KR102213041B1 - 광반응성 핵산 합성을 위한 신규 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이를 이용하여 근적외선 영역에서도 감응하여 세포손상 적게 핵산 합성, 합성 및 분리하고, 추가적인 공정이 필요하지 않아 경제적인 효과를 제공하는 것에 관한 것이다
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은
,
또는
Y는
,
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
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n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
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Y는
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
Description
본 발명은 광반응성 핵산 합성을 위한 신규 화합물 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 광반응성이 우수한 쿠마린을 기반으로 상기 쿠마린 상에 고분자 합성 및 다른 분자와의 접합이 가능한 그룹을 포함하는 광반응성 핵산 합성용 화합물에 관한 것이다.
특정 핵산 서열의 검출의 관심이 급속히 증대하고 있다. 이 관심은 최근 개시된 인간게놈의 뉴클레오티드 서열안 및 그 중 및 많은 다른 생물, 다량의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP) 게놈의 존재뿐만 아니라 AFLP 등 마커 기술 및 예를 들면 유전학적 유전성 질환의 지표로서의 특정 핵산 서열의 검출 타당성 일반적 인식에서도 발생하고 있다.
유전자의 단일 뉴클레오티드(및 작은 삽입/결실 등 다른 종류의 유전자 다형)가 다양한 정보를 제공한다고 하는 인식은 이 관심의 증대로 인하다고도 생각되었다. 현재, 이들의 단일 뉴클레오티드 치환이 예를 들면 사람의 다수의 단인자 및 다인자 유전성 질환의 주된 원인의 하나이며 또는 식물 및 가축종의 성능 형질 등 복잡한 표현형 발현에 관여하고 있는 것이 일반적으로 인식되어 있다. 따라서, 단일 뉴클레오티드는 많은 경우에 사람, 식물 및 동물종에 있어서의 중요한 형질에도 관련되어, 또는 적어도 이것을 나타낸다.
이들의 단일 뉴클레오티드 치환 및 분석은 결과적으로 가능한 한 넓은 점에서 의학 및 농업으로 광범위하게 미치는 의의를 가지는 대량의 정보를 가져온다. 예를 들면 이들의 발전이 결과적으로 환자 특이적 의약품을 가져오는 것이 일반적으로 상정되어 있다. 이들의 유전자 다형을 분석하기 위해, 얻어진 데이터의 품질을 크게 훼손하지 않고 다수의 샘플 및 다수의(주로) SNP 높은 처리량 방법에서의 처리를 가능하게 하는 충분히 확실하고 또한 신속한 방법의 필요성이 증대되어 있다. 기존의 배열 핵산 분석에 사용되는 주된 방법의 하나는 2개의 프로브를 표적 배열과 어닐링하고 프로브가 표적 배열과 인접해 혼성화되면, 프로브를 라이게이트하는 스텝에 기초한다. 이 컨셉은 올리고뉴클레오티드 결찰(Ligation) 어세이 또는 올리고뉴클레오티드 결찰(Ligation) 증폭(OLA)으로서 일반적으로 나타나고 있다.
이러한 핵산 분석을 위해 광반응성 화합물을 사용하는 방법이 제안되고 있다. 광반응성 핵산은 빛에 의해 끊어지는 화학 결합을 핵산에 도입한 것으로 단일 세포에서의 핵산 서열 분석, 핵산 위치 분석 등에 이용될 수 있다. 그러나 기존의 광반응성 핵산에 사용된 오르토-니트로벤질 화합물은 UV 파장의 빛에만 감응하여 침투 깊이가 얕고 세포에 손상을 줄 수 있고, 핵산 위치 분석에 사용될 경우 UV 파장의 특성 상 초점 부피가 커 좁은 영역에서의 관찰이 어려운 문제점이 있다.
또한, 종래는 광반응성 핵산을 고분자 합성 혹은 다른 분자와의 접합이 가능한 형태로 만들기 위해서는 이러한 합성 및 접합에 필요한 반응기를 광반응성 핵산을 합성한 후 별도의 과정을 거쳐 도입해야 했다.
핵산 분석에서뿐만 아니라 핵산 기반 약물을 특정 분자에 접합시켰다가 원하는 시간 및 장소에서 빛을 조사하여 분해하여 효과를 나타내고자 할 때, 기존의 광반응성 핵산을 사용할 시에는 오르토-니트로벤질 화합물의 문제점 및 합성의 복잡성 등 동일한 문제가 존재하였다.
이런 배경 하에서, 본 발명자들은 종래의 문제를 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 근적외선 영역의 빛에도 감응하는 쿠마린 유도체를 이용하였고, 이러한 광반응성 작용기에 고분자 합성 및 다른 분자와의 접합이 가능한 작용기를 도입하면 추가적인 단계 없이 고분자 합성 및 다른 분자와의 접합이 가능한 핵산을 제공할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 핵산 합성에 사용할 수 있으면서 고분자 합성 및 다른 분자와의 접합이 가능한 신규한 쿠마린 화합물을 포함하여 종래의 문제점이 개선되는 것을 확임함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은
,
또는
Y는 
, 
, 
, 
,
상기 Y의 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
본 발명의 다른 목적은 화학식 1의 화합물을 포함하는 광반응성 핵산 합성용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 1로 표기되는 화합물과 제1핵산을 반응시켜 화학식1의 포스포르아미다이트 모이어티에 제1핵산이 결합된 제1복합체를 제조하는 제1단계 및 상기 제1복합체를 제2핵산과 접촉시켜 상보적인 서열의 핵산 이중가닥을 형성하는 제2복합체를 제조하는 제2단계를 포함하는 것인, 핵산 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은
,
또는
Y는 
,
상기 Y의 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 광반응성 핵산 합성용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은
,
또는
Y는 
,
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 하기 화학식 1로 표기되는 화합물과 제1핵산을 반응시켜 화학식1의 포스포르아미다이트 모이어티에 제1핵산이 결합된 제1복합체를 제조하는 제1단계 및 상기 제1복합체를 제2핵산과 접촉시켜 상보적인 서열의 핵산 이중가닥을 형성하는 제2복합체를 제조하는 제2단계를 포함하는 것인, 핵산 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은
,
또는
Y는 
,
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
구체적으로, 상기 화합물은 핵산 합성, 핵산 분리 및 복합체 형성 용도로 사용되는 것일 수 있고, 기존의 광반응성 핵산에 사용되어온 오르토-니트로벤질 화합물은 UV 파장의 빛에만 감응하여 침투 깊이가 얕고 세포에 손상을 줄 수 있었던 문제점을 해결하고, 본 발명의 화합물이 핵산 위치 분석에 사용될 경우 UV 파장의 특성 상 초점 부피가 커 좁은 영역에서의 관찰이 어려웠던 문제점을 해결하고, UV 뿐만 아니라 근적외선 영역의 빛에도 감응하는 쿠마린 유도체를 포함한 화합물을 이용하므로 침투 깊이가 깊고 세포 손상이 적게하는 효과를 제공 및 광반응성 핵산을 고분자 중합 혹은 다른 분자와의 접합이 가능한 형태로 만들기 위해 필요했던 광반응성 핵산 합성 후의 별도의 공정이 필요하지 않으므로 경제적인 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 용어, "핵산 합성(Solid-phase oligonucleotide synthesis)"은 뉴클레오티드 즉, 핵산의 구성 단위. 뉴클레오시드 당부분의 인산에스테르가 각각 상보적인 서열 상호작용에 의해 합성되는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "복합체 형성"은 본 발명의 제1핵산과 제2핵산이 상보적인 서열 작용에 의해 핵산 이중가닥을 형성하는 것을 의미할 수 있고, 상기 제2핵산은 제1핵산의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 핵산 또는 A, G, C 및 T 핵산 단량체의 혼합물인 것일 수 있고, 상기 제2핵산은 제1핵산과 상보적인 서열 또는 그와 유사한 서열을 포함하여 핵산 사이의 상호 작용에 따라 제2복합체를 의미할 수 있다.
본 발명의 용어, "핵산 분리"는 핵산과 다른 화합물이 결합되어 있는 복합체로부터 핵산과 다른 화합물이 분리되는 것을 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 제3복합체에 광을 조사하면 화학식 1로 표기되는 화합물 및 조성물과 분리되어 핵산만을 얻을 수 있는 것을 말할 수 있다.
상기 화합물은 하기 화학식 2, 화학식 3, 또는 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 2 내지 화학식 4 에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
본 발명의 용어, "쿠마린"은 헤테로고리계열에 속하는 유기화합물로서 외관상 무색 결정인데, 통카콩(tonka bean)의 방향성분으로 알려져 있어 향료로 사용되고, 벤조-α-피론이라고도 하며, o-옥시신남산의 락톤에 해당한다. 화학식 C9H6O2. 통카콩의 방향 성분으로 미량이지만 각종 식물, 특히 열매에 함유되어 있다. 무색의 결정이며, 분자량 146.15, 녹는점 71℃, 끓는점 301.7℃, 비중 0.935이다. 찬물에는 녹기 어렵지만 뜨거운 물에는 녹는다. 살리실알데하이드와 아세트산무수물을 아세트산칼륨의 무수물 존재하에서 축합하면 얻고, 향료로 사용되며 치환체에도 향료가 되는 것이 많은 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 쿠마린은 7-하이드록시-4-메틸쿠마린을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 화합물은 7-하이드록시-4-메틸쿠마린을 모핵에 포함하는 화합물일 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물은 쿠마린을 포함하고 쿠마린은 광반응성이 우수하여 높은 효율로 이광자 현상 즉, 낮은 에너지의 근적외선으로 흡수하여 활성화가 가능할 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물에 포함된 비닐기가 고분자 네트워크겔에 포함된 고분자와 결합될 수 있고, 고분자에 고정된 제3복합체는 광을 조사하기 용이하게 고정될 수 있다.
상기 쿠마린은 광분해성인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "광분해"는 광에 반응하여 빛을 흡수함으로써 일어나는 분리로 빛을 흡수한 물질이 분리하는 직접광분해와 빛을 흡수하여 생긴 여기광 증감제로부터의 에너지 이동이나 화학반응에 의해 반응물질이 분리하는 광증감분리가 있고, 한 분자가 빛을 흡수하여 두 가지 이상의 성분으로 분리되는 것을 의미한다.
본 발명의 화합물은 광반응성 물질로 쿠마린 연결체를 포함하여 쿠마린은 빛 에너지를 화학에너지로 전환시키며, 광화학 작용에 의해 광반응으로 더 적은 분자량을 가지는 물질로 변환되는 광분해 될 수 있다.
구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 화합물이 광반응 하여 핵산을 제3복합체로부터 분리되어 핵산만을 얻는 것을 확인하였다.
상기 조성물은 화학식 1의 화합물에 포함된 비닐기를 통해 고분자 네트워크겔과 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "비닐기(vinyl group)"는 CH2=CH-로 표시되는 작용기로 염화비닐 등의 고분자화합물을 만드는 데 사용되며, 이중결합을 가지기 때문에 이 기를 가진 화합물은 반응성이 풍부하며 합성하여 고분자화합물을 잘 만드는 것을 의미한다.
본 발명의 화합물은 비닐기를 포함하여 고분자 네트워크로겔과 중합 시 공중합될 수 있다. 본 발명의 화합물이 고정되는 고분자 네트워크겔은 핵산을 합성 및 분리할 수 있게 하는 매개체가 될 수 있다. 본 발명의 화합물은 비닐기를 포함하여 고분자 네트워크에 고정 또는 비닐기와의 반응으로 화학 결합을 형성할 수 있는 물질과 접합될 수 있다.
상기 고분자 네트워크기겔은 비닐기와 반응 가능한 물질 일 수 있다.
상기 조성물은 화학식 1의 화합물에 포함된 포스포르아미다이트 모이어티를 통해 핵산과 합성하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "포스포르아미다이트 모이어티(phosphoramidite moiety)"는 본 발명의 화학식 1에서 비닐기를 제외한 Y부분을 나타내며, [화학식 1-1]
로 나타낼 수 있다. 이 부분은 핵산과 결합하는 부분을 의미한다.
또한, 비닐기를 제외한 Y는 [화학식1-1]뿐만 아니라, [화학식 1-2] 
, [화학식 1-3] 
또는 [화학식 1-4] 
를 포함할 수 있다.
화학식 1의 화합물은 양끝에 비닐기 및 포함된 포스포르아미다이트 모이어티를 포함하여 비닐기에서는 고분자 네트워크겔과 결합 될 수 있고, 포스포르아미다이트 모이어티 부분에서는 제1핵산과 결합하고 제1핵산과 제2핵산이 상보적인 서열의 핵산 이중가닥을 형성하여 제2복합체를 형성할 수 있고, 본 발명의 제3복합체로 표기되는 고분자 네트워크겔-화합물-핵산의 형태로 복합체를 형성할 수 있다.
상기 조성물은 적외선 조사시 화학식 1의 화합물에 포함된 쿠마린에 의해 이광자 흡수를 통해 합성된 핵산을 분리하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물은 쿠마린을 포함하여 적외선에 광반응 할 수 있고, 본 발명의 조성물과 결합된 핵산은 적외선 파장의 광에 반응하여 분리될 수 있다.
하기 화학식 1로 표기되는 화합물과 제1핵산을 반응시켜 화학식1의 포스포르아미다이트 모이어티에 제1핵산이 결합된 제1복합체를 제조하는 제1단계 및 상기 제1복합체를 제2핵산과 접촉시켜 상보적인 서열의 핵산 이중가닥을 형성하는 제2복합체를 제조하는 제2단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2핵산은 제1핵산의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 핵산 또는 A, G, C 및 T 핵산 단량체의 혼합물인 것일 수 있다.
또한, 상기 제2단계 이전 또는 이후에 화학식1의 비닐기에 고분자 네트워크겔을 결합시켜 제3복합체를 형성하는 제3단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 제3 단계 이후 상기 상기 화합물에 광을 조사하여 핵산을 분리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1복합체는 화학식 1-제1핵산으로 표기될 수 있고 상기 제2복합체는 화학식 1-제2핵산-제2핵산 형태로 형성할 수 있고, 제3복합체는 고분자 네트워크겔-화학식1-제1핵산-제2핵산형태로형성될 수 있다 광을 조사하여 화학식1에 포함된 쿠마린이 광반응하여 고분자 네트워크겔-화학식 1의 형태 및 제1핵산-제2핵산 형태로 분리될 수 있어 핵산을 수득할 수 있다.
상기 광은 자외선, 가시광선 또는 적외선인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "자외선(UV)"은 자외선은 파장 범위 10~400 nm(에너지 범위 3 eV ~ 124 eV)인 빛으로서, 파장이 가시광보다 더 짧고 엑스선보다는 더 긴 전자기파이며, 유리는 거의 투과할 수 없고, 공기도 잘 통과하지 못한다. 진동수가 큰 고에너지파로 생명체의 분자들을 부분적으로 파괴하거나 분리할 정도로 화학 작용을 강하게 일으키는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "가시광선"은 눈으로 지각되는 파장 범위를 가진 빛. 물리적인 빛은 눈에 색채로서 지각되는 범위의 파장 한계 내에 있는 스펙트럼이며, 대략 380~780nm(nanometer) 범위의 파장을 가진 전자파를 의미한다.
본 발명의 용어, "적외선"은 가시광선(可視光線)보다 파장이 길며, 0.75μm에서 1mm 범위에 속하는 전자기파. 햇빛이나 백열된 물체로부터 방출되는 빛을 스펙트럼으로 분산시켜 보면 적색스펙트럼의 끝보다 더 바깥쪽에 있으므로 적외선이라 한다. 파장 0.75 ∼3μm의 적외선을 근적외선, 3~25μm의 것을 단순히 적외선이라 하며, 25μm 이상의 것을 원적외선이라 한다. 가시광선이나 자외선에 비해 강한 열작용을 가지고 있는 것이 특징이며, 이 때문에 열선(熱線)이라고도 하는 것을 의미한다.
본 발명의 화합물은 UV 뿐만 아니라 근적외선 영역에서도 감응하는 쿠마린을 포함하여 자외선(UV)에 만 반응하여 침투 깊이가 얕고 세포에 손상을 주는 문제점 및 핵산 위치 분석에 사용시 상 초첨 부피가 커 좁은 영역에 관찰이 어려웠던 문제점을 해결할 수 있다.
구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 화합물을 이용하여 UV뿐만아니라 근적외선에서 반응하므로 UV에만 반응하여 침투 깊이가 얕고 세포에 손상을 줄 수 있었던 문제점 및 부피가 커 좁은 영역에서의 관찰이 어려웠던 종래 문제점을 해결하고, 또한, 광반응성 핵산을 고분자 중합 혹은 다른 분자와의 접합이 가능한 형태로 만들기 위해 필요했던 광반응성 핵산 합성 후의 별도의 공정이 필요하지 않으므로 경제적인 효과를 확인하였다.
본 발명의 화합물은 기존의 광반응성 핵산에 사용되어온 오르토-니트로벤질 화합물은 UV 파장의 빛에만 감응하여 침투 깊이가 얕고 세포에 손상을 줄 수 있었던 문제점을 해결하고, 본 발명의 화합물이 핵산 위치 분석에 사용될 경우 UV 파장의 특성 상 초점 부피가 커 좁은 영역에서의 관찰이 어려웠던 문제점을 해결한다.
또한, 본 발명에서는 근적외선 영역의 빛에도 감응하는 쿠마린 유도체를 포함한 화합물을 이용하므로 침투 깊이가 깊고 세포 손상이 적게하는 효과를 제공한다. 또한, 광반응성 핵산을 고분자 중합 혹은 다른 분자와의 접합이 가능한 형태로 만들기 위해 필요했던 광반응성 핵산 합성 후의 별도의 공정이 필요하지 않으므로 경제적인 효과를 제공한다.
도 1은 화학식 2의 NMR분석을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 화학식 2의 화합물이 연결된 복합체의 MS분석을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 화학식 2의 화합물이 연결된 복합체에 광을 조사하여 광분해한 이후 MS분석을 나타낸 그래프이다.
도 4의 A는 화학식1의 각 작용기의 기능을 나타낸 구조식이고, B는 B는 근적외선 영역의 빛에 의한 본 발명의 화합물과 연결된 핵산의 광분해 실험 과정을 나타내는 모식도이고, C는 광분해와 형광 소광 직후의 공초점 현미경 이미지 및 D는 광분해와 형광 소광 후 새로운 형광 프로브로 핵산이 존재하는 하이드로젤을 염색한 후의 공초점 현미경 이미지이다.
도 2는 본 발명의 화학식 2의 화합물이 연결된 복합체의 MS분석을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 화학식 2의 화합물이 연결된 복합체에 광을 조사하여 광분해한 이후 MS분석을 나타낸 그래프이다.
도 4의 A는 화학식1의 각 작용기의 기능을 나타낸 구조식이고, B는 B는 근적외선 영역의 빛에 의한 본 발명의 화합물과 연결된 핵산의 광분해 실험 과정을 나타내는 모식도이고, C는 광분해와 형광 소광 직후의 공초점 현미경 이미지 및 D는 광분해와 형광 소광 후 새로운 형광 프로브로 핵산이 존재하는 하이드로젤을 염색한 후의 공초점 현미경 이미지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 쿠마린을 포함한 광반응성 화합물의 제조
[반응식 1]
쿠마린을 포함한 광반응성 화합물의(화학식 2)의 제조는 하기 반응식 1에 따라 제조하였다.
a단계: 먼저, 화합물 2를 제조(반응식 1의 2로 표기되는 화합물 2)하였다. 7-하이드록시-4-메틸쿠마린 (0.30 g, 1.70 mmol) 을 아세톤 (18 mL)에 용해시키고 K2CO3 (0.259 g, 1.87 mmol)와 크라운에테르 (0.450 g, 1.70 mmol)를 가하였다. 리플럭스 장치에서 1시간 동안 교반한 후 2-터트부틸록시카보닐 아미노에틸브로마이드 (0.42 g, 1.87 mmol)를 가하였다. 리플럭스 장치에서 18시간 동안 교반한 후 여과한 뒤 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜 흰색 고체의 화합물 2를 수득하였다. (0.483 g, 88% 수율)
b단계: 그 다음으로, 화합물 3을 제조(반응식 1의 3으로 표기되는 화합물 3을 제조하는 b반응)하였다.
상기 화합물 2 (0.30 g, 0.94 mmol)를 디메틸포름아미드 (1 mL)에 용해시키고 교반시키면서 디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(0.25 mL, 1.8 mmol)을 가하였다. 리플럭스 장치에서 14시간 동안 교반한 후 상온으로 냉각시켰다. 그런 다음 포화 NaHCO3 용액을 가하고 CH2Cl2로 추출하였다. 얻어진 유기층은 무수 MgSO4로 건조시키고 여과한 뒤 감압 하에 농축시켜 crude 화합물 3을 수득하였다. 별도의 정제과정 없이 다음 반응에 사용하였다.
c단계: 화합물 4를 제조(반응식 1의 4로 표기되는 화합물 4를 제조하는 c반응)하였다.
상기 crude 화합물 3을 물 (4 mL)과 THF (4 mL)에 용해시키고 NaIO4 (0.60 g, 2.8 mmol)을 가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후 여과한 뒤 감압하여 농축하였다. 그런 다음 포화 NaHCO3 용액을 가하고 CH2Cl2로 추출하였다. 얻어진 유기층은 무수 MgSO4로 건조시키고 여과한 뒤 감압 하에 농축시켜 crude 화합물 4를 수득하였다. 별도의 정제과정 없이 다음 반응에 사용하였다.
d단계: 화합물 5를 제조(반응식 1의 5로 표기되는 화합물 5를 제조하는 d반응)하였다.
상기 crude 화합물 4를 무수 THF (9 mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 뒤 NaBH4 (0.071 g, 1.9 mmol)을 가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후 포화 NaHCO3 용액을 가하고 CH2Cl2로 추출하였다. 얻어진 유기층은 무수 MgSO4로 건조시키고 여과한 뒤 감압 하에 농축시켜 crude 화합물 4를 수득하였다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜 연한 노란색 고체의 화합물 5를 수득하였다. (0.14 g, 46% 수율)
e단계: 화합물 6을 제조(반응식 1의 6으로 표기되는 화합물 6을 제조하는 e반응)하였다.
상기 화합물 5(0.10 g, 0.30 mmol)를 디클로로메테인 (10 mL)에 용해시킨 뒤 트리플루오로아세트산 (1.6 mL, 21 mmol)을 천천히 가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 뒤 TFA를 증발시키고 디에틸에테르를 가해 침전시켰다. 감압 하에 농축시켜 화합물 6을 수득하였다. (0.098 g, 94% 수율)
f단계: 화합물 7의 제조(반응식 1의 7로 표기되는 화합물 7을 제조하는 f반응)
상기 화합물 6(0.44 g, 1.3 mmol)을 무수 아세토니트릴 (6.6 mL)에 용해시킨 뒤 트리에틸아민 (0.22 mL, 1.6 mmol)과 숙신이미딜 메타크릴레이트 (0.27 g, 1.5 mmol)를 가하였다. 0℃로 냉각시킨 뒤 상온에서 16시간 동안 교반하였다. 그런 다음 0.01 M HCl을 가하고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층은 포화 NaHCO3 용액으로 씻은 후 무수 MgSO4로 건조시키고 여과한 뒤 감압 하에 농축시켰다. 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜 연한 노란색 고체의 화합물 7을 수득하였다. (0.23 g, 59% 수율)
g단계: 화학식 2을 제조(반응식 1의 8로 표기되는 화학식 2을 제조하는 g반응)하였다.
상기 화합물 7(0.2 g, 0.66 mmol)을 무수 아세토니트릴 (3.5 mL)에 용해시킨 뒤 1H-트리아졸 (1.5 mL, 0.72 mmol)과 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포르디아미디트 (0.42 mL, 1.3 mmol)를 천천히 가하였다. 상온에서 16시간 동안 교반한 후 여과한 뒤 감압하여 농축하였다. 그런 다음 에틸아세테이트를 가하고 포화 NaHCO3 용액으로 씻어주었다. 포화 NaHCO3 용액은 다시 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층은 포화 염화나트륨 용액으로 씻은 뒤 무수 MgSO4로 건조하여 여과한 뒤 감압 하에 농축시켰다. 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜 흰색 고체의 쿠마린을 포함한 광반응성 화합물(화학식 2)을 수득하였다. (0.19 g, 57% 수율)
실시예 2: 핵산 합성 및 분리방법
상기 실시예 1로 제조된 화학식 2에 제1핵산을 반응시켜 화학식1의 포스포르아미다이트 모이어티에 제1핵산이 결합된 제1복합체를 제조하였고, 제1복합체에 생체시료에 포함된 제2핵산을 접촉시켜 상보적인 서열의 핵산 이중가닥을 형성하는 제2복합체를 제조하여 핵산을 합성하였고, 화학식2의 비닐기에 고분자 네트워크겔을 결합시켜 제3복합체를 형성하였다.
제3복합체에 근적외선 780nm파장의 이광자레이저를 25%출력으로 조사하여 화학식 2의 쿠마린으로부터 광반응을 통해 핵산이 분리되어 핵산을 얻을 수 있다.
실험예 1: NMR 분석 실험
상기 실시예 1로 제조된 화학식 2를 분석하기위해 NMR분석 실험을 하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, NMR분석 결과 화학식 2와 의 n 및 m이 정수 1인 것을 확일 할 수 있었고, R1은 메틸 R2a 및 R2b는 이소프로필인 것을 확인할 수 있었다. 또한, 화학식 2의 말미에는 비닐기를 포함하여 고분자와 결합되는 작용기를 확인하였고, 쿠마린을 포함하여 광반응 할 수 있는 작용기를 확인하고, 포스포르아미다이트 모이어티를 포함하여 핵산과 결합되는 부분을 확인할 수 있었다.
실험예 2: MS 분석 실험
상기 실시예 2에서 제조한 복합체를 자외선을 조사하기 전 및 조사한 후에 MALDI-TOF를 이용하여 질량을 분석하였다.
| Sequence | Mass calculated (Da) | Mass found (Da) |
| 5'-/Coumarin/TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' | 6387.12 | 6388.668 |
| 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' | 6101.01 | 6102.254 |
표 1 및 도 2 내지 도 3에서 나타난 바와 같이, 자외선을 조사하기 전의 복합체의 경우 도2 와 같이 본 발명의 화합물 화학식2와 합성된 핵산의 질량이 관찰되었다. 자외선을 조사한 이후 광분해된 복합체의 경우, 도 3과 같이 화학식2의 화합물을 제외한 온전한 핵산의 질량만이 관찰되었다. 이를 통해 자외선 영역의 빛을 처리하였을 때 복합체는 본 발명의 화합물을 포함하여 광에 반응하여 분리되는 것을 확인하였고 효과적으로 핵산을 분리하는 것을 확인하였다.
실험예 3: 이광자 분해 실험
화학식 2와 연결된 poly(dT)20 핵산을 아크릴아마이드 단량체와 APS 개시제를 이용해 공중합하여 고분자 네트워크로 구성된 겔을 형성한 뒤 형광이 달린 poly(dA) 프로브를 이용하여 겔에 존재하는 poly(dT)를 염색하였다. 해당 겔의 특정 부분에는 (도 4C의 ★) 근적외선 780 nm 파장의 이광자 레이저를 조사하여 화학식 2의 광분해를 유도하였고 겔의 다른 부분에는 (도 4C의 #) 488 nm 파장의 단광자 레이저를 이용하여 poly(dA) 프로브의 형광을 소광시켰다. 도 4B의 모식도에서 나타난 바와 같이, 가열을 통해 기존의 형광 프로브를 제거하고 새로운 형광 프로브를 넣어주었을 때 형광반응을 관찰하였다.
도 4에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 복합체를 나타낸 도 4의 A는 도 4의 B의 모식도와 같이 두가지 파장을 조사하여 광분해 실험을 하였다. 도 4의 C 및 D와 같이 #부분은 형광만을 488nm파장의 단광자 레이저로 ??칭하여 소광시킬 수 있고 ★ 부분은 780nm파장의 이광자 레이저를 조사하여 복합체에서 핵산만 분리되어 광분해 될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 도 4의 C는 형광을 ??칭했지만 새로운 probe를 부착할 경우 형광을 관찰할 수 있고, D는 근적외선 파장의 이광자레이저를 조사하면 광분해가 일어나 복합체에서 핵산만 분리되어 ★ 부분에만 형광 신호가 존재하지 않음을 확인함으로, 근적외선에서 감응하여 광분해되고 핵산이 분리된 것을 확인하였다.
본 발명의 실시예 1 내지 실시예 2 및 실험예 1 내지 실험예 3을 종합하면, 본 발명의 화합물을 사용하여 핵산의 합성, 분리 및 복합체 형성이 가능하고 종래대비 추가공정을 줄여 경제적인 효과를 제공하며 UV뿐만 아니라 근적외선에서도 광분해하여 세포의 손상을 줄이고 좁은 영역에도 활용될 수 있는 것을 확인할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은,
또는
Y는,
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 광반응성 핵산 합성 또는 핵산 분리 용도로 사용되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 2, 화학식 3, 또는 화학식 4로 표시되는 것인 화합물:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 2 내지 화학식 4 에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
- 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 광반응성 핵산 합성용 조성물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은,
또는
Y는,
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 화학식 1의 화합물에 포함된 비닐기를 통해 고분자와 결합하는 것인, 핵산 합성용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 화학식 1의 화합물에 포함된 포스포르아미다이트 모이어티를 통해 핵산과 접합되는 것인, 핵산 합성용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 조성물은 적외선 조사시 화학식 1의 화합물에 포함된 쿠마린에 의해 이광자 흡수를 통해 합성된 핵산을 분리하는 것인, 핵산 합성용 조성물.
- 하기 화학식 1로 표기되는 화합물과 제1핵산을 반응시켜 화학식1의 포스포르아미다이트 모이어티에 제1핵산이 결합된 제1복합체를 제조하는 제1단계; 및
상기 제1복합체를 제2핵산과 접촉시켜 상보적인 서열의 핵산 이중가닥을 형성하는 제2복합체를 제조하는 제2단계;를 포함하는 것인, 핵산 제조방법:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-6알킬,
R2a 내지 R2b는 각각 독립적으로 C1-6알킬,
n1은 0 내지 40에서 선택되는 정수,
n2는 0 내지 40에서 선택되는 정수,
L은,
또는
Y는,
상기 m은 1 내지 3에서 선택되는 정수.
- 제8항에 있어서,
상기 제2핵산은 제1핵산의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 핵산 또는 A, G, C 및 T 핵산 단량체의 혼합물인 것인, 핵산 제조방법.
- 제8항에 있어서,
상기 제2단계 이전 또는 이후에 화학식1의 비닐기에 고분자 네트워크겔을 결합시켜 제3복합체를 형성하는 제3단계를 추가로 포함하는 것인, 핵산 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 제3 단계 이후 상기 상기 화합물에 광을 조사하여 핵산을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인, 핵산 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 광은 자외선, 가시광선 또는 적외선인 것인, 핵산 제조방법.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020180116563 | 2018-09-28 | ||
| KR20180116563 | 2018-09-28 |
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| WO2000076554A1 (en) | 1999-06-15 | 2000-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Ligand-conjugated oligomeric compounds |
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-
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| ChemBiochem., 2016, Vol.17, pp.2046-2053 |
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