯核苷間連接
在與GalNAc結合之前，表4之LNA寡聚物表示為AM-C6 ca-寡聚物，其中AM-C6代表準備用於結合之胺基連接體且ca係可裂解之磷酸二酯連接。該等寡聚物係自表4以引用方式併入優先權申請案GB1408623.5中。
實施例
以編號段落表示之本發明之以下實施例可與本文所述其他實施例組合使用： 1.一種寡聚物結合物，其用於治療病毒病症，其中該寡聚物結合 物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)用於將該第一寡聚物遞送至肝之載劑組份。
2.如段落1使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份能夠遞送該寡聚物至欲藉由投與該寡聚物結合物治療之個體之該肝。
3.如段落1或段落2使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份能夠遞送該寡聚物至欲藉由投與該寡聚物結合物治療之個體之肝細胞。
4.如段落1至3中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分。
5.如段落1至4中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份係去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)靶向部分。
6.如段落4或5使用之寡聚物結合物，其中該碳水化合物結合物部分或ASGP-R靶向部分係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇。
7.如段落1至6中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份係GalNAc簇，其包含2至4種末端半乳糖衍生物、將每一半乳糖衍生物連接至分支點基團之親水性間隔體。
8.如段落7使用之寡聚物結合物，其中該等半乳糖衍生物係GalNAc，該間隔體係PEG間隔體且該分支點基團包含具有兩個或更多個胺基之肽，例如二-離胺酸或三-離胺酸。
9.如段落1至8中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份係GalNAc2。
10.如段落1至9中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一 寡聚物區域與該靶序列至少80%互補。
11.如段落1至10中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域包含一或多個LNA單元。
12.如段落1至11中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係缺口聚物。
13.如段落1至12中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元。
14.如段落1至13中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域包含以下基序中之任一者：2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、2-9-2、3-9-3、2-9-3、3-9-2、2-10-2、3-10-3、3-10-2、2-10-3，其中第一個數字係該5’LNA翼區中之LNA單元之數目，第二個數字係該缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係該3’LNA翼區中之LNA單元之數目。
15.如段落1至14中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係8至30個核苷酸長。
16.如段落1至15中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係10至20個核苷酸長。
17.如段落1至16中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係10至16個核苷酸長。
18.如段落1至17中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係10至14個核苷酸長。
19.如段落1至18中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域結合至該靶序列。
20.如段落1至19中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域能夠抑制該靶序列之表現、複製或轉譯中之任一或多者。
21.如段落1至20中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域能夠抑制該靶序列之表現。
22.如段落1至21中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列係基因或mRNA。
23.如段落1至22中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA的至少一部分。
24.如段落1至23中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列係編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA。
25.如段落1至24中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列在顯示為SEQ ID No.1及/或SEQ ID No.2之序列、或與其具有至少80%一致性、較佳與其具有至少85%一致性、較佳與其具有至少90%一致性、較佳與其具有至少95%一致性之序列內。
26.如段落1至24中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列在顯示為SEQ ID No.1及SEQ ID No.2之序列內。
27.如段落1至26中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列與HBV基因型A至H中之任一或多者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。
28.如段落1至27中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該靶序列係選自由SEQ ID NO：3之以下位置中之任一或多者組成之群：1264-1278；1530-1544；1551-1566；1577至1598；691-706；670-684。
29.如段落1至28中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)。
30.如段落1至29中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)； GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)；CGCagtatggaTC(SEQ ID NO：300)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；CGAaccactgaaCAA(SEQ ID NO：296)；CGAaccactgaAC(SEQ ID NO：298)；CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；GAAccactgaaCAAA(SEQ ID NO：585)；CGAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：588) GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；TAGtaaactgagCCA(SEQ ID NO：678)；CGAaccactgAAC(SEQ ID NO：600)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及CGAaccactgAACA(SEQ ID NO：597)， 其中大寫字母表示LNA單元且小寫字母表示DNA單元。
31.如段落1至30中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物係選自由以下中之任一或多者組成之群： 5'-GN2-C6 ca m C s G s A s ascscsascstsgs A s A s m C s A-3'(SEQ ID NO：824)
其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯連接；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元；GN2-C6表示具有C6連接體之GalNAc2載劑組份。
32.如段落1至29中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)
GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)及CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)。
33.如段落1至29中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)及AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)。
34.如段落1至33中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L2-載劑組份
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分。
35.如段落1至34中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域
其中L1係可選連接體。
36.如段落34或段落35使用之寡聚物結合物，其中存在該連接體1。
37.如段落1至36中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份連接、較佳結合至該寡聚物之5’端。
38.如段落34至37使用之寡聚物結合物，其中該連接體基團或該支鏈區域係生理上不穩定之連接體基團或生理上不穩定之支鏈區域或生理上不穩定之系鏈分子或生理上不穩定之橋接部分。
39.如段落38使用之寡聚物結合物，其中該生理上不穩定之連接體基團係核酸酶易感性連接體。
40.如段落38或39使用之寡聚物結合物，其中該生理上不穩定之連接體進一步與C6至C12胺基烷基結合。
41.如段落1至40中任一段落使用之寡聚物結合物，其進一步包含能夠調節靶序列之第二寡聚物區域。
42.如段落41使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域及該等第二寡聚物區域中之每一者皆能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列。
43.如段落31或42中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域及該等第二寡聚物區域中之每一者皆能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列；其中該等靶區域不同。
44.如段落41至43中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域-L3-載劑組份
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2及L3可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份1-L1-第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域-L3-載劑組份2
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1、L2及L3可相同或不同
其中載劑組份1及載劑組份2可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L1-載劑組份1-L2-第二寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2及L3可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：第一寡聚物區域-L1-載劑組份1-L2-第二寡聚物區域-L3-載劑組份2
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2可相同或不同
其中載劑組份1及載劑組份2可相同或不同；或其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份1-L1-第一寡聚物區域-L2-載劑組份2-L3-第二寡聚物區域-L4-載劑組份3
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L3係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1、L2及L3可相同或不同
其中載劑組份1、載劑組份2及載劑組份3可相同或不同。
45.如段落39至43中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有或包含以下結構：載劑組份-L1-第一寡聚物區域-L2-第二寡聚物區域
其中L1係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L2係可選連接體或支鏈區域或系鏈分子或橋接部分
其中L1及L2可相同或不同。
46.如段落45使用之寡聚物結合物，其中存在該連接體1。
47.如段落45或段落46使用之寡聚物結合物，其中存在該連接體2。
48.如段落41至46中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該載劑組份連接、較佳結合至該寡聚物之5’端。
49.如段落41至48中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物區域及該等第二寡聚物區域中之每一者皆藉助連接體或支鏈區域連接較佳結合。
50.如段落41至49中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該第 一寡聚物區域及該等第二寡聚物區域中之每一者皆藉助生理上不穩定之連接體基團或生理上不穩定之支鏈區域連接、較佳結合。
51.如段落1至50中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該病毒病症係B型肝炎或與HBV相關之病症。
52.如段落1至51中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該病毒病症與HBx或HBsAg之表現或過表現相關。
53.如段落1至52中任一段落使用之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物係經皮下投與。
54.一種組合物，其用於治療病毒病症，其中該組合物包含如段落1至53中任一段落中所定義之寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸。
55.如段落54使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之至少一者係寡聚物結合物。
56.如段落54或段落55使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之每一者皆係寡聚物結合物。
57.如段落54至56中任一段落使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之每一者皆能夠調節HBV中之靶序列。
58.如段落54至57中任一段落使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之至少一者能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列。
59.如段落54至58中任一段落使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之至少一者能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列；且其中該額外不同寡核苷酸中之該至少一者能夠調節不同於由如段落1至53中任一段落所定義之寡聚物結合物靶向之靶序列之HBV之HBx或HBsAg中之靶序列。
60.如段落54至59中任一段落使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之每一者皆能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列。
61.如段落54至60中任一段落使用之組合物，其中該額外不同寡核苷酸中之每一者皆能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列；且其中該額外不同寡核苷酸中之每一者皆能夠調節不同於由如段落1至53中任一段落所定義之寡聚物結合物靶向之靶序列之HBV之HBx或HBsAg中之靶序列。
62.一種適於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)用於將該第一寡聚物遞送至肝之載劑組份。
63.如段落62之寡聚物結合物，其中該寡聚物係如段落1至53中任一段落中所定義。
64.一種適於治療病毒病症之組合物，其中該組合物包含寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)用於將該第一寡聚物遞送至肝之載劑組份。
65.如段落64之組合物，其中該寡聚物結合物係如段落1至53中任一段落或段落62至63中任一段落中所定義之寡聚物結合物。
66.如段落64或段落65之組合物，其中該額外不同寡核苷酸係如段落62至63中任一段落中所定義之額外不同寡核苷酸。
67.一種寡聚物，其係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)； AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)
其能夠調節HBV之HBx或HBsAg中之靶序列以治療病毒病症。
68.如段落67之寡聚物，其中該寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)
GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)及CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)。
69.如段落67之寡聚物，其中該寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)； AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)及AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)。
70.如段落67至69中任一段落之寡聚物，其中該寡聚物包含一或多個LNA單元。
71.如段落67至70中任一段落之寡聚物，其中該寡聚物係缺口聚物。
72.如段落67至71中任一段落之寡聚物，其中該寡聚物包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元。
73.如段落67至72中任一段落之寡聚物，其中該寡聚物包含以下基序中之任一者：2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、2-9-2、3-9-3、2-9-3、3-9-2、2-10-2、3-10-3、3-10-2、2-10-3，其中第一個數字係LNA翼區中之LNA單元之數目，第二個數字係該缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係LNA翼區中之LNA單元之數目。
74.如段落67至73中任一段落之寡聚物，其中該第一寡聚物區域係10至18個核苷酸長。
75.如段落67至74中任一段落之寡聚物，其中該第一寡聚物區域係10至16個核苷酸長。
76.如段落67至75中任一段落之寡聚物，其中該第一寡聚物區域係10至14個核苷酸長。
77.如段落67至76中任一段落之寡聚物，其係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)； GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：310) AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：668)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：308)；CGAaccactgaACA(SEQ ID NO：297)；CGCagtatggaTC(SEQ ID NO：300)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：315)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：316)；GAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：294)；CGAaccactgaacAAA(SEQ ID NO：295)；CG，AaccactgaaCAA(SEQ ID NO：296)；CGAaccactgaAC(SEQ ID NO：298)；CCGcagtatggaTCG(SEQ ID NO：299)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：304)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：305)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：306)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：307)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：309)；GAAccactgaaCAAA(SEQ ID NO：585)；CGAAccactgaacAAA(SEQ ID NO：588) GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：628)；TAGtaaactgagCCA(SEQ ID NO：678)；CGAaccactgAAC(SEQ ID NO：600)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：317)；及 CGAaccactgAACA(SEQ ID NO：597)，其中大寫字母表示親和力增強核苷酸類似物且小寫字母表示DNA單元。
78.如段落67至77中任一段落之寡聚物，其係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之序列：
其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯連接；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元；AM-C6係胺基-C6連接體；其中5’末端基團「AM-C6 c a」係可選的。
79.如段落67至78中任一段落中所定義之寡聚物，其用於醫學治療。
80.如段落67至79中任一段落中所定義之寡聚物，其用於治療病毒病症。
81.如段落79或段落80中所定義之寡聚物，其中該寡聚物係如段落1至53中任一段落中所定義。
82.如段落79或段落81中所定義之寡聚物，其中該病症係如段落1至53中任一段落中所定義。
83.一種適於治療病毒病症之組合物，其中該組合物包含寡聚物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物包含至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症。
84.如段落83之組合物，其中該寡聚物係如段落67至82中任一段落中所定義之寡聚物。
85.如段落83或段落84之組合物，其中該至少一種額外不同寡核苷酸係如段落54至61中任一段落中所定義之額外不同寡核苷酸。
86.一種治療病毒病症之方法，該方法包含向需要治療之個體投與有效量之如段落62或段落63之寡聚物結合物或如段落1至52中任一段落中所定義之寡聚物結合物。
87.一種治療病毒病症之方法，該方法包含向需要治療之個體投與有效量之如段落64至66中任一段落之組合物或如段落54至61中任一段落中所定義之組合物或如段落83至85中任一段落中所定義之組合物。
88.一種治療病毒病症之方法，該方法包含向需要治療之個體投與有效量之如段落67至82中任一段落之寡聚物。
89.一種醫藥組合物，其包含如段落62或段落63之寡聚物結合物或如段落1至53中任一段落中所定義之寡聚物結合物；及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。
90.一種醫藥組合物，其包含如段落64至66中任一段落之組合物或如段落54至61中任一段落中所定義之組合物或如段落83至85中任一段落中所定義之組合物；及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。
91.一種醫藥組合物，其包含如段落67至82中任一段落之寡聚物；及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。一種醫藥系統，其包含如段落89至91中任一段落之醫藥組合物及額外醫藥實體。
92.一種製造如段落1至52中任一段落之寡聚物結合物的方法，其包含使一或多種如段落1至53中任一段落中所定義之寡聚物與如段落1至53中任一段落中所定義之載劑組份結合。
93.一種製造如段落64至66中任一段落之組合物的方法，其包含使如段落1至53中任一段落中所定義之寡聚物結合物與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑混合。
94.一種製造如段落91之組合物之方法，其包含使如段落67至82中任一段落中所定義之寡聚物與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑混合。
95.根據前述段落中任一段落之本發明，其中該寡聚物或該寡聚物結合物之寡聚物組份包含以下基序中之任一者：3-10-3、3-10-2、3-9-3、3-9-2、3-8-3、3-8-2，其中第一個數字係該翼區中之經修飾之核苷酸之數目，較佳至少一個係LNA單元，較佳全部係LNA單元，第二個數字係該缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係該翼區中之經修飾之核苷酸之數目，較佳至少一個係LNA單元，較佳全部係LNA單元。
96.一種寡聚物結合物，其實質上如本文中且參照實例所述。
97.一種組合物，其實質上如本文中且參照實例所述。
98.一種寡聚物，其實質上如本文中且參照實例所述。
99.一種方法，其實質上如本文中且參照實例所述。
特定實施例
本發明係關於用於治療病毒病症之寡聚物結合物。該寡聚物結合物包含：a)寡聚物，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)之HBx或HBsAg中之靶序列以治療該病毒病症；及b)結合至該寡聚物之載劑組份。較佳地，載劑組份係用於將該第一寡聚物遞送至肝。
現提供對於本發明之某些實施例之較佳態樣。
在一個態樣中，本發明提供用於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份；其中該第一寡聚物區域係8至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元； 其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係8至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之組合物，其中 該組合物包含寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係8至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分。
在一個態樣中，本發明提供用於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份；其中該第一寡聚物區域係8至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元； 其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)； GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係8至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)； AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15) GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之組合物，其中該組合物包含寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係8至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳 地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8) CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9) CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)。
在一個態樣中，本發明提供用於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份；其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該寡聚物結合物之該寡聚物組份包含以下基序中之任一者：3-10-3、3-10-2、3-9-3、3-9-2、3-8-3、3-8-2，其中第一個數字係翼區中之LNA單元之數目，第二個數字係缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係翼區中之LNA單元之數目。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該寡聚物結合物之該寡聚物組份包含以下基序中之任一者：3-10-3、3-10-2、3-9-3、3-9-2、3-8-3、3-8-2，其中第一個數字係該翼區中之LNA單元之數目，第二個數字係該缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係該翼區中之LNA單元之數目。
在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之組合物，其中該組合物包含寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及 b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該寡聚物結合物之該寡聚物組份包含以下基序中之任一者：3-10-3、3-10-2、3-9-3、3-9-2、3-8-3、3-8-2，其中第一個數字係該翼區中之LNA單元之數目，第二個數字係該缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係該翼區中之LNA單元之數目。
在一個態樣中，本發明提供用於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份；其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元； 其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8)
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在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份
其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成 之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8)
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在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之組合物，其中 該組合物包含寡聚物結合物及至少一種額外不同寡核苷酸；其中該寡聚物結合物包含：a)至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；及b)載劑組份，其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該載劑組份係碳水化合物結合物部分，較佳地，該載劑組份係選自由以下組成之群：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正-丁醯基-半乳胺糖、N-異丁醯基半乳糖-胺或其任一或多者之簇；較佳地，該載劑組份包含GalNAc或GalNAc簇；較佳地，該載劑組份係GalNAc2；其中該靶序列包含編碼HBx或HBsAg或其天然變體之基因或mRNA之至少一部分；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)； CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8)
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在一個態樣中，本發明提供用於治療病毒病症之寡聚物，其中該寡聚物包含至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒(HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；且其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序： GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8)
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在一個態樣中，本發明提供適於治療病毒病症之寡聚物，其中該寡聚物包含至少一個第一寡聚物區域，其能夠調節B型肝炎病毒 (HBV)、較佳HBV之HBx或HBsAg之靶序列以治療該病毒病症；且其中該第一寡聚物區域係12至16個核苷酸長；其中該第一寡聚物區域係缺口聚物，較佳地，其中該第一寡聚物區域包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，較佳地，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元；其中該第一寡聚物區域係基於選自由以下中之任一或多者組成之群之核心基序：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；AGCGAAGTGCACACG(SEQ ID NO：20)；AGGTGAAGCGAAGTG(SEQ ID NO：26)；AGCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 18)；CGAACCACTGAACA(SEQ ID NO：7)；GAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 4)；CGAACCACTGAACAAA(SEQ ID NO 5)；CGAACCACTGAACAA(SEQ ID NO 6)；CGAACCACTGAAC(SEQ ID NO 8)
CCGCAGTATGGATCG(SEQ ID NO 9)
CGCAGTATGGATC(SEQ ID NO：10)；CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO 12)；AGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 14)；GAGAAGGCACAGACGG(SEQ ID NO 15)
GAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 16)；GCGAAGTGCACACGG(SEQ ID NO 17)；CGAAGTGCACACG(SEQ ID NO 19)；AGGTGAAGCGAAGT(SEQ ID NO 27)；及 TAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO：834)；其中該寡聚物包含以下基序中之任一者：3-10-3、3-10-2、3-9-3、3-9-2、3-8-3、3-8-2，其中第一個數字係該翼區中之LNA單元之數目，第二個數字係該缺口區域中之核苷酸之數目，且第三個數字係該翼區中之LNA單元之數目。
實例 材料及方法 HBsAg及HBeAg檢測
在感染AAV-HBV之小鼠血清中根據製造商之方案使用HBsAg化學發光免疫分析(CLIA)及HBeAg CLIA套組(Autobio diagnostics有限公司，Zhengzhou,China，目錄號分別為CL0310-2及CL0312-2)測定血清HBsAg及HBeAg含量。簡言之，將50μl血清轉移至各別抗體塗佈之微量滴定板並添加50μl酶結合物試劑。於室溫下將板在振盪器上培育60min，之後使用自動洗滌器將所有孔用洗滌緩衝液洗滌六次。向每一孔中添加25μl受質A及隨後25μl受質B。將板於RT下培育10min，之後使用Envision發光讀數器量測發光。HBsAg係以單位IU/ml給出；其中1ng HBsAg=1.14IU。HBeAg係以單位NCU/ml血清給出。
HBV DNA萃取及qPCR
最初將小鼠血清用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)以10(1：10)之因子稀釋。使用MagNA Pure 96(Roche)機器人萃取DNA。將50μl稀釋血清在具有200ul MagNA Pure 96外部裂解緩衝液(Roche，目錄號06374913001)之處理柱中混合並培育10分鐘。隨後使用「MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Small Volume Kit」(Roche，目錄號06543588001)及「Viral NA Plasma SV external lysis 2.0」方案萃取DNA。DNA溶析體積係50μl。
使用Taqman qPCR機器(ViiA7,life technologies)實施萃取HBV DNA之量化。在PCR中一式兩份地測試每一DNA試樣。向384孔板中之含有10μl TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems，目錄號4369016)、0.5μl PrimeTime XL qPCR引子/探針(IDT)及4.5μl蒸餾水之15μl PCR標準混合物中添加5μl DNA試樣並使用以下設置實施PCR：UDG培育(2min，50℃)、酶活化(10min，95℃)及PCR(40個循環，15sec，95°進行變性並1min，60℃進行退火及延長)。藉由ViiA7軟體基於HBV質體DNA標準曲線自Ct值計算DNA拷貝數。
TaqMan引子及探針(IDT)之序列：正向核心引子(F3_核心)：CTG TGC CTT GGG TGG CTT T
反向引子(R3_核心)：AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA
Taqman探針(P3_核心)：56-FAM/AGC TCC AAA /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ
組織特異性活體外連接體裂解分析
使用有關組織(例如肝或腎)及血清之勻漿物使具有欲測試之生理上不穩定之連接體(例如DNA磷酸二酯連接體(PO連接體))之FAM標記之寡聚物經受活體外裂解。
自適宜動物(例如小鼠、猴、豬或大鼠)採集組織及血清試樣並在均質化緩衝液(0.5% Igepal CA-630、25mM Tris pH 8.0、100mM NaCl pH 8.0(經1N NaOH調節))中均質化。向組織勻漿物及血清摻雜寡聚物至200μg/g組織之濃度。將試樣於37℃下培育24小時且其後用苯酚-氯仿萃取試樣。使溶液在Dionex Ultimate 3000上使用Dionex DNApac p-100管柱及介於10mM至1M範圍內之高氯酸鈉(pH 7.5)之梯度經受AIE HPLC分析。使用615nm下之螢光檢測器及260nm下之uv檢測器針對標準測定裂解及未裂解寡聚物之含量。
S1核酸酶裂解分析
使具有S1核酸酶易感性連接體(例如DNA磷酸二酯連接體(PO連接體))之FAM標記之寡聚物在S1核酸酶萃取物或血清中經受活體外裂解。
使100μM寡聚物在核酸酶緩衝液(60U/100μL)中經受由S1核酸酶之活體外裂解達20及120分鐘。藉由向緩衝液溶液中添加EDTA停止酶活性。使溶液在Dionex Ultimate 3000上使用Dionex DNApac p-100管柱及介於10mM至1M範圍內之高氯酸鈉(pH 7.5)之梯度經受AIE HPLC分析。使用615nm下之螢光檢測器及260nm下之uv檢測器針對標準測定裂解及未裂解寡聚物之含量。
實例1 結合物之構築
在來自Kinovate之尿苷通用載體或UnyLinker載體上使用亞磷醯胺方法在MerMade12或OligoMaker DNA/RNA合成器上以4μmol規模合成寡核苷酸。在合成結束時，於室溫下使用氨水使寡核苷酸自固體載體解離達1-2小時，且於65℃下進一步去保護達16小時。藉由反相HPLC(RP-HPLC)純化寡核苷酸並藉由UPLC特徵，且藉由ESI-MS進一步確認分子質量。關於更多詳情，參見下文。
寡核苷酸之伸長
使用0.1M 5’-O-DMT保護之亞磷醯胺於乙腈中之溶液及乙腈中之DCI(4,5-二氰基咪唑)(0.25M)作為活化劑實施β-氰基乙基-亞磷醯胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或胺基-C6連接體)之偶合。使用氫化黃原素(0.01M，於乙腈/吡啶9：1中)實施用於引入硫代磷酸酯連接之硫醇化。使用THF/吡啶/水7：2：1中之0.02M碘引入磷酸二酯連接。其餘試劑係通常用於寡核苷酸合成者。對於後固相合成結合，市售C6胺基連接體亞磷醯胺用於固相合成之最後循環且在去保護及自固體載體解離後，分離胺基連接之去保護寡核苷酸。經由羧酸 之活化及隨後與寡核苷酸之5’端上之胺反應使用標準合成方法引入結合物。
藉由RP-HPLC之純化：
藉由製備型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mm管柱上純化粗製化合物。以5mL/min之流速使用0.1M乙酸銨(pH 8)及乙腈作為緩衝液。將收集部分凍乾以產生通常白色固體狀純化化合物。
縮寫：
DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲醯胺
DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF：四氫呋喃
Bz：苯甲醯基
Ibu：異丁醯基
RP-HPLC：反相高效液相層析
實例2 測試活體外效能 導論
以下研究中所用之HbsAg分析係標準方法。其量測所產生病毒之量。因此，其量測由於靶向HBx或HBsAg之寡聚物或寡聚物結合物之病毒減少。另外，靶向HBx轉錄物之寡聚物或寡聚物結合物亦將靶向HbsAg轉錄物(亦參見結果表中之第3及4行)。
細胞系
以200mg/L之最終濃度在補充有10%胎牛血清(Invitrogen)及G418(Invitrogen)之DMEM+Glutamax-I培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中培養HepG2.2.15細胞並維持於5% CO2中37℃下。
HBsAg分析
將HepG2.2.15細胞(組成型HBV表現細胞系)以1.5×104個細胞/孔一式兩份地接種於白色96孔板中。將細胞用單一濃度之寡聚物或化合物於DMSO中之三倍連續稀釋系列處理。所有孔中之最終DMSO濃度皆係1%且使用DMSO作為對照。
使用HBsAg化學發光免疫分析(CLIA)套組(Autobio Diagnostics公司，Zhengzhou,China)以半定量地量測所分泌HBV抗原之含量。對於檢測而言，使用50uL/孔培養上清液且如由製造商之說明書所指導執行程序。使用CellTiter-Glo(Promega,Madison,WI,USA，目錄號G7571)量測細胞毒性。使用E-WorkBook Suite(ID Business Solutions有限公司，Guildford,UK)，生成劑量-反應曲線且外推IC50及CC50值。IC50及CC50定義為HBsAg分泌(IC50)及細胞毒性(CC50)與對照相比分別減少50%之化合物濃度(或條件培養基對數稀釋)。在以一系列濃度測試時數據可表示為寡聚物之EC50值，或在以單一濃度測試時表示為上清液中之HBsAg之絕對含量(以非藥物對照試樣中之HBsAg含量之百分比表示)。
來自單一濃度處理之結果
使用25μM寡聚物之單一劑量在活體外效能分析中篩選總共290種無結合物之寡聚物。13天後量測HBV抗原(HBsAg)分泌。下表5顯示篩選之結果。SEQ ID NO 294至SEQ ID NO 318之寡聚物皆將HBsAg活性減少至對照之小於40%。SEQ ID NO 584之寡聚物對應於US 8,598,334中揭示為SEQ ID NO 16之寡聚物。
使用25μM寡聚物之單一劑量在活體外效能分析中篩選額外213種寡聚物。結果示於圖5a中。
表5：25μM寡聚物之HBsAg活性(以對照之%表示).
表5a：25μM寡聚物之HBsAg活性(以對照之%表示).
來自多個濃度處理之結果
使用三倍連續稀釋(25.000、8.3333、2.7778、0.9259、0.0343、0.0114、0.0038、0.0013μM寡聚物)在活體外效能分析中測試表5之寡聚物之選擇以評價寡聚物之IC 50及CC50值。13天後量測HBV抗原(HBsAg)分泌。下表6顯示分析之結果。SEQ ID NO 585之寡聚物對應於US 8,598,334中揭示為SEQ ID NO 16之寡聚物。
實例3 活體內AAV/HBV小鼠模型：
可在AAV/HBV小鼠模型中評估抗HBV LNA。在此模型中，感染攜帶HBV基因體之重組腺相關病毒(AAV)(AAV/HBV)之小鼠維持穩定病毒血症及抗原血症達30週以上(Dan Yang，等人 2014 Cellular & Molecular Immunology 11,71-78)。
自SLAC(Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences)購得無特異性病原體之雄性C57BL/6小鼠(4-6週齡)且將其在動物看護所中圈養在單獨通氣籠中。對於動物之護理及使用遵循指南，如由WuXi IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee,WUXI IACUC方案編號R20131126-Mouse)所指示。使小鼠適應新環境3天且根據實驗設計進行分組。
將重組AAV-HBV稀釋於PBS中，200μL/注射。此重組病毒攜帶1.3個HBV基因體(基因型D，血清型ayw)拷貝。
在第0天，向所有小鼠經由尾靜脈注射200μL AAV-HBV。在AAV注射後第6、13及20天，使所有小鼠經下頜下流血(0.1ml血液/小 鼠)用於血清採集。在注射後第22天，將患有穩定病毒血症之小鼠用以5mg/kg靜脈內投用之媒劑或抗HBV LNA處理。LNA寡聚物可為未結合或GalNAc結合。
向小鼠每兩週投用一次達兩週。在首次LNA投用後第3、7、10及14天，使所有小鼠經下頜下流血(0.1ml血液/小鼠)用於血清採集以監測血清中之HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)及HBV基因體DNA。
實例4 以單一劑量每兩週注射一次之活體內研究
此研究中使用如實例3中製備之AAV/HBV小鼠模型。在患有穩定病毒血症之C57BL/6小鼠中利用鹽水作為對照測試十種GalNAc結合之抗HBV LNA寡聚物。將一些寡聚物與護理標準核苷類似物恩替卡韋(ETV)比較，該護理標準係以0.03mg/公斤處方之每日經口劑量投與。
在第0、3、7及10天或第0、3、6及9天以2mg/kg/注射之劑量向小鼠皮下投用2週。使用「材料及方法」部分中所述之方法於指定天時量測血清中之HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)及HBV基因體DNA。隨訪小鼠23-24天。
結果示於下表中。
表7A-C-2mg/kg之每週兩次劑量後HBsAg之血清含量(log10(IU/ml))
數據係來自三個獨立研究。
自該等數據可推斷出，所有GalNAc結合之抗HBV反義寡聚物在 活體內皆能夠將HBV s抗原(HBsAg)之血清含量降低至低於鹽水及護理標準。具體而言，SEQ ID NO 807、SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：814、SEQ ID NO：815、SEQ ID NO：825、SEQ ID NO：826可展示大大降低HBsAg之血清含量。
自該等數據可推斷出，所有GalNAc結合之抗HBV反義寡聚物在活體內皆能夠將HBeAg之血清含量降低至低於鹽水及護理標準。具體而言，SEQ ID NO：807、SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：814、SEQ ID NO：815、SEQ ID NO：825、SEQ ID NO：826可展示大大降低HBeAg之血清含量。
LLOQ=小於較低程度之量化
LLOQ=小於較低程度之量化
LLOQ=小於較低程度之量化
自該等數據可推斷出，所有GalNAc結合之抗HBV反義寡聚物皆能夠將HBV基因體DNA之血清含量降低至低於鹽水或等於ETV(臨床 護理標準)之量。具體而言，SEQ ID NO：807、SEQ ID NO：808、SEQ ID NO：814、SEQ ID NO：815、SEQ ID NO：825、SEQ ID NO：826可展示大大降低HBV基因體DNA之血清含量。
自該等數據之總體推論係，在活體內，GalNAc結合之HBV靶向LNA可較ETV(臨床護理標準)更佳地靶向並降低HBsAg及HBeAg之表現，且以與ETV相比相等或更佳之效能靶向並降低HBV血清DNA。由於較核苷類似物ETV更寬之對病毒轉錄程式之效應，該等數據表明，在診療所中使用GalNAc結合之HBV靶向LNA可能產生更大改良結果，包括顯著增加慢性感染HBV患者之治癒率。具體而言，免疫阻抑劑HBsAg之減少將引起針對HBV之宿主免疫反應之恢復。
實例5 若干劑量之每兩週一次注射之活體內研究
此研究中使用如實例3中製備之AAV/HBV小鼠模型。在患有穩定病毒血症之C57BL/6小鼠中利用鹽水作為對照測試七種不同劑量之GalNAc結合之抗HBV LNA寡聚物。
在第0、3、7及10天或第0、3、6及9天每週兩次向小鼠皮下投用下表中所指示之劑量(mg/kg(mpk)/注射)達2週。使用「材料及方法」部分中所述之方法於指定天時量測血清中之HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)及HBV基因體DNA。隨訪小鼠23-24天。
結果示於下表中。
上述數據亦提供於圖11中。
上述數據亦提供於圖12中。
LLOQ=小於較低程度之量化
LLOQ=小於較低程度之量化
上述數據亦提供於圖13中。
自該等數據可推斷出，所有GalNAc結合之抗HBV反義寡聚物能夠將HBsAG、HBeAG及HBV基因體DNA之血清含量降低至低於鹽水之量。具體而言，SEQ ID NO：807、814、815及825即使於中等劑量下亦顯示極有效之HBsAG減少。於最高劑量下，對於SEQ ID NO：807及815，抗原減少在治療結束後維持至少11天。SEQ ID 814、815及825展示病毒血清DNA之最有效敲低，從而展示對病毒聚合酶表現之轉錄物之尤其有效力之效應。
實例6 藉由不同投與途徑比較抗病毒效能
此研究中使用如實例3中製備之AAV/HBV小鼠模型。在患有穩定病毒血症之C57BL/6小鼠中利用鹽水作為對照使用皮下(SC)或靜脈內(IV)投與途徑測試不同劑量之GalNAc結合之抗HBV LNA寡聚物。
在第0、3、6及9天每週兩次向小鼠皮下或靜脈內投用下表中所指示之劑量(mg/kg(mpk)/注射)達2週。使用「材料及方法」部分中所述之方法於指定天時量測血清中之HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)及HBV基因體DNA。在首次投用後隨訪小鼠23天。
結果示於下表中。
LLOQ=小於較低程度之量化
LLOQ=小於較低程度之量化
LLOQ=小於較低程度之量化
數據亦提供於圖14中。
自該等數據可推斷出，與靜脈內投與相比在藉由皮下投與時，GalNAc結合之抗HBV反義寡聚物之投與更有效地將HBsAG、HBeAG及HBV基因體DNA之血清含量降低至低於鹽水之量。
實例7：結合及未結合寡核苷酸之比較
此研究中使用如實例3中製備之AAV/HBV小鼠模型。在患有穩定病毒血症之C57BL/6小鼠中利用鹽水作為對照以等莫耳寡聚物測試未結合(SEQ ID NO 308及303)及GalNAc結合(SEQ ID NO：807及815)之抗HBV LNA寡聚物。
在第0、3、6及9天每週兩次向小鼠皮下投用下表中所指示之劑量(mg/kg(mpk)/注射)達2週。使用「材料及方法」部分中所述之方法於指定天時量測血清中之HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)及HBV基因體DNA。隨訪小鼠23天。
結果示於下表中。
表17A-B-於等莫耳濃度下每兩週一次劑量後HBeAg之血清含量(log10(IU/ml))
LLOQ=小於較低程度之量化
LLOQ=小於較低程度之量化
數據亦提供於圖15中。
自該等數據可推斷出，與靜脈內投與相比在藉由皮下投與時，GalNAc結合之抗HBV反義寡聚物之投與更有效地將HBsAG及HBeAG之血清含量降低至低於鹽水之量。藉由兩種遞送方法以相等效能降低血清HBV DNA，但分析之限制方案高劑量下之區分。
本文所引用之所有參考文獻(包括出版物、專利申請案及專利)之全文皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同將每一參考文獻個別且特別指明以引用方式併入本文中並且其全文列示於本文中一般(至法律允許之最大程度)。所有標題及子標題在本文中皆僅出於便利使用且不應理解為以任何方式限制本發明。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或實例性語言(例如「例如」)僅意欲用於更好地闡釋本發明且並非對本發明範疇加以限制。本說明書中之任何語言均不應解釋為指示任何未主張要素對於本發明實踐係必不可少的。本文中之專利文件之引用及納入僅出於便利進行且並不反映該等專利文件之有效性、專利性及/或強制性的任何觀點。因此，本發明包括適用法律所允許之本文隨附申請專利範圍中所引述標的物之所有修改形式及等效形式。
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> B型肝炎病毒
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<212> DNA
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<223> 寡核苷酸序列基序
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<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(3)
<220>
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<222> (3)..(5)
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
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<222> (1)..(3)
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<220>
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<222> (4)..(16)
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (4)..(15)
<220>
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<220>
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<222> (4)..(15)
<220>
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<220>
<221> LNA核苷
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
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<220>
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<222> (1)..(3)
<220>
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<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(15)
<220>
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<222> (14)..(15)
<400> 817
<210> 818
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
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<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
<221> LNA核苷
<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
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<220>
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<222> (14)..(16)
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<211> 17
<212> DNA.
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
<221> GalNAc2-C6
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<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
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<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(17)
<220>
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<222> (14)..(17)
<400> 819
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
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<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
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<220>
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<222> (4)..(18)
<220>
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<222> (16)..(18)
<400> 820
<210> 821
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
<221> GalNAc2-C6
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
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<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(15)
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<222> (13)..(15)
<400> 821
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
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<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
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<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(17)
<220>
<221> LNA核苷，LNA C係5-甲基C
<222> (15)..(17)
<400> 822
<210> 823
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
<221> GalNAc2-C6
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
<221> LNA核苷，LNA C係5-甲基C
<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(15)
<220>
<221> LNA核苷，LNA C係5-甲基C
<222> (13)..(15)
<400> 823
<210> 824
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
<221> GalNAc2-C6
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
<221> LNA核苷，LNA C係5-甲基C
<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(16)
<220>
<221> LNA核苷，LNA C係5-甲基C
<222> (13)..(16)
<400> 824
<210> 825
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
<221> GalNAc2-C6
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
<221> LNA核苷，LNA C係5-甲基C
<222> (3)..(5)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(15)
<220>
<221> LNA核苷
<222> (13)..(15)
<400> 825
<210> 826
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸GalNAc結合物
<220>
<221> GalNAc2-C6
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 磷酸二酯核苷間連接
<222> (1)..(3)
<220>
<221> LNA核苷
<222> (3)..(4)
<220>
<221> 硫代磷酸酯核苷間連接
<222> (4)..(17)
<220>
<221> 5-甲基C
<222> (11)..(11)
<220>
<221> LNA核苷
<222> (14)..(17)
<400> 826
<210> 827
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸靶序列
<400> 827
<210> 828
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸靶序列
<400> 828
<210> 829
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸靶序列
<400> 829
<210> 830
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸靶序列
<400> 830
<210> 831
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸靶序列
<400> 831
<210> 832
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 832
<210> 833
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸靶序列
<400> 833
<210> 834
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 834
<210> 835
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 835
<210> 836
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 836
<210> 837
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 837
<210> 838
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 838
<210> 839
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 839
<210> 840
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 840
<210> 841
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 841
<210> 842
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 842
<210> 843
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 843
<210> 844
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 844
<210> 845
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 845
<210> 846
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 846
<210> 847
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 847
<210> 848
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 848
<210> 849
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 849
<210> 850
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 850
<210> 851
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 851
<210> 852
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 852
<210> 853
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 853
<210> 854
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 854
<210> 855
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 855
<210> 856
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 856
<210> 857
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 857
<210> 858
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 858
<210> 859
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 859
<210> 860
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 860
<210> 861
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 861
<210> 862
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列基序
<400> 862

Claims (17)

  1. 一種寡聚物結合物，其包含：a)至少一個長度10至20個核苷酸且與來自SEQ ID NO：3位置1530至1544之序列100%互補之第一寡聚物；及b)載劑組份，其包含具N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)之去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)靶向部分。
  2. 如請求項1之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物包含在每一側上側接翼之2’-去氧核糖核苷酸缺口區域，其中每一翼獨立地包含一或多個LNA單元。
  3. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該載劑組份係GalNAc簇，其包含2至4個末端GalNAc部分、將每一GalNAc部分連接至分支點基團之PEG間隔體。
  4. 如請求項3之寡聚物結合物，其中該GalNAc簇係三價GalNAc，其選自由結合物1、2、1a或2a組成之群，
  5. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該載劑組份係GalNAc2。
  6. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該載劑組份藉助包含兩個、三個、四個或五個磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷之磷酸二酯連接體(PO連接體)連接至該第一寡聚物。
  7. 如請求項6之寡聚物結合物，其中該PO連接體由二核苷酸序列CA組成。
  8. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物包含選自由以下組成之群之序列：GCGTAAAGAGAGG(SEQ ID NO：13)；GCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：11)；及CGCGTAAAGAGAGGT(SEQ ID NO：12)。
  9. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該第一寡聚物係選自由以下組成之群之序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：303)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：301)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：618)；及CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：302)。其中大寫字母表示LNA單元且小寫字母表示DNA單元。
  10. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其係選自由以下中之任一或多者組成之群：5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G-3'(SEQ ID NO：815)5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G s T-3'(SEQ ID NO：814)5'-GN2-C6 caG s m C s G s tsasasasgsasgs A s G s G-3'(SEQ ID NO：825)；及5'-GN2-C6 ca m C s G s m C s gstsasasasgsasgsas G s G s T-3'(SEQ ID NO：803)其中大寫字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「s」表示硫代磷酸酯連接；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基之DNA或β-D-氧基-LNA單元；GN2-C6表示具有C6連接體之GalNAc2載劑組份。
  11. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有以下結構：
    Figure TWI639432B_C0002
    (SED ID NO：815)。
  12. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有以下結構：
    Figure TWI639432B_C0003
    (SED ID NO：814)。
  13. 如請求項1或2之寡聚物結合物，其中該寡聚物結合物具有以下結構：
    Figure TWI639432B_C0004
    (SED ID NO：825)。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之寡聚物結合物及一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。
  15. 一種如請求項1至13中任一項之寡聚物結合物或如請求項14之醫藥組合物之用途，其用於製造治療肝病毒病症之藥劑。
  16. 如請求項15之用途，其中該病毒病症係B型肝炎病毒(HBV)且藥劑下調HBx及/或HBsAg之表現。
  17. 如請求項15或16之用途，其中該藥劑係用於皮下投與。
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