KR20220110729A - 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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KR20220110729A
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데이비드 엠. 에반스
패트릭 와이. 루
샤오용 루
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서나오믹스, 인크.
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Abstract

siRNA 서열 내의 시토신 모이어티 대신 겜시타빈 (GEM)을 함유하는 siRNA 조성물을 제공한다. 상기 siRNA 분자를 함유하는 제약 조성물, 및 예컨대, 암과 같은 질환을 치료하기 위해 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드
본 출원은 2019년 10월 2일 출원된 미국 가출원 62/909526; 2019년 10월 29일 출원된 미국 가출원 62/927500; 및 2020년 2월 17일 출원된 62/977,630의 우선권을 주장하며, 상기 출원들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 배경
siRNA는 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 이중 가닥 RNA 분자이다. 이들 분자는 각 가닥상의 길이가 19-29개인 평활(blunt) 말단 분자일 수 있거나, 또는 2개의 염기 오버행 (전형적으로 dTdT)를 나타낼 수 있다.
siRNA의 각 가닥은 일반적으로 원하는 서열 중의 다음 염기를 증가하는 올리고뉴클레오티드에 부착된 이전 염기에 접합시킴으로써 합성기에서 제조된다. 아미다이트 화학 또는 다른 합성 접근법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일단 합성되고 나면, 이어서, 두 가닥은 서로 어닐링되어 이중체를 형성한다.
암 세포 내의 선택된 표적에 대하여 siRNA가 침묵된 유전자 표적에 의해 코딩된 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다는 것이 입증되었다. 상기 유전자를 침묵시키면(silencing), 이는 차례로 해당 세포의 성장을 억제시킬 수 있다. 세포가 구체적으로 siRNA가 접근할 수 있는 이환된 세포 (예컨대, 암 세포)인 경우, 이때 siRNA는 치료제로 작용할 수 있다. 추가로, 일부 경우에, 현재 요법을 위한 '최적의 스탠다드(standard)'로 선택된 치료제(소분자 억제제, 모노클로날 항체 등)를 사용하는 것은 선택된 경로의 유전자를 침묵시킴으로써 증강될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
겜시타빈(Gemcitabine) (2',2'-디플루오로 2'-데옥시시티딘)은 전신 투여시, 뉴클레오시드 수송체에 의해 흡수되고, 데옥시시티딘 키나제에 의한 삼인산화에 의해 활성화된 후, 이어서, RNA 또는 DNA 내로 도입될 수 있는 피리미딘계 뉴클레오시드 유사체이다. 이는 DNA 복제 동안 (세포 분열 동안) 핵산 시티딘(cytidine)을 치환하고, 새 뉴클레오시드가 상기 뉴클레오시드 모방체에 부착될 수 없기 때문에 종양 성장을 억제시킬 수 있고, 그 결과로 세포의 아폽토시스를 초래할 수 있다 (문헌 [Damaraju et al., Oncogene 22:7524-7536 (2003)]).
겜시타빈은 췌장암 치료에서 1차 치료제이지만 (문헌 [Burris et al., J Clin Oncol 15:2403-2413 (1997)]), 담관암종(cholangiocarcinoma)(문헌 [Jo and Song, "Chemotherapy of Cholangiocarcinoma: Current Management and Future Directions. Topics in the Surgery of the Biliary Tree", chapter 3; p35-52. http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.76134 , S.Y. (2018)]), 비소세포 폐암 (문헌 [Muggia et al., Expert Opinion on Investigational Drugs, 21:4, 403-408 (2012)]), 난소암 (문헌 [Le et al., Gynaecol . Oncol . Res. Pract . 4:16 (2017)]) 및 유방암 (문헌 [Xie et al., Oncotarget, 9:7148-7161 (2018)])을 비롯한 다수의 다른 암의 치료에서 사용된다. 겜시타빈은 뉴클레오시드 수송체에 의해 흡수되고, 데옥시시티딘 키나제에 의해 활성화되고, RNA 및 DNA, 둘 모두에 도입된다. 리보뉴클레오티드 리덕타제(reductase) 및 dCMP 데아미나제(deaminase)의 억제는 그의 활성화를 증진시키는 반면, 시티딘 데아미나제는 겜시타빈을 비활성인 것으로 추정되는 그의 대사산물인2',2'-디플루오로데옥시우리딘으로 전환시키고, 이는 그의 뉴클레오티드 형태로 티미딜레이트 신타제를 억제시킬 수 있다. 겜시타빈은 환자 내로의 IV 주입에 의해 전신 투여된다. 겜시타빈의 표준 투여는 1000 mg/㎡로 매주 30-min 주입으로 이루어지지만, 이는 종양 세포 뿐만 아니라, 정상 세포로도 분포하기 때문에, 상당한 독성을 보이는 바, 그의 유용성에 있어 제한된다. 추가로, 일부 종양 유형에서의 효능을 알아보기 위해서는 용량을 매우 높은 수준으로 상승시켜야 하며, 약물에 대한 치료 지수는 매우 제한될 수 있다.
겜시타빈은 주로 백금 유사체와 함께 조합하여 널리 사용된다. 난소암에서의 겜시타빈의 조합에 대한 다른 대안은 트리아핀 또는 하이드록시우레아를 이용하여 리보뉴클레오티드 리덕타제의 억제를 증가시키는 것으로 구성된다.
겜시타빈 독성을 극복하기 위한 다양한 방법이 시도되었다. 가장 유망한 것 중 하나는 종양 세포로의 전달을 선택적으로 강화시키면서, 정상 세포로의 그의 전달을 감소시키는 표적화된 전달제를 사용하는 것이다.
화합물 겜시타빈의 작용을 증강시키는 유전자의 예로는 몇 가지만 예로 들자면, RAD17, CHK1, CHK2, ATR, ATM을 표적화하는 siRNA를 포함한다 (문헌 [Azorsa, J. Transl . Med . 7:43 (2009)]; [Fredebohm (Journal of Cell Science 126:3380-3389, 2013)], 및 [Plunkett et al., Semin Oncol 23:3-15 (1996)] 참조).
상기에서 언급된 연구에서는 (예컨대, 소분자 또는 항체 등과 같은 길항제에 의해) 억제되었거나, 또는 (siRNA 또는 miRNA를 사용하여) 침묵되었을 때, 약물에 대한 용량 반응 곡선이, 더 낮은 용량/농도에서 동일한 효능을 나타내는 것으로의 유익한 이동을 초래하는 세포 내의 추가 표적을 찾고자 하였다.
상기와 같은 용량 반응의 이동은 (예로서) RAD17 또는 CHK1에 대한 siRNA에 대해 관찰된다.
질환을 보이는 동물/인간 내의 종양 환경으로의 상기 siRNA의 전달은 다양한 표적화 또는 비표적화된 전달제를 사용하여 이루어질 수 있다. 이러한 전달 비히클은 지질, 변형된 지질, 펩티드 전달 비히클 등으로 구성될 수 있거나, 또는 심지어는 뉴클레아제 및 순환시 맞닥뜨리게 되는 다른 효소에 의한 siRNA의 분해를 방지하기 위해 백본(backbone)의 변형을 통해 변형된 (화학적으로 안정한) siRNA 분자에의 표적화 리간드의 직접 부착을 통해 이루어질 수 있다.
최근, GalNAc 변형된 siRNA는 특이적으로 간 내의 간세포로의 siRNA의 전달을 촉진하는 데 사용되었다. GalNac 모이어티(moiety)는 간세포에 특이적으로 많은 수로 존재하는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 매우 높은 친화도로 결합한다. ASGPR은 결합시 세포 내로 내재화되고, 이로써, 부착된 siRNA를 그와 함께 세포 내로 운반하는 것으로 간주된다.
특정 세포 유형에 페이로드(payload)를 전달할 수 있는 다른 표적화 리간드로는 GLP1 펩티드 (췌장 베타 세포의 GLP1 수용체에 결합), RGD 모티프 (예컨대, cRGD, α5β3 인테그린 수용체에 결합하는 iRGD, 또는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Virus)로부터 유래된 펩티드 (α5β3 수용체에 대해 거의 마이크로몰인 친화도와 비교하여 α5β6 인테그린 수용체에 대하여 nM인 친화도로 결합)), 폴레이트 리간드 (폴레이트 수용체에 결합), 트랜스페린 수용체에 결합하는 트랜스페린 리간드와 EGF 수용체를 통한 EGFR 표적화 리간드를 포함한다. 표적화 모이어티의 다른 많은 예는 별개의 세포 유형으로의 전달에 대한 특이성을 보여준다.
본원에서는 siRNA 또는 약물 단독의 투여보다 더 큰 치료 이점을 생성하기 위해 약물 (예컨대, 겜시타빈)과 함께 (유전자를 침묵시키는) siRNA의 공동-전달을 제공하는 조성물 및 방법을 기술한다.
(5-FU 및 다른 뉴클레오시드 유사체와 같은) 겜시타빈은 전통적인 합성 수단을 통해 (수동으로 또는 자동화 기기를 사용하여) DNA 또는 RNA 염기에 직접 커플링할 수 있도록 하는 방식으로 화학적으로 합성될 수 있다.
상세한 설명
siRNA 서열 내의 시토신 모이어티 대신 겜시타빈 (GEM)을 함유하는 siRNA 조성물을 제공한다. 상기 siRNA 분자를 함유하는 제약 조성물, 및 예컨대, 암과 같은 질환을 치료하기 위해 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
정의
소형 간섭 RNA ( siRNA ): 분자가 세포에 도입된 후, 세포에서 유전자의 발현을 방해(preventing)하는 짧은 이중 가닥 RNA인 이중체 올리고뉴클레오티드. 예를 들어, 단일 가닥 표적 RNA 분자에서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화하고, 그에 결합한다. siRNA 분자는 화학적으로 합성되거나, 또는 그렇지 않으면 당업자에게 공지된 기술에 의해 구축된다. 이러한 기술은 미국 특허 번호 5, 898,031, 6,107,094, 6,506,559, 7,056,704, RE46,873 E, 및 9,642,873 B2에, 및 유럽 특허 번호 1214945 및 1230375에 기술되어 있고, 상기 특허들 모두 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 분야의 관례에 따르면, siRNA 분자가 뉴클레오티드 서열에 의해 식별될 때, 그 서열은 이중체 분자의 센스 가닥을 지칭한다. 분자를 포함하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 그의 개별 뉴클레오티드 수준에서 변형되는 것 외에도, 올리고뉴클레오티드의 백본이 변형될 수 있다. 추가 변형으로는 siRNA 분자에 접합하기 위한 소분자 (예컨대, 당 분자), 아미노산, 펩티드, 콜레스테롤 및 다른 큰 분자를 사용하는 것을 포함한다.
마이크로RNA ( miRNA ): 단일 가닥 표적 RNA 분자 중의 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화하고, 그에 결합함으로써 유전자 발현의 RNA 침묵 및 전사 후 조절에 작용하는 소형 비코딩 RNA 분자.
안티센스 올리고뉴클레오티드 ( ASO ): 단일 가닥 표적 RNA 분자 중의 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화하고, 그에 결합함으로써 포유동물 세포 내에서 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 짧은 단일 가닥 RNA 또는 DNA (전형적으로, 11-27개의 염기).
DNA 또는 RNA 압타머(aptamer): 특정 표적 분자에 결합하는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드. 이러한 표적으로는 소분자, 단백질 및 핵산을 포함한다. 상기 압타머는 일반적으로 시험관내 선택의 반복적인 라운드 또는 지수 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화 (SELEX)를 통해 대규모 무작위 서열 풀로부터 생성된다.
폴리GEM 서열: 다중 겜시타빈 뉴클레오시드를 일렬로 포함하는 서열.
올리고GEM: 다중 겜시타빈 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드. 뉴클레오시드는 한쪽 말단에 또는 올리고뉴클레오티드 내에 일렬로 존재할 수 있거나, 한쪽 또는 양쪽 말단에 단일 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 내에 산재될 수 있다.
히스티딘-리신 공중합체: 히스티딘 및 리신 아미노산으로 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드. 상기 공중합체는 미국 특허 번호 7,070,807 B2, 7,163,695 B2, 미 7,772,201 B2에 기술되어 있으며, 이들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
암은 임의의 악성 종양이다.
악성 종양은 신생물성 세포 매스이다.
간암: 간 내의 임의의 원발성 암, 즉, 간에서 시작되는 암; 또는 간 내의 임의의 속발성 암, 즉, 포유동물 체내의 또 다른 조직으로부터 간으로 전이된 암. 원발성 간암의 예로는 간세포 암종이 있다. 속발성 간암의 예로 결장암이 있다.
치료하는/치료: 암 세포 중 일부 또는 그 전체를 사멸시키거나, 암의 크기를 축소시키거나, 암의 성장을 억제시키거나, 또는 암의 성장 속도를 감소시키는 것.
항종양 효능 증진: 종양 세포의 성장 속도를 더 크게 감소시키고, 종양 세포를 사멸시키고/거나, 종양 매스를 축소시키는 데 더 큰 효과를 제공하여, 궁극적으로는 종양 환자의 수명을 연장시킴으로써 더 나은 치료 효과를 생성하는 것을 의미한다.
GEM 활성 증강을 위한 표적 선택
GEM을 함유하는 구축물
아조르사(Azorsa) 등 (문헌 [J. Transl. Med. 7:43 (2009)])은 배양물 중 췌장암 세포에서의 겜시타빈 효과의 강화를 보여준 유전자 CHK1에 대한 siRNA를 확인하였다. 그 후, 프레데봄(Fredebohm) (문헌 [Journal of Cell Science 126:3380-3389, 2013])은 CHK1이 췌장 종양 세포에서 겜시타빈 효과의 강화제라는 것을 입증하였을 뿐만 아니라, 침묵되었을 때, 겜시타빈의 활성을 개선시킨 다른 여러 잠재적 표적도 확인하였다. RAD17은 이러한 표적들 중 하나인 것으로 확인되었으며, 세포 생존능을 감소시키는 겜시타빈의 작용이 상당한 개선된 것으로 입증되었다.
RAD17은 이 유전자를 단독으로 침묵시키는 것이 세포 생존능에는 거의 영향을 미치지 않지만, 겜시타빈을 포함하였을 때에는 암 세포 생존능을 감소시키는 데에는 시너지 작용 또한 명백하게 나타났는 바, CHK1보다 더 나은 표적으로 제안되었다. 그러나, CHK1 침묵 자체는 심지어 겜시타빈의 부재하에서도 세포에서 약간의 독성을 나타내는 것으로 나타났고, 이를 위해서는 CHK1에 대한 siRNA의 사용이 정상적인 분열 세포가 아닌 종양 세포로 우선적으로 흡수될 수 있도록 하는 방식으로 투여되어야 한다.
RAD17 억제는 또한 체크포인트 키나제의 억제와 시너지 작용을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Shen et al., Oncotarget 6:35755-35769 (2015)]). 따라서, 췌장암에 대한 활성을 추가로 증강시키기 위해 두 표적 - RAD17 및 CHK1, 둘 모두에 대한 siRNA를 공동 전달하는 것이 가능할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, RAD17 및 CHK1에 대한 siRNA는 둘 모두 센스 가닥 내에서 겜시타빈 뉴클레오티드로 변형될 수 있거나, 또는 센스 가닥의 말단에 추가될 수 있고, 2개의 Gem-변형된 siRNA는 세포에 형질감염되었을 때, 효능을 개선시키는 단일 폴리펩티드 나노입자에 조합될 수 있다. 추가로, 히스티딘-리신 분지형 공중합체를 사용하여 제조된 폴리펩티드 나노입자 ("PNP")는 동시에 다중 siRNA를 동일한 세포에 동시에 전달할 수 있다. 이러한 PNP는 또한 동물 모델에서 이종이식편으로 발현될 때 siRNA를 다양한 종양 세포 유형에 전달하는 데 사용될 수 있다.
하기 기술되는 바와 같이, siRNA 서열의 말단에 및/또는 서열 내 내부에 연결된 GEM 모이어티를 함유하는 siRNA 분자가 제조될 수 있다. 이러한 GEM 함유 siRNA는 표적 유전자를 침묵시키는 기능을 유지하고, 세포 내로의 GEM의 방출을 통해 종양을 사멸시키는 효능을 증진시키며, 여기서, 유전자 침묵 활성과 약물의 효과 사이에 시너지 효과가 관찰되고, 즉, 관찰되는 결과는 siRNA 및 GEM을 별개의 성분으로서 개별적으로 투여함으로써 달성되는 결과보다 더 크다.
GEM이 천연 뉴클레오티드에 분리되는 경우, 더욱 잘 프로세싱되는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 겜시타빈이 뉴클레오티드 시티딘의 유사체인 바, 시티딘 (C) 대신으로 siRNA 서열에 직접 도입될 수 있다는 사실을 이용하였다. 겜시타빈 아미다이트는 완전히 GEM 모이어티로 구성된 중합체를 형성하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Ma et al, Chem. Commun., 55:6603-6606 (2019)]). 이러한 중합체는 나노겔을 형성하고, 이들은 시험관내 및 생체내 암 세포 모델에서 일부 활성을 입증하였다. 아미다이트 작용기를 도입한 변형된 뉴클레오시드는 그의 합성 동안 이중체 중 쇄 중 하나에 예컨대, GEM과 같은 변형된 뉴클레오시드를 도입하는 데 사용될 수 있다. siRNA 이중체로부터의 안티센스 가닥은 siRNA 영역 내의 센스 가닥에서 그의 적절한 서열과 어닐링되어야 하고, 안티센스 가닥은 RISC 복합체에 통합되고, 매칭 mRNA 서열을 감시하는 데 사용되기 때문에, 변형된 뉴클레오시드는 안티센스 가닥에 비해 센스 가닥 길이의 연장을 형성하기 위해 siRNA의 센스 가닥에 먼저 추가되었다. 다중 (n) 비천연 뉴클레오시드 염기는 단일 siRNA 분자의 전달이 다중 (n) 비천연 뉴클레오시드의 공동 전달을 초래하도록 가닥의 말단에 도입될 수 있다.
일단 세포 세포질 내부로 들어가고 나면, 안티센스 가닥은 RISC 복합체에 도입되고, 매칭 mRNA 서열이 확인되고 나면, mRNA는 효소 DICER에 의해 절단된다. 이 프로세스에서 센스 가닥은 제거되고, 이어서, 세포질에서 절단된다. 이어서, 센스 가닥의 말단에 도입된 비천연 뉴클레오시드 유사체는 내인성 뉴클레아제에 의해 절단될 것이다. 이어서, 겜시타빈 (또는 항암 비천연 뉴클레오시드 유사체를 갖는 유사한 구조)의 유리된 분자는 종양 세포 복제 기구를 억제시키고, siRNA가 표적화하는 유전자 발현의 감소와 함께, 종양 세포 성장을 감소시키는 데 있어서 상기 작용제의 부재하에서보다 더 우수한 효과를 나타낼 것이다.
GEM 잔기를 도입한 화학적으로 비변형된 siRNA 분자는 혈액을 통한 순환에서, 또는 조직, 종양 미세 환경 등에서의 분해로부터 siRNA를 보호하는 적합한 나노입자 제제로 전달될 수 있다. 일단 관심 종양 또는 조직 내부로 들어가고 나면, siRNA는 종양 세포 내로 방출되어 그의 세포독성 효과를 발휘한다.
GEM 아미다이트를 사용하여 합성된 siRNA 분자는 히스티딘 리신 폴리펩티드 나노입자 (HKP PNP) 나노입자 시스템으로 전달될 수 있다. GEM은 유전자를 표적화한 후, 이어서, 종양 세포를 사멸시키는 데 있어서 겜시타빈의 작용을 증강시키고 - 치료 효과를 관찰하기 위해 필요한 투여량을 감소시키고, 겜시타빈을 단독으로 환자에 투여하였을 때에 관찰되는 독성 효과에 대한 잠재성을 감소시키는 siRNA 이중체 서열 내에 포함될 수 있다. 하기 기술되는 바와 같이, 겜시타빈이 siRNA와 별개로 (즉, 개별 성분으로서) 투여되었을 때, 겜시타빈 작용의 강화를 입증한 CHK1에 대해 이전에 공개된 siRNA 서열 (문헌 [Azorsa, 상기 문헌 동일])을 선택하였다.
siRNA는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 예컨대, 2'-OMe 및/또는 2'-F 및/또는 포스포로티오에이트 변형의 사용에 의해 이루어지는 화학적 변형에 의해 뉴클레아제 분해로부터 안정화될 수 있다. siRNA는 임의적으로 표적화 모이어티 (예컨대, GalNac, RGD, 폴레이트, TFR, EGFR, 펩티드 표적화 리간드, 압타머 또는 다른 탄수화물 또는 심지어 소분자 또는 항체 또는 나노바디(nanobody))에 (SS 또는 AS의 말단을 통해, 또는 심지어는 분자에 부가된 말단 GEM을 통해) 화학적으로 연결될 수 있다. 표적화 모이어티는 세포 표면 상의 수용체 또는 다른 표적에 대해 친화성을 가지며, 이는 이들 세포 내로의 흡수를 강화시킨다. 비변형된 siRNA와 같이, SS 및 AS 가닥은 세포에서 분리될 것이며, AS 가닥은 관심 유전자의 침묵을 초래하는 반면, 방출된 SS-폴리GEM 구조는 분해되어 GEM을 방출하고, 이는 침묵된 유전자와 함께 조합하여 단독인 것보다 더 큰 효과를 나타낼 것이다.
기본 구조는 도 1에 제시되어 있다. 도 2는 폴리GEM 테일을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 ("ASO") 서열을 보여주는 것이다. 도 2b는 표적화 리간드를 통한 표적화된 ASO 전달을 보여주는 것이다. 도 3은 표적화된 올리고 전달을 보여주는 것이고: 도 3a는 센스 가닥에 부착된 표적화 리간드를 나타내는 보여주는 것이고, 도 3b는 안티센스 가닥에 부착된 표적화 리간드를 보여주는 것이다.
폴리 겜시타빈은 또한 길이가 동일한 센스 가닥과 안티센스 가닥, 둘 모두를 갖는 단일 올리고뉴클레오티드로 접합될 수 있다 (도 4 참조). 어닐링 후에는 이중 가닥 RNA의 두 가닥 사이에 연결된 "폴리 겜시타빈 루프"를 형성한다. 단일 올리고뉴클레오티드 서열은 두 가닥에 비해 제조 비용이 낮고, 생성물의 개선된 안정성을 가질 수 있는 잠재성 및 세포 내로 전달되는 siRNA당 훨씬 더 많은 수의 GEM 분자를 전달할 수 있는 능력을 갖는 바, 암 세포에 대한 효능을 개선시킬 수 있다. 추가로, 특정 상황에서, 더 짧은 가닥에 염기가 충분하여 더 긴 가닥의 관련 동족 서열과 하이브리드화할 수 있다면, RNA의 두 가닥이 동일한 길이일 필요가 없을 수도 있다 (도 5 참조). 이러한 상황하에서, 겜시타빈 루프는 두 가닥 사이에서 대칭이 아닐 수도 있다.
또 다른 실시양태에서, 이들 구축물은 다른 비표적 세포보다 표적 세포 상에 더 높은 수준으로 존재하는 표적에 고친화도로 결합하는 표적화 리간드를 부착함으로써 특정 세포 유형으로의 전달을 위해 표적화된다. 표적화된 전달을 위해, 다중 리간드는 겜시타빈 루프 영역에 부착될 수 있고 (도 6 참조), 이는 동시에 그의 표적에 결합하는 다중 리간드에 의한 다가 표적화의 이점을 제공한다 (결합 활성을 증가시키고, 가능하게는 세포 특이성을 개선시킨다). 표적화 리간드는 링커(linker)를 통해 루프 영역에서 겜시타빈과 접합된다. 이를 통해 올리고 및 겜시타빈 접합체를 특이적으로 표적화된 세포 또는 조직에 전달할 수 있고, 이어서, 상기 표적화된 세포 또는 조직에서 이들은 상가적 또는 시너지적 또는 더 넓은 치료 효과를 유도할 수 있다. 리간드는 또한 비대칭 가닥 구축물의 Gem 루프에 부가될 수도 있다 (도 7).
GEM 모이어티를 포함하는 CHK1 siRNA 분자의 구체적인 예는 하기에 제시되어 있다. SS 및 AS 가닥은 GEM 부재시 어닐링되어 CHK1을 표적화하는 siRNA를 형성한다. 이 특정 서열은 인간과 마우스 CHK1 유전자 사이에 동일성을 갖도록 디자인되었고, 하기 기술되는 바와 같이, 유전자를 침묵시키는 데 있어서 CHK1_AZ 서열보다 더 강력한 효력을 보였다 (도 8 및 9 참조).
SS=5'-CCU GUG GAA UAG UA[GEM] UUA [GEM]UG [GEM]AA U-3' ("C" 대신 [GEM])
AS=5'-A UUG CAG UAA GUA CUA UUC CAC AGG-3' (AS 가닥 상에 GEMS 부재).
다른 분자에서는 SS 말단에 추가 GEM이 부착되었다:
SS=5'-CCU GUG GAA UAG UA[GEM] UUA [GEM]UG [GEM]AA U-[GEM][GEM].....[GEM}3' ("C" 대신 [GEM] 및 3' 말단에 GEM 부가)
AS=5'-A UUG CAG UAA GUA CUA UUC CAC AGG-3' (AS 가닥 상에 GEMS 부재).
겜시타빈은 시티딘 유사체이기 때문에, RNA 올리고뉴클레오티드 서열 중의 시티딘 모이어티를 DNA 올리고뉴클레오티드 중의 겜시타빈 모이어티 또는 데옥시시티딘 모이어티로 치환하는 데 사용될 수 있다. 이들 GEM은 여전히 올리고뉴클레오티드의 두 번째 가닥에 있는 그의 대응물과 하이브리드화할 것이며, 즉, GEM은 반대쪽 가닥의 "G" (구아노신/데옥시구아노신)와 하이브리드화할 것이다. 따라서, 침묵될 때, 세포 성장을 억제시키고, 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 유전자를 표적화하는 siRNA 서열은 siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서, 또는 심지어는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) 경우와 같이 단일 가닥 서열에서 시토신 모이어티 대신에 GEM 모이어티를 포함함으로써 증강된다. 하기 기술되는 바와 같이, CHK1 유전자를 침묵시키는 siRNA의 경우, CHK1_AZ 서열에서 GEM으로 2개의 시토신 모이어티를 치환하면 siRNA 단독의 억제 활성이 증강된다 (하기 실험 참조).
SS=5'-CCU GUG GAA UAG UA[GEM] UUA [GEM]UG [GEM]AA U-3' ("C" 대신 [GEM])
AS=5'-A UUG CAG UAA GUA CUA UUC CAC AGG-3' (AS 가닥 상에 GEMS 부재)
GEM 부가는 또한 센스 가닥의 3' 또는 5' 말단에 있을 수도 있다. 또한 AS 가닥 상의 동일부에 부가될 수 있다. 부가는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 그 초과의 GEM 모이어티를 함유할 수 있다.
다른 뉴클레오시드 항암제가 겜시타빈 대신 올리고뉴클레오티드 백본에 부착될 수 있다. 상기 유사체로는 몇 가지 예를 들자면, 시타라빈 (ara-C), 5-FU, 5-데옥시-5-플루오로우리딘, 플루다라빈, 카페시타빈, 클라드리빈, 트록사시타빈 또는 클로파라빈, 아자시티딘 및 5-데옥시 아자시티딘을 포함할 수 있다 (문헌 [Damaraju, 상기 문헌 동일] 참조).
다수의 siRNA 서열은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 폴리뉴클레오시드 유사체 쇄에 부착될 수 있다. 상기 siRNA 서열의 예로는 뉴클레오시드 유사체의 억제 기전에 역효과를 내는 단백질을 코딩하는 유전자를 침묵시키는 siRNA가 있다. 예를 들어, siRNA는 겜시타빈의 탈아미노화 및 불활성화를 담당하는 효소 (시티딘 데아미나제 또는 5'-뉴클레오티다제) 또는 예컨대, 뉴클레오시드 수송체와 같이 세포로부터의 뉴클레오시드 방출 증진을 담당하는 효소를 침묵시키는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Damaraju, 상기 문헌 동일] 및 그 안의 참고문헌 참조).
(뉴클레오시드 유사체 쇄에 부착된) 상기 구축물에서 siRNA 서열로 사용될 수 있는 다른 잠재적 표적으로는 각각 MDR1 및 MRP1 유전자에 의해 코딩되는, 다중약물 내성 (MDR) 단백질, 예컨대, P-당단백질 (P-gp) 및 다중약물 내성-연관 단백질-1 (MRP1)을 포함할 것이다. 이들 단백질의 발현은 암 화학요법에 사용되는 광범위한 약물에 내성 표현형을 부여한다. 이러한 수송체는 ATP-결합 카세트 단백질 (ABC)로 광범위하게 분류되며, 단백질의 슈퍼패밀리를 구성한다. siRNA를 사용한 MDR1 및 MRP1 유전자의 침묵이 기술되어 있다. 문헌 [Donmez and Gunduz, Biomed Pharmacother. 65(2):85-9 (2011)]을 참조한다. 침묵될 수 있는 유전자의 다른 예로는 메틸 트랜스퍼라제, 유기 음이온 및 양이온 수송체 (OAT 및 OCT), 옥시도리덕타제 플라보단백질 및 뉴클레오시드 수송체 (NT)를 포함하며, 이들은 모두 세포에서 약물 수송 및 대사에 관여하며, 암 세포에 약물 내성 표현형을 부여할 수 있다.
siRNA에 대한 다른 유전자 표적은 스스로 침묵될 때, 겜시타빈 또는 다른 뉴클레오시드 유사체의 작용을 증강시키는 것으로 검증된 것이다. 상기 유전자 표적으로는 CHK1, RAD17 외에 ATR 및 WEE1을 포함한다. 다른 표적이 침묵되고, 뉴클레오시드 활성을 증강시키는 것으로 입증된 바, 이들은 또한 적절한 뉴클레오시드 유사체에 커플링된 표적에 대한 siRNA를 가질 수 있다.
서열을 사용할 때, SS와 AS 가닥에서 각각 치환될 수 있는 2개의 C가 있었다. 따라서, 본 발명자들은 C 대신 2개의 Gem을 삽입하여 SS만 변형된 구축물을 제조하였고, 동일한 방식으로 AS 가닥을 제조하였다. 이어서, 본 발명자들은 2개의 GEM을 함유하는 SS를 비변형된 AS 가닥과 어닐링하였고, 본 발명자들은 GEM-변형된 AS 가닥을 비변형된 SS와 어닐링하였다. 본 발명자들은 추가로 GEM 변형된 SS를 GEM 변형된 AS 가닥과 어닐링하였다. 이들 구축물을 모두 어느 가닥도 변형되지 않은 siRNA와 비교하고, 겜시타빈 단독인 것의 용량 반응과 비교하였다.
아조르사 등에 의해 확인된 siRNA 서열 (CHK1_AZ)은 GEM 모이어티를 함유하는 분자를 제조하는 데 사용될 수 있는 siRNA의 예이다. 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여, 서열 중에 존재하는 천연 시티딘 ("C") 기 대신 GEM 잔기를 포함 및 포함하지 않는 하기 siRNA 가닥을 제조하였다.
C1D-2A -(서열 AUUGAUACAGAUCUCUUUCUU)는 시티딘 잔기 대신 2개의 GEM 잔기를 포함하고, 3' 말단에 dTdT를 갖는 CHK1 siRNA 안티센스 가닥을 지칭하며; 이는 GEM을 함유하지 않는 센스 가닥 (SS)(서열 AAGAAAGAGAUCUGUAUCAAU)과 어닐링된다.
C1D-2S - 이는 시티딘 대신 2개의 GEM 잔기를 포함하고, 3' 말단에 dTdT를 갖는 CHK1 siRNA 센스 가닥을 지칭하며; 이는 GEM을 포함하지 않는 안티센스 가닥 (AS)과 어닐링된다.
C1D-4 - 이는 2개의 GEM 또한 포함하는 센스 가닥 (SS)과 어닐링되는 2개의 GEM 잔기를 포함하는 CHK1 siRNA 안티센스 가닥을 지칭하며 - 즉, siRNA당 4개의 gem이 존재한다. 두 가닥 모두 상기와 같이 3' 말단에 dTdT를 갖는다.
SS의 3' 말단에 2, 4 또는 6개의 GEM이 추가된 상기 siRNA의 유사체를 합성하였고, 또한, 서열 내의 C가 그 자리에 GEM을 삽입하여 변형될 수 있는 수개의 상이한 siRNA도 디자인하였다. GEM 함량의 증가가 효능 또는 효능을 개선시켰는지 여부를 조사하기 위해 GEM을 센스 가닥 내에 및 안티센스 가닥 내에서 개별적으로 또는 조합하여 C 대신에 삽입하였다. 비변형된 CHK1 siRNA, C1D-2A, C1D-2S 및 C1D-4를 CHK1 +Gem에 민감한 것으로 밝혀진 췌장암 세포주 BxPC3에 형질감염시켰다 (문헌 [Azorsa, 상기 문헌 동일]). (대조군으로서) 비침묵 siRNA의 형질감염과 함께 겜시타빈 단독의 용량 반응을 수행하였다.
(일반 dTdT 말단 기 앞의) SS의 3' 말단에 추가 GEM을 추가하는 것은 2개의 GEM을 부가하는 것보다 더 큰 상가적 효과는 없었고, 4 또는 6개를 부가하였을 때, 효력 및 효능이 증가하지 않는 것으로 관찰되었다. 이론에 얽매이지 않고, 세포 내에 존재하는 뉴클레아제는 GEM 모이어티 사이의폴리GEM 서열을 절단할 수 없지만, 오직 그의 선행 비변형된 뉴클레오티드로부터 GEM을 절단할 수 있고 - 이로써, 서열 내 GEM의 개수와 상관없이 폴리GEM 서열 내에서 단 1개의 GEM을 방출할 수 있는 것으로 추정되었다. 결과적으로, SS의 3' 말단에 4 또는 6개의 GEM을 포함하는 구축물은 이 위치의 2GEM과 비교하였을 때, 동일하거나 약간 더 나쁜 효능을 가졌다.
SS에서 C 대신 GEM을 삽입하여 같은 시간 동안 인큐베이션된 비변형된 siRNA (IC50= 3 nM (도 5 우측 패널))와 비교하여 IC50 및 효능이 개선된 (IC50= 0.38 nM (도 6)) 생성물을 수득하였다. C 잔기 대신 안티센스 가닥에 GEM을 부가하는 것은 siRNA가 RISC 복합체로 로딩되거나, 또는 동족 mRNA의 후속 인식 및 Dicer에 의한 후속 절단을 방해할 수 있는 잠재능을 갖고 있다. 그러나, 선택된 특정 CHK1 siRNA 서열의 경우, AS 가닥에 GEM을 부가하면 효력 및 효능 (IC50 1.8 nM)이 개선되지만, SS에 대해 관찰되는 정도까지는 아닌 것으로 나타났다. 추가로, 2개의 가닥 (이제 총 4개의 GEM을 포함)을 조합해도 주요 기여가 두 가닥에서 GEM의 방출로 인한 것이라면 예상할 수 있는 효력 (1.98 nM)의 추가 개선을 제공하지 못했다. 이 IC50은 AS 가닥 단독의 2GEM과 유사하였다. siRNA를 RISC 복합체에 로딩하는 동안, 가닥이 분리되고, 센스 가닥이 세포질로 방출되어 분해되는 것으로 알려져 있다. AS 가닥은 일정 시간 동안 RISC에 유지되는 바, 혼합물에 GEM을 제공하지 않을 수 있고 - 따라서, 모든 GEM은 SS에서 유래된 것이다.
이는 다양한 구축물에 의해 유도된 침묵의 QPCR 분석에서도 확인되었다. 도 4는 SS, AS 가닥 또는 두 가닥 모두에 있는 GEM의 개수와 상관없이 siRNA에 의한 동등한 유전자 침묵이 수득되었다는 것을 보여주는 것이다.
siRNA가 세포 내에서 프로세싱될 때, 안티센스 가닥은 센스 가닥으로부터 언와인딩되고, 동족 mRNA 서열에 대해 세포를 감시하는 RISC 복합체에 로딩된다. 일단 안티센스 가닥에 의해 확인되고, 결합되고 나면, mRNA는 효소 DICER에 의해 절단되고, 안티센스 가닥은 RISC에 로딩되고, 센스 가닥은 세포질로 방출되고, 여기서, 분해된다. 이전 공개문헌 (문헌 [Ma et al., 2019])에서, 반복된 10개의 겜시타빈 서열로 구성된 폴리겜시타빈 나노겔이 합성되었고, 이러한 구조는 자체 어닐링되어 나노겔을 형성한 후, 이어서, 췌장 종양 세포에서 개선된 효능을 보였다. 센스 가닥의 말단에 반복되는 GEM 서열의 부가는 siRNA가 세포 내로 전달됨과 동시에 겜시타빈 전달에서 유사한 개선을 일으킬 것으로 예상되었다. 그러나, 비변형된 안티센스 가닥과의 어닐링 전에 센스 가닥의 [3'] 말단에 2, 4 또는 6개의 Gem을 부가해도 예상되는 효능 증가는 발생하지 않은 것으로 밝혀졌다. 오히려, 2, 4 및 6개의 GEM 서열은 단지 각 서열에서 1개의 GEM이 방출되는 것과 같은 동일한 효력을 보였다. 이는 엑소 또는 엔도뉴클레아제가 폴리GEM 서열을 절단할 수 없기 때문에 일어나는 결과일 수 있거나, 또는 방출 및 후속하여 gem을 활성화시키는 인산화가 매우 느리게 일어나기 때문에 발생하는 결과일 수 있다. 세포 생존능 실험에서 이들 구조 각각의 효능 결과는 인큐베이션 시간 증가 (72 h에서 96 h)따라 개선되는 것으로는 보이지 않았다.
GEM을 포함하는 s iRNA 합성
CHK-Az siRNA는 각 가닥의 3' 말단에 2개 염기 (dTdT) 오버행을 포함하는 19-mer siRNA였다. 센스 가닥 내에 겜시타빈 모이어티를 포함하는 것으로 변형되었을 때, 본 발명자들은 이를 센스 가닥의 말단과 dTdT 말단 기 앞 사이에 삽입하였다. dTdT 말단은 뉴클레아제 분해에 대해 siRNA 서열을 안정화시키는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 차례로 절단 및 침묵되는 동족 mRNA 서열에 대하여 AS 가닥을 감시하는 동안 RISC 복합체의 AS에서 분리될 때, 센스 가닥으로부터 Gem을 방출하는 속도에 영향을 줄 수 있다.
GEM을 포함하는 25mer 대비 GEM을 포함하는 CHK1 _AZ의 개선에 대한 근거.
본 발명자들이 디자인한 25mer siRNA는 평활 말단 siRNA인 반면, 아조르사에 의해 사용된 siRNA 서열은 3' 말단에 2 염기 (dTdT) 오버행을 포함하는 19mer siRNA였다. siRNA SS의 마지막 뉴클레오티드와 dTdT 오버행 사이에 2개의 GEM 모이어티가 부가되었을 때, 본 발명자들은 이 서열이 BxPC3 세포보다 MiaPaca 세포에 대해 훨씬 더 높은 효능을 보였다는 것을 알 수 있었다. 서열 말단에 dTdT를 포함하면, SS가 AS 가닥으로부터 언와인딩되어 세포질로 방출될 때, 이 구축물에서 SS로부터의 GEM의 방출 속도가 감소될 수 있다. 이를 통해 GEM이 SS에서 방출되기 전에 AS 서열이 유전자의 침묵을 유도하도록 할 수 있으며, 이는 BxPC3 세포와 비교하여 MiaPaca 세포에서 이 조합의 효능을 증강시킬 수 있다.
췌장암 요법을 위한 개선된 옵션
제시된 데이터에 따르면, 본 발명자들은 겜시타빈을 포함함으로써 췌장암 세포에서 겜시타빈 작용의 효능이 극적으로 개선되었음을 입증할 수 있는 것으로 보인다. 다수의 GEM을 siRNA의 센스 가닥에 도입하면 siRNA가 효과를 발휘하는 동일한 세포에 GEM을 전달할 수 있다. 이전 연구 (문헌 [Azorsa, 2009])에서, CHK1을 침묵시키면 겜시타빈의 작용이 증강될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CHK1을 침묵시킬 수 있는 siRNA 서열에 GEM을 부가하면, 상호작용에서 약간의 상가/시너지가 있을 것으로 본 발명자들은 예상할 것이다. 히스티딘 리신 폴리펩티드 나노입자 (PNP)를 사용하여, 본 발명자들은 시험관내 및 생체내에서 다수의 상이한 종양 유형에 siRNA를 전달하는 능력을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 암 치료를 위한 새로운 치료법으로서 GEM CHK1 siRNA의 전달을 연구하고 있다. 추가로, 폴리펩티드 나노입자는 동일한 세포에 1 초과의 표적에 대한 siRNA를 동시에 전달할 수 있는 바, 본 발명자들은 또한 제1 siRNA와 시너지 효과를 낼 수 있는 제2 유전자 표적을 침묵시킬 수도 있다. 공개문헌 (문헌 [Paul et al., 2015])에서는 췌장암에서 CHK1과 RAD17 억제 사이의 시너지가 입증되었고, 이로써, 본 발명자들은 GEM-CHK1 siRNA와 함께 조합하여 RAD17을 침묵시킴으로써 이점을 얻을 수 있는 것이 실현가능하다. GEM-Chk1 siRNA에 의해 전달되는 겜시타빈의 양이 시험관내 및/또는 생체내에서 강건한 효과를 발휘하는 데 충분하지 않다면, 이때 RAD17 SS를 추가로 변형시켜 "C" 대신 이 서열에 Gem을 도입할 수 있다.
겜시타빈 옵션
겜시타빈 활성은 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 dCMP 데아미나제의 억제에 의해 증강될 수 있다.
겜시타빈은 주로 백금 유사체와 함께 조합하여 널리 사용되며, 다른 조합은 덜 빈번하게 사용되거나, 또는 현재 탐색 중에 있다. 겜시타빈의 표준 투여는 1000 mg/㎡로 매주 30-min 주입으로 이루어지지만, 예컨대, 프로드럭 (예컨대, 수송 결핍을 우회할 수 있는 CO-1.01), 고정 용량 비율 주입 (10 mg/㎡/min), 및 24-h 간 동맥 주입, 방광에서의 점적주입에 의한 또는 진행성 난소암 치료를 위한 복강내 투여에 의한 국소 경로 투여와 같은 대안이 탐색되고 있다. 난소암에서 겜시타빈의 조합에 대한 다른 대안은 트리아핀 또는 히드록시우레아로 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제를 증가시키는 것으로 구성된다. 신호 전달에 대한 겜시타빈의 작용은 또한 신호 전달 경로와의 조합에 대한 합리적인 개념을 제공한다.
결론
아미다이트인 겜시타빈은 올리고뉴클레오티드 합성 동안 포함될 수 있으며, 뉴클레오티드 서열에 도입된다. 본 발명자들은 siRNA에 GEM을 부가하면, siRNA와 겜시타빈을 같은 세포에 함께 전달할 수 있다는 것을 입증하였다. 종양 세포의 생존능을 감소시키는 데 있어 겜시타빈의 효과를 개선시킬 것으로 예상되는 분자 표적에 대한 siRNA를 선택함으로써, 본 발명자들은 두 제제 중 어느 하나 단독으로는 볼 수 없는 효능의 현저한 개선을 볼 수 있다.
본 발명자들은 예로서 CHK1 및 RAD17을 표적화하는 siRNA를 사용하기 위해 선택했지만, 겜시타빈은 유사한 결과를 보이는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드에 도입될 수 있다. 겜시타빈 활성을 증강시키는 siRNA의 예 또한 cMyc를 적합한 유전자 표적으로 기술하였다 (문헌 [Zhang et al., Cancer Metastasis Rev 26:85-110 (2013)]). 따라서, cMyc에 대한 siRNA는 직접 도입된 GEM을 가질 수 있고, 이를 사용하여 예컨대, NSCLC와 같은 암을 치료할 수 있다. 실제로, 올리고뉴클레오티드는 침묵 효과가 전혀 필요하지 않을 수 있지만, 질환에 대한 효능을 위해 겜시타빈을 전달하는 데 사용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 siRNA 구조 내의 염기에 대한 화학적 변형 (예컨대, 2'-OMe, 2'-플루오로, 포스포로티오에이트 변형 등)은 생체내 투여시 뉴클레아제 공격에 대해 올리고뉴클레오티드를 안정화시킬 수 있다는 것은 널리 공지되어 있다. 이러한 화학적으로 변형된 올리고는 암 세포 상의 수용체에 대한 결합을 통해 직접 전달을 허용하는 표적화 리간드에 직접 커플링될 수 있다는 것이 실현 가능하다.
추가로, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포 내에서 선택된 유전자의 발현을 변경시킬 수 있고, 이들 단일 쇄 올리고 또한 gem에 의해 변형될 수 있다. (C 염기에서의) 이러한 변형 또는 서열 말단에의 부가를 사용하여 겜시타빈의 공동 전달 뿐만 아니라, 특정 표적에 대한 하이브리드화 효율을 변경시키는 데 도움을 줄 수 있다.
유사하게, 항암 효과가 있는 miRNA (모방체 또는 억제제)가 기술되었으며, 이들은 동일한 세포에 전달하기 위해 그의 서열에 겜시타빈을 삽입함으로써 변형될 수 있다. 특히, 겜시타빈의 작용을 증강시킬 수 있는 miRNA가 관심의 대상이 될 것이다.
마지막으로, 압타머는 선택된 표적에 고친화도로 결합도록 디자인되고, 제조될 수 있는 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 이들은 세포 상의 수용체, 또는 구체적으로 암 세포에서 상향조절된 수용체일 수 있다. Gem 뉴클레오티드는 상기 서열에 추가 또는 (C 대신) 삽입되어 암 세포 표면 상의 표적 수용체에 고친화도로 결합할 수 있도록 허용한 후, 올리고가 세포 내로 흡수될 수 있도록 하여 세포에서 겜시타빈이 방출되어 치료 효과를 발휘하도록 할 수 있다.
겜시타빈 변형된 올리고뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)는 여러 암 유형에서 암 치료 옵션을 개선시키는 데 유용할 수 있다.
겜시타빈은 또한 방사선 감작 물질로서 작용할 수 있다 (종양의 방사선 치료 효능을 개선). 따라서, 겜시타빈은 상기 기술된 올리고의 변형을 통해 특정 암 세포로 전달될 수 있다는 것이 실현 가능하다. 일단 겜시타빈이 전달되고 나면, 종양은 방사선에 노출된 후, 이에 의해 종양 세포는 사멸된다. 때때로, 이러한 방사선 노출은 그 프로세스에서 방출되는 종양 특이적 항원에 대한 면역 반응을 추가로 생성할 수 있다.
따라서, 겜시타빈 또는 다른 비뉴클레오시드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 암 및 비뉴클레오시드 (또는 뉴클레오티드) 유사체가 효과적일 수 있는 다른 질환에 대하여 실행 가능한 치료법이 될 수 있다. 비뉴클레오시드 유사체 또는 뉴클레오티드 유사체의 사용의 또 다른 예는 바이러스 질환의 치료에 있다. 예를 들어, 바이러스 질환에서, 비뉴클레오시드 (또는 뉴클레오티드) 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 공동 투여하는 것이 가능할 수 있다. 이는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 역전사효소 억제제 (NRTI), 예컨대, 지도부딘, 디다노신, 잘시타빈, 스타부딘, 라미부딘, 아바카비르, 엠트리시타빈 및 테노포비르, 또는 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI), 예컨대, 네비라핀, 델라비르딘, 에파비렌즈, 및 에트라비린을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1
방법
500개의 세포/웰로 2개의 384 웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 세포를 다양한 농도의 CID2A, CID2S, CID4 siRNA (리포펙타민 RNAiMAX로 제제화된 것) 또는 겜시타빈 (0.1-1000 nM)으로 72 hr 동안 처리하였다. 37℃에서 72 hr 동안 인큐베이션시킨 후, CTG2 시약을 사용하여 생존가능한 세포의 개수를 평가하였다. 비처리된 세포를 100%로 설정하였다.
siRNA 디자인
아조르사 chk1 서열에 대한 siRNA는 논문 (문헌 [Azorsa, 상기 문헌 동일])으로부터 얻었다. 이는 각 가닥의 3' 말단에 2개의 dTdT 염기 오버행을 갖는 19mer이다. 추가 siRNA를 사용하여 RAD17 및 CHK1을 침묵시킬 수 있는 능력을 조사하기 위해, 마우스와 인간 유전자 사이에 동일성을 갖는 25mer 평활 말단 siRNA 서열을 디자인하였다.
표적 침묵 의 siRNA 검증 ( qRTPCR )
데이터는 RAD17 또는 CHK1에 대해 디자인된 여러 siRNA가 그의 각각의 표적 유전자를 침묵시킬 수 있는 능력에 미치는 상대적인 효과를 보여준다. 본 실험은 하기 제시된 siRNA를 사용하여 수행하였다. 유전자 표적 침묵 정도는 (50 nM)에서 siRNA로 형질감염된 세포에서 측정하였고, 유전자 침묵의 정도는 qRTPCR을 사용하여 (데이터 정규화를 위해 대조군 하우스키핑 유전자로서 베타-액틴을 사용) 측정하였다.
결과
도 8은 췌장암 세포주 BxPC3가 전달제로서 리포펙타민을 사용하여 투여된 비-침묵 siRNA(NS/리포)에 대해 어떤 반응도 나타내지 않는다는 것을 보여주는 것이다. 그러나, 동일한 시약을 사용하여 CHK1 siRNA를 투여한 경우 (Chk_Az/리포), 72h 노출 후 용량이 증가함에 따라 세포 생존능이 약 50%까지 감소한 것으로 관찰되었다. CHK_Az siRNA 서열(2S/리포)의 센스 가닥에서 2개의 시토신이 GEM으로 치환되거나, 또는 안티센스 가닥 (2A/리포)에서 2개의 시토신이 GEM으로 치환된 siRNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. GEM 함유 센스 가닥은 비표지된 안티센스 가닥과 어닐링되어 2S를 형성하거나, 또는 GEM 함유 안티센스 가닥은 비표지된 센스 가닥과 어닐링되어 2A를 형성하거나, 또는 2개의 GEM을 포함하는 센스 가닥은 2개의 GEMS를 포함하는 안티센스 가닥과 어닐링되어 화합물 4를 형성하였다. 선택된 서열에서, 2S 생성물의 CHK1 유전자에 대해서만 침묵 활성이 관찰되었다. 겜시타빈을 나타내는 활성은 2A 생성물에서만 관찰되었다. 추가로, GEM-SS를 GEM-AS와 어닐링하여 cpd4를 수득하였을 때, siRNA 서열에 대한 침묵 효과는 관찰되지 않았지만, siRNA당 4개의 GEM의 존재로 인해 용량 반응이 좌측으로 이동된 것이 관찰되었다. 도 8의 그래프는 그래프 아래 표에 제시된 데이터를 보여주는 것이다. 표는 표의 맨 윗줄에 표시된 농도 (nM)에서 각 처리하에 존재하는 생존가능한 세포의 비율(%)을 나타낸다.
본 연구의 결과에 따르면, GEM이 siRNA의 SS 내에 부가될 수 있고, 종양 세포, 특히, 본 췌장 종양 세포주 BxPC3 사멸에 대한 siRNA 침묵의 활성을 증강시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 도 8 참조.
비침묵 siRNA (NS)는 72h 인큐베이션 기간 동안 세포 생존능에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 겜시타빈 노출 (리포펙타민 부재 - gem)은 IC50 ~7 nM으로 세포 생존능에 있어 용량 의존적 감소를 보였다. 비변형된 CHK1 siRNA (Chk-Az)는 최대 0.1 nM까지 용량 의존적 효과를 보였지만, 그 이후에 그 효과는 세포 생존능의 50%의 최대 억제에서 안정 상태를 유지하였다.
내부 GEM이 CHK1 siRNA 효능에 미치는 효과
2개의 GEM이 AS 가닥 (2A)에 포함된 경우, 이때 용량 반응은 GEM 단독 용량 반응 곡선과 매우 유사한 것으로 보였다. 2개의 GEM이 SS (2S)에 포함된 경우, 이때 용량 반응 곡선의 초기 부분은 CHK1 siRNA (0-0.1nM)에 의해 생성된 침묵과 더 유사한 것으로 보였다. 그러나, 50% 세포 생존능에서 안정 상태를 유지하는 CHK1 siRNA 효과와 달리, 1 nM 초과의 농도에서 2S는 계속해서 세포 생존능에 대한 억제 효과를 생성하여 50 nM에서 최대 14% 세포 생존능을 보였다. 이 효과는 GEM 단독인 경우에 관찰된 반응과 더 유사한 것으로 보였다 (동일 농도 (50 nM)에서 최대 26% 세포 생존능). 각각 2개의 GEM을 포함하는 두 가닥의 어닐링은 siRNA 분자(C1D-4)당 4개의 GEM을 제공하였다. 2A와 비교하여, 이 물질에 대해 용량 반응은 왼쪽으로 이동한 것으로 관찰되었다 (더 많은 수의 GEM이 효력을 증가시킨다는 것을 반영). 그러나, CHK1 siRNA 단독과 비교할 때, 세포 생존능의 초기 감소는 관찰되지 않았지만, 곡선은 GEM 단독 곡선과 평행하게 진행되었고, 이는 siRNA당 2배 많은 GEM을 도입함으로써 유일한 효과가 생성되었다는 것을 시사하는 것이다.
스크리닝을 통해 췌장 종양 세포 억제에 대해 효력이 있는 siRNA 서열을 확인한다.
도 9는 CHK1에 대해 디자인된 다수의 8개 siRNA 서열의 형질감염시 췌장암 세포주 생존능의 민감도를 보여주는 것이다. siRNA 서열을 배양물 중의 세포에 형질감염시킨 후 72h째의 생존가능한 세포의 비율(%)이 제시되어 있다 (상부 패널 - BxPC3 세포, 하부 패널 - CFPAC 세포). 100% 생존능은 비침묵 제어 siRNA (NS) 존재하의 것으로 정의된다. CHK1_AZ (AZ)는 비교기로서 시험되었다. CD=세포 사멸 siRNA - 세포에 형질감염되었을 때 많은 세포 유형을 최대로 사멸시키는 것으로 공지.
Chk4 서열은 BxPC3 세포에서 가장 강력한 효과를 제공하였다. 또한 또 다른 췌장암 세포인 CFPAC에 형질감염되었을 때, 세포 생존능에 매우 현저한 영향을 미쳤다.
시험된 서열은 하기와 같았다:
1. GGGAGAGGTGCCTATGGAGAAGTT
2. GGAGAAGTTCAACTTGCTGTGAATA
3. CCAGTTGATGTTTGGTCCTGTGGAA
4. CCTGTGGAATAGTACTTACTGCAAT
5. GGAATAACTCACAGGGATA
6. GGGATATTAAAACCAGAAAA
7. GCAGAACCAGTTGATGTTT
8. GGAATAGTACTTACTGCAA.
Chk4는 BxPC3 세포에서 CHK-AZ (아조르사 논문의 CHK1 siRNA 서열)보다 더 큰 효력을 보였다. 추가로, 이 서열에는 CHK1_AZ의 2개와 비교하여 GEM으로 치환될 수 있는 3개의 시토신이 있다. 이는 분자당 더 많은 개수의 GEM을 전달함으로써 CHK1 유전자를 침묵시키는 데 더 큰 효력을 발휘할 수 있는 가능성을 제공하고, 이 활성을 추가로 증강시키고, 변형된 CHK1_AZ와 비교하여 효력과 효능을 개선시킨다.
이 데이터는 하기 내용을 보여주었다:
1. CHK1 siRNA의 SS에 2개의 GEM을 배치하면, siRNA 단독인 경우와 비교하였을 때, 효능이 개선된다.
2. AS 가닥에 2개의 GEM 배치 - 본 발명자들은 siRNA 침묵 효과의 효과는 볼 수 없지만, GEM이 세포 생존능에 대한 미치는 효과는 볼 수 있다.
3. AS 및 SS 어닐링 - 각각 2개의 GEM을 포함하며, 이로써, 분자당 4개의 GEM이 생성된다. 그러나, #2와 같이, AS 가닥 상의 2개의 GEM은 AS 가닥이 유전자 억제 효과를 생성하는 것을 방지하고, 본 발명자들이 siRNA당 4개의 GEM을 전달하기 때문에, 본 발명자들은 오직 개선된 효능만 볼 수 있다.
4. 각 가닥의 3' 말단에 dTdT 모이어티를 부가하면, GEM의 방출이 느려질 수 있고, 이로써, 유전자 억제 효과와 다른 효과를 구별할 수 있다.
5. AS 가닥 내의 GEM은 AS 가닥이 RISC 복합체에 결합하는 능력을 방해하고, 표적화된 유전자의 침묵을 유도하는 경우, siRNA 효능을 억제시킬 수 있다. 그러나, AS 가닥의 3' 말단 상의 GEM은 AS 가닥에 의해 유도된 침묵과 함께 상가 활성을 나타내는 것으로 입증되었다. 이러한 상가 활성을 위해 1 또는 2개의 GEM이 부가될 수 있다. 추가 GEM도 또한 부가될 수 있다.
6. SS 상의 GEM은 세포 생존능에 대한 GEM의 억제 효과와 함께 추가된 siRNA 매개 침묵을 보여줌으로써 효능을 개선시킨다.
2x GEM을 포함하는 상기 SS 가닥 및 2x GEM을 포함하는 AS 가닥을 조합하면, 4개의 GEM에 기인하여 더 우수한 효능이 생성되지만, siRNA에 의한 표적화된 유전자의 침묵은 없다.
개선된 CHK1 siRNA (CHK_DE4)가 이전 연구의 아조르사 서열보다 더 우수한 침묵을 보였다.
시험된 서열은 하기와 같았다: (이는 센스 가닥 서열을 나타낸다)
CHK_X
Figure pct00001
#4 서열 CCTGTGGAATAGTACTTACTGCAAT가 가장 우수한 것으로 보였다.
그러므로, SS =
SS=5'-CCU GUG GAA UAG UA[GEM] UUA [GEM]UG [GEM]AA U-3' ("C" 대신 [GEM])
AS=5'-A UUG CAG UAA GUA CUA UUC CAC AGG-3' (AS 가닥 상에 GEMS 부재)
AS를 모든 변형된 염기로서 제조한다. SS를 모든 변형된 (2'-O-Me)로서 제조하고, 비교를 위해 비변형된 것으로 제조한다.
관심의 대상이 되는 추가 서열:
CHK1A: 표적 서열: CHK1-A: AAGAAAGAGAUCUGUAUCAAU; "C" 대신 GEM을 위한 2개의 위치
CHK1B: 표적 서열: Chk1-B: UUGGAAUAACUCCACGGGAUA. 본 서열에 GEM을 배치하기 위한 4개의 위치가 존재한다.
본 발명자들은 4개의 GEM SS를 포함하는 CHK1-B_AZ가 CHK1A에서 2보다 더 우수한 활성을 보일 것으로 예상한다.
겜시타빈은 방광암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 비소세포 폐암을 비롯한 다수의 암을 치료하는 데 사용된다. 이들 다른 암 유형은 본원에 기술된 방법을 사용하여, 임의적으로, 활성을 증진시키기 위해 추가의 siRNA 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
실시예 2
췌장암 BxPC3 세포를 1000개의 세포/ml로 시딩하고, 384 웰 플레이트에 단층으로 성장시켰다. 세포를 리포펙타민 (써모피셔(ThermoFisher))을 사용하여 CHK1 또는 Rad17에 대해 명시된 siRNA로 형질감염시키거나, 또는 X축에 명시된 농도의 겜시타빈으로 처리하였다. 5% CO2하에 37℃에서 96h 인큐베이션시킨 후, 초민감 발광 검출 광학 장치가 장착된 퍼킨 엘머 인비젼(Perkin Elmer Envision) 플레이트 판독기에서 시약에 의해 생성된 발광 신호를 모니터링함으로써 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) (퍼킨 엘머)를 사용하여 세포 생존능을 측정하였다. 본 발명자들은 도면으로부터 겜시타빈 (GEM)이 ~6 nM의 IC50으로 및 >80% 세포 사멸의 최대 효능으로 용량에 의존하는 방식의 세포 생존능 억제를 생성한다는 것을 알 수 있다. RAD17에 대한 25mer 평활 말단 siRNA는 단지 60%의 세포 생존능 감소의 최대 효능 및 ~5 nM의 IC50으로 용량에 의존하는 방식의 세포 생존능 억제를 생성하였다. 문헌 [Azorsa, 상기 문헌 동일]로부터의 CHK1에 대해 이전에 공개된 19mer siRNA 서열을 사용하여, 본 발명자들은 Rad17 siRNA와 유사한 세포 생존능에서 유사한 최대 효능을 관찰하였다. CHK1에 대한 평활 말단 25mer siRNA는 100 nM에서 ~90%의 세포 생존능 억제로 아조르사 CHK1 siRNA 서열보다 더 큰 효능을 보였다. 후자의 siRNA에 대한 IC50은 아조르사 서열에 대한 IC50 (~0.3 nM)과 유사하였다. 도 11에 제시된 결과는 CHK1 및 RAD17에 대한 siRNA 단독으로 췌장암 세포 생존능을 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3
명시된 siRNA 서열에 대한 각 센스 가닥의 3' 말단에 겜시타빈 뉴클레오티드 아미다이트가 부가된 siRNA를 합성하였다. siRNA를 세포에 형질감염시키고, 도 1에 설명된 바와 같이 인큐베이션. 모든 서열의 최대 효능은 이제 10 nM 초과의 농도에서 >95%의 세포 생존능 억제로 개선되었다. 극도로 낮은 농도 (0.1 nM)에서, 겜시타빈 변형된 RAD17 siRNA 자체는 세포 생존능에 영향을 미치지 않는 반면, 동일한 농도의 겜시타빈 변형된 CHK1 siRNA는 세포 생존능을 31% 억제 (25mer) 또는 56% 억제시켰다 (19mer). 겜시타빈 뉴클레오티드가 siRNA 서열 내에서 시티딘 뉴클레오티드를 치환할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 그를 연구하였다. AZ CHk1 서열은 GEM에 의해 치환된 2개의 "C" 기를 가졌고, 본 발명자들은 상기 siRNA (CHK1-AZ-2S)가 3' 말단에 2개의 GEM을 갖는 siRNA (CHK-AZ-Poly2)와 거의 동일하게 거동한다는 것을 알 수 있다. 도 12a-12d는 각 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에의 2개의 겜시타빈 뉴클레오티드의 부가가 효력 및 효능에 대해 미치는 효과를 보여주는 것이다.
실시예 4
1000개의 세포/웰로 384 웰 플레이트에 시딩된 BxPC3 세포를 siRNA 구축물로 형질감염시키거나, 도면에 명시된 농도로 겜시타빈에 노출시켰다. 시험된 샘플은 겜시타빈 단독 (GEM), CHK1에 대한 비변형된 19mer siRNA (CHK-AZ) 및 서열은 동일하되, 단, 동일한 안티센스 가닥과의 어닐링 전에 센스 가닥의 3' 말단에 부가된 2개 (폴리-2), 4개 (폴리-4) 또는 6개 (폴리-6)의 겜시타빈 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA였다. 다양한 작용제에 120h 노출시킨 후, 셀 타이터 글로 (PE)를 첨가하여 세포 생존능을 측정하였고, 플레이트를 10-20 min 동안 진탕시킨 후, PE 인비젼 플레이트 판독기에서 세포 생존능과 상관관계를 갖는 발광 신호를 측정하였다. 도 13은 센스 가닥의 3' 말단 상에 추가 GEM 부가가 효능 및 효력에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
siRNA의 SS 상에 2개의 GEM 뉴클레오티드를 부가하였을 때, 췌장암 세포 생존능에 대한 효능이 개선되었고, 이어서, 추가 GEM을 부가하면, siRNA의 효능 및/또는 효력이 추가로 개선될 것으로 추론되었다. 이를 위해, 비변형된 19mer siRNA (CHK-AZ)를, SS의 3' 말단에 2Gem이 부가된 동일 서열 (폴리-2), 4GEM이 부가된 동일 서열 (폴리-4), 또는 6GEM이 부가된 동일 서열 (폴리-6)과 비교하였다. 상기 서열들을 겜시타빈 단독 (GEM)과 비교하였다. 도 1에서와 같이 BxPC3 세포에서 siRNA의 형질감염에 의해 본 실험을 수행하였지만, 세포 생존능 측정 전 노출 시간은 120h였다. 인큐베이션 시간이 더 길기 때문에, siRNA의 용량 반응을 훨씬 더 낮은 농도에서 조사하였다. 이를 통해 진정한 IC50 값을 확인할 수 있었다. GEM 자체는 이 세포주에서 전체 용량 반응을 생성하였고, 이 인큐베이션 시간에 50 nM 초과의 농도에서 100% 세포 생존능 감소로 3 nM IC50을 생성하였다. 비변형된 19mer siRNA (CHK-AZ)를 통해 0.16 nM의 IC50을 얻었다. 그러나, 심지어 상기의 연장된 노출 시간에서도 효능을 ~70%의 세포 생존능 억제로 최대화되었다. siRNA의 3' 말단에 2, 4 또는 6개의 Gem을 부가하였을 때, 이들은 모두 생성물의 최대 효능을 개선시켰고, 이로써, 세포 생존능은 10 nM 초과의 농도에서 10% 미만이었다. 그러나, 더 많은 GEM이 siRNA의 효능을 개선시킬 것이라는 기대는 충족되지 않았으며, 2개의 GEM을 포함하는 서열은 4개의 Gem 또는 6개의 Gem 구축물보다 더 강력하였다. 2개의 GEM 구축물은 겜시타빈 단독 (3 nM) 대비 115배로 IC50 (0.026 nM)의 개선을 보였다. 상기 데이터는 siRNA의 SS의 3' 말단에의 2개 초과의 GEM이 세포 생존능 검정법에서 구축물의 효력 또는 효능에 추가적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
실시예 4
BxPC3 세포 (12 웰 플레이트의 2.5x105개의 세포/웰)를 Chk1/Gem siRNA의 상이한 변이체 (50 nM)로 형질감염시켰다. 형질감염 24hr 후, Sybr 그린(Sybr Green) RT-PCR에 의해 Chk1 RNA의 상대적 수준을 측정하였다. B-액틴의 발현 수준을 정규화군으로 사용하였다. 모든 샘플의 mRNA 수준은 ΔΔCt 방법을 사용하여 비처리된 세포에서의 mRNA 수준 대비로 계산하였다.
2AGem/Chk - CHK1 siRNA의 안티센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈.
2AGem/NS - 비침묵 siRNA의 안티센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈.
2SGem/Chk - CHK1 siRNA의 센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈.
2SGem/NS - 비침묵 siRNA의 센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈.
4Gem/CHK - CHK1 siRNA의 센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈 및 CHK1 siRNA의 안티센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈.
4Gem/NS - 비침묵 siRNA의 센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈 및 비침묵 siRNA의 안티센스 가닥 상의 C를 치환하는 2개의 겜시타빈.
Blnk - 비처리된 샘플.
Chk_Az(a) - 비변형된 CHK1 siRNA.
NS - 비침묵 siRNA 단독.
도 14는 센스/안티센스 가닥 내의 겜시타빈 삽입이 미치는 효과 및 유전자 침묵에 대한 효과 (qPCR 결과)를 보여주는 것이다.
실시예 5
BxPC3 세포에서 GEM 변형된 siRNA로 관찰된 결과는 이들 작용제에 노출된 시간에 의존하였다. 도 15는 세포 생존능에서 siRNA 및 siRNA-GEM 구축물의 효능의 시간 의존성을 보여주는 것이다. 화합물에 노출된 세포의 생존능을 다양한 농도에서 48h (왼쪽 패널), 72h (중간 패널) 또는 120h (오른쪽 패널)에 조사하였다. 각 시점에서 비표지된 siRNA (CHK-Az)는 최고 농도 (100 nM)에서 GEM-변형된 siRNA (폴리-2, 폴리-4 또는 폴리-6 - 3' 말단에 2, 4 또는 6개의 겜시타빈 모이어티 포함)보다 더 약학 효과를 보였다는 것을 알 수 있다. 4개의 (폴리-4) 또는 6개의 Gems (폴리-6)과 비교하여 2개의 Gems (폴리-2)을 함유하는 siRNA 사이에 효력 또는 효능에 있어 큰 차이는 없었지만, 각 폴리GEM 구축물에 의한 세포 사멸 정도는 노출 시간에 따라 증가하였다 (48h에서 ~40%로부터 72h에서 ~70% 및 120h에서 100%). 본 데이터는 세포에 유입되는 siRNA당 1 또는 2개의 겜시타빈 분자만이 방출되었다는 것을 시사한다. 추가로, 시간 의존성은 GEM 자체의 효과를 증강시키기 위해 강건한 유전자 침묵을 얻는 데 소요되는 시간을 반영할 수 있거나, 방출된 GEM을 활성화시키는 데 필요한 프로세스에도 시간이 걸린다는 것을 시사할 수 있다. 이는 겜시타빈 모이어티의 방출, 및 이어서, 뉴클레아제 안정 GEM 뉴클레오시드의 연장 서열 내로의 도입을 통해 복제 분기점을 차단할 수 있는 활성 모이어티를 생성하기 위해 요구되는 뉴클레오티드의 삼중 인산화에 필요한 시간이다. 또한, 특정 세포 유형에 대한 세포 주기 및 분열 (복제) 시간에 따라 달라질 수 있고 - BxPC3의 경우, 상기 시간은 ~48-60시간인 바, 본 발명자들은 120h에서는 72h에서 1회인 것과 비교하여 2-3회의 분열 사이클에 대해 조사할 것이다.
실시예 6
본 발명자들은 GEM 뉴클레오티드가 siRNA의 안티센스 (AS) 가닥에 있는 siRNA 내의 시티딘 뉴클레오티드를 치환하는 데 사용될 수 있는지 여부를 추가로 확인하였다. 이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 아조르사 등으로부터의 CHK1에 대한 19mer siRNA 서열을 다시 사용하였다. 도 16에서:
2A-CHK1은 siRNA 침묵 CHK1의 AS 가닥에서 C를 치환하는 2개의 GEMS를 지칭한다.
2A/NS는 비침묵 (NS) siRNA 서열에서 C를 치환하는 2개의 GEMS를 지칭한다.
2S/Chk1은 CHK1에 대한 siRNA의 센스 가닥에서 C를 치환하는 2개의 GEMS를 지칭한다.
2S/NS는 비침묵 (NS) siRNA의 센스 가닥에서 C를 치환하는 2개의 GEMS를 지칭한다.
CID4/Chk1은 두 SS 및 AS 가닥 모두 각각 2개의 Gems를 포함하여 4개의 GEM이 존재하는 단일 siRNA를 제조하는 CHK1 siRNA를 지칭한다.
CID4/NS는 두 SS 및 AS 가닥 모두 각각 2개의 Gems를 포함하여 어닐링시 4개의 GEM이 존재하는 단일 siRNA를 제조하는 비침묵 (NS) siRNA를 지칭한다.
상기 구축물들을 각각 웰당 1000개의 세포인 밀도로 384 웰 플레이트에서 BxPC3 세포로 형질감염시켰다. 이어서, 세포를 형질감염 후 120h 동안 5% CO2 및 95% 습도하에 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 이전에 기술된 바와 같이 셀 타이터 글로 (PE)를 사용하여 세포 생존능을 측정하였다.
본 실험에서는 CHK1을 표적화하는 siRNA의 SS 내로 2개의 GEM을 도입하는 것이 상기 유전자를 침묵시키는 조합된 효과, 및 세포 내에서 겜시타빈을 방출하는 효과를 제공하였고 - 그 결과로 전체 효능 또한 유지하면서, IC50 (0.35 nM)을 이동시킨 것으로 나타났다. 비침묵 (NS) siRNA의 SS 내로 2개의 GEM을 도입한 것과 비교하였으며, 여기서, CHK1을 침묵시키는 이점을 얻지 못하고, GEM의 방출과의 시너지를 볼 수 없었지만, 본 발명자들은 겉보기 IC50 (5.4nM)에 대한 GEM 방출 효과만을 관찰할 수 있었다. 따라서, Chk1 siRNA에 2개의 Gems을 부가하기만 하면, 본 발명자들은 NS siRNA SS에 2개의 GEM을 갖는 것보다 ~15배 정도 개선된 것을 볼 수 있다.
CHK1 및 NS siRNA의 AS 가닥에서 2개의 GEM을 부가하였을 때, 본 발명자들은 6.68 nM인 NS siRNA (2A/Ns)와 비교하여 CHK1-GEM IC50 (2A-Chk1)이 1.975 nM로 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 이는 CHK1의 AS 서열에 GEM을 갖는 것이 NS-GEM과 비교하여 여전히 일부 효능을 생성할 수 있지만, 효과의 차이는 단지 3배에 불과하고, CHK1의 AS 가닥에 GEM을 삽입하는 것은 SS에 2개의 GEM을 갖는 것과 비교하여 효력을 ~6배 감소시켰다는 것을 시사한다. 이는 AS 가닥 중의 GEM는 AS 가닥의 침묵 기능을 방해하고 있다는 것을 시사하며 - 따라서, 본 발명자들은 CHK1 유전자의 침묵에 의해 유도되는 증강 결과를 얻지 못한다. 두 CHK1 AS 및 SS 가닥 모두 각각 2개의 GEM이 도입된 것인 siRNA 가닥의 조합에 대한 IC50 (CID4/Chk1; 1.8 nM)은 오직 AS 가닥에만 2Gems을 도입한 siRNA에 대한 IC50과 매우 유사하다 (2A-Chk1; 1.98 nM). 이는 4개의 Gems을 부가한 것으로부터의 이익은 거의 없다는 것을 시사하며, 본 발명자들은 본 발명자들이 SS에 2개의 GEM을 가질 때와 동일한 효력을 볼 수 있다. 이는 AS 가닥은 유전자 침묵을 위해 RISC 복합체에서 무손상 상태로 유지되는 반면 (그러나, 상기 가닥 상의 Gems은 우수한 침묵을 방해한다), (세포질에서 RISC 내로 도입된 후, 이어서, 뉴클레아제에 의해 절단되었을 때, AS 가닥으로부터 언와인딩된) 센스 가닥 상의 2개의 GEM은 방출되고, 관찰되는 최대 활성에 기여한다는 기대와 일치한다. 이는 2S/NS IC50 (5.4 nM)이 CID4/NS IC50에 대한 것 (5.19 nM)과 매우 유사한 바, 심지어 NS siRNA인 경우에도 일치한다.
2S/NS, 2A/NS 및 CID4/NS에 대한 곡선은 모두 중첩되며, CHK1이 침묵되었을 때의 것보다 IC50은 훨씬 더 낮다. 전자의 siRNA는 유전자 침묵이 없는 바, 이에 그의 모든 효과는 오직 절단 동안 SS 상에 존재하는 2개의 GEM의 방출에 기인하며 - 유사한 IC50 값, 및 겜시타빈 단독에 대한 용량 반응과 유사한 효과를 제공한다 (도 13 및 도 14 참조). 도 16은 AS 가닥에서 C 대신 GEM을 포함하는 효과를 보여주는 것이다.
실시예 7:
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 서열을 사용하여 어닐링하여 이중체 25mer 평활 말단 siRNA를 생성하였다. 서열 1은 SS 서열에 어떤 GEM도 도입되지 않은 25mer 평활 말단 siRNA이다. 서열 2는 추후에 서열 #1에서의 것과 동일한 AS 가닥과 어닐링되는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된 2개의 GEM을 갖는다. 서열 5 및 6은 동일한 AS 가닥이되, SS의 처음 2개의 염기는 제거되어 서열을 단축시킨다 (이는 다른 가닥을 AS 가닥으로 사용하도록 하기 위한 것이다). 서열 5 및 6은 서열 6이 seq5의 위치 13(또는 원래의 SS 서열에서 위치 15)에 있는 시티딘 기 대신에 GEM을 포함하지 않는다는 점에서 다양하다. 이러한 제외의 근거는 상기 위치에 GEM을 삽입하는 것이 침묵 동안 AS 가닥을 RISC 복합체에 로딩하는 데 필요할 수 있는 SS의 절단을 차단하는지 여부를 결정하는 것이었다. 서열 7은 (siRNA당 더 많은 GEM을 부가하는 것이 최종 구축물의 효력 또는 효능을 개선시켰는지 여부를 확인하기 위해) 서열 6과 동일하되, 센스 가닥의 5' 말단에 존재하는 2개의 시티딘 대신 2개의 GEM을 포함하는 것이다. 서열 3은 RAD17에 대한 비표지된 25mer 평활 말단 siRNA인 반면, 서열 4는 동일한 siRNA이되, 단, SS의 3' 말단에 2개의 추가 GEM이 부착되어 있는 것이다.
표 2에 제시된 siRNA 서열은 120h 노출 후 BxPC3 췌장암 세포 생존능에 대한 효능 및 효력에 대해 시험하였다. 상기 도면은 120h 노출 후 측정된 BxPC3 세포의 생존능에 대한 겜시타빈 단독 (GEM) 적정의 효과를 보여주는 것이다. IC50은 ~5 nM이었지만, 최대 효능은 심지어 100 nM에서도 ~85%의 세포 생존능 억제에 불과하였다.
RAD17에 대한 비변형 siRNA (SL-P49-3)는 ~4 nM의 IC50 및 단지 60%에 불과한 세포 생존능 억제의 최대 효능으로 용량에 의존하는 방식의 세포 생존능 감소를 보였다. 상기 siRNA가 센스 가닥의 3' 말단에 부가된 2개의 겜시타빈 모이어티를 가질 때, 본 발명자들은 효력 (IC50 ~4 nM)은 변함없이 효능 (30 nM에서 100% 세포 사멸)이 현저히 개선된 것을 볼 수 있다.
25mer 평활 말단 siRNA 서열은 GEM 변형 없이 사용될 때 세포 사멸에 매우 강력한 영향을 미치는 것으로 입증되었다 (SL-P49-1; IC50 0.25 nM 및 100 nM에서 효능 90%).
RAD17과 같이, SS의 3' 말단에 2개의 Gem을 부가하였을 때, IC50 값은 유사하지만, 효능은 더 큰 (30 nM에서 ~100% 억제) 생성물 (SL-P49-2)을 얻었다.
도 17은 siRNA의 SS에서 GEM 위치 및 변형 개수가 siRNA/Gem 조합의 효능 및 효력에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
2 Gems (SL-P49-6) 또는 3Gems (SL-P49-5)을 함유하는 CHk1 siRNA의 SS의 5' 말단을 단축시켰을 때, 동일한 효과를 얻었다 (IC50 ~3 nM; 30 nM에서 83-97%의 최대 효능). 이는 일반 침묵이 siRNA로부터 단일 GEM의 방출에 의해 증강되었다는 것을 시사한다.
C 대신 4개의 GEM을 포함한 동일한 SS 서열 사용시 단 2개의 GEM을 함유한 서열 (SL-49P-2)과 유사한 IC50 및 효능 값을 얻었다. 상기 결과는 이러한 siRNA 안티센스 가닥 서열이 최대량의 유전자 침묵을 제공하지만, 2 또는 4개의 Gem을 함유하는 SS로부터 방출된 GEM이 효능을 동일하게 개선시킨다는 것을 시사하며 - 이는 4개의 Gem 방출이 2개인 것과 비교하였을 때, 효능을 개선시키지 못하며, 따라서, Gem에 의한 효과의 포화가 있을 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 분자당 1 개의 Gem을 초과하면, 상가 효과를 생성하는 GEM의 추가 절단은 없을 수 있다. 본 발명자들은 엑소뉴클레아제가 (예컨대, 표 2 및 상기 도면에서 SL-P49-2와 같이) 동일한 서열에서 또 다른 GEM에 직접 부착된 경우, 두 번째 GEM을 절단하고, 방출하지 못할 수 있다고 간주하였다. 그러나, 심지어 본 발명자들이 (예컨대, SL-49P-5 또는 SL-49P-7에서와 같이) 뉴클레아제 민감성 뉴클레오티드(예: SL-49P-5 또는 SL-49P-7)에 의해 GEM을 분리한 경우에도, 본 발명자들은 효력 또는 효능에 있어 어떤 추가 개선도 관찰하지 못했다. 본 결과는 오직 단일의 Gem만이 관찰된 효과를 제공할 수 있다는 것을 시사한다. 이는 siRNA RISC 로딩 동안 AS 가닥으로부터 SS를 방출하는 데 필요한 시간, 복제 DNA 분기 구조에 삽입하기 위해 인산화가 필요한 GEM 방출과 함께 세포질에서 SS가 분해되기 때문에 발생할 수 있는 결과일 수 있다. 대안적으로, 방출된 GEM의 양은 세포 복제 주기와 상관관계가 있을 수 있으며, 따라서, 상기 분기점으로의 Gem 도입 속도 측면에서 제한적일 수 있다.
실시예 8
겜시타빈 또는 BxPC3 세포에 사용된 것과 동일한 비변형 siRNA 및 노출 시간 (96h)을 사용하여 (도 1), 본 발명자들은 또 다른 췌장암 세포주인 MiaPaca-2에 대한 효과를 연구하였다. BxPC3 세포에서와 같이 겜시타빈 단독은 유사한 IC50 값 및 최대 효능으로 용량에 의존하는 방식의 세포 생존능을 감소시켰다. CHK1에 대해 디자인된 19mer siRNA (CHK-Az) 및 25mer 평활 말단 siRNA는 둘 모두 유사한 효능을 나타내었지만(최대 억제 ~80%), 이는 BxPC3 세포에서 19mer에 대해 관찰된 60% 억제보다 훨씬 컸지만, 상기 세포에서 25mer에 대해서는 유사하였다. 그러나, RAD17 siRNA는 BxPC3 세포(최대 억제율 ~60%)보다 MiaPaca 세포 (최대 억제율 단 ~30%)에 대해 단독으로 사용하였을 때 훨씬 감소된 효능을 보였다. 도 18은 또 다른 췌장 종양 세포인 MiaPaca에서 구축물의 효과를 보여주는 것이다.
실시예 9
MiaPaca 세포에서 2개의 비변형 siRNA인 Chk1_de (25mer 평활 말단 서열) 또는 Chk-Az (2개의 염기 dTdT 오버행을 포함하는 19mer)는 80% 억제의 유사한 최대 효능을 보였다. SS 의 3' 말단 상에서의 2개의 GEM의 CHK1-Az 서열에의 부가 (Chk-az-폴리2) 또는 SS 내의 C 치환에 의한 것 (Chk1-AZ-2S)은 MiaPaca 세포 사멸에 있어 siRNA의 효능을 유의적으로 개선시켰다 (10 nM에서 ~100% 최대 억제). 25-mer siRNA의 SS의 3' 말단에 2개의 GEM을 부가한 경우 (Chkde_2Gem)에도 마찬가지였으며, MiaPaca 세포에 비해 10 nM에서 ~100%의 최대 효능을 보였다. RAD17을 표적화하는 비변형된 25mer siRNA는 MiaPaca 세포 생존력에 대하여 효능을 거의 나타내지 않았지만 (최대 ~25%), 상기 siRNA의 SS의 3' 말단에 2Gems을 부가하는 것이 상기 구축물의 효능을 극적으로 개선시켰다 (30 nM에서 93% 억제). 모든 변형된 siRNA는 이제 겜시타빈을 단독 사용하여 달성할 수 있는 것 (100 nM에서 90%의 최대 억제) 이상의 최대 효능을 보여주었다. 도 19는 MiaPaca 세포에 대한 Gem 변형된 siRNA의 효과를 보여주는 것이다.
비록 본 발명이 그의 특정 실시양태와 관련하여 기술되고, 많은 세부사항이 예시의 목적으로 제시되었지만, 본 발명이 추가 실시양태에 영향을 받기 쉽고, 본원에서 설명된 특정 세부사항은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고 달라질 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.

Claims (87)

  1. 뉴클레오티드 및 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체(anticancer nucleoside analog)를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 분자의 말단에 부착되는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 분자 내에 있는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 루프(loop)로서, 또는 분자의 2개의 가닥 사이의 루프 내에 부착되는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 이 유사체의 대상이 되거나, 또는 이들 유사체들의 대상이 되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 1-10개의 항암 뉴클레오시드 유사체를 갖는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 miRNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 압타머(aptamer) 또는 RNA 압타머를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 암 세포 내의 특정 유전자의 발현을 표적화하고, 침묵(silencing)시키거나, 또는 감소시키는 올리고뉴클레오티드.
  15. 제10항에 있어서, siRNA가, 침묵되었을 때, 암 세포 내에서 항암 뉴클레오시드(들)의 작용을 증강시키는 표적을 침묵시키거나, 또는 침묵되었을 때, 세포를 사멸시키는 데 있어 항암 뉴클레오시드의 작용을 증강시키는 유전자를 침묵시키는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 쇄가 뉴클레아제에 대한 안정성을 개선시키도록 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 대한 변형이 2'-0-메틸 또는 2'-플루오로 또는 포스포로티오에이트 유사체인 올리고뉴클레오티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항암 뉴클레오시드 유사체가 겜시타빈, 시타라빈, 5-FU, 5-데옥시-5-플루오로우리딘, 플루다라빈, 카페시타빈, 클라드리빈, 트록사시타빈 또는 클로파라빈, 아자시티딘, 및 5-데옥시 아자시티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항암 뉴클레오시드 유사체가 겜시타빈을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 뉴클레오티드가 다중 겜시타빈 뉴클레오시드를 일렬로 포함하는 폴리GEM 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 암 세포 내의 특정 유전자의 발현을 표적화하고, 침묵시키거나, 또는 감소시키는 올리고뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 유전자가 ATR, ATM, WEE1, CHK1, CHK1A, CHK1B, CHK2, RAD17, BCL2, 시티딘 데아미나제, 및 BCLXL로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  23. 제21항에 있어서, 유전자가 CHK1 또는 CHK2인 올리고뉴클레오티드.
  24. 제21항에 있어서, 유전자가 CHK1 또는 RAD17인 올리고뉴클레오티드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드를 추가로 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  26. 제25항에 있어서, 리간드가 암 세포 상의 수용체 또는 단백질에 대해 특이적이고, 여기서 리간드는 세포에 결합하는 올리고뉴클레오티드.
  27. 제26항에 있어서, 수용체가 암이 아닌 세포 상에서보다 암 세포 상에서 더 높은 수준으로 발현되는 올리고뉴클레오티드.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 펩티드, 소분자, 단백질, 압타머, 항체, 나노바디(nanobody), ScFv 단편 및 탄수화물 모이어티(moiety)로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  29. 제28항에 있어서, 탄수화물 모이어티가 GalNac를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  30. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 리간드가 종양 세포 상에서 상향조절된 특이적 수용체를 표적화하는 펩티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 수용체가 인테그린 수용체를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  32. 제31항에 있어서, 인테그린 수용체가 알파5 베타 3 또는 알파 5 베타 6을 포함하고, 리간드가 상기 두 수용체 사이에 차등적인 친화성(differential affinity)을 나타내는 올리고뉴클레오티드.
  33. 제32항에 있어서, 표적화 리간드가 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Virus; FMV) 결합 펩티드로부터 유래된 올리고뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서, 표적화 리간드가 FMDV20 펩티드 서열 (NAVPNLRGDLQVLAQKVART)의 10-20개의 아미노산을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  35. 제34항에 있어서, 펩티드가 표준 L-아미노산 보다는 D-아미노산을 포함하도록 첫 번째 및 마지막 위치에서 변형된 것 ({D-ASN}AVPNLRGDLQVLAQKVAR{D-THR})인 올리고뉴클레오티드.
  36. 제35항에 있어서, 펩티드가 용해도(solubility) 및/또는 PK 특성을 개선시키기 위해 분자를 따라 일부 지점에서 페길화된 것 (예컨대, PEG-{D-ASN}AVPNLRGDLQVLAQKVAR{D-THR})인 올리고뉴클레오티드.
  37. 제36항에 있어서, 펩티드 서열이 올리고뉴클레오티드-폴리GEM 분자에 공유적으로 부착되는 올리고뉴클레오티드.
  38. 제37항에 있어서, 펩티드가 관련 수용체를 과발현(overexpressing)하는 포유동물 조직 또는 기관 중의 암 세포로 올리고뉴클레오티드-폴리GEM 분자를 전달하는 올리고뉴클레오티드.
  39. 제38항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-폴리Gem 분자가 세포내이입(endocytosis)에 의해 암 세포 내로 흡수되는 올리고뉴클레오티드.
  40. 제39항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 암 세포를 사멸시키는 올리고뉴클레오티드.
  41. 뉴클레오티드 및 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 여기서 올리고뉴클레오티드는 siRNA, miRNA, ASO, DNA 압타머, 또는 RNA 압타머를 포함하고, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체는 겜시타빈을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  42. 제41항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA 또는 miRNA를 포함하고, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 겜시타빈을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 겜시타빈 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드들이 siRNA 분자 또는 miRNA 분자의 서열 내의 시토신 분자를 치환하는 올리고뉴클레오티드.
  44. 제43항에 있어서, 겜시타빈 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드들이 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥 내로 도입되는 올리고뉴클레오티드.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서, 겜시타빈(들) 또는 다른 항암 뉴클레오시드 유사체(들)가 암 세포의 세포질 내에서 올리고뉴클레오티드의 분해시 방출되는 올리고뉴클레오티드.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA이고, 겜시타빈이 암 세포 내에서 RISC 복합체에 의한 안티센스 가닥 흡수시 세포질 내로 방출되는 siRNA의 센스 가닥 상에 존재하는 올리고뉴클레오티드.
  47. 제46항에 있어서, 안티센스 siRNA 가닥이 관심 유전자를 침묵시키는 올리고뉴클레오티드.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA 또는 miRNA이고, 세포질 내로 방출된 겜시타빈이 siRNA 또는 miRNA의 침묵 효과의 활성을 증강시켜 암 세포 내에서 치료 효과를 생성하는, 예컨대, 복제 또는 성장을 방해(preventing)하거나, 또는 활발하게 암 세포를 사멸시키는 올리고뉴클레오티드.
  49. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 또는 miRNA가, 침묵되었을 때, 암 세포를 사멸시키는 데 있어 겜시타빈의 작용을 증강시키는 표적 유전자를 침묵시키는 올리고뉴클레오티드.
  50. 제49항에 있어서, 표적 유전자가 ATR, ATM, WEE1, CHK1, CHK1A, CHK1B, CHK2, RAD17, BCL2, 시티딘 데아미나제, 및 BCLXL로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드.
  51. 제49항에 있어서, 표적 유전자가 CHK1 또는 RAD17인 올리고뉴클레오티드.
  52. 제49항에 있어서, 마우스 및 인간 세포에서 서열과 동일성을 갖는 CHK1을 침묵시키고, CHK1에 대한 CHK_Az siRNA 서열에 존재하는 2개의 시토신과 비교하여 GEM으로 치환될 수 있는 더 많은 수의 시토신 모이어티를 갖는 siRNA 서열 (서열: SS: 5'- AAGAAAGAGAU[GEM]UGUAU[GEM]AAU-dTdT-3' : 비-Gem 함유 AS 가닥 5'- AUUGAUACAGAUCUCUUUCUU-dTdT-3')을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 분자가 하기 서열:
    SS=5'-CCU GUG GAA UAG UAC UUA CUG CAA U-3' CHK1 siRNA 센스 가닥
    AS=5'-A UUG CAG UAA GUA CUA UUC CAC AGG-3' CHK1 siRNA 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  54. 제53항에 있어서, 겜시타빈이 하기 센스 가닥 내의 선택된 시토신 모이어티를 치환하는 올리고뉴클레오티드:
    SS=5'-CCU GUG GAA UAG UA[GEM] UUA [GEM]UG [GEM]AA U-3' ("C" 대신 [GEM])
    AS=5'-A UUG CAG UAA GUA CUA UUC CAC AGG-3' (AS 가닥 상에 GEMS 부재).
  55. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 및 인간의 RAD17 유전자에 대한 siRNA 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥 (SS)이 RAD17 _7(6): SS-5'CCAACAAUUAUGAUGAAAUUUCUUA-3'인 올리고뉴클레오티드.
  56. 제55항에 있어서, siRNA의 SS 상의 선택된 'C' 기가 하기 제시된 바와 같은 GEM 모이어티로 치환되는 올리고뉴클레오티드:
    SS-5'CCAA[GEM]AAUUAUGAUGAAAUUU[GEM]UUA-3'.
  57. 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 또는 miRNA가 화학적으로 변형되고, 올리고뉴클레오티드를 표적화하고, 이를 특이적 수용체로 전달한 후, 이어서, 세포 내로 흡수되는 리간드에 직접 부착되는 올리고뉴클레오티드.
  58. 제57항에 있어서, 표적화 리간드가 GalNac를 포함하고, 수용체가 간에서 간 세포 상의 ASGPR 수용체를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  59. 제57항에 있어서, 표적화 리간드가 치료제에 반응하는 종양 세포에 특이적이고, 예컨대, 췌장암 세포가 CHK1 침묵에 반응하고, 이의 성장이 억제되고, CHK1을 표적화하는 siRNA에 GEM를 부가하는 것이 췌장 및 다른 종양 세포에서의 효과를 추가로 증강시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 물, 및 하기 염 또는 완충제: 인산칼륨 일염기성 무수 NF, 염화나트륨 USP, 인산나트륨 이염기성 칠수화물 USP, 및 인산염 완충처리된 염수 (PBS) 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
  62. 제60항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 생분해성 히스티딘-리신 중합체, 생분해성 폴리에스테르, 예컨대, 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 및 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머(dendrimer), 양이온성 지질, 예컨대, DOTAP, DOPE, DC-Chol/DOPE, DOTMA, 및 DOTMA/DOPE, PEG화된(PEGylated) PEI, 및 지질, 예컨대, 리포펙타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물.
  63. 제60항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 히스티딘-리신 공-중합체(co-polymer) (HKP)를 포함하는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, HKP가 구조식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 포함하고, 여기서, R =KHHHKHHHKHHHKHHHK, K = 리신, 및 H = 히스티딘인 조성물.
  65. 제60항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 분지형 히스티딘-리신 공-중합체를 포함하는 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 분지형 히스티딘-리신 중합체가 화학식 (R)K(R)-K(R)-(R)K(X)를 갖고, 여기서, R=KHHHKHHHKHHHKHHHK, 또는 R=KHHHKHHHNHHHNHHHN, X=C(O)NH2, K=리신, H=히스티딘, 및 N=아스파라긴인 조성물.
  67. 제60항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 스페르민-지질 접합체 (SLiC) 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜을 포함하는 조성물.
  68. 제60항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 화학식 Kp{[(H)n(K)m]}y 또는 Kp{[(H)n(K)m]}y-C-x-Z 또는 화학식 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m (H)c(K)m(H)d(K)m]}y 또는 Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m (H)c(K)m(H)d(K)m]}y-C-x-Z를 갖는 펩티드를 포함하고, 여기서, K는 리신이고, H는 히스티딘이고, C는 시스테인이고, x는 링커(linker)이고, Z는 포유동물 세포-표적화 리간드이고, p는 0 또는 1이고, n은 1 내지 5의 정수이고, m은 0 내지 3의 정수이고, a, b, c, 및 d는 3 또는 4이고, y는 3 내지 10의 정수인 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 제약상 허용되는 담체가 절단가능한 결합을 통해 가교결합된, 제68항의 펩티드들 중 적어도 2개를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  70. 제60항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 나노입자를 포함하는 조성물.
  71. 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드 또는 두 올리고뉴클레오티드 모두 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA, miRNA, ASO, DNA 압타머, 및 RNA 압타머로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드가 제1 siRNA를 포함하고, 제2 올리고뉴클레오티드가 제1 siRNA와 상이한 제2 siRNA를 포함하는 조성물.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 표적 유전자가 ATR, ATM, WEE1, CHK1, CHK1A, CHK1B, CHK2, RAD17, BCL2, 시티딘 데아미나제, 및 BCLXL로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 제1 siRNA가 CHK1을 표적화하고, 제2 siRNA가 RAD17을 표적화하는 조성물.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 조성물로서, 여기서, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 본원에 기술된 바와 같은 조성물.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 항암 뉴클레오시드 유사체가 겜시타빈을 포함하는 조성물.
  78. 제71항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 본원에 기술된 바와 같은 표적화 리간드를 추가로 포함하는 조성물.
  79. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 본원에 기술된 바와 같은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  80. 포유동물에게 치료 유효량의, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 또는 제60항 내지 제79항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암 세포를 사멸시키는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 암이 췌장암, 간암, 결장암, 방광암, 비소세포 폐암, 유방암, 난소암, 또는 두경부암(head and neck cancer)을 포함하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 간암이 전이성 췌장암, 간세포 암종, 또는 전이성 결장암을 포함하는 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 실험실 동물인 방법.
  84. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 암 세포를 포함하는 종양 내로 직접 주사되는 방법.
  86. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 분자가 하기 서열:
    CHK1_AZ SS (내부 GEMS) 5'-AAGAAAGAGAU[GEM]UGUAU[GEM]AAU-dTdT-3';
    AS 가닥:
    CHK1_AZ AS (Gems 부재) 5'-AUUGAUACAGAUCUCUUUCUU-dTdT-3'을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  87. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA 분자가 하기 서열 쌍:
    (a) Chk1_AZ SS (말단 GEMS): 5'-AAGAAAGAGAUCUGUAUCAAU[GEM] [GEM]-dTdT-3'
    CHK1_AZ AS (Gems 부재) 5'-AUUGAUACAGAUCUCUUUCUU-dTdT-3';
    (b) . Chk1_AZ SS (GEMS 부재): 5'-AAGAAAGAGAUCUGUAUCAAU-dTdT-3'
    Chk1_AZ AS (말단 GEMS) 5'-AUUGAUACAGAUCUCUUUC-UU[GEM][GEM]dTdT-3' 또는
    (c) Chk1_AZ SS (말단 GEMS): 5'-AAGAAAGAGAUCUGUAUCAAU[GEM] [GEM]-dTdT-3'
    Chk1_AZ AS (말단 GEMS) 5'-AUUGAUACAGAUCUCUUUC-UU[GEM][GEM]dTdT-3' 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
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