JP2019522972A - 遺伝性障害の治療のための改善された特徴を有する二環式スキャフォールド部分を含むプレｍＲＮＡスプライススイッチング又は調節オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＤＭＤなどの神経筋障害を治療する、寛解させる、予防する及び／又は遅延させるための、臨床適用性を増強する改善された特徴を有するアンチセンススプライススイッチングオリゴヌクレオチドを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝性障害、より詳細には、神経筋障害の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、より詳細には、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドの分野に関する。本発明は、特に、本明細書においてさらに定義されるような臨床適用性を増強する改善された特徴を有するオリゴヌクレオチドの使用に関する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、癌、炎症状態、心血管疾患並びに神経変性及び神経筋障害を含む多数の疾患及び状態のために（前）臨床開発中である。その作用機序は、核又は細胞質における標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介性分解、核におけるスプライス調節（エキソン包含又はスキッピング）又は細胞質におけるリボソームサブユニット結合の立体障害による翻訳阻害などの種々の標的を目的とする。スプライス調節又はスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、ヒトβ−グロビンプレｍＲＮＡにおける異常なスプライシングの修正のために最初に記載され（Ｄｏｍｉｎｓｋｉ及びＫｏｌｅ、１９９３年）、現在、それだけには限らないが、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ遺伝子、Ｆｒｉｅｄｍａｎら、１９９９年）、乳癌（ＢＲＣＡ１遺伝子、Ｕｃｈｉｋａｗａら、２００７年）、前立腺癌（ＦＯＬＨ１遺伝子、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００６年）、炎症性疾患（ＩＬ−５Ｒアルファ及びＭｙＤ８８遺伝子、Ｋａｒｒａｓら、２００１年、Ｖｉｃｋｅｒｓら、２００６年）、眼白子症１型（ＯＡ１遺伝子、Ｖｅｔｒｉｎｉら、２００６年）、運動失調毛細血管拡張症（ＡＴＭ遺伝子、Ｄｕら、２００７）、母斑性基底細胞癌症候群（ＰＴＣＨ１遺伝子、Ｕｃｈｉｋａｗａら、２００７年）、メチルマロン酸血症（ＭＵＴ遺伝子、Ｒｉｎｃｏｎら、２００７年）、早期分娩（ＣＯＸ−２遺伝子、Ｔｙｓｏｎ−Ｃａｐｐｅｒら、２００６年）、アテローム性動脈硬化症（artherosclerosis）（ＡＰＯＢ遺伝子、Ｋｈｏｏら、２００７年）、プロピオン酸血症（ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ遺伝子、Ｒｉｎｃｏｎら、２００７年）、白血病（ｃ−ｍｙｃ及びＷＴ１遺伝子、２００４年、Ｇｉｌｅｓら、１９９９年）、ジストロフィー型表皮水疱症（ＣＯＬ７Ａ１遺伝子、Ｇｏｔｏら、２００６年）、家族性高コレステロール血症（ＡＰＯＢ遺伝子、Ｄｉｓｔｅｒｅｒら、２０１３年）、レーザー誘導性脈絡膜新生血管及び角膜移植後拒絶反応（ＫＤＲ遺伝子、Ｕｅｈａｒａら、２０１３年）、肥大型心筋症（ＭＹＢＰＣ３遺伝子、Ｇｅｄｉｃｋｅ−Ｈｏｒｎｕｎｇら、２０１３年）、アッシャー症候群（ＵＳＨ１Ｃ遺伝子、Ｌｅｎｔｚら、２０１３年）、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＫＴＮ遺伝子、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ−Ｉｋｅｄａら、２０１１年）、レーザー誘導性脈絡膜新生血管（ＦＬＴ１遺伝子、Ｏｗｅｎら、２０１２）、癌（ＳＴＡＴ３及びｂｃｌ−Ｘ遺伝子、Ｚａｍｍａｒｃｈｉら、２０１１年、Ｍｅｒｃａｔａｎｔｅら、２００２年）及びハッチンソン・ギルフォードプロジェリア（ＬＭＮＡ遺伝子、Ｏｓｏｒｉｏら、２０１１年）、三好型筋疾患（ＤＹＳＦ遺伝子、Ｗｅｉｎら、２０１０年）、脊髄小脳失調症１型（ＡＴＸＮ１遺伝子、Ｇａｏら、２００８年）、アルツハイマー病／ＦＴＤＰ−１７タウオパチー（ＭＡＰＴ遺伝子、Ｐｅａｃｅｙら、２０１２年）、筋緊張性ジストロフィー（ＣＬＣ１遺伝子、Ｗｈｅｅｌｅｒら、２００７年）及びハンチントン舞踏病（Ｅｖｅｒｓら、２０１４年）を含む種々の遺伝性障害のために研究されている。しかし、スプライススイッチングＡＯＮは、神経筋障害デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、脊髄性筋ジストロフィー（脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）型）の治療において最も速く進んでいる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、最も一般的な小児型の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、重度の致死性神経筋障害であり、１２歳前に車椅子の補助への依存をもたらし、多くの場合、１３歳前に患者は呼吸器不全又は心不全のために死亡する。これは、機能性ジストロフィンの不在をもたらす２．２４ＭｂのＤＭＤ遺伝子中の１つ又は複数のエキソンのリーディングフレームシフト性欠失（約６７％）若しくは重複（約７％）によって、又は点突然変異（約２５％）によって引き起こされる。ＢＭＤもまた、ＤＭＤ遺伝子中の突然変異によって引き起こされるが、これらは、オープンリーディングフレームを維持し、半機能性ジストロフィンタンパク質を生成し、典型的にはかなり穏やかな表現型及びより長い寿命をもたらす。過去１０年間、ＤＭＤの有望な療法として、転写物の破壊されたリーディングフレームを回復させるためのスプライシングの特異的修飾が出現した（ｖａｎ Ｏｍｍｅｎら、２００８年；Ｙｏｋｏｔａら、２００７年；ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、２００７年；Ｇｏｅｍａｎｓら、２０１１年；Ｖｏｉｔら、２０１４年；Ｃｉｒａｋら、２０１１年）。突然変異に隣接する又はそれを含有するエキソンと結合し、そのスプライシングシグナルに干渉する高度配列特異的スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用は、ＤＭＤプレｍＲＮＡのプロセシングの際にそのエキソンのスキッピングを誘導できる。末端切断型転写物が生じるものの、オープンリーディングフレームは修復され、ＢＭＤ患者で見られるものと類似したタンパク質が産生される。ＡＯＮ誘導性エキソンスキッピングは、ＤＭＤ患者に、突然変異特異的な、したがって個別化された治療的アプローチを提供する。エキソン４５〜５５周辺の突然変異クラスターの大部分と同様に、１つの特定のエキソンのスキッピングが、種々の突然変異を有する多数の患者にとって治療的であり得る。エキソン５１のスキッピングは、エキソン４５〜５０、４８〜５０、５０又は５２の欠失を有するものを含む患者の最大の小集団（約１３％）に適用される。適用されるＡＯＮは、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨに抵抗するように、並びにＲＮＡ結合及び二本鎖安定性を促進するように化学的に修飾される。ＤＭＤのための修正エキソンスキッピングを誘導するために、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ（２ＯＭｅＰＳ；Ｖｏｉｔら、２０１４年）、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ；Ｃｉｒａｋら、２０１１年）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅら、２０１５年）及びペプチド核酸（ＰＮＡ；Ｇａｏら、２０１５年）を含む種々のＡＯＮ化学が現在調査されている。ＡＯＮは、通常健常な筋肉線維によって十分に取り込まれないが、活性化サテライト細胞及び損傷を受けた、したがって、より透過性の線維膜を特徴とするＤＭＤ及びその結果生じる病理におけるジストロフィン欠乏は、実際、より良好な取り込みを促進する。ジストロフィン欠乏性ｍｄｘマウスモデルにおける研究では、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレオチドは、実際、野生型マウスにおけるものと比較した場合に種々の筋肉群において最大１０倍高い取り込みを実証した（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋら、２０１０年）。ＤＭＤ患者において２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ及びホスホロジアミデートモルホリノＡＯＮの両方を用いる最近の第Ｉ／ＩＩ相結果によって、筋肉生検におけるＡＯＮの存在が確認されるが、種々の化学的修飾は、筋肉による差次的取り込み及び筋肉中の分布をもたらすと思われる。さらに、両研究において、治療後の新規ジストロフィンのレベルは、依然として制限されており、これが、治療係数及び臨床適用性を増強する改善された特徴を有するオリゴヌクレオチドを開発する分野に意欲をかきたてる。
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、６０００人の新生児のうち１人が罹患する常染色体劣性疾患であり、運動ニューロン遺伝子１（ＳＭＮ１）の生存における突然変異によって引き起こされる。脊髄における運動ニューロンの進行性の喪失及びその後の随意筋の萎縮をもたらす。臨床重症度は、ほとんど同一のＳＭＮ２遺伝子における天然に存在するエキソン７包含レベル及びＳＭＮ２のコピー数に応じて変わる。ＳＭＮ２では、エキソン７スプライシングエンハンサー部位におけるＣ＞Ｔ移行は、普通、不安定なエキソン７がスキップされたイソ型及び不十分なレベルの全長イソ型（Ｋｈｏｏ及びＫｒａｉｎｅｒ、２００９年）をもたらす。しかし、有効なＳＭＮ２エキソン７包含は、スプライススイッチングＡＯＮを用いてイントロン７（ＩＳＳ−Ｎ１；Ｓｉｎｇｈら、２００６年；Ｈｕａら、２００８年）の５’領域においてイントロンスプライシングサイレンサーをブロックすることによって達成できる。成功したマウス研究に基づいて（Ｈｕａら、２０１０年、２０１１年；Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１年）、候補ＡＯＮ（ＩＳＩＳ−ＳＭＮＲｘ、ＩＳＩＳ３９６４４３又はヌシネルセン）が、現在、ＩＯＮＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州、カールバッド）によって臨床開発中である。第１相研究では、くも膜下腔内空間へのＩＳＩＳ−ＳＭＮＲｘの単回９ｍｇ用量の直接注射は、ＳＭＡを有する小児において中枢神経系における広い分布及び一部の運動機能改善をもたらした（Ｓｗｏｂｏｄａら、２０１４年、Ｃｈｉｒｉｂｏｇａら、２０１６年）。しかし、心臓の病理を軽減し、末梢運動ニューロン機能を、結果的に生存を増大するには、全身ＳＳＯ送達が必要であり得る。
スプライススイッチングＡＯＮなどの全身投与されたＡＯＮの臨床有効性は、投与経路、生体安定性、体内分布、組織内分布、標的細胞による取り込み及び所望の細胞内位置（核）への経路などの複数の因子に応じて変わる。これらの因子は、少なくとも幾分かは、ＡＯＮの化学構造によって決定される。本発明の一部は、ＡＯＮスキャフォールドにおける特定の化学修飾が、遺伝性障害の可能性ある治療のための改善された特徴を示すＡＯＮにつながり得ることを示す。
結論として、ＤＭＤ、ＢＭＤ又はＳＭＡなどの遺伝性障害のためのスプライススイッチングＡＯＮなどのＡＯＮの治療適用性を増強するために、最適化された化学特徴を有するＡＯＮに対する必要性がある。
オリゴヌクレオチド
第１の態様において、本発明は、好ましくは、スプライス調節による、例えば、両方ともスプライススイッチングの形態であるエキソンスキッピング又はエキソン包含による疾患又は状態を治療するための薬剤として使用するための、２’−置換モノマー、好ましくは、２’−置換ＲＮＡモノマー及びホスホロチオエート骨格を含む、又はホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーからなる、好ましくは、２’−置換ＲＮＡモノマーからなる、二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む、並びに５−メチルピリミジン塩基を含むオリゴヌクレオチドを提供する。これに関連して好ましい疾患として、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー及び脊髄性筋萎縮症がある。
図１は、配列番号４５２に基づくＢＮＡ修飾を有さない同配列のＡＯＮと比較した、ＤＭＤ患者（エキソン４８〜５０欠失）筋肉細胞培養物における、ＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン５１スキッピング（Ａ）及びジストロフィン生成（Ｂ）に対する、５’及び／又は３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。この場合には、ＢＮＡ修飾は、ＬＮＡである（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号と関連する）。（Ａ）：平均エキソン５１スキッピングパーセンテージは、３連のＲＮＡサンプルのＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ（８００ｎＭ又は４μＭ）。（Ｂ）：平均化学発光値（電気泳動図から得た曲線下面積（ＡＵＣ））は、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙイムノアッセイによって測定した；高対低タンパク質濃度をロードしたＨＣ＝健常な対照筋肉サンプル、ＮＴ＝未処置サンプル、ＡＯＮ濃度８００ｎＭ。 図１は、配列番号４５２に基づくＢＮＡ修飾を有さない同配列のＡＯＮと比較した、ＤＭＤ患者（エキソン４８〜５０欠失）筋肉細胞培養物における、ＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン５１スキッピング（Ａ）及びジストロフィン生成（Ｂ）に対する、５’及び／又は３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。この場合には、ＢＮＡ修飾は、ＬＮＡである（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号と関連する）。（Ａ）：平均エキソン５１スキッピングパーセンテージは、３連のＲＮＡサンプルのＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ（８００ｎＭ又は４μＭ）。（Ｂ）：平均化学発光値（電気泳動図から得た曲線下面積（ＡＵＣ））は、Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙイムノアッセイによって測定した；高対低タンパク質濃度をロードしたＨＣ＝健常な対照筋肉サンプル、ＮＴ＝未処置サンプル、ＡＯＮ濃度８００ｎＭ。 図２は、配列番号４５２に基づくＢＮＡ修飾を有さない同配列のＡＯＮと比較した、ＤＭＤ患者（エキソン４８〜５０欠失）筋肉細胞培養物における、ＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン５１スキッピングに対する、５’及び／又は３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。ＡにおけるＢＮＡ修飾は、ＣＲＮである（図中に示される配列番号４５３Ｃ及び４５５Ｃは、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＣＲＮモノマーをもたらす配列番号４５３及び４５５に関連する）。ＢにおけるＢＮＡ修飾は、本出願において、２’−アミノ−ＬＮＡと呼ばれる２’−アミノ−２’−デオキシＬＮＡである（図中に示される配列番号４５６Ａは、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾が、２’−アミノ−ＬＮＡ モノマーをもたらす配列番号４５６に関連する）。平均エキソン５１スキッピングパーセンテージは、３連のＲＮＡサンプルのＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ濃度８００ｎＭ（Ｂ）又は４μＭ（Ａ，Ｂ）。 図２は、配列番号４５２に基づくＢＮＡ修飾を有さない同配列のＡＯＮと比較した、ＤＭＤ患者（エキソン４８〜５０欠失）筋肉細胞培養物における、ＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン５１スキッピングに対する、５’及び／又は３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。ＡにおけるＢＮＡ修飾は、ＣＲＮである（図中に示される配列番号４５３Ｃ及び４５５Ｃは、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＣＲＮモノマーをもたらす配列番号４５３及び４５５に関連する）。ＢにおけるＢＮＡ修飾は、本出願において、２’−アミノ−ＬＮＡと呼ばれる２’−アミノ−２’−デオキシＬＮＡである（図中に示される配列番号４５６Ａは、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾が、２’−アミノ−ＬＮＡ モノマーをもたらす配列番号４５６に関連する）。平均エキソン５１スキッピングパーセンテージは、３連のＲＮＡサンプルのＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ濃度８００ｎＭ（Ｂ）又は４μＭ（Ａ，Ｂ）。 図３は、１２週間のＩＶ治療（１００ｍｇ／ｋｇ ＡＯＮ毎週）後のｈＤＭＤマウスモデルにおける、ＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン５１スキッピングに対する、５’及び／又は３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。この場合におけるＢＮＡ修飾は、ＬＮＡである（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号と関連する）。平均エキソン５１スキッピングパーセンテージは、筋肉ＲＮＡサンプルのＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定した。 図４は、配列番号４５２に基づくＢＮＡ修飾を有さない同配列のＡＯＮと比較した、ＤＭＤ患者（エキソン４８〜５０欠失）筋肉細胞培養物における、ＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン５１スキッピングに対する、少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である（すべて８００ｎＭで）。この場合にはＢＮＡ修飾は、ＬＮＡをもたらす（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号と関連する）。配列番号４５２を上回るエキソン５１スキッピングレベルの平均増加倍数は、３連のＲＮＡサンプルのＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析に基づいている。 図５は、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さない同配列のＡＯＮ（配列番号２６（エキソン４４）、配列番号６０４９（エキソン４５）及び配列番号８６０（エキソン５３）と比較した、健常なヒト筋肉細胞におけるＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン４４スキッピング（Ａ、配列番号２９）、エキソン４５スキッピング（Ｂ、配列番号３１８５）及びエキソン５３スキッピング（Ｃ、配列番号８６３）に対する、５’及び３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。この場合にはＢＮＡ修飾は、ＬＮＡをもたらす（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号に関連する）。平均エキソンスキッピングパーセンテージは、ＲＮＡサンプル（ｎ＝６）のＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ（８００ｎＭ又は４μＭ）。 図５は、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さない同配列のＡＯＮ（配列番号２６（エキソン４４）、配列番号６０４９（エキソン４５）及び配列番号８６０（エキソン５３）と比較した、健常なヒト筋肉細胞におけるＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン４４スキッピング（Ａ、配列番号２９）、エキソン４５スキッピング（Ｂ、配列番号３１８５）及びエキソン５３スキッピング（Ｃ、配列番号８６３）に対する、５’及び３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。この場合にはＢＮＡ修飾は、ＬＮＡをもたらす（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号に関連する）。平均エキソンスキッピングパーセンテージは、ＲＮＡサンプル（ｎ＝６）のＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ（８００ｎＭ又は４μＭ）。 図５は、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さない同配列のＡＯＮ（配列番号２６（エキソン４４）、配列番号６０４９（エキソン４５）及び配列番号８６０（エキソン５３）と比較した、健常なヒト筋肉細胞におけるＡＯＮ誘導性ＤＭＤエキソン４４スキッピング（Ａ、配列番号２９）、エキソン４５スキッピング（Ｂ、配列番号３１８５）及びエキソン５３スキッピング（Ｃ、配列番号８６３）に対する、５’及び３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施の効果を示す図である。この場合にはＢＮＡ修飾は、ＬＮＡをもたらす（図中に示される配列番号は、示されるようなＢＮＡスキャフォールド修飾がＬＮＡモノマーをもたらす配列番号に関連する）。平均エキソンスキッピングパーセンテージは、ＲＮＡサンプル（ｎ＝６）のＲＴ−ｄｄＰＣＲ解析によって決定し、エラーバーは、標準偏差を示す、ＡＯＮ（８００ｎＭ又は４μＭ）。
本出願において記載されるようなオリゴヌクレオチドについて、モノマーの特徴が、規定されておらず、文脈から明らかではない場合には、ＲＮＡモノマーに由来する対応する特徴は、推測されるべきである。
そのようなものとして、この態様では、本発明は、
ｉ）Ｉａ）少なくとも１つの２’−置換モノマー及び任意選択でホスホロチオエート骨格連結、又は
Ｉｂ）ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、並びに
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
前記モノマーは、ＲＮＡモノマーであるか、又はＲＮＡモノマーに由来することが好ましい。本明細書では、このようなオリゴヌクレオチドを、本発明に従うオリゴヌクレオチドと呼ぶ。そのようなものとして、本発明に従う好ましいオリゴヌクレオチドは、
ｉ）Ｉａ）少なくとも１つの２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー若しくは２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマー、任意選択で、ホスホロチオエート骨格連結、又は
Ｉｂ） ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル連結によって連結された、２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー若しくは２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、並びに
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含む。
本発明に従う好ましいオリゴヌクレオチドは、３４未満のオリゴヌクレオチドの長さを有する。前記オリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドを有し得る。このようなオリゴヌクレオチドはまた、１０〜３３ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドとして同定され得る。本発明に従うより好ましいオリゴヌクレオチドは、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドの長さを有し、１６〜２２ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドとして同定され得る。
別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１６〜２５ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６〜２２ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１６、１８、２０又は２２ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、２１、２２、２４又は２５ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１８、２２、２４又は２５ヌクレオチドの長さである。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６〜２５ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４４、４５、５１又は５３をスキップするためのものである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４４、５１又は５３をスキップするためのものである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６〜２２ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６、１８、２０又は２２ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２０又は２３ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４４をスキップするためのものである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２１、２２、２４又は２５ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８、２２、２４又は２５ヌクレオチドの長さであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５３をスキップするためのものである。本出願を通じて、ジストロフィンへの言及は、ヒトジストロフィンへの言及と解釈されることが好ましい。
上記の（（ｉ）（Ｉａ））によって包含されるものとして、少なくとも１つの２’−置換モノマー、好ましくは、２’−置換ＲＮＡモノマーを含み、ホスホロチオエート骨格連結を含まないオリゴヌクレオチドがある。このようなオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結のみを含む骨格を有し得る。同様に、少なくとも１つの２’−置換モノマー、好ましくは、２’−置換ＲＮＡモノマー及び１つ又は複数のホスホロチオエート骨格連結を含むオリゴヌクレオチドが包含される。
上記の（（ｉ）（Ｉｂ））によって包含されるものとして、２’−置換ＲＮＡモノマー以外のモノマーを含まない、ホスホロチオエート骨格連結である骨格連結のみを含むオリゴヌクレオチドがある。同様に、２’−置換ＲＮＡモノマー以外のモノマーを含まない、ホスホジエステル骨格連結である骨格連結のみを含むオリゴヌクレオチドが包含される。
当業者に公知のように、ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、一般に、反復モノマーからなる。このようなモノマーは、ほとんどの場合ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体である。ＲＮＡ中の最もよくある天然に存在するヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、シチジン一リン酸、グアノシン一リン酸、チミジン一リン酸及びウリジン一リン酸である。これらは、ペントース糖リボース、リン酸エステルによって連結されている５’連結リン酸基及び１’連結塩基からなる。糖は、塩基とリン酸を接続し、したがって、ヌクレオチドのスキャフォールドと呼ばれることが多い。ペントース糖中の修飾は、したがって、スキャフォールド修飾と呼ばれることが多い。重度修飾については、元のペントース糖は、その全体が、塩基とリン酸を同様に接続する別の部分によって置換されることもある。したがって、ペントース糖は、スキャフォールドであることが多いが、スキャフォールドは、必ずしもペントース糖ではないと理解される。
塩基は、核酸塩基と呼ばれることもあり、一般に、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル又はその誘導体である。シトシン、チミン及びウラシルは、ピリミジン塩基であり、一般に、その１−窒素を介してスキャフォールドに連結される。アデニン及びグアニンは、プリン塩基であり、一般に、その９−窒素を介してスキャフォールドに連結される。
ヌクレオチドは、一般に、その５’−リン酸部分の、隣接するヌクレオチドモノマーの３’−ヒドロキシル部分への縮合によって隣接するヌクレオチドに接続される。同様に、その３’−ヒドロキシル部分は、一般に、隣接するヌクレオチドモノマーの５’−リン酸に接続される。これは、リン酸ジエステル結合を形成する。ホスホジエステル及びスキャフォールドは、交互コポリマーを形成する。塩基は、このコポリマーに、すなわち、スキャフォールド部分にグラフトされる。この特徴のために、オリゴヌクレオチドの連結されたモノマーによって形成される交互コポリマーは、オリゴヌクレオチドの骨格と呼ばれることが多い。リン酸ジエステル結合は、隣接するモノマーを一緒に接続するので、それらは、骨格連結と呼ばれることが多い。リン酸基が代わりにホスホロチオエートなどの類似部分であるように修飾される場合には、このような部分は、依然として、モノマーの骨格連結と呼ばれると理解される。これは、骨格連結修飾と呼ばれる。一般用語では、したがって、オリゴヌクレオチドの骨格は、交互のスキャフォールド及び骨格連結からなる。
別の実施形態では、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルである。別の実施形態では、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン又はウラシルである。別の実施形態では、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルの修飾された形態である。別の実施形態では、修飾された核酸塩基は、ヒポキサンチン、プソイドウラシル、プソイドシトシン、１−メチルプソイドウラシル、オロト酸、アグマチジン（agmatidine）、ライシジン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ハロウラシル、５−ハロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、プソイドイソシチジン、Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）又はＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）である。別の実施形態では、修飾された核酸塩基は、ヒポキサンチン、プソイドウラシル、プソイドシトシン、１−メチルプソイドウラシル、オロト酸、アグマチジン（agmatidine）、ライシジン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ハロウラシル、５−ハロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン又は５−ヒドロキシメチルシトシンである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−置換ホスホロチオエートモノマー、好ましくは、２’−置換ホスホロチオエートＲＮＡモノマー、２’−置換ホスフェートＲＮＡモノマー又は２’−置換混合ホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡモノマーを含む又はからなる。このようなオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート若しくはホスフェート骨格連結若しくはそれらの混合物を介して接続された、若しくはそれによって連結された２’−置換ＲＮＡモノマーを含む、又は２’−置換ホスホロチオエートＲＮＡ、２’−置換ホスフェートＲＮＡ若しくはそれらの混合物からなる。このようなオリゴヌクレオチドは、２’−置換ホスホロチオエートＲＮＡモノマー、２’−置換ホスフェートＲＮＡモノマー又はそれらの混合物からなることが好ましい。２’−置換ＲＮＡは、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル又は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）であることが好ましい。２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）部分は、２’−ＭＯＥと呼ばれることが多い。２’−置換ＲＮＡモノマーは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであることがより好ましい。このような化学は、当業者には公知である。この態様の好ましい実施形態では、前記２’−置換モノマーが２’−置換ＲＮＡモノマー、２’−Ｆモノマー、２’−アミノモノマー、２’−Ｏ−置換モノマー、２’−Ｏ−メチルモノマー又は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）モノマー、好ましくは、２’−Ｏ−メチルモノマーである本発明に従うオリゴヌクレオチドが提供される。前記２’−置換モノマーは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーなどの２’−置換ＲＮＡモノマーであることが好ましい。
本出願を通じて、２’−Ｏ−メチルモノマー又は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー及びホスホロチオエート、ホスフェート又は混合ホスフェート／ホスホロチオエート骨格連結を含むオリゴヌクレオチドは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルホスフェートＲＮＡ又は２’−Ｏ−メチルホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドによって置き換えられていてもよい。本出願を通じて、ホスホロチオエート、ホスフェート又は混合ホスフェート／ホスホロチオエート骨格連結によって連結された、又はそれを介して接続された２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーからなるオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡ、２’−Ｏ−メチルホスフェートＲＮＡ又は２’−Ｏ−メチルホスフェート／ホスホロチオエートＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドによって置き換えられていてもよい。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的鎖に対する結合親和性を増大する、前記オリゴヌクレオチドのその標的との得られる二本鎖の融解温度を増大する、並びに／又は免疫賦活性効果を低減する、並びに／又は生体安定性を増大する、並びに／又は体内分布及び／若しくは組織内分布及び／若しくは細胞性取り込み及び輸送を改善する塩基修飾を含む。より好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５−メチルピリミジンを含む。５−メチルピリミジンは、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル及び／又はチミンが、５−メチルウラシルに対して同一であるチミンから選択される。「チミン」及び「５−メチルウラシル」は、文書を通じて交換され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシン塩基又は５−メチルウラシル塩基のいずれかのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、すべてのシトシン塩基が５−メチルシトシン塩基であり、及び／又はすべてのウラシル塩基が５−メチルウラシル塩基である上記のオリゴヌクレオチドが提供される。これは、５−メチルシトシンを含むが、非置換シトシン又はウラシルを含まないオリゴヌクレオチドに、５−メチルウラシルを含むが、非置換シトシン又はウラシルを含まないオリゴヌクレオチドに、並びに５−メチルシトシン及び５−メチルウラシルの両方を含むが、非置換シトシン又はウラシルを含まないオリゴヌクレオチドに関する。５−メチルシトシンを含むが、非置換シトシンを含まず、さらに非置換ウラシルを含むオリゴヌクレオチドに、又は５−メチルウラシルを含むが、非置換ウラシルを含まず、さらに非置換シトシンを含むオリゴヌクレオチドに関する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的鎖に対する結合親和性を増大する、前記オリゴヌクレオチドのその標的との得られた二本鎖の融解温度を増大する、並びに／又は免疫賦活性効果を低減する、並びに／又は生体安定性を増大する、並びに／又は体内分布及び／若しくは組織内分布及び／若しくは細胞性取り込み及び輸送を改善するスキャフォールド修飾を含む。二環式核酸（ＢＮＡ）モノマーをもたらすスキャフォールド修飾が、本発明によって包含される。二環式スキャフォールドは、一般に、スキャフォールドをコンホメーション的に制限し、上記の効果の改善をもたらすように化学的に変更されているペントース由来スキャフォールドである。二環式スキャフォールドの例として、ペントース環などの第１の環がさらなる環状部分を有するスピランを形成し、その結果、両環が１個のみの原子を共有するスキャフォールド、ペントース環などの第１の環がさらなる環状部分と融合され、その結果、両環が２個の隣接する原子を共有するスキャフォールド及びペントース環などの第１の環が２個の非隣接原子で第１の環状部分に連結されている部分を介して架橋された化合物を形成するスキャフォールドがある。このような非隣接原子は、橋頭原子と呼ばれる。架橋化合物は、複数の環を含み、その各々は、少なくとも３個の原子にわたって重複する。２個の原子のみにわたって重複する２つの環を有する化合物は、は、融合化合物である。いくつかの架橋化合物では、２個の橋頭原子間の最小の連結は、架橋(bridging)部分と、又は架橋(bridge)部分と呼ばれる。その他の架橋化合物では、１つの環が、ヌクレオチドのペントース環などの特徴的な環である場合には、その特徴的な環に対して構成的ではない部分は、架橋部分と呼ばれる。架橋二環式化合物の命名法は、状況依存的であるということになる。
二環式化合物は、さらなる環を含み得る。本発明の二環式化合物は、少なくとも二環式であり、前記の２つの環は、スピラン、融合系又は架橋系又はそれらの組合せを構成する。本発明は、２つの独立環が、スピラン、融合化合物又は架橋化合物を形成しないように非環状リンカーによって連結されているスキャフォールド修飾を包含しない。好ましい二環式化合物は、融合化合物又は架橋化合物である。より好ましい実施形態では、二環式核酸モノマー（ＢＮＡ）は、架橋核酸モノマーである。本明細書において記載されるように、「架橋」又は「二環式」核酸モノマーの両方が、非ＢＮＡヌクレオチド含有対照オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮＡ標的に対するオリゴヌクレオチドの融解温度を増強する修飾されたスキャフォールドを有するヌクレオチドに関する。
好ましい実施形態では、前記二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾の各出現が、コンホメーション的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）モノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、キシロ−ＬＮＡモノマー、α−ＬＮＡモノマー、α−Ｌ−ＬＮＡモノマー、β−Ｄ−ＬＮＡモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−Ｎ−置換−２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、２’−チオ−ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたエチル（ｃＥｔ）ＢＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたメトキシエチル（ｃＭＯＥ）ＢＮＡモノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）モノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）モノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｂｎ）モノマー、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）モノマー、カルバＬＮＡ（ｃＬＮＡ）モノマー、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン核酸（ＤｐＮＡ）モノマー、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）モノマー、複素環式架橋ＢＮＡモノマー（例えば、トリアゾリル又はテトラゾリル連結された）、アミド架橋ＢＮＡモノマー、尿素架橋ＢＮＡモノマー、スルホンアミド架橋ＢＮＡモノマー、二環式炭素環式ヌクレオチドモノマー、ＴｒｉＮＡモノマー、α−Ｌ−ＴｒｉＮＡモノマー、ビシクロＤＮＡ（ｂｃＤＮＡ）モノマー、Ｆ−ｂｃＤＮＡモノマー、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）モノマー、Ｆ−ｔｃＤＮＡモノマー、オキセタンヌクレオチドモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡ由来のロックドＰＭＯモノマー、グアニジン架橋核酸（ＧｕＮＡ）モノマー、スピロシクロプロピレン架橋核酸（ｓｃｐＢＮＡ）モノマー及びそれらの誘導体からなる群から独立に選択されるモノマーをもたらす、本発明に従うオリゴヌクレオチドが提供される。前記オリゴヌクレオチド中に２つ以上の別個のスキャフォールドＢＮＡ修飾を導入することも、本発明に包含される。前記ＢＮＡスキャフォールド修飾の各出現が、コンホメーション的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）モノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、キシロ−ＬＮＡモノマー、α−Ｌ−ＬＮＡモノマー、β−Ｄ−ＬＮＡモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−Ｎ−置換−２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたエチル（ｃＥｔ）ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたメトキシエチル（ｃＭＯＥ）ＢＮＡモノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）モノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）モノマー、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）モノマー、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）モノマー並びにそれらの誘導体からなる群から独立に選択されるモノマーをもたらすことがより好ましい。好ましい実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ｃＥｔ ＢＮＡモノマー、オキソ−ＣＢＢＮモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡモノマー又はｃＭＯＥ ＢＮＡモノマーをもたらす。高度に好ましい実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ｃＥｔ ＢＮＡモノマー又はｃＭＯＥ ＢＮＡモノマーをもたらす。ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡモノマーをもたらすことが最も好ましい。
本出願を通じて、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む任意のモノマーは、好ましくは、その核酸塩基又は修飾された核酸塩基を保ちながら、ＢＮＡ修飾を含む任意のその他のモノマーによって置き換えられていてもよい。言い換えれば、スキャフォールド修飾は、オリゴヌクレオチドの配列を保ちながら交換され得る。限定されない例として、アデニンを含むＬＮＡモノマーは、アデニンを含むＥＮＡモノマーによって置き換えられていてもよい。
これらのＢＮＡスキャフォールド修飾を含むモノマーの構造例を以下に示し、ここで、Ｂは、本明細書において先に定義されるような塩基であり、Ｘは、ヘテロ原子又はメチレン部分などの変数であり、Ｘ２は、ヒドロキシル部分又は本明細書において先に定義されるような別の２’−置換であり、Ｌは、本明細書において先に定義されるような骨格連結である。文献において、このような修飾の名称は、任意であることが多く、均一な変換に従わず、本出願において、以下に提供されるような名前は、以下に提供される構造を指すものとする。比較のために、従来のＲＮＡモノマーの環状スキャフォールドを最初に示す。以下に示される構造では、モノマーは、通常、３’末端モノマーとして表される。キラリティーが示されない場合には、各エナンチオマーは、個別に参照される。本発明は、例示目的で提供されるこの種のモノマーに制限されない。環状部分中に含まれるヘテロ原子は、その他のヘテロ原子によって置換され得る。

以下は、上記で示されるＢＮＡスキャフォールド修飾の文献参照の包括的でない概観である：ｃＥｔ（２’−Ｏ，４’−Ｃ制約されたエチル）ＬＮＡ（ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ７１０３４２ｑ）、ｃＭＯＥ（２’−Ｏ，４’−Ｃ制約されたメトキシエチル）ＬＮＡ（Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０年、第７５巻、１５６９〜１５８１頁）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）（ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｓｓ／１．１．２４１）、カルバＬＮＡ（ｃＬＮＡ）（ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｏ１００１７０ｇ）、ＤｐＮＡ（Ｏｓａｗａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１５年、第８０巻（２１号）、１０４７４〜１０４８１頁）、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ、例えば、国際公開第２０１４／１４５３５６号（ＭｉＲａｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）におけるような）、複素環式架橋ＬＮＡ（例えば、国際公開第２０１４／１２６２２９号（Ｍｉｔｓｕｏｋａ Ｙら）におけるような）、アミド架橋ＬＮＡ（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５年、第１３巻、３７５７頁におけるような）、尿素架橋ＬＮＡ（例えば、Ｎｉｓｈｉｄａら Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０年、第４６巻、５２８３頁におけるような）、スルホンアミド架橋ＬＮＡ（例えば、国際公開第２０１４／１１２４６３号（Ｏｂｉｋａ Ｓら）におけるような）、二環式炭素環式ヌクレオシド（例えば、国際公開第２０１５／１４２９１０号（Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）におけるような）、ＴｒｉＮＡ（Ｈａｎｅｓｓｉａｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０１３年、第７８巻（１８号）、９０６４〜９０７５頁）、α−Ｌ−ＴｒｉＮＡ、ビシクロＤＮＡ（ｂｃＤＮＡ）（Ｂｏｌｌｉら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９６年３月；第３巻（３号）：１９７〜２０６頁）、Ｆ−ｂｃＤＮＡ（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊｏ４０２６９０ｊ）、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）（Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１２年、第４０巻、１３号６１３５〜６１４３頁）、Ｆ−ｔｃＤＮＡ（ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｏｃ．５ｂ００１８４）、オキセタンヌクレオチドモノマー（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４年、第３２巻、５７９１〜５７９９頁）、ｓｃｐＮＡ（Ｈｏｒｉｂａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１６年、ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｏｃ．６ｂ０２０３６、ＧｕＮＡ（Ｓｈｒｅｓｔｈａら、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１４年、ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ３ＣＣ４６０１７Ｇ）。上記で記載されないものについて、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０９７６４１号（ＩＳＩＳ／Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及び国際公開第２０１６／０１７４２２号（Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）が参照される。
ＢＮＡ及び５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基を含む本発明のオリゴヌクレオチドとは、それぞれ、前記オリゴヌクレオチドのシトシン核酸塩基のうち少なくとも１つが、ピリミジン環の５位の水素のメチル基との置換によって修飾されていること、すなわち、５−置換シトシンと組み合わせて、前記オリゴヌクレオチドのスキャフォールドのうち少なくとも１つが、ＢＮＡとの置換によって修飾されていること、及び／又は前記オリゴヌクレオチドのウラシル核酸塩基のうち少なくとも１つが、ピリミジン環の５位のプロトンのメチル基との置換によって修飾されていること（すなわち、５−メチルウラシル）を意味する。本発明との関連内で、表現「ピリミジン環の５位における水素のメチル基との置換」は、表現「ピリミジンの５−メチルピリミジンとの置換」と置き換えられてもよく、ピリミジンは、ウラシルのみ、シトシンのみ又は両方を指す。前記オリゴヌクレオチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はそれ以上のシトシン及び／又はウラシルを含む場合には、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又はそれ以上のシトシン及び／又はウラシルは、それぞれ、このように修飾されている。すべてのシトシン及び／又はウラシルが、それぞれ、このように修飾されている、又は５−メチルシトシン及び／若しくは５−メチルウラシルによって置換されていることが好ましい。言うまでもなく、本発明はしたがって、その配列中にそれぞれ少なくとも１個のシトシン又はウラシルを含むオリゴヌクレオチドに適用され得る。
ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は極めて安定であるので、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡモノマーを含むことが好ましい。ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡにさらなる特性、例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨに対する抵抗性、さらなるハイブリッド形成力、増大した安定性（例えば、体液中での）、増大又は減少した可動性、増大した活性、低減した毒性、増大した細胞内輸送、増大した細胞性取り込み、組織特異性などを提供する修飾を含むことが好ましい。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドと複合体形成したｍＲＮＡは、ＲＮａｓｅＨ切断に対して感受性ではないことが好ましい。好ましい修飾は上記で同定されている。
したがって、本発明は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡモノマーを含む、又は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡからなり、５−メチルピリミジン塩基を有する又は有さないＢＮＡを含むオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はホスフェート骨格を介して接続された２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーからなり、そのシトシンのすべて及び／又はそのウラシルのすべてがそれぞれ独立に、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシルによって置換されており、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルスキャフォールドがＢＮＡによって置き換えられていることが最も好ましい。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾を有することに加えて：
５−メチルシトシンで置換された少なくとも１つ、好ましくはすべてのシトシン、
５−メチルシトシンで置換された少なくとも１つ、好ましくはすべてのシトシン及び５−メチルウラシルで置換された少なくとも１つのウラシル、
５−メチルウラシルで置換された少なくとも１つのウラシル
を有し得る。
本態様の好ましい実施形態では、上記のようなオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾、好ましくは架橋核酸スキャフォールド修飾を含む、１、２、３、４、５又は６つのモノマーを含む。
これらの実施形態では、少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾が、オリゴヌクレオチドの末端モノマー中に、好ましくは５’末端モノマー中に含まれることが好ましい。両方の末端モノマーがＢＮＡスキャフォールドを含むことが最も好ましい。そのようなものとして、本態様のより好ましい実施形態は、少なくとも１つの二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾が、前記オリゴヌクレオチドの末端モノマー中に、好ましくは前記オリゴヌクレオチドの５’末端モノマー中に、より好ましくは前記オリゴヌクレオチドの両方の末端モノマー中に含まれる、本発明に従うオリゴヌクレオチドを提供する。その他の好ましい実施形態は、末端モノマー及びその隣接するモノマーが各々、ＢＮＡスキャフォールド含むことを必要とする。このような場合には、オリゴヌクレオチドの最初の２つのモノマー又は最後の２つのモノマーは各々、ＢＮＡスキャフォールドを含む。これは、例えば、最初及び最後の２つのモノマー又は最初の２つの及び最後のモノマーがすべて、ＢＮＡスキャフォールドを含むように何らかの形で組み合わされ得る。本発明に従うオリゴヌクレオチドが、ＢＮＡスキャフォールドを含む末端モノマーを含む場合には、ＢＮＡスキャフォールドを有するさらなるモノマーは、もう一方の末端にあるか、又はＢＮＡスキャフォールドを有する末端モノマーに隣接するかのいずれかであることが好ましい。
本態様の好ましい実施形態は、前記オリゴヌクレオチドが、以下からなるセットから選択されるようなＢＮＡ修飾を含む本発明のオリゴヌクレオチドを提供する：
５’末端のモノマーにおける単一ＢＮＡスキャフォールド修飾、
３’末端のモノマーにおける単一ＢＮＡスキャフォールド修飾、
一方が５’末端のモノマー中にあり、もう一方が３’末端のモノマー中にある２つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
２つのモノマー各々中の１つが５’末端に最も近い、２つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
２つのモノマー各々中の１つが３’末端に最も近い、２つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、１〜５つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、３〜７つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、１〜４つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、３〜６つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、１〜３つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、３〜５つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、１つ又は２つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、３又は４つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、１つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、３つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、２〜４つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、４〜６つのＢＮＡスキャフォールド修飾、
１つが５’末端のモノマー中にあり、１つが３’末端のモノマー中にあり、２〜３つのＢＮＡスキャフォールド修飾が非末端残基中にある、４つ又は５つのＢＮＡスキャフォールド修飾。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、２３０、２３６、２４２、２４８、２５４、２６０、２６６、２７２、２７８、２８４、２９０、２９６、３０２、３０８、３１４、３２０、３２６、３３２、３３８、３４４、３５０、３５６、３６２、３６８、３７４、３８０、３８６、３９２、３９８、４０４、４１０、４１６、４２２、４２８、４３４、４４０、４４６、４５２、４５８、４６４、４７０、４７６、４８２、４８８、４９４、５００、５０６、５１２、５１８、５２４、５３０、５３６、５４２、５４８、５５４、５６０、５６６、５７２、５７８、５８４、５９０、５９６、６０２、６０８、６１４、６２０、６２６、６３２、６３８、６４４、６５０、６５６、６６２、６６８、６７４、６８０、６８６、６９２、６９８、７０４、７１０、７１６、７２２、７２８、７３４、７４０、７４６、７５２、７５８、７６４、７７０、７７６、７８２、７８８、７９４、８００、８０６、８１２、８１８、８２４、８３０、８３６、８４２、８４８、８５４、８６０、８６６、８７２、８７８、８８４、８９０、８９６、９０２、９０８、９１４、９２０、９２６、９３２、９３８、９４４、９５０、９５６、９６２、９６８、９７４、９８０、９８６、９９２、９９８、１００４、１０１０、１０１６、１０２２、１０２８、１０３４、１０４０、１０４６、１０５２、１０５８、１０６４、１０７０、１０７６、１０８２、１０８８、１０９４、１１００、１１０６、１１１２、１１１８、１１２４、１１３０、１１３６、１１４２、１１４８、１１５４、１１６０、１１６６、１１７２、１１７８、１１８４、１１９０、１１９６、１２０２、１２０８、１２１４、１２２０、１２２６、１２３２、１２３８、１２４４、１２５０、１２５６、１２６２、１２６８、１２７４、１２８０、１２８６、１２９２、１２９８、１３０４、１３１０、１３１６、１３２２、１３２８、１３３４、１３４０、１３４６、１３５２、１３５８、１３６４、１３７０、１３７６、１３８２、１３８８、１３９４、１４００、１４０６、１４１２、１４１８、１４２４、１４３０、１４３６、１４４２、１４４８、１４５４、１４６０、１４６６、１４７２、１４７８、１４８４、１４９０、１４９６、１５０２、１５０８、１５１４、１５２０、１５２６、１５３２、１５３８、１５４４、１５５０、１５５６、１５６２、１５６８、１５７４、又は１５８０によって表される配列を含む又はからなる場合には、少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾が、前記オリゴヌクレオチド中に含まれることが好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、２２５、２３１、２３７、２４３、２４９、２５５、２６１、２６７、２７３、２７９、２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２３、４２９、４３５、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７、５１３、５１９、５２５、５３１、５３７、５４３、５４９、５５５、５６１、５６７、５７３、５７９、５８５、５９１、５９７、６０３、６０９、６１５、６２１、６２７、６３３、６３９、６４５、６５１、６５７、６６３、６６９、６７５、６８１、６８７、６９３、６９９、７０５、７１１、７１７、７２３、７２９、７３５、７４１、７４７、７５３、７５９、７６５、７７１、７７７、７８３、７８９、７９５、８０１、８０７、８１３、８１９、８２５、８３１、８３７、８４３、８４９、８５５、８６１、８６７、８７３、８７９、８８５、８９１、８９７、９０３、９０９、９１５、９２１、９２７、９３３、９３９、９４５、９５１、９５７、９６３、９６９、９７５、９８１、９８７、９９３、９９９、１００５、１０１１、１０１７、１０２３、１０２９、１０３５、１０４１、１０４７、１０５３、１０５９、１０６５、１０７１、１０７７、１０８３、１０８９、１０９５、１１０１、１１０７、１１１３、１１１９、１１２５、１１３１、１１３７、１１４３、１１４９、１１５５、１１６１、１１６７、１１７３、１１７９、１１８５、１１９１、１１９７、１２０３、１２０９、１２１５、１２２１、１２２７、１２３３、１２３９、１２４５、１２５１、１２５７、１２６３、１２６９、１２７５、１２８１、１２８７、１２９３、１２９９、１３０５、１３１１、１３１７、１３２３、１３２９、１３３５、１３４１、１３４７、１３５３、１３５９、１３６５、１３７１、１３７７、１３８３、１３８９、１３９５、１４０１、１４０７、１４１３、１４１９、１４２５、１４３１、１４３７、１４４３、１４４９、１４５５、１４６１、１４６７、１４７３、１４７９、１４８５、１４９１、１４９７、１５０３、１５０９、１５１５、１５２１、１５２７、１５３３、１５３９、１５４５、１５５１、１５５７、１５６３、１５６９、又は１５７５によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドの５’末端モノマーのみが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含むことが好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、２２６、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８、２７４、２８０、２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４、４００、４０６、４１２、４１８、４２４、４３０、４３６、４４２、４４８、４５４、４６０、４６６、４７２、４７８、４８４、４９０、４９６、５０２、５０８、５１４、５２０、５２６、５３２、５３８、５４４、５５０、５５６、５６２、５６８、５７４、５８０、５８６、５９２、５９８、６０４、６１０、６１６、６２２、６２８、６３４、６４０、６４６、６５２、６５８、６６４、６７０、６７６、６８２、６８８、６９４、７００、７０６、７１２、７１８、７２４、７３０、７３６、７４２、７４８、７５４、７６０、７６６、７７２、７７８、７８４、７９０、７９６、８０２、８０８、８１４、８２０、８２６、８３２、８３８、８４４、８５０、８５６、８６２、８６８、８７４、８８０、８８６、８９２、８９８、９０４、９１０、９１６、９２２、９２８、９３４、９４０、９４６、９５２、９５８、９６４、９７０、９７６、９８２、９８８、９９４、１０００、１００６、１０１２、１０１８、１０２４、１０３０、１０３６、１０４２、１０４８、１０５４、１０６０、１０６６、１０７２、１０７８、１０８４、１０９０、１０９６、１１０２、１１０８、１１１４、１１２０、１１２６、１１３２、１１３８、１１４４、１１５０、１１５６、１１６２、１１６８、１１７４、１１８０、１１８６、１１９２、１１９８、１２０４、１２１０、１２１６、１２２２、１２２８、１２３４、１２４０、１２４６、１２５２、１２５８、１２６４、１２７０、１２７６、１２８２、１２８８、１２９４、１３００、１３０６、１３１２、１３１８、１３２４、１３３０、１３３６、１３４２、１３４８、１３５４、１３６０、１３６６、１３７２、１３７８、１３８４、１３９０、１３９６、１４０２、１４０８、１４１４、１４２０、１４２６、１４３２、１４３８、１４４４、１４５０、１４５６、１４６２、１４６８、１４７４、１４８０、１４８６、１４９２、１４９８、１５０４、１５１０、１５１６、１５２２、１５２８、１５３４、１５４０、１５４６、１５５２、１５５８、１５６４、１５７０、又は１５７６によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドの３’末端モノマーのみが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含むことが好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、２２７、２３３、２３９、２４５、２５１、２５７、２６３、２６９、２７５、２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９、３９５、４０１、４０７、４１３、４１９、４２５、４３１、４３７、４４３、４４９、４５５、４６１、４６７、４７３、４７９、４８５、４９１、４９７、５０３、５０９、５１５、５２１、５２７、５３３、５３９、５４５、５５１、５５７、５６３、５６９、５７５、５８１、５８７、５９３、５９９、６０５、６１１、６１７、６２３、６２９、６３５、６４１、６４７、６５３、６５９、６６５、６７１、６７７、６８３、６８９、６９５、７０１、７０７、７１３、７１９、７２５、７３１、７３７、７４３、７４９、７５５、７６１、７６７、７７３、７７９、７８５、７９１、７９７、８０３、８０９、８１５、８２１、８２７、８３３、８３９、８４５、８５１、８５７、８６３、８６９、８７５、８８１、８８７、８９３、８９９、９０５、９１１、９１７、９２３、９２９、９３５、９４１、９４７、９５３、９５９、９６５、９７１、９７７、９８３、９８９、９９５、１００１、１００７、１０１３、１０１９、１０２５、１０３１、１０３７、１０４３、１０４９、１０５５、１０６１、１０６７、１０７３、１０７９、１０８５、１０９１、１０９７、１１０３、１１０９、１１１５、１１２１、１１２７、１１３３、１１３９、１１４５、１１５１、１１５７、１１６３、１１６９、１１７５、１１８１、１１８７、１１９３、１１９９、１２０５、１２１１、１２１７、１２２３、１２２９、１２３５、１２４１、１２４７、１２５３、１２５９、１２６５、１２７１、１２７７、１２８３、１２８９、１２９５、１３０１、１３０７、１３１３、１３１９、１３２５、１３３１、１３３７、１３４３、１３４９、１３５５、１３６１、１３６７、１３７３、１３７９、１３８５、１３９１、１３９７、１４０３、１４０９、１４１５、１４２１、１４２７、１４３３、１４３９、１４４５、１４５１、１４５７、１４６３、１４６９、１４７５、１４８１、１４８７、１４９３、１４９９、１５０５、１５１１、１５１７、１５２３、１５２９、１５３５、１５４１、１５４７、１５５３、１５５９、１５６５、１５７１、又は１５７７によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドの５’末端モノマー及び３’末端モノマーの両方が、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含むことが好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、２２８、２３４、２４０、２４６、２５２、２５８、２６４、２７０、２７６、２８２、２８８、２９４、３００、３０６、３１２、３１８、３２４、３３０、３３６、３４２、３４８、３５４、３６０、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０、３９６、４０２、４０８、４１４、４２０、４２６、４３２、４３８、４４４、４５０、４５６、４６２、４６８、４７４、４８０、４８６、４９２、４９８、５０４、５１０、５１６、５２２、５２８、５３４、５４０、５４６、５５２、５５８、５６４、５７０、５７６、５８２、５８８、５９４、６００、６０６、６１２、６１８、６２４、６３０、６３６、６４２、６４８、６５４、６６０、６６６、６７２、６７８、６８４、６９０、６９６、７０２、７０８、７１４、７２０、７２６、７３２、７３８、７４４、７５０、７５６、７６２、７６８、７７４、７８０、７８６、７９２、７９８、８０４、８１０、８１６、８２２、８２８、８３４、８４０、８４６、８５２、８５８、８６４、８７０、８７６、８８２、８８８、８９４、９００、９０６、９１２、９１８、９２４、９３０、９３６、９４２、９４８、９５４、９６０、９６６、９７２、９７８、９８４、９９０、９９６、１００２、１００８、１０１４、１０２０、１０２６、１０３２、１０３８、１０４４、１０５０、１０５６、１０６２、１０６８、１０７４、１０８０、１０８６、１０９２、１０９８、１１０４、１１１０、１１１６、１１２２、１１２８、１１３４、１１４０、１１４６、１１５２、１１５８、１１６４、１１７０、１１７６、１１８２、１１８８、１１９４、１２００、１２０６、１２１２、１２１８、１２２４、１２３０、１２３６、１２４２、１２４８、１２５４、１２６０、１２６６、１２７２、１２７８、１２８４、１２９０、１２９６、１３０２、１３０８、１３１４、１３２０、１３２６、１３３２、１３３８、１３４４、１３５０、１３５６、１３６２、１３６８、１３７４、１３８０、１３８６、１３９２、１３９８、１４０４、１４１０、１４１６、１４２２、１４２８、１４３４、１４４０、１４４６、１４５２、１４５８、１４６４、１４７０、１４７６、１４８２、１４８８、１４９４、１５００、１５０６、１５１２、１５１８、１５２４、１５３０、１５３６、１５４２、１５４８、１５５４、１５６０、１５６６、１５７２、又は１５７８によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドの２つの最も５’末端のモノマーのみが両方とも、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含むことが好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、２２３、２２９、２３５、２４１、２４７、２５３、２５９、２６５、２７１、２７７、２８３、２８９、２９５、３０１、３０７、３１３、３１９、３２５、３３１、３３７、３４３、３４９、３５５、３６１、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１、３９７、４０３、４０９、４１５、４２１、４２７、４３３、４３９、４４５、４５１、４５７、４６３、４６９、４７５、４８１、４８７、４９３、４９９、５０５、５１１、５１７、５２３、５２９、５３５、５４１、５４７、５５３、５５９、５６５、５７１、５７７、５８３、５８９、５９５、６０１、６０７、６１３、６１９、６２５、６３１、６３７、６４３、６４９、６５５、６６１、６６７、６７３、６７９、６８５、６９１、６９７、７０３、７０９、７１５、７２１、７２７、７３３、７３９、７４５、７５１、７５７、７６３、７６９、７７５、７８１、７８７、７９３、７９９、８０５、８１１、８１７、８２３、８２９、８３５、８４１、８４７、８５３、８５９、８６５、８７１、８７７、８８３、８８９、８９５、９０１、９０７、９１３、９１９、９２５、９３１、９３７、９４３、９４９、９５５、９６１、９６７、９７３、９７９、９８５、９９１、９９７、１００３、１００９、１０１５、１０２１、１０２７、１０３３、１０３９、１０４５、１０５１、１０５７、１０６３、１０６９、１０７５、１０８１、１０８７、１０９３、１０９９、１１０５、１１１１、１１１７、１１２３、１１２９、１１３５、１１４１、１１４７、１１５３、１１５９、１１６５、１１７１、１１７７、１１８３、１１８９、１１９５、１２０１、１２０７、１２１３、１２１９、１２２５、１２３１、１２３７、１２４３、１２４９、１２５５、１２６１、１２６７、１２７３、１２７９、１２８５、１２９１、１２９７、１３０３、１３０９、１３１５、１３２１、１３２７、１３３３、１３３９、１３４５、１３５１、１３５７、１３６３、１３６９、１３７５、１３８１、１３８７、１３９３、１３９９、１４０５、１４１１、１４１７、１４２３、１４２９、１４３５、１４４１、１４４７、１４５３、１４５９、１４６５、１４７１、１４７７、１４８３、１４８９、１４９５、１５０１、１５０７、１５１３、１５１９、１５２５、１５３１、１５３７、１５４３、１５４９、１５５５、１５６１、１５６７、１５７３、又は１５７９によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドの２つの最も３’末端のモノマーのみが両方とも、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含むことが好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号１５８０ではない配列番号によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドは、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含むことが好ましく、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートモノマーを含むことが好ましく、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートモノマーのみを含むことがより好ましい。本発明に従うオリゴヌクレオチドが、配列番号１５８０によって表される配列を含む又はからなる場合には、前記オリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシンの代わりにシトシンを含むことが好ましく、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートモノマーを含むことが好ましく、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートモノマーのみを含むことがより好ましい。配列番号がＴ又はＵに言及する時は常に、前記モノマーは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、前記モノマー（すなわち、前記言及）は、それぞれ、任意選択でＵ又はＴによって置き換えられていてもよい。配列番号がＣ又は５−メチル−Ｃに言及する時は常に、前記モノマーは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、前記言及は、それぞれ、任意選択で、５−メチル−Ｃ又はＣによって置き換えられていてもよい。
本出願を通じて、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、常に、明確に別に示されない限りオリゴヌクレオチド中に含まれ得る。しかし、読みやすさのために、これは、常に明確に略さずに書かれるわけではない。これは、オリゴヌクレオチドが、特定の種類のモノマーのみを含む又はからなるといわれる時は常に、これは、ＢＮＡスキャフォールド修飾が存在していると記載される場合に、ＢＮＡスキャフォールド修飾の存在を排除しないことを意味する。例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみからなるオリゴヌクレオチドは、それにもかかわらず、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有するモノマーを含み得る。これは、状況（例えば、ＡＯＮが１つのモノマーのみからなるといわれる場合に、なおさらに、ＢＮＡスキャフォールド修飾も含む）から明らかとなる。
本態様の好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが提供され、前記オリゴヌクレオチドは、エキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部と、相補的である、好ましくは、逆相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズするか、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、エキソン認識配列（ＥＲＳ）、エキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、ＳＲタンパク質結合部位、又は別のスプライシングエレメント、シグナル若しくは構造の少なくとも一部と、相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする配列を含む又はからなる。このようなオリゴヌクレオチドが相補的である場合には、逆相補的であり得ると理解される。本出願において、用語「相補的である」は、文脈から当業者には明らかであろうように、順方向相補的及び逆相補的配列の両方を包含する。
この関連において、本発明に従うオリゴヌクレオチドが相補的である、又は結合する、又は標的化する、又はハイブリダイズする好ましい配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン２〜７８などのジストロフィンエキソンである。好ましいジストロフィンエキソンは、エキソン２〜７８、より好ましくは、エキソン１０〜６０、最も好ましくは、エキソン４４〜５５であり、好ましい非エキソン領域は、イントロン１〜７８である。オリゴヌクレオチドが相補的である、又は結合する、又は標的化する、又はハイブリダイズするより好ましいエキソンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン４４、４５、５１、５２、５３及び５５である。オリゴヌクレオチドが相補的である、又は結合する、又は標的化する、又はハイブリダイズする好ましいエキソンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン４４、４５、５１、５２、５３及び５５である。このようなオリゴヌクレオチドは、エキソン４４、４５、５１、５２、５３及び５５から選択されるジストロフィンプレｍＲＮＡエキソンの少なくとも一部とハイブリダイズし、１０〜３３ヌクレオチドの、より好ましくは、１６〜２２ヌクレオチドの長さを有することが最も好ましい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが提供され、前記オリゴヌクレオチドは、エキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部と、相補的である、好ましくは、逆相補的であり、前記のエキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部は、１０〜３３ヌクレオチドの、好ましくは、１６〜２２ヌクレオチドの長さを有する。前記のエキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドの長さを有することがより好ましい。したがって、前記のエキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部は、最大でも３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１又は１０ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。最も好ましい長さは、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドである。
さらに、この関連では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが相補的である、又は結合する、又は標的化する、又はハイブリダイズするその他の好ましい配列として、ＳＭＮ２スプライシング調節エレメント、好ましくは、例えば、イントロン６及び７中のもの、より好ましくは、例えば、イントロン７中のスプライシングサイレンサーＩＳＳ−Ｎ１がある。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが提供され、前記エキソン及び／又は非エキソン領域は、ＤＭＤ遺伝子中、又はＳＭＮ遺伝子中にある。ＳＭＮ遺伝子は、ＳＭＮ１遺伝子又はＳＭＮ２遺伝子、好ましくは、ＳＭＮ２遺伝子であり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエキソンの一部と結合可能、標的化可能又は相補的であることが可能である配列を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることが好ましい。前記結合部分又は標的化される部分は、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は９８％又は最大１００％であり得る。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列によって表されることができ、前記ヌクレオチド配列は、本明細書において定義されるようなジストロフィンプレｍＲＮＡの少なくとも一部と結合する、標的化する、又は相補的である配列並びにさらなるそれぞれの両端に位置する配列を含む。より好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの前記結合部分又は標的化される部分の長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドのものである。いくつかの種類のそれぞれの両端に位置する配列が使用され得る。それぞれの両端に位置する配列は、タンパク質の前記オリゴヌクレオチドとの結合を修飾するために、又は前記オリゴヌクレオチドの熱力学的特性を修飾するために使用されることが好ましく、標的ＲＮＡ結合親和性を修飾するために使用されることがより好ましい。別の好ましい実施形態では、さらなるそれぞれの両端に位置する配列は、前記エキソン中に存在しないジストロフィンプレｍＲＮＡの配列と相補的である。このようなそれぞれの両端に位置する配列は、前記エキソンの枝分かれ部位及び／又はスプライス部位アクセプター若しくはドナーコンセンサス配列を含む又はからなる配列と結合可能である、又は標的化可能であることが好ましい。好ましい実施形態では、このようなそれぞれの両端に位置する配列は、前記エキソンに隣接するジストロフィンプレｍＲＮＡのイントロンの配列を含む又はからなる配列と結合可能である、又は標的化可能である。
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜１６０７を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜１６０７の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４５３〜６１３若しくは配列番号１５９２〜１６０５若しくは配列番号１６０７を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５３〜６１３若しくは配列番号１５９２〜１６０５若しくは配列番号１６０７を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８６、４８３、１５９２、１５９３、１５９４、１５９５、１５９６、１５９７、１５９８、１５９９、１６００、１６０１、１６０２、１６０３、１６０４、１６０５若しくは１６０７を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８６、４８３、１５９２、１５９３、１５９４、１５９５、１５９６、１５９７、１５９８、１５９９、１６００、１６０１、１６０２、１６０３、１６０４、１６０５若しくは１６０７を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表されるものである。本発明の関連内で、配列番号の断片とは、前記配列番号に由来する少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む又はからなるヌクレオチド配列を意味することが好ましい。
本発明のより好ましいオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８若しくは４５６８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８若しくは４５６８の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表されるものである。
本発明のより好ましいオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３若しくは４８６を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３若しくは４８６の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４５２〜６１３、４５２８〜４５７２を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５２〜６１３、４５２８〜４５７２を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表され、最も好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８若しくは４５６８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８若しくは４５６８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表されるものである。
好ましいＡＯＮは、前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を含み、好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、タンパク質の産生又は組成を変更し、好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、エキソンスキッピング又はエキソン包含を含み、最も好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、エキソンスキッピングを含むものである。このプレｍＲＮＡスプライシング調節は、本明細書において後記で定義されるような治療的適用に関連して使用されることが好ましい。
プレｍＲＮＡスプライシング調節の目的は、タンパク質、ほとんどの場合、そのＲＮＡがコードするタンパク質の産生を変更することであり得る。この産生は、前記産生のレベルの増大又は低減によって変更され得る。この産生はまた、例えば、プレｍＲＮＡスプライシング調節が１つ又は複数のエキソンの包含又は排除を、及び異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をもたらす場合に、実際に産生されるタンパク質の組成の変更によって変更され得る。異なるアミノ酸配列を有するこのようなタンパク質は、疾患又は状態の結果として産生されるタンパク質よりも多くの機能性を有する、又はより良好な機能性を有する、又は少なくとも１つの変更された特性を有することが好ましい。
ＤＭＤの場合には、プレｍＲＮＡスプライシング調節は、転写物のオープンリーディングフレームを回復させ、より短いが（より多くの）機能性ジストロフィンタンパク質の発現を誘導するために、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中の１つ又は複数の特定のエキソンをスキップするために適用されてもよく、最終目的は、疾患の過程に干渉できることである。同様の戦略によって、ＢＭＤの過程に干渉することが可能となる。ＳＭＡの場合には、プレｍＲＮＡスプライシング調節は、ＳＭＮ２遺伝子へのエキソン７の包含を増強し、運動ニューロンタンパク質の生存のレベルを増大するために適用されてもよく、これが、脊髄における運動ニューロンの喪失及びその後の随意筋の萎縮を低減する。そのようなものとして、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドが提供され、前記オリゴヌクレオチドは、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節は、疾患又は状態と関連しているタンパク質の産生を変更し、好ましくは、前記疾患又は状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
ＡＯＮは、治療用プレｍＲＮＡのスプライシング調節において使用するためのものである。ＡＯＮは、好ましくは、個体のＤＮＡのコーディング鎖に由来するジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡの特定の配列と相補的であるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。このオリゴヌクレオチドは、前記プレｍＲＮＡの前記配列と結合する、又はそれを標的化する。本発明との関連で、治療用プレｍＲＮＡは、遺伝病に関与する遺伝子の罹患プレｍＲＮＡと呼ばれることもある。したがって、治療用プレｍＲＮＡのスプライシングの調節は、前記遺伝病の治療を可能にする。
ＤＭＤの又はＢＭＤの場合には、プレｍＲＮＡスプライシング調節は、転写物のオープンリーディングフレームを回復させ、より短いが（より多くの）機能性ジストロフィンタンパク質の発現を誘導するために、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中の１つ又は複数の特定のエキソンをスキップするために適用されてもよく、最終目的は、疾患の進行を遅延又はさらには停止できることである。
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞において、臓器において、組織及び／又は個体において、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中にエキソンスキッピングを誘導するために使用される。エキソンスキッピングは、スキップされたエキソンを含有しない成熟ジストロフィンｍＲＮＡをもたらし、したがって、前記エキソンがアミノ酸をコードする場合には、より短いタンパク質産物の発現につながり得る。少なくとも１つのエキソンのスキッピングは、ＡＯＮの、スプライシング調節エレメント、スプライス部位及び／又はイントロン枝分かれ部位配列を含む特定のエキソン内部の配列との結合によって誘導されることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明はまた、複数のエキソンのスキッピングに適している、マルチスキッピングと呼ばれることもある上記のようなオリゴヌクレオチドを包含する。このような本発明に従うオリゴヌクレオチドは、同一プレｍＲＮＡ内の、第１のエキソンの領域と、及び第２のエキソンの領域と結合可能であり、前記の第２のエキソンの前記領域は、前記の第１のエキソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、前記プレｍＲＮＡの前記の第１のエキソン及び前記の第２のエキソンのスキッピングを誘導可能であることが好ましい。さらなるエキソン（複数可）のスキッピングも誘導され、前記のさらなるエキソン（複数可）は、前記の第１の及び前記の第２のエキソンの間に位置することが好ましい。前記エキソンがスキップされている前記プレｍＲＮＡの得られた転写物は、インフレームである。このようなオリゴヌクレオチドのより詳細は、国際公開第２０１４００７６２０号に提供されている。
本明細書において定義されるように、ＤＭＤプレｍＲＮＡは、ジストロフィンタンパク質をコードするＤＭＤ遺伝子のプレｍＲＮＡを意味することが好ましい。突然変異されたＤＭＤプレｍＲＮＡは、罹患していない人の野生型ＤＭＤプレｍＲＮＡと比較した場合に突然変異を有し、異常なタンパク質（ＢＭＤ）又は機能性ジストロフィンの不在（ＤＭＤ）（そのレベルの低減）をもたらす、ＢＭＤ又はＤＭＤ患者のプレｍＲＮＡに対応する。ＤＭＤプレｍＲＮＡはまた、ジストロフィンプレｍＲＮＡと名付けられる。ＤＭＤ遺伝子はまた、ジストロフィン遺伝子と名付けられることもある。ジストロフィン及びＤＭＤは、本出願を通じて同義的に使用され得る。
患者は、本明細書において後記で定義されるようにＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する患者又はその遺伝的背景のためにＤＭＤ若しくはＢＭＤを発生しやすい患者を意味するものとすることが好ましい。ＤＭＤ患者の場合には、使用されるオリゴヌクレオチドは、前記患者のＤＭＤ遺伝子中に存在するような１つの突然変異を補正し、ＢＭＤタンパク質のように見えるタンパク質を生成することが好ましい。前記タンパク質は、本明細書において後記で定義されるように機能性又は半機能性ジストロフィンとなることが好ましい。ＢＭＤ患者の場合には、使用されるようなオリゴヌクレオチドは、前記患者のＢＭＤ遺伝子中に存在するような１つの突然変異を補正し、前記ＢＭＤ患者中に元々存在していたジストロフィンよりも機能性となるジストロフィンを生成することが好ましい。
本明細書において定義されるように、機能性ジストロフィンは、配列番号１において同定されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ジストロフィンであることが好ましい。本明細書において定義されるように、半機能性ジストロフィンは、そのＮ末端部分中の作用性結合ドメイン（Ｎ末端の最初の２４０個のアミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１から３６８５まで）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５個のアミノ酸）を有し、これらのドメインの各々が、当業者に公知のように野生型ジストロフィン中に存在するタンパク質に対応するＢＭＤ様ジストロフィンであることが好ましい。本明細書において示されるアミノ酸は、配列番号１によって表されている野生型ジストロフィンのアミノ酸に対応する。言い換えれば、機能性又は半機能性ジストロフィンは、少なくともある程度まで野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンである。「少なくともある程度まで」とは、野生型機能性ジストロフィンの対応する活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味することが好ましい。これに関連して、機能性ジストロフィンの活性は、アクチンとの、ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ又はＤＡＰＣ）との結合であることが好ましい（Ｅｈｍｓｅｎ Ｊら、２００２年）。
ジストロフィンのアクチンとの、及びＤＧＣ又はＤＡＰＣ複合体との結合は、当業者に公知のように、治療前及び／又は治療後に、ジストロフィーであると疑われる筋肉から得たものの対照（非ＤＭＤ）生検から得た、総タンパク質抽出物を使用する免疫共沈降又は複合体の種々のメンバーと反応する種々の抗体を使用する断面の免疫蛍光解析のいずれかによって可視化できる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている個人又は患者は、通常、完全タンパク質の合成を妨げる、ジストロフィン（ＤＭＤ又はジストロフィン遺伝子）をコードする遺伝子中の突然変異を有する、すなわち、中途停止コドンは、Ｃ末端の合成を妨げる。ベッカー型筋ジストロフィーでは、ジストロフィン遺伝子はまた、野生型と比較して突然変異を含むが、突然変異は、通常、中途停止コドンをもたらさず、Ｃ末端は、通常合成される。結果として、野生型タンパク質と、種類において少なくとも同一の活性であるが、必ずしも同量ではない活性を有する機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質が合成される。ＢＭＤ患者のゲノムは、通常、Ｎ末端部分（Ｎ末端の最初の２４０個のアミノ酸）、システインリッチドメイン（アミノ酸３３６１から３６８５まで）及びＣ末端ドメイン（Ｃ末端の最後の３２５個のアミノ酸）を含むが、ほとんどの場合、その中央の桿状ドメインが野生型ジストロフィンのものよりも短いジストロフィンタンパク質をコードする（Ｍｏｎａｃｏら、１９８８年）。ＤＭＤの治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導性エキソンスキッピングは、通常、中央の桿状ドメイン形状ドメインにおいてエキソンをスキップして、オープンリーディングフレームを修正し、Ｃ末端を含むジストロフィンタンパク質の残部の合成を可能にすることによってプレｍＲＮＡにおいて中途停止を克服するように向けられることが好ましく、それにもかかわらず、タンパク質は、より小さい桿状ドメインの結果として幾分か小さい。好ましい実施形態では、ＤＭＤを有する、本明細書において定義されるようなオリゴヌクレオチドによって治療されている個体は、少なくともある程度まで野生型ジストロフィンの活性を示すジストロフィンが提供される。前記個体が、デュシェンヌ型患者である、又はデュシェンヌ型患者であると疑われる場合には、機能性又は半機能性ジストロフィンは、ＢＭＤを有する個体のジストロフィンであり、通常、前記ジストロフィンは、アクチン及びＤＧＣ又はＤＡＰＣの両方と相互作用できるが、その中央の桿状ドメインは、野生型ジストロフィンのものよりも短いことがあることがより好ましい（Ｍｏｎａｃｏら、１９８８年）。野生型ジストロフィンの中央の桿状ドメインは、２４スペクトリン様リピートを含む。例えば、本明細書において提供されるようなジストロフィンの中央の桿状ドメインは、５〜２３、１０〜２２又は１２〜１８スペクトリン様リピートを含むことができ、並びに、アクチンと、及びＤＧＣと結合できる。
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して個体においてデュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状を軽減することは、以下のアッセイのいずれかによって評価できる：歩行ができなくなるまでの時間の延長、筋肉強度の改善、ウエイトを持ち上げる能力の改善、床から立ち上がるためにかかる時間の改善、９メートル歩行時間の改善、４階上がるためにかかる時間の改善、下肢機能グレードの改善、肺機能の改善、心臓機能の改善、クオリティオブライフの改善。これらのアッセイの各々は、当業者に公知である。例として、Ｍａｎｚｕｒら（２００８年）の刊行物は、これらのアッセイの各々の詳細な説明を示す。これらのアッセイの各々について、アッセイにおいて測定されるパラメータの検出可能な改善又は延長が見られるや否や、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状が、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して個人において軽減されていることを意味することが好ましい。検出可能な改善又は延長は、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（２００６年）に記載されるように統計的に有意な改善又は延長である。或いは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ又は複数の症状の軽減は、筋肉線維機能の改善、完全性及び／又は生存を測定することによって評価され得る。好ましい方法では、ＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者の１つ若しくは複数の症状が、軽減され、及び／又はＤＭＤ若しくはＢＭＤ患者から得た１種又は複数の筋肉細胞の１つ若しくは複数の特徴が改善される。このような症状又は特徴は、細胞レベル、組織レベルで、又は患者自体で評価できる。
患者から得た筋肉細胞の１つ若しくは複数の特徴の軽減は、患者から得た筋原細胞又は筋肉細胞で以下のアッセイのいずれかによって評価できる：筋肉細胞によるカルシウム取り込みの低減、コラーゲン合成の減少、形態学の変更、脂質生合成の変更、酸化ストレスの減少及び／又は筋肉線維機能の改善、完全性及び／又は生存。これらのパラメータは、普通、筋肉生検の断面図の免疫蛍光及び／又は組織化学的解析を使用して評価される。
筋肉線維機能の改善、完全性及び／又は生存は、以下のアッセイのうち少なくとも１つを使用して評価できる：血液中のクレアチンキナーゼの検出可能な減少、ジストロフィーであると疑われる筋肉の生検断面における筋肉線維の壊死の検出可能な減少及び／又はジストロフィーであると疑われる筋肉の生検断面における筋肉線維の直径の均一性の検出可能な増大。これらのアッセイの各々は、当業者に公知である。
クレアチンキナーゼは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（２００６年）に記載されるように血液中で検出できる。クレアチンキナーゼの検出可能な減少は、治療前の同一ＤＭＤ又はＢＭＤ患者におけるクレアチンキナーゼの濃度と比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少を意味し得る。
筋肉線維の壊死の検出可能な減少は、筋肉生検において、より好ましくは、生検断面を使用してＨｏｄｇｅｔｔｓら（２００６年）に記載されるように評価されることが好ましい。壊死の検出可能な減少は、生検断面を使用して壊死が同定されている領域の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の減少であり得る。減少は、治療前の同一ＤＭＤ又はＢＭＤ患者において評価されるような壊死に対する比較によって測定される。
筋肉線維の直径の均一性の検出可能な増大は、筋肉生検断面において、より好ましくは、Ｈｏｄｇｅｔｔｓら（２００６年）に記載されるように評価されることが好ましい。増大は、治療前の同一ＤＭＤ又はＢＭＤ患者における筋肉線維の直径の均一性に対する比較によって測定される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記個体に、機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供し（通常、ＤＭＤの場合には）、少なくとも幾分かは、前記個体における異常なジストロフィンタンパク質の生成を減少させることができる（通常、ＢＭＤの場合には）ことが好ましい。
異常なジストロフィンｍＲＮＡ又は異常なジストロフィンタンパク質の生成を減少させることは、異常なジストロフィンｍＲＮＡ又は異常なジストロフィンタンパク質の初期量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ以下が、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）又は免疫蛍光又はウエスタンブロット解析（タンパク質）によって依然として検出可能であることを意味することが好ましい。異常なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質はまた、本明細書において、あまり機能的ではない（本明細書において先に定義されるような野生型機能性ジストロフィンタンパク質と比較して）又は非機能性ジストロフィンｍＲＮＡ若しくはタンパク質と呼ばれる。非機能性ジストロフィンタンパク質は、アクチン及び／又はＤＧＣタンパク質複合体のメンバーと結合できないジストロフィンタンパク質であることが好ましい。非機能性ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンｍＲＮＡは、通常、無傷のタンパク質のＣ末端を有するジストロフィンタンパク質を有さない、又はコードしない。機能性又は半機能性ジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質の検出は、異常なジストロフィンｍＲＮＡ又はタンパク質についてのように行われ得る。
ひとたび、ＤＭＤ患者に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質が提供されると、ＤＭＤの原因の少なくとも一部が取り除かれる。したがって、次いで、ＤＭＤの症状が、少なくとも部分的に軽減されること又は症状が悪化する速度が低下され、より遅い減退をもたらすことが予測される。スキッピング頻度の増大はまた、ＤＭＤ又はＢＭＤ個体の筋肉細胞において産生される機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質のレベルも増大する。
脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）は、遺伝性障害であり、致死性であることが多く、これは、運動神経細胞生存（Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ）ＳＭＮ遺伝子によってコードされるＳＭＮタンパク質の喪失に起因する。ＳＭＮ遺伝子、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２は、染色体５に位置し、ＳＭＡは、両染色体からのＳＭＮ１の喪失によって引き起こされる。ＳＭＮ１とほとんど同一であるＳＭＮ２は、ＳＭＮタンパク質を提供するのにはあまり有効ではない。ＳＭＮ１は、ｓｎＲＮＰアセンブリー、細胞生存にとって必須のプロセスに必要である、遍在性発現される３８ｋＤａ ＳＭＮタンパク質をコードする。ＳＭＮ１及びＳＭＮ２は、エキソン７の位置６の重大なＣからＴへの突然変異（ＳＭＮ２の転写物におけるＣ６Ｕ）によって異なる。Ｃ６Ｕは、コード配列を変更しないが、ＳＭＮ２においてエキソン７スキッピングを引き起こすのに十分である。これは、不安定な末端切断型タンパク質、ＳＭＮΔ７につながる。ＳＭＡの重症度は、いくつかのコピーがあるＳＭＮ２を用いて、そのＳＭＮタンパク質を産生する効率によって影響される。ＳＭＡ患者では、ＳＭＮ２は、一般に、不安定な末端切断型タンパク質、細胞生存を確実にできないＳＭＮΔ７を産生するエキソン７スキッピングのために、ＳＭＮ１の喪失を代償できない。現在、ＳＭＡの利用可能な治療は、慢性運動単位喪失の二次効果の予防及び管理からなる。ＳＭＡの治療又は予防のために利用可能な薬物はない。スプライススイッチングのためのアンチセンス技術を使用してＳＭＡ治療のための新規治療薬を提供できる。有効な薬剤は、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのスプライシングを変更でき、治療上有用である可能性が高い。ＳＭＡの別の分子機序は、点突然変異（Ｅ１３４Ｋ）であり得る。
好ましいＡＯＮは、細胞において、エキソン７が欠失したＳＭＮ２ ｍＲＮＡに対して、エキソン７を含有するＳＭＮ２ ｍＲＮＡのレベルを増強する。好ましいＡＯＮは、ＡＯＮがＳＭＮ２遺伝子内の領域と特異的にハイブリダイズするように、適当な長さで、相補性のものであることが好ましく（より好ましくは、本明細書において後記で定義されるような）、その結果、細胞におけるエキソンが欠失したＳＭＮ２ ｍＲＮＡに対するエキソン７を含有するＳＭＮ２ ｍＲＮＡのレベルが増強される。好ましいＡＯＮは、配列番号１４００〜１５７９を含む又はからなる。より好ましいＡＯＮは、配列番号１４９０を含む又はからなる。ＳＭＡの場合には、プレｍＲＮＡスプライシング調節は、ＳＭＮ２ プレｍＲＮＡ中に１つ又は複数のエキソン、好ましくは、エキソン７を含み、エキソン７を含有するＳＭＮ２ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を増大することによって機能性ＳＭＮ２レベルを増大するように適用され得る。これは、疾患の進行を遅延又は、さらには停止できるという最終目的を有する。
好ましい実施形態では、ＡＯＮは、細胞における、臓器における、組織における及び／又は個体におけるＳＭＮプレｍＲＮＡ、好ましくは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡ中へのエキソン７包含を誘導するために使用される。エキソン包含は、そうでなければスキップされるエキソン７を含有する成熟ＳＭＮ ｍＲＮＡをもたらし、したがって、より多くの機能性タンパク質産物の発現につながり得ることが好ましい。少なくとも１つのエキソン、好ましくは、エキソン７の包含は、ＡＯＮの、スプライシング調節エレメント、スプライス部位及び／又はイントロン枝分かれ部位配列を含む特異的配列、好ましくは、イントロン内部の配列との結合によって誘導されることが好ましい。
本明細書において定義されるように、ＳＭＮ１プレｍＲＮＡは、ＳＭＮタンパク質をコードするＳＭＮ１遺伝子のプレｍＲＮＡを意味することが好ましい。本明細書において定義されるように、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡは、ＳＭＮタンパク質をコードするＳＭＮ２遺伝子のプレｍＲＮＡを意味することが好ましい。ＳＭＡを患っている対象のプレｍＲＮＡが論じられる場合には、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡは、ＳＭＮプレｍＲＮＡと名付けられることもあり、これは、ＳＭＡ患者では、ＳＭＮ１遺伝子が存在せず、したがって、すべてのＳＭＮプレｍＲＮＡがＳＭＮ２プレｍＲＮＡであるからである。このような場合には、ＳＭＮ２遺伝子はまた、ＳＭＮ遺伝子と名付けられることもある。
患者は、本明細書において定義されるようなＳＭＡを有する患者又はその遺伝的背景のためにＳＭＡを発症しやすい患者を意味するものとすることが好ましい。ＳＭＡ患者の場合には、使用されるオリゴヌクレオチドは、前記患者のＳＭＮ２遺伝子中に存在するようなエキソン７の包含を促進し、ＳＭＮΔ７タンパク質ではなく機能性ＳＭＮタンパク質を生成することが好ましく、前記タンパク質は、本明細書において後記に定義されるような機能性又は半機能性ＳＭＮとなることが好ましい。ＳＭＡ患者の場合には、使用されるようなオリゴヌクレオチドは、前記患者のＳＭＮ２遺伝子中に存在するような突然変異の効果を抑制又は低減し、前記ＳＭＡ患者中に元々存在していたＳＭＮタンパク質、しばしばＳＭＮΔ７タンパク質よりも機能性となるＳＭＮタンパク質のレベルの増大をもたらすことが好ましい。ＳＭＮタンパク質対ＳＭＮΔ７タンパク質の比は、機能性ＳＭＮタンパク質寄りにシフトすることが好ましい。治療後に検出されるＳＭＮタンパク質対ＳＭＮΔ７タンパク質の好ましいモル比は、５：４、５：３、５：２、５：１又は１０：１である。ＳＭＮΔ７タンパク質は、もはや検出できない、又は微量でしか検出できないことが最も好ましい。
本明細書において定義されるように、機能性ＳＭＮタンパク質は、配列番号１５８１に同定されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する野生型ＳＭＮであることが好ましい。機能性ＳＭＮタンパク質は、エキソン７を含むことが好ましい。このエキソン７は、配列番号１５８４で同定される。言い換えれば、機能性又は半機能性ＳＭＮタンパク質は、少なくともある程度まで野生型ＳＭＮタンパク質の活性を示すＳＭＮタンパク質である。「少なくともある程度まで」は、野生型機能性ＳＭＮタンパク質の対応する活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％を意味することが好ましい。これに関連して、機能性ＳＭＮタンパク質の好ましい活性は、当業者に公知のように、テロメラーゼ再生に、転写調節に、及び細胞輸送に関する。機能性ＳＭＮタンパク質のより好ましい活性は、機能性ｓｎＲＮＰアセンブリーの形成及びＳｍタンパク質（Ｓｍｉｔｈタンパク質）との相互作用である。
機能性ＳＭＮは、Ｓｍ Ｄ１及びＤ３タンパク質のＡｒｇ及びＧｌｙリッチＣ末端テールと結合する（Ｓｅｌｅｎｋｏら、２００１年）。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質としてのＳｍ Ｄ１及びＳｍ Ｄ３のＣ末端の発現及び単離されたＳＭＮタンパク質を用いるプルダウン実験によってこの相互作用を研究するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを実施できる。あまり機能的ではないＳＭＮは、相互作用をあまり又は全く示さない。このようなアッセイは総タンパク質抽出物を使用して実施できる。或いは、エキソン７によってコードされる領域と、又はその領域の一部と、又はエキソン７を含むＳＭＮ中にのみ存在するフォールディングと相互作用する種々の抗体を使用する生検断面の免疫蛍光解析によって、エキソン７が包含されたＳＭＮを検出できる。当業者に公知であるように、非ＳＭＡ（対照）生検との比較が適当であり得る。
好ましい実施形態では、ＳＭＡを有し、本明細書において定義されるようなＡＯＮによって治療されている個体は、少なくともある程度まで、通常ＳＭＮ１遺伝子によってコードされるような野生型ＳＭＮタンパク質の活性を示すＳＭＮタンパク質が提供される。前記個体がＳＭＡ患者である、又はＳＭＡ患者であると疑われる場合には、機能性ＳＭＮタンパク質は、通常、ＳＭＮ１遺伝子によってコードされるようなエキソン７が含まれるＳＭＮタンパク質であることがより好ましい。
ＡＯＮを使用して個体においてＳＭＡの１つ又は複数の症状を軽減することは、以下のアッセイのいずれかによって評価できる：対象の体重増加の改善、対象における運動活性の改善及び対象又は運動ニューロン細胞いずれかの生存時間の増大及び機能性ＳＭＮの生成の増大。これらのパラメータの各々は、当業者に公知であり、日常的にアッセイされ得る。これらのアッセイの各々について、アッセイにおいて測定されたパラメータの検出可能な改善又は延長が見られるや否や、本発明に従うオリゴヌクレオチドを使用して個体においてＳＭＡの１つ又は複数が軽減されたことを意味することが好ましい。検出可能な改善又は延長は、統計的に有意な改善又は延長であることが好ましい。或いは、ＳＭＡの１つ又は複数の症状の軽減は、筋肉機能の改善、完全性及び／又は生存を測定することによって評価できる。好ましい方法では、ＳＭＡ患者の１つ若しくは複数の症状が軽減され、及び／又はＳＭＡ患者から得た１つ若しくは複数の筋肉細胞の１つ若しくは複数の特徴が改善される。このような症状又は特徴は、細胞レベル、組織レベル又は患者自身で評価できる。
患者から得た運動ニューロン細胞の１つ又は複数の特徴の軽減は、患者から得た細胞で以下のアッセイのいずれかによって評価できる：カルシウム取り込みの低減、ｓｎＲＮＰ生成の減少、コラーゲン合成の減少、形態学の変更、脂質生合成の変更、酸化ストレスの減少及び／又は筋肉機能の改善、完全性及び／又は生存。これらのパラメータは、普通、筋肉生検などの生検の断面図の免疫蛍光及び／又は組織化学的解析を使用して評価される。
運動ニューロン生存の検出可能な増加は、筋肉生検において、生検断面を使用して評価されることが好ましい。生存の検出可能な増加は、治療されていない対照サンプルと比較して、生存の公知の割合若しくはこれまでの割合と比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の増加であり得る。増加は、治療前の同一ＳＭＡ患者において評価されたような生存に対する比較によって測定される。
運動ニューロン生存の検出可能な増加は、当業者に公知のように、例えば、Ｌｕｎｎら、２００４年に記載されるような方法を使用して評価できる。
ＡＯＮは、前記個体に、機能性又は半機能性ＳＭＮタンパク質を提供し、少なくとも幾分かは、前記個体におけるＳＭＮΔ７などの異常なＳＭＮタンパク質の生成を減少させることができることが好ましい。
異常なＳＭＮ ｍＲＮＡ又は異常なＳＭＮタンパク質の生成を減少させることは、異常なＳＭＮ ｍＲＮＡ又は異常なＳＭＮタンパク質の初期量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満が、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）又は免疫蛍光又はウエスタンブロット解析（タンパク質）によって依然として検出可能であることを意味することが好ましい。異常なＳＭＮ ｍＲＮＡ又はタンパク質はまた、あまり機能的ではない（本明細書において先に定義されるような野生型機能性ＳＭＮタンパク質と比較して）又は非機能性ＳＭＮ ｍＲＮＡ若しくはタンパク質とも呼ばれる。非機能性ＳＭＮタンパク質は、Ｓｍタンパク質と結合できない及び／又はｓｎＲＮＰアセンブリーを促進しない、若しくは妨害するＳＭＮタンパク質であることが好ましい。非機能性ＳＭＮタンパク質又はＳＭＮ ｍＲＮＡは、通常、エキソン７によってコードされるアミノ酸配列を有さない、又はコードしない。機能性又は半機能性ＳＭＮ ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出は、異常なＳＭＮ ｍＲＮＡ又はタンパク質について行うことができる。
ひとたび、ＳＭＡ患者に、機能性又は半機能性ＳＭＮタンパク質が提供されると、ＳＭＡの原因の少なくとも一部が取り除かれる。したがって、次いで、ＳＭＡの症状が、少なくとも部分的に軽減されること又は症状が悪化する速度が低下され、より遅い減退をもたらすことが予測される。包含頻度の増大はまた、ＳＭＡ個体の細胞において産生される機能性又は半機能性ＳＭＮタンパク質のレベルも増大する。
エキソン及びイントロンは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効な標的であると示されているスプライシング調節エレメントを含む１つ又は複数の特定の配列を含有する。一実施形態は、したがって、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィン又はＳＭＮタンパク質を提供するためにオリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡエキソン又はイントロン中のこれらのスプライシング調節エレメントと特異的に結合する及び／又は遮断する配列を含む。さらに、両スプライス部位がスプライセオソーム複合体によって認識される場合には、結果として得られるｍＲＮＡ中にエキソンのみが含まれるので、スプライス部位は、本発明のオリゴヌクレオチドの他の標的である。したがって、一実施形態は、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィン又はＳＭＮタンパク質を提供するためにオリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン若しくはＳＭＮ２プレｍＲＮＡのエキソンの両スプライス部位のうち一方若しくは両方と特異的に結合する及び／又は遮断する配列を含む。普通、エキソンのスプライス部位は、前記エキソン中に存在する１、２、３つ又はそれ以上のヌクレオチド及び隣接する若しくは付近のイントロン中に存在する１、２、３つ又はそれ以上のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン領域とのみ結合するオリゴヌクレオチドが使用される。しかし、これは、必要ではない：イントロン特異的配列並びにエキソン特異的配列を標的化する、又は結合するオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。もちろん、オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン又はＳＭＮ２エキソン又はイントロンの全配列と必ずしも結合しない。このようなエキソン又はイントロンの一部と特異的に結合するオリゴヌクレオチドが好ましい。オリゴヌクレオチドが使用され、前記オリゴヌクレオチドが、エキソン及び／又はイントロンの少なくとも一部と、相補的である、それと結合する、又はそれを標的化し、前記の一部が、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドを有することが好ましい。
プレｍＲＮＡのスプライシングは、イントロン分岐点及び隣接するイントロンのスプライス部位を含む２つの連続エステル転移反応によって起こる。したがって、オリゴヌクレオチドは、エキソンスキッピングのために使用されることが好ましく、前記オリゴヌクレオチドは、このような分岐点及び／又はスプライス部位と結合する配列を含む。前記スプライス部位及び／又は分岐点が、ジストロフィンプレｍＲＮＡ中に存在することが好ましい。
スプライス部位はコンセンサス配列含有するので、スプライス部位と結合可能である配列を含むオリゴヌクレオチド部分又はその機能性等価物の使用は、乱雑なハイブリダイゼーションのリスクを伴う。前記オリゴヌクレオチドの、スキップされるべきエキソンの部位以外のスプライス部位とのハイブリダイゼーションは、スプライシングプロセスの正確性を容易に干渉し得る。スプライス部位と結合するオリゴヌクレオチドの使用と関連するこれら及びその他の可能性ある問題を克服するために、最も好ましい実施形態は、前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィン又はＳＭＮタンパク質を提供するためのオリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物は、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡエキソン又はイントロンの特定の部分と結合する。エキソンは、非コーディングイントロン配列よりも特異的であるコード配列を通常含有する。ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソンの特定の部分との前記オリゴヌクレオチド結合は、前記ジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡ中のスプライシング調節配列及び／又は予測されるエキソン（複数可）の構造を特異的に遮断、干渉及び／又は阻害可能であることが好ましい。このようなスプライシング調節配列及び／又は構造を干渉することは、このようなエレメントがエキソン内に位置するという利点を有する。したがって、配列関連オフターゲット効果のリスクが制限される。エキソンスキッピングの場合には、スキップされるべきエキソンの内部にオリゴヌクレオチドを提供することによって、エキソンをスプライシング装置からマスクすることが可能である。スプライシング装置が、スキップされるべきエキソンを認識できないことは、したがって、最終ｍＲＮＡからのエキソンの排除につながる。エキソン包含の場合には、例えば、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）を遮断するためにオリゴヌクレオチドを提供することによって、エキソン包含の増大が達成される。ＡＯＮのＩＳＳ領域とのハイブリダイゼーションは、トランス作用性負のリプレッサーを置換できる、及び／又は含まれるべきエキソンの５’スプライス部位でのＵ１小核ＲＮＡの結合を干渉する、シス作用性ＲＮＡステム−ループを巻き戻すことができる。これらの実施形態は、スプライシング機構（エキソンの連結）の酵素的プロセスを直接干渉しない。これが、方法がより特異的であり、及び／又は信頼できるものであることを可能にすると考えられる。
本発明の関連内で、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能性等価物を含み得る。オリゴヌクレオチドのさらなる等価物は、１つ又は複数のヌクレオチドが置換されており、前記機能性等価物の活性が少なくともある程度まで保持されている本明細書において定義されるようなオリゴヌクレオチドを意味することが好ましい。オリゴヌクレオチドの機能性等価物を含む前記オリゴヌクレオチドの活性は、機能性又は半機能性ジストロフィン又はＳＭＮタンパク質を提供することであることが好ましい。したがって、オリゴヌクレオチドの機能性等価物を含む前記オリゴヌクレオチドの前記活性は、機能性又は半機能性ジストロフィン又はＳＭＮタンパク質の量を定量することによって評価されることが好ましい。機能性又は半機能性ジストロフィンは、アクチン及びＤＧＣ（又はＤＡＰＣ）タンパク質複合体のメンバーと結合可能なジストロフィンであると本明細書において定義されることが好ましい。オリゴヌクレオチドの前記機能性等価物の前記活性の評価は、ＲＴ−ＰＣＲ及びシーケンシング（ＲＮＡレベルでの；特異的エキソンスキッピング（ＤＭＤ）又は包含（ＳＭＡ）の検出のための）によって、又は免疫蛍光及びウエスタンブロット解析（タンパク質レベルでの：タンパク質回復の検出のための）によって行われることが好ましい。前記活性は、機能性等価物が由来する前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又はそれ以上を表す場合には、少なくともある程度まで保持されることが好ましい。本出願を通じて、語句オリゴヌクレオチドが使用される場合には、本明細書において定義されるようなその機能性等価物によって置換されてもよい。本出願を通じて、語句オリゴヌクレオチドが使用される場合には、特に断りのない限り、本明細書において定義されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドによって置換されてもよい。
したがって、２’−Ｏ−メチルモノマー、好ましくは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーを含む、又は２’−Ｏ−メチルＲＮＡからなる、任意選択で、ホスホロチオエートを含む、５−メチルピリミジン（すなわち、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル）塩基を有する又は有さない少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾を含む、ジストロフィン若しくはＳＭＮ２プレｍＲＮＡエキソン若しくはイントロンと、相補的である、それと結合する、若しくはそれを標的化する、若しくはそれとハイブリダイズする配列を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される本発明に従うオリゴヌクレオチド又はその機能性等価物の使用は、本明細書において先に示されるような５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシルを有する／又は有さない任意のＢＮＡスキャフォールド修飾を含まないその対応物と比較した場合に、本明細書においてすでに定義されているように、前記オリゴヌクレオチドのパラメータのうち少なくとも１つに対して正の効果を有すると推測され、したがって、患者のＤＭＤ若しくはＢＭＤ若しくはＳＭＡ細胞において、及び／又はＤＭＤ若しくはＢＭＤ若しくはＳＭＡ患者において治療結果の改善を示すと推測される。このような治療結果は、ＤＭＤ又はＢＭＤ又はＳＭＡの１つ又は複数の症状を軽減することを特徴とし得る。このような治療結果はまた、以下であり得る、或いは、以下を特徴とし得る：
前記症状のうち１つ若しくは複数の増大若しくは悪化の速度を低減すること及び／又は、
患者から得た筋肉細胞の１つ若しくは複数の特徴を軽減すること及び／又は、
前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィン若しくはＳＭＮタンパク質を提供すること及び／又は、
脊髄における運動ニューロンの喪失を減少させること及び／又は
前記個体において随意筋の萎縮を減少させること及び／又は異常なジストロフィンタンパク質の生成を少なくとも幾分か減少させること。
これらの特徴の各々は、本明細書においてすでに定義されている。
オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡの少なくとも一部と、結合する、それを標的化する、それと相補的である配列を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることが好ましく、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有する。しかし、前記オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３のヌクレオチドであり得る。
１つの好ましい実施形態は、前記個体に、機能性又は半機能性ジストロフィン又はＳＭＮタンパク質を提供するためにオリゴヌクレオチドを提供し、前記オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物は、以下を含む配列によって表される：
ジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡエキソン（閉構造）の別の部分とハイブリダイズされるジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡエキソンの領域と、結合する、それを標的化する、ハイブリダイズする、又はそれと相補的である配列、及び
前記ジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡ（開構造）中のハイブリダイズされないジストロフィン又はＳＭＮ２プレｍＲＮＡエキソンの領域と、結合する、それを標的化する、ハイブリダイズする、又はそれと相補的である配列。
この実施形態のために、国際公開第２００４／０８３４４６号特許出願が参照される。ＲＮＡ分子は、大部分は、同一ＲＮＡ内の相補的又は部分的に相補的なストレッチの塩基対形成のために強力な二次構造を示す。ＲＮＡ中のその構造は、ＲＮＡの機能において役割を果たすと長く考えられてきた。理論に捉われようとは思わないが、エキソンのＲＮＡの二次構造は、スプライシングプロセスの構造化において役割を果たすと考えられる。その構造によって、エキソンは、ｍＲＮＡ中に含まれことを必要とする部分として認識される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、エキソンの構造を干渉可能であり、したがって、前記エキソンのスプライシング装置を干渉し、エキソンをスプライシング装置からマスクし、それによって、前記エキソンのスキッピングを誘導可能である。多数のオリゴヌクレオチドは、実際、この能力を含み、いくつかは、他のものよりも効率的であることがわかった。理論に捉われようとは思わないが、開構造との重複が、オリゴヌクレオチドの侵入効率を改善する（すなわち、オリゴヌクレオチドが構造中に入ることができる効率を増大する）が、閉構造との重複は、続いて、エキソンのＲＮＡの二次構造を干渉する効率を増大すると考えられる。閉構造及び開構造両方に対する部分相補性の長さは、極度に制限されないということがわかる。本発明者らは、いずれかの構造中に可変長の相補性を有するオリゴヌクレオチドを含む化合物を用いて高い効率を観察した。用語（逆）相補的は、生理学的状態下で別の核酸のストレッチとハイブリダイズできる核酸のストレッチを指すために本明細書において使用される。アンチセンス鎖は、一般に対応するセンス鎖に対して相補的であるといわれる。これに関連して、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その標的に対して相補的である。ハイブリダイゼーション状態は、本明細書において後記で定義される。したがって、相補性の領域中のすべての塩基が、反対の鎖中の塩基と対合可能であることは絶対的に必要ではない。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドヲ設計する場合には、例えば、相補鎖の塩基と塩基対形成しない残基を組み込もうとしてもよい。細胞中の環境下で、ヌクレオチドのストレッチが相補的部分とハイブリダイズ可能である場合には、ミスマッチはある程度まで許容され得る。
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（前記開構造に対する又は前記閉構造のいずれかに対する）の相補的部分は、少なくとも３、より好ましくは、少なくとも４つの連続ヌクレオチドを含む。相補的領域は、組み合わされた場合に、それらがプレｍＲＮＡ中のエキソンに対して特異的であるように設計されることが好ましい。このような特異性は、系中のその他の（プレ−）ｍＲＮＡ中の実際の配列に応じて変わるように、種々の長さの相補的領域を用いて作り出すことができる。１つ又は複数のその他のプレｍＲＮＡも、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズできるであろうというリスクは、前記オリゴヌクレオチドの大きさが増大するにつれ減少する。相補性の領域中にミスマッチを含むが、プレｍＲＮＡ中の標的化される領域とハイブリダイズする能力を保持するアンチセンスオリゴヌクレオチドを本発明において使用できることは明らかである。しかし、少なくとも相補的部分は、このようなミスマッチを含まないことが好ましいが、これは、これらは、通常、１つ又は複数の相補的領域中にこのようなミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりも高い効率及び高い特異性を有するからである。より高いハイブリッド形成力（すなわち、反対の鎖との相互作用の数を増大する）が、系のスプライシング機構を干渉するプロセスの効率を増大するには好都合であると考えられる。
単一エキソンスキッピングを誘導するのに適しているＡＯＮについては、相補性は、９０〜１００％であることが好ましい。一般に、これは、２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中、１又は２つのミスマッチ又は４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中、１〜４つのミスマッチを許容する。したがって、本発明者らは、１０〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中に１、２、３、４、５つのミスマッチを有し得る。１０〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中に、０、１又は２つのミスマッチが存在することが好ましい。
いわゆるマルチスキッピングＡＯＮ（第１のエキソンの領域と及び同一プレｍＲＮＡ内の別のエキソン（すなわち、第２のエキソン）の領域と結合可能であるＡＯＮであって、前記の第２のエキソンの前記領域が、前記の第１のエキソンの前記領域と少なくとも５０％の同一性を有するＡＯＮ）については、前記の第１のエキソンの前記領域に対する少なくとも８０％の相補性及び前記の第２のエキソンの前記領域に対する少なくとも４５％の相補性があることが好ましい。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記の第１の前記領域に対して少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％相補的であり、前記の第２のエキソンの前記領域に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％相補的であることがより好ましい。しかし、相補性は、オリゴヌクレオチドの全長にわたって必ずしも評価されないことが好ましい。
このようないわゆるマルチスキッピングＡＯＮについては、第１のエキソンの領域は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、又は最大９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のヌクレオチドであり得る。第１のエキソンの領域はまた、前記エキソンの長さの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％であると定義され得る。第１のエキソンの領域は、同一性領域と呼ばれることがある。
このようないわゆるマルチスキッピングＡＯＮについては、第２のエキソンの領域は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０又は最大９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のヌクレオチドであり得る。第２のエキソンの領域は、前記エキソンの長さの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％であると定義され得る。第２のエキソンの領域は、同一性領域と呼ばれることがある。いわゆるマルチスキッピングＡＯＮの好ましいさらなる特徴は、国際公開第２０１４００７６２０号に記載されている。
構造（すなわち、開構造及び閉構造）は、エキソンが存在するプレｍＲＮＡに関連して最良に解析される。このような構造は、実際のＲＮＡにおいて解析され得る。しかし、構造モデリングプログラムを使用して上手くＲＮＡ分子の二次構造を予測することが現在可能である（最低のエネルギーコストで）。適したプログラムの限定されない例として、ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５又はＲＮＡ ｍｆｏｌｄバージョン３．５（Ｚｕｋｅｒら、２００３年）がある。当業者ならば、エキソンのあり得る構造、与えられるヌクレオチド配列を適した再現性をもって予測できるであろう。前記エキソン及びそれぞれの両端に位置するイントロン配列とともにこのようなモデリングプログラムを提供した場合に、最良の予測が得られる。全プレｍＲＮＡの構造をモデリングすることは、通常、必要ではない。
オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが向けられる開構造及び閉構造は、互いに隣接することが好ましい。このようにして、オリゴヌクレオチドの開構造とのアニーリングは、アニーリングがこの閉構造に進むとすぐ、閉構造の開放を誘導すると考えられる。この作用を通して、あらかじめ閉じられていた構造は、異なるコンホメーションをとる。
しかし、可能性ある（潜在性の）スプライスアクセプター及び／又はドナー配列が、標的化されるエキソン内に存在する場合、時には、異なる（新しい）エキソン、すなわち異なる５’末端、異なる３’末端又は両方を有するエキソンを規定する新規エキソン包含シグナルが生じる。この種の活性は、標的化されたエキソンがｍＲＮＡから排除されるので、本発明の範囲内にある。ｍＲＮＡ中の標的化されたエキソンの一部を含有する新規エキソンの存在は、標的化されたエキソンがそのようなものとして排除されるという事実を変更しない。新エキソンの包含は、ほんの時折生じる副作用として見られ得る。エキソンスキッピングが、突然変異の結果として破壊されるジストロフィンのオープンリーディングフレーム（の一部）を回復させるために使用される場合には、２つの可能性がある。１つは、新エキソンがリーディングフレームの回復において機能性であるが、その他の場合にはリーディングフレームは回復されないということである。エキソンスキッピングによってジストロフィンリーディングフレームを回復するためのオリゴヌクレオチドを含む化合物を選択する場合には、もちろん、これらの条件下で、新エキソンを有する又は有さない、ジストロフィンオープンリーディングフレームを回復させるエキソンスキッピングを実際にもたらすそれらのオリゴヌクレオチドを含むそれらの化合物のみが選択されることは明らかである。
前記個体に機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質を提供するためのオリゴヌクレオチドがさらに提供され、前記オリゴヌクレオチド又はその機能性等価物は、上記のようなオリゴヌクレオチドであり、すなわち、２’−Ｏ−メチルモノマーを含み、２’−Ｏ−メチルモノマー、好ましくは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーからなり、任意選択で、ホスホロチオエートを含み、５−メチルピリミジン（すなわち、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル）を有する又は有さないＢＮＡスキャフォールドをさらに含み、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエキソンのＲＮＡ中のセリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質の結合部位と、相補的である、又はそれと結合、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする配列を含むヌクレオチド配列によって表される。国際公開第２００６／１１２７０５号特許出願において、本発明者らは、エキソンスキッピングの誘導におけるエキソン内部アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率と、前記ＡＯＮの標的プレｍＲＮＡ中の予測されるＳＲ結合部位の存在（例えば、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒによる）の間の相関の存在を開示した。したがって、一実施形態では、オリゴヌクレオチドが作製され、ジストロフィンエキソンのＲＮＡ中のＳＲ（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）タンパク質の（推定）結合部位を決定すること並びに前記ＲＮＡと、相補的である、それと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする、及び前記（推定）結合部位と少なくとも部分的に重複するオリゴヌクレオチドを含む対応する化合物を製造することを含む。用語「少なくとも部分的に重複する」は、ＳＲ結合部位の単一ヌクレオチドのみ並びに前記結合部位の複数のヌクレオチドの重複並びに前記結合部位の完全重複を含むと本明細書において定義される。この実施形態は、前記ＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分とハイブリダイズされる領域（閉構造）及び前記構造中のハイブリダイズされない領域（開構造）を決定すること、続いて、前記（推定）結合部位と少なくとも部分的に重複する、及び前記閉構造の少なくとも一部と重複し、前記開構造の少なくとも一部と重複するオリゴヌクレオチドを作製することをさらに含むことが好ましい。このようにして、本発明者らは、プレｍＲＮＡからｍＲＮＡへのエキソン包含を干渉可能であるオリゴヌクレオチドを得る機会を増大する。第１の選択されたＳＲ結合領域が、必要とされる開−閉構造を有さないことがあり得、この場合には、別の（第２の）ＳＲタンパク質結合部位が選択され、これが続いて、開−閉構造の存在について試験される。このプロセスは、ＳＲタンパク質結合部位並びに（部分的に重複する）開−閉構造を含有する配列が同定されるまで継続される。次いで、この配列は、前記配列と相補的であるオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するためのこのような方法はまた、記載された順序を反転すること、すなわち、ジストロフィンエキソンから得られるＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分とハイブリダイズされる構造（閉構造）を想定する領域及び前記構造中のハイブリダイズされない領域（開構造）を決定すること、続いて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、前記閉構造と相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも別の部分が、前記開構造と相補的であるオリゴヌクレオチドを作製することを含むオリゴヌクレオチドをまず作製することによって実施される。次いで、これに、ＳＲタンパク質結合部位が、前記開／閉構造と少なくとも重複するか否かを決定することが続く。このようにして、国際公開第２００４／０８３４４６号の方法が改善される。さらに別の実施形態では、選択は同時に実施される。
いずれかの理論に捉われようとは思わないが、現在、ＳＲタンパク質結合部位に向けられる、又はそれを標的化するオリゴヌクレオチドの使用は、破壊された又は損なわれたスプライシングをもたらす、ＳＲタンパク質の、ＳＲタンパク質の結合部位との結合を損なうことをもたらす（少なくとも部分的に）と考えられている。
開／閉構造及びＳＲタンパク質結合部位は、部分的に重複することが好ましく、開／閉構造がＳＲタンパク質結合部位と完全に重複すること又はＳＲタンパク質結合部位が開／閉構造を完全に重複することがいっそうより好ましい。これは、エキソン包含の破壊の改善を可能にする。
連続スプライス部位及び枝分かれ部位イントロン配列に加えて、多数の（すべてではないが）エキソンは、スプライセオソームによる本当のスプライス部位の認識を促進するために、それだけには限らないが、エキソン性スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列などのスプライシング調節配列を含有する（Ｃａｒｔｅｇｎｉら、２００２年及びＣａｒｔｅｇｎｉら、２００３年）。ＳＲタンパク質と呼ばれるスプライシング因子のサブグループは、これらのＥＳＥと結合し、Ｕ１及びＵ２ＡＦなどのその他のスプライシング因子を（弱く規定された）スプライス部位に補充できる。４種の最も豊富なＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０及びＳＲｐ５５）の結合部位は、詳細に解析されており、これらの結果は、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒ、これらのＳＲタンパク質の可能性ある結合部位を予測するウェブ情報源において実行される（Ｃａｒｔｅｇｎｉら、２００２年及びＣａｒｔｅｇｎｉら、２００３年）。ＡＯＮがエキソンスキッピングのためのものである実施形態では、ＡＯＮの有効性と、前記ＡＯＮによって標的化される部位中のＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５及びＳＲｐ４０結合部位の有／無の間に相関がある。好ましい実施形態では、したがって、本発明は、ＳＲタンパク質の結合部位と、相補的である、又はそれを標的化する、又は結合する上記のようなオリゴヌクレオチドを提供する。前記ＳＲタンパク質は、ＳＦ２／ＡＳＦ又はＳＣ３５又はＳＲｐ４０であることが好ましい。ＡＯＮがエキソン包含のためのものである実施形態では、ＡＯＮの有効性と、前記ＡＯＮによって標的化される部位中のＵ１小核ＲＮＡ結合部位又は異種核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）結合部位又は小核リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）の存在の間に相関がある。好ましい実施形態では、本発明は、Ｕ１小核ＲＮＡ、ｓｎＲＮＰ又はｈｎＲＮＰなどのｓｎＲＮＡの結合部位と、相補的である、又はそれを標的化する、又は結合する上記のようなオリゴヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、ＤＭＤ患者に、上記のようなオリゴヌクレオチドを使用することによって機能性又は半機能性ジストロフィンタンパク質、又はその機能性等価物、すなわち、２’−Ｏ−メチルモノマー、好ましくは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーを含む、又は２’−Ｏ−メチルＲＮＡからなり、５−メチルピリミジン（すなわち、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル）塩基を有する又は有さない少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールドを含み、転写物におけるジストロフィンエキソンの正しいスプライシングに必要である調節ＲＮＡ配列と特異的に結合可能である、又はそれを標的化可能であるオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかのシス作用性ＲＮＡ配列が、転写物におけるエキソンの正しいスプライシングに必要である。構成的及び代替エキソンの特異的及び効率的スプライシングを調節するために、特に、エキソン性スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エキソン認識配列（ＥＲＳ）及び／又はエキソン性スプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）及び／又はイントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）などのエレメントが同定される。エレメントと、結合する、それを標的化する、又はそれと相補的である配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、ＤＭＤ又はＳＭＡについて示されるようにエキソンがスキップされる、又は含まれるようにその調節機能が妨げられる。したがって、１つの好ましい実施形態では、エキソン性スプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、エキソン認識配列（ＥＲＳ）及び／又はエキソン性スプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）及び／又はイントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）と、相補的である、それと結合する、又はそれを標的化するオリゴヌクレオチド又はその機能性等価物が使用される。
好ましい実施形態では、単一エキソンのスキッピングを導入するのに適している本発明のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５の少なくとも一部と、相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする配列を含む、又はからなり、前記部分は、少なくとも１０ヌクレオチドを有する。しかし、前記部分はまた、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドを有し得る。上記で同定されたジストロフィンエキソンについては、本発明者らは、オリゴヌクレオチドが、好ましくは、結合する、又は相補的である、又は標的化する、又はハイブリダイズする、前記エキソンから得られたヌクレオチドのストレッチ（配列番号２〜７）を提供する。
好ましい実施形態では、本明細書において先に定義されたようないわゆるマルチスキッピングに適している本発明のオリゴヌクレオチドは、以下のジストロフィンエキソンのスキッピングを誘導する：エキソン８〜１９、エキソン９〜２２、エキソン９〜３０、エキソン１０〜１８、エキソン１０〜３０、エキソン１０〜４２、エキソン１０〜４７、エキソン１０〜５７、エキソン１０〜６０、エキソン１１〜２３、エキソン１３〜３０、エキソン２３〜４２、エキソン３４〜５３、エキソン４０〜５３、エキソン４４〜５６、エキソン４５〜５１、エキソン４５〜５３、エキソン４５〜５５、エキソン４５〜６０又はエキソン５６〜６０。本発明のこのようないわゆるマルチスキッピングオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡの第１のエキソンの領域と、結合する、それを標的化する、ハイブリダイズする、及び／又は逆相補性部分が、本発明の前記オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも３０％であるように逆相補的であることが可能である配列を含む又はからなることが好ましく、少なくとも４０％がより好ましく、少なくとも５０％がさらにより好ましく、少なくとも６０％がさらにより好ましく、少なくとも７０％がさらにより好ましく、少なくとも８０％がさらにより好ましくは、少なくとも９０％がさらにより好ましく、又は少なくとも９５％がさらにより好ましくは、又は９８％がさらにより好ましく、最大１００％が最も好ましい。これに関連して、第１のエキソンは、本明細書において定義されるジストロフィンプレｍＲＮＡのエキソン８、９、１０、１１、１３、２３、３４、４０、４４、４５又は５６であることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、さらなるそれぞれの両端に位置する配列を含み得る。より好ましい実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの前記逆相補的部分の長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０ヌクレオチドである、いくつかの種類のそれぞれの両端に位置する配列が使用され得る。タンパク質の前記オリゴヌクレオチドとの結合を修飾するために、又は前記オリゴヌクレオチドの熱力学的特性を修飾するために、より好ましくは、標的ＲＮＡ結合親和性を修飾するために、それぞれの両端に位置する配列が使用されることが好ましい。別の好ましい実施形態では、さらなるそれぞれの両端に位置する配列は、前記エキソン中に存在しないジストロフィンプレｍＲＮＡの晴れ一に対して逆相補的である。
好ましいオリゴヌクレオチドは、
ｉ）Ｉａ）少なくとも１つの２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー若しくは２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマー及び任意選択で、ホスホロチオエート骨格連結、又は
Ｉｂ）ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／若しくはホスホジエステル連結によって連結された、２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー若しくは２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基並びに
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含み
配列番号２〜７から、より好ましくは、
エキソン４４のスキッピング又は少なくともスキッピングのための
5’-GCGAUUUGACAGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUCUUAAG-3’（配列番号２）
エキソン４５のスキッピング又は少なくともスキッピングのための
5’-GAACUCCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUUGUCAGAACAUUGAAUGCAACUGGGGAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUGGGAAGCCUGAAUCUGCGGUGGCAGGAGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGAG-3’（配列番号３）
エキソン５１のスキッピング又は少なくともスキッピングのための
5’-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAAG-3’（配列番号４）
エキソン５２のスキッピング又は少なくともスキッピングのための
5’-GCAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAUCAUUACGGAUCGAA-3’（配列番号５）
エキソン５３のスキッピング又は少なくともスキッピングのための
5’-UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGAAACCAAG-3’（配列番号６）
エキソン５５のスキッピング又は少なくともスキッピングのための
5’-GGUGAGUGAGCGAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUGGCAA-3’（配列番号７）
から選択される以下のエキソンヌクレオチド配列のうち少なくとも１つの、少なくとも１０ヌクレオチドから最大３３ヌクレオチドの連続ストレッチと結合する、又はそれと、相補的である、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする。
別の好ましいオリゴヌクレオチドは、
ｉ）Ｉａ）少なくとも１つの２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー若しくは２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマー及び任意選択で、ホスホロチオエート骨格連結、又は
Ｉｂ）ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／若しくはホスホジエステル連結によって連結された、２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー又は２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基並びに
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含み、
配列番号６０６５〜６０７０から、より好ましくは、
少なくともエキソン４４のスキッピングのための
5’-CUUAAGAUACCAUUUGUAUUUAGCAUGUUCCCAAUUCUCAGGAAUUUGUGUCUUUCUGAGAAACUGUUCAGCUUCUGUUAGCCACUGAUUAAAUAUCUUUAUAUCAUAAUGAAAACGCCGCCAUUUCUCAACAGAUCUGUCAAAUCGC-3’（配列番号６０６５）
少なくともエキソン４５のスキッピングのための
5’-CUCUUUUUUCUGUCUGACAGCUGUUUGCAGACCUCCUGCCACCGCAGAUUCAGGCUUCCCAAUUUUUCCUGUAGAAUACUGGCAUCUGUUUUUGAGGAUUGCUGAAUUAUUUCUUCCCCAGUUGCAUUCAAUGUUCUGACAACAGUUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUGGAGUUC-3’（配列番号６０６６）
少なくともエキソン５１のスキッピングのための
5’-CUUCUGCUUGAUGAUCAUCUCGUUGAUAUCCUCAAGGUCACCCACCAUCACCCUCUGUGAUUUUAUAACUUGAUCAAGCAGAGAAAGCCAGUCGGUAAGUUCUGUCCAAGCCCGGUUGAAAUCUGCCAGAGCAGGUACCUCCAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCUAGUUUGGAGAUGGCAGUUUCCUUAGUAACCACAGGUUGUGUCACCAGAGUAACAGUCUGAGUAGGAG-3’（配列番号６０６７）
少なくともエキソン５２のスキッピングのための
5’-UUCGAUCCGUAAUGAUUGUUCUAGCCUCUUGAUUGCUGGUCUUGUUUUUCAAAUUUUGGGCAGCGGUAAUGAGUUCUUCCAACUGGGGACGCCUCUGUUCCAAAUCCUGCAUUGUUGC-3’（配列番号６０６８）
少なくともエキソン５３のスキッピングのための
5’-CUUGGUUUCUGUGAUUUUCUUUUGGAUUGCAUCUACUGUAUAGGGACCCUCCUUCCAUGACUCAAGCUUGGCUCUGGCCUGUCCUAAGACCUGCUCAGCUUCUUCCUUAGCUUCCAGCCAUUGUGUUGAAUCCUUUAACAUUUCAUUCAACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGUACUUCAUCCCACUGAUUCUGAAUUCUUUCAA-3’（配列番号６０６９）
少なくともエキソン５５のスキッピングのための
5’-UUGCCAUUGUUUCAUCAGCUCUUUUACUCCCUUGGAGUCUUCUAGGAGCCUUUCCUUACGGGUAGCAUCCUGUAGGACAUUGGCAGUUGUUUCAGCUUCUGUAAGCCAGGCAAGAAACUUUUCCAGGUCCAGGGGGAACUGUUGCAGUAAUCUAUGAGUUUCUUCCAAAGCAGCCUCUCGCUCACUCACC-3’（配列番号６０７０）
から選択される以下のヌクレオチド配列のうち少なくとも１つの、少なくとも１０ヌクレオチドから最大３３ヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号８〜２７１又は配列番号１６０８〜２０９９又は配列番号３０００〜３１８４によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン４４をスキップするためのものであることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号２７２〜４５１又は配列番号３１８５〜４５２７によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン４５をスキップするためのものであることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５２〜６１３又は配列番号４５２８〜４５７２によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。より好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８又は４５６８によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン５１をスキップするためのものであることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号８４２〜１１５９又は配列番号４５７３〜６０４８によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン５３をスキップするためのものであることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号６１４〜８４１によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン５２をスキップするためのものであることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１１６０〜１３９９によって表されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン５５をスキップするためのものであることが好ましい。
配列番号６０６５〜６０７０は、配列番号２〜７に対して逆相補的配列を表す。より好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有し、
ｉ）ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー又は２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン塩基並びに
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含み、
配列番号６０６５〜６０７０から選択されるヌクレオチド配列のうち少なくとも１つ、好ましくは配列番号６０６７のヌクレオチド配列の、少なくとも１０ヌクレオチドから最大３３ヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
さらにより好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有し、
ｉ）ホスホロチオエート骨格連結によって連結された、２’−置換モノマー、好ましくは、２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン塩基及び
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含み、
配列番号６０６５〜６０７０から選択されるヌクレオチド配列のうち少なくとも１つ、好ましくは配列番号６０６７のヌクレオチド配列の、少なくとも１０ヌクレオチドから最大３３ヌクレオチドの連続ストレッチを含む。より好ましい実施形態では、このようなオリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも２つのモノマーを有する。
これらの実施形態では、前記の連続ストレッチは、少なくとも１６〜２６ヌクレオチドの、又は１６〜２５ヌクレオチドの長さのものであることが好ましい。別の実施形態では、前記の連続ストレッチは、１６〜２４ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、前記の連続ストレッチは、１６〜２２ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、前記の連続ストレッチは、１６、１８、２０又は２２ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、前記の連続ストレッチは、２１、２２、２４又は２５ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、前記の連続ストレッチは、１８、２２、２４又は２５ヌクレオチドの長さである。本発明のオリゴヌクレオチドは、前記の連続ストレッチからなることが好ましい。
より好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−置換モノマー及び任意選択で、ホスホロチオエート骨格連結又はホスホロチオエート骨格連結によって、及び／若しくはホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマーのみを含み、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基を含み、二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含み、配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜１６０７を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜１６０７の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される。より好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−置換モノマー及び任意選択で、ホスホロチオエート骨格連結又はホスホロチオエート骨格連結によって、及び／若しくはホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマーのみを含み、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基を含み、二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含み、配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８を含む、若しくは、からなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜３０ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２４ヌクレオチドがより好ましく、１９、２２又は２２ヌクレオチドが最も好ましい。より好ましいオリゴヌクレオチドは、上記のとおりであり、配列番号９〜１３、１５〜１９、２１〜２５、２７〜３１、３３〜３７、３９〜４３、４５〜４９、５１〜５５、５７〜６１、６３〜６７、６９〜７３、７５〜７９、８１〜８５、８７〜９１、９３〜９７、９９〜１０３、１０５〜１０９、１１１〜１１５、１１７〜１２１、１２３〜１２７、１２９〜１３３、１３５〜１３９、１４１〜１４５、１４７〜１５１、１５３〜１５７、１５９〜１６３、１６５〜１６９、１７１〜１７５、１７７〜１８１、１８３〜１８７、１８９〜１９３、１９５〜１９９、２０１〜２０５、２０７〜２１１、２１３〜２１７、２１９〜２２３、２２５〜２２９、２３１〜２３５、２３７〜２４１、２４３〜２４７、２４９〜２５３、２５５〜２５９、２６１〜２６５、２６７〜２７１、２７３〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２８９、２９１〜２９５、２９７〜３０１、３０３〜３０７、３０９〜３１３、３１５〜３１９、３２１〜３２５、３２７〜３３１、３３３〜３３７、３３９〜３４３、３４５〜３４９、３５１〜３５５、３５７〜３６１、３６３〜３６７、３６９〜３７３、３７５〜３７９、３８１〜３８５、３８７〜３９１、３９３〜３９７、３９９〜４０３、４０５〜４０９、４１１〜４１５、４１７〜４２１、４２３〜４２７、４２９〜４３３、４３５〜４３９、４４１〜４４５、４４７〜４５１、４５３〜４５７、４５９〜４６３、４６５〜４６９、４７１〜４７５、４７７〜４８１、４８３〜４８７、４８９〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０５、５０７〜５１１、５１３〜５１７、５１９〜５２３、５２５〜５２９、５３１〜５３５、５３７〜５４１、５４３〜５４７、５４９〜５５３、５５５〜５５９、５６１〜５６５、５６７〜５７１、５７３〜５７７、５７９〜５８３、５８５〜５８９、５９１〜５９５、５９７〜６０１、６０３〜６０７、６０９〜６１３、６１５〜６１９、６２１〜６２５、６２７〜６３１、６３３〜６３７、６３９〜６４３、６４５〜６４９、６５１〜６５５、６５７〜６６１、６６３〜６６７、６６９〜６７３、６７５〜６７９、６８１〜６８５、６８７〜６９１、６９３〜６９７、６９９〜７０３、７０５〜７０９、７１１〜７１５、７１７〜７２１、７２３〜７２７、７２９〜７３３、７３５〜７３９、７４１〜７４５、７４７〜７５１、７５３〜７５７、７５９〜７６３、７６５〜７６９、７７１〜７７５、７７７〜７８１、７８３〜７８７、７８９〜７９３、７９５〜７９９、８０１〜８０５、８０７〜８１１、８１３〜８１７、８１９〜８２３、８２５〜８２９、８３１〜８３５、８３７〜８４１、８４３〜８４７、８４９〜８５３、８５５〜８５９、８６１〜８６５、８６７〜８７１、８７３〜８７７、８７９〜８８３、８８５〜８８９、８９１〜８９５、８９７〜９０１、９０３〜９０７、９０９〜９１３、９１５〜９１９、９２１〜９２５、９２７〜９３１、９３３〜９３７、９３９〜９４３、９４５〜９４９、９５１〜９５５、９５７〜９６１、９６３〜９６７、９６９〜９７３、９７５〜９７９、９８１〜９８５、９８７〜９９１、９９３〜９９７、９９９〜１００３、１００５〜１００９、１０１１〜１０１５、１０１７〜１０２１、１０２３〜１０２７、１０２９〜１０３３、１０３５〜１０３９、１０４１〜１０４５、１０４７〜１０５１、１０５３〜１０５７、１０５９〜１０６３、１０６５〜１０６９、１０７１〜１０７５、１０７７〜１０８１、１０８３〜１０８７、１０８９〜１０９３、１０９５〜１０９９、１１０１〜１１０５、１１０７〜１１１１、１１１３〜１１１７、１１１９〜１１２３、１１２５〜１１２９、１１３１〜１１３５、１１３７〜１１４１、１１４３〜１１４７、１１４９〜１１５３、１１５５〜１１５９、１１６１〜１１６５、１１６７〜１１７１、１１７３〜１１７７、１１７９〜１１８３、１１８５〜１１８９、１１９１〜１１９５、１１９７〜１２０１、１２０３〜１２０７、１２０９〜１２１３、１２１５〜１２１９、１２２１〜１２２５、１２２７〜１２３１、１２３３〜１２３７、１２３９〜１２４３、１２４５〜１２４９、１２５１〜１２５５、１２５７〜１２６１、１２６３〜１２６７、１２６９〜１２７３、１２７５〜１２７９、１２８１〜１２８５、１２８７〜１２９１、１２９３〜１２９７、１２９９〜１３０３、１３０５〜１３０９、１３１１〜１３１５、１３１７〜１３２１、１３２３〜１３２７、１３２９〜１３３３、１３３５〜１３３９、１３４１〜１３４５、１３４７〜１３５１、１３５３〜１３５７、１３５９〜１３６３、１３６５〜１３６９、１３７１〜１３７５、１３７７〜１３８１、１３８３〜１３８７、１３８９〜１３９３、１３９５〜１３９９、１４０１〜１４０５、１４０７〜１４１１、１４１３〜１４１７、１４１９〜１４２３、１４２５〜１４２９、１４３１〜１４３５、１４３７〜１４４１、１４４３〜１４４７、１４４９〜１４５３、１４５５〜１４５９、１４６１〜１４６５、１４６７〜１４７１、１４７３〜１４７７、１４７９〜１４８３、１４８５〜１４８９、１４９１〜１４９５、１４９７〜１５０１、１５０３〜１５０７、１５０９〜１５１３、１５１５〜１５１９、１５２１〜１５２５、１５２７〜１５３１、１５３３〜１５３７、１５３９〜１５４３、１５４５〜１５４９、１５５１〜１５５５、１５５７〜１５６１、１５６３〜１５６７、１５６９〜１５７３、１５７５〜１５７９、１５９２〜２０９９、又は３０００〜６０４８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号９〜１３、１５〜１９、２１〜２５、２７〜３１、３３〜３７、３９〜４３、４５〜４９、５１〜５５、５７〜６１、６３〜６７、６９〜７３、７５〜７９、８１〜８５、８７〜９１、９３〜９７、９９〜１０３、１０５〜１０９、１１１〜１１５、１１７〜１２１、１２３〜１２７、１２９〜１３３、１３５〜１３９、１４１〜１４５、１４７〜１５１、１５３〜１５７、１５９〜１６３、１６５〜１６９、１７１〜１７５、１７７〜１８１、１８３〜１８７、１８９〜１９３、１９５〜１９９、２０１〜２０５、２０７〜２１１、２１３〜２１７、２１９〜２２３、２２５〜２２９、２３１〜２３５、２３７〜２４１、２４３〜２４７、２４９〜２５３、２５５〜２５９、２６１〜２６５、２６７〜２７１、２７３〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２８９、２９１〜２９５、２９７〜３０１、３０３〜３０７、３０９〜３１３、３１５〜３１９、３２１〜３２５、３２７〜３３１、３３３〜３３７、３３９〜３４３、３４５〜３４９、３５１〜３５５、３５７〜３６１、３６３〜３６７、３６９〜３７３、３７５〜３７９、３８１〜３８５、３８７〜３９１、３９３〜３９７、３９９〜４０３、４０５〜４０９、４１１〜４１５、４１７〜４２１、４２３〜４２７、４２９〜４３３、４３５〜４３９、４４１〜４４５、４４７〜４５１、４５３〜４５７、４５９〜４６３、４６５〜４６９、４７１〜４７５、４７７〜４８１、４８３〜４８７、４８９〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０５、５０７〜５１１、５１３〜５１７、５１９〜５２３、５２５〜５２９、５３１〜５３５、５３７〜５４１、５４３〜５４７、５４９〜５５３、５５５〜５５９、５６１〜５６５、５６７〜５７１、５７３〜５７７、５７９〜５８３、５８５〜５８９、５９１〜５９５、５９７〜６０１、６０３〜６０７、６０９〜６１３、６１５〜６１９、６２１〜６２５、６２７〜６３１、６３３〜６３７、６３９〜６４３、６４５〜６４９、６５１〜６５５、６５７〜６６１、６６３〜６６７、６６９〜６７３、６７５〜６７９、６８１〜６８５、６８７〜６９１、６９３〜６９７、６９９〜７０３、７０５〜７０９、７１１〜７１５、７１７〜７２１、７２３〜７２７、７２９〜７３３、７３５〜７３９、７４１〜７４５、７４７〜７５１、７５３〜７５７、７５９〜７６３、７６５〜７６９、７７１〜７７５、７７７〜７８１、７８３〜７８７、７８９〜７９３、７９５〜７９９、８０１〜８０５、８０７〜８１１、８１３〜８１７、８１９〜８２３、８２５〜８２９、８３１〜８３５、８３７〜８４１、８４３〜８４７、８４９〜８５３、８５５〜８５９、８６１〜８６５、８６７〜８７１、８７３〜８７７、８７９〜８８３、８８５〜８８９、８９１〜８９５、８９７〜９０１、９０３〜９０７、９０９〜９１３、９１５〜９１９、９２１〜９２５、９２７〜９３１、９３３〜９３７、９３９〜９４３、９４５〜９４９、９５１〜９５５、９５７〜９６１、９６３〜９６７、９６９〜９７３、９７５〜９７９、９８１〜９８５、９８７〜９９１、９９３〜９９７、９９９〜１００３、１００５〜１００９、１０１１〜１０１５、１０１７〜１０２１、１０２３〜１０２７、１０２９〜１０３３、１０３５〜１０３９、１０４１〜１０４５、１０４７〜１０５１、１０５３〜１０５７、１０５９〜１０６３、１０６５〜１０６９、１０７１〜１０７５、１０７７〜１０８１、１０８３〜１０８７、１０８９〜１０９３、１０９５〜１０９９、１１０１〜１１０５、１１０７〜１１１１、１１１３〜１１１７、１１１９〜１１２３、１１２５〜１１２９、１１３１〜１１３５、１１３７〜１１４１、１１４３〜１１４７、１１４９〜１１５３、１１５５〜１１５９、１１６１〜１１６５、１１６７〜１１７１、１１７３〜１１７７、１１７９〜１１８３、１１８５〜１１８９、１１９１〜１１９５、１１９７〜１２０１、１２０３〜１２０７、１２０９〜１２１３、１２１５〜１２１９、１２２１〜１２２５、１２２７〜１２３１、１２３３〜１２３７、１２３９〜１２４３、１２４５〜１２４９、１２５１〜１２５５、１２５７〜１２６１、１２６３〜１２６７、１２６９〜１２７３、１２７５〜１２７９、１２８１〜１２８５、１２８７〜１２９１、１２９３〜１２９７、１２９９〜１３０３、１３０５〜１３０９、１３１１〜１３１５、１３１７〜１３２１、１３２３〜１３２７、１３２９〜１３３３、１３３５〜１３３９、１３４１〜１３４５、１３４７〜１３５１、１３５３〜１３５７、１３５９〜１３６３、１３６５〜１３６９、１３７１〜１３７５、１３７７〜１３８１、１３８３〜１３８７、１３８９〜１３９３、１３９５〜１３９９、１４０１〜１４０５、１４０７〜１４１１、１４１３〜１４１７、１４１９〜１４２３、１４２５〜１４２９、１４３１〜１４３５、１４３７〜１４４１、１４４３〜１４４７、１４４９〜１４５３、１４５５〜１４５９、１４６１〜１４６５、１４６７
〜１４７１、１４７３〜１４７７、１４７９〜１４８３、１４８５〜１４８９、１４９１〜１４９５、１４９７〜１５０１、１５０３〜１５０７、１５０９〜１５１３、１５１５〜１５１９、１５２１〜１５２５、１５２７〜１５３１、１５３３〜１５３７、１５３９〜１５４３、１５４５〜１５４９、１５５１〜１５５５、１５５７〜１５６１、１５６３〜１５６７、１５６９〜１５７３、１５７５〜１５７９、１５９２〜２０９９、又は３０００〜６０４８の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される。本発明の関連内で、配列番号８〜１５８０又は配列番号１５９２〜２０９９又は配列番号３０００〜６０４８の断片は、前記配列番号から得られる少なくとも１０の連続ヌクレオチドを含む又はからなるヌクレオチド配列を意味することが好ましい。
より好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−置換モノマー、好ましくは、ＲＮＡモノマー及び任意選択でホスホロチオエート骨格連結、又はホスホロチオエート骨格連結によって、及び／若しくはホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマーのみを含み、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基を含み、二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含み、配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０若しくは配列番号１５９２〜２０９９若しくは配列番号３０００〜６０４８の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３ヌクレオチドの長さを有する。
好ましい配列は、配列番号４５２〜６１３及び配列番号１５９２〜１６０５及び配列番号１６０７、より好ましくは、配列番号４５３〜４５７、４５９〜４６３、４６５〜４６９、４７１〜４７５、４７７〜４８１、４８３〜４８７、４８９〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０５、５０７〜５１１、５１３〜５１７、５１９〜５２３、５２５〜５２９、５３１〜５３５、５３７〜５４１、５４３〜５４７、５４９〜５５３、５５５〜５５９、５６１〜５６５、５６７〜５７１、５７３〜５７７、５７９〜５８３、５８５〜５８９、５９１〜５９５、５９７〜６０１、６０３〜６０７、６０９〜６１３、１５９２〜１６０５、及び１６０７、さらにより好ましくは、配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３、４８６、１５９２、１５９３、１５９４、１５９５、１５９６、１５９７、１５９８、１５９９、１６００、１６０１、１６０２、１６０３、１６０４、１６０５又は１６０７を含む。最も好ましい配列は、配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８である。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８〜２７１又は配列番号１６０８〜２０９９又は配列番号３０００〜３１８４を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４４をスキップするためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましく、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号９〜１３、１５〜１９、２１〜２５、２７〜３１、３３〜３７、３９〜４３、４５〜４９、５１〜５５、５７〜６１、６３〜６７、６９〜７３、７５〜７９、８１〜８５、８７〜９１、９３〜９７、９９〜１０３、１０５〜１０９、１１１〜１１５、１１７〜１２１、１２３〜１２７、１２９〜１３３、１３５〜１３９、１４１〜１４５、１４７〜１５１、１５３〜１５７、１５９〜１６３、１６５〜１６９、１７１〜１７５、１７７〜１８１、１８３〜１８７、１８９〜１９３、１９５〜１９９、２０１〜２０５、２０７〜２１１、２１３〜２１７、２１９〜２２３、２２５〜２２９、２３１〜２３５、２３７〜２４１、２４３〜２４７、２４９〜２５３、２５５〜２５９、２６１〜２６５、又は２６７〜２７１を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２７２〜４５１又は配列番号３１８５〜４５２７を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２７３〜２７７、２７９〜２８３、２８５〜２８９、２９１〜２９５、２９７〜３０１、３０３〜３０７、３０９〜３１３、３１５〜３１９、３２１〜３２５、３２７〜３３１、３３３〜３３７、３３９〜３４３、３４５〜３４９、３５１〜３５５、３５７〜３６１、３６３〜３６７、３６９〜３７３、３７５〜３７９、３８１〜３８５、３８７〜３９１、３９３〜３９７、３９９〜４０３、４０５〜４０９、４１１〜４１５、４１７〜４２１、４２３〜４２７、４２９〜４３３、４３５〜４３９、４４１〜４４５、又は４４７〜４５１を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４５２〜６１３又は配列番号１５９２〜１６０５又は配列番号４５２８〜４５７２を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号４５３〜４５７、４５９〜４６３、４６５〜４６９、４７１〜４７５、４７７〜４８１、４８３〜４８７、４８９〜４９３、４９５〜４９９、５０１〜５０５、５０７〜５１１、５１３〜５１７、５１９〜５２３、５２５〜５２９、５３１〜５３５、５３７〜５４１、５４３〜５４７、５４９〜５５３、５５５〜５５９、５６１〜５６５、５６７〜５７１、５７３〜５７７、５７９〜５８３、５８５〜５８９、５９１〜５９５、５９７〜６０１、６０３〜６０７、６０９〜６１３、１５９２〜１６０５、又は１６０７を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましく、配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３、４８６、１５９２、１５９３、１５９４、１５９５、１５９６、１５９７、１５９８、１５９９、１６００、１６０１、１６０２、１６０３、１６０４、１６０５又は１６０７がさらにより好ましく、配列番号１５９２、１５９３、１５９４、１５９５、１５９６、１５９７、１５９８、１５９９、１６００、１６０１、１６０２、１６０３、１６０４、１６０５又は１６０７が最も好ましく、配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８がさらにより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９２（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９３（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中、及び３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９４（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及びその隣接するモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９５（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９６（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及び３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９７（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及びその隣接するモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９８（ＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１５９９（ＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及び３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６００（ＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及びその隣接するモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０１（ＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０２（ＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及び３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０３（ＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及びその隣接するモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０４（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０５（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及びその隣接するモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０７（ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、いずれのモノマー中にもＢＮＡスキャフォールド修飾を含まず、シトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０７（ＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、任意のモノマー中、好ましくは、５’末端モノマー、３’末端モノマー中のいずれかのみ、５’末端及び３’末端モノマー中の両方、２つの最も５’末端のモノマー又は２つの最も３’末端のモノマー中に少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、シトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５５（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中及び３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５９（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５２８（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー、その隣接するモノマー、及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３１（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー、その隣接するモノマー中、５’末端から１３番目のモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３２（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー、その隣接するモノマー中、５’末端から９番目のモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３３（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー、その隣接するモノマー中、５’末端から９番目のモノマー中、５’末端から１３番目のモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３５（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中、その隣接するモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５４２（ＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中、その５’末端から１３番目のモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５４８（ＣＡＡＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵＵＵＣＴ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中、その隣接するモノマー中、その５’末端から８番目のモノマー中、その５’末端から１２番目のモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５６８（ＧＧＵＡＡＧＵＵＣＵＧＵＣＣＡＡＧＣ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものであり、５’末端モノマー中、その隣接するモノマー中、その５’末端から６番目のモノマー中及びその３’末端モノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、その他のモノマー中にはなく、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号６１４〜８４１を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５２をスキップするためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号６１５〜６１９、６２１〜６２５、６２７〜６３１、６３３〜６３７、６３９〜６４３、６４５〜６４９、６５１〜６５５、６５７〜６６１、６６３〜６６７、６６９〜６７３、６７５〜６７９、６８１〜６８５、６８７〜６９１、６９３〜６９７、６９９〜７０３、７０５〜７０９、７１１〜７１５、７１７〜７２１、７２３〜７２７、７２９〜７３３、７３５〜７３９、７４１〜７４５、７４７〜７５１、７５３〜７５７、７５９〜７６３、７６５〜７６９、７７１〜７７５、７７７〜７８１、７８３〜７８７、７８９〜７９３、７９５〜７９９、８０１〜８０５、８０７〜８１１、８１３〜８１７、８１９〜８２３、８２５〜８２９、８３１〜８３５、又は８３７〜８４１を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８４２〜１１５９又は配列番号４５７３〜６０４８を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５３をスキップするためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号８４３〜８４７、８４９〜８５３、８５５〜８５９、８６１〜８６５、８６７〜８７１、８７３〜８７７、８７９〜８８３、８８５〜８８９、８９１〜８９５、８９７〜９０１、９０３〜９０７、９０９〜９１３、９１５〜９１９、９２１〜９２５、９２７〜９３１、９３３〜９３７、９３９〜９４３、９４５〜９４９、９５１〜９５５、９５７〜９６１、９６３〜９６７、９６９〜９７３、９７５〜９７９、９８１〜９８５、９８７〜９９１、９９３〜９９７、９９９〜１００３、１００５〜１００９、１０１１〜１０１５、１０１７〜１０２１、１０２３〜１０２７、１０２９〜１０３３、１０３５〜１０３９、１０４１〜１０４５、１０４７〜１０５１、１０５３〜１０５７、１０５９〜１０６３、１０６５〜１０６９、１０７１〜１０７５、１０７７〜１０８１、１０８３〜１０８７、１０８９〜１０９３、１０９５〜１０９９、１１０１〜１１０５、１１０７〜１１１１、１１１３〜１１１７、１１１９〜１１２３、１１２５〜１１２９、１１３１〜１１３５、１１３７〜１１４１、１１４３〜１１４７、１１４９〜１１５３、又は１１５５〜１１５９を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１１６０〜１３９９を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５５をスキップするためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１１６１〜１１６５、１１６７〜１１７１、１１７３〜１１７７、１１７９〜１１８３、１１８５〜１１８９、１１９１〜１１９５、１１９７〜１２０１、１２０３〜１２０７、１２０９〜１２１３、１２１５〜１２１９、１２２１〜１２２５、１２２７〜１２３１、１２３３〜１２３７、１２３９〜１２４３、１２４５〜１２４９、１２５１〜１２５５、１２５７〜１２６１、１２６３〜１２６７、１２６９〜１２７３、１２７５〜１２７９、１２８１〜１２８５、１２８７〜１２９１、１２９３〜１２９７、１２９９〜１３０３、１３０５〜１３０９、１３１１〜１３１５、１３１７〜１３２１、１３２３〜１３２７、１３２９〜１３３３、１３３５〜１３３９、１３４１〜１３４５、１３４７〜１３５１、１３５３〜１３５７、１３５９〜１３６３、１３６５〜１３６９、１３７１〜１３７５、１３７７〜１３８１、１３８３〜１３８７、１３８９〜１３９３、又は１３９５〜１３９９を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１４００〜１５７９を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ＳＭＮ２のプレｍＲＮＡのエキソン７を包含するためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりに５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１６０６を含む、若しくはからなり、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含まない、又は配列番号１４９０を含む、若しくはからなり、任意のモノマー中、好ましくは、５’末端モノマー、３’末端モノマー中のいずれかのみ、５’末端及び３’末端モノマー中の両方、２つの最も５’末端のモノマー若しくは２つの最も３’末端のモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含むヌクレオチド配列によって表されることが最も好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１４００〜１４４１を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ＳＭＮ２のプレｍＲＮＡのイントロン６を標的化するためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１４０１〜１４０５、１４０７〜１４１１、１４１３〜１４１７、１４１９〜１４２３、１４２５〜１４２９、１４３１〜１４３５、１４３７〜１４４１を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１４４２〜１５７９を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ＳＭＮ２のプレｍＲＮＡのイントロン７を標的化するためのものであり、以下のうち１つ又は複数を含む：
少なくとも１つの２’−置換モノマー、
少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結、
２’−置換モノマーのみ、
ホスホロチオエート骨格連結のみ、
ホスホロチオエート骨格連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基、
シトシン塩基の代わりの５−メチルシトシン塩基のみ、
二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー。
前記オリゴヌクレオチドは、２’−置換モノマーのみ、ホスホロチオエート骨格連結のみ及びＢＮＡスキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマーを含むことが好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１４４３〜１４４７、１４４９〜１４５３、１４５５〜１４５９、１４６１〜１４６５、１４６７〜１４７１、１４７３〜１４７７、１４７９〜１４８３、１４８５〜１４８９、１４９１〜１４９５、１４９７〜１５０１、１５０３〜１５０７、１５０９〜１５１３、１５１５〜１５１９、１５２１〜１５２５、１５２７〜１５３１、１５３３〜１５３７、１５３９〜１５４３、１５４５〜１５４９、１５５１〜１５５５、１５５７〜１５６１、１５６３〜１５６７、１５６９〜１５７３、１５７５〜１５７９を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表されることがより好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１４９０を含む、又はからなり、任意のモノマー中、好ましくは、５’末端モノマー、３’末端モノマー中のいずれかのみ、５’末端及び３’末端モノマー中の両方、２つの最も５’末端のモノマー又は２つの最も３’末端のモノマー中にＢＮＡスキャフォールド修飾を含むヌクレオチド配列によって表されることが最も好ましい。前記オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１６〜２２ヌクレオチドの長さがより好ましく、１８モノマーが最も好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号１６０６（ＵＣＡＣＵＵＵＣＡＵＡＡＵＧＣＵＧＧ）を含む又はからなるヌクレオチド配列によって表され、ＳＭＮ２のプレｍＲＮＡのイントロン７を標的化するためのものであり、いずれのモノマー中にもＢＮＡスキャフォールド修飾を含まず、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含み、ホスホロチオエート連結のみを含み、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーのみをさらに含む。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが、二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドと比較して改善されたパラメータを有するものである。本発明者らは、本発明のオリゴヌクレオチド中の５−メチルシトシン又は５−メチルウラシルを有するＢＮＡの存在は、前記オリゴヌクレオチドのパラメータのうち少なくとも１つに対して正の効果を有することを発見した。これに関連して、パラメータは、以下に説明するような、結合親和性及び／又は動態学、エキソンスキッピング活性、生体安定性、（組織内）分布、細胞性取り込み及び／又は輸送及び／又は前記オリゴヌクレオチド免疫原性を含み得る。
結合親和性及び動態学は、オリゴヌクレオチドの熱力学的特性に応じて変わる。これらは、基本的Ｔｍ及び最近接モデルを使用して前記オリゴヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡについて、融解温度（Ｔｍ；例えば、オリゴヌクレオチド特性計算機（例えば、ｗｗｗ．ｕｎｃ．ｅｄｕ／〜ｃａｉｌ／ｂｉｏｔｏｏｌ／ｏｌｉｇｏ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで、又は例えばｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／でインターネットによってアクセス可能））を用いて算出される）及び／又はオリゴヌクレオチド−標的エキソン複合体の自由エネルギー（ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅバージョン４．５又はＲＮＡ ｍｆｏｌｄバージョン３．５を使用して）によって少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが増大される場合には、エキソンスキッピング活性は、通常、増大するが、Ｔｍがあまりにも高い場合には、オリゴヌクレオチドは、あまり配列特異的ではなくなると予測される。容認できるＴｍ及び自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に応じて変わる。したがって、これらのパラメータの各々の好ましい範囲を示すことは困難である。
エキソンスキッピング活性は、標的化されるエキソンのそれぞれの両端に位置するＤＭＤ遺伝子特異的プライマーを使用する逆転写酵素定量的又はデジタルドロップレットポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ又はＲＴ−ｄｄＰＣＲ）（Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら、２００３年、Ｓｐｉｔａｌｉら、２０１３年）によって、オリゴヌクレオチドによって処置された筋肉細胞培養物又は筋肉組織から単離された全ＲＮＡを解析することによって測定されることが好ましい。全部の転写物産物に対する、標的化されるエキソンがスキップされる転写物を表すより短い転写物断片の割合が評価される（オリゴヌクレオチドによって誘導されたエキソンスキッピングのパーセンテージとして算出される）。標的化されたエキソンスキッピングの正確性及び特異性を決定するために、より短い断片はまたシーケンシングされ得る。
特定の実施形態では、ＲＮＡ調節活性は、核酸又はタンパク質の量の増大又は減少であり得る。特定の実施形態では、このような活性は、核酸又はタンパク質のスプライスバリアントの割合の変化であり得る。アンチセンス活性の検出及び／又は測定は、直接である場合も、間接である場合もある。特定の実施形態では、アンチセンス活性は、細胞又は動物の表現型の変化を観察することによって評価される。
本明細書において使用され、上記で説明されるように、「調節」は、調節前の機能又は活性と比較した場合の、機能又は活性の量又は質の撹乱を指すこともある。例えば、調節は、遺伝子発現の変化、増大（刺激又は誘導）又は減少（阻害又は低減）のいずれかを含む。さらなる例として、発現の調節は、プレｍＲＮＡプロセシングのスプライス部位選択を撹乱し、撹乱されなかった状態と比較した存在する特定のスプライスバリアントの量の変化をもたらすことを含み得る。さらなる例として、調節は、タンパク質の翻訳を撹乱することを含む。
体内分布及び生体安定性は、Ｙｕら、２００２年から適応された検証されたハイブリダイゼーションライゲーションアッセイによって少なくとも部分的に決定されることが好ましい。一実施形態では、血漿又はホモジナイズされた組織サンプルを、特異的捕獲オリゴヌクレオチドプローブとともにインキュベートする。分離後、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを複合体にライゲートし、抗ＤＩＧ抗体が連結されたペルオキシダーゼを使用する検出を続ける。非コンパートメント薬物動態解析は、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮソフトウェアパッケージ（モデル２００、バージョン５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して実施する。１ｍＬの血漿又は１ｍｇの組織あたりのオリゴヌクレオチド（μｇ）のレベルを経時的にモニタリングして、曲線下面積（ＡＵＣ）、ピーク濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、終末相半減期及び吸収ラグタイム（ｔｌａｇ）を評価する。このような好ましいアッセイは、実験部分に開示されている。
したがって、好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドとは、ＢＮＡスキャフォールド修飾の脱落のみによって異なっている対応するオリゴヌクレオチドと比較して、すなわち、２’−Ｏ−メチル置換モノマー、５’−メチルシトシン及び／又は５’−メチルウラシル、任意選択で、ホスホロチオエートも含むが、ＢＮＡ修飾されたスキャフォールドを有さない同一配列のオリゴヌクレオチドと比較して、許容される若しくは減少した免疫原性及び／又はより良好な体内分布及び／又は許容される若しくは改善されたＲＮＡ結合動態学及び／又は熱力学的特性などの改善されたパラメータを有する。これらのパラメータの各々は、当業者に公知の、又は好ましくは本明細書において開示されるようなアッセイを使用して評価され得る。
オリゴヌクレオチドのさらなる化学修飾
以下に、本発明のオリゴヌクレオチドのその他の化学及び修飾を定義する。これらのさらなる化学及び修飾は、前記オリゴヌクレオチドについてすでに定義された化学、すなわち、５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシルを有する又は有さない少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾の存在及び／又は任意選択のホスホロチオエート骨格連結を有する２’−Ｏ−メチルモノマーを含む若しくはからなるオリゴヌクレオチドと組み合わせて存在し得る。
好ましい本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子又は修飾されたＲＮＡ分子を含む又はからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。当業者ならば、しかし、一本鎖オリゴヌクレオチドが内部二本鎖構造を形成し得ることが可能であることを理解するであろう。しかし、このオリゴヌクレオチドは、本発明に関連して一本鎖オリゴヌクレオチドと依然として名付けられる。
上記の修飾に加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下に記載されるような異なる種類の核酸モノマー又はヌクレオチドなどのさらなる修飾を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドを作製するために異なる種類の核酸モノマーを使用してもよい。前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、少なくとも１つの骨格及び／又はスキャフォールド修飾及び／又は少なくとも１つの塩基修飾を有し得る。
塩基修飾は、天然プリン及びピリミジン塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン及びチミン）の修飾版、例えば、ヒポキサンチン、プソイドウラシル、プソイドシトシン、１−メチルプソイドウラシル、オロト酸、アグマチジン(agmatidine)、ライシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプ及びその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−ハロメチルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ｔ又は例えば、Ｋｕｍａｒら Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１４年、第７９巻、５０４７頁；Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋａら Ｏｒｇ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４年、第１２巻、１０５２頁に記載されるような）、ピラゾロ［１，５−ａ］−１，３，５−トリアジンＣ−ヌクレオシド（例えば、ＬｅｆｏｉｘらＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１４年、第７９巻、３２２１頁におけるような）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ｇ、スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ａ、ホウ素化シトシン（例えば、Niziolら Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４年、第２２巻、３９０６頁）、プソイドイソシチジン、Ｃ（Ｐｙｃ）（例えば、Ｙａｍａｄａら Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４年、第１２巻、２２５５頁におけるような）及びＮ４−エチルシトシン又はそれらの誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）及びＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、炭水化物修飾されたウラシル（例えば、Ｋａｕｒａら Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１４年、第１６巻、３３０８頁）、アミノ酸修飾されたウラシル（例えば、Ｇｕｅｎｔｈｅｒら Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４年、第５０巻、９００７頁）又はそれらの誘導体及び２，６−ジフルオロトルエン又は塩基脱落部位のような非存在塩基のような、縮重塩基又はユニバーサル塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース又は環酸素が窒素で置換されている（アザリボース）ピロリジン誘導体）を含み得る。スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ａ、スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ｇ及びスーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ｔの誘導体の例は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に見ることができる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰ及びＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡ中に組み込まれた場合には免疫賦活性効果を低減するとわかっている（Ｐｅａｃｏｃｋ Ｈ．らＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、第１３３巻、９２００頁）。修飾された塩基の例は、例えば、国際公開第２０１４／０９３９２４号（ＭｏｄｅＲＮＡ）に記載されている。
本発明のオリゴヌクレオチドは、その長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３又は３４の塩基修飾を含み得る。また、前記オリゴヌクレオチド中に２以上の別個の塩基修飾を導入することも本発明によって包含される。
すでに記載されたＢＮＡスキャフォールド修飾に加えて、スキャフォールド修飾は、２’−Ｏ−アルキル又は２’−Ｏ−（置換）アルキルなどの２’−Ｏ−修飾ＲＮＡ、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−シアノエチル）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−（２−チオメチル）エチル、２’−Ｏ−ブチリル、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−アセタールエステル（例えば、ＢｉｓｃａｎｓらＢｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１５年、第２３巻、５３６０頁など）、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−（２Ｓ−メトキシプロピル）、２’−Ｏ−（Ｎ−（アミノエチル）カルバモイル）メチル）（２’−ＡＥＣＭ）、２’−Ｏ−（２−カルボキシエチル）及びカルバモイル誘導体（Ｙａｍａｄａら Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２０１４年、第１２巻、６４５７頁）、２’−Ｏ−（２−アミノ）プロピル、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）プロピル）、２’−Ｏ−（２−アミノ）エチル、２’−Ｏ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）、２’−デオキシ（ＤＮＡ）、２’−Ｏ−（ハロアルコキシ）メチル（Ａｒａｉ Ｋ．ら Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１１年、第２１巻、６２８５頁）例えば、２’−Ｏ−（２−クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、２’−Ｏ−（２，２−ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）、２’−Ｏ−アルコキシカルボニル、例えば、２’−Ｏ−［２−（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、２’−Ｏ−［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＣＭＥ）、２’−Ｏ−［２−（メチルチオ）エチル］（２’−ＭＴＥ）、２’−（ω−Ｏ−セリノール）、２’−ハロ、例えば、２’−Ｆ、ＦＡＮＡ（２’−Ｆアラビノシル核酸）、２’，４’−ジフルオロ−２’−デオキシ、カルバ糖及びアザ糖修飾、３’−Ｏ−置換、例えば、３’−Ｏ−メチル、３’−Ｏ−ブチリル、３’−Ｏ−プロパルギル、４’−置換、例えば、４’−アミノメチル−２’−Ｏ−メチル又は４’−アミノメチル−２’−フルオロ、５’−置換、例えば、５’−メチル又はＣＮＡ（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ． ２０１４年、第２２巻、６２２７頁）及びそれらの誘導体などのリボシル部分の修飾版を含み得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾に加えて、その長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２又は３３のスキャフォールド修飾を含み得る。また、前記オリゴヌクレオチド中に２以上の別個のスキャフォールド修飾を導入することも本発明によって包含される。
その他の修飾として、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、Ｆ−ＣｅＮＡ、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、リボ−シクロヘキサニル核酸（ｒ−ＣＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、フッ素化ＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）、ピラノシル−ＲＮＡ（ｐ−ＲＮＡ）、３’−デオキシピラノシル−ＤＮＡ（ｐ−ＤＮＡ）及びそれらの誘導体が挙げられる。フラノース及び非フラノース糖環を有するフッ素化核酸類似体の例も包含され、例えば、Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ２０１４年、第７９巻、８８７７頁に記載されている。
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾に加えて、その長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３又は３４のスキャフォールド修飾を含み得る。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、十分に２’−Ｏ−メチル修飾されており、１、２、３、４、５又は６つのＢＮＡスキャフォールド修飾を含有する。
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、骨格連結修飾を含み得る。骨格連結修飾は、それだけには限らないが、ＲＮＡ中に存在するホスホジエステル修飾版、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、キラル純粋なホスホロチオエート、（Ｒ）−ホスホロチオエート、（Ｓ）−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、ホスホノアセトアミド（ＰＡＣＡ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、チオホスホノアセトアミド、ホスホロチオエートプロドラッグ、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、メチルホスフェート、メチルホスホロチオエート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、メチルボラノホスホノチオエート、ホスフェート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル及びそれらの誘導体であり得る。別の修飾は、ホスホリルグアニジン、ホスホルアミダイト、ホスホルアミダート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミダート、ホスホルジアミデート(phosphordiamidate)、ホスホロチオジアミデート、スルファメート、ジメチレンスルホキシド、アミド、スルホネート、シロキサン、スルフィド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、アルケニル、メチレンヒドラジノ、スルホンアミド、アミド、トリアゾール、オキサリル、カルバメート、メチレンイミノ（ＭＭＩ）及びチオアセトアミド核酸（ＴＡＮＡ）及びそれらの誘導体を含む。キラル純粋なホスホロチオエート連結の例は、例えば、国際公開第２０１４／０１０２５０号又は同２０１７／０６２８６２号（ＷａＶｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されている。ホスホリルグアニジン連結の例は、国際公開第２０１６／０２８１８７号（Ｎｏｏｇｅｎ）に記載されている。種々の塩、混合塩及び遊離塩形態並びに３’→３’及び２’→５’連結も含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、その長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３の骨格連結修飾を含み得る。前記オリゴヌクレオチド中に２つ以上の別個の骨格修飾を導入することも本発明によって包含される。
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含む。より好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、十分にホスホロチオエート修飾されている。別の好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスフェートを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の化学修飾は、水素原子のいずれかのうち１つ又は２つ以上の、重水素又はトリチウムでの置換を含み、その例は、例えば、国際公開第２０１４／０２２５６６号（Ａｓｅｄ）又は国際公開第２０１５／０１１６９４号（Ｃｅｌｇｅｎｅ）に見ることができる。
核酸模倣技術の到来とともに、種類において、量においては必ずしもそうではないが、核酸自体と同様の、好ましくは、同一のハイブリダイゼーション特徴を有する分子を作製することが可能になった。このような機能性等価物も、もちろん、本発明における使用に適している。
当業者ならば、スキャフォールド、塩基及び／又は骨格が、各々が同一の方法で修飾されないことがあることは理解するであろう。いくつかの別個の修飾スキャフォールド、塩基及び／又は骨格を、本発明の１つの単一オリゴヌクレオチド中に組み合わせてもよい。
一実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、
ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ：

［式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｘは、Ｆ、−ＮＲ１Ｒ２又は−ＯＲであり、
Ｒは、アルケニル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ１Ｒ２又はＳＲ１であり、
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ又はアルキルで各々独立に任意選択でさらに置換された、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールであり、
Ｒ２は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｂ）少なくとも１つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩ

［式中、
Ｂ１は、核酸塩基であり、
Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ３−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏｍ）−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＣＨ＝ＣＨＯ−、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲ３−及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選択される二価の基であり、
ｎは、１又は２であり、
ｍは、０、１又は２であり、
Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ３であり、
Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ５Ｒ５、ベンジル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ及びアルコキシから選択され、
Ｒ４は、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ５は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｃ）モノマーが、ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル骨格連結によって連結され、
ｄ）オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの核酸塩基が、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。
用語「オリゴヌクレオチドの残部」とは、本明細書で使用される場合、一般には、隣接するモノマーに関する。当業者には理解されるであろうが、式Ｉの又は式ＩＩのモノマーが、末端モノマーである場合には、オリゴヌクレオチドの残部は、−Ｈであり得る。式Ｉの又は式ＩＩのいずれかのモノマーについて、両残部は、隣接するモノマーであり得る。対照的に、式Ｉの又は式ＩＩのいずれかのモノマーについて、多くとも１つの単一残部が、末端を構成でき、したがって、例えば、−Ｈであり得る。当業者には理解されるであろうが、全オリゴヌクレオチドは、２つの末端のみを有する。
Ｚ−Ｙは、二価の基である。このような二価の基は、その原文表示で左側に結合を有してスキャフォールドの４’位に（Ｚの近く）、及びその原文表示で右側に結合を有してスキャフォールドの２’位に（Ｙの近く）接続されることが好ましい。例えば、二価の基が、−ＣＨ２−Ｏ−であるといわれる場合には、−ＣＨ２−が、スキャフォールドの４’位に接続されること及び−Ｏ−が、スキャフォールドの２’位に接続されることが好ましい。これは、ＬＮＡモノマーを形成するであろう。
前記オリゴヌクレオチドは、本発明に従う方法又は組成物において使用するためであることが好ましい。前記核酸塩基は、ｄ）下で、Ｂ又はＢ１又は別の核酸塩基であり得る。
別の実施形態では、Ｘは、Ｆ又は−ＯＲである。別の実施形態では、Ｘは、Ｆである。別の実施形態では、Ｘは、−ＯＲである。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。別の実施形態では、Ｘは、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。別の実施形態では、Ｘは、−ＯＣＨ３である。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ又は−ＯＣＨ３である。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
別の実施形態では、Ｒは、非置換アルキルである。別の実施形態では、Ｒは、ＣＨ３又はエチルである。別の実施形態では、Ｒは、ＣＨ３である。別の実施形態では、Ｒは、エチルである。別の実施形態では、Ｒは、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ１Ｒ２又はＳＲ１で置換されたアルキルである。別の実施形態では、Ｒは、ＯＲ１又はＮＲ１Ｒ２で置換されたアルキルである。別の実施形態では、Ｒは、ＯＲ１で置換されたアルキルである。
別の実施形態では、Ｒ１は、Ｈ又は非置換アルキルである。別の実施形態では、Ｒ１は、非置換アルキルである。別の実施形態では、Ｒ１は、ＣＨ３である。別の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。別の実施形態では、Ｒ２は、アルキルである。別の実施形態では、Ｒ２は、ＣＨ３である。
別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＲ３−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏｍ）−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＣＨ＝ＣＨＯ−、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲ３−及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選択される二価の基である。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＲ３−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−から選択される二価の基である。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ２ＮＲ３−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−から選択される。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＲ３ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＮＲ３−から選択される。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−及び−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−から選択される。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−及び−ＣＨ２ＮＨ−から選択される。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−又は−ＣＨ２ＮＨ−から選択される。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−から選択される。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−である。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−である。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−である。別の実施形態では、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２ＮＨ−である。
別の実施形態では、Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。別の実施形態では、Ｗは、Ｏである。別の実施形態では、Ｗは、Ｓである。別の実施形態では、Ｗは、Ｏ、ＮＨ又はＮＣＨ３である。別の実施形態では、Ｗは、Ｏ又はＮＨである。別の実施形態では、Ｗは、ＮＨである。
別の実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４又は非置換アルキルである。別の実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４又はＣＨ３である。別の実施形態では、Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３又はＣＨ３である。
別の実施形態では、Ｒ４は、アルキルである。別の実施形態では、Ｒ４は、ＣＨ３である。
別の実施形態では、Ｒ５は、Ｈである。別の実施形態では、Ｒ５は、アルキルである。
別の実施形態では、Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＲ３ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＮＲ３−である。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−又は−ＣＨ２ＮＨ、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−又は−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−である。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＨ２−又は−ＣＨ２ＮＨ−である。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−及び−ＣＨ２ＮＨ−から選択される。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ又は−ＯＣＨ３であり、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−及び−ＣＨ２ＮＨ−から選択される。別の実施形態では、Ｘは、Ｆ又はＯＣＨ３であり、Ｚ−Ｙは、−ＣＨ２Ｏ−である。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのＢは、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのＢ１は、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド中のシトシン核酸塩基のすべては、５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド中のウラシル核酸塩基のすべては、５−メチルウラシルである。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、
ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ
［式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｘは、Ｆ、−ＮＲ１Ｒ２又は−ＯＲであり、
Ｒは、任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ１Ｒ２又はＳＲ１であり、
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ又はアルキルで各々独立に任意選択でさらに置換された、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールであり、
Ｒ２は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｂ）少なくとも１つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、
ｃ）モノマーが、ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル骨格連結によって連結され、
ｄ）オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの核酸塩基が、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、
ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ
［式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｘは、Ｆ、−ＮＲ１Ｒ２又は−ＯＲであり、
Ｒは、任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ１Ｒ２又はＳＲ１であり、
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ又はアルキルで各々独立に任意選択でさらに置換された、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールであり、
Ｒ２は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｂ）少なくとも１つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩ
［式中、Ｂ１及びＺ−Ｙは、上記で定義のとおりである］
を有し、
ｃ）モノマーが、ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル骨格連結によって連結され、
ｄ）オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの核酸塩基が、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。
別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＣＲＮ、ＬＮＡ、キシロ−ＬＮＡ、α−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡ、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡ、２’−チオ−ＬＮＡ、ｃＥｔ ＢＮＡ、ｃＭＯＥ ＢＮＡ、ｃＬＮＡ、アミド架橋ＬＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｂｎ）、ＣＢＢＮ、ＥＮＡ、ＤｐＮＡ、スルホンアミド架橋ＢＮＡ、尿素架橋ＢＮＡ、二環式炭素環式ヌクレオチド、ＴｒｉＮＡ、α−Ｌ−ＴｒｉＮＡ、ｂｃＤＮＡ、ｔｃＤＮＡ、Ｆ−ｂｃＤＮＡ、Ｆ−ｔｃＤＮＡ、複素環式架橋ＢＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ由来のロックドＰＭＯ、ＧｕＮＡ又はｓｃｐＮＡであるモノマーをもたらす。
別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＣＲＮ、ＬＮＡ、キシロ−ＬＮＡ、α−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡ、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡ、２’−チオ−ＬＮＡ、ｃＥｔ ＢＮＡ、ｃＭＯＥ ＢＮＡ、ｃＬＮＡ、アミド架橋ＬＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｂｎ）、ＣＢＢＮ、ＥＮＡ、ＤｐＮＡ、スルホンアミド架橋ＢＮＡ、尿素架橋ＢＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＣＲＮ、ＬＮＡ、キシロ−ＬＮＡ、α−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ又は２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＣＲＮ、ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ又はＣＢＢＮであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＣＲＮ、ＬＮＡ又は２’−アミノ−ＬＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡ、キシロ−ＬＮＡ、α−ＬＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、β−Ｄ−ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡ、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡ、２’−チオ−ＬＮＡ、ｃＥｔ ＢＮＡ、ｃＭＯＥ ＢＮＡ又はｃＬＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡ、２’−チオ−ＬＮＡ、ｃＥｔ ＢＮＡ、ｃＭＯＥ ＢＮＡ又はｃＬＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、ＣＢＢＮ又はＥＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡ、２’−アミノ−ＬＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、ＣＢＢＮ又はＥＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡ、ＣＢＢＮ又はＥＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡ又はＥＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡであるモノマーをもたらす。
別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｂｎ）、ＣＢＢＮ、ＥＮＡ、スルホンアミド架橋ＢＮＡ又は尿素架橋ＢＮＡであるモノマーをもたらす。別の実施形態では、ＢＮＡスキャフォールド修飾は、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）、ＣＢＢＮ又はＥＮＡであるモノマーをもたらす。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、
ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ
［式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｂ）少なくとも１つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩ
［式中、
Ｂ１は、核酸塩基であり、
Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＲ３−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＣＨ＝ＣＨＯ−、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲ３−及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選択される二価の基であり、
ｎは、１又は２であり、
Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ３であり、
Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ５Ｒ５、ベンジル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ及びアルコキシから選択され、
Ｒ４は、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ５は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｃ）モノマーが、ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル骨格連結によって連結され、
ｄ）オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの核酸塩基が、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、
ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ
［式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｘは、Ｆ、−ＯＣＨ３又は−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｂ）１つ又は２つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩ
［式中、
Ｂ１は、核酸塩基であり、
Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＲ３−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＣＨ＝ＣＨＯ−、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲ３−及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選択される二価の基であり、
ｎは、１又は２であり、
Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ３であり、
Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ５Ｒ５、ベンジル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ及びアルコキシから選択され、
Ｒ４は、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ５は、Ｈ又はアルキルであり、
は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｃ）モノマーが、ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル骨格連結によって連結され、
ｄ）オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの核酸塩基が、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含まないすべてのモノマー（「非ＢＮＡモノマー」）は、式Ｉの修飾モノマーである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、１つ又は２つの式Ｉの非ＢＮＡモノマーを有する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜３３ヌクレオチドの長さであり、１つの式Ｉの非ＢＮＡモノマーを有する。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む１、２、３、４、５、６又は７つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩを有する１、２、３、４、５、６又は７つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む１、２、３又は４つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩを有する１、２、３又は４つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む１、２又は３つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩを有する１、２又は３つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む１又は２つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩを有する１又は２つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む２つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩを有する２つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含む１つのモノマーを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩを有する１つのモノマーを含む。
別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵ（配列番号６０７２）を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３、４５５、４５６、４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３、４８６、５２５、５３１、５３８、５３９、５４０、５４３、５４５、５４６及び４５２８〜４５７２からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３、４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３、４５５及び４５６からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５５及び４５９からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３及び４５４２からなる群から選択される配列を含む。
別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵ（配列番号６０７２）を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５２〜６１３又は配列番号４５２８〜４５７２からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５３、４５５及び４５６からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５５及び４５９からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。
別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＧＵＡＡＧＵＵＣＮＧＵＣＣＡＡＧＣ（配列番号６０７３）を含み、ここで、Ｎは、Ｔ又はＵである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＧＵＡＡＧＵＵＣＮＧＵＣＣＡＡＧＣ（配列番号６０７３）を含み、ここで、Ｎは、Ｔ又はＵであり、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５６５〜４５７１からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５６５〜４５７１からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。
別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５６１〜４５６４及び配列番号４５７２からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号４５６１〜４５６４及び配列番号４５７２からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである。
別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＣＣＡＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧ（配列番号６０７４）を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＣＣＡＡＵＧＣＣＡＵＣＣＵＧ（配列番号６０７５）を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号３１８５、３５７３、３８５５、４１９８及び４４０１からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号３１８５、３５７３、３８５５及び４４０１からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＣＣＡＡＵＵＵＵＵＣＣＵＧ（配列番号６０７４）を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＣＣＡＡＵＧＣＣＡＵＣＣＵＧ（配列番号６０７５）を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号３１８５、３５７３、３８５５、４１９８及び４４０１からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものである。別の実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列番号３１８５、３５７３、３８５５及び４４０１からなる群から選択される配列を含み、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＵＵＣＵＧＵＵＡＧＣＣ（配列番号６０７６）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２０ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号２９によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＵＡＵＵＵＡＧＣＡ（配列番号６０７７）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２３ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号１６１によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＧＡＡＵＵＵＧＵ（配列番号６０７８）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２３ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号１１９によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＵＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号６０７９）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２３ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号２３３によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４４をスキップするためのものである場合には、配列番号６０７６〜６０７９によって表される配列を含むことが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＣＣＣＡＡＵ（配列番号６０８０）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２５ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号３１８５によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＣＡＡＵＵＵＵ（配列番号６０８１）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２４ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号３５７３によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＣＣＣＡＡＵ（配列番号６０８２）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２５ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号３８５５によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＵＣＵＧＡＣＡＡＣＡ（配列番号６０８３）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２２ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号４１９８によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＣＡＡＵＧＣＣＡＵＣＣ（配列番号６０８４）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２１ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号４４０１によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン４５をスキップするためのものである場合には、配列番号６０７４、６０７５又は６０８０〜６０８４によって表される配列を含むことが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵ（配列番号６０８５）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２２ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号４５９によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＵＡＡＧＵＵＣＵＧＵＣＣＡＡ（配列番号６０８６）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１８ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号４５６５によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５１をスキップするためのものである場合には、配列番号６０７２、６０７３、６０８５又は６０８６によって表される配列を含むことが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＵＵＧＣＣＵＣＣＧＧＵＵＣ（配列番号６０８７）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、１８ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号８４５によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＧＵＵＣＵＧ（配列番号６０８８）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２５ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号８６３によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＧＡＵＵＣＵＧＡＡＵ（配列番号６０８９）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２４ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２２ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号４９８７によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＡＣＵＵＣＡＵＣ（配列番号６０９０）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２４ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号５１７４によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＵＵＣＣＡＵＧＡ（配列番号６０９１）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２４ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号５４４６によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、配列ＵＧＵＵＧＣＣＵ（配列番号６０９２）を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、１６〜２６ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、２４ヌクレオチドの長さがより好ましい。これに関連して、好ましい実施形態は、配列番号５７６５によって表されるヌクレオチド配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明に従うオリゴヌクレオチドが、ジストロフィンのプレｍＲＮＡのエキソン５３をスキップするためのものである場合には、配列番号６０８７〜６０９２によって表される配列を含むことが好ましい。
組成物
本発明の一態様では、少なくとも１種の本発明に従うオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、好ましい、少なくとも１種の賦形剤を含み、及び／又は前記オリゴヌクレオチドは、組織及び／若しくは細胞への、並びに／又は組織及び／若しくは細胞中への前記組成物及び／又は前記オリゴヌクレオチドの標的化及び／又は送達の増強にさらに役立ち得る少なくとも１種のコンジュゲートされたリガンドを含む、組成物が提供される。本明細書において記載されるような組成物は、本明細書において、本発明に従う組成物と呼ばれる。本発明に従う組成物は、１種又は２種以上の本発明に従うオリゴヌクレオチドを含み得る。本発明に関連して、賦形剤は、別個の分子であり得るが、コンジュゲートされた部分でもあり得る。第１の場合には、賦形剤は、デンプンなどの増量剤であり得る。後者の場合には、賦形剤は、例えば、本発明に従うオリゴヌクレオチドに連結される標的化性リガンドであり得る。
本態様の好ましい実施形態では、このような組成物は、カチオン性両親媒性化合物（ＣＡＣ）又はカチオン性両親媒性薬物（ＣＡＤ）をさらに含み得る。ＣＡＣは、一般に、リソソーム作用剤(lysosomotropic agent)及びエンドソーム及びリソソームを緩衝できる弱塩基である（Ｍａｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ 第１３４巻：２２１〜２２７頁、２００９年）。ＣＡＣをさらに含む組成物は、前記ＣＡＣを含まない同様の組成物と比較して、ＲＮＡ調節の改善されたパラメータを有することが好ましい。理論に捉われようとは思わないが、これは、ＣＡＣが、例えば、エンドソーム脱出の促進によって、本発明のオリゴヌクレオチドをその活性の部位に到達することにおいて補助できるからであると考えられる。本発明の組成物中に含まれるような好ましいＣＡＣとして、トレミフェン及びその誘導体、類似体及びＮ−デスメチルトレミフェンなどの代謝産物、タモキシフェン、アフィモキシフェン(afimoxifene)、クロミフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、ミプロキシフェン及びナフォキシジンがある。これらのＣＡＣは、共通の１，１−ジフェニルエチレン部分を共有する。化合物が、本明細書において記載されるような化合物とわずかな置換又は修飾によってのみ異なる場合には、前記化合物は、このような化合物の誘導体であり、その類似体としても見られることもある。化合物の代謝産物は、特定のクラスの誘導体である。当技術分野で公知の化合物については、代謝産物も公知であることが多い。化合物の代謝産物が言及される場合には、少なくともこれらの公知の代謝産物のすべてが言及される。例えば、Ｎ−デスメチルトレミフェンは、トレミフェンの公知の代謝産物である。
好ましい実施形態では、前記組成物は、薬剤として使用するためのものである。前記組成物は、したがって、医薬組成物である。医薬組成物は、普通、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、本明細書において定義されるような化合物を含み、任意選択で、薬学的に許容される製剤、増量剤、防腐剤、可溶化剤、担体、希釈剤、賦形剤、塩、アジュバント及び／又は溶媒をさらに含む。このような薬学的に許容される担体、増量剤、防腐剤、可溶化剤、希釈剤、塩、アジュバント、溶媒及び／又は賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年に見ることができる。本発明において記載されるような化合物は、少なくとも１つのイオン化できる基を有し得る。イオン化できる基は、塩基であっても酸であってもよく、電荷を有しても、中性であってもよい。イオン化できる基は、反対の電荷（複数可）を保持する適当な対イオンとのイオン対として存在し得る。カチオン性対イオンの例として、ナトリウム、カリウム、セシウム、Ｔｒｉｓ、リチウム、カルシウム、マグネシウム、トリアルキルアンモニウム、トリエチルアンモニウム及びテトラアルキルアンモニウムがある。アニオン性対イオンの例として、クロリド、ブロミド、ヨーダイド、ラクテート、メシレート、ベシレート、トリフレート、アセテート、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート、タートレート、ラクテート及びシトレートがある。対イオンの例は、記載されている［例えば、参照により本明細書において組み込まれるＫｕｍａｒ、２００８年］。
医薬組成物は、前記化合物の安定性、溶解度、吸収、バイオアベイラビリティ、活性、薬物動態、薬動力学、細胞性取り込み及び細胞内輸送の増強における助剤、特に、複合体を形成可能な賦形剤、ナノ粒子、微粒子、ナノチューブ、ナノゲル、ハイドロゲル、ポロクサマー又はプルロニック、ポリマーソーム、コロイド、マイクロバブル、ベシクル、ミセル、リポプレックス及び／又はリポソームを含み得る。ナノ粒子の例として、ポリマーナノ粒子、（混合）金属ナノ粒子、炭素ナノ粒子、金ナノ粒子、磁性ナノ粒子、シリカナノ粒子、脂質ナノ粒子、糖粒子、タンパク質ナノ粒子及びペプチドナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子とオリゴヌクレオチドの組合せの例として、例えば、Ｂａｒｎａｂｙら Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｓ． ２０１５年、第１６６巻、２３頁におけるような球状核酸（ＳＮＡ）がある。
好ましい組成物は、組織及び／若しくは細胞への、及び／又は組織及び／若しくは細胞中への前記組成物及び／又は前記オリゴヌクレオチドの標的化及び／又は送達の増強にさらに役立ち得る少なくとも１種の賦形剤を含む。好ましい組織又は細胞は、筋肉組織又は細胞である。
これらの賦形剤のうち多数が、当技術分野で公知であり（例えば、Ｂｒｕｎｏ、２０１１年を参照のこと）、第１の種類の賦形剤としてカテゴリー化され得る。第１の種類の賦形剤の例として、ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、デキストラン誘導体、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）、ヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、カダベリン）、キトサン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エステルアミン）、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）シクロデキストリン、ヒアルロン酸、コロミン酸及びその誘導体）、デンドリマー（例えば、ポリ（アミドアミン）、脂質｛例えば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジオレオイルジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、ホスファチジルコリン誘導体［例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）］、リソ−ホスファチジルコリン誘導体［例えば、１−ステアロイル−２−リソ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｓ−ＬｙｓｏＰＣ）］、スフィンゴミエリン、２−｛３−［ビス−（３−アミノ−プロピル）−アミノ］−プロピルアミノ｝−Ｎ−ジテトラセディル（ditetracedyl）カルバモイルメチルアセトアミド（ＲＰＲ２０９１２０）、ホスホグリセロール誘導体［例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、ナトリウム塩（ＤＰＰＧ−Ｎａ）、ホスファチシドアシッド(phosphaticid acid)誘導体［１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチシドアシッド(phosphaticid acid)、ナトリウム塩（ＤＳＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン誘導体［例えば、ジオレオイル−Ｌ−Ｒ−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ），］、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、（１，２−ジミリスチオルキシプロピル(dimyristyolxypropyl)−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、（Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、（ｂ−Ｌ−アルギニルｌ−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレリル−アミドトリヒドロクロリド（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン誘導体［例えば、１，２−ジステアロイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｏＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ホスファチジルセリン誘導体［１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、ナトリウム塩（ＤＯＰＳ）］、タンパク質（例えば、アルブミン、ゼラチン、アテロコラーゲン(atellocollagen)）及び直鎖又は環状ペプチド（例えば、プロタミン、ＰｅｐＦｅｃｔｓ、ＮｉｃｋＦｅｃｔｓ、ポリアルギニン、ポリリジン、ＣＡＤＹ、ＭＰＧ、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、標的化ペプチド、細胞転位置ペプチド、エンドソーム脱出ペプチド）が挙げられる。このようなペプチドの例は、記載されている、例えば、筋肉標的化ペプチド（例えば、Ｊｉｒｋａら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ． ２０１４年、第２４巻、２５頁）、ＣＰＰ（例えば、Ｐｉｐシリーズ、国際公開第２０１３／０３０５６９号を含む、及びオリゴアルギニンシリーズ、例えば、米国特許第９，１６１，９４８号（Ｓａｒｅｐｔａ）、国際公開第２０１６／１８７４２５号（Ｓａｒｅｐｔａ）及び例えば、Ｇａｏら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１４年、第２２巻、１３３３頁中のＭ１２ペプチド）又は（分岐）ＡｐｏＥ誘導体などの血液脳関門（ＢＢＢ）通過ペプチド（Ｓｈａｂａｎｐｏｏｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｔｈｅｒ．２０１７年、第２７巻、１３０頁）。別個の化合物として使用される場合には、以下に記載されるような炭水化物及び炭水化物クラスターも、第１の種類の賦形剤として使用するのに適している。
別の好ましい組成物は、第２の種類の賦形剤としてカテゴリー化される少なくとも１種の賦形剤を含み得る。第２の種類の賦形剤は、例えば、筋肉組織又は細胞のような組織及び／若しくは細胞への、及び／又は組織及び／若しくは細胞中への本発明の組成物及び／又はオリゴヌクレオチドの標的化及び／又は送達を増強するために、本明細書において記載されるようなコンジュゲート基を含み得る又は含有し得る。コンジュゲート基は、１つ又は複数の異なる又は同一のリガンドを示し得る。コンジュゲート基リガンドの例として、例えば、ペプチド、ビタミン、アプタマー、炭水化物又は炭水化物の混合物（Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１６年、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０９８１；Ｃａｏら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２０１６年、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１６．４６）、タンパク質、小分子、抗体、ポリマー、薬物がある。炭水化物コンジュゲート基リガンドの例として、グルコース、マンノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース−６リン酸、マンノース−６リン酸及びマルトトリオースがある。炭水化物は、多数で、例えば、炭水化物を組成物の成分と連結する樹状又は分岐リンカー部分で末端基として存在し得る。炭水化物はまた、ＧａｌＮＡｃクラスター部分などの炭水化物クラスター部分中に含まれ得る。炭水化物クラスター部分は、標的化部分及び任意選択でコンジュゲートリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、炭水化物クラスター部分は、１、２、３、４、５、６つ又はそれ以上のＧａｌＮＡｃ基を含む。「炭水化物クラスター」は、本明細書で使用される場合、スキャフォールド又はリンカー基に結合された１つ又は複数の炭水化物残基を有する化合物を意味する（例えば、Ｍａｉｅｒら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３年、（第１４巻）：１８〜２９頁；Ｒｅｎｓｅｎら、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．２００４年、（第４７巻）：５７９８〜５８０８頁を参照のこと）。これに関連して、「修飾された炭水化物」とは、天然に存在する炭水化物に対して１つ又は複数の化学修飾を有する任意の炭水化物を意味する。「炭水化物誘導体」は、本明細書で使用される場合、出発材料又は中間体として炭水化物を使用して合成され得る任意の化合物を意味する。「炭水化物」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する炭水化物、修飾された炭水化物又は炭水化物誘導体を意味する。両方の種類の賦形剤を、本明細書において記載されるような１つの単一組成物に一緒に組み合わせてもよい。三価Ｎ−アセチルグルコサミンクラスターの例が、国際公開第２０１７／０６２８６２号（Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に記載されており、これはまた、スルホンアミド小分子のクラスターも記載する。小分子セルトラリンの単一コンジュゲートの一例（Ｆｅｒｒｅｓ−Ｃｏｙら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．２０１６年、第２１巻、３２８頁）並びにイブプロフェン（例えば、米国特許第６，６５６，７３０号ＩＳＩＳ／Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、スペルミン（例えば、Ｎｏｉｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ２００８年、第１３０巻、１３５００頁）、アニスアミド（例えば、Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０年、第１３２巻、８８４８頁）及び葉酸（例えば、Ｄｏｈｍｅｎら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ ２０１２年、第１巻、ｅ７）を含むタンパク質結合性小分子のコンジュゲートも記載されている。
オリゴヌクレオチドのアプタマーとは、当技術分野で公知である（例えば、ＺｈａｏらＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１５年、第６７巻、４２頁）。
抗体及び抗体断片も、本発明のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートできる。好ましい実施形態では、特定の興味深い組織、特に、筋肉組織を標的化する抗体又はその断片を、本発明のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする。このような抗体及び／又は断片の例は、例えば、国際公開第２０１６／１７９２５７号（ＣｙｔｏＭｘ）に、及びＳｕｇｏらＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．２０１６年、第２３７号、１頁に記載されるＣＤ７１（トランスフェリン受容体）に対して、又は例えば、Ｗｅｉｓｂａｒｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２年、第１１巻、１頁に記載されるような３Ｅ１０抗体などの受動拡散型ヌクレオシド輸送体（ＥＮＴ）に対して標的化される。
その他のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、当業者に公知であり、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．２０１３年、第４巻、７９１頁、 Ｍａｎｏｈａｒａｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｄｅｖ． ２００４年、第１２巻、１０３頁及びＭｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ． ２０１５年、第８７巻、８１頁に概説されている。
当業者ならば、本発明において使用するために化合物を製剤化し、送達するために、上記の又はその他の代替賦形剤及び送達系のうち１種又は複数を選択し、組合せ、及び／又は適応させることができる。
本発明のこのような医薬組成物は、動物、好ましくは、哺乳動物に、設定された時間で有効濃度で投与してもよい。より好ましい哺乳動物として、ヒトがある。本発明に従って使用するための本明細書において定義されるようなオリゴヌクレオチド又は組成物は、本明細書において同定されるような疾患又は状態に冒されている、又はそれを発生するリスクにある個体のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞、組織及び／又は臓器への直接投与に適したものであることがあり、ｉｎ ｖｉｖｏで直接、ｅｘ ｖｉｖｏで又はｉｎ ｖｉｔｒｏで投与してもよい。投与は、局所、全身及び／又は非経口経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、くも膜下腔内、筋肉内、眼内、鼻腔、泌尿生殖器、皮内、経皮、腸内、硝子体内、空洞内、大脳内、くも膜下腔内、硬膜外又は経口経路によるものであり得る。
本発明のこのような医薬組成物は、経口送達のために、エマルジョン、懸濁液、丸剤、錠剤、カプセル剤又はソフトゲルの形態で、又は気道及び肺への送達のために、エアゾール又は乾燥散剤の形態でカプセル化され得ることが好ましい。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、前記疾患の治療のために使用されることがすでに知られている別の化合物と一緒に使用されてもよい。炎症を低減するための、好ましくは、筋肉組織炎症を低減するためのこのようなその他の化合物並びに／又は筋肉線維機能、完全性及び／若しくは生存を改善するための、及び／若しくは候補機能を改善、増大若しくは回復させる補助化合物が使用されてもよい。
例として、それだけには限らないが、ステロイド、好ましくは、（グルコ）コルチコステロイド、エピカテキン、ＡＣＥ阻害剤（好ましくは、ペリンドプリル）及びＨＤＡＣ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ１型受容体ブロッカー（好ましくは、ロサルタン）、アンジオテンシンペプチド（１−７）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、ＮＦ−ｋＢ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤（好ましくは、デコリン）、ヒト組換えバイグリカン、ｍＩＧＦ−１の供給源、ミオスタチン阻害剤、マンノース−６リン酸、抗酸化薬、イオンチャネル阻害剤、ダントロレン、プロテアーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤（好ましくは、シルデナフィル又はタダラフィルなどのＰＤＥ５阻害剤）及び／又はＬ−アルギニンがある。このような併用使用は、逐次使用であってもよい：各成分は、おそらくは、別個の組成物として別個の様式で投与される。或いは、各化合物は、単一組成物中で一緒に使用されてもよい。
本発明に従う組成物中に含まれる化合物はまた、例えば、本発明に従う組成物の有効成分の逐次投与を可能にするために別個に提供されることもある。このような場合には、本発明に従う組成物は、コンジュゲートリガンドを有する又は有さない少なくとも１種の本発明に従うオリゴヌクレオチド、少なくとも１種の賦形剤及び任意選択で上記のようなＣＡＣを含む化合物の組合せである。
使用
さらなる態様において、薬剤又は療法の一部又は前記オリゴヌクレオチドが細胞内でその活性を発揮する適用として使用するための、これまでの節に記載されたような組成物又はオリゴヌクレオチドの使用が提供される。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物は、ＤＭＤ又はＢＭＤ又はＳＭＡを予防、遅延、治癒、寛解及び／又は治療するための薬剤又は療法の一部として使用するためのものである。
本発明のこの態様の一実施形態では、好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する、予防する及び／又は遅延させるための薬剤として使用するための、本発明に従うオリゴヌクレオチド又は本発明に従う組成物が提供される。
方法
さらなる態様において、個体において、前記個体の細胞、組織又は臓器において、これまでの節において定義されるような状態又は疾患を予防する、治療する、治癒させる、寛解させる及び／又は遅延させるための方法が提供される。方法は、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を、それを必要とする前記個体又は対象に投与することを含む。
本明細書において定義されるようなオリゴヌクレオチド又は組成物が、本明細書において定義される疾患のいずれかによって冒された、又は炎症性障害を発生するリスクにある個体のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞、組織及び／又は臓器への投与に適したものであることがあり、ｉｎ ｖｉｖｏで、ｅｘ ｖｉｖｏで又はｉｎ ｖｉｔｒｏで投与され得る本発明の方法。必要とする個体又は対象は、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。或いは、対象は、ヒトではない。投与は、局所、全身及び／又は非経口経路、例えば、静脈内、皮下、鼻腔、眼内、腹腔内、くも膜下腔内、筋肉内、空洞内、泌尿生殖器、皮内、経皮、腸内、硝子体内、大脳内、くも膜下腔内、硬膜外又は経口経路によるものであり得る。
一実施形態では、本発明の方法では、オリゴヌクレオチド又は組成物の濃度は、０．０１ｎＭ〜１μＭの範囲である。使用される濃度は、０．０５〜５００ｎＭ又は０．１〜５００ｎＭ又は０．０２〜５００ｎＭ又は０．０５〜５００ｎＭであることがより好ましく、１〜２００ｎＭがさらにより好ましい。
本発明に従うオリゴヌクレオチド又は組成物の用量範囲は、厳格なプロトコール必要条件が存在する臨床治験における上昇用量研究（ｉｎ ｖｉｖｏ使用）に基づいて設計されることが好ましい。本明細書において定義されるようなオリゴヌクレオチドは、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ又は０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である用量で使用され得る。
上記で示されるようなオリゴヌクレオチド又は組成物の濃度又は用量の範囲は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ使用にとって好ましい濃度又は用量である。当業者ならば、使用されるオリゴヌクレオチドの同一性、治療されるべき標的細胞、遺伝子標的及びその発現レベル、使用される媒体及びトランスフェクション及びインキュベーション条件に応じて、使用されるオリゴヌクレオチドの濃度又は用量は、さらに変わることがあり、さらに省略されることが必要である場合もあるということは理解するであろう。
本発明のこの態様の一実施形態では、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を予防する、治療する及び／又は遅延させるための方法であって、対象に本発明に従うオリゴヌクレオチド又は本発明に従う組成物を投与することを含む方法が提供される。
本発明の特定の実施形態
１．ｉ）Ｉａ）少なくとも１つの２’−置換モノマー及び任意選択でホスホロチオエート骨格連結又は
Ｉｂ）ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
ｉｉ）５−メチルシトシン及び／又は５−メチルウラシル塩基並びに
ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
を含むオリゴヌクレオチド。
２．二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾、好ましくは架橋核酸スキャフォールド修飾を含む、１、２、３又は４つのモノマーを含む、実施形態１に従うオリゴヌクレオチド。
３．少なくとも１つの二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾が、前記オリゴヌクレオチドの末端モノマー中に、好ましくは前記オリゴヌクレオチドの５’末端モノマー中に、より好ましくは前記オリゴヌクレオチドの両方の末端モノマー中に含まれる、実施形態１又は２に従うオリゴヌクレオチド。
４．前記二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾の各出現が、コンホメーション的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）モノマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、キシロ−ＬＮＡモノマー、α−Ｌ−ＬＮＡモノマー、β−Ｄ−ＬＮＡモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−Ｎ−置換−２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたエチル（ｃＥｔ）ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたメトキシエチル（ｃＭＯＥ）ＢＮＡモノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）モノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）モノマー、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）モノマー、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）モノマー及びそれらの誘導体からなる群から独立に選択されるモノマーをもたらす、実施形態１〜３のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
５．前記２’−置換モノマーが、２’−置換ＲＮＡモノマー、２’−Ｆモノマー、２’−アミノモノマー、２’−Ｏ−置換モノマー、２’−Ｏ−メチルモノマー又は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）モノマー、好ましくは、２’−Ｏ−メチルモノマーである、実施形態１〜４のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
６．すべてのシトシン塩基が５−メチルシトシン塩基であり、及び／又はすべてのウラシル塩基が５−メチルウラシル塩基である、実施形態１〜５のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
７．前記オリゴヌクレオチドの長さが、３４ヌクレオチド未満である、実施形態１〜６のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
８．エキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部と、相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする、好ましくは、エキソン認識配列（ＥＲＳ）、エキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、ＳＲタンパク質結合部位、又は別のスプライシングエレメント、シグナル若しくは構造の少なくとも一部と、相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする配列を含む又はからなる、実施形態１〜７のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
９．前記のエキソン及び／又は非エキソン領域の少なくとも一部が、１０〜３３ヌクレオチドの長さを有する、実施形態８に従うオリゴヌクレオチド。
１０．前記エキソン及び／又は非エキソン領域が、ＤＭＤ遺伝子中又はＳＭＮ遺伝子中にある、実施形態８又は９に従うオリゴヌクレオチド。
１１．配列番号８〜１５８０を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号８〜１５８０の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される、好ましくは、配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３若しくは４８６を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって、又は配列番号４５３、４５５、４５６、４５９、４６１、４６２、４６５、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、４８３若しくは４８６の断片を含む若しくはからなるヌクレオチド配列によって表される、実施形態１〜１０のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
１２．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、タンパク質の産生又は組成を変更し、好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、エキソンスキッピング又はエキソン包含を含み、最も好ましくは、前記ＲＮＡ調節が、エキソンスキッピングを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
１３．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、疾患又は状態と関連するタンパク質の産生を変更し、前記疾患又は状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であることが好ましい、実施形態１〜１２のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
１４．二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドと比較して改善されたパラメータを有する、実施形態１〜１３のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド。
１５．組織及び／若しくは細胞への、並びに／又は組織及び／若しくは細胞中への前記組成物及び／又は前記オリゴヌクレオチドの標的化及び／又は送達の増強にさらに役立ち得る少なくとも１種の賦形剤を含むことが好ましい、実施形態１〜１４のいずれか１つにおいて定義されるようなオリゴヌクレオチドを含む組成物。
１６．薬剤として使用するための、好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する、予防する及び／又は遅延させるための実施形態１〜１４のいずれか１つに従うオリゴヌクレオチド、又は請求項１５に記載の組成物。
１７．デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を予防する、治療する及び／又は遅延させるための方法であって、対象に、実施形態１〜１４のいずれか１つにおいて定義されるようなオリゴヌクレオチド又は請求項１５において定義されるような組成物を投与するステップを含む、方法。
１８．１０〜３３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであって、
ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ

［式中、
Ｂは、核酸塩基であり、
Ｘは、Ｆ、−ＮＲ１Ｒ２又は−ＯＲであり、
Ｒは、アルケニル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ１Ｒ２又はＳＲ１であり、
Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ又はアルキルで各々独立に任意選択でさらに置換された、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールであり、
Ｒ２は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｂ）少なくとも１つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩ

［式中、
Ｂ１は、核酸塩基であり、
Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ３−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏｍ）−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＣＨ＝ＣＨＯ−、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲ３−及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選択される二価の基であり、
ｎは、１又は２であり、
ｍは、０、１又は２であり、
Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ３であり、
Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ５Ｒ５、ベンジル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ及びアルコキシから選択され、
Ｒ４は、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ５は、Ｈ又はアルキルであり、

は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
を有し、
ｃ）モノマーが、ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル骨格連結によって連結され、
ｄ）オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの核酸塩基が、５−メチルシトシン又は５−メチルウラシル塩基である、オリゴヌクレオチド。
１９．Ｒが、非置換アルキル又はＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である、実施形態１８に従うオリゴヌクレオチド。
２０．Ｒ１がＣＨ３である、実施形態１８又は１９に従うオリゴヌクレオチド。
２１．ＸがＦ又は−ＯＲである、実施形態１８〜２０のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２２．Ｘが、Ｆ又は−ＯＣＨ３である、実施形態１８〜２１のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２３．Ｚ−Ｙが、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−からなる群から選択される二価の基である、実施形態１８〜２２のいずれかのオリゴヌクレオチド。
２４．Ｚ−Ｙが−ＣＨ２Ｏ−であり、好ましくは、Ｚが−ＣＨ２−であり、Ｙが−Ｏ−である、実施形態１８〜２３のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２５．配列ＧＧＡＡＧＡＵＧＧＣＡＵ（配列番号６０７２）を含む、実施形態１８〜２４のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２６．１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１８〜２５のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２７．１９、２０又は２２ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１８〜２６のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２８．２０又は２２ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１８〜２７のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
２９．２０ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１８〜２８のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３０．２２ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１８〜２８のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３１．１９ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１８〜２７のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３０．配列番号４５３、４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８から選択される配列を含む又はからなる配列によって表される、実施形態１８〜２７のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３１．配列番号４５３、４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８から選択される配列からなる配列によって表される、実施形態１８〜２６のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３２．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、タンパク質の産生又は組成を変更することが好ましく、エキソンスキッピング又はエキソン包含を含むことが好ましく、前記ＲＮＡ調節が、エキソンスキッピングを含むことが最も好ましい、実施形態１８〜３１のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３３．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、疾患又は状態と関連するタンパク質の産生を変更し、前記疾患又は状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であることが好ましい、実施形態１８〜３２のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３４．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）と関連するタンパク質の産生を変更する、実施形態１８〜３３のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３５．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）と関連するタンパク質の産生を変更する、実施形態１８〜３３のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３６．前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）と関連するタンパク質の産生を変更する、実施形態１８〜３３のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
３７．二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドと比較して改善されたパラメータを有する、実施形態１８〜３６のいずれかに従うオリゴヌクレオチド。
定義
本文書において、及びその請求項において、動詞「含む」及びその活用は、その限定されない意味で、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に記載されない項目が排除されないことを意味するように使用される。さらに、動詞「からなる」は、本明細書において定義されるようなオリゴヌクレオチド又は組成物は、具体的に同定されるものよりもさらなる成分を含んでもよく、前記のさらなる成分（複数可）は、本発明の独特の特徴を変更しないことを意味する「本質的にからなる」によって置き換えられ得る。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、内容が明確に、１つの及び１つのみの要素があることを必要としない限り、２以上の要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、したがって、普通、「少なくとも１つの」意味する。
本明細書において同定されるような各実施形態は、特に断りのない限り一緒に組み合わせることができる。本明細書において引用されるすべての特許及び文献参考は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
本出願を通じて、単語「結合する」、「標的化する」、「ハイブリダイズする」は、本明細書において同定されるようなプレｍＲＮＡの一部に対して相補的である、好ましくは、逆相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関連して使用される場合に同義的に使用され得る。本発明に関連して、「ハイブリダイズ」は、特に断りのない限り、細胞、好ましくは、筋肉細胞において生理学的状態下で使用される。
構造式又は化学名が、当業者にキラル中心を有すると理解される場合には、キラリティーは示されないが、各キラル中心について、ラセミ混合物、純粋なＲエナンチオマー及び純粋なＳエナンチオマーいずれかの３種すべてに対して個々の参照がなされる。
本発明に関連して物質のパラメータが論じられる場合はいつも、特に断りのない限り、生理学的状態下でパラメータが決定され、測定され、又は示されると想定される。生理学的状態は、当業者に公知であり、水性溶媒系、大気圧、６から８の間のｐＨ値、室温〜約３７℃（約２０℃〜約４０℃）の範囲の温度及びバッファー塩又はその他の成分の適した濃度を含む。電荷は、平衡と関連することが多いということは理解される。電荷を保持する又は保有するといわれる部分は、このような電荷を保有又は保持しないものよりもより多く、このような電荷を保有又は保持する状態において見られる部分である。そのようなものとして、当業者には理解されるであろうが、本開示において電荷を有すると示される原子は、特定の状態下では電荷を有さないことがあり、中性部分は、特定の状態下で電荷を有することがある。
一般に置換は、水素であり得るある部分を別の部分によって置き換える。有機分子の炭素骨格を考えると、ＲＮＡモノマーは、その２’位にヒドロキシル部分を有するので本質的に２’−置換される。ＤＮＡモノマーは、したがって、２’−置換されないであろう、ＲＮＡモノマーは、２’−置換ＤＮＡモノマーとして見ることができる。次に、ＲＮＡモノマーが２’−置換される場合には、この置換は、２’−ＯＨ又は２’−Ｈのいずれかを置き換えたものであり得る。ＲＮＡモノマーが、２’−Ｏ−置換される場合には、この置換は、２’−ＯＨ部分のＨを置き換える。限定されない例として、２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、２’−置換モノマー（−ＯＭｅは、−Ｈを置換する）及び２’−置換ＲＮＡモノマー（−ＯＭｅは、−ＯＨ置換する）及び２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマー（−Ｍｅは、−Ｈを置換する）であるが、２’−Ｆ ＲＮＡは、２’−置換ＲＮＡモノマー（−Ｆは、−ＯＨ又はＨを置換する）であるが、２’−Ｏ−置換ＲＮＡモノマー（２’−Ｏは、もはや存在しないか、置換されていないのいずれか）ではない。Ｆ置換２’−ＯＨが２’−Ｆ−２’−デオキシＲＮＡであり、２’−Ｆ ＤＮＡでもある２’−Ｆ ＲＮＡ。
「アルケニル」は、２〜８個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐炭化水素基を意味する。特定の実施形態では、アルケニルは、エテニル、プロペニル、１ブタ−３−エニル、１ペンタ−３−エニル及び１−ヘキサ−５−エニルを含む。
「アルコキシ」は、式−ＯＲの基を意味し、式中、Ｒは、アルキルである。特定の実施形態では、アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ及びヘキシルオキシを含む。
「アルキル」とは、１〜２０個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐飽和炭化水素基を意味し、特定の実施形態では、１〜６個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、アルキルは、１〜４個の炭素原子を含み、特定の実施形態では、１〜３個の炭素原子を含む。特定の実施形態では、アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル及びｎ−デシルを含む。
「アリール」とは、一価の６〜１４員の一−、二−又は三−炭素環を意味し、単環式環は、芳香族であり、二環式環又は三環式環中の環のうち少なくとも１つは、芳香族である。特定の実施形態では、アリールは、フェニル、ナフチル、インダニル及びアントラセニルを含む。
「シクロアルキル」とは、単環式又は二環式、飽和又は部分不飽和（芳香族ではない）、３〜１０個の炭素環原子の炭化水素基を意味する。特定の実施形態では、シクロアルキル基は、５〜６個の炭素原子を含有し、本明細書においてＣ５〜６シクロアルキルと呼ばれることもある。シクロアルキル基は、縮合、架橋及びスピロシクロアルキル二環式環を含む。例えば、縮合される場合には、シクロアルキル基は、隣接する原子（例えば、１つの共有結合）を共有する２つの環を含み得る。架橋される場合には、シクロアルキル基は、３個以上の原子を共有し、少なくとも１個の原子を含有する架橋によって２個の橋頭原子を分けている２つの環を含み得る。スピロの場合には、シクロアルキル基は、１個のみの単一原子、例えば、第四級炭素であり得るスピロ原子を共有する２つの環を含み得る。特定の実施形態では、シクロアルキル基は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルを含む。特定の実施形態では、シクロアルキル基は、

を含む。
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード基を意味する。「ハロ」は、フルオロを意味することが好ましい。「ハロ」は、ハロゲンによって置き換えられ得る。好ましいハロゲンとして、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素がある。最も好ましいハロゲンは、フッ素である。
「ヘテロアリール」とは、１個又は複数の、別の例では、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは、０、１又は２である）、−Ｎ＝（三価窒素）、Ｎ（Ｈ）−及び＞Ｎ−オキシド、から独立に選択される１個、２個、３個又は４個の環ヘテロ原子を含有し、残りの環原子は炭素である５〜１４個の環原子の単環式、縮合二環式又は縮合三環式ラジカルを意味し、ここで、単環式ラジカルを含む環は、芳香族であり、二環式又は三環式ラジカルを含む縮合環のうち少なくとも１つは、芳香族である（しかし、ヘテロ原子を含有する環でなくてもよい、例えば、２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）。縮合二環式ラジカルは、架橋環構造を含む。特に断りのない限り、原子価は、原子価則が容認する、ヘテロアリール基の任意の環の任意の原子に位置し得る。
特定の実施形態では、ヘテロアリールとして、それだけには限らないが、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、インダゾリル、フタリミジル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾピラニル、ベンゾチアゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノリニル、イソキノリニル及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。
「ヘテロシクロアルキル」とは、１個又は複数の環原子は、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは、０、１又は２である）、−Ｎ＝（三価窒素）又はＮＨ−から独立に選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子は、炭素である、３〜９個の環原子の飽和又は部分不飽和（しかし芳香族ではない）一価の単環式基又は５〜１２個の環原子の飽和又は部分不飽和（しかし芳香族ではない）一価の二環式基を意味する。ヘテロシクロアルキル基は、縮合、架橋及びスピロヘテロシクロアルキル二環式環を含む。例えば、縮合される場合には、ヘテロシクロアルキル基は、隣接する原子（例えば、１つの共有結合）を共有する２つの環を含み得る。架橋される場合には、ヘテロシクロアルキル基は、３個以上の原子を共有し、少なくとも１個の原子を含有する架橋によって２個の橋頭原子を分けている２つの環を含み得る。スピロの場合には、ヘテロシクロアルキル基は、１個のみの単一原子、例えば、第四級炭素であり得るスピロ原子を共有する２つの環を含み得る。特定の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは、０、１又は２である）、−Ｎ＝（三価窒素）又はＮＨ−から独立に選択される１個、２個、３個又は４個の環ヘテロ原子を含む。
特定の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、５又は６個の環原子を含有する。特定の実施形態では、ヘテロシクロアルキルとして、それだけには限らないが、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジオキシニル、チイオモルホリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル及びテトラヒドロフリルが挙げられる。
本発明に関連して、評価されるべきパラメータの減少又は増大は、そのパラメータに対応する値の少なくとも５％の変化を意味する。値の減少又は増大は、少なくとも１０％の変化を意味することがより好ましく、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％がいっそうより好ましい。この後者の場合には、もはやパラメータと関連する検出可能な値がない場合であり得る。
本文書に記載されるような薬剤としての物質の使用はまた、薬剤の製造における前記物質の使用として解釈され得る。同様に、物質が、治療のために、又は薬剤として使用される時には常に、治療のための薬剤の製造のためにも使用され得る。
単語「約」又は「およそ」とは、数値に関連して使用される場合には（例えば、約１０）、値は、値の０．１％多い又は少ない所与の値（１０の）であり得ることを意味することが好ましい。
本発明の化合物又は組成物は、本発明の方法又は使用において使用するためのものであることが好ましい。
当業者には理解されるであろうが、本出願を通じて、用語「ＢＮＡ」、「ＢＮＡスキャフォールド」、「ＢＮＡヌクレオチド」、「ＢＮＡヌクレオシド」、「ＢＮＡ修飾」又は「ＢＮＡスキャフォールド修飾」は、必要に応じて、コンホメーション的に制限されたスキャフォールド修飾、ロックドスキャフォールド修飾、ロックドヌクレオチド、ロックドヌクレオシド、ロックドモノマー又はＴｍ増強性スキャフォールド修飾又は高親和性修飾などによって置き換えられ得る。
以下の実施例は、単に例示目的で提供するものであって、決して本発明の範囲を制限するよう意図されるものではない。
実施例１（ＩＮ ＶＩＴＲＯ）
材料及び方法
ＡＯＮ
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）（表１、図１〜３）は、２’−Ｏ−メチルモノマー及びＬＮＡ（配列番号４５２、４５３、４５５及び４５６）又は２’−アミノ−ＬＮＡ（配列番号４５６Ａ）又はＣＲＮ（配列番号４５３Ｃ及び４５５Ｃ）スキャフォールド修飾のいずれかを有するホスホロチオエート骨格を有していた。配列番号４５２を有するＡＯＮは、シトシンを特徴とし、その他の配列番号は、５−メチルシトシンを特徴とした。２’−アミノ−ＬＮＡは、２’−アミノ−２’−デオキシＬＮＡと名付けられることもあるスキャフォールド修飾を指す。ＡＯＮは、標準ホスホルアミダイトプロトコールによってＯＰ−１０シンセサイザー（ＧＥ／ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ）を使用して１０μｍｏｌ規模で合成した。２段階シークエンスでＡＯＮを切断し、脱保護し（ジエチルアミンと、それに続く濃ＮＨ４ＯＨ処置）、ＨＰＬＣによって精製し、水に溶解し、イオンを交換するために過剰のＮａＣｌを添加した。蒸発後、ＡＯＮを水に再溶解し、ＦＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥した。質量分析によって、すべてのＡＯＮの同一性を確認し、純度（ＵＰＬＣによって決定された）は、すべてのＡＯＮについて許容されるとわかった（＞８０％）。
ジムノシスによる（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）取り込み及びｃＤＮＡ合成
エキソン４８〜５０の欠失（Δ４８〜５０）を有するＤＭＤ患者由来の不死化筋芽細胞を、６ウェルプレート中でコンフルエンシーまで培養した。筋管の形成を誘導するために、非ＧＬＰ標準操作手順に従って、増殖培地を、８００ｎＭ又は４μＭのＡＯＮを補給した低血清分化培地によって５日間置き換えた（３連で）。次いで、全ＲＮＡを単離し、１０００ｎｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマーを使用するｃＤＮＡ合成のための投入量として使用した。
デジタルドロップレット（ｄｄ）ＰＣＲ解析
エキソン５１を有する及び有さないジストロフィン転写物産物を検出するための特異的Ｔａｑｍａｎ副溝結合剤（ＭＧＢ）アッセイが設計されており（表２）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。デジタルドロップレットＰＣＲ解析を、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って６０℃のアニーリング／伸長温度を使用して２０μｌの反応容量中で、１μｌ（スキップされていない転写物について）又は４μｌ（スキップされた転写物について）のｃＤＮＡで実施した。データは、エキソンスキップパーセンテージ［Ｎ０スキップされた／（Ｎ０スキップされた＋Ｎ０スキップされていない）＊１００］として示した。
Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙイムノアッセイ
総タンパク質を、タンパク質ローディングバッファー（プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を有する、６％ １．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２０％グリセロール、１５％ ＳＤＳ、０．００１６％ブロモフェノールブルー、５％ β−メルカプトエタノール（すべてＳｉｇｍａ））中に抽出した。Ｃｏｍｐａｔ−Ａｂｌｅタンパク質アッセイ調製試薬セット（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を測定した。健常なヒト対照細胞サンプルのために、５０、５又は０．５μｇ／ｍＬを適用し、ＤＭＤ患者細胞サンプルのために１００、５０又は１０μｇ／ｍＬを適用した。Ｓｉｍｐｌｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃａｐｉｌｌａｒｙイムノアッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）及びＷＥＳ６６〜４４０ｋＤａウサギマスターキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅカタログ番号ＰＳＭＫ２０）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ジストロフィンタンパク質レベルを定量した。ＷＥＳプレートに、ビオチン化ラダー、サンプル、一次ウサギポリクローナル抗ジストロフィン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５２７７、供給された抗体希釈剤で１：５０希釈した）、ラダー検出のためのストレプトアビジン−ＨＲＰ、二次抗ウサギ抗体、ルミノール−ペルオキシドミックス及び洗浄バッファーをロードした（すべてＷＥＳマスターキット中に供給されていた）。プレートを２５００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、対応するキャピラリーカートリッジと一緒にＷＥＳ装置中にロードした。アッセイを流した後、Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェアを使用してデータを解析した。
結果
ＡＯＮにおける少なくとも１つの５’及び／又は３’ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドの実施は、ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドを有さない同配列のＡＯＮ（配列番号４５２に基づく）と比較した場合に、エキソン５１スキッピングレベルを改善する。図１Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＭＤ患者筋肉細胞における低（８００ｎＭ）及び高（４μＭ）濃度の３種のＡＯＮ（配列番号４５３、番号４５５及び番号４５６）のこの効果を示す。この場合におけるＢＮＡスキャフォールド修飾は、ＬＮＡである。配列番号４５２に基づくＢＮＡスキャフォールド修飾を有さないＡＯＮと比較して、ＬＮＡヌクレオチドを有するＡＯＮは、４〜８倍高いエキソン５１スキッピングレベルを誘導した。これは、ジストロフィンレベルにおけるさらにより高い改善（配列番号４５６を用いた場合に最大２０倍）と関連していた（図１Ｂ）。同様の効果が、８００ｎＭ及び／又は４μＭで配列番号４５２に基づくＢＮＡスキャフォールド修飾を有さないＡＯＮと比較した場合に、５’及び／又は３’ＣＲＮスキャフォールド修飾（配列番号４５３Ｃ及び４５５Ｃ）又は２’−アミノ−ＬＮＡスキャフォールド修飾（配列番号４５６Ａ）ヌクレオチドの実施を用いて得られた（図２Ａ、Ｂ）。
実施例２（ＩＮ ＶＩＶＯ）
材料及び方法
ＡＯＮ
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）（表１、図３）は、すべての非ＢＮＡモノマー中に２’−Ｏ−メチル置換を有する全ホスホロチオエート骨格、５−メチルシトシン及びＬＮＡモノマーをもたらすＢＮＡスキャフォールド修飾を有していた（配列番号４５３、４５５及び４５６）。配列番号４５２を有する対照ＡＯＮは、２’−Ｏ−メチルモノマー、シトシンを有し、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さないホスホロチオエート骨格を有していた。ＡＯＮは、標準ホスホルアミダイトプロトコールによってＯＰ−１０シンセサイザー（ＧＥ／ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ）を使用して１ｍｍｏｌ規模で合成した。２段階シークエンスでＡＯＮを切断し、脱保護し（ジエチルアミンと、それに続く濃ＮＨ４ＯＨ処置）、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製し、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって脱塩し、凍結乾燥した。質量分析によって、すべてのＡＯＮの同一性を確認し、純度（ＵＰＬＣによって決定された）は、すべてのＡＯＮについて許容されるとわかった（＞８５％）。
マウス実験
実験動物のケア及び使用のための国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）ガイドラインに従ってこのマウス実験を実施した。ＪＡＸ Ｌａｂｓ（ＵＳＡ）によってｈＤＭＤマウスが飼育され、遺伝子型が同定された。マウスを無作為化し、ベースライン体重及び雄−雌分布を考慮して群（ｎ＝１５）にした。１００ｍｇ／ｋｇの配列番号４５２、４５３、４５５又は４５６を有する各ＡＯＮを用いて、マウスに週に１回静脈内尾静脈注射を、５〜６週齢で開始し、合計１２週間施した（配列番号４５２は、この場合には、ＢＮＡスキャフォールド修飾を全く含まない）。最後のＡＯＮ注射の４日後、動物を屠殺し、組織サンプルを採取した（組織から血液を除去するためのＰＢＳを用いる経心腔的灌流後）。筋肉組織サンプルをスナップ凍結し、−８０℃で保存した。
ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成
組織を、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＭａｇＮａ Ｌｙｓｅｒ中で粉砕することによって１ｍｌ ＲＮＡ−Ｂｅｅ（Ｂｉｏ−Ｃｏｎｎｅｃｔ）中でホモジナイズした。製造業者の使用説明書に基づいてホモジネートから全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成のために、１０００ｎｇの全ＲＮＡを投入量として使用した。ｃＤＮＡを、２０μｌの反応物中で、ランダムヘキサマープライマー及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素を使用し、インキュベーションを、５５℃で３０分の代わりに５０℃で４０分行った点を除いて製造業者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従って作製した。
デジタルドロップレットＰＣＲ解析
エキソン５１を有する及び有さないジストロフィン転写物産物を検出するための特異的Ｔａｑｍａｎ副溝結合剤（ＭＧＢ）アッセイは設計されており（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０．１ソフトウェア；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（表２）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。デジタルドロップレットＰＣＲ解析を、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って６０℃のアニーリング／伸長温度を使用して２０μｌの反応容量中で、２μｌ又は４μｌのｃＤＮＡで実施した。データは、エキソンスキップパーセンテージ［Ｎ０スキップされた／（Ｎ０スキップされた＋Ｎ０スキップされていない）＊１００］として示した。
結果
全長ヒトジストロフィンを発現するトランスジェニックｈＤＭＤマウスは、マウス実験バックグラウンドにおいてヒト特異的ＡＯＮのｉｎ ｖｉｖｏ スクリーニングを可能にする。このモデルは、ジストロフィン欠損ではなく、筋肉病理も有さないことは留意されたい。したがって、筋肉組織によるＡＯＮの取り込みは、通常、ｍｄｘマウスモデルにおけるものよりも低い。この実験では、１２週間の全身（ＩＶ）ｈＤＭＤ研究において、５’及び／又は３’ＢＮＡ−スキャフォールド修飾ヌクレオチドを有する３種のＡＯＮ（配列番号４５３、４５５及び４５６、ＬＮＡスキャフォールド修飾を使用する）を、ＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチドを有さない同配列のＡＯＮ（配列番号４５２）と比較した。図３は、すべてのＬＮＡ含有ＡＯＮについてｉｎ ｖｉｖｏエキソン５１スキッピングレベルの改善を示し、配列番号４５５のＡＯＮを用いた場合に、配列番号４５２のＡＯＮと比較した場合に最大８倍であった。
実施例３（ＩＮ ＶＩＴＲＯ）
ＡＯＮ
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）（表３、図４）は、すべての非ＢＮＡモノマー中に２’−Ｏ−メチル置換を有する全ホスホロチオエート骨格、５−メチルシトシン及びＬＮＡモノマーをもたらす少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾を含んでいた（配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８）。配列番号４５２を有する対照ＡＯＮは、２’−Ｏ−メチルモノマーを有するホスホロチオエート骨格、シトシンを含んでおり、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含んでいなかった。ＡＯＮは、標準ホスホルアミダイトプロトコールによってＯＰ−１０シンセサイザー（ＧＥ／ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ）を使用して５μｍｏｌ規模で合成した。２段階シークエンスでＡＯＮを切断し、脱保護し（ＤＥＡと、それに続く濃ＮＨ４ＯＨ処置）、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製し、サイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、凍結乾燥した。質量分析によって、すべてのＡＯＮの同一性を確認し、純度（ＵＰＬＣによって決定された）は、すべてのＡＯＮについて許容されるとわかった（＞８０％）。
ジムノシスによる取り込み及びｃＤＮＡ合成
エキソン４８〜５０の欠失（Δ４８〜５０）を有するＤＭＤ患者由来の不死化筋芽細胞を、６ウェルプレート中でコンフルエンシーまで培養した。筋管の形成を誘導するために、非ＧＬＰ標準操作手順に従って、増殖培地を、８００ｎＭのＡＯＮを補給した低血清分化培地によって７日間置き換えた（３連で）。次いで、全ＲＮＡを単離し、１０００ｎｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマーを使用するｃＤＮＡ合成のための投入量として使用した。
デジタルドロップレット（ｄｄ）ＰＣＲ解析
エキソン５１を有する及び有さないジストロフィン転写物産物を検出するための特異的Ｔａｑｍａｎ副溝結合剤（ＭＧＢ）アッセイが設計されており（表２）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。デジタルドロップレットＰＣＲ解析を、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って６０℃のアニーリング／伸長温度を使用して２０μｌの反応容量中で、１μｌ（エキソンスキップのない転写物について）又は４μｌ（エキソンスキップのある転写物について）のｃＤＮＡで実施した。データは、エキソンスキップパーセンテージ［Ｎ０スキップされた／（Ｎ０スキップされた＋Ｎ０スキップされていない）＊１００］として示した。
結果
ＡＯＮにおける少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾ヌクレオチド（ＬＮＡモノマーをもたらす）の実施は、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さない同配列のＡＯＮ（配列番号４５２に基づく）と比較した場合に、エキソン５１スキッピングレベルを改善する。図４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＭＤ患者筋肉細胞における８００ｎＭ濃度の１０種のＡＯＮ（配列番号４５５、４５９、４５２８、４５３１、４５３２、４５３３、４５３５、４５４２、４５４８及び４５６８）のこの効果を示す。ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さないＡＯＮ（配列番号４５２）と比較して、ＬＮＡヌクレオチドを有するＡＯＮは、１０〜４０倍高いエキソン５１スキッピングレベルを誘導した。
実施例４（ＩＮ ＶＩＴＲＯ）
材料及び方法
ＡＯＮ
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）（表４、図５）は、２’−Ｏ−メチル置換を有する全ホスホロチオエート骨格、５−メチルシトシン及びＬＮＡモノマーをもたらす少なくとも１つのＢＮＡスキャフォールド修飾を含んでいた（配列番号２９、３１８５及び８６３）。対照ＡＯＮは、２’−Ｏ−メチル置換モノマーのみを有する全ホスホロチオエート骨格、５−メチルシトシンを含んでいたが、ＢＮＡスキャフォールド修飾は含んでいなかった（配列番号２６、６０４９及び８６０；配列番号６０４９については、これらの修飾は、配列番号６０７１と同一にする）。ＡＯＮは、標準ホスホルアミダイトプロトコールによってＯＰ−１０シンセサイザー（ＧＥ／ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ）を使用して５μｍｏｌ規模で合成した。２段階シークエンスでＡＯＮを切断し、脱保護し（ＤＥＡと、それに続く濃ＮＨ４ＯＨ処置）、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製し、サイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、凍結乾燥した。質量分析によって、すべてのＡＯＮの同一性を確認し、純度（ＵＰＬＣによって決定された）は、すべてのＡＯＮについて許容されるとわかった（＞８０％）。
ジムノシスによる取り込み及びｃＤＮＡ合成
健常ドナー由来の不死化筋芽細胞を、１２ウェルプレート中でコンフルエンシーまで培養した。筋管の形成を誘導するために、非ＧＬＰ標準操作手順に従って、増殖培地を、８００ｎＭ又は４μＭのＡＯＮを補給した低血清分化培地によって７日間置き換えた（ｎ＝６）。次いで、全ＲＮＡを単離し、１０００ｎｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマーを使用するｃＤＮＡ合成のための投入量として使用した。
デジタルドロップレット（ｄｄ）ＰＣＲ解析
エキソン４４、４５又は５３を有する及び有さないジストロフィン転写物産物を検出するための特異的Ｔａｑｍａｎ副溝結合剤（ＭＧＢ）アッセイが設計されており（表５）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。デジタルドロップレットＰＣＲ解析を、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って６０℃のアニーリング／伸長温度を使用して２０μｌの反応容量中で、１μｌ（エキソンスキップのない転写物について）又は４μｌ（エキソンスキップのある転写物について）のｃＤＮＡで実施した。データは、エキソンスキップパーセンテージ［Ｎ０スキップされた／（Ｎ０スキップされた＋Ｎ０スキップされていない）＊１００］として示した。
結果
ＤＭＤエキソン４４、エキソン４５又はエキソン５３を標的化するＡＯＮの５’及び３’末端両方でのＬＮＡモノマーをもたらすＢＮＡスキャフォールド修飾の実施は、ＢＮＡスキャフォールド修飾を有さない同配列のＡＯＮと比較した場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで健常ヒト対照筋管においてエキソンスキッピングレベルを２〜３倍改善した。図５は、低（８００ｎＭ）及び高（４μＭ）濃度の３種のＡＯＮ（配列番号２９（エキソン４４を標的化する）、配列番号３１８５（エキソン４５を標的化する）及び配列番号８６３（エキソン５３を標的化する）のこの効果を示す。健常ヒト筋管におけるエキソンスキップレベルは、通常、ＤＭＤ患者筋肉細胞において得られるもの（実施例１において使用されたような）よりも低いことは留意されたい。これは、健常筋肉細胞におけるＡＯＮ誘導性エキソンスキッピングに起因するアウトオブフレーム転写物のナンセンス媒介性崩壊によって説明される。
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Claims (15)

  1. １０〜３３ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドであって、
    ｉ）ホスホロチオエート骨格連結によって、及び／又はホスホジエステル連結によって連結された２’−置換モノマーのみ、
    ｉｉ）５−メチルシトシン塩基、及び
    ｉｉｉ）二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含む少なくとも１つのモノマー
    を含み、
    前記オリゴヌクレオチドが、ジストロフィンプレｍＲＮＡエキソン２〜７８の少なくとも一部と、相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
  2. 配列番号６０６５〜６０７０から選択されるヌクレオチド配列のうち少なくとも１つ、好ましくは配列番号６０６７のヌクレオチド配列の、少なくとも１０最大３３のヌクレオチドの連続ストレッチを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾、好ましくは架橋核酸スキャフォールド修飾を含む、１、２、３又は４つのモノマーを含む、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 少なくとも１つの二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾が、前記オリゴヌクレオチドの末端モノマー中に、好ましくは前記オリゴヌクレオチドの５’末端モノマー中に、より好ましくは前記オリゴヌクレオチドの両方の末端モノマー中に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾の各出現が、
    ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマー、コンホメーション的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）モノマー、キシロ−ＬＮＡモノマー、α−Ｌ−ＬＮＡモノマー、β−Ｄ−ＬＮＡモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、２’−（アルキルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−（アシルアミノ）−ＬＮＡモノマー、２’−Ｎ−置換−２’−アミノ−ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたエチル（ｃＥｔ）ＬＮＡモノマー、（２’−Ｏ，４’−Ｃ）制約されたメトキシエチル（ｃＭＯＥ）ＢＮＡモノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｈ）モノマー、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（Ｎ−Ｍｅ）モノマー、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）モノマー、２’−Ｃ−架橋二環式ヌクレオチド（ＣＢＢＮ）モノマー及びそれらの誘導体からなる群から独立に選択されるモノマーをもたらし、
    好ましくは、ＬＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ｃＥｔ ＢＮＡモノマー、オキソ−ＣＢＢＮモノマー、２’−アミノ−ＬＮＡモノマー及びｃＭＯＥ ＢＮＡモノマーからなる群から選択されるモノマーをもたらし、
    より好ましくは、ＬＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ｃＥｔ ＢＮＡモノマー又はｃＭＯＥ ＢＮＡモノマーからなる群から選択されるモノマーをもたらし、
    最も好ましくは、ＢＮＡスキャフォールド修飾が、ＬＮＡモノマーをもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 前記２’−置換モノマーが、２’−置換ＲＮＡモノマー、２’−Ｆモノマー、２’−アミノモノマー、２’−Ｏ−置換モノマー、２’−Ｏ−メチルモノマー又は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）モノマー、好ましくは、２’−Ｏ−メチルモノマーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. すべてのシトシン塩基が５−メチルシトシン塩基であり、及び／又はすべてのウラシル塩基が５−メチルウラシル塩基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記オリゴヌクレオチドの長さが、３４ヌクレオチド未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. エキソン認識配列（ＥＲＳ）、エキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）、ＳＲタンパク質結合部位、又は別のスプライシングエレメント、シグナル若しくは構造の少なくとも一部と、相補的である、又はそれと結合する、又はそれを標的化する、又はそれとハイブリダイズする配列を含む又はからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 前記オリゴヌクレオチドが、プレｍＲＮＡスプライシング調節を誘導し、好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節が、タンパク質の産生又は組成を変更し、好ましくは、前記プレｍＲＮＡスプライシング調節がエキソンスキッピング又はエキソン包含を含み、最も好ましくは、前記ＲＮＡ調節が、エキソンスキッピングを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 二環式核酸（ＢＮＡ）スキャフォールド修飾を含まない対応するオリゴヌクレオチドと比較して改善されたパラメータを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. ａ）少なくとも１つのモノマーが、式Ｉ

    ［式中、
    Ｂは、核酸塩基であり、
    Ｘは、Ｆ、−ＮＲ１Ｒ２又は−ＯＲであり、
    Ｒは、アルケニル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ、ＯＲ１、ＮＲ１Ｒ２又はＳＲ１であり、
    Ｒ１は、ハロ、ヒドロキシ又はアルキルで各々独立に任意選択でさらに置換された、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリールであり、
    Ｒ２は、Ｈ又はアルキルであり、

    は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
    を有し、
    ｂ）少なくとも１つのモノマーが、ＢＮＡスキャフォールド修飾を含み、式ＩＩ

    ［式中、
    Ｂ１は、核酸塩基であり、
    Ｚ−Ｙは、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ−、−ＣＨ２ＷＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｎＮＲ３−、−ＣＨ２Ｓ（Ｏｍ）−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ３）Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＣＨ＝ＣＨＯ−、−ＣＨ２ＳＯ２ＮＲ３−及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−から選択される二価の基であり、
    ｎは、１又は２であり、
    ｍは、０、１又は２であり、
    Ｗは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ３であり、
    Ｒ３は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ５Ｒ５、ベンジル又は任意選択で置換されたアルキルであり、任意選択の置換基は、存在する場合、ハロ及びアルコキシから選択され、
    Ｒ４は、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
    Ｒ５は、Ｈ又はアルキルであり、

    は、オリゴヌクレオチドの残部との結合点を示す］
    を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、好ましくは、組織及び／若しくは細胞への、並びに／又は組織及び／若しくは細胞中への、前記組成物及び／又は前記オリゴヌクレオチドの標的化及び／又は送達の増強にさらに役立ち得る少なくとも１種の賦形剤を含む、組成物。
  14. 薬剤として使用するための、好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する、予防する及び／又は遅延させるための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１３に記載の組成物。
  15. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を予防する、治療する及び／又は遅延させるための方法であって、対象に、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１３に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
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