JP2015522275A - 筋ジストロフィー患者の治療のためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、オリゴヌクレオチド及び前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。このオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域及び同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合でき、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、前記オリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソン、並びに好ましくは間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングに適している。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ヒト遺伝学の分野、より具体的にはｍＲＮＡ前駆体の２つ以上のエクソンのスキッピングを好ましくは誘導できる単一オリゴヌクレオチドを設計するための方法に関する。本発明は、前記オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、及び本明細書において特定されている前記オリゴヌクレオチドの使用をさらに提供する。
発明の背景
オリゴヌクレオチドは筋ジストロフィーのような遺伝性障害を治療するための医学において現れている。筋ジストロフィー（ＭＤ）とは、骨格筋の進行性衰弱及び変性によって特徴付けられる遺伝性疾患を指す。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が筋ジストロフィーの最も一般的な小児型であり、本発明を例示するために本明細書に使用される。ＤＭＤは１２歳の前に車椅子のサポートに依存することとなる重度の致死性の神経筋障害であり、ＤＭＤ患者は多くの場合、呼吸又は心不全に起因して３０歳の前に死ぬ。
ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子の変異、主にフレームシフト欠失又は１つ若しくは複数のエクソンの複製、小ヌクレオチド挿入若しくは欠失によって、又は典型的に機能的ジストロフィンの不在をもたらすナンセンス点突然変異によって引き起こされる。この１０年の間、ＤＭＤ転写物の破壊されたリーディングフレームを修復するためにスプライシングの特別に誘導された修飾がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のための有望な治療として現れている（ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ Ｇ．Ｊ．ら、Ｙｏｋｏｔａ Ｔ．ら、ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、Ｇｏｅｍａｎｓ Ｎ．Ｍ．ら）。変異に隣接するか又は変異を含有し、そのスプライシングシグナルを妨げる特異的エクソンを標的とする配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、そのエクソンのスキッピングがＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングの間に誘導され得る。得られる切断された転写物にもかかわらず、オープンリーディングフレームは修復され、典型的に軽度のベッカー型筋ジストロフィー患者において見出されるものと類似するタンパク質が導入される。ＡＯＮ誘導性エクソンスキッピングは変異特性を与えるので、ＤＭＤ患者及び特定の重度のＢＭＤ患者のための治療的アプローチを個人向けにする可能性がある。ほとんどの変異はＤＭＤ遺伝子におけるエクソン４５〜５５周辺に集まっているので、その領域における１つの特定のエクソンのスキッピングは様々な変異を有する患者の亜集団のための治療であり得る。エクソン５１のスキッピングは、エクソン４５〜５０、４８〜５０、５０又は５２の欠失を有する患者を含む、患者の最大の亜集団（約１３％）に影響を与える。いくつかの変異に関して、１つより多いエクソンのスキッピングは、オープンリーディングフレームを修復するのに必要とされる。例えば、ＤＭＤ遺伝子においてエクソン４６〜エクソン５０の欠失を有するＤＭＤ患者の場合、エクソン４５及び５１の両方のスキッピングのみが矯正手段となる。これらの患者を治療するために、２つのオリゴヌクレオチド（一方はエクソン４５を標的とし、他方はエクソン５１を標的とする）の投与が必要とされる。カクテル又はウイルスにより送達された遺伝子構築物のいずれかにおいて、ＡＯＮの組み合わせを使用することによって２つ又は複数の連続エクソンをスキッピングする実行可能性が広範囲に研究されている（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａ．ら，２００４；Ｂｅｒｏｕｄ Ｃ．ら；Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｌ．ら；Ｙｏｋｏｔａ Ｔ．ら；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ Ａ．ら）。マルチエクソンスキッピングが患者の混合した亜集団に適用可能であり、比較的軽度の表現型と関連していることが知られている欠失の模倣を可能にし、ＤＭＤ遺伝子におけるホットスポット欠失領域の外側で稀な変異を扱う手段を提供する。しかしながら、複数のオリゴヌクレオチドを含む薬物の開発についての欠点は、薬物規制機関が、異なる配列のオリゴヌクレオチドを異なる薬物と考える場合があり、各々が安全な製造、毒性試験及び臨床試験の証明を必要とすることである。したがって、ＤＭＤ患者の混合した亜集団の治療を促進するために少なくとも２つのエクソンのスキッピングを誘導できる単一分子化合物についての必要性が存在する。
発明の説明
本発明は単一オリゴヌクレオチドを設計するための方法であって、前記オリゴヌクレオチドは同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域に結合でき、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する、方法を提供する。前記方法によって得ることが可能なオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピングを好ましくは誘導できる。さらなるエクソンのスキッピングも好ましくは誘導され、前記さらなるエクソンは、好ましくは前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置する。前記エクソンがスキップされる、得られる前記ｍＲＮＡ前駆体の転写物は、インフレームである。
オリゴヌクレオチド：
第１の態様において、本発明は、同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソンの領域及び第２のエクソンに領域に結合できるオリゴヌクレオチドであって、前記第２のエクソンの前記領域が前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する、オリゴヌクレオチドに関する。
このオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソンのスキッピングを好ましくは誘導でき、より好ましくはさらなるエクソンのスキッピングが誘導され、前記さらなるエクソンは、好ましくは前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置し、得られる転写物はインフレームである。
エクソンスキッピングは真核細胞内で生じる天然のスプライシングプロセスを妨げる。高等真核生物において、細胞のＤＮＡにおけるタンパク質についての遺伝情報はイントロン配列によって互いから分離されるエクソンにおいてコードされる。これらのイントロンは、いくつかの場合、非常に長い。真核生物の転写機序はエクソン及びイントロンの両方を含有するｍＲＮＡ前駆体を生成するのに対して、スプライシング機序は、多くの場合、ｍＲＮＡ前駆体の進行中の産生の間既に、スプライシングと呼ばれるプロセスの間、ｍＲＮＡ前駆体に存在するイントロンを除去しエクソンを結合することによってタンパク質についての実際のコードｍＲＮＡを生成している。
ｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域及び同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合できる本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域への結合に適し、同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域への結合に適したオリゴヌクレオチドと解釈される。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、細胞内で、ｍＲＮＡ前駆体とともに使用される場合又はｍＲＮＡ前駆体と組み合わせて使用される場合、そのオリゴヌクレオチドの結合特性（すなわち結合できる）によって特徴付けられる。この文脈内で、「できる（ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ）」は「可能である（ａｂｌｅ ｔｏ）」に置き換えられてもよい。それ故、当業者は、第１のエクソンの領域に結合でき、同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合でき、ヌクレオチド配列によって定義されるオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドを構造的に定義すること、つまり前記オリゴヌクレオチドが、前記第１のエクソンの前記領域の配列と逆相補的であり、また、同じｍＲＮＡ前駆体の前記第２のエクソンの前記領域の配列と逆相補的であるような配列を有することを理解するであろう。本発明のオリゴヌクレオチドに必要とされる前記第１のエクソンの前記領域及び／又は前記第２のエクソンの前記領域との逆相補性の程度は１００％未満であってもよい。本明細書でさらに扱われる場合、ある程度の量のミスマッチ又は１つ若しくは２つのギャップが許容され得る。本発明のオリゴヌクレオチドが結合できる、前記第２のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する第１のエクソンの領域のヌクレオチド配列（又は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する第２のエクソンの領域のヌクレオチド配列）は、後述の本発明の方法を用いて設計され得る。好ましいｍＲＮＡ前駆体はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体である。
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の第１のエクソン及び第２のエクソンの好ましい組み合わせ並びに前記第１のジストロフィンエクソン及び第２のジストロフィンエクソンの好ましい領域は表２に定義されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソンのスキッピングを好ましくは誘導でき、さらなるエクソンのスキッピングがより好ましくは誘導され、前記さらなるエクソンは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に好ましくは位置し、得られるジストロフィン転写物はインフレームであり、好ましくは表１に記載のものである。
転写物が、タンパク質の産生を可能にするオープンリーディングフレームを有する場合、その転写物はインフレームである。ｍＲＮＡのインフレーム状態は、当業者に知られている配列及び／又はＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価され得る。インフレーム転写物の翻訳に由来する、得られるタンパク質は、当業者に知られている、前記タンパク質と交差反応する抗体を使用して、免疫蛍光及び／又はウェスタンブロット分析によって分析され得る。本発明全体にわたって、得られるインフレーム転写物がＲＴ−ＰＣＲ及び／又は配列分析によって同定される場合、又は前記インフレーム転写物から得られるタンパク質が、転写物の同一性に応じて、関連したインビトロ又はインビボ系において、免疫蛍光及び／又はウェスタンブロット分析によって同定される場合、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは機能的といわれ得る。転写物がジストロフィン転写物である場合、関連する系は、以下に説明されるように、健康なドナー又はＤＭＤ患者の筋細胞又は筋管又は筋線維又は筋原線維であり得る。
一実施形態において、第２のエクソンの領域（第１のエクソンの領域と同じｍＲＮＡ前駆体内に存在する）は、上記第１のエクソンの領域と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する（第１のジストロフィンエクソン及び第２のジストロフィンエクソンの好ましい領域は表２に記載されている）。同一性は、前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの全体の長さにわたって又は本明細書におけるジストロフィンエクソンについて例示されている１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００若しくはそれら以上のヌクレオチドの領域にわたって評価され得る。本明細書に記載の第１のエクソン及び第２のエクソンが１つの単一ｍＲＮＡ前駆体の２つの異なるエクソン又は同じｍＲＮＡ前駆体内の２つの異なるエクソンであることは当業者にとって自明である。本明細書に記載の第１のエクソンは本明細書に記載の同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの上流（すなわち５’）に位置してもよく、或いは前記第２のエクソンは前記第１のエクソンの上流であってもよい。
前記第１のエクソンは前記第２のエクソンから上流に位置することが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは第一次的に第１のエクソンの領域に結合できるように設計され得、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンの領域の同一性を考慮して、前記オリゴヌクレオチドは第二次的に前記第２のエクソンの前記領域にも結合できるように設計され得ることは当業者にとって自明である。逆の設計も可能である。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは第一次的に第２のエクソンの領域に結合できるように設計され得、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンの領域の同一性を考慮して、前記オリゴヌクレオチドは第二次的に前記第１のエクソンの前記領域にも結合できるように設計され得る。
前記第１のエクソンの領域と前記第２のエクソンの領域との間の同一性は前記第１のエクソンの領域全体にわたって評価され得、その領域は、本発明のオリゴヌクレオチドが結合できるその領域の部分より短くてもよく、長くてもよく、又は等しい長さであってもよい。本発明において、第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域は同一性領域（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ）としても特定され得る。第２のエクソンの領域との同一性を定義する第１のエクソンの領域は、本発明のオリゴヌクレオチドが結合できるその領域の部分と同じ長さであるか又はより長いことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの配列同一性を評価するために使用される前記領域のより小さな部分又は部分的に重複している部分に結合できることが理解されなければならない。したがって、第１のエクソン及び第２のエクソンの領域に結合できるオリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンの前記領域の一部に結合できることは理解される。前記部分は前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの前記領域と同じ長さであってもよい。前記部分は前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの前記領域より短くてもよいか又は長くてもよい。前記部分は前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの前記領域内に含まれてもよい。前記部分は前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの前記領域と重複してもよい。この重複は前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの領域の５’及び／又は３’側における１、２、３、４、５又はそれ以上のヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの領域より長いか又は短い少なくとも１、２、３、４、５又はそれ以上のヌクレオチドであってもよく、前記第１の領域及び／又は第２の領域の５’又は３’側であってもよい。
第１のエクソンと第２のエクソンとの間の同一性を計算するために使用される、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、又は最大で９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のヌクレオチドである領域は、領域全体にわたる同一性が少なくとも５０％である限り、連続したストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）であってもよく、１、２、３、４又はそれ以上のギャップで中断されてもよい。
第１のエクソンの領域と第２のエクソンの領域との間の同一性は当業者に公知の任意のプログラムを用いて評価され得る。前記同一性は以下のように評価されることが好ましい：デフォルト設定（マトリクス：ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ギャップ＿ペナルティ：１６；伸長＿ペナルティ：４）を使用したオンラインツールＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒを使用した第１のエクソンと第２のエクソンとの間の最適ペアワイズアラインメント。
本明細書において、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソン及び第２のエクソンの領域又は領域の一部に結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的であるオリゴマーを指す。
本明細書で同定されている（つまり、同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソンの領域及び別のエクソン（すなわち第２のエクソン）の領域に結合でき、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する）、オリゴヌクレオチドはまた、好ましくは、前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも８０％逆相補的であり、前記第２のエクソンの前記領域と少なくとも４５％逆相補的である。前記オリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％逆相補的であり、前記第２のエクソンの前記領域と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％逆相補的であることがより好ましい。逆相補性は、必ずではないが好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さ全体にわたって評価される。
本発明に包含されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチドを含んでもよい。本発明に包含されるオリゴヌクレオチドは、多くても４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０ヌクレオチドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、前記オリゴヌクレオチドに存在する任意の修飾に関係なく、前記オリゴヌクレオチドに包含されるヌクレオチドの総数によって規定される。以下にさらに説明されているように、ヌクレオチドは特定の化学修飾を含有してもよいが、そのような修飾されたヌクレオチドは依然として本発明の文脈におけるヌクレオチドと考えられる。オリゴヌクレオチドの化学的性質に依存して、オリゴヌクレオチドの最適な長さは異なってもよい。例えば、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの長さは１５〜３０までであってもよい。このオリゴヌクレオチドが本明細書に例示されているようにさらに修飾される場合、最適な長さは１４、１３又はさらに短く短縮されてもよい。
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、低下した合成効率、収率、純度又は拡張性、低下したバイオアベイラビリティ及び／又は細胞取り込み及び輸送、低下した安全性、の可能性を制限するために、並びに物品のコストを制限するために、３０ヌクレオチドより長くない。より好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは１５〜２５ヌクレオチドである。本発明に包含されるオリゴヌクレオチドは、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドからなることが最も好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１００ｎＭがインビトロで関連する細胞培養物をトランスフェクトするために使用される場合、オリゴヌクレオチドの機能性又は活性が、第１のエクソン及び第２のエクソン（及び間にある任意のエクソン）のスキッピングの少なくとも５％を誘導することによって、又はインフレーム転写物の少なくとも５％が形成されることを促進することによって定義されるようであることが好ましい。前記転写物の存在の評価は本明細書で既に説明されている。関連する細胞培養物は、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンを含むｍＲＮＡ前駆体がｍＲＮＡ転写物に転写され、スプライスされる、細胞培養物である。ｍＲＮＡ前駆体がジストロフィンｍＲＮＡ前駆体である場合、関連する細胞培養物は（分化した）筋細胞を含む。この場合、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも２５０ｎＭが使用される場合、インフレーム転写物の少なくとも２０％が形成される。
第１のエクソンの領域は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、又は最大で９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又はそれ以上のヌクレオチドであってもよい。第１のエクソンの領域はまた、前記エクソンの長さの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％であるように定義されてもよい。第１のエクソンの領域は同一性領域と呼ばれ得る。
第２のエクソンの領域は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０又は最大で９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００若しくはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。第２のエクソンの領域は、前記エクソンの長さの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％であるように定義されてもよい。第２のエクソンの領域は同一性領域と呼ばれ得る。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ前駆体由来のエクソンＵ＋１（第１のエクソン）の領域に結合でき、同じｍＲＮＡ前駆体内の別のエクソンＤ−１（第２のエクソン）の領域は前記（Ｕ＋１）エクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、前記オリゴヌクレオチドは、（例えば好ましくは表１に記載のＤＭＤのための）エクソンＵ及びＤが一緒にスプライスされるインフレーム転写物を得るための、前記ｍＲＮＡ前駆体の前記Ｕ＋１及び前記Ｄ−１エクソン（及び前記第１のエクソンと前記第２のエクソンの間に好ましくは位置するさらなるエクソン）のスキッピングのためである。また、本発明のオリゴヌクレオチドは化合物として本明細書に記載されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（すなわちＡＯＮ）である。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記ｍＲＮＡ前駆体の前記２つのエクソン（すなわち前記第１の（Ｕ＋１）エクソン及び前記第２の（Ｄ−１）エクソン）のスキッピングのためであり、得られる転写物（ＵがＤに直接スプライスされる）は、（例えば好ましくは表１に記載のＤＭＤのための）インフレームである。前記オリゴヌクレオチドは１つの単一ｍＲＮＡ前駆体において前記２つのエクソンのスキッピングを含むということができる。任意選択で、さらなるエクソンのスキッピングが誘導され、前記さらなるエクソンは、好ましくは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置し、得られる転写物はインフレームである。
オリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ前駆体内の、前記２つのエクソン（すなわち前記第１のエクソン及び前記第２のエクソン）及び前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングのためであることがより好ましく、それは前記ストレッチ内の任意の変異を除去するため、及びより短いがタンパク質産生を可能にする修復されたオープンリーディングフレームを有する転写物を得るためである。
いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、前記２つのエクソンの間の少なくとも５０％の配列同一性又は類似性に起因して、本発明の単一オリゴヌクレオチドは、両方のエクソン、及び好ましくは、インフレームであるより短い転写物を得るために間にあるエクソンのストレッチ全体に結合でき、それらのスキッピングを誘導できると考えられる。したがって、前記２つのエクソンはｍＲＮＡ前駆体に隣接してもよく、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のエクソンによって分離されてもよい。前記第１のエクソンと前記第２のエクソンの間に存在する１つ又は複数のエクソンを包含する領域はまた、（複数の）エクソンのストレッチ又はマルチエクソンストレッチと呼ばれてもよい。好ましくは、このマルチエクソンストレッチの第１のエクソンは本明細書で上記に同定されている第１のエクソンであり、このマルチエクソンストレッチの最後のエクソンは本明細書で上記に同定されている第２のエクソンである。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、前記２つのエクソンのスキッピング又は（複数の）エクソンのストレッチのスキッピング又は前記マルチエクソンストレッチのスキッピングを誘導できるオリゴヌクレオチドと同定されてもよい。好ましい実施形態において、第１のエクソン及び第２のエクソンの両方のスキッピングは本発明の１つの単一オリゴヌクレオチドを使用することによって誘導される。好ましい実施形態において、１つの単一オリゴヌクレオチドを使用した１超、２超、３超、４超、５超、６超、７超、８超、９超、１０超、１１超、１２超、１３超、１４超、１５超、１６超、１７超のエクソン、１８超、１９超、２０超、２１超、２２超、２３超、２４超、２５超、２６超、２７超、２８超、２９超、３０超、３１超、３２超、３３超、３４超、３５超、３６超、３７超、３８超、３９超、４０超、４１超、４２超、４３超、４４超、４５超、４６超、４７超、４８超、４９超、５０超のエクソンのスキッピングが実施され、したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０超のエクソンのこのスキッピングは、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドの混合物若しくはカクテルを使用せずに、又は１つ若しくは複数のリンカーで連結され得る２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用せずに、又は２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを転写する遺伝子構築物を使用せずに実施される。したがって、一実施形態において、本発明が１つの単一オリゴヌクレオチドを包含し、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを含まないという条件で、前記単一オリゴヌクレオチドは前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンに結合でき、本明細書に例示されている単一ｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピングを誘導できる。この文脈において、当業者は、「単一」という用語はエクソンスキッピングを誘導するために必要とされる分子の数を指していないことを理解する。単一とは、オリゴヌクレオチドの配列を指す：本発明は１つの単一オリゴヌクレオチド配列及びその使用を包含し、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチド配列を含まず、前記単一オリゴヌクレオチド配列は、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンに結合でき、本明細書に例示されている単一ｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピングを誘導できる。これは、遺伝子における異なるエクソンが少なくとも５０％の配列同一性を有する領域を含むという条件で、前記遺伝子における（稀な）変異によって引き起こされる疾患を治療するために１つの単一オリゴヌクレオチドのみを用いた１より多いエクソンのスキッピングを可能にする最初の発明である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書で下記に定義されているＲＮＡ調節活性に基づいた療法の一部として好ましくは使用される。第１のエクソン及び第２のエクソンが存在する転写物の同一性に依存して、所与の疾患を予防、治療又は遅延するためのオリゴヌクレオチドを設計できる。
両方のエクソンに結合できる単一オリゴヌクレオチドを用いた単一ｍＲＮＡ前駆体内の２つのエクソンの標的化により、標的化されたエクソンを欠くｍＲＮＡ、及びさらに、間にあるエクソンのストレッチ全体が得られることが示されている。本明細書に定義されているこのような単一オリゴヌクレオチドの利点は、このマルチエクソンストレッチ内の異なる変異によって引き起こされる欠陥が治療され得ることである。２つ以上のエクソンのスキッピングを誘導するために２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用することを選択する場合、例えば、各々のオリゴヌクレオチドがその独自のＰＫプロファイルを有し得ること及びそれにより、それらのオリゴヌクレオチドの各々が同じ細胞内に同様に存在する条件を見つけなければならないことを考慮するべきである。したがって、上記で同定されている２つの異なるエクソンに結合できるただ１つの単一オリゴヌクレオチドを使用する別の利点は、産生、毒性、用量の発見及び臨床試験を、１つの単一化合物の直接的な産生及び試験に低減させることができるので、それらが極めて容易になることである。
本発明のオリゴヌクレオチドの以下のさらなる特徴が定義される。
本発明の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンに結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、逆相補的であり、及び／又は少なくとも前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソン内の少なくとも１つのスプライシング制御配列の機能を阻害でき、及び／又は少なくとも前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの構造に影響を与え、
前記オリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンにおけるセリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質についての結合部位に対して、結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である配列を含み、及び／又は
前記オリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンにおけるエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エクソン認識配列（ＥＲＳ）、及び／又はエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に対して、結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である。
第１のｍＲＮＡ前駆体エクソンの領域及び／又は第２のｍＲＮＡ前駆体エクソンの領域に対して結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング制御配列を特異的に阻害でき、及び／又は前記ｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの構造に影響を与えることができることがより好ましい。このようなスプライシング制御配列及び／又は構造に干渉することは、このような要素がエクソン内に位置するという点で利点を有する。本明細書に定義されているこのようなオリゴヌクレオチドを用意することによって、スプライシング機構から、少なくとも前記第１のエクソン及び第２のエクソン、並びに好ましくは間にあるエクソンのストレッチ全体を効果的にマスクすることが可能となる。それ故、これらのエクソンを認識するスプライシング機構の機能停止は、最終的なｍＲＮＡからこれらのエクソンのスキッピング又は排除を導く。この実施形態はコード配列のみに焦点を当てている。これは、より特異的でありそれ故確実である方法を可能にすると考えられる。ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの前記領域に対する前記オリゴヌクレオチドの逆相補性は、好ましくは、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。
したがって、本発明は、
対象における疾患を予防、遅延、改善及び／又は治療するための医薬としての使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域に結合でき、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、
前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンは前記対象における同じｍＲＮＡ前駆体内にあり、
前記結合の結果、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピング、及び好ましくは、前記第１のエクソンで開始し、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に存在する１つ又は複数のエクソンを包含するマルチエクソンストレッチのスキッピング、及び多くても前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを生じ、
機能的又は半機能的タンパク質の産生を可能にするインフレーム転写物が得られる、
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本明細書で説明されているように、前記オリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを誘導できることが好ましい。
本明細書で説明されているように、前記オリゴヌクレオチドの前記結合は、前記ｍＲＮＡ前駆体内で、前記第１のエクソン及び第２のエクソンの前記領域における少なくとも１つのスプライシング制御配列、及び／又は前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンの二次構造、及び／又は少なくとも前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンを包含する二次構造に、干渉することができることがより好ましい。好ましいスプライシング制御配列は本明細書で下記に提示されている。
したがって、１つの好ましい実施形態は、ｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域及び／又は同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合できる本発明のオリゴヌクレオチドであって、同じｍＲＮＡ前駆体内の前記第２のエクソンの前記領域は、（例えば好ましくは表２のＤＭＤのための）前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、前記オリゴヌクレオチドは前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソンのスキッピングを誘導でき、その結果、（例えば好ましくは表１又は６のＤＭＤのための）インフレームである転写物を生じる、オリゴヌクレオチドに関する。前記オリゴヌクレオチドは機能的又は半機能的タンパク質を前記個体に提供し、前記オリゴヌクレオチドはさらに以下を含む：
第１のｍＲＮＡ前駆体エクソン及び／又は第２のｍＲＮＡ前駆体エクソンの領域に対して結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である配列であって、第１のｍＲＮＡ前駆体エクソン及び／又は第２のｍＲＮＡ前駆体エクソンの別の部分にハイブリダイズする配列（閉じた構造）、及び／又は
前記第１のｍＲＮＡ前駆体エクソン及び／又は第２のｍＲＮＡ前駆体エクソンの領域に対して結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的であり、前記ｍＲＮＡ前駆体においてハイブリダイズしない配列（開いた構造）。
この実施形態に関して、参照が国際公開第２００４／０８３４４６号の特許出願に対してなされる。ＲＮＡ分子は、同じＲＮＡ内の逆相補的又は部分的に逆相補的なストレッチの塩基対合に大部分起因して、強力な二次構造を示す。ＲＮＡにおける構造はＲＮＡの機能においてある役割を果たすと長い間考えられていた。理論によって束縛されないが、エクソンのＲＮＡの二次構造はスプライシングプロセスを構造化する際にある役割を果たすと考えられる。その構造により、エクソンはｍＲＮＡに含まれることを必要とする一部として認識される。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも前記第１のエクソン及び恐らくまた前記第２のエクソン並びに場合によりまた間のエクソンのストレッチの構造に干渉することができ、したがって、スプライシング機構から前記エクソンをマスクすることによって、前記第１のエクソン及び恐らくまた前記第２のエクソン並びに場合によりまた間のエクソンのストレッチのスプライシングを妨げることができ、それにより、前記エクソンのスキッピングを生じる。理論によって束縛されないが、開いた構造との重複はオリゴヌクレオチドの侵入効率を改善する（つまり、オリゴヌクレオチドが構造に入ることができる効率を増加させる）が、閉じた構造との重複は、エクソンのＲＮＡの二次構造に干渉する効率を後で増加させると考えられる。閉じた構造及び開いた構造の両方に対する部分的な逆相補性の長さは極度に制限されないことが見出される。本発明者らはいずれの構造においても可変長の逆相補性を有するオリゴヌクレオチドで高い効率を観察した。逆相補性という用語は、生理的条件下で核酸の別のストレッチにハイブリダイズできる核酸のストレッチを指すために本明細書で使用される。ハイブリダイゼーション条件は本明細書で下記に定義されている。それ故、逆相補性の領域における塩基のすべてが反対鎖における塩基と対合できることを必ずしも必要とするとは限らない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計する場合、例えば、逆相補鎖における塩基と塩基対合しない１つ又は複数の残基を組み込んでもよい。細胞内の環境下で、ヌクレオチドのストレッチが依然として逆相補的部分にハイブリダイズできる場合、ミスマッチがある程度許容されてもよい。本発明の文脈において、一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、第１のエクソンの領域及び／又は前記第２のエクソンの領域と少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％逆相補的であるため、前記オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチの存在は好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、本明細書で上記に同定されている前記第１のエクソンの領域及び前記第２のエクソンの領域に結合できるため、前記オリゴヌクレオチドにおけるミスマッチの存在は本発明の好ましい特性である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるミスマッチの存在を許容する他の利点は本明細書に定義されており、イノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はヌクレオチドであってゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチド、の存在によって提供されているものと同様であり、ＣｐＧの存在を回避し、潜在的な多量体化又は凝集を回避するか又は減少させ、四重構造を回避し、改善されたＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学特性を有するオリゴヌクレオチドを設計することを可能にする。
前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの間の同一性の領域に対するオリゴヌクレオチドの逆相補性は４５％〜６５％、５０％〜７５％であることが好ましいが、６５％〜１００％又は７０％〜９０％又は７５％〜８５％又は８０％〜９５％であることがより好ましい。一般に、このことは、２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個のミスマッチを許容する。したがって、４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１又は２２個のミスマッチを有してもよい。１４個未満のミスマッチが４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに存在することが好ましい。ミスマッチの数は、本発明のオリゴヌクレオチドが依然として前記第１のエクソンの領域及び前記第２のエクソンの領域に結合でき、ハイブリダイズでき、標的化でき、それにより少なくとも前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピングを誘導でき、本明細書に例示されているインフレーム転写物の産生を誘導できるような数である。インフレーム転写物の産生は、本明細書の上記で説明されている関連する細胞培養物をインビトロでトランスフェクトするために少なくとも１００ｎＭの前記オリゴヌクレオチドを使用して少なくとも５％の効率で得られることが好ましい。
本発明は、第１のエクソンの領域とのミスマッチを１つも有さず、本明細書に定義されている第２のエクソンの対応する領域との１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１又は２２個のミスマッチを有することができるオリゴヌクレオチドを包含することに注目されなければならない。しかしながら、本発明はまた、第２のエクソンの領域とのミスマッチを１つも有さず、本明細書に定義されている第１のエクソンの対応する領域との１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１又は２２個のミスマッチを有することができるオリゴヌクレオチドも包含する。最後に、本発明は、第１のエクソンの領域との１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１又は２２個のミスマッチを有することができ、本明細書に定義されている第２のエクソンの対応する領域との２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のミスマッチを有することができるオリゴヌクレオチドを包含する。ここで再び、本発明のオリゴヌクレオチドにおけるミスマッチの数は、前記オリゴヌクレオチドが依然として、本明細書に説明されている前記第１のエクソンの領域及び前記第２のエクソンの領域に結合でき、ハイブリダイズでき、標的化できるような数であると理解される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書に同定されている第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域のアラインメントにおけるギャップを好ましくは交差しない。アラインメントは、本明細書で上記に説明されているオンラインツールＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒを用いて好ましくは実施される。しかしながら、特定の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは本明細書で上述のように、ギャップを交差することを必要としてもよい。前記ギャップは、好ましくは、ただ１つのギャップである。前記ギャップは、好ましくは、３未満のヌクレオチド、最も好ましくは、１ヌクレオチドのみにわたる。ギャップの数及び長さは、本発明のオリゴヌクレオチドが依然として、前記第１のエクソンの領域及び前記第２のエクソンの領域に結合でき、ハイブリダイズでき、標的化でき、それにより少なくとも前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピングを誘導でき、本明細書に説明されているインフレーム転写物の産生を誘導できるような数及び長さである。
構造（すなわち開いた構造及び閉じた構造）が、エクソンが存在するｍＲＮＡ前駆体の文脈において最適に分析される。このような構造は実際のＲＮＡにおいて分析され得る。しかしながら、現在、構造モデリングプログラムを使用してかなり十分にＲＮＡ分子の二次構造を（最低のエネルギーコストで）予測することが可能である。好適なプログラムの非限定的な例はＭｆｏｌｄウェブサーバである（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ）。
当業者は、好適な再現性で、有力なエクソンの構造、所与のヌクレオチド配列を予測できる。前記エクソン及び隣接するイントロン配列の両方を用いてこのようなモデリングプログラムを実現する場合、最適な予測が得られる。典型的に、ｍＲＮＡ前駆体全体の構造をモデル化することは必ずしも必要ではない。
本発明のオリゴヌクレオチドのアニーリングは、標的ＲＮＡ（すなわち少なくとも第１のエクソン及び／又は第２のエクソンを包含する領域）の局所フォールディング又は３Ｄ構造若しくは配座に影響を与え得る。異なる配座の結果、スプライシング機序によって認識される構造の破壊を生じる場合がある。しかしながら、潜在的（隠蔽）スプライスアクセプター及び／又はドナー配列が第１の標的エクソン及び／又は第２の標的エクソン内に存在する場合、時折、異なる（ネオ）エクソンを定義する、つまり異なる５’末端、異なる３’末端又は両方を有する新たな構造が生成される。この種類の活性は、標的エクソンがｍＲＮＡから排除される場合、本発明の範囲内である。ｍＲＮＡにおいて前記第１の標的エクソン及び／又は第２の標的エクソンの部分を含有する新たなエクソンの存在は、標的エクソン自体が排除されるという事実を変えない。ネオエクソンの包含はごくまれに発生する副作用と見られ得る。エクソンスキッピングが、変異の結果として破壊される転写物のオープンリーディングフレーム（の部分）を修復するために使用される場合、２つの可能性が存在する。一方は、ネオエクソンがリーディングフレームの修復において機能するが、他方の場合、リーディングフレームは修復されない。複数のエクソンスキッピングによってオープンリーディングフレームを修復するためにオリゴヌクレオチドを選択する場合、これらの条件下で、ネオエクソンがあるかどうかにかかわらず、所与の転写物のオープンリーディングフレームを修復するエクソンスキッピングを実際にもたらすオリゴヌクレオチドのみが選択されることは明らかである。
さらに別の好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域及び同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合できる本発明のオリゴヌクレオチドが提供され、前記第２のエクソンの前記領域は、前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し（ジストロフィンエクソンのための好ましい領域は表２又は表６に記載されている）、前記オリゴヌクレオチドは前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソンのスキッピングを誘導でき、その結果、（好ましくは表１又は表６のＤＭＤのための）インフレームである転写物を生じる。前記オリゴヌクレオチドは前記個体に機能的又は半機能的タンパク質を提供し、前記オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンのＲＮＡにおけるセリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質についての１つ若しくは複数の結合部位に対して結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、逆相補的であり、及び／又はそれらの機能を阻害できる配列をさらに含む。
国際公開第２００６／１１２７０５号の特許出願において、本発明者らは、エクソンスキッピングを誘導する際のエクソン内部のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の有効性と、前記ＡＯＮの標的ｍＲＮＡ前駆体部位における推定ＳＲ結合部位の存在との間の相関関係の存在を開示した。したがって、一実施形態において、本明細書に定義されている前記オリゴヌクレオチドを生成することは、前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンのＲＮＡにおけるＳＲタンパク質についての１つ又は複数の（推定）結合部位を決定すること、並びに前記ＲＮＡに対して結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的であり、前記（推定）結合部位と少なくとも部分的に重複する対応するオリゴヌクレオチドを産生することを含む。「少なくとも部分的に重複する」という用語は、ＳＲ結合部位の単一ヌクレオチド及び１つ若しくは複数の前記結合部位の複数のヌクレオチドのみの重複並びに１つ若しくは複数の前記結合部位の完全な重複を含むこととして本明細書で定義されている。この実施形態は、第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの二次構造から、前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの別の部分にハイブリダイズする領域（閉じた構造）並びに前記構造においてハイブリダイズしない領域（開いた構造）を決定するステップ、並びに続いて、１つ又は複数の前記（推定）結合部位と少なくとも部分的に重複し、前記閉じた構造の少なくとも一部と重複し、前記開いた構造の少なくとも一部と重複し、第１のエクソン及び第２のエクソンの両方に対して結合し、標的化し、ハイブリダイズし、及び／又は逆相補的であるオリゴヌクレオチドを生成するステップを好ましくはさらに含む。このように、本発明者らは、ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡにおける、前記第１のエクソン及び第２のエクソン、並びに該当する場合、間にあるエクソンのストレッチ全体の包含を妨げることができるオリゴヌクレオチドを得る機会を増加させる。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、現在、ＳＲタンパク質結合部位を対象とするオリゴヌクレオチドの使用により、前記結合部位に対するＳＲタンパク質の結合の（少なくとも部分的な）損傷が生じ、破壊又は損傷したスプライシングが生じると考えられている。
本発明のオリゴヌクレオチドが結合できる、同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソンの領域及び／又は第２のエクソンの領域は、開いた構造／閉じた構造及び／又はＳＲタンパク質結合部位を含むことが好ましく、前記開いた構造／閉じた構造並びに前記ＳＲタンパク質結合部位は部分的に重複することがより好ましく、前記開いた構造／閉じた構造はＳＲタンパク質結合部位と完全に重複するか、又はＳＲタンパク質結合部位は開いた構造／閉じた構造と完全に重複することがさらに好ましい。これにより、エクソン包含のさらに改良された破壊を可能にする。
コンセンサススプライス部位配列以外に、多くの（すべてではないが）エクソンは、スプライセオソームによって真のスプライス部位の認識を容易にするためにエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列などのスプライシング制御配列を含有する（Ｃａｒｔｅｇｎｉ Ｌら，２００２及びＣａｒｔｅｇｎｉ Ｌら，２００３）。ＳＲタンパク質と呼ばれるスプライシング因子のサブグループはこれらのＥＳＥに結合でき、（弱く定義された）スプライス部位に対してＵ１及びＵ２ＡＦなどの他のスプライシング因子を動員できる。４つの最も豊富なＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５）の結合部位は詳細に分析されている（Ｃａｒｔｅｇｎｉ Ｌら，２００２及びＣａｒｔｅｇｎｉ Ｌら，２００３）。オリゴヌクレオチドの有効性と、前記オリゴヌクレオチドによって結合され、ハイブリダイズされ、及び／又は標的化される第１のエクソンの一部におけるＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５結合部位の存在／不在との間に相関関係が存在する。好ましい実施形態において、本発明は、それ故、ＳＲタンパク質についての結合部位に対して結合し、ハイブリダイズし、標的化し、及び／又は逆相補的であるオリゴヌクレオチドを提供する。前記ＳＲタンパク質はＳＦ２／ＡＳＦ又はＳＣ３５、ＳＲｐ４０又はＳＲｐ５５であることが好ましい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第１のエクソンにおけるＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０又はＳＲｐ５５タンパク質についての結合部位及び第２のエクソンにおける異なるＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０又はＳＲｐ５５タンパク質についての結合部位に対して結合し、ハイブリダイズし、標的化し、及び／又は逆相補的である。より好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第１のエクソンにおけるＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０又はＳＲｐ５５タンパク質についての結合部位並びに第２のエクソンにおける同様のＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０又はＳＲｐ５５タンパク質についての対応する結合部位に対して結合し、ハイブリダイズし、標的化し、及び／又は逆相補的である。
一実施形態において、患者は、転写物における前記エクソンの正確なスプライシングに必要とされる第１のエクソン及び／又は第２のエクソンに存在する制御ＲＮＡ配列に結合でき、標的化できるオリゴヌクレオチドを使用することによって、機能的又は半機能的タンパク質を提供される。いくつかのｃｉｓ−作用ＲＮＡ配列は転写物におけるエクソンの正確なスプライシングを必要とする。特に、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）などの補足要素は、構成的及び代替的エクソンの特異的及び効果的なスプライシングを制御することが確認されている。前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンにおける補足要素の１つに結合する又は結合できるオリゴヌクレオチドを含む化合物を使用することにより、エクソンがスキップされるようにそれらの制御機能は壊される。それ故、１つの好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域及び同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合でき、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、前記オリゴヌクレオチドは前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソンのスキッピングを誘導でき、前記第１のエクソンの前記領域及び／又は前記第２のエクソンの前記領域はエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エクソン認識配列（ＥＲＳ）及び／又はスプライシングエンハンサー配列（ＳＥＳ）を含み、及び／又は前記オリゴヌクレオチドは、前記エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エクソン認識配列（ＥＲＳ）及び／又はスプライシングエンハンサー配列（ＳＥＳ）に結合でき、標的化でき、阻害でき、及び／又は逆相補的である。
本発明のオリゴヌクレオチドの以下の好ましい化学的性質が開示される。
オリゴヌクレオチドは天然核酸と同様の基本的なハイブリダイゼーション特性を有するオリゴマーとして一般に知られている。ハイブリダイゼーションは本発明の説明の終わりの定義に割り当てられた部分において定義されている。本明細書において、オリゴヌクレオチド及びオリゴマーという用語は交換可能に使用される。異なる種類のヌクレオチドが本発明の前記オリゴヌクレオチドを生成するために使用されてもよい。オリゴヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチド系又はデオキシリボヌクレオチド系オリゴヌクレオチドと比較して、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合及び／又は少なくとも１つの糖修飾及び／又は少なくとも１つの塩基修飾を含んでもよい。
「修飾されたヌクレオシド間結合」は、ＲＮＡ及びＤＮＡにおいて天然に存在するようなホスホジエステルの修飾された型の存在を示す。本発明と適合するヌクレオシド間結合修飾の例は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、キラルに純粋なホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）、ホスホノアセトアミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホノ酢酸、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、リン酸メチル、メチルホスホロチオエート、リン酸エチル、エチルホスホロチオエート、ボラノリン酸、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート及びそれらの誘導体である。別の修飾には、ホスホラミダイト、ホスホロアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオアミデート、ホスホロチオジアミデート、スルファミン酸、ジメチレンスルホキシド、スルホン酸、メチレンイミノ（ＭＭＩ）、オキサリル及びチオアセトアミド核酸（ＴＡＮＡ）及びそれらの誘導体が含まれる。その長さに応じて、本発明のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８又は３９個の骨格修飾を含んでもよい。また、前記オリゴヌクレオチドに１つより多い異なる骨格修飾を導入することも本発明に包含される。
また、天然に存在するヌクレオシド間結合と比較して、互いに結合するヌクレオシドの原子に関して異なり得るヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドも本発明に包含される。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’−３’、５’−５’、２’−３’、２’−５’、２’−２’結合モノマーと解釈される少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含んでもよい。位置番号付けは他の化学的性質と異なってもよいが、その考えは本発明の範囲内にある。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含む。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは完全に修飾されたホスホロチオエートである。
「糖修飾」は、二環式糖、テトラヒドロピラン、モルホリン、２’−修飾糖、３’−修飾糖、４’−修飾糖、５’−修飾糖及び４’−置換糖などのＲＮＡ及びＤＮＡにおいて天然に存在するようなリボシル部分（すなわちフラノシル部分）の修飾型の存在を示す。好適な糖修飾の例には、限定されないが、２’−Ｏ−アルキル又は２’−Ｏ−（置換）アルキルなどの２’−Ｏ−修飾ＲＮＡヌクレオチド残基、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−シアノエチル）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（２−チオメチル）エチル、２’−Ｏ−ブチリル、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−（２−アミノ）プロピル、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）プロピル）、２’−Ｏ−（３−アミノ）プロピル、２’−Ｏ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）、２’−Ｏ−（２−アミノ）エチル、２’−Ｏ−（３−グアニジノ）プロピル（その全体が本明細書に参照により組み込まれている、特許出願の国際公開第２０１３／０６１２９５号，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｉｔｗａｔｅｒｓｒａｎｄに記載されている）、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）、２’−Ｏ−（ハロアルキル）メチル（Ａｒａｉ Ｋ．ら）、例えば２’−Ｏ−（２−クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、２’−Ｏ−（２，２−ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）、２’−Ｏ−アルコキシカルボニル、例えば２’−Ｏ−［２−（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＭＣＥ）、２’−Ｏ−［メチルアミノカルボニル］メチル、２’−アジド、２’−アミノ及び２’−置換アミノ、２’−ハロ、例えば２’−Ｆ、ＦＡＮＡ（２’−Ｆアラビノシル核酸）、カルバ糖及びアザ糖修飾、３’−Ｏ−アルキル、例えば３’−Ｏ−メチル、３’−Ｏ−ブチリル、３’−Ｏ−プロパルギル、２’，３’−ジデオキシ及びそれらの誘導体が含まれる。
別の糖修飾には、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ｘｙｌｏ−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、ｃＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル）ＬＮＡ、ｃＭＯＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ拘束メトキシエチル）ＬＮＡ、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ＢＮＡＮＣ［Ｎ−Ｍｅ］（その全体が参照として本明細書に組み込まれているＣｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００７，３７６５−３７６７ Ｋａｚｕｙｕｋｉ Ｍｉｙａｓｈｉｔａらに記載されている）、特許出願の国際公開第２０１３／０３６８６８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれている；Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に記載されているＣＲＮに見出されるものなどの「架橋された」又は「二環式」核酸（ＢＮＡ）修飾糖部分；その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１３／０１３０３７８（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に記載されているものなどのアンロックド核酸（ＵＮＡ）又は他の非環式ヌクレオチド；５’−メチル置換ＢＮＡ（その全体が参照により組み込まれている米国特許出願１３／５３０，２１８に記載されている）；シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アルトリオール（ａｌｔｒｉｏｌ）核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、フッ素化ＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、ピラノシル−ＲＮＡ（ｐ−ＲＮＡ）、３’−デオキシピラノシル−ＤＮＡ（ｐ−ＤＮＡ）；モルホリノ（ＰＭＯ）、カチオンモルホリノ（ＰＭＯＰｌｕｓ）、ＰＭＯ−Ｘなどの他の修飾糖部分；トリシクロＤＮＡ；トリシクロ−ＰＳ−ＤＮＡ；及びそれらの誘導体が含まれる。ＢＮＡ誘導体は、例えば、その全体が参照により組み込まれている国際公開第２０１１／０９７６４１号に記載されている。ＰＭＯ−Ｘの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１１１５０４０８号に記載されている。その長さに応じて、本発明のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の糖修飾を含んでもよい。また、１つより多い異なる糖修飾を前記オリゴヌクレオチドに組み込むことも本発明に包含される。
一実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、２’−Ｆ、モルホリノ、架橋ヌクレオチド又はＢＮＡから選択される少なくとも１つの糖修飾を含むか、又はオリゴヌクレオチドは、架橋ヌクレオチド及び２’−デオキシヌクレオチド（ＢＮＡ／ＤＮＡミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ））の両方を含む。２’−フルオロ（２−‘Ｆ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、インターロイキンエンハンサー−結合因子２及び３（ＩＬＦ２／３）を動員でき、それにより標的化ｍＲＮＡ前駆体内のエクソンスキッピングを誘導できることが示されている（Ｒｉｇｏ Ｆら，国際公開第２０１１／０９７６１４号）。
別の実施形態において、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドはＬＮＡ又はその誘導体を含むか又はからなる。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、モルホリノ、架橋核酸（ＢＮＡ）、又はＢＮＡ／ＤＮＡミックスマーから選択される糖修飾によりその全長にわたって修飾されることがより好ましい。より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは完全に２’−Ｏ−メチル修飾されている。
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの糖修飾及び少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。このような修飾には、ペプチド−塩基核酸（ＰＮＡ）、ボロン−クラスター修飾ＰＮＡ、ピロリジン系オキシ−ペプチド核酸（ＰＯＰＮＡ）、グリコール系又はグリセロール系核酸（ＧＮＡ）、トレオース系核酸（ＴＮＡ）、非環式トレオニノール系核酸（ａＴＮＡ）、モルホリノ系オリゴヌクレオチド（ＰＭＯ、ＰＰＭＯ、ＰＭＯ−Ｘ）、カチオンモルホリノ系オリゴマー（ＰＭＯＰｌｕｓ、ＰＭＯ−Ｘ）、組み込まれた塩基及び骨格を有するオリゴヌクレオチド（ＯＮＩＢ）、ピロリジン−アミドオリゴヌクレオチド（ＰＯＭ）並びにそれらの誘導体が含まれる。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸骨格及び／又はモルホリノホスホロジアミデート骨格又はそれらの誘導体を含む。より好ましい実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは修飾された２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートであり、すなわち少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾を含み、本発明に係るオリゴヌクレオチドは完全に修飾された２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートであることが好ましい。２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチド又は完全に２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート修飾されたオリゴヌクレオチドはＲＮＡオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
本明細書において、「塩基修飾」又は「修飾塩基」という用語は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中に天然に存在する塩基（すなわちピリミジン又はプリン塩基）の修飾又はデノボ合成塩基を指す。このようなデノボ合成塩基は既存の塩基との比較によって「修飾された」と特定され得る。
上記の修飾に加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下に記載される異なる種類の核酸ヌクレオチド残基又はヌクレオチドなどのさらなる修飾を含んでもよい。異なる種類の核酸ヌクレオチド残基は本発明のオリゴヌクレオチドを生成するために使用されてもよい。前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ系オリゴヌクレオチドと比較して少なくとも１つの骨格及び／又は糖修飾及び／又は少なくとも１つの塩基修飾を有してもよい。
オリゴヌクレオチドは、天然塩基のプリン（アデニン、グアニン）又はピリミジン（シトシン、チミン、ウラシル）及び／又は以下に定義されている修飾塩基を含んでもよい。本発明において、ウラシルはチミンに置き換えられてもよい。
塩基修飾には、天然のプリン及びピリミジン塩基（例えばアデニン、ウラシル、グアニン、シトシン及びチミン）の修飾型、例えばヒポキサンチン、オロチン酸、アグマチジン、リシジン、疑似ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、疑似チミン（ｐｓｅｕｄｏｔｈｙｍｉｎｅ）、Ｎ１−メチル疑似ウラシル、２−チオピリミジン（例えば２−チオウラシル、２−チオチミン）、２，６−ジアミノプリン、Ｇ−クランプ（ｃｌａｍｐ）及びその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば５−ハロウラシル、５−メチルウラシル、５−メチルシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ（Ｓｕｐｅｒ Ｔ）、５−オクチルピリミジン、５−チオフェンピリミジン、５−オクチン−１−イルピリミジン、５−エチニルピリミジン、５−（ピリジルアミド）、５−イソブチル、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１３／０１３１１４１号（ＲＸｉ）に記載されている５−フェニル；７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ（Ｓｕｐｅｒ Ｇ）、スーパーＡ（Ｓｕｐｅｒ Ａ）及びＮ４−エチルシトシン又はそれらの誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）及びＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）又はそれらの誘導体；並びに２，６−ジフルオロトルエンのような変性若しくはユニバーサル塩基又は脱塩基部位のような不在塩基（例えば１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；又は環酸素が窒素で置き換えられているピロリジン誘導体（アザリボース（ａｚａｒｉｂｏｓｅ）））が含まれる。スーパーＡ、スーパーＧ及びスーパーＴの誘導体の例は、全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見出され得る。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰ及びＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込まれる場合、免疫活性化作用を減少させることが示されており（Ｐｅａｃｏｃｋ Ｈら）、類似の特徴が疑似ウラシル及びＮ１−メチル疑似ウラシルについて示された（全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１３／０１２３４８１号，ｍｏｄｅＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。「チミン」及び「５−メチルウラシル」は本明細書全体を通じて交換され得る。同様に、「２，６−ジアミノプリン」は「２−アミノアデニン」と同一であり、これらの用語は本明細書全体を通じて交換され得る。
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの５−メチルシトシン及び／又は少なくとも１つの５−メチルウラシル及び／又は少なくとも１つの２，６−ジアミノプリン塩基を含み、これにより、前記オリゴヌクレオチドのシトシン核酸塩基の少なくとも１つが、メチル基（すなわち５−メチルシトシン）、でのピリミジン環の５位におけるプロトンの置換によって修飾されていること及び／又は前記オリゴヌクレオチドのウラシル核酸塩基の少なくとも１つが、メチル基（すなわち５−メチルウラシル）でのピリミジン環の５位におけるプロトンの置換によって修飾されていること、及び／又は前記オリゴヌクレオチドのアデニン核酸塩基の少なくとも１つが、アミノ基（すなわち２，６−ジアミノプリン）での２位におけるプロトンの置換によって修飾されていることがそれぞれ理解される。本明細書において、「ピリミジン環の５位におけるメチル基でのプロトンの置換」という表現は、「５−メチルピリミジンでのピリミジンの置換」という表現に置き換えられてもよく、ピリミジンはウラシルのみ、シトシンのみ又はその両方を指している。同様に、本明細書において、「アデニンの２位におけるアミノ基でのプロトンの置換」という表現は、「２，６−ジアミノプリンでのアデニンの置換」という表現に置き換えられてもよい。前記オリゴヌクレオチドが１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はそれ以上のシトシン、ウラシル及び／又はアデニンを含む場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はそれ以上のシトシン、ウラシル及び／又はアデニンのそれぞれはこのように修飾されてもよい。好ましい実施形態において、すべてのシトシン、すべてのウラシル及び／又はすべてのアデニンはこのように修飾されるか、又は５−メチルシトシン、５−メチルウラシル及び／又は２，６−ジアミノプリンのそれぞれに置き換えられる。
本発明のオリゴヌクレオチドにおける５−メチルシトシン、５−メチルウラシル及び／又は２，６−ジアミノプリンの存在は、前記オリゴヌクレオチドのパラメータの少なくとも１つに対するプラスの効果又は少なくとも１つのパラメータの改善を有することが発見された。この文脈において、パラメータには、以下に説明しているように、前記オリゴヌクレオチドの結合親和性及び／又は動態、サイレンシング活性、生体内安定性、（組織内）分布、細胞取り込み及び／又は細胞輸送及び／又は免疫原性が含まれ得る。
上述のようないくつかの修飾はＴｍ値を増加させることが知られており、それにより特定のヌクレオチドの、その標的ｍＲＮＡにおけるその相対物に対する結合を増強するので、これらの修飾は、本発明の文脈において第１のエクソン及び第２のエクソンの両方の領域との本発明のオリゴヌクレオチドの結合を促進するために調査され得る。本発明のオリゴヌクレオチドの配列は第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの所与の領域に対して１００％逆相補的でなくてもよいので、架橋ヌクレオチド又はＢＮＡ（ＬＮＡなど）又は５−メチルピリミジン及び／又は２，６−ジアミノプリンから選択される塩基修飾などのＴｍを増加させる修飾が、好ましくは、前記エクソンの前記第１の領域及び／又は前記第２の領域に対して逆相補的であるヌクレオチド位置において実施され得る。
結合親和性及び／又は結合若しくはハイブリダイゼーション動態はＡＯＮの熱力学特性に依存する。それらは、前記オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；例えば、基本Ｔｍ及び隣接モデルを使用して、一本鎖ＲＮＡについてオリゴヌクレオチド特性計算器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ又はｈｔｔｐ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／）を用いて算出した）、及び／又は（ＲＮＡ構造バージョン４．５又はＲＮＡ ｍｆｏｌｄバージョン３．５を使用した）オリゴヌクレオチド標的エクソン複合体の自由エネルギーによって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが増加する場合、エクソンスキッピング活性は典型的に増加するが、Ｔｍが非常に高い場合、ＡＯＮはあまり配列特異的ではなくなると予想される。許容されるＴｍ及び自由エネルギーはオリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらのパラメータの各々について好ましい範囲を与えることは困難である。
本発明のオリゴヌクレオチドの活性は、好ましくは、以下のように定義される：
第１のエクソン及び／又は第２のエクソンに存在する変異及び／又は前記第１のエクソンにおいて開始し、前記第２のエクソンにおいて終了するストレッチ内に存在する変異に関連する疾患の１つ若しくは複数の症状を軽減すること、好ましくはＤＭＤ若しくはＢＭＤの１つ若しくは複数の症状を軽減すること、及び／又は
患者由来の細胞、好ましくは患者由来の筋細胞の１つ若しくは複数の特徴を軽減すること、及び／又は
前記個体に機能的若しくは半機能的タンパク質、好ましくは機能的若しくは半機能的ジストロフィンタンパク質を提供すること、及び／又は
前記個体における異常タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させること、好ましくは前記個体における異常ジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させること。これらの特徴及びそれらを評価するためのアッセイの各々は本明細書で下記に定義されている。
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドである、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル及び／又は２，６−ジアミノプリン塩基を含むオリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシンを１つも有さない、５−メチルウラシルを１つも有さない、及び２，６−ジアミノプリン塩基を１つも有さないオリゴヌクレオチドの対応する活性と比較して、増加した活性を示すと予想される。活性に関するこの相違は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％であり得る。生体内分布及び生体内安定性は、好ましくは、出典Ｙｕら，２００２の有効なハイブリダイゼーションライゲーションアッセイによって少なくとも部分的に決定される。一実施形態において、血漿又は均質化組織試料が特異的捕捉オリゴヌクレオチドプローブとインキュベートされる。分離後、ＤＩＧ標識化オリゴヌクレオチドが複合体とライゲーションされ、続いて抗ＤＩＧ抗体連結ペルオキシダーゼを使用して検出が行われる。非コンパートメント薬物動態分析が、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮソフトウェアパッケージ（モデル２００、バージョン５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて実施される。血漿１ｍｌ当たり又は組織１ｍｇ当たりのＡＯＮのレベル（ｕｇ）は、曲線下面積（ＡＵＣ）、ピーク濃度（Ｃｍａｘ）、時間対ピーク濃度（Ｔｍａｘ）、終末相半減期及び吸収遅延時間（ｔｌａｇ）を評価するために経時的にモニターされる。このような好ましいアッセイは実験部分に開示されている。オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９及びＴＬＲ７を含む、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を活性化することによって先天性免疫反応を刺激できる（Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．ら，１９９５）。ＴＬＲ９の活性化は、典型的に、ＴＬＲ９媒介性サイトカイン放出により先天性免疫系を活性化する細菌ＤＮＡを模倣することによって、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に存在する非メチル化ＣＧ配列の存在に起因して生じる。しかしながら、２’−Ｏ−メチル修飾はこのような起こり得る効果を著しく減少させることができる。ＴＬＲ７はＲＮＡにおけるウラシルリピートを認識することが記載されている（Ｄｉｅｂｏｌｄ Ｓ．Ｓ．ら，２００６）。
ＴＬＲ９及びＴＬＲ７の活性化の結果、先天性免疫（マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）及びＮＫ細胞）を含む一連の同調的免疫反応が生じる（Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．ら，１９９５；Ｋｒｉｅｇ Ａ．Ｍ．ら，２０００）。ＩＰ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１及びＩＦＮαなどのいくつかのケモカイン及びサイトカイン（Ｗａｇｎｅｒ Ｈ．ら，１９９９；Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｐ．Ｊ．ら，２００６）はこのプロセスに関与している。炎症性サイトカインは、Ｔ及びＢ細胞などの血液由来のさらなる防御細胞を引きつける。これらのサイトカインのレベルはインビトロ試験によって調べられ得る。手短に述べると、ヒト全血は高濃度のオリゴヌクレオチドとインキュベートされ、その後、サイトカインのレベルが標準的な市販のＥＬＩＳＡキットによって決定される。免疫原性の低下は、好ましくは、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル又は２，６−ジアミノプリンを有さない対応するオリゴヌクレオチドで処理した細胞と比較して少なくとも１つの５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル及び／又は２，６−ジアミノプリンを含むオリゴヌクレオチドで処理した細胞のアッセイにおける対応するサイトカインの濃度と比較して、上述のサイトカインの少なくとも１つの濃度の検出可能な減少に対応する。
したがって、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシンを有さない、５−メチルウラシルを有さない、及び２，６−ジアミノプリンを有さない、対応するオリゴヌクレオチドと比較して、許容可能な若しくは減少した免疫原性及び／又は良好な生体内分布及び／又は許容可能な若しくは改善された、ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学特性などの、改善されたパラメータを有する。これらのパラメータの各々は当業者に公知のアッセイを用いて評価され得る。
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドはＲＮＡ分子又は修飾ＲＮＡ分子を含むか又はからなる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。しかしながら、一本鎖オリゴヌクレオチドは内部二本鎖構造を形成できる可能性があることを当業者は理解するであろう。しかしながら、このオリゴヌクレオチドは依然として、本発明の文脈において一本鎖オリゴヌクレオチドと命名される。一本鎖オリゴヌクレオチドは二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較していくつかの利点を有する：（ｉ）その合成は二本の相補的ｓｉＲＮＡ鎖より容易であると予想される；（ｉｉ）細胞内の取り込み、良好な（生理学的）安定性を増強し、起こり得る一般的な悪影響を減少させることが可能な広範囲の化学修飾が存在する；（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡは非特異的効果（標的外の遺伝子を含む）についてのより高い可能性及び過剰の薬理学（例えば治療スケジュール又は用量による有効性及び選択性のコントロール可能性が低い）を有する、並びに（ｉｖ）ｓｉＲＮＡは核において作用する可能性が低く、イントロンに向けられることができない。
別の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは脱塩基部位又は脱塩基モノマーを含む。本明細書において、このようなモノマーは脱塩基部位又は脱塩基モノマーと呼ばれ得る。脱塩基モノマーは、核酸塩基を含む対応するヌクレオチド残基と比較して、核酸塩基を欠くヌクレオチド残基又は構成要素である。本発明内で、脱塩基モノマーはそれ故、核酸塩基を欠くが、オリゴヌクレオチドの構成要素部分である。このような脱塩基モノマーはオリゴヌクレオチドの遊離末端に存在又は連結又は結合又はコンジュゲートできる。
より好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは１〜１０個又はそれ以上の脱塩基モノマーを含む。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の脱塩基モノマーは本発明のオリゴヌクレオチドに存在してもよい。
脱塩基モノマーは、当業者に知られていて想定可能ないかなるタイプのものであってもよい。その非限定的な例を以下に示す。
本明細書において、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、オリゴヌクレオチド又は他の脱塩基部位であり、但し、Ｒ１及びＲ２の両方がＨであるわけではなく、Ｒ１及びＲ２の両方がオリゴヌクレオチドであるわけではない。脱塩基モノマーは、先に特定されているオリゴヌクレオチドの末端のいずれか又は両方に結合していてもよい。１つ又は２つの脱塩基部位又は脱塩基モノマーに結合したオリゴヌクレオチドは１０未満のヌクレオチドを含み得ることに留意されるべきである。これに関して、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、１つ又は両方の末端において１つ又は複数の脱塩基部位又は脱塩基モノマーを任意選択で含む少なくとも１０ヌクレオチドを含み得る。本発明に包含される脱塩基部位の他の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１３／０１３３７８号（Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に記載されている。
その長さに応じて、本発明のオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個の塩基修飾を含んでもよい。また、１個より多い異なる塩基修飾を前記オリゴヌクレオチドに組み込むことも本発明に包含される。
したがって、一実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは以下を含む。
（ａ）２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、チミン、２，６−ジアミノプリンから選択される少なくとも１つの塩基修飾、及び／又は
（ｂ）少なくとも１つの糖修飾であって、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、２’−Ｏ−デオキシ（ＤＮＡ）、２’−Ｆ、モルホリノ、架橋ヌクレオチド又はＢＮＡから選択され、或いは前記オリゴヌクレオチドが架橋ヌクレオチド及び２’−デオキシ修飾ヌクレオチド（ＢＮＡ／ＤＮＡミックスマー）の両方を含む、糖修飾、及び／又は
（ｃ）ホスホロチオエート又はホスホロジアミデートから選択される少なくとも１つの骨格修飾。
別の実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは以下を含む。
（ａ）５−メチルピリミジン及び２，６−ジアミノプリンから選択される少なくとも１つの塩基修飾、及び／又は
（ｂ）２’−Ｏ−メチルである、少なくとも１つの糖修飾、及び／又は
（ｃ）ホスホロチオエートである、少なくとも１つの骨格修飾。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチド系又はデオキシリボヌクレオチド系オリゴヌクレオチドと比較して少なくとも１つの修飾、より好ましくは、
（ａ）少なくとも１つの塩基修飾であって、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、チミン、２，６−ジアミノプリンから好ましくは選択され、５−メチルピリミジン及び２，６−ジアミノプリンからより好ましくは選択される塩基修飾、及び／又は
（ｂ）少なくとも１つの糖修飾であって、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、２’−Ｏ−デオキシ（ＤＮＡ）、２’−Ｆ、モルホリノ、架橋ヌクレオチド若しくはＢＮＡから好ましくは選択され、或いは前記オリゴヌクレオチドが架橋ヌクレオチド及び２’−デオキシ修飾ヌクレオチド（ＢＮＡ／ＤＮＡミックスマー）の両方を含み、より好ましくは糖修飾が２’−Ｏ−メチルである、糖修飾、及び／又は
（ｃ）少なくとも１つの骨格修飾であって、ホスホロチオエート又はホスホロジアミデートから好ましくは選択され、より好ましくはホスホロチオエートである骨格修飾
を含む。
したがって、本発明のこの実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、塩基修飾（ａ）を含み、糖修飾（ｂ）を含まず、骨格修飾（ｃ）を含まない。本発明のこの態様に係る別の好ましいオリゴヌクレオチドは、糖修飾（ｂ）を含み、塩基修飾（ａ）を含まず、骨格修飾（ｃ）を含まない。本発明のこの態様に係る別の好ましいオリゴヌクレオチドは、骨格修飾（ｃ）を含み、塩基修飾（ａ）を含まず、糖修飾（ｂ）を含まない。また、上述の修飾のいずれも有さないオリゴヌクレオチドが本発明に含まれ、同様に２つ、つまり上記に定義されている（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、及び／又は（ｂ）及び（ｃ）、或いは修飾（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の３つすべてを含むオリゴヌクレオチドも本発明に含まれる。
好ましい実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、（ａ）塩基修飾の１つ及び／又は（ｂ）糖修飾の１つ及び／又は（ｃ）骨格修飾の１つから選択される、同じ修飾の１つ又は複数で、その長さ全体にわたって修飾される。
核酸模倣技術の出現により、必ずしも核酸自体と同じ量ではない、同種のもので類似、好ましくは同じハイブリダイゼーション特性を有する分子を生成することが可能になっている。このような機能的等価物ももちろんまた、本発明における使用に適している。
別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、イノシン、ヒポキサンチン、ユニバーサル塩基、変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオシド若しくはヌクレオチド又はそれらの機能的等価物を含む。本発明のオリゴヌクレオチドにおけるイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドの使用は以下に説明されているように非常に魅力的である。例えばイノシンは、３つの塩基：ウラシル、アデニン及びシトシンと対合できる公知の修飾塩基である。イノシンは、ヒポキサンチンがβ［ベータ］−Ｎ９−グリコシド結合を介してリボース環（リボフラノースとしても知られている）に結合する場合に形成されるヌクレオシドである。イノシン（Ｉ）は一般にｔＲＮＡにおいて見出され、ゆらぎ塩基対における遺伝子コードの適切な翻訳に必須である。ゆらぎ塩基対は、ＧとＵとの間、又は一方におけるＩと他方におけるＵ、Ａ若しくはＣとの間に存在できる。これらはＲＮＡ二次構造の形成の基本である。その熱力学的安定性はワトソン−クリック塩基対のものに匹敵する。遺伝子コードは、アンチコドンの第１の塩基における修飾塩基対を使用することによって、トリプレットコドン（６４）についてのアミノ酸の数（２０）の相違を補う。
本発明のオリゴヌクレオチドにおけるイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを使用する第１の利点は、ｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域に結合でき、同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域に結合できるオリゴヌクレオチドを設計できることであり、前記第２のエクソン由来の前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する。つまり、本発明のオリゴヌクレオチドにおけるイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドの存在により、前記ｍＲＮＡ前駆体の第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域への前記オリゴヌクレオチドの結合が可能となる。
本発明のオリゴヌクレオチドにおけるイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを使用する第２の利点は、多型がオリゴヌクレオチドのアニーリング効果を破壊することを気にせずに、一塩基変異多型（ＳＮＰ）を補うオリゴヌクレオチドを設計できることである。したがって、本発明において、このような塩基の使用により、本発明のオリゴヌクレオチドによって標的とされるｍＲＮＡ前駆体ストレッチ内にＳＮＰを有する個体に使用できるオリゴヌクレオチドを設計できる。
本発明のオリゴヌクレオチドにおけるイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを使用する第３の利点は、本明細書に記載の第１のｍＲＮＡ前駆体エクソンの一部に相補的であるようにオリゴヌクレオチドを設計する場合、前記オリゴヌクレオチドがＣｐＧを通常含有することである。オリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧの存在は通常、前記オリゴヌクレオチドの増加した免疫原性に関連する（Ｄｏｒｎ Ａ．及びＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｓ．）。この増加した免疫原性は、筋繊維の崩壊を誘導し得るので望ましくない。前記オリゴヌクレオチドにおける１つ、２つ又はそれ以上のＣｐＧにおいてグアニンをイノシンに置き換えることにより、免疫原性の減少した及び／又は許容されるレベルでオリゴヌクレオチドが得られると予想される。免疫原性は、動物の筋生検におけるＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞の存在及び／又は炎症性の単核球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ）浸潤を評価することによって前記動物モデルにおいて評価され得る。免疫原性は、本発明のオリゴヌクレオチドで治療された動物又はヒトの血液においても、当業者に公知の標準的なイムノアッセイを使用して中和抗体の存在及び／又は前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在を検出することによって評価され得る。免疫原性の増強は、好ましくは、治療前の動物又は少なくとも１つのイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを有する対応するヌクレオチドで治療された動物の対応する筋生検中の各細胞型の量との比較によるこれらの細胞型の少なくとも１つの検出可能な増強に対応する。あるいは、免疫原性の増強は、標準的なイムノアッセイを使用して、中和抗体又は前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体が存在すること、又はそれらの量が増加していることを検出することによって評価され得る。免疫原性の減少は、好ましくは、治療前の動物又はイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを有さない対応するオリゴヌクレオチドで治療された動物の対応する筋生検中の対応する細胞型の量との比較によるこれらの細胞型の少なくとも１つの検出可能な減少に対応する。あるいは、免疫原性の減少は、標準的なイムノアッセイを使用して、前記化合物及び／又は中和抗体が存在しないこと、又はそれらの量が減少していることによって評価され得る。
本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを使用する第４の利点は、オリゴヌクレオチドの潜在的な多量体化又は凝集を回避又は減少することである。例えば、Ｇ−カルテットモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、４つの一本鎖オリゴヌクレオチドのフーグスティーン塩基対合によって形成される四重鎖、多量体又は凝集物を形成する傾向を有することが知られており（Ｃｈｅｎｇ Ａ．Ｊ．及びＶａｎ Ｄｙｋｅ Ｍ．Ｗ．）、これは当然、望ましくない：結果として、オリゴヌクレオチドの効率は減少すると予想される。多量体化又は凝集は、好ましくは、当業者に公知の標準的なポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ）非変性ゲル電気泳動法によって評価される。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの総数の２０％未満又は１５％、１０％、７％、５％若しくはそれ未満が、上述のアッセイを用いて評価される、多量体を形成する能力又は凝集する能力を有する。
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを使用する第５の利点は、抗血栓活性（Ｍａｃａｙａ Ｒ．Ｆ．ら）並びにマクロファージスカベンジャー受容体への結合及びマクロファージスカベンジャー受容体の阻害（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．ら）に関連している四重構造を回避することである。
本発明のオリゴヌクレオチドにおいてイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチドを使用する第６の利点は、ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学的特性が改善されたオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることである。ＲＮＡ結合動態及び／又は熱力学的特性は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ；基本的なＴｍ及び最近接モデルを使用して、一本鎖ＲＮＡに対してオリゴヌクレオチド特性計算器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて計算される）、及び／又は（ＲＮＡ構造バージョン４．５を使用した）ＡＯＮ−標的エクソン複合体の自由エネルギーによって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎる場合、オリゴヌクレオチドは、それほど特異的でないと予想される。許容されるＴｍ及び自由エネルギーはオリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらのパラメータの各々に対して好ましい範囲を与えることは困難である。許容されるＴｍは３５〜８５℃の範囲であり得、許容される自由エネルギーは１５〜４５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。
その長さに応じて、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のイノシン（ヒポキサンチン）及び／又はユニバーサル塩基及び／又は変性塩基及び／又はゆらぎ塩基対を形成できる塩基を含有するヌクレオチド又はそれらの機能的等価物を含み得る。
ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は非常に安定しているので、本発明の前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含むことが好ましい。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、さらなる特性、例えばエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨに対する耐性、さらなるハイブリダイゼーション強度、増加した安定性（例えば体液中）、増加した又は低下した柔軟性、減少した毒性、増加した細胞内輸送、組織特異性などをＲＮＡに与える修飾を含むことが好ましい。好ましい修飾は上述の通りである。
したがって、一実施形態は少なくとも１つの修飾を含むオリゴヌクレオチドを提供する。好ましい修飾オリゴヌクレオチドは完全に修飾された２’−Ｏ−メチルである。本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド修飾及び架橋核酸修飾（上記に例示されているＢＮＡ）を含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを含むか又はからなる。本発明の別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエート修飾及び架橋核酸（上記に例示されているＢＮＡ）を含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを含むか又はからなる。本発明の別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、架橋核酸（上記に例示されているＢＮＡ）修飾及びオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾を含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを含むか又はからなる。この特定の組み合わせは、架橋核酸のみからなる等価物と比較して、より良い配列特異性を含み、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾からなるオリゴヌクレオチドと比較して改善された効果を含む。
本発明に記載されている化合物は、好ましくは、イオン性基を有してもよい。イオン性基は塩基又は酸であってもよく、帯電されていてもよく又は中性であってもよい。イオン性基は、反対の電荷を有する適切な対イオンとのイオン対として存在してもよい。陽イオン性の対イオンの例は、ナトリウム、カリウム、セシウム、トリス、リチウム、カルシウム、マグネシウム、トリアルキルアンモニウム、トリエチルアンモニウム及びテトラアルキルアンモニウムである。陰イオン性の対イオンの例は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、乳酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ジクロロ酢酸塩及びクエン酸塩である。対イオンの例は記載されている（例えばＫｕｍａｒ Ｌ（その全体は参照により本明細書に組み込まれている））。二価又は三価対イオン、特にＣａ２＋の適用の例は、その全体が参照により組み込まれている米国特許出願公開第２０１２０４６３４８（Ｒｅｐｌｉｃｏｒ）において、選択されたオリゴヌクレオチドにプラスの特性を付加することとして記載されている。好ましい二価又は三価対イオンは、以下の記載又は群：カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅及び亜鉛から選択される。好ましい二価対イオンはカルシウムである。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド及び上述の任意の他の対イオン、好ましくはカルシウムを含む組成物を調製し、得て、使用することは本発明に包含される。前記オリゴヌクレオチド及び前記対イオン、好ましくはカルシウムを含む前記組成物を調製するためのこのような方法は以下の通りであり得る：本発明のオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される水性賦形剤に溶解でき、前記対イオンを含む溶液を溶解したオリゴヌクレオチドに徐々に加え、それによりオリゴヌクレオチドキレート錯体は溶解したままになる。
したがって、好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、このような対イオン、好ましくはＣａ２＋を含む組成物と接触して、本明細書に記載されているこのような対イオンによって連結された２つ以上の同一のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドキレート錯体を形成する。したがって、対イオン、好ましくはカルシウムによって連結された２つ以上の同一のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドキレート錯体を含む組成物は本発明に包含される。
オリゴヌクレオチドを設計するための方法：
したがって、本発明のさらなる態様において、オリゴヌクレオチドを設計するための方法であって、上述のオリゴヌクレオチドをもたらす方法が提供される。
この方法は以下のステップを含む。
（ａ）同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソン及び第２のエクソンのインフレームの組み合わせを同定するステップであって、前記第２のエクソンの領域は前記第１のエクソンの領域と少なくとも５０％の同一性を有する、ステップ、
（ｂ）前記第１のエクソンの前記領域及び前記第２のエクソンの前記領域に結合できるオリゴヌクレオチドを設計するステップ、並びに
（ｃ）前記結合の結果、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピング、好ましくは、前記第１のエクソンで開始し、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に存在する１つ又は複数のエクソンを包含するマルチエクソンストレッチのスキッピング、及び多くても前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを生じるステップ。
このような方法のステップｂ）において、前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、その結合が、前記ｍＲＮＡ内の前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの前記領域における少なくとも１つのスプライシング制御配列に干渉するように設計される。
代替として、又はスプライシング制御配列の干渉と組み合わせて、前記オリゴヌクレオチドの結合は、好ましくは、前記ｍＲＮＡ前駆体内に少なくとも前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンを包含する二次構造に干渉する。
本発明によって得ることが可能なオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ前駆体の前記第１のエクソン及び第２のエクソンのスキッピングを誘導できる。追加のエクソンのスキッピングが誘導されることが好ましく、前記追加のエクソンは、好ましくは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置し、得られるｍＲＮＡ転写物はインフレームである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを誘導できる。一実施形態において、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンの前記領域はスプライシング制御要素を含み、それにより前記オリゴヌクレオチドの結合は、前記第１のエクソン及び第２のエクソンの前記領域における少なくとも１つのスプライシング制御配列に干渉することができる。また、前記オリゴヌクレオチドの結合が、前記ｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンを包含する二次構造に干渉することも包含される。好ましいスプライシング制御配列は、セリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質についての結合部位、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エクソン認識配列（ＥＲＳ）、及び／又はエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）を含む。
この方法の各々の特徴は既に本明細書に記載されているか、又は当業者に知られている。
好ましいオリゴヌクレオチド：
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬としての使用のためであることが好ましく、前記化合物はＲＮＡ調節療法における使用のためであることがより好ましい。前記ＲＮＡ調節により、破壊された転写リーディングフレームの修正及び／又は望ましい若しくは予測されるタンパク質の発現の修復が導かれることがより好ましい。したがって、本発明の方法及び本発明のオリゴヌクレオチドは、原則として、異常転写物及び／又はコードタンパク質の不在及び／又は異常タンパク質の存在を導く、フレーム破壊変異の存在に関連する任意の疾患に適用され得る。好ましい実施形態において、本発明の方法及び本発明のオリゴヌクレオチドは、反復配列及びそれにより比較的高い配列同一性（つまり、本明細書に定義されている第２のエクソンの領域と第１のエクソンの領域との間で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％の配列同一性）を有する領域を有する疾患関連遺伝子に適用される。非限定的な例は、スペクトリン様リピート（本明細書に記載されているデュシェンヌ型筋ジストロフィーに関与するＤＭＤ遺伝子として）、Ｋｅｌｃｈ様リピート（家族性高カリウム性高血圧に関与するＫＬＨＬ３遺伝子（Ｌｏｕｉｓ−Ｄｉｔ−Ｐｉｃａｒｄ Ｈら）、慢性リンパ球性白血病に関与するＫＬＨＬ６遺伝子（Ｐｕｅｎｔｅ ＸＳら）、網膜色素変性に関与するＫＬＨＬ７遺伝子（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＪＳら）、シェーグレン症候群に関与するＫＬＨＬ７／１２遺伝子（Ｕｃｈｉｄａ Ｋら）、末梢性ミオパシーに関与するＫＬＨＬ９遺伝子（Ｃｉｒａｋ Ｓら）、巨大軸索神経病（Ｂｏｍｏｎｔ Ｐら）に関与するＫＬＨＬ１６若しくはＧＡＮ遺伝子、いくつかの癌に関与するＫＬＨＬ１９若しくはＫＥＡＰ１遺伝子（Ｄｈａｎｏａ ＢＳら）、前骨髄球性白血病に関与するＫＬＨＬ２０遺伝子（Ｄｈａｎｏａ ＢＳら）又は脳腫瘍に関与するＫＬＨＬ３７若しくはＥＮＣ１遺伝子（Ｄｈａｎｏａ ＢＳら）など）、ＦＧＦ様リピート、ＥＧＦ様リピート（ＣＡＤＡＳＩＬに関与するＮＯＴＣＨ３遺伝子（Ｃｈａｂｒｉａｔ Ｈら）、癌又は代謝性骨疾患に関与するＳＣＵＢＥ遺伝子、精神神経障害及び特発性全般てんかんに関与するニューレキシン−１（ＮＲＸＮ１）遺伝子（Ｍｏｌｌｅｒ ＲＳら）、Ｄｅｌ−１遺伝子、アテローム性動脈硬化症及び冠動脈疾患に関与するテネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）遺伝子（Ｍｏｌｌｉｅ Ａら）、ＴＨＢＳ３遺伝子若しくはマルファン症候群に関与するフィブリリン（ＦＢＮ１）遺伝子（Ｒａｎｔａｍａｋｉ Ｔら）など）、アンキリン様リピート（拡張型心筋症に関与するＡＮＫＲＤ１遺伝子（Ｄｕｂｏｓｑ−Ｂｉｄｏｔ Ｌら）、ＡＮＫＲＤ２遺伝子、ＫＢＧ症候群に関与するＡＮＫＲＤ１１遺伝子（Ｓｉｒｍａｃｉ Ａら）、血小板減少症（Ｎｏｒｉｓ Ｐら）若しくは糖尿病（Ｒａｃｉｔｉ ＧＡら）に関与するＡＮＫＲＤ２６遺伝子、多発性硬化症に関与するＡＮＫＲＤ５５遺伝子（Ａｌｌｏｚａ Ｉら）又は遠位脊髄性筋萎縮症に関与するＴＲＰＶ４遺伝子（Ｆｉｏｒｉｌｌｏ Ｃら）など）、ＨＥＡＴ様リピート（ハンチントン病に関与するｈｔｔ遺伝子など）、アネキシン様リピート、ロイシンリッチリピート（特発性反復流産に関与するＮＬＲＰ２及びＮＬＲＰ７遺伝子（Ｈｕａｎｇ ＪＹら）、パーキンソン病に関与するＬＲＲＫ２遺伝子（Ａｂｅｌｉｏｖｉｃｈ Ａら）、アルツハイマー病若しくは髄膜炎に関与するＮＬＲＰ３遺伝子（Ｈｅｎｅｋａ ＭＴら）、腎不全に関与するＮＡＬＰ３遺伝子（Ｋｎａｕｆ Ｆら）又は尿顔症候群（ｕｒｏｆａｃｉａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に関与するＬＲＩＧ２遺伝子（Ｓｔｕａｒｔ ＨＭら）など）又はセリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン（Ａｎｄｒａｄｅ Ｍ．Ａ．らに記載されている、ネザートン症候群（Ｎｅｔｈｅｒｔｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に関与するＳＰＩＮＫ５遺伝子（Ｈｏｖｎａｎｉａｎ Ａら）などを有する遺伝子である。
本発明において、好ましいｍＲＮＡ前駆体又は転写物はジストロフィンｍＲＮＡ前駆体又は転写物である。この好ましいｍＲＮＡ前駆体又は転写物は、好ましくはヒトのｍＲＮＡ前駆体又は転写物である。ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体に存在する変異の存在に関連する疾患は、変異に応じてＤＭＤ又はＢＭＤである。本発明の文脈において使用されるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソン及び第２のエクソンの好ましい組み合わせ及び領域は表２に記載されている。
好ましい実施形態において、本発明の化合物は、細胞内、器官内、組織内及び／又は患者内、好ましくはＢＭＤ若しくはＤＭＤ患者内又は前記患者由来の細胞、器官、組織内でエクソン−スキッピングを誘導するために使用される。エクソン−スキッピングの結果、スキップされたエクソンを含有せず、それにより、前記エクソンがアミノ酸をコードする場合、変化し、内部で切断されているが、部分的から大部分の機能的なジストロフィン産物の発現を導き得る成熟ｍＲＮＡが生じる。エクソンスキッピングについての技術は、現在、ＡＯＮ又は遺伝子構築物を転写するＡＯＮの使用に向けられている。最近では、エクソンスキッピング技術は、遺伝的筋ジストロフィーに対処するために調べられている。有望な結果が、最近、ｍｄｘマウス及びＤＭＤ患者由来の細胞内のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のリーディングフレームの修復を目的としているＡＯＮにより誘導されるスキッピング療法について本発明者ら及び他者によって報告されている（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ Ｈら；Ｃｉｒａｋ Ｓ．ら；Ｇｏｅｍａｎｓら）。特異的エクソンの標的化スキッピングによって、重度のＤＭＤ表現型（機能的ジストロフィンを欠く）は軽度のＢＭＤ表現型（機能的又は半機能的ジストロフィンを発現する）に変換される。エクソンのスキッピングは、好ましくは、エクソン内部配列を標的化するＡＯＮの結合によって誘導される。
以下に、本発明を、第１のエクソン及び第２のエクソンが存在する、変異ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体によって例示する。本明細書において、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体は、好ましくは、ジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を意味する。変異ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体は、（低下したレベルの）異常タンパク質（ＢＭＤ）又は機能的ジストロフィンの不在（ＤＭＤ）をもたらす、罹患していないヒトの野生型ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体と比較して変異を有するＢＭＤ又はＤＭＤ患者のｍＲＮＡ前駆体に対応する。ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体はまた、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体と命名される。ジストロフィン遺伝子はＤＭＤ遺伝子とも命名され得る。ジストロフィン及びＤＭＤは本明細書全体を通じて交換可能に使用できる。
患者は、好ましくは、後述のＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する患者又は彼（若しくは彼女）の遺伝的背景に起因してＤＭＤ若しくはＢＭＤを発症しやすい患者を意味すると意図される。ＤＭＤ患者の場合、使用される化合物は、好ましくは、前記患者のＤＭＤ遺伝子に存在するような変異を正し、したがって、好ましくは、ＢＭＤ患者由来のジストロフィンタンパク質のように見えるジストロフィンタンパク質を創製する。前記タンパク質は、好ましくは後述の機能的又は半機能的ジストロフィンである。ＢＭＤ患者の場合、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記タンパク質のＢＭＤ遺伝子に存在するような変異を修正し、好ましくは、前記ＢＭＤ患者に最初に存在したジストロフィンより機能的であるジストロフィンを創製する。
本明細書において、機能的ジストロフィンは、好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンである。機能的ジストロフィンは、好ましくは、そのＮ末端部分（Ｎ末端における最初の２４０アミノ酸）、システイン−リッチドメイン（アミノ酸３３６１から３６８５まで）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端における最後の３２５アミノ酸）に作用結合ドメインを有するジストロフィンであり、これらのドメインの各々は当業者に公知の野生型ジストロフィンに存在する。本明細書に示されているアミノ酸は配列番号１によって表されている野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。つまり、機能的又は半機能的ジストロフィンは、少なくともある程度まで野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンである。「少なくともある程度まで」は、好ましくは、対応する野生型機能的ジストロフィンの活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味する。この文脈において、機能的ジストロフィンの活性は、好ましくは、アクチンに結合し、ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）又は（ＤＡＧＣ）と相互作用する（Ｅｈｍｓｅｎ Ｊら）。アクチン及びＤＧＣ複合体へのジストロフィンの結合は、当業者に公知である、全タンパク質抽出物を使用する免疫共沈降又はジストロフィーである疑いのある筋肉の生検由来の断面の免疫蛍光分析のいずれかによって視覚化され得る。
ＤＭＤを患っている個体は典型的に、完全なタンパク質の合成を防ぐ（例えば、早まった停止はＣ末端の合成を防ぐ）ジストロフィンをコードする遺伝子において変異を有する。ＢＭＤにおいて、ジストロフィン遺伝子はまた、変異を含むが、この変異はオープンリーディングフレームを破壊せず、Ｃ末端が合成される。結果として、必ずしも類似の量の活性ではないが、野生型タンパク質と同種のもので類似の活性を有する（半）機能的又は機能的ジストロフィンタンパク質が生成される。ＢＭＤ個体のゲノムは典型的に、Ｎ末端部分（Ｎ末端における第１の２４０アミノ酸）、システイン−リッチドメイン（アミノ酸３３６１から３６８５まで）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端における最後の３２５アミノ酸）を含むジストロフィンタンパク質をコードするが、ほとんどの場合、その中心の棒状ドメインは野生型ジストロフィンのものより短くなり得る（Ｍｏｎａｃｏ Ａ．Ｐ．ら）。ＤＭＤを治療するためのエクソンスキッピングは典型的に、変異に隣接する又は変異を含有するエクソンをスキップすることによってｍＲＮＡ前駆体内の早まった停止を迂回することを対象とする。これにより、オープンリーディングフレームの矯正、及び、Ｃ末端を含むものの、内部で切断されたジストロフィンタンパク質の合成が可能となる。好ましい実施形態において、ＤＭＤを有し、本発明のオリゴヌクレオチドで治療される個体は、野生型ジストロフィンの類似の活性を少なくともある程度まで示すジストロフィンを合成する。前記個体がＤＭＤ患者であるか又はＤＭＤ患者である疑いがある場合、（半）機能的ジストロフィンはＢＭＤを有する個体のジストロフィンであることがより好ましい：典型的に前記ジストロフィンはアクチン及びＤＧＣ又はＤＡＧＣの両方と相互作用できる（Ｅｈｍｓｅｎ Ｊ．ら；Ｍｏｎａｃｏ Ａ．Ｐ．ら）。
野生型ジストロフィンの中心の棒状ドメインは２４個のスペクトリン様リピートを含む（Ｅｈｍｓｅｎ Ｊ．ら）。多くの場合、ＢＭＤ様タンパク質における中心の棒状ドメインは野生型ジストロフィンのものより短い（Ｍｏｎａｃｏ Ａ．Ｐ．ら）。例えば、本明細書に提供されているジストロフィンの中心の棒状ドメインは、それがアクチン及びＤＧＣに結合できる限り、５〜２３個、１０〜２２個又は１２〜１８個のスペクトリン様リピートを含んでもよい。
本発明の化合物を使用した、個体におけるＤＭＤ又はＢＭＤの１つ又は複数の症状の軽減は以下のアッセイのいずれかによって評価され得る：歩行喪失時間の延長、筋肉強度の改善、重りを持ち上げる能力の改善、床から立ち上がるのにかかる時間の改善、９メートル歩行時間の改善、４階を上るのにかかる時間の改善、足の機能の悪性度の改善、肺機能の改善、心臓機能の改善、生活の質の改善。これらのアッセイの各々は当業者に公知である。一例として、Ｍａｎｚｕｒら（Ｍａｎｚｕｒ Ａ．Ｙ．ら）の公報はこれらのアッセイの各々の広範囲の説明を与えている。これらのアッセイの各々について、アッセイにおいて測定されたパラメータの検出可能な改善又は延長が見られるとすぐに、好ましくは、ＤＭＤ又はＢＭＤの１つ又は複数の症状が、本発明の化合物を使用した個体において軽減していることを意味する。検出可能な改善又は延長は、好ましくは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら）に記載されているように統計的に有意な改善又は延長である。あるいは、ＤＭＤ又はＢＭＤの１つ又は複数の症状の軽減は、筋繊維の機能、完全性及び／又は生存率の改善を測定することによって評価され得る。好ましい方法において、ＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者の１つ若しくは複数の症状が軽減され、及び／又はＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者由来の１つ若しくは複数の筋細胞の１つ若しくは複数の特性が改善される。このような症状又は特性は、細胞、組織レベルにて又は患者自身で評価されてもよい。
ＤＭＤ又はＢＭＤ患者由来の筋細胞の１つ又は複数の特性の軽減は、その患者由来の筋原細胞又は筋細胞に対する以下のアッセイのいずれかによって評価され得る：筋細胞による低下したカルシウム取り込み、減少したコラーゲン合成、変化した形態、変化した脂質生合成、減少した酸化的ストレス及び／又は改善した筋繊維の機能、完全性及び／又は生存率。これらのパラメータは、通常、筋生検の断面の免疫蛍光及び／又は組織化学的分析を用いて評価される。
筋繊維の機能、完全性及び／又は生存率の改善は以下のアッセイの少なくとも１つを用いて評価され得る：血液中のクレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーである疑いがある筋肉の生検断面における筋繊維の壊死の検出可能な減少及び／又はジストロフィーである疑いがある筋肉の生検断面における筋繊維の直径の均一性の検出可能な増加。これらのアッセイの各々は当業者に知られている。
クレアチンキナーゼは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら）に記載されているように血液中で検出され得る。クレアチンキナーゼの検出可能な減少は、治療前の同じＤＭＤ又はＢＭＤ患者におけるクレアチンキナーゼの濃度と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少を意味し得る。
筋繊維の壊死の検出可能な減少は、好ましくは、筋生検において評価され、より好ましくは、生検断面を使用してＨｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら）に記載されているように評価される。壊死の検出可能な減少は、壊死が生検断面を用いて特定されている領域の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少であり得る。減少は、治療前の同じＤＭＤ又はＢＭＤ患者において評価された壊死との比較によって測定される。
筋繊維の直径の均一性の検出可能な増加は、好ましくは、筋生検断面において評価され、より好ましくは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（Ｈｏｄｇｅｔｔｓ Ｓ．ら）に記載されているように評価される。増加は、治療前の同じＤＭＤ又はＢＭＤ患者における筋繊維の直径の均一性との比較によって測定される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記個体に（より高いレベルの）機能的及び／又は（半）機能的ジストロフィンタンパク質（ＤＭＤ及びＢＭＤの両方）を提供し、前記個体において異常なジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させることができることが好ましい。この文脈において、「一つの」機能的及び／又は「一つの」半機能的ジストロフィンは、機能的及び／又は半機能的ジストロフィンのいくつかの形態が生成され得ることを意味し得る。これは、第１のエクソンと第２のエクソンとの間の少なくとも５０％の同一性の領域が、他の第１のエクソンと第２のエクソンとの間の少なくとも５０％の同一性の１つ又は複数の他の領域と重複する場合、及び前記オリゴヌクレオチドが前記重複している部分に結合でき、それによりエクソンのいくつかの異なるストレッチがスキップされ、いくつかの異なるインフレーム転写物が産生される場合に予想され得る。この状況は実施例４に例示され、本発明に係る１つの単一のオリゴヌクレオチド（ＰＳ８１６，配列番号１６７９）が、第１のエクソンとしてエクソン１０をすべて共有するいくつかのインフレーム転写物の産生を誘導でき、第２のエクソンは１３、１４、１５、１８、２０、２７、３０、３１、３２、３５、４２、４４、４７、４８又は５５であってもよい。
より高いレベルとは、本発明のオリゴヌクレオチドでの治療の開始前の患者における機能的及び／又は（半）機能的ジストロフィンタンパク質の対応するレベルと比較して、機能的及び／又は（半）機能的ジストロフィンタンパク質レベルの増加を指す。前記機能的及び／又は（半）機能的ジストロフィンタンパク質のレベルは、好ましくは、免疫蛍光又はウェスタンブロット分析（タンパク質）を用いて評価される。
異常なジストロフィンｍＲＮＡ又は異常なジストロフィンタンパク質の産生を減少させることとは、好ましくは、初期量の異常なジストロフィンｍＲＮＡ又は異常なジストロフィンタンパク質の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満が、ＲＴ ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）又は免疫蛍光又はウェスタンブロット分析（タンパク質）によってまだ検出可能であることを意味する。異常なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質とはまた、本明細書において、ほとんど機能的でない（本明細書で上に定義されている野生型の機能的ジストロフィンタンパク質と比較して）又は非機能的ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質を指す。非機能的ジストロフィンタンパク質は、好ましくは、アクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体のメンバーに結合できないジストロフィンタンパク質である。非機能的ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは、典型的に、タンパク質のインタクトなＣ末端を有するジストロフィンタンパク質を有さないか、又はコードしない。好ましい実施形態において、エクソンスキッピング（ＲＮＡ調節又はスプライススイッチングとも呼ばれる）技術が適用される。
機能的及び／又は半機能的ジストロフィンｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生を増加させることとは、好ましくは、このような機能的及び／又は半機能的ジストロフィンｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が検出可能であるか、又は治療の開始において検出可能な前記ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の検出可能な量と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上増加させること意味する。前記検出は、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）又は免疫蛍光又はウェスタンブロット分析（タンパク質）を用いて実施され得る。
別の実施形態において、本発明の化合物は前記個体に機能的又は半機能的ジストロフィンタンパク質を提供する。この機能的又は半機能的ジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡは、本明細書の上記に説明されている異常なジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡとして検出され得る。
前記２つのエクソン（前記第１のエクソン及び前記第２のエクソン）の標的化された共スキッピング（ｃｏ−ｓｋｉｐｐｉｎｇ）によって、さらなるエクソンのスキッピングが誘導でき、前記さらなるエクソンは、好ましくは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置し、得られたジストロフィン転写物は、（好ましくは表１又は６に記載の）インフレームであり、ＤＭＤ又は重度のＢＭＤ表現型は軽度のＢＭＤ又はさらに無症候表現型に変換される。前記２つのエクソンの共スキッピングは、好ましくは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体由来の第１のエクソンの領域とのオリゴヌクレオチドの結合によって、及びジストロフィンｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンの領域とのオリゴヌクレオチドの結合によって誘導され、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する。前記第１のジストロフィンエクソン及び前記第２のジストロフィンエクソン並びにそれらの中の同一性領域は表２又は６に記載されているものであることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、非エクソン配列と重複していないことを示す。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくともそれらがイントロンに存在する限り、スプライス部位と重複しない。前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、隣接するイントロンと逆相補的である配列を含有しないエクソン内部配列に向けられる。エクソンスキッピング技術は、ＤＭＤ ｍＲＮＡ前駆体から産生されたｍＲＮＡにおける、前記２つのエクソンの不在が、好ましくはさらなるエクソンの、より好ましくは前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置するエクソンの不在が、より（半）機能的な、短いけれども、ジストロフィンタンパク質の（より高い）発現についてのコドン領域を生成するように適用されることが好ましい。この文脈（典型的にＢＭＤ患者）において、前記２つのエクソン、好ましくは、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置するさらなるエクソン、の包含を阻害することとは、好ましくは以下を意味する。
元の異常な（ほとんど機能的でない）ジストロフィンｍＲＮＡのレベルが、ＲＴ−ＰＣＲによって評価して少なくとも５％減少すること、又は対応する異常なジストロフィンタンパク質レベルが、抗ジストロフィン抗体を使用した免疫蛍光若しくはウェスタンブロット分析によって評価して少なくとも２％減少すること、及び／又は
半機能的若しくは機能的ジストロフィンタンパク質をコードするインフレーム転写物が検出可能であるか、又はそのレベルが、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベル）によって評価して少なくとも５％、若しくは抗ジストロフィン抗体（タンパク質レベル）を使用した免疫蛍光若しくはウェスタンブロットによって評価して少なくとも２％増加すること。
異常な、ほとんど機能的でない又は非機能的ジストロフィンタンパク質の減少は、好ましくは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％であり、好ましくは、より機能的又は半機能的なジストロフィン転写物又はタンパク質の検出又は増加した産生と一致又は類似している。この文脈（典型的にＤＭＤ患者）において、前記２つのエクソン、好ましくは前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に位置するさらなるエクソンの包含を阻害することは、好ましくは、（より高いレベルの）より機能的又は（半）機能的なジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡが前記個体に提供されることを意味する。
一旦、ＤＭＤ患者が（より高いレベルの）（より）機能的又は半機能的なジストロフィンタンパク質を与えられると、ＤＭＤの原因が少なくとも部分的に軽減される。それ故、次に、ＤＭＤの症状が十分に低下することが予期される。本発明は、ストレッチの外側エクソンの両方に向けられた（又は結合できるか若しくはハイブリダイズできるか若しくは逆相補的であるか若しくは標的化できる）単一のオリゴヌクレオチドを使用する場合、少なくとも２つのジストロフィンエクソンのストレッチ全体の、前記エクソンを含むｍＲＮＡ前駆体からのスキッピングが誘導又は増強されるという洞察をさらに提供する。好ましい実施形態における本明細書全体にわたって、したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記第１のエクソンの前記領域に少なくとも８０％逆相補的であり、本明細書に定義されている前記第２のエクソンの前記領域に少なくとも４５％逆相補的であり、前記第１のエクソン及び第２のエクソンはスキップされるエクソンストレッチの外側エクソンに対応する。
前記オリゴヌクレオチドは、前記第１の前記領域に少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％逆相補的であり、前記第２のエクソンの前記領域に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％逆相補的であることがより好ましい。増強したスキッピング頻度はまた、ＤＭＤ又はＢＭＤ個体の筋細胞において産生される、より（半）機能的なジストロフィンタンパク質のレベルを増加させる。
使用されることが好ましい本発明に係るオリゴヌクレオチドは、好ましくは、第１のジストロフィンエクソンの領域に逆相補的であるか又は結合できるか又はハイブリダイズできるか又は標的化でき、前記領域は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又はそれ以上のヌクレオチドを有し、好ましくは、第２のジストロフィンエクソンの領域に逆相補的であるか又は結合できるか又はハイブリダイズできるか又は標的化でき、前記領域は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又はそれ以上のヌクレオチドを有し、同じｍＲＮＡ前駆体内の前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性である。
本発明において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的等価物を含んでもよいか又はからなってもよい。オリゴヌクレオチドの機能的等価物は、１つ又は複数のヌクレオチドが置換されており、前記機能的等価物の活性が少なくともある程度まで保持される、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドを好ましくは意味する。オリゴヌクレオチドの機能的等価物を含む前記化合物の活性は、機能的又は半機能的ジストロフィンタンパク質を提供することが好ましい。したがって、オリゴヌクレオチドの機能的等価物を含む前記化合物の前記活性は、好ましくは、機能的又は半機能的ジストロフィンタンパク質の量を定量することによって評価される。機能的又は半機能的ジストロフィンは、本明細書において好ましくは、アクチン及びＤＧＣタンパク質複合体のメンバーに結合でき、筋繊維膜構造及び柔軟性をサポートできるジストロフィンであると定義される。機能的オリゴヌクレオチド又は等価物を含む化合物の前記活性の評価は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡレベルでエクソンスキッピングを検出するため）及び／又は免疫蛍光若しくはウェスタンブロット分析（タンパク質発現及び局在を検出するため）を含む。前記活性は、その活性が、機能的等価物が由来するオリゴヌクレオチドを含む前記化合物の、対応する活性の少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又はそれ以上を表す場合、好ましくは少なくともある程度まで保持される。本明細書全体にわたって、オリゴヌクレオチドという用語が使用される場合、その用語は、本明細書に定義されているその機能的等価物に置き換えられてもよい。
したがって、オリゴヌクレオチド又はその機能的等価物の使用は、
第１のジストロフィンエクソンの領域に結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的であり、
第２のジストロフィンエクソンの領域に結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である、
配列を含むか又はからなり、
ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体内の前記第２のエクソンの前記領域は、前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、
ＤＭＤ又はＢＭＤの１つ又は複数の症状を軽減すること、及び／又は
患者由来の筋細胞の１つ又は複数の特性を軽減すること、及び／又は
前記個体に機能的若しくは半機能的ジストロフィンタンパク質を提供すること、及び／又は
前記個体における異常なジストロフィンタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させること
によるＤＭＤ治療結果を示す。
これらの特徴の各々は既に本明細書に定義されている。
オリゴヌクレオチドは、第１のＤＭＤ又はジストロフィンエクソンの領域に結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である配列を含むか又はからなり、同じｍＲＮＡ前駆体内の第２のＤＭＤ又はジストロフィンの領域は、前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性であることが好ましい。前記第１のエクソン及び第２のエクソンは、好ましくは、エクソン８〜６０を含むエクソンの群から選択され、エクソンのストレッチは、第１のエクソンで開始し、最後のエクソンとして第２のエクソンを含み、スキップされる場合、インフレーム転写物を生じる。ジストロフィンｍＲＮＡにおける好ましいインフレームエクソンの組み合わせは表１、２又は６に与えられる。
いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、第１のジストロフィンエクソン及び第２のジストロフィンエクソンの同一性は以下の態様の１つ又は複数によって決定され得る。一実施形態において、第１のエクソンと第２のエクソンとの間に存在する１つ又は複数のイントロンは非常に大きいわけではない。この文脈において、ジストロフィン遺伝子における非常に大きいイントロンは、７０、８０、９０、１００、２００ｋｂ又はそれ以上；例えば、イントロン１（約８３ｋｂ）、イントロン２（約１７０ｋｂ）、イントロン７（約１１０ｋｂ）、イントロン４３（約７０ｋｂ）、イントロン４４（約２４８ｋｂ）、イントロン５５（約１１９ｋｂ）又はイントロン６０（約９６ｋｂ）であり得る。さらなる実施形態に加えて、それらのイントロンは既に、切断されたジストロフィンタンパク質を発現するＢＭＤ患者の一例であり得、前記第１のエクソンから前記第２のエクソンまでのこの第１、この第２及びエクソンストレッチは欠失される。別の基準（ｃｒｉｔｅｒｏｎ）は、特定の関連する変異を有するＤＭＤ（及び／又はＢＭＤ）患者の組み合わされた亜集団についてのスキップされたエクソンの比較的大きな適用性であり得る。
好ましい実施形態において、ＤＭＤエクソンのインフレームストレッチはスキップされ（より好ましくは１つの転写物内で完全にスキップされる）、外側エクソンは以下のような第１のエクソン及び第２のエクソンによって定義される。
第１のエクソンはエクソン８であり、第２のエクソンはエクソン１９である（約７％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン９であり、第２のエクソンはエクソン２２である（約１１％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン９であり、第２のエクソンはエクソン３０である（約１４％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１０であり、第２のエクソンはエクソン１８である（約５％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１０であり、第２のエクソンはエクソン３０である（約１３％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１０であり、第２のエクソンはエクソン４２である（約１６％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１０であり、第２のエクソンはエクソン４７である（約２９％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１０であり、第２のエクソンはエクソン５７である（約７２％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１０であり、第２のエクソンはエクソン６０である（約７２％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１１であり、第２のエクソンはエクソン２３である（約８％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン１３であり、第２のエクソンはエクソン３０である（約１０％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン２３であり、第２のエクソンはエクソン４２である（約７％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン３４であり、第２のエクソンはエクソン５３である（約４２％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン４０であり、第２のエクソンはエクソン５３である（約３８％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン４４であり、第２のエクソンはエクソン５６である（約４０％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン４５であり、第２のエクソンはエクソン５１である（約１７％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン４５であり、第２のエクソンはエクソン５３である（約２８％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン４５であり、第２のエクソンはエクソン５５である（約３３％のＤＭＤ患者に適用可能）；
第１のエクソンはエクソン４５であり、第２のエクソンはエクソン６０である（約３７％のＤＭＤ患者に適用可能）；或いは
第１のエクソンはエクソン５６であり、第２のエクソンはエクソン６０である（約２％のＤＭＤ患者に適用可能）。
したがって、一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは以下のジストロフィンエクソンのスキッピングを含む：エクソン８から１９、エクソン９から２２、エクソン９から３０、エクソン１０から１８、エクソン１０から３０、エクソン１０から４２、エクソン１０から４７、エクソン１０から５７、エクソン１０から６０、エクソン１１から２３、エクソン１３から３０、エクソン２３から４２、エクソン３４から５３、エクソン４０から５３、エクソン４４から５６、エクソン４５から５１、エクソン４５から５３、エクソン４５から５５、エクソン４５から６０、又はエクソン５６から６０。
本発明のオリゴヌクレオチドは、逆相補的部分が本発明の前記オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％又はさらに好ましくは少なくとも９５％又はさらに好ましくは９８％及び最も好ましくは最大１００％であるように、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の第１のエクソンの領域に結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、及び／又は逆相補的である、配列を含むか又はからなることが好ましい。この文脈において、第１のエクソンは、好ましくは、本明細書に定義されているジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のエクソン８、９、１０、１１、１３、２３、３４、４０、４４、４５又は５６である。前記オリゴヌクレオチドはさらなる隣接配列を含んでもよい。より好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの前記逆相補的部分の長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチドである。いくつかの種類の隣接配列が使用されてもよい。隣接配列は、前記オリゴヌクレオチドに対するタンパク質の結合を変更するため、又は前記オリゴヌクレオチドの熱力学特性を変更するため、より好ましくは標的ＲＮＡ結合親和性を変更するために使用されることが好ましい。別の好ましい実施形態において、さらなる隣接配列は前記エクソンに存在しないジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の配列に逆相補的である。
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体に存在する少なくとも第１のジストロフィンエクソンの領域及び第２のジストロフィンエクソンの領域に結合でき、標的化でき、ハイブリダイズでき、逆相補的である、配列を含むか又はからなり、前記第１のエクソン及び第２のエクソンは、エクソン８（配列番号２）、９（配列番号３）、１０（配列番号４）、１１（配列番号１７６１）、１３（配列番号１７６２）、１８（配列番号５）、１９（配列番号６）、２２（配列番号７）、２３（配列番号８）、３０（配列番号９）、３４（配列番号１７６３）、４０（配列番号１７６４）、４２（配列番号１１）、４４（配列番号１７６５）、４５（配列番号１２）、４７（配列番号１０）、５１（配列番号１７６０）、５３（配列番号１３）、５５（配列番号１４）、５６（配列番号１５）、５７（配列番号１７４４）、又は６０（配列番号１６）、の群から選択され、前記領域は少なくとも１０ヌクレオチドを有する。しかしながら、前記領域はまた、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、又はそれ以上のヌクレオチドを有してもよい。上述の好ましいエクソンについて、当業者はまた、当分野において公知の技術を使用して第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域を同定できる。オンラインツールＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒが上述のように使用されることがより好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドが好ましくは結合し、及び／又は少なくとも部分的に逆相補的である、第１のジストロフィンエクソン及び第２のジストロフィンエクソンの好ましい同一性の領域は表２に提供されているものであることがさらに好ましい。ここで、逆相補的とは、好ましくは、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。本発明に使用される好ましいオリゴヌクレオチド配列は、好ましくは、表２からの前記第１のエクソンと第２のエクソンとの間の同一性の領域に結合でき、ハイブリダイズでき、標的化でき、及び／又は逆相補的であり、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチド、より好ましくは４０ヌクレオチド未満又はより好ましくは３０ヌクレオチド未満、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満及び最も好ましくは２０から２５ヌクレオチドの長さを有する。ここで、逆相補的とは、好ましくは、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。
一実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドは、第１のジストロフィンエクソン及び第２のジストロフィンエクソンが表１、２又は６に記載されたものであり、前記オリゴヌクレオチドが、表２又は６に記載され、配列番号１７から１６７０、１７４２、１７４３又は１７６６から１７７７に定義されている対応する第１のエクソン及び第２のエクソンの領域に結合できるようなものである。
好ましいオリゴヌクレオチドは表３に開示されたものであり、配列番号１６７１〜１７４１を含むか又はからなる。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、表６に開示されている配列番号１７７８〜１８９１を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６７１〜１７４１又は１７７８〜１８９１を含み、表３又は６に与えられているそれらの配列番号の配列よりも１、２、３、４若しくは５多いヌクレオチド又は１、２、３、４若しくは５少ないヌクレオチドを有する。これらのさらなるヌクレオチドは所与の配列番号の配列の５’又は３’側に存在し得る。これらの欠損ヌクレオチドは、所与の配列番号の配列の５’側又は３’側に存在するヌクレオチドであり得る。これらのオリゴヌクレオチドの各々は、上述の化学物質又はそれらの組み合わせのいずれかを有してもよい。本明細書において配列番号により識別されているオリゴヌクレオチドの各々において、ＵはＴに置き換えられてもよい。
より好ましいオリゴヌクレオチドは以下に示される。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン８であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１９である場合、エクソン８の好ましい領域は配列番号１７を含むか又はからなり、エクソン１９の好ましい領域は配列番号１８を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７２２若しくは１７２３からなるか又は配列番号１７２２若しくは１７２３を含み、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１３である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１０１を含むか又はからなり、エクソン１３の好ましい領域は配列番号１０２を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１４である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１０３を含むか又はからなり、エクソン１４の好ましい領域は配列番号１０４を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１５である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１０５を含むか又はからなり、エクソン１５の好ましい領域は配列番号１０６を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１８である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１０９を含むか又はからなり、エクソン１８の好ましい領域は配列番号１１０を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは以下を含む：
配列番号１６７９〜１６８１、１７７８、１８１２、１８１３、１８８４〜１８８６、１８９０若しくは１８９１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８１４に定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８１５〜１８１９のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２０、１８２４のいずれか１つに定義され、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２６、１７８２、１８３２のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２１、１８２５、１７８０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２２のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２３、１７８１、１８２９、１８３０、１８３１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、
配列番号１８８７のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８８８若しくは１８８９のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２７に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８２８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１８である場合、エクソン１０の別の好ましい領域は配列番号１７６６を含むか又はからなり、エクソン１８の別の好ましい領域は配列番号１７６７を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１７８３、１８３３、１８３４、１８３５のいずれか１つに定義され、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン１８である場合、エクソン１０の別の好ましい領域は配列番号１７６８を含むか又はからなり、エクソン１８の別の好ましい領域は配列番号１７６９を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１６７３若しくは１６７４のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン２０である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１１１を含むか又はからなり、エクソン２０の好ましい領域は配列番号１１２を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン２７である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１２１を含むか又はからなり、エクソン２７の好ましい領域は配列番号１２２を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン３０である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１２７を含むか又はからなり、エクソン３０の好ましい領域は配列番号１２８を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、
配列番号１６７９〜１６８１、１８１２、１８１３、１８８４〜１８８６、１８９０若しくは１８９１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８１４に定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１６７５若しくは１６７６に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１６７７若しくは１６７８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７８４、１８３６のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７８６、１８３８のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７８０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７８５、１８３７のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン３０である場合、エクソン１０の別の好ましい領域は配列番号１７７２を含むか又はからなり、エクソン３０の別の好ましい領域は配列番号１７７３を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、
配列番号１６８８、１６８９、１８３９、１８４０、１８４１、１８４２、１８４３若しくは１８４４のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８４５、１８４６、１８４７、１８４８のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８４９、１８５０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７８７、１８５１のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン３１である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１２９を含むか又はからなり、エクソン３１の好ましい領域は配列番号１３０を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン３２である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１３１を含むか又はからなり、エクソン３２の好ましい領域は配列番号１３２を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン３５である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１３７を含むか又はからなり、エクソン３５の好ましい領域は配列番号１３８を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン４２である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１５１を含むか又はからなり、エクソン４２の好ましい領域は配列番号１５２を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン４４である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１５３を含むか又はからなり、エクソン４４の好ましい領域は配列番号１５４を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン４７である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１５７を含むか又はからなり、エクソン４７の好ましい領域は配列番号１５８を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン４８である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１５９を含むか又はからなり、エクソン４８の好ましい領域は配列番号１６０を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５５である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１６７を含むか又はからなり、エクソン５５の好ましい領域は配列番号１６８を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５７である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１６９を含むか又はからなり、エクソン５７の好ましい領域は配列番号１７０を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン６０である場合、エクソン１０の好ましい領域は配列番号１７３を含むか又はからなり、エクソン６０の好ましい領域は配列番号１７４を含むか又はからなる。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６７３からなるか又は配列番号１６７３を含み、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６７５からなるか又は配列番号１６７５を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６７７からなるか又は配列番号１６７７を含み、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６７９からなるか又は配列番号１６７９を含み、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６７９の塩基配列を含み、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。任意選択で、配列番号１６７９のＵの１、２、３、４、５、６、７はＴに置き換えられる／置き換えられている。好ましい実施形態において、配列番号１６７９のすべてのＵはＴに置き換えられている。配列番号１６７９を含む好ましいオリゴヌクレオチドは上述のいずれかの化学的性質：塩基修飾及び／又は糖修飾及び／又は骨格修飾を含む。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６８１からなるか又は配列番号１６８１を含み、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６８４からなるか又は配列番号１６８４を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６８５からなるか又は配列番号１６８５を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６８６からなるか又は配列番号１６８６を含み、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６８８からなるか又は配列番号１６８８を含み、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６８８の塩基配列を含み、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。任意選択で、配列番号１６８８のＵの１、２、３、４、５、６はＴに置き換えられる／置き換えられている。好ましい実施形態において、配列番号１６８８のすべてのＵはＴに置き換えられている。配列番号１６８８を含む好ましいオリゴヌクレオチドは本明細書で上記に定義されているいずれかの化学的性質：塩基修飾及び／又は糖修飾及び／又は骨格修飾を含む。
配列番号１６７３、１６７５、１６７７、１６７９、１６８１、１６８４、１６８５、１６８６及び１６８８によって表されるオリゴヌクレオチドの各々について、第１のジストロフィンエクソンはエクソン１０である。しかしながら、第２のジストロフィンエクソンはエクソン１３、１４、１５、１８、２０、２７、３０、３１、３２、３５、４２、４４、４７、４８、５５、５７又は６０である。このことは、これらのオリゴヌクレオチドのいずれかを使用することにより、インフレーム転写物のいくつかの形成が起こり得、各々が、切断されてはいるものの（半）機能的ジストロフィンタンパク質の産生を導くことを意味する。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１１であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン２３である場合、エクソン２３の好ましい領域は配列番号１９１を含むか又はからなり、エクソン２３の好ましい領域は配列番号１９２を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、
配列番号１７９４、１８６１、１７９５、１８６２のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７９６、１８６３、１７９７、１８６４のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１７９８、１８６５、１７９９、１８６６のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン１３であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン３０である場合、エクソン１３の好ましい領域は配列番号２８５を含むか又はからなり、エクソン３０の好ましい領域は配列番号２８６を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、
配列番号１８０８、１８６７、１８０９、１８６８、１８１０、１８６９、１８５８、１８７３のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、
配列番号１８１１、１８７０、１８５９、１８７４のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８５６、１８７１、１８６０、１８７５のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８５７、１８７２のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン２３であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン４２である場合、エクソン２３の好ましい領域は配列番号７７６を含むか又はからなり、エクソン４２の好ましい領域は配列番号７７７を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１６９８〜１７０３を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン３４であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５３である場合、エクソン３４の好ましい領域は配列番号１２９４を含むか又はからなり、エクソン５３の好ましい領域は配列番号１２９５を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、
配列番号１８００、１８７６、１８０１、１８７７のいずれか１つに定義され、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８０２、１８７８、１８０３、１８７９のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４０であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５３である場合、エクソン４０の好ましい領域は配列番号１４７７を含むか又はからなり、エクソン５３の好ましい領域は配列番号１４７８を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、
配列番号１８０４、１８８０のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
配列番号１８０５、１８８１のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４４であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５６である場合、エクソン４４の好ましい領域は配列番号１５７７を含むか又はからなり、エクソン５６の好ましい領域は配列番号１５５８を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１８０６、１８８２、１８０７、１８８３のいずれか１つに定義され、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４５であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５１である場合、エクソン４５の好ましい領域は配列番号１５６７を含むか又はからなり、エクソン５１の好ましい領域は配列番号１５６８を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７３０〜１７３１を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４５であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５３である場合、エクソン４５の好ましい領域は配列番号１５６９を含むか又はからなり、エクソン５３の好ましい領域は配列番号１５７０を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７３２〜１７３７を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４５であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５５である場合、エクソン４５の好ましい領域は配列番号１５７１を含むか又はからなり、エクソン５５の好ましい領域は配列番号１５７２を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７０４〜１７１９、１７８８、１８５２、１７８９、１８５３を含むか又はからなる。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７０６からなるか又は配列番号１７０６を含み、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。配列番号１７０６を含み、２５ヌクレオチドの長さを有する好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７０６からなる。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７０７からなるか又は配列番号１７０７を含み、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。配列番号１７０７を含み、２５ヌクレオチドの長さを有する好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７０６からなる。
好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７１３からなるか又は配列番号１７１３を含み、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。配列番号１７１３を含み、２５ヌクレオチドの長さを有する好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７１０からなる。
好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１７８８、１８５２、１７８９、１８５３のいずれか１つに定義されている塩基配列を含み、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４５であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン５５である場合、エクソン４５の別の好ましい領域は配列番号１７７４を含むか又はからなり、エクソン５５の別の好ましい領域は配列番号１７７５を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１７９０、１８５４、１７９２、１８５５のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列を含む。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン４５であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン６０である場合、エクソン４５の好ましい領域は配列番号１５７７を含むか又はからなり、エクソン６０の好ましい領域は配列番号１５７８を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７３８〜１７４１を含むか又はからなる。
第１のジストロフィンエクソンがエクソン５６であり、第２のジストロフィンエクソンがエクソン６０である場合、エクソン５６の好ましい領域は配列番号１７４２を含むか又はからなり、エクソン６０の好ましい領域は配列番号１７４３を含むか又はからなる。好ましいオリゴヌクレオチドは配列番号１７２０〜１７２１を含むか又はからなる。
より好ましいオリゴヌクレオチドは以下を含む。
（ａ）配列番号１６７３若しくは１６７４に定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｂ）配列番号１６７５若しくは１６７６に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｃ）配列番号１６７７若しくは１６７８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｄ）配列番号１６７９〜１６８１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｅ）配列番号１６８４〜１６８６のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｆ）配列番号１６８８若しくは１６８９に定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｇ）配列番号１７０４〜１７０６のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、
（ｈ）配列番号１７０７〜１７０９のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｉ）配列番号１７１０、１７１３〜１７１７のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列。
さらに好ましいオリゴヌクレオチドは以下を含む。
（ａ）配列番号１６７９〜１６８１、１７７８、１８１２、１８１３、１８８４〜１８８６、１８９０若しくは１８９１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有するか、又は配列番号１８１４に定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｂ）配列番号１６８８、１６８９又は１８３９〜１８４４に定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｃ）配列番号１６７３又は１６７４に定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｄ）配列番号１６７５又は１６７６に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｅ）配列番号１６７７又は１６７８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｆ）配列番号１６８４〜１６８６のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｇ）配列番号１７０４〜１７０６のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｈ）配列番号１７０７〜１７０９のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｉ）配列番号１７１０、１７１３〜１７１７のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｊ）配列番号１８１５〜１８１９のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｋ）配列番号１８２０、１８２４のいずれか１つに定義され、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｌ）配列番号１８２６、１７８２、１８３２のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｍ）配列番号１８２１、１８２５、１７８０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｎ）配列番号１８２２のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｏ）配列番号１８２３、１７８１、１８２９、１８３０、１８３１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｐ）配列番号１７８３、１８３３、１８３４、１８３５のいずれか１つに定義され、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｑ）配列番号１８８７のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｒ）配列番号１８８８又は１８８９のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｓ）配列番号１８２７に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｔ）配列番号１８２８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｕ）配列番号１７８４、１８３６のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｖ）配列番号１７８６、１８３８のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｗ）配列番号１７８０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｘ）配列番号１７８５、１８３７のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｙ）配列番号１８４５、１８４６、１８４７、１８４８のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｚ）配列番号１８４９、１８５０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ａ１）配列番号１７８７、１８５１のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｂ１）配列番号１７８８、１８５２、１７８９、１８５３のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｃ１）配列番号１７９０、１８５４、１７９２、１８５５のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｄ１）配列番号１７９４、１８６１、１７９５、１８６２のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｅ１）配列番号１７９６、１８６３、１７９７、１８６４のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｆ１）配列番号１７９８、１８６５、１７９９、１８６６のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｇ１）配列番号１８０８、１８６７、１８０９、１８６８、１８１０、１８６９、１８５８、１８７３のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｈ１）配列番号１８１１、１８７０、１８５９、１８７４のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｉ１）配列番号１８５６、１８７１、１８６０、１８７５のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｊ１）配列番号１８５７、１８７２のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｋ１）配列番号１８００、１８７６、１８０１、１８７７のいずれか１つに定義され、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｌ１）配列番号１８０２、１８７８、１８０３、１８７９のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｍ１）配列番号１８０４、１８８０のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｎ１）配列番号１８０５、１８８１のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
（ｏ１）配列番号１８０６、１８８２、１８０７、１８８３のいずれか１つに定義され、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列。
配列番号によって定義されている配列を含むか又はからなる本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号によって定義されている塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを包含することを意味する。また、配列番号によって定義されている塩基配列に対して修飾骨格（すなわち修飾糖部分及び／又は修飾ヌクレオシド間結合）を有するオリゴヌクレオチドは本発明に包含される。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの配列番号における各々の塩基ＵはＴで修飾されてもよいか又は置き換えられてもよい。
組成物：
さらなる態様において、「オリゴヌクレオチド」という標題のセクションに記載されているオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。この組成物は、好ましくは、上記のオリゴヌクレオチドを含むか又はからなる。好ましい組成物は上記の１つの単一オリゴヌクレオチドを含む。したがって、少なくとも前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピングは、１つの単一オリゴヌクレオチドを使用し、異なるオリゴヌクレオチドのカクテルを使用せずに得られることは明らかである。
好ましい実施形態において、前記組成物は医薬としての使用のためである。したがって、前記組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、通常、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。好ましい実施形態において、本発明の組成物は本明細書に定義されている化合物を含み、薬学的に許容される製剤、充填剤、防腐剤、可溶化剤、担体、希釈剤、賦形剤、塩、アジュバント及び／又は溶剤を任意選択でさらに含む。このような薬学的に許容される担体、充填剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤、塩、アジュバント、溶剤及び／又は賦形剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎに見出される。本発明に記載されている化合物は少なくとも１つのイオン性基を有する。イオン性基は塩基又は酸であってもよく、帯電されていてもよく又は中性であってもよい。イオン性基は、反対の電荷を有する適切な対イオンとのイオン対として存在してもよい。陽イオン性の対イオンの例は、ナトリウム、カリウム、セシウム、トリス、リチウム、カルシウム、マグネシウム、トリアルキルアンモニウム、トリエチルアンモニウム及びテトラアルキルアンモニウムである。陰イオン性の対イオンの例は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、乳酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ジクロロ酢酸塩及びクエン酸塩である。対イオンの例は記載されている（Ｋｕｍａｒ Ｌ．（その全体は参照により本明細書に組み込まれている））。したがって、好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、このようなイオン性基、好ましくはＣａ２＋を含む組成物と接触して、本明細書に既に定義されているこのような多価陽イオンによって連結された２つ以上の同一のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドキレート錯体を形成する。
医薬組成物は、前記化合物の安定性、溶解度、吸収性、バイオアベイラビリティ、薬物動態及び細胞取り込みを増強することをさらに補助するように、特に、複合体、ナノ粒子、微小粒子、ナノチューブ、ナノゲル、ヒドロゲル、ポロキサマー又はプルロニック、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、コロイド、マイクロバブル、ベシクル、ミセル、リポプレックス及び／又はリポソームを形成できる賦形剤又はコンジュゲートを含む製剤にさらに製剤化されてもよい。ナノ粒子の例には、ポリマーナノ粒子、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、シリカナノ粒子、脂質ナノ粒子、糖粒子、タンパク質ナノ粒子及びペプチドナノ粒子が含まれる。
好ましい組成物は、前記組成物及び／又は前記オリゴヌクレオチドの筋肉及び／又は細胞内への標的化及び／又は送達を増強するのをさらに補助し得る少なくとも１つの賦形剤を含む。細胞は筋細胞であってもよい。
別の好ましい組成物は第２のタイプの賦形剤として分類される少なくとも１つの賦形剤を含んでもよい。第２のタイプの賦形剤は、例えば筋組織又は筋細胞といった、組織及び／又は細胞への、及び／又は組織及び／又は細胞内への、本発明の組成物及び／又はオリゴヌクレオチドの標的化及び／又は送達を増強するために、本明細書に記載されているコンジュゲート基を含み得又は含有し得る。両方のタイプの賦形剤は本明細書に記載されている１つの単一組成物内に一緒に組み合わされてもよい。好ましいコンジュゲート基は定義のパートに開示されている。
当業者は、本発明における使用のための化合物を製剤化し、送達するために、上記又は他の代替の賦形剤及び送達系の１つ又は複数を選択でき、組み合わせることができ、及び／又は適合させることができる。
本発明のこのような医薬組成物は、設定時間にて有効濃度で、動物、好ましくは哺乳動物に投与され得る。より好ましい哺乳動物はヒトである。本発明に従う使用のための本明細書に定義されている化合物又は組成物は、個体の細胞、組織及び／又は器官へのインビボでの直接投与に好適であり得、前記個体はＢＭＤ又はＤＭＤに罹患しているか、又はそれらを発症するリスクがあることが好ましく、インビボ、エキソビボ又はインビトロで直接投与され得る。投与は、全身及び／又は非経口経路、例えば、静脈内、皮下、脳室内、髄腔内、筋肉内、鼻腔内、腸内、硝子体内、脳内、硬膜外又は経口経路を介してであってもよい。このような本発明の医薬組成物は、経口送達のための乳剤、懸濁剤、丸剤、錠剤、カプセル剤若しくは軟質ゲル剤の形態で、又は気道及び肺に送達するためのエアゾール剤若しくは乾燥粉末剤の形態でカプセル化され得ることが好ましい。
一実施形態において、本発明の化合物は前記疾患の治療に使用されることが既に知られている別の化合物と一緒に使用されてもよい。このような他の化合物は、疾患の進行を減速させるため、例えば異常行動又は動作を低下させるため、筋組織炎症を低下させるため、筋繊維の機能、完全性及び／又は生存を改善するため、及び／又は心臓機能を改善、増加若しくは修復するために使用され得る。例は、限定されないが、ステロイド、好ましくは（糖質）コルチコステロイド、ＡＣＥ阻害剤（好ましくはペリンドプリル）、アンジオテンシンＩＩ １型受容体遮断薬（好ましくはロサルタン）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤（好ましくはデコリン）、ヒト組換えビグリカン、ｍＩＧＦ−１源、ミオスタチン阻害剤、マンノース−６−リン酸、抗酸化剤、イオンチャネル阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤（好ましくはシルデナフィル又はタダラフィルなどのＰＤＥ５阻害剤）、Ｌ−アルギニン、ドーパミン遮断薬、アマンタジン、テトラベナジン及び／又はコエンザイムＱ１０である。この組み合わせた使用は逐次使用であってもよい：各成分は異なる組成物で投与される。あるいは、各化合物は単一組成物中で一緒に使用されてもよい。
使用：
さらなる態様において、医薬として若しくは療法の一部としての使用のための本明細書に記載の組成物若しくは化合物の使用、又は化合物がその活性を細胞内に与える適用が提供される。
好ましい実施形態において、本発明の化合物又は組成物は医薬としての使用のためであり、その医薬は、本明細書に定義されている疾患、好ましくはＤＭＤ又はＢＭＤを予防、遅延、改善及び／又は治療するためである。
疾患を予防、遅延、改善及び／又は治療するための方法：
さらなる態様において、本明細書に定義されている疾患、好ましくはＤＭＤ又はＢＭＤを予防、遅延、改善及び／又は治療するための方法が提供される。前記疾患は、個体において、前記個体の細胞、組織又は器官において予防、治療、遅延又は改善され得る。方法は、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする前記個体又は対象に投与するステップを含む。
本発明に係る方法は、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチド又は組成物が、個体、好ましくは、ＢＭＤ又はＤＭＤに罹患しているか又はこのような疾患を発症するリスクのある個体のインビボでの細胞、組織及び／又は器官への投与に好適であり得、インビボ、エキソビボ又はインビトロで投与され得る。必要とする個体又は対象は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
一実施形態において、本発明の方法において、オリゴヌクレオチド又は組成物の濃度は０．０１ｎＭから１μＭの範囲である。使用される濃度は０．０２から４００ｎＭ、０．０５から４００ｎＭ又は０．１から４００ｎＭであることがより好ましく、０．１から２００ｎＭであることがさらに好ましい。
本発明に係るオリゴヌクレオチド又は組成物の用量範囲は、好ましくは、厳格なプロトコル要件が存在する臨床試験（インビボでの使用）における漸増用量研究に基づいて設計される。本明細書に定義されているオリゴヌクレオチドは、０．０１から２００ｍｇ／ｋｇ又は０．０５から１００ｍｇ／ｋｇ又は０．１から５０ｍｇ／ｋｇ又は０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５から１０ｍｇ／ｋｇの範囲である用量で使用され得る。
上記に与えられているオリゴヌクレオチド又は組成物の濃度又は用量の範囲は、インビトロ又はエキソビボでの使用のための好ましい濃度又は用量である。当業者は、使用されるオリゴヌクレオチドの同一性に応じて、治療される標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される媒体並びにトランスフェクション及びインキュベーション条件、使用される前記オリゴヌクレオチドの濃度又は用量をさらに変化させてもよく、さらに最適化することを必要とする場合があることを理解するであろう。
定義：
当分野において公知の「配列同一性」は、配列を比較することによって決定される場合、２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド又はヌクレオチド）配列間の関係である。当分野において、「同一性」又は「類似性」は、このような配列の鎖間の一致によって決定される場合、核酸配列間の配列関連性の程度を示す。「同一性」は本明細書において「類似性」に置き換えられてもよい。同一性は、本明細書に記載されている全配列番号を比較することによって決定されることが好ましい。しかしながら、配列の一部も使用され得る。ここで、配列の一部は、所与の配列又は配列番号の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味し得る。
「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ、Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．、及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３ （１９８８）に記載されているものを含む公知の方法によって容易に計算され得る。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるために設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公表されているコンピュータプログラムにおいて成文化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ （１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が含まれる。データベース類似性検索のために使用され得るプログラムのＢＬＡＳＴ２．０ファミリーには、例えば、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列についてのＢＬＡＳＴＮが含まれる。ＢＬＡＳＴ２．０ファミリープログラムは、ＮＣＢＩ及び他の発信元（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用されてもよい。
核酸比較のための好ましいパラメータには以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリクス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長さペナルティ：３。Ｇａｐプログラムとして、ウィスコンシン州、マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ製のＧａｐプログラムが利用可能である。上記に与えられているのは核酸比較についてのデフォルトパラメータである。
配列類似性及び同一性を決定するための別の好ましい方法はアルゴリズムＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３、Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３） Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｉｎ Ｄ． Ｓａｎｋｏｆｆ及びＪ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ編、Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、ｐｐ．１−４４ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）を使用することによる。
配列類似性及び同一性を決定するための別の好ましい方法は、ＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒ及びＷａｔｅｒｍａｎ−Ｅｇｇｅｒｔアルゴリズム（２つの配列の局所アラインメント；［Ｓｃｈｏｎｉｇｅｒ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９２、Ｖｏｌ．５４（４）、ｐｐ．５２１−５３６；Ｖｉｎｇｒｏｎ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９９４；２３５（１）、ｐ１−１２．］）を使用することによる。以下のウェブサイトを使用することができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ又はｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｍｂｏｓｓ／ｍａｔｃｈｅｒ。このアルゴリズムに使用されるパラメータの定義は以下のウェブサイトに見出される：ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｄｏｃｓ／ｔｈｅｍｅｓ／ＡｌｉｇｎＦｏｒｍａｔｓ．ｈｔｍｌ＃ｉｄ。デフォルト設定（マトリクス：ＥＤＮＡＦＵＬＬ、ギャップ＿ペナルティ：１６、伸長＿ペナルティ：４）が使用されることが好ましい。Ｅｍｂｏｓｓ Ｍａｔｃｈｅｒは２つの配列間で最適な局所アラインメントを提供するが、代替のアラインメントが同様に提供される。表２は、２つの異なるエクソン、好ましくは、オリゴヌクレオチド設計のために使用される、好ましくは、ジストロフィンエクソンの間の最適な局所アラインメントを開示している。しかしながら、代替のアラインメント及びそれによる２つのエクソンの間の代替の同一性領域も、オリゴヌクレオチド設計（これも本発明の一部である。）のために同定及び使用され得る。
本明細書全体にわたって、「結合する」、「標的化する」、「ハイブリダイズする」という用語は、本明細書に記載されているｍＲＮＡ前駆体の領域に逆相補的であるオリゴヌクレオチドの文脈で使用される場合、交換可能に使用され得る。同様に、「結合できる」、「標的化できる」及び「ハイブリダイズできる」という表現は、オリゴヌクレオチドが、標的配列に結合でき、標的化でき、又はハイブリダイズできる、特定の配列を有することを示すために交換可能に使用され得る。標的配列が本明細書に定義されているか又は当分野において知られている場合はいつでも、当業者は、逆相補的の概念を使用して、前記オリゴヌクレオチドのすべての可能な構造を構築できる。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドと、第１のエクソン及び／又は第２のエクソンにおける標的配列との間の限定された数の配列のミスマッチ又はギャップは、結合が影響されない限り、上記で説明されているように、許容可能であることは理解されるであろう。したがって、特定の標的配列に結合できるオリゴヌクレオチドは標的配列に逆相補的であるオリゴヌクレオチドと考慮され得る。本発明の文脈において、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズできる」は、細胞、好ましくは特に断らない限りヒト細胞内で、生理的条件下で使用される。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的オリゴヌクレオチド化合物（例えば、アンチセンス化合物及びその標的核酸）の対合を指す。特定の機序によって限定されないが、対合の最も一般的な機序は、相補的ヌクレオシド若しくはヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間の、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は反転したフーグスティーン水素結合であり得る、水素結合を含む。例えば、天然塩基アデニンは、水素結合の形成により対合する、天然核酸塩基チミン、５−メチルウラシル及びウラシルに相補的な核酸塩基である。天然塩基グアニンは、天然塩基シトシン及び５−メチルシトシンに相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは可変状況下で起こり得る。
同様に、「逆相補的」は、互いにハイブリダイズできるが、配列の一方が３’から５’に方向付けられ、他方が逆方向、つまり５’から３’に方向付けられる、２つのヌクレオチド配列を特定するために使用される。したがって、第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオシドＡは、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオシドＡ＊と、それらのそれぞれの核酸塩基を介して対合でき、第１のヌクレオチド配列において上述のヌクレオシドＡから５’位に位置するヌクレオシドＢは、第２のヌクレオチド配列において上述のヌクレオシドＡ＊から３’位に位置するヌクレオシドＢ＊と対合できる。本発明の文脈において、第１のヌクレオチド配列は、典型的に、本発明のオリゴヌクレオチドであり、第２のヌクレオチド配列部分は、ｍＲＮＡ前駆体、好ましくはジストロフィンｍＲＮＡ前駆体由来のエクソンである。オリゴヌクレオチドが、前記第１のエクソン及び／又は第２のエクソンの前記領域と少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％逆相補的である場合、前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、エクソン（第１のエクソン及び／又は第２のエクソン）の領域に逆相補的であるといわれる。逆相補的は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％であることが好ましい。
本発明において、賦形剤には、ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、デキストラン誘導体、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）、ヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、カダベリン）、キトサン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エステルアミン）、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、コロミン酸及びこれらの誘導体）、デンドリマー（例えば、ポリ（アミドアミン））、脂質｛例えば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ホスファチジルコリン誘導体［例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）］、リゾ−ホスファチジルコリン誘導体［例えば、１−ステアロイル−２−リゾ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−リゾＰＣ）］、スフィンゴミエリン、２−｛３−［ビス−（３−アミノ−プロピル）−アミノ］−プロピルアミノ｝−Ｎ−ジテトラセジルカルバモイルメチルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）、ホスホグリセロール誘導体［例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、ナトリウム塩（ＤＰＰＧ−Ｎａ）、ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｃｉｄ ａｃｉｄ）誘導体［１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸、ナトリウム塩（ＤＳＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン誘導体［例えば、ジオレオイル−−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）］、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、（１，２−ジミリスチオルキシプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｏｌｘｙｐｒｏｐｙｌ）−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、（Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、（ｂ−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレリル−アミドトリヒドロクロリド（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン誘導体［例えば、１，２−ジステアロイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｏＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ホスファチジルセリン誘導体［１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、ナトリウム塩（ＤＯＰＳ）］、コレステロール｝、タンパク質（例えば、アルブミン、ゼラチン、アテロコラーゲン（ａｔｅｌｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ））及びペプチド（例えば、プロタミン、ＰｅｐＦｅｃｔ、ＮｉｃｋＦｅｃｔ、ポリアルギニン、ポリリシン、ＣＡＤＹ、ＭＰＧ）が含まれる。
本発明において、コンジュゲート基は、標的部分、安定性増強部分、取り込み増強部分、溶解度増強部分、薬物動態増強部分、薬力学増強部分、活性増強部分、レポーター分子及び薬物からなる群から選択され、これらの部分は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、エチレングリコール誘導体、ビタミン、脂質、ポリフルオロアルキル部分、ステロイド、コレステロール、蛍光部分及び放射活性物質で標識した部分であってもよい。コンジュゲート基は任意選択で保護され得、また、本発明のオリゴヌクレオチドに直接又は二価若しくは多価リンカーを介して結合していてもよい。
コンジュゲート基には、標的化、取り込み、溶解度、活性、薬力学、薬物動態を増強し、毒性を減少する部分が含まれる。このような基の例には、ペプチド（例えば、グルタミン、ポリアルギニン、ＲＸＲペプチド（例えば、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００９、５３、５２５を参照のこと）、ポリオルニチン、ＴＡＴ、ＴＰ１０、ｐＡｎｔｐ、ポリリシン、ＮＬＳ、ペネトラチン、ＭＳＰ、ＡＳＳＬＮＩＡ、ＭＰＧ、ＣＡＤＹ、Ｐｅｐ−１、Ｐｉｐ、ＳＡＰ、ＳＡＰ（Ｅ）、トランスポータン、ブフォリンＩＩ、ポリミキシンＢ、ヒスタチン、ＣＰＰ５、ＮｉｃｋＦｅｃｔ、ＰｅｐＦｅｃｔ）、ビボ−ポーター（ｖｉｖｏ−ｐｏｒｔｅｒ）、タンパク質（例えば、抗体、アビジン、Ｉｇ、トランスフェリン、アルブミン）、炭水化物（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、マルトリオース、リボース、トレハロース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラクトース、スクロース、フコース、アラビノース、タロース、シアル酸、ヒアルロン酸、ノイラミジニック酸（ｎｅｕｒａｍｉｄｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、ラムノース、キノボース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、リキソース、フルクトース、マンノース−６−ホスフェート、２−デオキシリボース、グルカール、セルロビオース（ｃｅｌｌｕｌｏｂｉｏｓｅ）、キトビオース、キトトリオース）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、ポリ（アミドアミン））、エチレングリコール誘導体（例えば、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール）、水溶性ビタミン（例えば、ビタミンＢ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ）、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｄ２、Ｄ３、Ｅ、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）、脂質（例えば、パルミチル、ミリスチル、オレイル、ステアリル、バチル、グリセロリン脂質、グリセロ脂質、スフィンゴ脂質、セラミド、セレブロシド、スフィンゴシン、ステロール、プレノール、エルシル、アラキドニル、リノレイル、リノレニル、アラキジル、ブチリル、サペイニル（ｓａｐｅｉｎｙｌ）、エライジル（ｅｌａｉｄｙｌ）、ラウリル、ベヘニル、ノニル、デシル、ウンデシル、オクチル、ヘプチル、ヘキシル、ペンチル、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、テルフェニル（ｔｅｒｐｅｎｙｌ）、ジテルペノイド、トリテルペルノイド（ｔｒｉｔｅｒｐｅｒｎｏｉｄ）、ポリフルオロアルキル部分（例えば、ペルフルオロ［１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ］−アルキル）、特異的タンパク質に対する親和性を有する分子量＜１５００Ｄａの承認された薬物（例えば、イブプロフェンなどのＮＳＡＩＤ（多くは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６５６，７３０号に記載されている））、抗うつ剤、抗ウイルス剤、抗生物質、アルキル化剤、抗アメーバ剤、鎮痛剤、アンドロゲン、ＡＣＥ阻害剤、食欲抑性剤、制酸剤、駆虫剤、抗血管形成剤、抗アドレナリン作動薬、抗狭心剤、抗コリン剤、抗凝固剤、抗けいれん剤、抗糖尿病剤、止瀉薬、抗利尿剤、解毒剤、抗真菌剤、制吐剤、抗げんうん剤、抗痛風剤、抗性腺刺激剤（ａｎｔｉｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃｓ）、抗ヒスタミン剤、抗高脂血症剤、降圧剤、抗マラリア剤（ａｎｔｉｍａｌｒｉａｌｓ）、抗片頭痛剤、抗腫瘍剤、抗精神病剤、抗リウマチ剤、抗甲状腺剤、抗毒素、鎮咳剤、抗不安剤、避妊剤、ＣＮＳ刺激剤、キレート剤、心血管剤、充血除去剤、皮膚病剤、利尿剤、去痰剤、診断剤、胃腸薬、麻酔剤、グルココルチコイド、抗不整脈剤（ａｎｔｉａｒｒｈｙｔｍｉｃｓ）、免疫賦活剤、免疫抑制剤、下剤、抗ハンセン病剤（ｌｅｐｒｏｓｔａｔｉｃｓ）、代謝剤、呼吸器剤、粘液溶解剤、筋弛緩剤、栄養補助剤、血管拡張剤、血栓溶解剤、子宮収縮剤、昇圧剤）、分子量＜２０００Ｄａの天然化合物（例えば、抗生物質、エイコサノイド、アルカロイド、フラボノイド、テルペノイド、酵素補因子、ポリケチド）、ステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ラノステロール、コール酸、エストラン、アンドロスタン、プレグナン、コラン、コレスタン、エルゴステロール、コレステロール、コルチゾール、コルチゾン、デフラザコート）、五環トリテルペノイド（例えば、１８β−グリシルレチン酸、ウルソール酸、アミリン、カルベノロキソン（ｃａｒｂｅｎｏｌｏｘｏｎｅ）、エノキソロン、アセトキソロン、ベツリン酸、アジア酸、エリトロジオール、オレアノール酸）、ポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレッシン、カダベリン）、蛍光部分（例えば、ＦＡＭ、カルボキシフルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣＷ８００、ＢＯＤＩＰＹ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｓ、Ｄａｂｃｙｌ、ＤＮＰ）、レポーター分子（例えば、アクリジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、（放射性）同位体で標識された部分（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、５７Ｃｏ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５３Ｇｄ））及びそれらの組み合わせが含まれる。このようなコンジュゲート基は、本発明の化合物に直接又はリンカーを介して接続されてもよい。このリンカーは、二価（１：１コンジュゲートを生じる）又は１つより多いコンジュゲート基を有するオリゴマーを生じる多価であってもよい。直接又はリンカーを介してのいずれかで、本発明に係るオリゴマーにこのようなコンジュゲート基をカップリングするための手順は当分野において公知である。また、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１２１９２（その全体が参照により本明細書に組み込まれている；Ｈｕｒｓｔら）に記載されているように、このような構築物が球形核酸（ＳＮＡ）と呼ばれる範囲で、本発明のオリゴヌクレオチドが共有結合されるナノ粒子の使用も本発明の文脈内にある。
本明細書において、「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用は、その用語の後の事項が含まれることを意味するためにその非限定的な意味で使用されるが、詳細に述べられていない事項が排除されるわけではない。さらに、「からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」という動詞は、「から本質的になる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置き換えられてもよく、本明細書に定義されているオリゴヌクレオチド又は組成物は、具体的に記載されているもの以外のさらなる成分を含んでもよく、前記さらなる成分は本発明の固有の特性を変化させないことを意味する。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、１つ及び１つのみの要素であると文脈が明確に必要としない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
数値（約１０）に関して使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、その値が、その値の１０より１％多い又は少ない所与の値であり得ることを好ましくは意味する。
本明細書に記載されている各々の実施形態は、特に断らない限り一緒に組み合わされてもよい。本明細書に引用されているすべての特許及び参考文献はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
［表１〜３］
表１：
エクソンＵ＋１（第１のエクソン）からＤ−１（第２のエクソン）まで及び間にある任意のエクソンが転写物から除去される場合、エクソンＵ（上流）がエクソンＤ（下流）とともに連続的なオープンリーディングフレームを有するＤＭＤ遺伝子転写物における可能なエクソン組み合わせのリスト。
表２：
エクソン領域のリスト。デフォルト設定（マトリクス：ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ギャップ＿ペナルティ：１６；伸長＿ペナルティ：４）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｍａｔｃｈｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）を使用したＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒによって最適なペアワイズアラインメントとして同定される、２つの異なるジストロフィンエクソンの間で（部分的に）高い配列同一性又は類似性（少なくとも５０％）を有する配列ストレッチ。これらのエクソン及び好ましくは間にある任意のエクソンのスキッピングは、（例えば表１の）インフレームＤＭＤ転写物を生じる。
表３：
本発明に係るオリゴヌクレオチドの好ましい塩基配列のリスト。これらの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは、（例えば表２に記載の）２つの異なるＤＭＤエクソンにおける高い類似性の領域（＞５０％の同一性を有する配列ストレッチ）に結合でき、これらの２つのエクソン及び間にある任意のエクソンのスキッピングを誘導してインフレームＤＭＤ転写物を生成することができる。

＊ Ｄ＝２，６−ジアミノプリン；Ｃ＝５−メチルシトシン；Ｘ＝Ｃ又は５−メチルシトシン；Ｙ＝Ｕ又は５−メチルウラシル；Ｚ＝Ａ又は２，６−ジアミノプリン
表６：
最も好ましい及び／又はさらなるエクソン組み合わせ、最も好ましい及び／又はさらなるエクソン同一性領域、及び最も好ましい及び／又はさらなるオリゴヌクレオチドを、それらの塩基配列、化学修飾及び配列番号（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）とともに示したリスト。リスト中、＊＝ＬＮＡ；Ｃ＝５−メチルシトシン；Ｕ＝５−メチルウラシル；Ｄ＝２，６−ジアミノプリン；Ｘ＝Ｃ又は５−メチルシトシン；Ｙ＝Ｕ又は５−メチルウラシル；Ｚ＝Ａ又は２，６−ジアミノプリン；＜＞はすべて２’−フルオロヌクレオチド（例えば配列番号１８４４）。
［実施例１〜５］
材料及び方法：
オリゴヌクレオチドの設計は、ＥＭＢＯＳＳ Ｍａｔｃｈｅｒによって同定され、表２に開示されている２つの異なるＤＭＤエクソンにおける特異的で高い類似性の配列ストレッチに対する逆相補性に主として基づいて行った。考慮されるさらなる配列パラメータは、前記配列ストレッチにおける部分的に開いた／閉じた二次ＲＮＡ構造（ＲＮＡ構造バージョン４．５又はＲＮＡ ｍｆｏｌｄバージョン３．５（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．）によって推測される）の存在及び／又は前記配列ストレッチにおける推定ＳＲ−タンパク質結合部位（ＥＳＥ−ファインダーソフトウェア（Ｃａｒｔｅｇｎｉ Ｌら，２００２及びＣａｒｔｅｇｎｉ Ｌら，２００３）によって推測される）の存在であった。すべてのＡＯＮは、Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって合成したか、又は商業的供給源（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＵＳ）から得、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及び全長ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含有する。すべてのオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡであり、標準的なホスホラミダイトプロトコルにより、ＯＰ−１０合成器（ＧＥ／ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ）を使用して１０μｍｏｌスケールで合成した。オリゴヌクレオチドを、２つのステップの順序（ＤＩＥＡ、続いて濃ＮＨ４ＯＨ処理）で開裂し、脱保護し、ＨＰＬＣによって精製し、水に溶解し、過剰なＮａＣｌを交換イオンに加えた。蒸発後、化合物を水に再溶解し、ＦＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥した。質量分析により、すべての化合物の同一性を確認し、純度（ＵＰＬＣによって測定した）はすべての化合物について許容可能（＞８０％）であると見出した。本明細書に記載されているインビトロ実験について、ＡＯＮの５０μＭの作用溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０）中で調製した。
組織培養、トランスフェクション及びＲＴ−ＰＣＲ分析：
分化したヒトの健康な対照筋細胞（筋管）を、非ＧＬＰ標準的作動手順に係る、４００ｎＭの標準的なＡＯＮ濃度にて６−ウェルプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ポリエチレンイミン（ＥｘＧｅｎ５００；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した（２μｌ／μｇＡＯＮ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ中）。上述のトランスフェクション手順を、以前に報告されている材料及び方法（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａ．ら，２００３）から適合した。トランスフェクションの２４時間後、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。手短に述べると、ｃＤＮＡを生成するために、ランダムヘキサマー混合物（１．６μｇ／μｌ，Ｒｏｃｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、投入量５００〜１０００ｎｇのＲＮＡで逆転写酵素（ＲＴ）反応において使用した。続いて、ＰＣＲ分析は、各試料について３μｌのｃＤＮＡで行われ、ＤＭＤ遺伝子特異的プライマーを使用した第１のＰＣＲ及びネステッドＰＣＲを含んだ（表４及び５を参照のこと）。ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ分析を、以前に報告されている材料及び方法（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａ．ら，２００２及びＡａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ Ａ．ら，２００３）から適合した非ＧＬＰ標準作動手順に従って実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をゲル電気泳動（２％アガロースゲル）によって分析した。得られたＲＴ−ＰＣＲ断片を、ＤＮＡ Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＵＳＡ；ＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐｓ）により定量した。「Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ」ソフトウェア及びＥｘｃｅｌ２００７によってデータを処理した。より小さな転写物（予測される複数のエクソンスキッピングを含有する）対転写物の総量の比を評価し（パーセントでスキッピング効率を表す）、トランスフェクトされていない細胞におけるものと直接比較した。ＰＣＲ断片もまた、配列検証（サンガーシークエンシング，ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のためにアガロースゲルから単離した（ＱＩＡクイックゲル抽出キット，Ｑｉａｇｅｎ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
表４：
標的エクソンのスキッピングの検出のために使用したＰＣＲプライマーセット
表５：
プライマー配列
結果：
実施例１：
異なる部位においてＡＯＮを用いたエクソン１０及び１８において高い類似性を有する配列ストレッチの標的化。
エクソン１０（配列番号１０９）及び１８（配列番号１１０）における高い類似性（６３％）の配列ストレッチに基づいて、一連のＡＯＮを設計し、エクソン１０（ＰＳ８１４，配列番号１６７５；ＰＳ８１５，配列番号１６７７；ＰＳ８１６，配列番号１６７９）又はエクソン１８（ＰＳ８１１，配列番号１６７３）のいずれかに１００％逆相補的である前記配列ストレッチにわたって分散させた。健康なヒト対照筋管培養物中でのトランスフェクション後、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、すべての４つのＡＯＮが、エクソン１０〜１８のスキッピング（配列分析によって確認）を誘導できることが実証された（図１）。ＰＳ８１１及びＰＳ８１６は、両方のエクソンで最も高い逆相補性パーセントを有し（図１Ｂ）、７０％及び６６％のそれぞれのエクソン１０〜１８のスキッピング効率を有して最も効果的であった（図１Ｃ）。ＰＳ８１４は最も効果が低く、このことは、その位置及び／又はより短い長さ（２５ヌクレオチドに対して２１）に固有であり得、そしてそれによるより低い結合親和性又は安定性であり得る。エクソン１０〜１８のスキッピングは未処理の細胞（ＮＴ）において観察されなかった。これらの結果は、高度に再現可能（２０／２０の異なるトランスフェクションにおけるＰＳ８１６によるエクソン１０〜１８のスキッピング）であり、エクソン１０〜１８までのマルチエクソンストレッチのスキッピングは、高い配列類似性（６３％）を有する領域におけるエクソン１０及び１８の両方に結合でき、これらのエクソン及び間にあるすべてのエクソンのスキッピングを誘導できる単一ＡＯＮを使用することによって実施可能であることを実証している。さらなる複数のエクソンスキッピング断片はこの転写物領域において得られるが、エクソン９が１９に直接スプライスされた得られた転写物（インフレーム転写物）はすべての実験において最も豊富であった。
実施例２：
異なる長さのＡＯＮを用いたエクソン１０及び１８において高い類似性を有する配列ストレッチの標的化。
エクソン１０（配列番号１０９）及び１８（配列番号１１０）における高い類似性の配列ストレッチ内で、本発明者らは、最も効果的な最小の長さを特定するために、異なる長さを有するＡＯＮの効果を評価した。健康なヒト対照筋細胞（すなわち分化した筋管）におけるＰＳ８１６（２５−ｍｅｒ，配列番号１６７９）、ＰＳ１０５９（２１−ｍｅｒ，配列番号１６８４）又はＰＳ１０５０（１５−ｍｅｒ，配列番号１６８２）のトランスフェクション後、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、すべての３つのＡＯＮが、エクソン１０〜１８のスキッピング（配列分析によって確認）を誘導できることを実証した（図２Ａ、Ｂ）。ＰＳ８１６及びＰＳ１０５９は最も効果的であった（それぞれ６８％及び７９％）。より短いＰＳ１０５０はあまり効果的ではなかった（２５％）。エクソン１０から１８のスキッピングは未処理の細胞（ＮＴ）において観察されなかった。これらの結果により、エクソン１０〜１８のマルチエクソンストレッチのスキッピングが、１５、２１及び２５ヌクレオチドのＡＯＮを使用することによって実施可能であることが示される。より長いＡＯＮも同様に作用すると予測される。２１−ｍｅｒ ＰＳ１０５９が最も効果的であり、最も短い候補である。１５−ｍｅｒ ＰＳ１０５０が最も効果が低く、このことは、エクソン１８に対するその低い逆相補性（４７％，図２Ｂ）及び／又は標的ＲＮＡに対する低い結合親和性又は安定性に固有であり得る。１５−ｍｅｒの生物活性を改善するために、塩基修飾が１５−ｍｅｒのＴｍ及びそれにより結合親和性又は二本鎖の安定性を向上させるのに必要とされ得る。この実験において最も豊富に得られた転写物は、再び、エクソン９が１９に直接スプライスされたものであった（インフレーム転写物）。
実施例３：
修飾塩基化学的性質を有するＡＯＮを用いたエクソン１０及び１８において高い類似性を有する配列ストレッチの標的化。
選択されたＡＯＮ化学的性質の特定の特性は、ＡＯＮの標的転写物への送達に少なくとも部分的に影響を与える：投与経路、生物学的安定性、生体内分布、組織内分布並びに細胞取り込み及び輸送。さらに、オリゴヌクレオチド化学的性質のさらなる最適化は、結合親和性及び安定性を向上させ、活性を向上させ、安全性を改善し、及び／又は長さを短くするか又は合成を改善するか及び／又は精製法によって物品のコストを低下させるために想定される。エクソン１０（配列番号１０９）及び１８（配列番号１１０）における高い類似性の配列ストレッチ内で、本発明者らは、異なる修飾塩基（５−置換ピリミジン及び２，６−ジアミノプリンなど）を有する２’−Ｏ−メチルＲＮＡ ＡＯＮの効果を評価した。健康なヒト対照筋細胞（すなわち分化した筋管）におけるＰＳ８１６（通常の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ ＡＯＮ；配列番号１６７９）、ＰＳ１１６８（ＰＳ８１６だが、すべてのＡが２，６−ジアミノプリンに置き換えられている；配列番号１６８１）、ＰＳ１０５９（通常の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ ＡＯＮ；配列番号１６８４）、ＰＳ１１３８（ＰＳ１０５９だが、すべてのＣが５−メチルシトシンに置き換えられている；配列番号１６８５）又はＰＳ１１７０（ＰＳ１０５９だが、すべてのＡが２，６−ジアミノプリンに置き換えられている；配列番号１６８６）（図３Ｂ）のトランスフェクション後、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、すべての５つのＡＯＮが、エクソン１０〜１８のスキッピング（配列分析によって確認）を誘導できることを実証した（図３）。ＰＳ８１６は最も効果的であった（８８％）。これらの特定の配列における塩基修飾は生物活性をさらに改善しなかったが、それらの塩基修飾は、生体内分布、安定性及び／又は安全性に対して、よりプラスの効果を有し得るので、効果の低い化合物も依然として臨床開発に好適である。これらの結果により、エクソン１０〜１８のマルチエクソンストレッチのスキッピングが、修飾塩基を有するＡＯＮを使用することによって実施可能であることが示される。この実験において最も豊富に得られた転写物は、再び、エクソン９が１９に直接スプライスされたものであった（インフレーム転写物）。
実施例４：
ＰＳ８１６は他のインフレームマルチエクソンストレッチのスキッピングを誘導する。
エクソン１０（配列番号１０９）及び１８（配列番号１１０）における高い類似性の配列ストレッチはまた、エクソン３０（配列番号１２８）、３１（配列番号１３０）、３２（配列番号１３２）、４２（配列番号１５２）、４７（配列番号１５８）、４８（配列番号１６０）、５７（配列番号１７０）、及び６０（配列番号１７４）において（部分的に）存在する（図４Ａ、Ｂ、表２）。本発明者らは、ここで、４００ｎＭのＰＳ８１６（配列番号１６７９）のトランスフェクション後、異なるマルチエクソンストレッチスキッピングの検出に焦点を当てた。本発明者らは、その目的のために異なるプライマーセット（表４及び５）を使用した。実際にＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、本発明者らは、複数の実験においてインフレームエクソン１０〜３０、エクソン１０〜４２、エクソン１０〜４７、エクソン１０〜５７及び／又はエクソン１０〜６０のスキッピング（配列分析によって確認）を観察し、これらは未処理の細胞では観察されなかった。一例として、図４Ｃは、ＰＳ８１６により誘導されたエクソン１０〜１８、エクソン１０〜３０及びエクソン１０〜４７のスキッピングを示す。さらなるマルチエクソンスキッピング事象（インフレーム又はアウトオブフレームのいずれか）にもかかわらず、エクソン９が１９に直接スプライスされた得られた転写物（インフレーム転写物）は最も再現可能であり、すべての実験において最も豊富にあるように見えた。これらの結果により、複数のエクソンスキッピングが、２つの異なるエクソン間で高い類似性である配列ストレッチに結合でき、インフレームＤＭＤ転写物を生成するためにこれらのエクソン及び間にあるすべてのエクソンのスキッピングを誘導できる単一ＡＯＮを使用してＤＭＤ遺伝子にわたって誘導され得ることが確認される。
実施例５：
修飾塩基化学的性質を有するＡＯＮを用いたエクソン４５及び５５において高い類似性を有する配列ストレッチの標的化。
エクソン４５（配列番号１５７１）及び５５（配列番号１５７２）における高い類似性（８０）％の配列ストレッチに基づいて、一連のＡＯＮを設計し、エクソン４５（ＰＳ１１８５，配列番号１７０６；ＰＳ１１８６，配列番号１７０７）に１００％逆相補的であるか又はエクソン５５（１つのミスマッチを有する）（ＰＳ１１８８，配列番号１７１３）に９６％逆相補的のいずれかである前記配列ストレッチにわたって分散させた（図５Ａ）。すべての３つのＡＯＮにおいて、Ａｓは２，６−ジアミノプリンに置き換えられた。健康なヒト対照筋管培養物中でのトランスフェクション後、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＰＳ１１８５、ＰＳ１１８６及びＰＳ１１８８がエクソン４５〜５５のスキッピング（配列分析によって確認）を誘導できることが実証された（図５Ｂ）。エクソン４５〜５５のスキッピングは未処理の細胞（ＮＴ）において観察されなかった。これらの結果は、エクソン４５〜５５の別のマルチエクソンストレッチのスキッピングが、高い配列類似性（８０％）を有する領域におけるエクソン４５及び５５の両方に結合でき、これらのエクソン及び間にあるすべてのエクソンのスキッピングを誘導できる単一ＡＯＮを使用することによって実施可能であることを実証している。エクソン４４が５６に直接スプライスされた得られた転写物はインフレームであり、複数の実験において観察された。エクソン１０〜１８のスキッピング実験（実施例３）に関して、本発明者らは、ここで再び、修飾塩基を有するＡＯＮが効果的に適用され得ることを示す。さらに、ＰＳ１１８８を用いて得られた結果は、ＡＯＮが、標的エクソンの１つに１００％逆相補的であることを必要としないが、いずれかの標的エクソンに対して１００％逆相補的が存在しないハイブリッド構造としても設計され得ることを示す。
図１（Ｆｉｇ．１）：Ａ）エクソン１０及びエクソン１８において高い類似性（６３％）である配列ストレッチにおけるＰＳ８１１（配列番号１６７３）、ＰＳ８１４（配列番号１６７５）、ＰＳ８１５（配列番号１６７７）及びＰＳ８１６（配列番号１６７９）の局在性。Ｂ）ＡＯＮ特性及び効率。エクソン１０又はエクソン１８のどちらかに対する各ＡＯＮの逆相補性（ｒｅｖ．ｃｏｍｐ．）（％）を示す。Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。健康なヒトの筋細胞（すなわち分化した筋管）において、４つすべてのＡＯＮはエクソン１０〜エクソン１８のマルチエクソンストレッチのスキッピングを誘導するのに効果的であった。ＰＳ８１１及びＰＳ８１６が最も効果的であった。図の左側のボックスはＰＣＲ増幅した転写物の含有量を表す（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処理の細胞）。 図２（Ｆｉｇ．２）：Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。健康なヒト筋細胞（すなわち分化した筋管）において、異なる長さを有するが、エクソン１０及びエクソン１８において高い類似性（６３％）である配列ストレッチ内に同じコア標的配列を有するＡＯＮを試験した。ＰＳ８１６（配列番号１６７９）（２５−ｍｅｒ）及びＰＳ１０５９（配列番号１６８４）（２１−ｍｅｒ）が最も効果的であった（それぞれ６８％及び７９％のエクソン１０〜１８のスキッピング）。１５−ｍｅｒ ＰＳ１０５０（配列番号１６８２）はほとんど効果がなかった。図の左側のボックスはＰＣＲ増幅した転写物の含有量を表す（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処理の細胞）。Ｂ）ＡＯＮ特性及び効率。エクソン１０又はエクソン１８のいずれかに対する各ＡＯＮの逆相補性（ｒｅｖ．ｃｏｍｐ．）（％）を示す。 図３（Ｆｉｇ．３）：Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。健康なヒト筋細胞（すなわち分化した筋管）において、異なる塩基化学的性質を有するＡＯＮを試験した。ＰＳ８１６（通常の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ ＡＯＮ；配列番号１６７９）、ＰＳ１１６８（ＰＳ８１６だが、すべてのＡが２，６−ジアミノプリンに置き換えられている；配列番号１６８１）、ＰＳ１０５９（通常の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ ＡＯＮ；配列番号１６８４）、ＰＳ１１３８（ＰＳ１０５９だが、すべてのＣが５−メチルシトシンに置き換えられている；配列番号１６８５）又はＰＳ１１７０（ＰＳ１０５９だが、すべてのＡが２，６−ジアミノプリンに置き換えられている；配列番号１６８６）。エクソン１０〜１８のスキッピングを試験したすべてのＡＯＮについて観察した。ＰＳ８１６が最も効果的であった（８８％）。これらの特定の配列において、塩基修飾は生物活性をさらに改善しなかった。図の左側のボックスはＰＣＲ増幅した転写物を示す（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処理の細胞）。Ｂ）ＡＯＮ特性及び効率。 図４（Ｆｉｇ．４）：Ａ）ＰＳ８１６についての複数の標的として、エクソン１０、１８、３０及び４７における高い類似性の配列ストレッチ。配列番号の番号は（例えば表２の）ＥＭＢＯＳＳ全長エクソンアラインメントを参照している。灰色のフォントにおいて、配列部分は、ＥＭＢＯＳＳアラインメントに含まれていなかったが、ＰＳ８１６に対して高い逆相補性を有する部分に隣接している。Ｂ）エクソンアラインメント及びＰＳ８１６逆相補性（ｒｅｖ．ｃｏｍｐ．）パーセントの概要。Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。複数のエクソンストレッチスキッピングはＰＳ８１６によって誘導され得、ここでは、エクソン１０〜１８、エクソン１０〜３０及びエクソン１０〜４７のスキッピングとして同定している。得られた転写物はインフレームである。これらは未処理の細胞（ＮＴ）において検出されなかった。図の左側及び右側におけるボックスはＰＣＲ増幅した転写物の含有量を表す（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー）。 図５（Ｆｉｇ．５）：Ａ）エクソン４５及びエクソン５５において高い類似性（８０％）である配列ストレッチにおけるＰＳ１１８５（配列番号１７０６）、ＰＳ１１８６（配列番号１７０７）及びＰＳ１１８８（配列番号１７１３）の局在性。表はＡＯＮ特性をまとめている。エクソン４５又はエクソン５５のいずれかに対する各ＡＯＮの逆相補性（ｒｅｖ．ｃｏｍｐ．）（％）を示す。Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。健康なヒト筋細胞（すなわち分化した筋管）において、３つすべてのＡＯＮはエクソン４５〜エクソン５５のマルチエクソンストレッチのスキッピングを誘導するのに効果的であった。図の左側のボックスはＰＣＲ増幅した転写物の含有量を表す（Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー；ＮＴ：未処理の細胞）。
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Claims (16)

  1. 対象における疾患を予防、遅延、改善及び／又は治療するための医薬としての使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
    前記オリゴヌクレオチドは第１のエクソンの領域及び第２のエクソンの領域に結合でき、前記第２のエクソンの前記領域は前記第１のエクソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有し、
    前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンは前記対象における同じｍＲＮＡ前駆体内にあり、
    前記結合の結果、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピング、好ましくは、前記第１のエクソンで開始し、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に存在する１つ又は複数のエクソンを包含するマルチエクソンストレッチのスキッピング、及び多くても前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを生じ、
    機能的又は半機能的タンパク質の産生を可能にするインフレーム転写物が得られる、
    アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを誘導できる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 前記結合は、前記ｍＲＮＡ前駆体内で、前記第１のエクソン及び第２のエクソンの前記領域における少なくとも１つのスプライシング制御配列、及び／又は少なくとも前記第１のエクソン及び／又は前記第２のエクソンを包含する二次構造に干渉することができる、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 前記スプライシング制御配列は、セリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質についての結合部位、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エクソン認識配列（ＥＲＳ）、及び／又はエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）を含む、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. １０〜４０ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 天然のリボヌクレオチド系又はデオキシリボヌクレオチド系オリゴヌクレオチドと比較して少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドであって、より好ましくは、
    （ａ）少なくとも１つの塩基修飾であって、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、チミン、２，６−ジアミノプリンから好ましくは選択され、５−メチルピリミジン及び２，６−ジアミノプリンからより好ましくは選択される塩基修飾、及び／又は
    （ｂ）少なくとも１つの糖修飾であって、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、２’−Ｏ−デオキシ（ＤＮＡ）、２’−Ｆ、モルホリノ、架橋ヌクレオチド又はＢＮＡから好ましくは選択され、或いは前記オリゴヌクレオチドが架橋ヌクレオチド及び２’−デオキシ修飾ヌクレオチド（ＢＮＡ／ＤＮＡミックスマー）の両方を含み、より好ましくは糖修飾が２’−Ｏ−メチルである、糖修飾、及び／又は
    （ｃ）少なくとも１つの骨格修飾であって、ホスホロチオエート又はホスホロジアミデートから好ましくは選択され、より好ましくはホスホロチオエートである骨格修飾
    を含むオリゴヌクレオチド。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドであって、
    前記オリゴヌクレオチドは１つ又は複数のコンジュゲート基を含み、
    前記コンジュゲート基は、任意選択で保護され、ペプチド、タンパク質、炭水化物、薬物、標的部分、取り込み増強部分、溶解度増強部分、薬力学増強部分、薬物動態増強部分、ポリマー、エチレングリコール誘導体、ビタミン、脂質、ポリフルオロアルキル部分、ステロイド、コレステロール、蛍光部分、レポーター分子、放射活性物質標識部分及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、直接又は二価若しくは多価リンカーを介して末端又は内部残基に結合する、
    オリゴヌクレオチド。
  8. 前記第１のエクソン及び第２のエクソンは、ジストロフィンエクソン１０、１８、３０、８、９、１１、１３、１９、２２、２３、３４、４０、４２、４４、４５、４７、５１、５３、５５、５６、５７又は６０から選択され、前記疾患はＤＭＤ又はＢＭＤである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. ジストロフィンエクソン１０〜１８、エクソン１０〜３０、エクソン１０〜４２、エクソン１０〜４７、エクソン１０〜５７、エクソン１０〜６０、エクソン８〜１９、エクソン９〜２２、エクソン９〜３０、エクソン１１〜２３、エクソン１３〜３０、エクソン２３〜４２、エクソン３４〜５３、エクソン４０〜５３、エクソン４４〜５６、エクソン４５〜５１、エクソン４５〜５３、エクソン４５〜５５、エクソン４５〜６０及び／又はエクソン５６〜６０のスキッピングを誘導できる、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 配列番号１６７９、１６８８、１６７１〜１６７８、１６８０〜１６８７、１６８９〜１７４１若しくは１７８８〜１８９１のいずれか１つに定義される塩基配列であって、前記塩基配列に存在するヌクレオチドの数によって規定される長さか、或いは前記塩基配列において定義されているより１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド長い又は１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド短い長さを有する塩基配列を含む、請求項８又は９に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドであって、
    （ａ）配列番号１６７９〜１６８１、１７７８、１８１２、１８１３、１８８４〜１８８６、１８９０若しくは１８９１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有するか、又は配列番号１８１４に定義され、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｂ）配列番号１６８８、１６８９又は１８３９〜１８４４に定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｃ）配列番号１６７３又は１６７４に定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｄ）配列番号１６７５又は１６７６に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｅ）配列番号１６７７又は１６７８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｆ）配列番号１６８４〜１６８６のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｇ）配列番号１７０４〜１７０６のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｈ）配列番号１７０７〜１７０９のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｉ）配列番号１７１０、１７１３〜１７１７のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｊ）配列番号１８１５〜１８１９のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｋ）配列番号１８２０、１８２４のいずれか１つに定義され、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｌ）配列番号１８２６、１７８０、１７８２、１８３２のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｍ）配列番号１８２１、１８２５のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｎ）配列番号１８２２のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｏ）配列番号１８２３、１７８１、１８２９、１８３０、１８３１のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｐ）配列番号１７８３、１８３３、１８３４、１８３５のいずれか１つに定義され、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｑ）配列番号１８８７のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｒ）配列番号１８８８又は１８８９のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｓ）配列番号１８２７に定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｔ）配列番号１８２８に定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｕ）配列番号１７８４、１８３６のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｖ）配列番号１７８６、１８３８のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｗ）配列番号１７８０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｘ）配列番号１７８５、１８３７のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｙ）配列番号１８４５、１８４６、１８４７、１８４８のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｚ）配列番号１８４９、１８５０のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ａ１）配列番号１７８７、１８５１のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｂ１）配列番号１７８８、１８５２、１７８９、１８５３のいずれか１つに定義され、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｃ１）配列番号１７９０、１８５４、１７９２、１８５５のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｄ１）配列番号１７９４、１８６１、１７９５、１８６２のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｅ１）配列番号１７９６、１８６３、１７９７、１８６４のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｆ１）配列番号１７９８、１８６５、１７９９、１８６６のいずれか１つに定義され、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｇ１）配列番号１８０８、１８６７、１８０９、１８６８、１８１０、１８６９、１８５８、１８７３のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｈ１）配列番号１８１１、１８７０、１８５９、１８７４のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｉ１）配列番号１８５６、１８７１、１８６０、１８７５のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｊ１）配列番号１８５７、１８７２のいずれか１つに定義され、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｋ１）配列番号１８００、１８７６、１８０１、１８７７のいずれか１つに定義され、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｌ１）配列番号１８０２、１８７８、１８０３、１８７９のいずれか１つに定義され、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｍ１）配列番号１８０４、１８８０のいずれか１つに定義され、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｎ１）配列番号１８０５、１８８１のいずれか１つに定義され、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列、又は
    （ｏ１）配列番号１８０６、１８８２、１８０７、１８８３のいずれか１つに定義され、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドの長さを有する塩基配列
    を含むオリゴヌクレオチド。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、塩、アジュバント及び／又は溶媒を任意選択でさらに含む組成物。
  13. 対イオン、好ましくはカルシウムによって連結された請求項１〜１１のいずれか一項に記載の２つ以上の同一のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 個体における疾患、好ましくはＢＭＤ又はＤＭＤを予防、遅延、改善及び／又は治療するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４若しくは１３に記載の組成物を前記個体に投与するステップを含む方法。
  15. 疾患、好ましくはＢＭＤ又はＤＭＤを予防、遅延、改善及び／又は治療するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１２若しくは１３に記載の組成物の使用。
  16. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを設計するための方法であって、
    （ａ）同じｍＲＮＡ前駆体内の第１のエクソン及び第２のエクソンのインフレームの組み合わせを同定するステップであって、前記第２のエクソンの領域が前記第１のエクソンの領域と少なくとも５０％の同一性を有する、ステップ、
    （ｂ）前記第１のエクソンの前記領域及び前記第２のエクソンの前記領域に結合できるオリゴヌクレオチドを設計するステップ、及び
    （ｃ）前記結合の結果、前記第１のエクソン及び前記第２のエクソンのスキッピング、好ましくは、前記第１のエクソンで開始し、前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間に存在する１つ又は複数のエクソンを包含するマルチエクソンストレッチのスキッピング、及び多くても前記第１のエクソンと前記第２のエクソンとの間にあるエクソンのストレッチ全体のスキッピングを生じるステップ
    を含む方法。
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